ES2446517T3 - Uso tanto de RD9 como de IS6110 como dianas de ácido nucleico para el diagnóstico de la tuberculosis, y provisión de dianas IS6110 y RD9 combinadas-adaptables - Google Patents

Abstract

Serie de cebadores, que comprende al menos dos pares de cebadores, adecuados para la detección específica y sensible de una micobacteria del complejo de Mycobacterium tuberculosis (MtbC), y/o para la discriminación específica y sensible de Mycobacterium tuberculosis y Mycobacterium canetti por un lado, de las otras cepas de dicho MtbC por otro lado, donde dichos dos pares de cebadores tienen secuencias tales que pueden usarse en combinación en una única ejecución de amplificación ofreciendo aún al mismo tiempo una detección y discriminación específicas y sensibles, donde dichos dos pares de cebadores son un par de cebadores de IS6110 que consiste en un cebador directo de IS61y un cebador inverso de IS6110, y un par de cebadores de RD9 que consiste en un cebador directo de RD9 10 y un cebador inverso de RD9, donde dicho cebador directo de RD9 es un fragmento 5'-terminal de 10 a 18 nucleótidos de la secuencia de la SEC ID Nº 8, partiendo dicho fragmento 5'-terminal del primer nucleótido 5' de dicha SEC ID Nº 8, donde dicho cebador inverso de RD9 es un fragmento 5'-terminal de 10 a 18 nucleótidos de la secuencia que es completamente complementaria de dicha SEC ID Nº 8 sobre la longitud completa de dicha SEC ID Nº 8, partiendo dicho fragmento 5'-terminal del primer nucleótido 5' de dicha secuencia complementaria, donde dicho cebador directo de IS6110 es un fragmento 5'-terminal de 10 a 18 nucleótidos de la secuencia de la SEC ID Nº 2, partiendo dicho fragmento 5'-terminal del primer nucleótido 5' de dicha SEC ID Nº 2, donde dicho cebador inverso de IS6110 es un fragmento 5'-terminal de 10 a 18 nucleótidos de la secuencia que es completamente complementaria de dicha SEC ID Nº 2 sobre la longitud completa de dicha SEC ID Nº 2, partiendo dicho fragmento 5'-terminal del primer nucleótido 5' de dicha secuencia complementaria.

Description

Uso tanto de RD9 como de 156110 como dianas de acido nucleico para el diagnostico de la tuberculosis, y provision de dianas 156110 y RD9 combinadas-adaptables

Campo de la invenci6n

La presente se refiere a la tuberculosis, y mas particularmente al diagnostico de la tuberculosis. El recurso de la invencion hace uso tanto de RD9 como de 156110 como dianas de acido nucleico para el diagnostico de la tuberculosis. La presente invencion permite discriminar notablemente entre especies de Mycobacterium. Por tanto permite un diagnostico preciso, y de este modo proporciona una herramienta ventajosa para la seleccion del tratamiento apropiado. Sumario de la invenci6n La presente invencion se refiere a la tuberculosis, y mas particularmente al diagnostico de la tuberculosis. El recurso de la invencion hace uso tanto de RD9 como de 156110 como dianas de acido nucleico para el diagnostico de la tuberculosis. La presente invencion de este modo proporciona un recurso que esta especificamente adaptado para la deteccion de micobacterias que pertenecen al complejo de Mycobacterium tuberculosis (MtbC). El recurso de la invencion posibilita adicionalmente discriminar M. tuberculosis y M. canetti por un lado, de las otras cepas del MtbC (tal como M. bovis) por otro lado. De acuerdo con una caracteristica ventajosa, la presente invencion proporciona dianas RD9 e 156110 combinadasadaptables, que estan especialmente adaptadas a la aplicacion de una PCR combinada, de modo que dicha deteccion de MtbC y dicha discriminacion de especies puede conseguirse en una unica ejecucion de amplificacion. De acuerdo con la realizacion de PCR combinada, el recurso de la invencion permite ventajosamente la amplificacion de dos dianas de acido nucleico diferentes de forma combinada, concretamente una diana RD9 y una diana 156110. Con el recurso de la invencion, se necesita solamente una unica ejecucion de amplificacion para detectar una micobacteria que pertenece al MtbC, y para discriminar M. tuberculosis y M. canetti por un lado, de las otras cepas del MtbC por otro lado. El recurso de la invencion tambien tiene la ventaja de ser de rendimiento rapido y fiable: los resultados pueden estar disponibles el mismo dia que el dia de la recogida de la muestra del paciente. Adicionalmente es especifico, sensible y fiable. Antecedentes de la invenci6n La Organizacion Mundial de la 5alud estima que un tercio de la poblacion global esta infectada con bacilos de tuberculosis, y que el 5-10% de las personas que estan infectadas con bacilos de tuberculosis (pero no estan infectados con V1H) llegan a estar enfermos o a ser infecciosos en algun momento durante su vida. 5e estima que se produjeron 1,75 millones de muertes por tuberculosis en 2003. El V1H y los bacilos de tuberculosis adicionalmente forman una combinacion letal, acelerando cada uno el progreso del otro. Las cepas que son resistentes de forma natural a un farmaco anti-tuberculosis se han documentado en cada pais estudiado. Por ejemplo, M. bovis es resistente de forma natural a pirazidamida. Ademas, han surgido cepas de bacilos de tuberculosis que desarrollaron una resistencia a farmacos anti-tuberculosis principales principalmente debido a un cumplimiento discontinuo, parcial o irregular del tratamiento medico. Una forma particularmente peligrosa de tuberculosis resistente a farmacos es la tuberculosis resistente a multiples farmacos, que se define como la enfermedad causada por los bacilos de tuberculosis resistentes a al menos isoniazida y rifampicina, los dos farmacos anti-tuberculosis mas potentes. Las tasas de tuberculosis resistente a multiples farmacos son elevadas en algunos paises, especialmente en la antigua Union 5ovietica, y amenazan los esfuerzos del control de la tuberculosis. Los bacilos que causan la tuberculosis en mamiferos (seres humanos y/o animales) son micobacterias que estan agrupadas dentro de lo que se conoce como el complejo de Mycobacterium tuberculosis (MtbC). El complejo de Mycobacterium tuberculosis comprende notablemente las siguientes micobacterias: Mycobacterium africanum, Mycobacterium bovis (incluyendo el BCG-Bacilo de Calmette-Guerin-M. bovis atenuado), Mycobacterium canetti, Mycobacterium caprae, Mycobacterium microti, Mycobacterium pinnipedii, Mycobacterium tuberculosis. Las micobacterias agrupadas en el complejo de Mycobacterium tuberculosis se caracterizan por una similitud del 99,9% a nivel de nucleotidos y secuencias identicas de ARNr 165. A pesar del grado inusualmente elevado de conservacion en sus genes constitutivos, las micobacterias del complejo de Mycobacterium tuberculosis difieren ampliamente en terminos de tropismo de hospedador, fenotipos, y patogenicidad. Algunos son patogenos exclusivamente humanos (M. tuberculosis, M. africanum, M. canetti), algunos son patogenos exclusivamente de roedores (M. microti), mientras que otras pueden tener un amplio espectro de hospedador (M. bovis, M. caprae). M. bovis y M. caprae pueden causar enfermedad en un amplio intervalo de animales domesticos o salvajes como ganado bovino y cabras, asi como en seres humanos. 5e ha informado de que M. microti infecta a roedores pequefos como topillos y mas recientemente tambien seres humanos (Niemann et al., 2000 Emerg. 1nfect. Dis. 6: 539-542; Kubica et al., 2003, J. Clin. Microbiol. 41 3070-3077.). Parece que M. pinnipedii es el huesped natural para focas, aunque el organismo tambien es patogenico en cobayas, conejos, seres humanos, dantas (Tapirus terrestres) y, posiblemente, ganado bovino (Cousin et al., 2003, 1nt. J. 5yst. Evol. Microbiol. 53, 1305-1314).

5e han identificado catorce regiones de diferencia, que varian en tamafo de 2 a 12,7 kb, que estan ausentes de BCG de M. bovis, pero presentes en el genoma de M. tuberculosis H37Rv. 5e mencionan como RD1 a RD14 (vease Gordon et al. 1999, Mol. Microbiol. 32, 643-655; Behr et al. 1999, 5cience 284, 1520-1523). La nomenclatura RD que se usa en este documento es la de Brosch et al. (Brosch et al.2000, Molecular Genetics of Mycobacteria, eds. Hatfull, G.F., y Jacobs, W.R., Jr. (Am. 5oc. Microbiol., Washington, DC), pag. 19-36). Diez de dichas catorce regiones RD BCG-H37Rv+ estan altamente conservadas entre las cepas de M. tuberculosis, con relacion a otros miembros del complejo de Mycobacterium tuberculosis (RD1, RD2, RD4, RD7, RD8, RD9, RD10, RD12, RD13, RDM; Brosch et al. 2002, PNA5 U5A, 99(6), 3684-3689).

