KR20130094714A - 비-정제된 샘플에서 세포 생존력을 결정하는데에 유용한 효소 활성을 측정하기 위한 방법 - Google Patents

비-정제된 샘플에서 세포 생존력을 결정하는데에 유용한 효소 활성을 측정하기 위한 방법 Download PDF

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제우스 사이언티픽, 아이엔씨.
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Abstract

본 발명은 미생물의 검출 분야, 특히 박테리아의 검출 분야에 일반적으로 관련이 있으며, DNA 폴리머라아제 효소 활성과 같은 효소 활성을 측정하기 위한 방법과 관련이 있으며, 그리고 특히 이러한 방법이 미생물 조질 용해물 상에서 수행되는 것과 관련이 있으며, 이러한 방법은 상기 실시간 폴리머라아제 연쇄 반응(PCR) 기술과 같은 증폭 신호 발생장치에 연결될 수 있는 미생물 효소 활성을 결정하는데에 유용하고, 이에 의하여 정제되지 않은 혈액 및 다른 체액과 같은 샘플 내에 미생물 병원균의 결정이 가능해진다. 또한, 본 발명은 이러한 방법에서 사용하기 위한 시약 및 상기 방법을 수행하기 위한 이러한 시약을 포함하는 테스트 키트에 관한 것이다.

Description

비-정제된 샘플에서 세포 생존력을 결정하는데에 유용한 효소 활성을 측정하기 위한 방법{METHODS FOR MEASURING ENZYME ACTIVITY USEFUL IN DETERMINING CELL VIABILITY IN NON-PURIFIED SAMPLES}
본원은 정규출원으로서, 2010년 4월 16일에 출원된 미국 가출원 제61/324,939호, 2010년 4월 16일에 출원된 미국 가출원 제61/324,949호, 및 2010년 4월 19일에 출원된 미국 가출원 제61/325,413호는 부분적으로 참조로서 본원에 포함되고, 그에 대한 우선권을 주장한다.
본 발명은 미생물을 검출하는 분야와 일반적으로 관련이 있으며, 구체적으로는 박테리아를 검출하는 분야와 관련이 있다. 또한, 본 발명에 의해 제공되는 것은 고도로 민감하고 비-정제된 샘플에 적당한 미생물을 검출하는 개선된 방법 및 분석 키트를 포함하는 많은 응용물들이며, 이들은 박테리아 생존의 표시로서, 리가아제 및/또는 포스파타아제의 존재를 필요로 한다.
세포 생존성과 연관되는 특정 분자의 존재 및 수준을 측정하는 것은 많은 맥락에서 중요하다. 예를 들어, ATP의 수준을 측정하는 것은 성장 분석 및 독성학 목적을 위한 포유류 세포에 유용하다.
배양 접근법들은 적은 수의 박테리아를 검출하는데에 사용될 수 있지만, 이러한 기술들은 완료하는데 까지 몇 일이 요구되고, 특히 적은 수의 박테리아를 검출하려는 시도와 느리게 성장하는 미생물을 검출하는 경우에 그러하다.
대안으로서, 테스트들은, 오염 세포 또는 유기체의 샘플 내의 존재물에 연결될 수 있는 분자의 존재를 측정하는 것을 기반으로 수행될 수 있다. 가장 일반적으로 검출된 분자는 아데노신 트리포스페이트(ATP)이다. DNA 및 RNA의 검출도 제안되었지만, DNA 및 RNA의 존재와 생존력 사이의 연관성은 죽음 뒤 세포 내 핵산의 가변 지속성 때문에 명백하지 않다(Keer & Birch, Journal of Microbiological Methods 53 (2003) 175-183). 생존력의 표시로서 아데닐레이트 키나아제(adenylate kinase)의 검출도 제안되었다(Squirrell DJ, Murphy MJ, Leslie RL, Green JCD: A comparison of ATP and adenylate kinase as bacterial cell markers: correlation with agar plate counts, in Bioluminescence and Chemiluminescence Progress and Current Applications. Edited by: Stanley RA, Kricka LJ. John Wiley and Sons; 2002 및 WO 96/02665). ATP 수준을 결정하기 위해 일상적으로 이용되는 방법은 생체발광의 사용을 수반한다. 상기 방법은 발광 루시퍼라아제(luciferase)가 루시페린의 산화를 촉진하는 반응의 ATP 의존성을 사용한다. 상기 방법은 상대적으로 낮은 농도의 ATP를 측정하는데에 사용될 수 있다. 생체발광을 사용하는 ATP를 검출하기에 유용한 키트는 로체, 뉴 호리존스 다이아그노스틱스 코오퍼레이션, 셀시스 등(Roche, New Horizons Diagnostics Corp, Celsis etc)으로부터 구입할 수 있다. 하지만, 많은 문제점들이 생체발광 검출과 관련하여 존재한다. 예를 들어, 비-미생물 공급원(source)으로부터의 ATP의 존재 하에서, 미생물 ATP만의 검출은 문제일 수 있다. 이 문제는 ATP의 비세균성 공급원으로부터 박테리아를 분리할 수 있는 필터들을 사용함으로써 어느 정도 해결되어서, 더 정확한 신호를 제공하게 된다.
따라서, 미생물 검출에 대한 종래 기술과 관련하여 존재한 많은 문제점들이 나타날 수 있다. 이러한 문제점들을 더 해결하기 위해서, 리가아제의 검출이 제안되었으며, 이는 1996년 2월 1일에 공개된 특허 출원서 WO/1996/002665에서 설명되었으며, 여기서는 샘플 내에 존재하는 미생물의 존재 및/또는 그의 양, 및/또는 미생물의 세포 내에 물질의 존재 및/또는 그의 양을 결정하는 방법으로서, 샘플 내에 아데닐레이트 키나아제의 양은 샘플을 아데노신 디포스페이트(ADP)와 혼합함으로써 추정되고, 이런 ADP로부터 샘플에 의해 생산된 아데노신 트리포스페이트(ATP)의 양이 결정되고, 아데닐레이트 키나아제의 존재 또는 양으로 생산되고 미생물 및/또는 그의 세포 내 물질로 생산되도록 ATP의 양을 관련시키며, 이때 ADP에서 ATP로의 전환은 마그네슘 이온의 존재 하에서 ADP에서 ATP로의 최대 전환이 가능하도록 수행된다. 존재하는 마그네슘의 양은, 모든 ADP 분자가 적어도 하나의 마그네슘 이온과 연관될 수 있도록, 1 몰의 ADP에 대하여 마그네슘 1 몰이 제공되기 충분한 것이 바람직하다.
2009년 1월 15일에 공개된 특허 출원 WO/2009/007719, 발명의 명칭 미생물의 NAD-의존성 DNA 리가아제 활성 리가아제, 특히 NAD-의존성 리가아제에 기초한 미생물의 검출,은 샘플 내에 (생존가능한) 미생물의 존재에 대한 유용한 표시로서 개시된다. 리가아제는 핵산 분자의 결찰(ligation)을 촉진하는 효소이다. 상기 결찰 반응은 고려된 리가아제에 의해 결정되는 공-인자(co-factor)로서 ATP 또는 NAD+ 중 어느 하나를 요구한다. 본원에서, NAD-의존성 리가아제 활성의 사용은 샘플 내에 (생존가능한) 미생물의 존재에 대한 표시로서 활용된다. 샘플 내에서 생존가능한 미생물 세포의 표시로서, 특히 세균 근원(origin)으로서 사용되는 이 효소의 활성을 허락하기 때문에, NAD-의존성 리가아제 활성과 생존성 사이의 관계는 본원에 개시된 발명의 중심이 된다(Korycka-Machala et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy, Aug. 2007, p2888-2897). 반면에, 본 발명의 개발을 가져온 실험에서, 공개된 특허 출원 WO/2009/007719에 설명된 기술 및 교시는 조질(crude) 미생물 용해물, 혈액 또는 혈액 배양균과 같은 비정제된 샘플 내에서 생존가능한 미생물을 결정하는 것에 적용할 수 없으며, 따라서 상기 문헌에서 설명되는 바와 같은 기술의 주요한 문제점이 되는 것으로 여겨진다. 반면에, 이러한 방법론들도 문제점을 가진다고 발견되어왔다. 예를 들어, 전술한 특허 출원서에서 개시되는 바와 같이, 일반적으로 종래의 리가아제 기질 분석(assay) 디자인 및 그의 결과물 검출 신호는, 의도된 샘플 유형(혈액 유래 미생물 조세포 용해물)에 적용되는 경우, 리가아제 특이적이지 않다. 본 발명은 이러한 문제들을 해결하고 극복하기 위한 것이다.
본 발명의 목적은 비-정제된 샘플에서 세포 생존력을 결정하는데에 유용한 효소 활성을 측정하기 위한 방법을 제공하는 것이다.
전술한 종래의 방법과 다르게, 일 양태로서 본 발명은 샘플 내에, 특히 예를 들어 조질 미생물 용해물 또는 비정제된 혈액 또는 혈액 배양인 샘플 내에, (생존가능한) 미생물 또는 미생물(microbe)의 존재의 유용한 표시로서 폴리머라아제, 바람직한 실시예로는 DNA 또는 RNA 폴리머라아제와 같은 효소의 검출에 관한 것이다. 효소 예를 들어, 폴리머라아제, 미생물 또는 미생물의 활성 및 생존력 사이의 본 발명에서 발견된 연관성은 샘플 내에서 생존가능한 미생물 세포, 특히 박테리아 유래의 생존가능한 미생물 세포의 표시로서 사용될 이러한 효소들의 활성의 검출을 허용한다.