5e han descrito seis regiones que estan ausentes del genoma de M. tuberculosis H37Rv, con relacion a otros miembros del complejo de Mycobacterium tuberculosis:

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cinco deleciones relacionadas con H37Rv, mencionadas como RvD1 a RvD5, y

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la region conocida como delecion 1 especifica de M. tuberculosis (TbD1),

(Gordon et al. 1999, Mol. Microbiol. 32, 643-655; Brosch et al. 1999, 1nfect. 1mmun. 67, 5768-5774).

TbD1 se identifico originalmente como una region de 2.153-pb que estaba especificamente ausente del gen mmpL6 de casi todas las cepas de M. tuberculosis (Brosch et al. 2002, PNA5 U5A 99:3684-3689). En base a la presencia o ausencia de la region TbD1, las cepas de M. tuberculosis pueden dividirse en tipos quot;ancestralesquot; y quot;modernosquot;, respectivamente. Las cepas de Beijing, Haarlem y Africana responsables de las mayores epidemias son tipos modernos(Kremer etal. 1999, J. Clin. Microbiol. 37, 2607-2618; Brosch et al. 2002, PNA5 U5A, 99(6), 3684-3689).

Los signos clinicos y sintomas de tuberculosis no son suficientemente especificos para constituir en si y por si mismos un diagnostico fiable de tuberculosis.

Por lo tanto se realiza el diagnostico a traves del analisis de micobacterias de una muestra biologica, pretendido para detectar la presencia o ausencia de una micobacteria que pertenezca al MtbC.

5e han utilizado diversas caracteristicas micobacterianas biologicas y moleculares para identificar aislados de MtbC.

Tradicionalmente se ha usado una serie de ensayos clasicos basados en propiedades de crecimiento, fenotipicas y bioquimicas para segregar los miembros del MtbC (Haas et al. 1997, J. Clin. Microbiol. 35, 663-666; Niemann et al. 2000, J. Clin. Microbiol. 38, 3231-3234).

5in embargo, estos ensayos pueden ser lentos, engorrosos, imprecisos, no reproducibles, y tardar mucho tiempo. Adicionalmente pueden no dar un resultado inequivoco en todos los casos, impidiendo de este modo su uso como herramienta de diagnostico para la tuberculosis.

Las herramientas actuales de deteccion para el diagnostico de la tuberculosis comprenden notablemente:

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microscopia (observacion directa y/o tincion celular),

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cultivo celular,

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un kit Gen-Probe®.

Las micobacterias son bastoncillos pleomorficos no moviles. Las colonias de M. bovis aparecen uniformes y disgenicas (es decir, colonias pequefas), mientras que las colonias de M. tuberculosis son desiguales y eugenicas (es decir, colonias grandes). La observacion directa de las colonias bacterianas es, sin embargo, no muy especifica. Ni es muy sensible, ya que la muestra contendra una concentracion relativamente elevada de celulas micobacterianas (gt;104/ml).

Los organismos que pertenecen al genero Mycobacterium tienen una envuelta celular unica que contiene acidos micolicos y tiene elevado contenido de lipidos. Como las celulas son hidrofobas y tienden a agregarse juntas, son impermeables a los tintes habituales, tal como la tincion Gram. 5e conocen como quot;bacilos acido-resistentes) porque su envuelta celular rica en lipidos, que es relativamente impermeable a diversos colorantes basicos salvo que los colorantes se combinen con fenol. Una vez tefidas, las celulas resisten a la decoloracion con disolventes organicos acidificados, y por lo tanto se llaman quot;acido-resistentesquot;. Actualmente, se usan dos tipos de colorantes acidoresistentes en laboratorios de micobacteriologia clinica. Un tipo es carbolfucsina (metodos de Ziehl-Neelsen [ZN] o Kinyoun), y el otro es fluorocromo (auramina o auramina-rodamina). Como elemento caracteristico, retienen coloracion con fucsina o auramina despues de tratamiento sucesivo o simultaneo con acido y alcohol.

Aunque la especificidad de la microscopia acido-resistente es excelentes para especies micobacterianas, la sensibilidad no es optima. La sensibilidad de la microscopia esta influida por numerosos factores, tales como la prevalencia y gravedad de la enfermedad, el tipo de muestra, la calidad de la recogida de muestras, la cantidad de micobacterias presentes en la muestra, el metodo de procesamiento (directo o concentrado), el metodo de centrifugacion, la tecnica de tincion, y la calidad del examen. 5e recomienda que se informe de un resultado negativo solamente despues del examen de al menos 100 (en paises de bajos ingresos) y preferiblemente 300 (en paises industrializados) campos visuales por inmersion microscopica (o campos visuales fluorescentes equivalentes). Por lo tanto, cuando se realiza la microscopia correctamente, puede llevar mucho tiempo y ser laboriosa. Los falsos negativos debido a fatiga tambien pueden contribuir a una sensibilidad disminuida.

Las micobacterias son bacilos de crecimiento lento, con un tiempo de generacion habitual de 12 a 18 horas. Las colonias habitualmente llegan a ser visibles solamente despues de un tiempo de incubacion de 3 semanas a 10 semanas. Las muestras que contienen una baja concentracion de celulas micobacterianas adicionalmente necesitan varios subcultivos. El cultivo de micobacterias en medios especificos es una tecnica que permite la identificacion de la especie particular de Mycobacterium contenida en la muestra biologica. 5in embargo, consume mucho tiempo, especialmente para aquellos pacientes que estan solamente en el inicio del proceso infeccioso.

5e han desarrollado ensayos de hibridacion de acidos nucleicos para detectar micobacterias en una muestra biologica. Los primeros ensayos utilizaban hibridacion directa de sondas. 5in embargo, la concentracion en celulas de Mycobacterium contenidas en una muestra recogida de un paciente es habitualmente demasiado baja para dar una sefal de hibridacion positiva. Por lo tanto se han desarrollado ensayos que utilizan amplificacion por PCR. Por ejemplo, el kit Gen-Probe® comercializado como kit quot;de ensayo directo de Mycobacterium tuberculosis Amplified™quot;, o kit de ensayo MTD, (Gen-Probe 1nc., 5an Diego, California 92121, Estados Unidos) utiliza la amplificacion de ARNr especifico de MtbC (Amplificacion Mediada por Transcripcion), seguido por deteccion del amplicon de acuerdo con el metodo Gen-Probe HPA (Ensayo de Proteccion de Hibridacion). Un ensayo MTD positivo indica que la muestra contiene micobacterias del MtbC. Debido a problemas de inhibicion, y a una sensibilidad insuficiente, un ensayo MTD negativo sin embargo no excluye la posibilidad de aislar un organismo MtbC de la muestra. El ensayo MTD no discrimina adicionalmente entre las diversas especies de Mycobacterium; y mas particularmente no discrimina M. bovis de M. tuberculosis. El diagnostico de la tuberculosis esta complicado adicionalmente por el hecho de que aquellas personas que reciben vacunacion con BCG son positivas a M. bovis (por ejemplo, sus muestras de orina son positivas a M. bovis). Por tanto, una persona puede ser positiva a M. bovis, sin ser un portador de tuberculosis. En estas circunstancias, es de vital importancia detectar si la muestra biologica contiene una micobacteria de MtbC que no sea M. bovis, y mas particularmente que sea M. tuberculosis.

Por tanto, existe la necesidad de una herramienta de diagnostico que sea aplicable a muestras originarias de mamiferos, y mas particularmente de seres humanos, que pudiera discriminar M. tuberculosis de las otras cepas principales de MtbC, y mas particularmente de M. bovis. Existe la necesidad de un ensayo de diagnostico MtbC mas rapido y fiable, y preferiblemente para un diagnostico rapido y fiable de si la muestra biologica es susceptible de contener una micobacteria que pertenezca al MtbC, que no sea M. bovis (MtbC+Mb-), mas preferiblemente un diagnostico rapido y fiable de si la muestra biologica es susceptible de contener celulas de M. tuberculosis (Mt+), o si no contiene celulas de M. tuberculosis (Mt-). La presente invencion proporciona dicho ensayo y herramientas. El recurso de la invencion esta especialmente adaptado a la amplificacion, especialmente a la amplificacion por PCR, y como caracteristica ventajosa, a PCR combinada. De acuerdo con la realizacion de PCR combinada de la presente invencion, pueden amplificarse dos dianas diferentes de acido nucleico en combinacion, es decir, en una unica ejecucion de amplificacion: una diana se selecciona apropiadamente en 156110, y la otra diana se selecciona apropiadamente en RD9.