유사하게, 바람직한 실시예에서, 본 발명은 샘플 내에 미생물의 존재의 표시로서 DNA 또는 RNA 폴리머라아제를 검출하는 방법을 제공한다. 이러한 방법은:
(a) 샘플 내에서 폴리머라아제 활성에 대한 기질로서 작용하는 핵산 분자를 샘플과 접촉시키는 단계;
(b) 접촉시킨 샘플을 폴리머라아제 활성에 적합한 조건 하에서 배양하는 단계; 및
(c) 미생물의 존재를 표시하기 위해, 기질 핵산 분자 상에 미생물 폴리머라아제의 작용으로 인한 핵산 분자의 존재 (및/또는 양)를 특이적으로 결정하는 단계를 포함할 수 있다.
게다가, 본 발명은 전술한 방법에서 유용한 시약 및 상기 방법을 수행하는데에 유용한 시약들을 포함하는 분석 키트를 제공한다.
다른 양태에서, 본 발명은 2009년 1월 15일에 공지된 특허 출원 특허 출원 WO/2009/007719, 발명의 명칭 NAD-의존성 DNA 리가아제 활성에 기초한 미생물의 검출,에 설명된 방법, 조성물 및 키트에 개선을 가져오며, 상기 공지된 문헌은 (생존가능한) 미생물 또는 미생물의 존재에 대한 유용한 표시로서 리가아제, 특히 NAD-의존성 리가아제를 확인한다.
상기 WO/2009/007719에 포함된 전체 공개내용은 참조로 본원에 포함되고 본원의 일부를 이룬다.
따라서, 본 발명은 샘플 내에 미생물의 존재의 표시로서 NAD-의존성 리가아제, 또는 포스포타아제, 또는 그들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택되는 효소를 검출하는 방법의 개선 및, 그에 기초한 WO/2009/007719에 개시된 조성물 및 키트의 개선을 제공하며, 이러한 개선된 방법은:
(a) 샘플 내에서의 효소 활성에 대한 기질로서 작용하지만 DNA 폴리머라아제로부터의 신호를 간섭하지 않는 핵산 분자를 샘플과 접촉시키는 단계;
(b) 접촉된 샘플을 효소 활성에 적합한 조건 하에서 배양하는 단계; 및
(c) 미생물의 존재를 표시하기 위해, 핵산 분자 상에 선택된 효소 또는 혼합물의 기질의 작용으로 인한 효소 변형된 핵산 분자의 존재 (및/또는 양)를 특이적으로 검출하는 단계를 포함한다.
따라서, 본 발명의 개선된 방법은 이러한 효소 또는 그들의 혼합물이 발현되거나 발현되는 모든 미생물을 식별하기에 유용하다.
본원에서 제시한 바와 같이, 상기 방법의 첫 번째 단계는 샘플 내에서 효소 활성을 위한 기질로서 작용하지만 DNA 폴리머라아제로부터의 신호를 간섭하지 않는 핵산 분자와 샘플을 접촉시키는 것이다. 따라서, 결찰 되자마자 특이적으로 검출될 수 있는 임의의 적절한 결찰 가능한 분자는 본 발명의 방법에 사용될 수 있다고 인식될 것이다.
도 1, 그림 A 내지 D는 전술한 본 발명에 따라 수행된 실험에 의해 제공된 결과의 주형 다이아그램 및 도식적 묘사이다.
도 2, 그림 A 내지 D는 비-결찰가능함을 보여주는 도식적 묘사이며, 폴리머라아제 친화(favorable) 기질은 미생물 유래 조질 세포 용해물에 민감하고 특이적이다.
도 3은 비-결찰가능함을 보여주는 도식적 묘사이며, 폴리머라아제 친화 기질은 미생물 스파이크 혈액 배양 유래 조질 세포 용해물(Microbe Spiked Blood Culture derived crude cell lysates)에 민감하고 특이적이다.
따라서, 전술한 내용으로부터, 본 발명의 방법은 적절한 폴리머라아제와 같은 효소가 발현되는 (또는 발현된) 모든 미생물을 식별하기에 유용하다고 인식될 수 있다. 특정 실시예에서, 본 발명의 방법은 생존가능한 미생물의 검출에 적용되어서, 샘플 내에서 생존가능한 미생물을 검출하기 위한 방법으로서 고려될 수 있다. 특히, 바람직한 실시예에서, 본 발명의 방법은 핵산 폴리머라아제 유전자 및 그의 번역된 활성 단백질 폴리머라아제가 생존에 필수적인 박테리아 또는 미생물을 식별하기에 유용할 수 있다. 반면에, 최근 생존할 수 없게 된(예를 들어, 항-박테리아로 처리함) 박테리아와 같은 미생물은 효소가 분해될 때까지 검출가능한 폴리머라아제 활성을 보유할 수 있다.
본 발명의 개발에서, 기능적 세포 생화학 구성 요소의 샘플 제제에서 패러다임의 전환은, 본 발명이 종래의 변성 기반 분리 프로토콜, 및 종종 극심한 변성 기반 분리 프로토콜에 의해 추가되는 고비용 문제없이 서서히 용해된 세포로부터 샘플 상에서 직접적으로 수행되도록 하는 분석을 가능하게 한다는 점에서 발견되었다. 따라서, 본 발명은 전혈 및/또는 혈액 배양으로부터, 그리고 그들의 큰 부피로부터의 세포 분획을 제한하지 않고 포함하는 조질 임상의 용해물과 같은 샘플에서 생존가능한 생물의 검출을 가능하게 한다는 것을 발견했으며, 여기서 큰 부피는 일반적으로 10-20 ml, 바람직하게는 0.1-100 ml이다. 본 발명은 패혈증과 관련된 모든 생물을 검출하는데에, 그리고 균혈증, 진균혈증, 바이러스 질환 및 기생충에 의한 질환을 제한하지 않고 포함하는 질환들과 관련된 모든 생물을 검출하는데에 특히 유용하다. 본 발명에 있어서, 분석 방법이 비-정제된 샘플 상에서 수행되는 경우에 샘플 유래 폴리머라아제 억제, 뿐만 아니라 간섭 프로테이나아제 및 뉴클리아제의 존재가 장애물이었던 종래 기술의 교시와 대조적으로, 이러한 생물들의 검출은 전술한 비-정제된 샘플에서 수행될 수 있다고 예기치 않게 발견되었다.
전술한 바와 같이, 리가아제, 특히 NAD-의존성 리가아제는 샘플 내에서 (생존가능한) 미생물의 존재의 유용한 표시로 추정되는 것으로 개시되었다. 반면에, 이와 대조적으로, 본 발명은 리가아제에 비해 더 유용한 다른 생존가능한 미생물 세포 유래 효소를 제공하며, 이러한 효소는 생존가능한 세포로부터의 활성이 PCR 등과 같은 기술에 의한 증폭과 같은 고민감성 신호 생성기에 연결되도록 유사하게 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 이런 특징은 균류(fungi)로부터의 박테리아를 분화시키는 것이 잠재적으로 가능할 것이다. 본 발명의 실시예의 예로서, 하기가 사용될 수 있다:
a. 키나아제는 리가아제를 가능하게 하거나 폴리머라아제를 멈추게 하는데에 사용될 수 있는 PO4를 첨가한다
b. 인산염은 PO4를 제거하고 폴리머라아제가 가능하게 하는데에 사용될 수 있다
c. DNA & RNA 폴리머라아제는 종래 PCR 또는 등온 증폭(isothermal amplifications)을 하류로 가능하도록 기질을 연장하는데에 사용될 수 있다
d. 등온 증폭은 엔도뉴클레아제 효소 활성의 런 오프(run off)을 할 수 있다
e. 리보좀
f. miRNA 기작
g. 자이레이즈(Gyrase)
h. 헬리카제(Helicase)
i. 엑소뉴클레아제, 5'-3', 3'-5' 즉, PO4, 타크맨(TaqMan) 등과 같은 차단기를 제거함
j. 엔도뉴클레아제
k. 프로테아제
1. DNA 분해효소(DNase)
m. RNA 분해효소(RNase)
n. UD글리코솔라제(UDGlycosolases)
o. 수선 효소(Repair enzymes).
본 발명의 바람직한 실시예에서, 본 발명에 따른 DNA 폴리머라아제 활성의 측정이 미생물 조질 용해물로부터의 세포 생존력의 결정을 가능하게 한다는 것을 발견했다. 이는 매우 선택적인 "핫 스타트(hot start)"(당해 분야에 잘 알려짐)와 결합하여 더 선택적으로 변형된 올리고 기질을 사용하고, 실온, 37, 60C 활성으로 조절하여 확인될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 본 발명은 혈액 생성물 검사, 특히 혈소판의 혈액 생성물 검사에 응용되며, 이러한 응용에서, 임의의 미생물 성장은 생성물의 폐기의 원인이기 되고, 균류로부터의 박테리아의 분화가 필요하지 않다. 본 발명의 추가적인 실시예에서, 포스파타아제가 채택될 수 있고, 포스파타아제는 폴리머라아제 활성을 가능케하는 또 다른 훌륭한 후보 효소일 가능성이 많으며, 그 이유는 포스파타아제가 -OH를 남기고 5' 또는 3' 인산염 중 어느 하나를 제거하여서, 포함되어 있는 설계된 5' 타크(Taq)를 제거함으로써 임의의 폴리머라아제를 가능하게 할 수 있거나, 리가아제(3' 제거함)를 가능하게 하기 때문이다. 게다가, 포스파타아제는 활발하여(robust), pH의 최적화를 통해 효모 및 박테리아를 분화시키는 것을 도울 수도 있다. 따라서, 본원의 교시에 의해 예상되는 바와 같이, 폴리머라아제를 가능하게 할 임의의 적절한 효소는 본 발명의 실시에 유용할 수 있다고 인식될 것이다.
본 발명의 실시예에서, 미생물의 검출은 DNA 폴리머라아제가 분해되는 시점까지 최근에 생존가능한 미생물을 포함할 수 있다고 생각한다. 만일 생존가능한 미생물과 최근에 생존가능한 미생물 사이에 차이가 요구된다면, 적절한 조건 하에서, 둘 이상의 시점들 사이에서 폴리머라아제 활성의 간단한 순시적(time course) 또는 비교가 폴리머라아제 활성이 시간의 지남에 따라 증가, 지속 또는 감손하는 지를 결정하기에 충분할 것이다. 바람직한 실시예에서, 만일 폴리머라아제 활성이 연장된 기간 또는 차후 시점에까지 지속되거나, 또는 증가되는 것으로 발견되면(초기 측정값과 비교), 이는 미생물이 생존가능하다는 것을 지시할 수 있다. 이런 순시적 측정 접근법은 항생물질감수성 테스트(AST)에 적용되는 경우뿐만 아니라 다른 적절한 치료법의 결정에 특히 유용할 수 있다. 검출 방법은 본원에서 구체적으로 논의된다. 본 발명의 구체적인 바람직한 실시예에서, 미생물은 본원에서 설명된 바와 같이 박테리아이고, 본 발명의 방법은 더 일반적으로 사용될 수 있다(Wilkinson et al., Molecular Microbiology (2001) 40(6), 1241-1248). 또한, 박테리아는 예를 들어 중온성 박테리아 및/또는 호열성 박테리아일 수 있다.
본 발명의 문맥에서 "샘플"은 미생물, 구체적으로 박테리아의 존재에 대한 테스트에 바람직한 임의의 샘플들을 포함하는 것으로 정의된다. 따라서, 샘플은 예를 들어, 임상적으로 제공된 조질 미생물 용해물로 구성될 수 있거나, 혈액 또는 혈액 배양의 임상적 샘플을 포함할 수 있거나, 시험관 내(in vitro) 분석 시스템에 적절한 샘플을 포함한다. 또한, 샘플은 음료 샘플, 음식 샘플 또는 그들의 제제를 포함할 수 있거나, 샴푸, 컨디셔너, 보습제 등을 포함하는 개인 미용 용품과 같은 약학 또는 미용 제품을 포함할 수 있으며, 이들 모두는 규칙적으로 정해놓고 미생물 오염에 대해 테스트된다. 샘플은 조직 또는 세포를 포함할 수 있고, 가래 또는 혈소판 샘플을 포함할 수 있다. 게다가, 본 발명의 방법 및 키트는 예를 들어 음식이 제조되는 장소에서 표면의 오염을 모니터링하는데에 사용될 수 있다. 바람직한 실시예에서, 오염은 폴리머라아제 활성의 존재에 의해 지시된다. 오염은 임의의 미생물원으로부터 유래될 수 있으며, 구체적으로 박테리아 오염일 수 있다. 나아가, 본 발명은 상수도, 오수, 해양 환경 등과 같은 환경 조건들을 모니터링하는데에도 유용할 수 있다. 또한, 본 발명은 발효 과정에서의 박테리아 성장을 모니터링하는 데에, 그리고 박테리아 또는 포자 함유물이 병원, 산업 시설 또는 바이오디펜스 응용(biodefense applications)에서 평가될 수 있는 공기 샘플링에 유용할수도 있다.
본 발명의 방법은, 만일 샘플 내에 하나 이상의 (생존가능한) 미생물, 특히 박테리아가 존재하면, 효소 활성, 바람직하게는 DNA 폴리머라아제 활성이 존재할 것이라는 사실에 기인한다. 따라서, 효소는 적절한 조건 하에서 반응을 촉진하여 (이후 공정에서) 신규 검출가능한 핵산 분자를 발생시킨다. 상기 신규 핵산 분자는 이하에서 설명되는 임의의 적절한 수단에 의해 검출될 수 있으며, 이에 의하여 테스트 하에서 샘플 내에 미생물의 존재를 결정할 수 있게 된다.
따라서, 만일 미생물이 샘플 내에 존재하지 않으면, 샘플 내에 효소 (예, 폴리머라아제) 활성이 존재하지 않고, 따라서 신규 검출가능한 핵산 분자는 발생되지 않을 것이다.
본 발명의 방법은 현저한 기술적 이점을 제공하며, 그 이유는 신규 핵산 분자가 본 방법의 일부에 의해 발생 된다는 사실이 큰 부분을 차지하기 때문이다. 본 발명의 방법에서, 반응하지 않은 핵산 분자는 신호에 기여하지 않을 것이고, 그 결과로서, 본 방법이 수행되는 경우에 허위 양성 신호가 생성되지 않을 것이다.
나아가, 본 발명에 의해 제공된 방법은 매우 민감하고, 샘플 내에 존재하는 효소의 검출을 펨토그램(fg)까지 제공하고, 가능하다면 아토그램(attogram)에까지제공할 수 있다. 민감도는 모든 박테리아 세포가 수천 개의 효소 분자를 함유하여서 각각의 효소 분자가 적절한 조건 하에서 복합적인 반응을 촉진할 수 있다는 사실로부터 유래된다. 리보솜 또는 메신저 RNA를 검출하기 위해서 추가적인 단계 또는 시약을 사용하거나, 세포 당 하나 또는 몇 개의 유전자 복제물을 목표로 삼아야하는 직접 PCR 접근법과 다르게, 본원에서 설명하는 방법은 간단한 분석 포맷에서 세포 당 효소의 다중 복제물을 검출하는 것을 목표로 삼는다.
본원에서 제시한 바와 같아, 본 발명에 따른 방법의 첫 번째 단계는 샘플 내에서 효소, 예를 들어 폴리머라아제, 활성을 위한 기질로서 작용하는 핵산 분자와 샘플을 접촉시키는 단계를 포함한다.
본 발명에서 사용하기 위한 적절한 기질 핵산 분자는 하기에서 더 구체적으로 설명된다. 핵산 분자는 타당하다고 생각되는 합성 뉴클레오티드 유사체를 포함할 수 있거나, 예를 들어, RNA 기반, DNA 기반, 또는 이들의 혼합물일 수 있다. 그들은, 예를 들어 형광 표지(label), 또는 특정 실시예에서는 FRET 쌍을 사용하여 표지되어 검출을 가능하게 할 수 있다. 적절한 검출 방법은 본원에서 설명된다.
"핵산"은 폴리머라아제의 작용에 의해 검출가능한 핵산 분자를 발생시킬 수 있는 임의의 천연 핵산 및 천연 또는 합성 유사체를 포함하는 것으로 본원에서 정의도니다. 적절한 핵산 분자는 예를 들어, 이중 또는 단일-가닥 DNA 및 이중 또는 단일-가닥 RNA로 구성될 수 있다.
핵산 기질이 둔단(blunt-ended) 이중-가닥 DNA 분자를 포함할 수 있음에도 불구하고, 본 발명의 실시예에서 폴리머라아제에 대한 핵산 기질은 상보적 돌출부(complementary overhang)를 갖고 말단에서 결합하기 위한 5' 인산기를 갖는 두 개의 이중 가닥 DNA 분자를 포함한다. 일 특이적 실시예에서, 상기 상보적 돌출부는 2개 내지 10개, 예를 들어 3개 또는 5개의 염기 쌍이다. 대안적인 실시예에서, 핵산 기질은 5' 인산염을 함유하는 닉(nick)을 갖는 DNA 분자를 포함한다. 합성된 핵산 분자는 구입가능하고, 말단 5' 인산기가 결합된 것을 주문할 수 있다. 이는 본 발명의 방법에 사용된 핵산 분자의 100%가 5' 인산기로 표지될 기술적 장점을 가진다.
본 발명의 특히 바람직한 실시예에서, 만일 폴리머라아제가 샘플 내에 존재하면, 이것은 촉매화할 것이어서 신규 핵산 분자(전체 신규 서열을 포함함)는 본원에서 설명한 바와 같이 이후 공정(예, PCR)에 의해 검출될 수 있도록 형성될 것이다.
따라서, 기질 핵산 분자는 사실상 타당하다고 생각되면 두개 이상의 핵산 분자를 포함한다. 이는 본 발명의 방법 및 키트에 일반적으로 적용된다.
특정 실시예에서, 핵산 기질은 단일-가닥 상보적 돌출부를 갖는 두 개의 이중 가닥 핵산 분자를 포함한다.