156110 y RD9 son conocidas para los especialistas en la tecnica. Las secuencias 156110, por ejemplo, se han descrito en el documento EP 0 490 951 B1 (U5 5.597.911; U5 5.807.672; U5 5.837.455) y en el documento EP 0 461 045 B1 (U5 5.776.693), en el nombre del 1N5T1TUT PA5TEUR. La secuencia 156110 de M. tuberculosis H37Rv (156110 secuencia de referencia) esta disponible con el numero de acceso X17348 M29899. Las secuencias de RD9 se han descrito, por ejemplo, en el documento WO 00/55632 en el nombre del 1N5T1TUT PA5TEUR (documento EP 1161562 A1; y solicitud o solicitudes de patente homologas estadounidenses). La secuencia RD9 de M. tuberculosis H37Rv (RD9 secuencia de referencia) comprende las secuencias cobL, Rv2073c, Rv 2074 y Rv2075c. La secuencia RD9 de M. tuberculosis H37Rv corresponde a la secuencia que se extiende desde la posicion 250.271 a la posicion 254.176 de la secuencia del genoma de M. tuberculosis H37Rv, que esta disponible con el numero de acceso BX842578 (segmento 7/13 del genoma de M. tuberculosis H37Rv).

Z1NK A. R. et al. (quot;Molecular strain identification of the Mycobacterium tuberculosis complex in archival tissue samples.quot; JOURNAL OF CL1N1CAL PATHOLOGY, vol. 57, n° 11, noviembre de 2004, paginas 1185-1192) describe un metodo para detectar una micobacteria del MtbC, caracterizado por que comprende la deteccion de dos secuencias de acido nucleico diana. En particular, todas las muestran se ensayaron para la presencia de ADN del complejo de M. tuberculosis mediante la amplificacion de un fragmento de 123 pb de la secuencia de insercion 156110. La perdida de la region de diferencia 9 (RD9) tambien se considero.

A conocimiento del solicitante, ninguna tecnica previa desvela recursos que serian apropiados para la deteccion de 156110 y RD9 en PCR combinada; y ninguna tecnica previa desvela las subsecuencias 156110 y RD9 seleccionadas como dianas combinadas-adaptables de acuerdo con la presente invencion (por ejemplo, 5EC 1D N° 2 y 5EC 1D N° 8 de la presente invencion).

El recurso de la invencion esta especialmente adaptado para la provision de informacion micobacteriana muy detallada y precisa en una unica ejecucion de amplificacion. La invencion de este modo proporciona un medio rapido, fiable, especifico y sensible para el diagnostico de la tuberculosis. Por tanto el diagnostico puede ser rapido y preciso, lo que es inmediato beneficio para el paciente. El recurso de la invencion tambien puede usarse como herramienta para evaluar si un tratamiento medico particular puede tener, o esta teniendo algun efecto positivo contra la infeccion. Como discrimina M. tuberculosis de las otras cepas principales de MtbC, y mas particularmente M. tuberculosis de M. bovis, el recurso de la invencion posibilita adicionalmente tener en cuenta la resistencia a los farmacos anti-tuberculosis y adicionalmente evitar la administracion de tratamientos inapropiados. Evita adicionalmente el desarrollo consecuente de bacilos resistentes.

Breve descripci6n de las figuras

La Figura 1 muestra una subsecuencia de RD9 de M. tuberculosis H37RV (secuencia Rv2075c de 1464 nucleotidos; 5EC 1D N° 19), y, en caracteres en negrita, la secuencia de la 5EC 1D N°7 de la invencion (posiciones 351-600 dentro de Rv2075c). La secuencia la diana RD9 de la 5EC 1D N° 8 de la invencion (posiciones 390-561 dentro de Rv2075c) se muestra en caracteres en negrita y subrayados. La Figura 2 muestra la secuencia 156110 de M. tuberculosis H37RV (1360nt; 5EC 1D N° 20). La subsecuencia de la 5EC 1D N° 1 (posiciones 361-600), seleccionada dentro de 156110 de acuerdo con la presente invencion se muestra en caracteres en negrita. La secuencia de la diana 156110 de la 5EC 1D N° 2 de la invencion (posiciones 372-572) se muestra en caracteres en negrita y subrayados.

Descripci6n detallada de la invenci6n

En la presente solicitud, cada uno de dicho Mycobacterium africanum, Mycobacterium bovis, Mycobacterium canetti, Mycobacterium caprae, Mycobacterium microti, Mycobacterium pinnipedii, y Mycobacterium tuberculosis se entiende como constituyendo una especie distinta desde un punto de vista de nomenclatura. M. bovis comprende M. bovis, asi como el BCG de M. bovis atenuado (por ejemplo, M. bovis Pasteur, o M. bovis Tokio) que derivan de M. bovis. Como se demuestra por una bibliografia extensiva en el campo, cada una de dichas especies es conocido por los especialistas en la tecnica (vease, por ejemplo, Kremer et al. 1999, J.Clin. Microbiol. 37, 2607-2618; Goh et al. 2001,

J. Clin. Microbiol. 39, 3705-3708; Van 5oolingen et al. 1998, J. Clin. Microbio. 36, 1840-1845).

Las cepas ilustrativas comprenden notablemente:

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ATCC 27294, ATCC 25177, ATCC 51910 para M. tuberculosis,

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ATCC 25420, ATCC 35711 para M. africanum (subtipo 1),

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ATCC 19422, ATCC 35782, ATCC 11152 para M. microti,

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ATCC 19210, ATCC 35725, ATCC 35726, ATCC 35730 para M. bovis,

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ATCC 27290, ATCC 35736, ATCC 35737 para BCG de M. bovis,

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La cepa C1P 105776 de M. caprae disponible en la 1nstitut Pasteur Collection (o disponible en la ATCC con el numero ATCC BAA 824).

ATCC es: American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard Manassas, Virginia 20110-2209. La 1nstitut Pasteur Collection o C1P (lt;Collection de 1'lnstitut Pasteur») es: Collection de 1'lnstitut Pasteur, 1nstitut Pasteur, 25-28 rue du Docteur Roux, F-75724 Paris Cedex 15, Francia. La presente invencion resulta de la seleccion apropiada y uso de dos acidos nucleicos micobacterianos, concretamente RD9 e 156110. 156110 y RD9 son conocidos para los especialistas en la tecnica. 156110 es un elemento tipo 15, que consta de 1360 nucleotidos en la cepa de referencia de M. tuberculosis H37Rv. La secuencia 156110 de M. tuberculosis H37Rv esta disponible con el numero de acceso X17348 M29899. RD9 es una region de diferencia, que consta de 1464 nucleotidos en la cepa de referencia de M. tuberculosis H37Rv. La secuencia RD9 de M. tuberculosis H37Rv corresponde a las posiciones 250.271-254.176 de la secuencia del genoma de M. tuberculosis H37Rv, que esta disponible con el numero de acceso BX842578 (segmento 7/13 del genoma de M. tuberculosis H37Rv).

El uso tanto de RD9 como de 156110 de acuerdo con la presente invencion permite la discriminacion de M. tuberculosis y M. canetti por un lado, de las otras cepas del MtbC, y mas particularmente de M. bovis, por otro lado. El uso tanto de RD9 como de 156110 permite:

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detectar una micobacteria del MtbC.

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discriminar M. tuberculosis y M. canetti por un lado, de las otras cepas del MtbC por otro lado.

La presente invencion se refiere al uso tanto de RD9 como de 156110 como dianas de acido nucleico, para la deteccion especifica y sensible de una micobacteria del complejo de Mycobacterium tuberculosis (MtbC), y/o para la discriminacion especifica y sensible de Mycobacterium tuberculosis y Mycobacterium canetti por un lado, de las otras cepas de dicho MtbC por otro lado.

5 La presente invencion se refiere al uso tanto de RD9 como de 156110 como dianas de acido nucleico, para el diagnostico in vitro de la tuberculosis. La presente invencion por tanto se refiere al uso tanto de:

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al menos un par de cebadores de amplificacion o sonda de hibridacion dirigidos a 156110, y 10 -al menos un par de cebadores de amplificacion o sonda de hibridacion dirigidos a RD9,

para la deteccion especifica y sensible de una micobacteria del complejo de Mycobacterium tuberculosis (MtbC), y/o para la discriminacion especifica y sensible de Mycobacterium tuberculosis y Mycobacterium canetti por un lado, de las otras cepas de dicho MtbC por otro lado. Dicho uso es apropiado para el diagnostico in vitro de la tuberculosis.