본 발명의 신규 방법은 폴리머라아제와 리가아제를 모두 함유하는 것으로 의심되는 샘플을 취하고, 분리된 반응 용기에서 동시에 폴리머라아제 및 리가아제 모두를 테스트한 뒤, 신호를 차감하는 것에 의해 폴리머라아제로부터 리가아제를 구별하는데에 사용될 수 있어서, 사실상 샘플 내에서 발견된 진정한 리가아제 수준을 결정한다고 인정될 것이다. 이는 하기 수식에 의해 보여질 수 있다:
[폴리머라아제 신호 - 리가아제 신호(폴리머라아제+리가아제) = 진정한 리가아제 신호]
또한, 본 발명의 임의의 실시예에서, 핵산 상에서 폴리머라아제의 작용은 잘 알려져 있다고 인정되고, 따라서 많은 다른 종류의 핵산 기질은 사용을 위해 선택될 수 있으며, 그리고 본원에서 설명된 바와 같이 본 발명의 신규 방법에서 사용하는데에 장점을 가질 것이다. 바람직하게, 핵산 기질은 샘플 내에 폴리머라아제에 대해 과잉으로, 특히 큰 몰랄 과잉으로 존재한다. 이는 선행 기술 방법에 대해 중요한 기술적 차이이다. 왜냐하면, 신규 중합된 핵산 분자가 검출되기 때문에, 샘플 내 그 분자의 존재만이 검출 방법이 효과적으로 작동하기 위해 필수적이다. 따라서, 만일 다른 핵산 분자가 샘플 내에 존재하면, 예를 들어 검출될 박테리아로부터의 핵산 분자 또는 테스트될 샘플 내에 발견될 수 있는 포유류 또는 균류 원(source)으로부터의 핵산 분자가 존재하면, 이것은 본 발명의 방법에 유해하지 않다.
본 발명은 본 발명에 따라 수행된 이어지는 실험의 예를 참조함으로써 더 완벽하게 설명될 수 있다. 또한, 본 발명의 특정 바람직한 실시예가 설명되고 구체적으로 예시되지만, 본 발명을 이러한 실시예로 한정하려는 의도가 아니다.
실시예 1. 리가아제 독립 기작의 발견:
대장균(E. Coli) 리가아제 또는 리가아제 없이 세 개의 다른 DNA 기질(A)을 배양하고, UNG의 존재/부재 하에서 전체 길이 DNA 리가아제 기질 특이적 PCR 프라이머를 함유하는 PCR을 적용했다. SYBR 그린(SYBR green)(qPCR)을 통해 PCR을 모니터링했고, 결과물에 겔 분석(B)을 적용했다. 대장균 리가아제 또는 리가아제 없이 세 개의 다른 DNA 기질(A)를 배양하고, UNG의 존재/부재 하에서 S1-연장 검출 프라이머를 함유하는 PCR을 적용했다. 상업적으로 구입가능한 Zeus-프로브(qPCR) 방법(Zeus Scientific, Inc., Raritan, NJ)을 통해 PCR을 모니터링했고, 결과물에 겔 분석(C)을 적용했다. 감소한 양의 비-결찰성 DNA 기질(오직, S1/AS)을 세 개의 다른 상업적으로 구입가능한 DNA 폴리머라아제와 함께 배양하고, Zeus-프로브 qPCR 분석을 적용했다. 이러한 실험의 결과는 도 1에서 그래픽으로 도시된다.
실시예 2. 비- 결찰성 , 폴리머라아제 친화 기질은 민감하고, 미생물 유래 조질 세포 용해물에 특이적인 것으로 발견되었다:
감소한 양의 미생물을 비드밀(beadmill)로 용해하고, 37℃, DNA 폴리머라아제 완충액 및 dNTP의 존재 하에서 30분 동안 DNA 기질(오직, S1/AS)과 함께 배양했다(A). 이후에, 용해물에 S1-연장 특이적 프라이머를 함유하는 Zeus-프로브 qPCR을 적용했다. 결과는 도 2에서 그래픽으로 보여진다.
실시예 3. 비- 결찰성 , 폴리머라아제 친화 기질은 민감하고, 미생물 접종 혈액 배양으로부터 유래된 조질 세포 용해물에 특이적인 것으로 발견되었다:
감소한 양의 미생물을 10ml의 혈액 배지 안에 접종(spiked) 했다. 이후에 미생물을 회수했으며, 비드밀로 용해하고, 37℃에서 DNA 폴리머라아제 완충액 및 dNTP의 존재하에서 30분 동안 DNA 기질(오직, S1/AS)과 함께 배양했다(A). 이후에, 용해물에 S1-연장 특이적 프라이머를 함유하는 Zeus-프로브 qPCR을 적용했다. 결과는 도 3에서 그래픽으로 보여진다.
따라서, 또 다른 양태에서, 본 발명은 WO/2009/007719에서 설명하고 청구하는 발명을 개선한다. 본 발명에 따르면, 상기 WO/2009/007719의 공개문헌에 따라 추정되는 DNA 리가아제 특이적 기질은 정제된 DNA 폴리머라아제 또는 정제된 DNA 리가아제 중 어느 하나로부터 강한 신호를 내어서, 그 문헌에 개시된 방법이 패혈증 샘플과 같은 의도된 샘플 유형에 적용되는 경우에 DNA 리가아제 특이성을 제공하지 않는다고 발견되었다. 예를 들어, 본 발명의 개발에 있어서, WO/2009/007719에 교시된 샘플 제조 방법을 사용하여 얻은 패혈증 샘플은 매우 풍부한 DNA 폴리머라아제를 함유하는 조질 미생물 세포 용해물로서 상기 문헌에서 교시되는 바와 같이 분석 프로토콜로의 입력이다. DNA 폴리머라아제(들)는 모든 살아있는 세포 내에 풍부하다. WO/2009/007719에서 개시된 분석법은, 현실적인 관점에서 모든 임상적 샘플 투입을 포함한 비-리가아제-정제된 샘플을 투입하는 경우에, 임의의 DNA 폴리머라아제 및 DNA 리가아제 유래 신호를 서로 구분할 수 없다고 밝혔으며, 그 이유는 임상적 샘플로부터 결과를 얻기 위한 시도의 경우, 리가아제를 분리하는 것이 상기 문헌에서 개시된 바와 같이 현실적이거나 일상적인 과정이 아니기 때문이다. 더 정확히 말하면, 이 문헌에서 교시하는 바에 따라 수행된 실험은 DNA 폴리머라아제에 의해 오염된 분석 신호를 생산하는 것으로 밝혀졌지, DNA 리가아제 특이적 신호가 아니였으며, 이는 분명히 상기 문헌에 따른 소정의 결과이다.
전술한 이러한 발견은 생존가능한 세포로부터 DNA 리가아제를 특이적으로 검출하기 위한, WO/2009/007719의 교시에 따라 생산된, 시스템의 능력에 반한다. 이는, ATP 의존성 균류에 의한 리가아제로부터 생존가능한 세포-유래 NAD 의존성 박테리아에 의한 리가아제를 구별하기 위한, 상기 문헌의 개시된 분석의 의도된 능력을 더 불가능하게 하며, 이는 활성 폴리머라아제가 모든 생존가능한 세포에 공통이고, 활성 폴리머라아제가 이러한 분석 시스템에서 임의의 리가아제로부터 구별될 수 없기 때문이다. 따라서, 상기 문헌 또는 임의의 다른 알려진 기술에 의해 분명히 충족되지 않는 이러한 치명적인 문제점을 갖는 것에 대해서, 본 발명은, 검출될 DNA 폴리머라아제로부터의 신호의 간섭을 허용하지 않는 이하에서 설명될 대안적, 대체 DNA 기질을 제공함으로써, 비-정제된 리가아제 샘플, 예를 들어 조질 미생물 용해물로부터 특정 리가아제 신호를 검출할 수 있는 개선점을 제공한다.
따라서, 본 발명은, 샘플 내에서 미생물의 존재의 지시로서 NAD-의존성 리가아제 또는 포스파타아제, 또는 그들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택된 효소를 검출하는 개선된 방법, 및 그 방법에 기초한 조성물 및 키트를 제공하며, 이때 상기 방법은:
(a) 샘플 내에서 효소 활성을 위한 기질로서 작용하지만 DNA 폴리머라아제로부터의 신호의 간섭을 허용하지 않는 핵산 분자와 샘플을 접촉시키는 단계;
(b) 효소 활성에 적합한 조건 하에서 접촉시킨 샘플을 배양하는 단계; 및
(c) 미생물의 존재를 지시하기 위해서, 기질 핵산 분자 상에서 선택된 효소 또는 혼합물의 작용에 기인한 효소 변형된 핵산 분자의 존재 (및/또는 양)를 결정하는 단계를 포함한다.
따라서, 본 발명의 개선된 방법은 NAD-의존성 리가아제 또는 포스파타아제, 또는 그들의 혼합물이 발현되는 (또는 발현된) 모든 미생물을 식별하기에 유용하다.
본 발명의 바람직한 실시예에서, 본원에서 개시된 개선된 방법의 첫 번째 단계는 샘플 내에서 NAD-의존성 리가아제 활성을 위한 기질로서 작용하지만 DNA 폴리머라아제로부터의 신호의 간섭을 허용하지 않는 핵산 분자와 샘플을 접촉시키는 단계를 포함한다. 일단 결찰되면 특이적으로 검출가능한 임의의 적절한 효소 변형, 또는 결찰성, 분자는 본 발명의 방법에 사용될 수 있다.
본 발명의 방법에 사용하기 위한 기질 핵산 분자 및 키트 내 포함물은 검출가능한 효소 변형된 또는 결찰된 (신규) 핵산 분자를 생산할 수 있도록 NAD-의존성 리가아제가 분자 상에서 작용할 수 있고, DNA 폴리머라아제로부터의 신호의 간섭을 허용하지 않도록 하기 위한 서열 및 구조이어야만 한다.