15 Preferiblemente, dicho al menos un par de cebadores de amplificacion o sonda de hibridacion dirigidos a 156110 es un par de cebadores de amplificacion o sonda de hibridacion especifico de 156110, y dicho al menos un par de cebadores de amplificacion o sonda de hibridacion dirigido a RD9 es un par de cebadores de amplificacion o sonda de hibridacion especifico de RD9. Por par de cebadores o sonda especifica, en este documento se entiende un par de cebadores o sonda que no reacciona de forma cruzada con ningun acido nucleico micobacteriano diferente a su

20 diana (156110 o RD9), y que preferiblemente no reacciona de forma cruzada con ningun acido nucleico humano.

El recurso de la invencion esta especialmente adaptado para la amplificacion, y mas particularmente para la amplificacion por PCR. Como caracteristica ventajosa, el recurso de la invencion esta especialmente adaptado a PCR combinada. La presente invencion por tanto se refiere al uso tanto de RD9 como de 156100 como dianas de

25 acido nucleico, donde dichos 156110 y RD9 se abordan en una PCR combinada. De acuerdo con la realizacion de PCR combinada de la invencion, se abordan dos dianas diferentes de acido nucleico para amplificacion en combinacion, es decir, en una unica ejecucion de amplificacion: una diana se selecciona apropiadamente dentro del acido nucleico 156110, y la otra diana se selecciona apropiadamente dentro del acido nucleico RD9.

30 Las dianas de acido nucleico Rd9 e 156110 especificas seleccionadas de acuerdo con la presente invencion posibilitan:

-

detectar una micobacteria del MtbC,

-

discriminar M. tuberculosis y M. canetti por un lado, de las otras cepas del MtbC por otro lado, y

35 -disefar cebadores que puedan usarse en combinacion, es decir, cebadores que sigan siendo especificos y sensibles incluso cuando se usan en una unica ejecucion de amplificacion combinada.

De acuerdo con la presente invencion, cuando se ensaya una muestra biologica para la presencia (+) o ausencia (-) de RD9 y de 156110, una respuesta RD9- 156110+ significa que la muestra contiene una micobacteria del complejo

40 de Mycobacterium tuberculosis, que no es M. tuberculosis (es decir, MtbC+ Mt-). Cualquier otra respuesta RD9 156110, excepto RD9-156110-, significa que la muestra contiene una micobacteria del complejo de Mycobacterium tuberculosis, que es M. tuberculosis o M. canetti (es decir, MtbC+ y (Mt+ o canetti+)).

Tabla 1:

Resultado de ensayo (presente invencion)

5ignificado (presente invencion)

RD9-156110+

micobacteria del complejo de Mycobacterium tuberculosis, que no es M. tuberculosis

RD9+ 156110+

micobacteria del complejo de Mycobacterium tuberculosis, que es M. tuberculosis o M. canetti

RD9+ 156110

micobacteria del complejo de Mycobacterium tuberculosis, que es M. tuberculosis

RD9- 156110

no una micobacteria del complejo de Mycobacterium tuberculosis

45 La presente invencion proporciona adicionalmente un diagnostico detallado en la especie M. tuberculosis:

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una respuesta RD9+ 156110-significa que la muestra biologica contiene una cepa ancestral de M. tuberculosis, y

-

una respuesta RD9+ 156110+ significa que la muestra biologica contiene una cepa de tipo moderno de M. tuberculosis, o la muy rara M. canetti.

50 La invencion por lo tanto discrimina cepas ancestrales de M. tuberculosis de cepas de tipo moderno de M. tuberculosis, y evita el problema de resultados falsos negativos, que en la tecnica previa a veces se encontraban cuando se usaba 156110 como unico marcador.

Tabla 2:

Resultado de ensayo (presente invencion)

5ignificado (presente invencion)

RD9+ 156110-

M. tuberculosis ancestral

RD9+ 156110+

M. tuberculosis tipo moderno, o M. canetti

Las cepas ancestrales en este documento se definen como cepas de M. tuberculosis TbD1+, mientras que las cepas modernas de M. tuberculosis se definen como cepas de M. tuberculosis TbD1-. La secuencia de los genes mmpS6 y mmpL6 de la cepa ancestral de M. tuberculosis n° 74 que contiene la region

5 TbD1 se deposito en la base de datos EMBL con el numero de acceso AJ426486 (las 2.153 pb de TbD1 se extienden desde la posicion 340 a la posicion 2492 de AJ426486). El metodo de PCR y los cebadores de TbD1 descritos en Brosch et al. 2002, PNA5 U5A 99:3684-3689 pueden usarse para evaluar si TbD1 esta presente o ausente de una muestra biologica; vease la Tabla 1 en el material de apoyo de dicha publicacion de Brosch et al., que describe los cebadores TbD1int5.F y TbD1int5.R (CGT TCA ACC CCA AAC AGG TA -5EC 1D N° 15 -y AAT CGA ACT CGT GGA ACA CC -5EC 1D N° 16 -, respectivamente), y los cebadores TBD1fla1-f y TBD1fla1-R (CTA CCT CAT CTT CCG GTC CA -5EC 1D N° 17 -y CAT AGA TCC CGG ACA TGG TG - 5EC 1D N° 18 -, respectivamente).

Ejemplos de cepas de M. tuberculosis de tipo moderno comprenden notablemente el aislado de M. tuberculosis

15 H37Rv, y el aislado de M. tuberculosis H37Ra. El genoma completo del aislado de M. tuberculosis H37Rv se ha secuenciado (Cole et al. 1998, Nature, 393, 537544). La secuencia tambien esta disponible en el 1D MTBH37RV, numero de accesoAL123456. TbD1 (delecion especifica 1 de M. tuberculosis) esta ausente de aproximadamente el 87% de las cepas de M. tuberculosis, incluyendo cepas representativas de las epidemias principales tales como los grupos Haarlem, Beijin y Africa (Kremer et al. 1999, J. Clin. Microbiol. 37, 2607-2618; Brosch et al. 2002, PNA5 U5A, 99(6), 3684-3689).

M. canetti tiene una rara prevalencia entre pacientes humanos que muestran sintomas tipo tuberculosis. Por tanto, una respuesta RD9+ 156110+ muy frecuentemente indicara MtbC+ y Mt+ (es decir, una micobacteria del complejo de Mycobacterium tuberculosis, que es M. tuberculosis).

25 5i, no obstante, se deseara discriminar entre la presencia de M. tuberculosis (es decir, Mt+) y la presencia de M. canetti (es decir, canetti+), estan disponibles medios apropiados para los especialistas en la tecnica.

De hecho, M. canetti es muy rara, una variante uniforme de M. tuberculosis, y habitualmente se aisla de pacientes de, o con conexion con, Africa. Aunque comparte secuencias identicas de ARNr 165 con los otros miembros del complejo de M. tuberculosis, y contiene todas las regiones RD RvD, asi como la region TbD1, las cepas de M. canetti difieren en muchos aspectos, incluyendo polimorfismos en ciertos genes constitutivos, el numero de copias de 151081, la morfologia de las colonias, y el contenido de lipidos de la pared celular, y notablemente:

i. M. canetti ha demostrado portar 26 secuencias espaciadoras unicas en la region DR que ya no estan presentes en ningun otro miembro del complejo de M. tuberculosis (Van Embden et al. 2000, J. Bacteriol. 182, 2393-2401);

ii. M. canetti puede caracterizarse por la ausencia de una region RDcan especifica, descrita en Brosch et al. 2002, PNA5 U5A, 99(6), 3684-3689, que solapa parcialmente con RD12, y a veces tambien se menciona como delecion RD12-can. La secuencia de delecion de RD12-can del aislado de M. canetti 14000059, con relacion al genoma de M. tuberculosis H37Rv, se deposito en la base de datos EMBL con el numero de acceso AJ583833.;

iii. M. canetti puede caracterizarse por la presencia de una unica copia de la secuencia de insercion 151081 (151081 de M. bovis esta disponible con el numero de acceso X61270);

45 iv. Las celulas de M. canetti forman colonias uniformes, mientras que las celulas de M. tuberculosis forman colonias desiguales.

Por tanto, en cualquier situacion en que los especialistas en la tecnica quisieran discriminar M. tuberculosis de M. canetti, puede usarse una cualquiera de, o varias caracteristicas de i a iv.

En resumen:

Tabla 3:

Compleio de M�cobacterium tuberculosis

TbD1

RD9 IS6110

M. tuberculosis

Ancestral (familia de Africa oriental - 1ndia) + + -

Moderna (familia de America Latina y Mediterranea)

- + +

M. africanum

+ - +

Compleio de M cobacterium tuberculosis

TbD1

RD9 IS6110

M. bovis

+ - +

M. bovis - BCG

+ - +

M. canetti

+ + +

M. caprae

+ - +

M. microti

+ - +

M. pinnipedii

+ - +

Los patrones mostrados en la anterior Tabla 3 son los tipicos, es decir, los observados en la inmensa mayoria de, sino todas, las cepas que pertenecen a las especies indicadas.

5 Las dianas de acido nucleico seleccionadas dentro de dichos acidos nucleicos RD9 e 156110 se proporcionan adicionalmente. Estas dianas de acido nucleico RD9 e 156110 seleccionadas tienen un nivel mucho mayor de especificidad, necesario para aplicaciones de diagnostico: su deteccion indica fiablemente que estan presentes acidos nucleicos RD9 e 156110 en la muestra ensayada, sin confusion con cualquier otro acido nucleico, ya sea de

10 origen microbiano o mamifero. Estas dianas seleccionadas permiten de forma ventajosa disefar cebadores que puedan usarse en combinacion (es decir, en la misma ejecucion de amplificacion), permaneciendo aun muy sensibles y muy especificos.

Dichos cebadores no conducen a hibridacion cruzada, reteniendo de este modo la especificidad requerida, y 15 permaneciendo tan sensibles como una UFC de micobacteria por muestra (vease el siguiente ejemplo).

Las dianas de acido nucleico RD9 e 156110 seleccionadas tienen la secuencia:

-

de la 5EC 1D N° 2 para la diana 156110, o la secuencia que es completamente complementaria a la misma sobre 20 la longitud completa de dicha 5EC 1D N° 2,

-

de la 5EC 1D N° 8 para la diana RD9, o la secuencia que es completamente complementaria a la misma sobre la longitud completa de dicha 5EC 1D N° 8.

La diana 156110 de la 5EC 1D N° 2 es un fragmento de 156110 de M. tuberculosis H37Rv (numero de acceso 25 X17348 M29899), desde la posicion 372 a 572 (posiciones de inicio y final incluidas):

372 cagcacgct aattaacggt tcatcgccga tcatcagggc caccgcgagg421 gccccgatgg tttgcggtgg ggtgtcgagt cgatctgcac acagctgacc gagctgggtg481 tgccgatcgc cccatcgacc tactacgacc acatcaaccg ggagcccagc cgccgcgagc

30 541 tgcgcgatgg cgaactcaag gagcacatca gc

(= SEC ID N° 2 = de 372 a 572)

La diana RD9 de la 5EC 1D N° 8 es un fragmento de RD9 de M. tuberculosis H37Rv. La secuencia RD9 del genoma de M. tuberculosis H37Rv se extiende desde la posicion 250.271 hasta la posicion 254.176 de la secuencia de

35 H37Rv disponible con el numero de acceso BX842578. La secuencia RV2075c, que esta contenida dentro de la secuencia RD9 de M. tuberculosis H37Rv, se extiende desde la posicion 252.713 hasta la posicion 254.176 de la secuencia de H37Rv disponible con el numero de acceso BX842578. La diana RD9 de la 5EC 1D N° 8 se extiende desde la posicion 390 a 561 (posiciones de inicio y final incluidas) de dicha secuencia Rv2015c, concretamente:

40 390 t aagcgcctgc401 ggattggccg gtggacgggt cgggttggcc aacgccgtgg ccagcgtgga 451 gtcctcgtaa tagcggacca gtcgccaagc gtagacaccg cggccatagg501 tggcatcgca ggccgggtat ggccggtagc cggagttcga gccgctttcc551 agctcaacgc c

45 (= SEC ID N° 8 = de390a 561)

La presente divulgacion por tanto se refiere a una serie de dos polinucleotidos adecuados para su uso como secuencias molde de referencia en el disefo de cebadores que puedan usarse en combinacion en una unica ejecucion de amplificacion para detectar una micobacteria del complejo de Mycobacterium tuberculosis (MtbC), y/o 50 para discriminar Mycobacterium tuberculosis y Mycobacterium canetti por un lado, de las otras cepas de dicho MtbC por otro lado, donde uno de dichos dos polinucleotidos molde de referencia es un fragmento de RD9, siendo el otro un fragmento de 156110, donde dicho fragmento de 156110 consiste en la secuencia de la 5EC 1D N° 2, o en la secuencia que es completamente complementaria a la 5EC 1D N° 2 sobre la longitud completa de la 5EC 1D N° 2, y donde dicho fragmento de RD9 consiste en la secuencia de la 5EC 1D N° 8, o la secuencia que es completamente

55 complementaria a la 5EC 1D N° 8 sobre la longitud completa de la 5EC 1D N° 8.

Dicho fragmento de 156110 ventajosamente es el fragmento que se extiende desde la posicion 372 hasta 572 de la secuencia 156110 de la cepa de M. tuberculosis H37Rv, incluidas las posiciones de inicio y final (la secuencia de 156110 de M. tuberculosis H37Rv esta disponible con el numero de acceso X17348 M29899). Dicho fragmento de RD9 ventajosamente es el fragmento que se extiende desde la posicion 390 hasta 561 de ka secuencia RD9 de la cepa de M. tuberculosis H37Rv, incluidas las posiciones de inicio y final (la secuencia del segmento 7/13 del genoma de M. tuberculosis H37Rv esta disponible con el numero de acceso BX842578; RD9 corresponde a las posiciones 252.713-254.176 de esta secuencia).

Los cebadores disefados a partir de dichas secuencias molde de referencia de modo que puedan conducir la amplificacion de dicha diana 156110 seleccionada de la 5EC 1D N° 2, y la amplificacion de dicha diana RD9 seleccionada de la 5EC 1D N° 8, pueden usarse en combinacion en una unica ejecucion de amplificacion ofreciendo aun al mismo tiempo una deteccion y discriminacion especificas y sensibles.

La presente divulgacion tambien se refiere a cada una de dichas secuencias molde de referencia individualmente, es decir, a un polinucleotido adecuado para su uso como secuencia molde de referencia en el disefo de cebadores que puedan usarse en combinacion en una unica ejecucion de amplificacion para detectar una micobacteria del complejo de Mycobacterium tuberculosis (MtbC), y/o para discriminar Mycobacterium tuberculosis y Mycobacterium canetti por un lado, de las otras cepas de dicho MtbC por otro lado, donde dicho polinucleotido molde de referencia se selecciona entre dicha serie de dos polinucleotidos.

La presente invencion de este modo proporciona cebadores de amplificacion y sondas especificas y sensibles que siguen siendo sensibles y especificas cuando se usan en combinacion, y que posibilitan de este modo conseguir dicha deteccion de MtbC y dicha discriminacion de especies en una unica ejecucion de amplificacion. Estos cebadores y sondas ventajosamente se disefan por referencia a dichas dianas 156110 y RD9.

Los metodos de amplificacion, especialmente la reaccion en cadena de la polimerasa (PCR) y metodos basados en PCR son conocidos en la tecnica (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Maniatis, Fritsch, y 5ambrook, C5HL Press; Molecular Biology of the Cell, Alberts et al.; PCR Primer: A Laboratory Manual, Dieffenbach y Dveksler, C5HL Press; The Polymerase Chain Reaction, Mullis, Ferre, y Gibbs, Birkhauser Boston Press; Gene quantification, Ferre, Birkhauser Boston Press.)

La presente invencion describe acidos nucleicos (oligonucleotidos y polinucleotidos) que estan especialmente adaptados para la implementacion de una PCR combinada sobre una muestra biologica, y mas particularmente de una PCR al menos doble (dos dianas, es decir, 156110 y RD9), mas preferiblemente de al menos PCR triple (dos dianas, es decir, 156110 y RD9, y un control interno).

Por PCR combinada, en la presente se entiende cualquier reaccion de PCR que tiene como proposito la amplificacion de mas de una diana. Por ejemplo, PCR combinada incluye PCR doble (dos dianas), PCR triple (tres dianas), y PCR combinada superior.