본 발명의 개발에서, 폴리머라아제 연쇄 반응(PCR) Taq-DNA 폴리머라아제 유래 바탕의 제거는 WO/2009/007719에서 개시된 최근 기질 디자인에서 발견되는 특이성의 결핍에 대한 실행 가능한 해결책이 아닌 것으로 밝혀졌다고 인식되는데, 그 이유는 이것이 개별적으로 해결되어야 하는 분리된 검출 시스템 사안으로 밝혀져서 본 공개문헌의 범위 밖에 있기 때문이다.
따라서, 본 발명에 이르는 실험의 경우에는, 리가아제를 방해하지 않는 억제제 첨가제로 모든 DNA 폴리머라아제 활성을 차단하는 것을 구체적으로 목표로 한다. 이를 달성하기 위해서, DNA 폴리머라아제는 중성화/조절되는 것이 필요한 문서에 의해 입증된 효소 기능을 가지는 것으로 밝혀졌다:
(a) 5'-3' DNA 폴리머라아제 활성
(b) 3'-5' 엑소뉴클레아제 활성
(c) 5'-3' 엑소뉴클레아제 활성
(d) 고유의 에스테라아제 활성
WO/2009/007719의 방법에서 사용되는 것으로 개시된 기질 분자에 대한 대체물로 적합한, 본 발명의 신규한 방법에 사용하기 위해 적절한 기질 핵산 분자 계획이 제한하지 않고 하기를 포함할 수 있다는 것이 본 발명에 의하여 밝혀졌다:
1. 임의의 활성으로부터의 폴리머라아제를 억제하는 변형된 뉴클레오티드
2. 디데옥시뉴클레오티드 ddCTP, 리가아제가 dATP를 사용하는 생산 반응을 향유하는 동안, 최초 염기 첨가에 따라 폴리머라아제를 정지시키고 그의 활성을 격리-중화시키는 ddGTP
3. AS 올리고가 연장되는 것을 방지하는 디데옥시올리고뉴클레오티드
4. DNA 기질 상에서 그들의 활성을 차단하기 위해 포함된 폴리머라아제 억제 변형된 염기를 갖는 S1 올리고
5. 이런 활성을 억제하는 DNA 폴리머라아제 특이 항체 - 이러한 것은 PCR의 기술 분야에서 잘 알려진 것이다.
6. 앱타머 올리고 억제 착물(Aptamer oligo inhibitory complexes)
7. PCR과 같은 증폭의 하류에서 검출되는 것에서 진정한 "핫 스타트"와 결합된 5'측 상의 AS를 단축시킴으로써 폴리머라아제에 의해 연장된 기질을 제거하는 DNA 기질 혼성 계획, 상기 "핫 스타트"는 기술 분야에 알려진 용어이다
8. 3'측 상의 AS를 단축함으로써 폴리머라아제를 결합 및 연장에서 제거하지만 리가아제에 영향을 미치지 않는 DNA 기질 혼성화 계획
9. 리가아제의 지원에 균형이 맞는 폴리머라아제 연장 길이와 결합된 상대적 속도 동역학
10. 사전-PCR(pre-PCR) S1 3'디데옥시 경쟁(전체 길이, 또는 AS의 3'에 상보적인 13mer)
11. 사전-PCR S1 3'인산염 경쟁
12. 최적의 UNG(표준 UNG 효소) 조건을 사용하여 AS의 완전한 제거
13. 내열성 UNG(NEB)를 사용하여 AS의 완전한 제거. UNG의 열 처리를 가능하게 하여 오염되는 리가아제/폴리머라아제를 제거하며, PCR mm은 dTTP를 반드시 가져야 함
14. PCR 이전에 UNG/RNA 분해 효소 공동 처리를 허용하기 위해서, 데옥시우리딘(UNG 제거) 및 잔류 RNA 염기를 갖는 AS를 제조
15. 디데옥시 3'AS를 얻을 필요성
16. 고온에서(즉, 65 도)에서 Taq 독킹(docking)을 감소시키기 위해 AS의 3'말단을 단축함
17. 결찰/연장 단계 과정 중에 고체 지지체에 공유 결합하는 AS
18. 3'디데옥시 S2 역 상보(전체 길이, 또는 S1 Po1 연장에 상보적인 딱 13mer 일 수 있음)
19. 바탕 감소를 위해 - "핫 스타트" 계획, 당해 분야에 잘 알려짐 - 원치 않는 올리고 또는 연장된 올리고 혼성화의 100% 제거
a. 진정한 물리적(true physical) - 모든 접촉 물질이 약 90℃의 고온에 있어야만 하고, 약 65℃의 임계 온도 밑으로 절대 떨어지면 안되기 때문에, 쉽지가 않으며, 전환 공정은 회피되어야 하는 온도의 하강을 만들기에 문제가 있다.
b. 비 효소 핫 스타트(non enzyme Hot Starts)가 예를 들어 2mM MgCl(), 프라이머, dNTP 또는 다른 필수 성분에 떨어뜨린다.
c. 화학-프라이머 핫 스타트(Chem-primer Hot Start).
본 발명의 개선은 본원에서 설명된 적절한 기질 핵산 분자를 WO/2009/007719에서 설명된 것들로의 치환에 의해 이루어질 수 있다고 보여진다 할지라도, 본 발명은 본원에서 설명된 특정 실시예에 의해 범위가 한정되지 않는 것으로 인식되어야 할 것이다. 참으로, 본원에서 설명된 것 이외에도 본 발명의 다양한 변형이 전술한 기재로부터 통상의 기술자에게 자명할 것이다. 모든 이러한 변형은 본 발명의 범위 내에 속하는 것으로 생각된다. 나아가, 본원에서 설명된 모든 실시예는 광범위하게 적용할 수 있고, 타당한 어떤 모든 다른 일관된 실시예와 결합이 가능하다.
본 발명의 폭 넓은 기본적인 이론 및 교시는 구체적으로 전술한 바와 같이 미생물 또는 미생물뿐만 아니라 박테리아, 균류, 바이러스 기생충과 같은 다양한 병원균에 대한 다양한 생물학적 조직 샘플(혈액, 체액 및 연조직을 포함하지만 이에 제한되지 않음)의 변성제-가능한-조질 용해물(비드밀 및 초음파)-직접적인-프로브/SYBR-PCR 분석의 모든 변형을 최적화하는데에 적용될 수 있다고 당해 분야의 통상의 기술자에 의해 인정될 것이다.
특정 문헌이 PCR에 대해 본원에서 제시되었지만, 본 발명의 개선은 PCR 또는 유사한 방법론에 제한되지 않는 것으로 더 인식될 것이다. 본 발명에 사용하기 위해 고려된 증폭 분석은 DNA 증폭 분석, 내열성의 폴리머라아제를 포함하는 PCR 분석 및 등온 증폭 방법과 같은 다른 잘 알려진 핵산에 기초한 기술을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 통상의 기술자는 본 발명의 실시에 유용할 다양한 적합한 증폭 방법을 생각할 수 있고, 따라서 본 발명이 그에 의해 제한되지 않을 것으로 의도된다고 인식될 것이다.
또한, 본 발명은 DNA 진단을 수반하는 임의의 그리고 모든 방법, 과정 및 공정에서 응용된다고 인식될 것이다. 이러한 응용의 예는 음식, 물 안전, 생물학적 테러, 의료/약을 수반하는 것들 및/또는 병원균 검출을 수반하는 모든 것들을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 식품 산업에서, 본 발명은 방부제의 효험을 모니터링하는데에 사용될 수 있다. 본 발명의 방법은 모든 세포에 적용될 가능성을 가진다. 박테리아 세포는 실시예에서 예시되지만, 통상의 기술자는 본 발명의 방법이 많은 다른 세포 유형에 적용될 수 있다고 용이하게 알 수 있다. 또한, 본 발명은 막을 파괴 및/또는 세포, 예를 들어 박테리아 세포를 죽일 수 있는 물질의 식별에 사용될 수 있다. 다중약물 내성 생물이 보건 시설 및 환자에게서 번창했고 확산되었기 때문에, 새로운 살균제 및/또는 항생제의 식별은 이제 우선 순위에 있다.
수단으로서 정량 PCR와 결합한 본 발명의 방법은 세포를 배양하고 성장을 기다리는데 시간을 소비함 없이 살균제 및/또는 항생제의 영향을 빠르고 성공적으로 식별할 수 있다고 더 인식될 것이다. 일부 예에서, 생물은 배양을 위해 몇 일에서 몇 주가 소요될 수 있고, 따라서 후보군 물질이 미생물과 같은 세포를 죽일 수 있는지를 보기 위해 현저한 시간이 소요될 수 있다. 다른 예에서, 특정 생물은 세포 배양에서 성장하지 않을 것이며, 따라서 물질이 효과적인지를 결정하기 어려워진다. 따라서, 본 발명의 신규 방법을 적용하는 것은 신규한 살균제 및/또는 항생제의 식별을 위한 시간 및 자원을 절약할 수 있다.