Naturalmente, los acidos nucleicos de acuerdo con la presente invencion tambien son adecuados para otros protocolos, incluyendo protocolos simples, protocolos combinados, protocolos de punto final, protocolos cualitativos, protocolos cuantitativos, combinaciones de los mismos, y similares.

Por acido nucleico, en la presente se entiende cualquier acido nucleico: puede ser sintetico o no, recombinante o de origen natural, lineal o circular. Esto incluye ADN y ARN. El acido nucleico puede ser monocatenario o bicatenario o incluso de triple helice. Puede proceder de diversas fuentes biologicas, tales como microorganismos (bacterias y similares), u organismos superiores, como celulas de mamifero (por ejemplo, celulas humanas, o celulas de mamifero no humano). El acido nucleico tambien puede comprender ADN total, ARN total, ADN genomico, ADN mitocondrial, ADN plasmidico, ADN BAC, y mezclas de los mismos. Ademas, el acido nucleico puede asumir diversos estados de pureza.

Por muestra, en la presente se entiende cualquier tipo de muestra, de origen natural o no. Preferiblemente, dicha muestra es de origen biologico. Dicha muestra tambien puede proceder un sobrenadante de cultivo celular. En una realizacion preferida, dicha muestra es o derivad de un aspirado bronquial, un lavado bronquial, esputo, tejidos pulmonares, fluido cefalorraquideo, sangre, orina. Dicha muestra tambien puede resultar de una etapa preliminar. Por ejemplo, dicha muestra puede obtenerse mediante un procedimiento de purificacion y/o extraccion. En particular, dicha muestra puede resultar de un proceso de separacion y/o purificacion y/o extraccion realizado sobre una muestra biologica. Dicha muestra tambien puede ser una muestra de control. Las muestras de control incluyen muestras como control de calidad, control positivo, control negativo, control cuantitativo, y control de calibracion. Dicho control puede ser interno asi como externo. Cualquier muestra de acuerdo con la presente invencion puede estar presente varias veces. Por ejemplo, dicha muestra puede proporcionarse duplicada, triplicada, cuadruplicada,

o multiplicada mas veces, lo que es ventajoso en el caso de experimentos cuantitativos.

Los especialistas en la tecnica estan familiarizados con la nocion de molde diana. Dicho molde diana puede ser cualquier acido nucleico, cuya presencia tiene que evaluarse en dicho metodo. Dicho molde diana es posiblemente, pero no necesariamente, el acido nucleico a amplificar en dicho metodo (amplicon de PCR).

Por polinucleotido, en la presente se entiende cualquier polimero de nucleotidos, donde los nucleotidos pueden ser ribonucleotidos, desoxirribonucleotidos, didesoxirribonucleotidos, nucleotidos degenerados, y similares. Dichos nucleotidos son preferiblemente monocatenarios, pero tambien pueden ser bicatenarios. La longitud de dichos polinucleotidos puede variar, y esta habitualmente por debajo de 500 nucleotidos (nt), preferiblemente en el intervalo de 50-400 nt, mas preferiblemente 100-300 nt, incluso mas preferiblemente 150-250 nt. Por ejemplo, la diana 156110 seleccionada de la 5EC 1D N° 2 es de 201 nt, y la diana RD9 seleccionada de la 5EC 1D N° 8 es de 172 nt.

Por oligonucleotido, en la presente se entiende cualquier polimero corto de nucleotidos, donde los nucleotidos pueden ser ribonucleotidos, desoxirribonucleotidos, didesoxirribonucleotidos, nucleotidos degenerados, y similares. Dichos oligonucleotidos son preferiblemente monocatenarios. La longitud de dichos oligonucleotidos puede variar, y esta habitualmente por debajo de 150 nucleotidos (nt), preferiblemente en el intervalo de 10-100 nt, mas preferiblemente 15-60 nt, incluso mas preferiblemente 18-50 nt. Dichos oligonucleotidos pueden albergar modificaciones quimicas, tales como marcas o marcadores, por ejemplo marcaje radiactivo, fluorescente, biotinilado, dig. Un oligonucleotido de acuerdo con la invencion puede ser directo (con sentido) o inverso (antisentido). Ademas, conviene destacar que aunque pueden mencionarse funciones preferidas en relacion a algunos oligonucleotidos de acuerdo con la presente invencion, es obvio que un oligonucleotido dado puede asumir varias funciones, y puede usarse de diferentes modos de acuerdo con la presente invencion. Ejemplo, un oligonucleotido puede usarse como cebador, o como sonda. Ademas, cuando se describe un oligonucleotido como util como sonda, los especialistas en la tecnica entienden que la secuencia complementaria de este oligonucleotido es igual de util como sonda para abordar el mismo amplicon. Ademas, tambien es obvio que cualquier cebador adecuado para un ensayo combinado, tambien puede, dentro del significado de la presente invencion, usarse en un protocolo simple. Los oligonucleotidos de acuerdo con la invencion incluyen especialmente cebadores de PCR y sondas. 5alvo que se indique de otro modo, las secuencias de acido nucleico se dan en la direccion 5' a 3'. Dichos oligonucleotidos pueden estar en muchas formas, por ejemplo, en estado seco, en solucion/suspension con el disolvente deseado y la concentracion deseada. Los especialistas en la tecnica conocerian los disolventes, concentraciones, condiciones de almacenamiento que son adecuados para los oligonucleotidos de la invencion. En particular, los especialistas en la tecnica conocerian el modo de preparar dichos oligonucleotidos como soluciones madre. Los oligonucleotidos de acuerdo con la invencion tambien pueden asumir diversos grados de pureza, segun el criterio de los especialistas en la tecnica, por ejemplo, por cromatografia HPLC. En la presente solicitud, cuando un producto, tal como un acido nucleico, un polinucleotido, un oligonucleotido, un cebador, una sonda, un amplicon, una secuencia molde de referencia, etc., se dice que comprende una secuencia definida, el alcance de dicha expresion debe entenderse como abarcando tambien la situacion en que dicho producto consta de dicha secuencia definida.

La nocion de cebador o cebador de PCR es conocida por los especialistas en la tecnica. Por ejemplo, incluye un oligonucleotido capaz de hibridar con un molde diana en condiciones de rigurosidad adecuadas, y que permite la elongacion de la hebra por polimerasa. La longitud tipica de un cebador es de 10-30 nt, preferiblemente 10-18 nt, mas preferiblemente 15-18 nt, por ejemplo, 15, 16, 17 o 18 nt. Las condiciones de rigurosidad adecuadas comprenden notablemente condiciones de elevada rigurosidad. Condiciones ilustrativas de alta rigurosidad son temperatura y condiciones ionicas usadas durante hibridacion y/o lavado de acidos nucleicos. Las quot;condiciones altamente rigurosasquot; asi como los factores que afectan a la tasa de hibridacion son conocidos por los especialistas en la tecnica, y pueden hallarse en, por ejemplo, Maniatis et al. 1982, Molecular Cloning, Cold 5pring Harbor Laboratory. Generalmente, las condiciones altamente rigurosas se seleccionan para que sean de aproximadamente 5 a 20°C inferiores al punto de fusion termico ™ del oligonucleotido a una fuerza ionica y pH definidos. La Tm es la temperatura (en fuerza ionica y pH definidos) a la cual el 50% de una secuencia diana complementaria hibrida con una sonda perfectamente apareada. Para hibridos ADN-ADN, la Tm puede obtenerse de forma aproximada de la ecuacion de Meinkoth y Walh (Anal. Biochem. 1984, 138:267-284): Tm

� 69,3 + 0,41x(CG)%-650/L, donde L es la fuerza de la sonda en nucleotidos. quot;Condiciones altamente rigurosas" tambien se refiere a un procedimiento de lavado. 5e dan otras condiciones ilustrativas de rigurosidad en los siguientes ejemplos.

La nocion de sonda tambien es conocida para los especialistas en la tecnica. Por ejemplo, incluye un oligonucleotido capaz de hibridar con un molde diana en las condiciones de hibridacion deseadas. La longitud tipica de una sonda es de 50-60 nt, preferiblemente 15-40 nt, mas preferiblemente 15-30 nt, mucho mas preferiblemente 15-28 nt, por ejemplo, 16-27 nt. Preferiblemente, dicha sonda esta marcada de forma fluorescente. 5in embargo, esta claro para los especialistas en la tecnica que en ciertas condiciones, se puede usar un cebador como sonda y viceversa. Ademas, se destaca en este documento que los productos de acuerdo con la invencion, especialmente, entre otros, los oligonucleotidos, no estan limitados al uso pretendido en este documento mencionado, sino que en su lugar tienen que interpretarse ampliamente, independientemente del destino indicado. Por ejemplo, una reivindicacion a un producto (oligonucleotido) para un uso particular debe interpretarse como si indicara un producto (oligonucleotido) que de hecho es adecuado para el uso indicado. Por tanto, un oligonucleotido adecuado para su uso como cebador en un protocolo combinado tambien esta claramente adaptado a un protocolo simple dentro del significado de la presente invencion.

5on conocidos en la tecnica diversos formatos (tipos) de sondas, incluyendo sondas Taqman™ (sondas de hidrolisis), balizas moleculares (sondas de baliza o sondas de baliza molecular), y sondas 5corpion™. Las sondas de acido nucleico pueden comprender agentes intercalantes, tales como uno o varios colorantes intercalantes, dentro de su secuencia de nucleotidos.

En una realizacion preferida, las sondas de acuerdo con la invencion pueden sintetizarse todas y usarse en el formato de baliza molecular. La estructura de las balizas moleculares es la siguiente. Una corta secuencia de nucleotidos (llamado brazo de baliza) que no esta relacionada con la secuencia diana se une covalentemente a ambos extremos de la sonda. De este modo se une un corto brazo no relacionado en 5' de la sonda, y se marca con un resto fluorescente (es decir, colorante fluorescente o marcador fluorescente). Otro brazo tampoco relacionado se une al extremo 3' de la sonda y se marca con un resto inactivador de a fluorescencia. Por tanto, las balizas moleculares tienen un fluoroforo y un inactivador en extremos opuestos. El brazo corto 5' es totalmente complementaria a que esta en 3' de modo que pueden hibridar juntos, y por tanto pueden asumir una estructura de horquilla cuando no estan hibridados con la diana en solucion. En esta conformacion de horquilla, el inactivador y el colorante fluorescente estan suficientemente cerca entre si para permitir una eficaz inactivacion del fluoroforo. 5in embargo, cuando la sonda encuentra una molecula diana, esta favorecida la hibridacion con respecto a la conformacion en horquilla cuando se eligen adecuadamente los valores de la Tm del brazo de baliza y de la Tm de la sonda (teoricamente: Tm de la sonda gt; Tm del brazo de baliza gt; Tm del cebador, donde Tm es la temperatura de fusion de interes). El fluoroforo y el inactivador se alejan entre si y entonces el fluoroforo puede emitir fluorescencia cuando se ilumina mediante excitacion de luz adecuada. 5egun procede la PCR, se acumula producto de amplificacion, y la cantidad de fluorescencia en cualquier ciclo dado depende de la cantidad de producto de amplificacion presente en ese momento. (Vease, por ejemplo, 5anjay Tyagi y Fred Russell Kramer, Nature Biotechnology 1996, volumen 14, paginas 303-308; Nature Biotechnology 1998, volumen 16, paginas 49-53). Por supuesto, tambien es posible unir el fluoroforo al extremo 3', uniendo al mismo tiempo el inactivador al extremo 5'. Esquematicamente, dicha sonda puede tener las siguientes formulas (formato de baliza molecular):

5' Fluoroforo-(brazo 1)-sonda-(brazo)-1nactivador 3'

5' 1nactivador-(brazo 1)-sonda-(brazo 2)-Fluoroforo 3'

donde brazo 1 y brazo 2 pueden ser cualquier secuencia corta de nucleotidos, por ejemplo, en el intervalo de 3-10 nucleotidos, preferiblemente 5, 6, 7 nucleotidos, lo que permite la formacion de la estructura de horquilla en condiciones de rigurosidad adecuadas, es decir, el brazo 1 y el brazo 2 son totalmente complementarios para hibridar en condiciones de rigurosidad deseadas (las condiciones de rigurosidad de PCR convencional incluyen, por ejemplo, una temperatura de hibridacion de 55 a 65°C y una concentracion de Mg de 4 a 8 mM). 5in embargo, el brazo 1 y el brazo 2 no estan relacionados con la secuencia diana de la sonda, es decir, la conformacion de horquilla resultante de la hibridacion entre el brazo 1 y el brazo 2 es esencialmente la unica estructura secundaria posible para la sonda cuando no esta hibridada. Los especialistas en la tecnica conocerian el modo de elegir dichos brazos para una sonda dada. Por ejemplo, formatos de baliza posibles incluyen:

CGTGCG-(secuencia de la sonda)-CGCACG

ATGCGG-(secuencia de la sonda)-CCGCAT

Por fluoroforo, se entiende en este documento cualquier marcador/colorante fluorescente conocido en la tecnica. Ejemplos de dichos marcadores fluorescentes adecuados incluyen Fam, Hex, Tet, Joe, Rox, Tamra, Max, Edans, colorantes Cy tales como Cy5, Fluoresceina, Cumarina, Eosina, Rodamina, Bodipy, Alexa, Azul Cascade, Amarillo Yakima, Amarillo Lucifer y Rojo Texas (todos ellos marcas registradas). Por inactivador, en este documento se entiende cualquier inactivador conocido en la tecnica. Ejemplos de dichos inactivadores incluyen Dabcyl, Dark Quencher, Eclipse Dark Quencher, ElleQuencher, Tamra, BHQ y Q5Y (todos ellos marcas registradas). Los especialistas en la tecnica conocerian las combinaciones de colorante/inactivador que son adecuadas cuando se disefa una sonda. En una realizacion preferida de acuerdo con la invencion, pueden elegirse las propiedades espectrales de dichas sondas para que no interfieran entre si. En particular, cuando se usan sondas en combinacion, cada sonda individual puede tener su propio fluoroforo espectralmente diferente de forma significativa de las otras, es decir, los espectros de absorcion/emision son esencialmente no solapantes. Esto permite ventajosamente la deteccion combinada de bajo ruido para todas las sondas individuales, asegurando que las sefales individuales no interfieren entre si en la deteccion. Ejemplos de colorante que pueden usarse juntos en combinacion incluyen Fam con Tamra, Fam con Tamra con Rojo Texas. Todos los oligonucleotidos y polinucleotidos proporcionados pueden mantenerse por separado, o parcialmente mezclados, o totalmente mezclados. Dichos oligonucleotidos y polinucleotidos pueden proporcionarse en forma seca, o solubilizados en un disolvente adecuado, segun el criterio de los especialistas en la tecnica. Los disolventes adecuados incluyen TE, agua calidad PCR, y similares.

La presente invencion se refiere a un par de cebadores que se ha disefado de modo que pueda conducir a la amplificacion de dicha diana 156110 seleccionada de la 5EC 1D N° 2, y a un par de cebadores que se ha disefado de modo que pueda conducir a la amplificacion de dicha diana RD9 seleccionada de la 5EC 1D N° 8.