본 발명에 따른 신규한 방법의 추가적인 장점은 사용의 편리성에 있다. 예를 들어, 이러한 방법의 사용에 있어서, 많은 양의 샘플은 생존가능한 세포, 예를 들어 박테리아의 존재에 대해 용이하게 테스트할 수 있다. 예를 들어, 샘플은 온전한 세포막을 갖는 잠재적으로 생존한 박테리아의 존재에 대해 테스트될 수 있다. 또 다른 실시예에서, 환경과 관련된 샘플은 생존가능한 세포, 예를 들어 박테리아의 존재에 대해 테스트될 수 있다. 이러한 샘플은, 예를 들어 토양 또는 식물의 일부로부터 수집될 수 있다. 본 발명에 따른 방법은 처리된 폐수를 방출 전 및 후에 테스트하기 위해 더 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 방법은 의료용 샘플, 예를 들어 대변 샘플, 혈액 배양, 가래, 조직 샘플(절단한 것 포함), 상처 물질, 소변, 및 기도로부터의 샘플, 임플란트 및 카테터 표면을 테스트하기 위해 더 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 방법의 또 다른 응용 분야는 식품에 대한 통제일 수 있다. 다른 실시예에서, 음식 샘플은 우유 또는 유제품(요거트, 치즈, 스윗 치즈, 버터 및 버터밀크), 식수, 음료(레모네이드, 맥주 및 쥬스), 빵제품 또는 육제품으로부터 얻어진다. 본 발명의 방법은, 음식 내의 방부제 또는 음식의 항균 처리(저온 살균)가 세포 성장을 방지하는지를 결정할 수 있다. 본 발명에 따른 방법의 또 다른 응용 분야는 약학 제품 및 미용 제품, 예를 들어 연고, 크림, 팅크제, 쥬스, 용액, 방울 등의 분석이다.
그 밖에, 본 발명의 방법은 생태 조사를 위한 미생물 군집 중 잠재적으로 생존가능한 멤버, 농업 및/또는 생태계 시스템에 대한 특정 토양의 건강상태를 식별할 수 있다. 박테리아 군집을 종래의 방법으로 식별하는 것은 재배 기반의 접근법 또는 평판계수(plate count)를 사용하여 수행되어왔다. 더 많은 군락의 갯수가 세어지면, 더 많은 박테리아가 원래의 샘플 내에 존재한다고 추정된다. 반면에, 가끔 긴 배양 시간(몇일 동안)이 시기적절하고 정확한 결과에 적합하지 않은 방법을 만들어내는 문제점이 야기된다. 이러한 문제점은 본 발명의 방법을 활용함으로 해결된다.
본 발명의 방법을 사용하여 분석하거나 본 발명의 방법을 사용하여 샘플 내의 잠재적인 생존력을 검출하기 위해 겪을 수 있는 박테리아의 제한되지 않는 예는 예를 들어, 백일해(B. pertussis), 렙토스피라 포모나(Leptospira pomona), S. 파라티피 A 및 B(S. paratyphi A and B), C. 디프테리에(C. diphtheriae), C. 테타니(C. tetani), C, 보티디눔(C. botidinum), C. 퍼프린제스(C. perfringens), C. 페세리(C.feseri) 및 다른 가스 괴저 박테리아(gas gangrene bacteria), 탄저균(B. anthracis), 페스트균(P. pestis), P. 멀토시다(P. multocida), 수막염균(Neisseria meningitidis), 임질균(N. gonorrheae), 인플루엔자간균(Hemophilus influenzae), 방선균(Actinomyces) {예, 노카르디아(Norcardia)}, 아시네토박터(Acinetobacter), 간균과(Bacillaceae) {예, 바실러스 안스라시스(Bacillus anthrasis)}, 박테로이데스(Bacteroides) {예, 박테로이드 후라길리스(Bacteroides fragilis)}, 분아균증(Blastomycosis), 보르데텔라(Bordetella), 보렐리아(Borrelia) {예, 보렐리아 부르그도르페리(Borrelia burgdorferi)}, 브루셀라(Brucella), 캄필로박터(Campylobacter), 클라미디아(Chlamydia), 콕시디오이데스(Coccidioides), 코리네박테리움(Corynebacterium) {예, 코리네박테리움 디프테리에(Corynebacterium diptheriae)}, 대장균 {예, 장관독소원성 대장균(Enterotoxigenic E. coli) 및 장출혈성 대장균(Enterohemorrhagic E. coli)}, 엔테로박터(Enterobacter) (예, 엔테로박터 에어로게네스균(Enterobacter aerogenes)), 장내세균(Enterobacteriaceae) (클렙시엘라(Klebsiella), 살모넬라(Salmonella) (예, 장티푸스균(Salmonella typhi), 장염균(Salmonella enteritidis), 셀라티아(Serratia), 여시니아(Yersinia), 쉬겔라(Shigella)), 에리시펠로트릭스(erysipelothrix), 헤모필루스(Haemophilus) (예, 헤모필루스 인플루엔자 유형 B(Haemophilus influenza type B)), 헬리코박터(Helicobacter), 레기오넬라(Legionella) (예, 레기오넬라 뉴모필라(Legionella pneumophila)), 렙토스피라(Leptospira), 리스테리아(Listeria) (예, 리스테리아균(Listeria monocytogenes)), 마이코플라즈마(Mycoplasma), 마이코박테리움(Mycobacterium) (예, 나병균(Mycobacterium leprae) 및 결핵균(Mycobacterium tuberculosis)), 비브리오(Vibrio) (예, 콜레라균(Vibrio cholerae)), 파스퇴렐라속(Pasteurellaceae), 프로테우스(Proteus), 슈도모나스(Pseudomonas) (예, 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)), 리케차과(Rickettsiaceae), 스피로헤타(Spirochetes) (예, 트레포네마 종(Treponema spp.), 렙토스피라 종(Leptospira spp.), 보렐리아 종(Borrelia spp.)), 시아겔라 종(Shigella spp.), 메닝기오코쿠스(Meningiococcus), 폐렴균(Pneumococcus) 및 모든 연쇄상구균(Streptococcus) (예, 폐렴연쇄상구균(Streptococcus pneumoniae) 및 A3 B 및 C군 용형연쇄구균(Groups A3 B, and C Streptococci)), 유레아플라즈마(Ureaplasmas), 매독스피로헤타(Treponema pallidum), 포도상구균(Staphylococcus aureus), 파스튜렐라 헤몰리티카(Pasteurella haemolytica), 디프테리아 병원균 독소(Corynebacterium diptheriae toxoid), 수막구균 폴리사카라이드(Meningococcal polysaccharide), 백일해균(Bordetella pertusis), 폐렴구균(Streptococcus pneumoniae), 파상풍균 독소(clostridium tetani toxoid), 및 미코박테리움 보비스(Mycobacterium bovis)를 포함한다. 상기 리스트는 단지 실례로만 의도되고 어떤 방식으로도 본 발명이 이러한 특정 박테리아 생물을 검출하기 위한 것으로 한정할 의도는 아니다.
본 발명의 특정 바람직한 실시예는 PCR을 사용한다. PCR에 대한 일반적인 과정은 US 특허번호 제4,683,195호(Mullis 등) 및 US 특허번호 제4,683,202호(Mullis 등)에서 교시된다. 반면에, 각각의 증폭 반응에 사용된 최적의 PCR 조건은 당해 분야의 기술자에 의해 일반적으로 채용된 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 일반적으로 경험에 기인하여 결정되거나 추정된다. 많은 파라미터들이 반응의 성공에 영향을 미친다. 그 중에서도, 어닐링 온도 및 시간, 연장 시간, Mg2 +, pH, 및 프라이머, 템플릿 및 데옥시리보뉴클레오티드의 상대적 농도이다. 일반적으로, 템플릿 핵산은 폴리머라아제 반응 이전에 약 95℃ 이상에서 1 내지 10분 동안 가열함으로써 변성된다. 약 20-99 사이클의 증폭은 90℃ 내지 96℃에서 0.05 내지 1분 동안의 변성 단계, 48℃ 내지 72℃의 온도에서 0.05 내지 2분 동안 어닐링 단계, 최적의 마지막 사이클로 68℃ 내지 75℃에서 0.1 분 이상 동안 연장 단계를 사용하여 실행된다. 일 실시예에서, PCR 반응은 약 100 ng 템플릿 핵산, 20 uM의 상류 및 하류 프라이머, 및 0.05 내지 0.5 mm의 각 종류의 dNTP, 및 0.5 내지 5 유닛의 상업적으로 구입가능한 내열성 DNA 폴리머라아제를 함유할 수 있다.
종래의 PCR의 변형은 역전사 PCR 반응(RT-PCR)이며, 여기서 역전사 효소는 먼저 RNA 분자를 단일 가닥 cDNA 분자로 전환시키고, 이런 cDNA는 폴리머라아제 연쇄 반응에서 차후 증폭을 위한 템플릿으로 채용된다. RNA의 분리는 당해 분야에서 잘 알려져 있다. RT-PCR을 수행함에 있어서, 역전사 효소는 목표 핵산이 열 변성된 이후에 반응 샘플에 일반적으로 첨가된다. 이후에, 반응은, 계획된 증폭 사이클이 수행되기 이전에, cDNA 템플릿을 생성하기 위해서 충분한 시간(10-60분) 동안 적합한 온도(예,30-45℃)에서 유지된다. 당해 분야의 통상의 기술자는, 만일 정량적 결과가 요구된다면, 증폭된 핵산의 상대적 복제를 위한 유지되거나 조절되는 방법을 사용하기 위해 경고가 있어야만 한다. "정량적" 증폭의 방법은 당해 분야의 통상의 기술자에게 잘 알려져 있다. 예를 들어, 정량적 PCR은 동일한 프리이머를 사용하는 제어 서열의 알려진 양을 동시적으로 공동-증폭하는 단계를 수반할 수 있다. 이는 PCR 반응을 교정하는데에 사용될 수 있는 내부적 기준을 제공한다.
PCR의 또 다른 대안은 정량적 PCR(qPCR)이다. qPCR은 작은 삽입 또는 결실에 의해 목표 대상으로부터의 크기를 다르게 하는 내부 상동 제어를 채용하는 경쟁적 기술에 의해 수행될 수 있다. 반면에, 비-경쟁적 및 동역학적 정량 PCR도 사용될 수 있다. 목표 서열과 동시에 검출될 수 있는 내부 상동 제어와 함께 실시간, 동역학적 PCR 검출의 조합은 유리할 수 있다.
PCR, RT-PCR 및/또는 qPCR을 위한 프라이머는 특정 생물에 대하여 선택되는 DNA 영역만을 증폭할 특정 박테리아 또는 영역들 내에서 선택된다. 대안적으로, 프라이머는 모든 생물에게 공통되는 DNA 부분을 혼성화하고 증폭하도록 선택된다. 프라이머 선택 및 제조는 당해 분야에 일반적으로 알려져 있다. 일반적으로, 하나의 프라이머는 증폭될 서열의 각 말단에 위치된다. 이러한 프라이머는 일반적으로 10개 내지 35개의 뉴클레오티드 길이를 갖고 바람직하게는 18개 내지 22개의 뉴클레오티드 길이를 갖는다. 증폭될 수 있는 가장 작은 서열은 약 50개의 뉴클레오티드 길이이다(예, 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머, 둘 모두 20개의 뉴클레오티드 길이, 서열 내에서 이들의 위치는 10개의 뉴클레오티드 이상에 의해 분리됨). 더 긴 서열이 증폭될 수 있다. 어떤 프라이머는 "정방향 프라이머"로 불려지고, 이는 증폭될 영역의 좌측 말단에 위치된다. 상기 정방향 프라이머는 DNA의 상부 가닥의 영역과 서열이 동일하다(이중-가닥 DNA가 종래의 기술로 사진찍으면, 상부 가닥은 5'에서 3' 방향으로 극성을 가지는 것으로 보인다). 정방향 프라이머의 서열은 DNA의 상부 가닥에 상보적인 DNA 가닥에 혼성화 되는 것이다. 다른 프라이머는 "역방향 프라이머"라고 불리고, 증폭될 영역의 우측 말단에 위치된다. 역방향 프라이머의 서열은 DNA의 상부 가닥의 영역에 상보적인 서열이며, 즉 이는 DNA의 상부 가닥의 영역의 서열에 역상보적이다. 역방향 프라이머는 DNA의 상부 말단에 혼성화한다. PCR 프라이머는 다른 많은 조건을 충족하도록 선택된다. PCR 프라이머는 템플릿 내의 한 영역보다 더 큰 혼성화를 최소화하기에 충분히 커야한다(바람직하게는 10개 내지 30개 뉴클레오티드 길이). 길게 연속되는 단일 염기를 갖는 프라이머는 가능하다면 피해야할 것이다. 바람직하게, 프라이머는 40% 내지 60%의 G+C 함량을 가져야 할 것이다. 가능하다면, 프라이머의 3'말단의 G+C 함량%는 프라이머의 5'말단의 G+C 함량 퍼센트에 비해 높아야할 것이다. 프라이머는 프라이머 내의 다른 서열(즉, 회문들(palindromes))과 혼성화될 수 있는 서열을 함유하지 않아야 한다. 동일한 PCR 반응에 사용된 두 개의 프라이머는 서로 혼성화될 수 없어야 한다. PCR 프라이머는 전술한 권고를 충족하도록 선택되는 것이 바람직하지만, 프라이머가 이러한 조건에 순응하는 것이 필수적이지는 않다. 다른 프라이머들도 사용할 수 있지만, 좋은 결과를 얻어낼 가능성이 낮다.
주어진 서열 내에서 DNA를 증폭하는데에 사용될 수 있는 PCR 프라이머는 사용가능한 많은 컴퓨터 프로그램 중 하나를 사용하여 선택될 수 있다. 이러한 프로그램은 주어진 서열의 증폭에 최적화된 프라이머를 선택한다(즉, 이러한 프로그램은 전술한 조건뿐만 아니라 PCR 프라이머의 기능성을 극대화할 수 있는 다른 조건에 충족하는 프라이머를 선택한다). 하나의 컴퓨터 프로그램은 유전학 컴퓨터 그룹(Genetic Computer Group)(GCG는 최근에 Accelrys가 되었음) 분석 패키지이며, 이는 PCR 프라이머의 선택을 위한 일반성을 갖는다.
하기 개시되는 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 프로브는 많은 방식으로 제조될 수 있다. 이러한 올리고뉴클레오티드를 제조하는 하나의 방법은 상업적으로 구입가능한 핵산 합성기를 사용하여 그들을 합성하는 것이다. 이러한 다양한 합성기가 존재하고 당해 분야의 통상의 기술자에게 잘 알려져 있다.
또한, 핵산은 혼성화 방법에 의해 검출될수도 있다. 이러한 방법에서, 표지된 핵산은 표지되거나 표지되지 않은 핵산 프로브를 함유하는 기질에 첨가될 수 있다. 대안적으로, 표지되지 않거나 표지되지 않은 핵산은 표지된 핵산 프로브를 함유하는 기질에 첨가될 수 있다. 혼성화 방법은 예를 들어, 문헌[마이크로어레이 분석(Micro Array Analysis), Marc Schena John Wiley 및 Sons, Hoboken N.J. 2003]에서 개시된다.
핵산을 검출하는 방법은 표지의 사용을 포함할 수 있다. 예를 들어, 방사성 동위원소로 표지된 것은 (방사성 인산염 포함 여부를 검출하거나 정량하기 위한) 사진 필름 또는 방사형광분석기를 사용하여 검출될 수 있다. 형광 마커(marker)는 방출 광을 검출하기 위해 광검출기를 사용하여 검출되거나 정량화될 수 있다(예시적 장치에 관한 US 특허번호 제5,143,854호 참고). 효소 표지는 기질을 갖는 효소를 제공하는 단계 및 기질 상에서 효소의 작용에 의해 생산된 반응 생성물을 측정하는 단계에 의해 일반적으로 검출된다. 비색 표지는 착색된 표지를 단순히 시각화함으로써 검출된다. 일 실시예에서, 증폭된 핵산 분자는 증폭된 생성물을 핵산 사이에 끼어드는 염료로 직접적으로 염색함으로써 시각화된다. 이는 통상의 기술자에게 자명한 것으로서, 예시적인 염료는 SYBR 그린, SYBR 블루, DAPI, 프로피듐 아이오딘(propidium iodine) 및 에티듐 브로마이드(ethidium bromide)를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 증폭된 DNA 분자 내로 끼어든 발광성 염료는 증폭된 생성물의 양에 직접적으로 비례하며, 이는 종래의 검출 장치를 사용하여 제조사의 지시에 따라 편리하게 정량될 수 있다. 이러한 접근법의 변형은 증폭된 생성물의 겔 전기 영동법 후에 선택된 끼어들기 염료(intercalating dye)의 염색 및 시각화가 이어진다. 대안적으로, 표지된 올리고뉴클레오티드 혼성 프로브(예를 들어, 형광 공명 에너지 전환(fluorescent resonance energy transfer, FRET) 프로브 및 비색 프로브와 같은 형광 프로브)는 증폭을 검출하는데에 사용될 수 있다. 필요에 따라서, 테스트된 생물학적 개체를 대표하는 게놈 서열의 특정 증폭은 서열화되거나 증폭된 생성물이 예상된 크기를 가지는지, 예상된 제한 소화 패턴(restriction digestion pattern)을 보이는지, 또는 올바르게 복게 뉴클레오티드 서열에 혼성화 되었는지를 보여줌으로써 확인될 수 있다.
또한, 본 발명은 키트를 포함한다. 예를 들어, 키트는 샘플 내에서 혼합물 또는 선택된 효소의 활성(DNA 폴리머라아제로부터의 신호를 간섭하지 않음)을 위한 핵산 분자을 함유하는 기질, 효소 활성에 적합한 조건 하에서 샘플 및 기질을 배양하기 위한 배양 수단, 및 기질 핵산 분자 상에서 혼합물 또는 선택된 효소의 작용에 기인한 핵산 분자의 존재 (및/또는 양)(미생물의 존재에 대한 표시)을 특이적으로 결정하기 위한 수단을 포함할 수 있다. 또한, 이러한 키트는 정상적으로 살균한 체액 내에 미생물의 부재의 존재 및 진단의, 예후의 환자 관리 정보뿐만 아니라 특이적으로 또는 일반적으로 생물에 해당하는 핵산 분자를 증폭하기에 유용한 프라이머를 제공하기 위한 검사를 위해, 본 발명의 신규 방법을 수행하기에 적합한 다른 시약, DNA를 분리하기 위한 완충액 및 시약, 및 PCR을 위한 시약을 포함할 수 있다. 키트는 검출가능하도록 표지된 올리고뉴클레오티드를 더 포함할 수 있으며, 이때 상기 올리고뉴클레오티드는 관심 있는 생물에 해당하는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열에 혼성화한다. 또한, 키트는 함유된 테스트 샘플과 분석되고 비교될 수 있는 일련의 대조군 샘플 또는 대조군 샘플을 함유할 수 있다. 키트의 각 구성 성분은 개별적인 용기 내에 밀봉될 수 있고, 모든 다양한 용기는 키트를 사용하여 수행된 분석의 결과를 해석하기 위한 지시서와 함께 단일 패키지 내에 포함될 수 있다.
또한, 본 발명에 의해 제공된 방법은 본원에서 제공된 원리 및 교시를 활용하는 전체 또는 부분적 미생물 게놈 및/또는 전사체 서열 분석을 수행하는 단계를 더 포함하되, 전체 또는 부분적 미생물 게놈 및/또는 전사체 서열 분석은 본원에 설명된 단일 샘플 제제를 사용하여 일제히 또는 동시에 동시적으로 수행될 수 있다고 인식될 것이다. 또한, 본 발명의 신규한 방법은 항균 활성 및/또는 항-폴리머라아제 활성을 갖는 시제(agents)를 진단 측정하고 검출하기 위해 제공될 수 있으며, 이는 환자의 관리에 유용하다.
본원 전반을 걸쳐서 인용된 모든 참고문헌, 특허 및 공개된 특허 출원서의 내용은, 마치 각각의 개별적인 출판물, 특허 또는 특허 출원서가 구체적으로 그리고 개별적으로 참조로서 포함되는 것으로 의도되도록, 참고로서 본원에 포함된다.
전술한 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용은 이해의 명확성을 위해서 제공되는 것이고, 변형이 통상의 기술자에게 자명하기 때문에, 그로부터 불필요한 제한이 추론되지 않아야 한다. 본원에 제공된 임의의 정보가 선행 문헌 또는 제시된 본 발명에 관련되거나, 구체적으로 또는 함축적으로 참고된 임의의 출판물이 선행 문헌이라고 시인하는 것이 아니다.
특별히 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명의 속하는 당해 분야의 통상의 기술자에 의해 일반적으로 이해되는 의미와 동일한 의미를 갖는다.
본 발명이 구체적으로 설명되지만, 본원의 특정 실시예는 본 발명의 실시예의 구체적 실례의 방식으로 그리고 이해의 명확성의 목적으로 제공된다. 본원에 제시된 본 발명의 교시에 비추어 볼 때, 많은 변화 및 변형은 이러한 실시예에 가해질 수 있어서 본 발명의 사상 또는 범위로부터 벗어나지 않고 설명되는 것으로 당해 분야의 통상의 기술자는 자명할 것이다.
본 발명이 그 특정 실시예와 관련하여 설명되지만, 추가적인 변형이 가능하다고 이해될 것이고, 본원은 일반적으로 본 발명의 원리 및 본 발명과 관련되는 당해 기술분야 내에서 알려지거나 관습적으로 실시되는 범위 안에 있는 본 공개문헌으로부터의 이러한 벗어남을 포함하는, 임의의 변형, 사용 또는 뒤따르는 발명의 개조를 포함하는 것으로 의도되고, 이는 이하에서 제시되고 이어지는 첨부된 청구항의 범위에서 본질적 특징에 적용될 수 있다.

Claims (17)

  1. 샘플 내에 미생물의 존재에 대한 표시로서, 폴리머라아제 활성을 검출하는 방법에 있어서, 상기 방법은:
    (a) 샘플 내에서 폴리머라아제 활성에 대한 기질로서 작용하는 핵산 분자를 샘플과 접촉시키는 단계;
    (b) 접촉시킨 샘플을 폴리머라아제 활성에 적합한 조건 하에서 배양하는 단계; 및
    (c) 미생물의 존재를 표시하기 위해, 기질 핵산 분자 상에 미생물 폴리머라아제의 작용으로 인한 핵산 분자의 존재 (및/또는 양)를 특이적으로 결정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리머라아제 활성을 검출하는 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    폴리머라아제는 DNA 또는 RNA 폴리머라아제 중 어느 하나인 것을 특징으로 하는 폴리머라아제 활성을 검출하는 방법.
  3. 제 1 항에 있어서,
    검출된 미생물은 샘플 내에서 생존가능한 미생물인 것을 특징으로 하는 폴리머라아제 활성을 검출하는 방법.
  4. 제 1 항에 있어서,
    검출된 미생물은 샘플 내에서 온전한 미생물인 것을 특징으로 하는 폴리머라아제 활성을 검출하는 방법.
  5. 제 4 항에 있어서,
    검출된 온전한 미생물은, 그 미생물 내에 핵산 폴리머라아제 유전자 및 그의 번역된 활성 단백질 폴리머라아제가 상기 미생물의 생존에 필수적인 것을 특징으로 하는 폴리머라아제 활성을 검출하는 방법.
  6. 제 1 항에 있어서,
    폴리머라아제 기질은 고정화된 것을 특징으로 하는 폴리머라아제 활성을 검출하는 방법.
  7. 제 1 항에 있어서,
    미생물이 검출되는 샘플은 정상적으로 살균된 체액인 것을 특징으로 하는 폴리머라아제 활성을 검출하는 방법.
  8. 제 1 항에 있어서,
    샘플은 차등 세포 용해 샘플 제조 방법(differential cell lysis sample preparation method)을 사용하여 제조됨으로써, 생존가능한 미생물 유래 폴리머라아제 활성만이 폴리머라아제 특이 기질을 변형하도록 허용하는 것을 특징으로 하는 폴리머라아제 활성을 검출하는 방법.
  9. 제 1 항에 있어서,
    미생물이 검출된 샘플은 조세포 용해물 또는 정제된 세포 분획으로부터 제조되는 것을 특징으로 하는 폴리머라아제 활성을 검출하는 방법.
  10. 제 9 항에 있어서,
    폴리머라아제 활성을 검출하는 방법은 전체 또는 부분적인 미생물 게놈 및/또는 전사체 서열 분석을 수행하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리머라아제 활성을 검출하는 방법.
  11. 제 10 항에 있어서,
    전체 또는 부분적인 미생물 게놈 및/또는 전사체 서열 분석은 단일 샘플 제제를 사용하여 일제히 또는 동시에 동시적으로 수행될 수 있는 것을 특징으로 하는 폴리머라아제 활성을 검출하는 방법.
  12. 제 10 항에 있어서,
    전체 또는 부분적인 미생물 게놈 및/또는 미생물의 전사체 서열 분석은, 환자의 관리에 유용한 항균 활성 및/또는 항-폴리머라아제 활성을 갖는 시제(agents)의 진단 측정 및 검출을 위한 방법을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리머라아제 활성을 검출하는 방법.
  13. 정상적으로 살균한 체액 내에 미생물의 결핍이 있는지 그리고 진단, 예후 환자 관리 정보를 제공하기 위하여 정상적으로 살균한 체액을 검사하기 위해서, 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항의 방법에 유용한 시약을 포함하는 것을 특징으로 하는 분석 키트.
  14. 샘플 내에 미생물의 존재에 대한 표시로서, NAD-의존성 리가아제 또는 포스파타아제 또는 그들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택된 효소를 검출하는 방법에 있어서, 상기 방법은:
    (a) 선택된 효소 또는 혼합물의 샘플 내에서의 효소 활성에 대한 기질로서 작용하지만 DNA 폴리머라아제로부터의 신호를 간섭하지 않는 핵산 분자를 샘플과 접촉시키는 단계;
    (b) 접촉된 샘플을 효소 활성에 적합한 조건 하에서 배양하는 단계; 및
    (c) 미생물의 존재를 표시하기 위해, 핵산 분자 상에 선택된 효소 또는 혼합물의 기질의 작용으로 인한 효소 변형된 핵산 분자의 존재 (및/또는 양)를 특이적으로 검출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 효소를 검출하는 방법.
  15. 제 14 항에 있어서,
    미생물은 선택된 효소 또는 혼합물이 발현되는 (또는 발현된) 것을 특징으로 하는 효소를 검출하는 방법.
  16. 제 14 항 또는 제 15 항에 있어서,
    샘플은 차등 세포 용해 샘플 제조 방법을 사용하여 제조됨으로써, 생존가능한 미생물로부터 유래된 리가아제 및/또는 포스파타아제 활성만이 리가아제 특이 기질을 변형하도록 허용하는 것을 특징으로 하는 효소를 검출하는 방법.
  17. 샘플 내에 미생물의 존재에 대한 표시로서, NAD-의존성 리가아제 또는 포스파타아제 또는 그들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택된 효소를 검출하기 위한 분석을 수행할 수 있는 분석 키트에 있어서, 상기 키트는:
    (a) 선택된 효소 또는 혼합물의 샘플 내에서의 활성을 위한, 또한 DNA 폴리머라아제로부터의 신호를 간섭하지 않는 핵산 분자를 함유하는 기질;
    (b) 효소 활성에 적합한 조건 하에서 샘플 및 기질을 배양하기 위한 배양 수단; 및
    (c) 미생물의 존재에 대한 표시로서, 기질 핵산 분자 상에 선택된 효소 또는 혼합물의 작용으로 인한 핵산 분자의 존재 (및/또는 양)를 특이적으로 결정하기 위한 수단을 포함하는 것을 특징으로 하는 분석 키트.
KR1020127030167A 2010-04-16 2011-04-15 비-정제된 샘플에서 세포 생존력을 결정하는데에 유용한 효소 활성을 측정하기 위한 방법 KR20130094714A (ko)

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