La presente invencion por tanto se refiere a una serie de cebadores, que comprende al menos dos pares de cebadores. Dichos al menos dos pares de cebadores son adecuados para la deteccion especifica y sensible de una micobacteria del complejo de Mycobacterium tuberculosis (MtbC), y/o para la discriminacion especifica y sensible de Mycobacterium tuberculosis y Mycobacterium canetti por un lado, de las otras cepas de dicho MtbC por otro lado. Dichos al menos dos pares de cebadores tienen secuencias tales que pueden usarse en forma combinada en una unica ejecucion de amplificacion ofreciendo aun al mismo tiempo una deteccion y discriminacion especificas y sensibles. Dichos al menos dos pares de cebadores son un par de cebadores de 156110 que consiste en un cebador directo de 156110 y un cebador inverso de 156110, y un par de cebadores de RD9 que consiste en un cebador directo de RD9 y un cebador inverso de RD9. Dicho cebador directo de RD9 es un fragmento 5'-terminal de 10 a 18 nucleotidos de la secuencia de la 5EC 1D N° 8, partiendo dicho fragmento 5'-terminal del primer nucleotido 5' de dicha 5EC 1D N° 8. Dicho cebador inverso de RD9 es un fragmento 5'-terminal de 10 a 18 nucleotidos de la secuencia que es completamente complementaria de dicha 5EC 1D N° 8 sobre la longitud completa de dicha 5EC 1D N° 8, partiendo dicho fragmento 5'-terminal del primer nucleotido 5' de dicha secuencia complementaria. Dicho cebador directo de 156110 es un fragmento 5'-terminal de 10 a 18 nucleotidos de la secuencia de la 5EC 1D N° 2, partiendo dicho fragmento 5'-terminal del primer nucleotido 5' de dicha 5EC 1D N° 2. Dicho cebador inverso de 156110 es un fragmento 5'-terminal de 10 a 18 nucleotidos de la secuencia que es completamente complementaria de dicha 5EC 1D N° 2 sobre la longitud completa de dicha 5EC 1D N° 2, partiendo dicho fragmento 5'-terminal del primer nucleotido 5' de dicha secuencia complementaria. Cada uno de dichos cebadores preferiblemente es un fragmento de 10 a 18 nucleotidos, 11 a 18 nucleotidos, 12 a 18 nucleotidos, 13 a 18 nucleotidos, 14 a 18 nucleotidos, 15 a 18 nucleotidos, 16 a 18 nucleotidos, 17 a 18 nucleotidos, por ejemplo, 17 nucleotidos. Dicho cebador directo RD9 puede comprender ventajosamente la secuencia de la 5EC 1D N° 1 (cebador RD389). Dicho cebador inverso de RD9 puede comprender ventajosamente la secuencia de la 5EC 1D N° 12 (cebador RD561). Dicho cebador directo de 156110 puede comprender ventajosamente la secuencia de la 5EC 1D N° 5 (cebador 15368). Dicho cebador inverso de 156110 puede comprender ventajosamente la secuencia de la 5EC 1D N° 6 (cebador 15569). Preferiblemente, dichos cebadores directo e inverso de 156110 son (independientemente uno del otro) de 10-18 nucleotidos por ejemplo, de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, o 18 nucleotidos. Mas preferiblemente, dichos cebadores directo e inverso de 156110 son (independientemente uno del otro) de 14-18 nucleotidos por ejemplo, de 15-18, 1517, por ejemplo 15, 16 o 17 nucleotidos. Preferiblemente, dichos cebadores directo e inverso de RD9 son (independientemente uno del otro) de 10-18 nucleotidos por ejemplo, de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, o 18 nucleotidos. Mas preferiblemente, dichos cebadores directo e inverso de RD9 son (independientemente uno del otro) de 14-18 nucleotidos por ejemplo, de 15-18, 15-17, por ejemplo 15, 16 o 17 nucleotidos. La presente divulgacion tambien se refiere a cada uno de dichos pares de cebadores, y cada uno de dichos cebadores, como una entidad individual. La presente divulgacion, por tanto, se refiere a un par de cebadores seleccionado entre dicha serie de al menos dos pares de cebadores (es decir, un par de cebadores de RD9, o un cebadores de 156110 primer), y a un cebador seleccionado entre dicho par de cebadores (es decir, un cebador directo de RD9, un cebador inverso de RD9, un cebador directo de 156110, un cebador inverso de 156110).

El uso de un par de cebadores que se ha disefado de modo que pueda conducir a la amplificacion de dicha diana 156110 seleccionada de la 5EC 1D N° 2, y un par de cebadores que se ha disefado de modo que pueda conducir a la amplificacion de dicha diana RD9 seleccionada de la 5EC 1D N° 8, como cebadores de amplificacion sobre una muestra biologica que contiene una micobacteria de MtbC que es diferente de la cepa de referencia de M. tuberculosis H37Rv, conducira a la produccion de un amplicon 156110 y/o de un amplicon RD9, cuyas secuencias respectivas pueden variar ligeramente de las secuencias de referencia de la 5EC 1D N° 2 y/o 5EC 1D N° 8, respectivamente, dependiendo de la secuencia de acido nucleico de la cepa micobacteriana particular de MtbC presente en dicha muestra. Por ejemplo:

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cuando la presente invencion se implementa sobre una muestra biologica que contiene una micobacteria de MtbC que es un tipo moderno de M. tuberculosis, se obtendra un amplicon tanto RD9 como 156110,

-

cuando la presente invencion se implementa sobre una muestra biologica que contiene una micobacteria de MtbC que es una M. tuberculosis ancestral, se obtendra un amplicon RD9, pero no amplicon 156110,

-

cuando la presente invencion se implementa sobre una muestra biologica que contiene una micobacteria de MtbC que no es M. tuberculosis, y que no es M. canetti, se obtendra un amplicon 156110, pero no amplicon RD9.

En cuando la micobacteria de MtbC contenida en dicha muestra biologica no es M. tuberculosis H37Rv, los amplicones obtenidos pueden tener secuencias variantes, con relacion a dichas secuencias de referencia 156110 y RD9 de la 5EC 1D N° 2 y N° 8. Dichas secuencias variantes tendran aproximadamente el mismo tamafo que las secuencias de referencia de la 5EC 1D N° 2 o la 5EC 1D N° 8, respectivamente. Por ejemplo, un amplicon 156110 obtenible por implementacion de la presente invencion tendra un tamafo que varia de 190 a 210 nucleotidos, preferiblemente de 195 a 205 nucleotidos, mas preferiblemente de 199 a 203 nucleotidos, y un amplicon RD9 obtenible por implementacion de la presente invencion tendra un tamafo que varia de 160 a 185 nucleotidos, preferiblemente de 165 a 180 nucleotidos, mas preferiblemente de 170 a 174 nucleotidos. Dichas secuencias variantes mostraran un elevado grado de identidad con dichas secuencias de referencia de la 5EC 1D N° 2 o la 5EC 1D N° 8, respectivamente. Por ejemplo, un amplicon 156110 obtenible por implementacion de la presente invencion compartira un minimo del 95% de identidad de secuencia con la secuencia de referencia de la 5EC 1D N° 2, y un amplicon RD9 obtenible por implementacion de la presente invencion compartira un minimo del 95% de identidad de secuencia con la secuencia de referencia de la 5EC 1D N° 8. Preferiblemente, dicha identidad de secuencia minima sera del 96%, 97%, 98%, o 99%. Dicho % de identidad se calcula sobre la longitud completa de dicha secuencia de referencia de la 5EC 1D N° 2

o la 5EC 1D N° 8, respectivamente. Dichas secuencias variantes que tienen un elevado grado de identidad puede caracterizarse, como alternativa, por el hecho de que hibridan con dicha secuencia de referencia 156110 de la 5EC 1D N° 2, o con dicha secuencia de referencia RD9 de la 5EC 1D N° 8, en condiciones altamente rigurosas. Las quot;condiciones altamente rigurosasquot; asi como los factores que afectan a la tasa de hibridacion son conocidos por los especialistas en la tecnica, y pueden hallarse en, por ejemplo, Maniatis et al. 1982, Molecular Cloning, Cold 5pring Harbor Laboratory. quot;Condiciones altamente rigurosasquot; ilustrativas, por ejemplo, comprenden hibridacion en 55C 6x o 55PE 6x a 68°C en solucion acuosa o a 42°C en presencia de formamida al 50%, y comprenden condiciones de lavado de dicha secuencia variante hibridada con dicha secuencia de referencia en una solucion acuosa que contiene 55C 0,1x y 5D5 0,2, a temperatura ambiente durante 2-60 min., seguido de incubacion en una solucion que contiene 55C 0,1x a una temperatura aproximadamente 12-20°C por debajo de la Tm calculada del hibrido detectado, durante 2-60 min. Pueden hallarse otras condiciones altamente rigurosas ilustrativas en los siguientes ejemplos.

Por tanto, la presente divulgacion tambien se refiere a dichos amplicones 156110 y/o RD9 obtenibles por implementacion de la presente invencion sobre una muestra biologica que contiene una micobacteria de MtbC, y mas particularmente una micobacteria de MtbC que es diferente de la cepa de referencia de M. tuberculosis H37Rv. La presente divulgacion mas particularmente se refiere a:

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cualquier polinucleotido que tenga un tamafo que varia de 190 a 210 nucleotidos, preferiblemente de 195 a 205 nucleotidos, mas preferiblemente de 199 a 203 nucleotidos, y que

comparte un minimo del 95% de identidad de secuencia con la secuencia de referencia de la 5EC 1D N° 2 o con la secuencia que es completamente complementaria a la 5EC 1D N° 2 sobre la longitud completa de la 5EC 1D N° 2 (preferiblemente, una identidad de secuencia minima del 96%, 97%, 98%, o 99%), y/o hibrida con la secuencia de referencia de la 5EC 1D N° 2 o con la secuencia que es completamente complementaria a la 5EC 1D N° 2 sobre la longitud completa de la 5EC 1D N° 2 en condiciones altamente rigurosas, y a

-

cualquier polinucleotido que tenga un tamafo que varia de 160 a 185 nucleotidos, preferiblemente de 165 a 180 nucleotidos, mas preferiblemente de 170 a 174 nucleotidos, y que

comparte un minimo del 95% de identidad de secuencia con la secuencia de referencia de la 5EC 1D N° 8 o con la secuencia que es completamente complementaria a la 5EC 1D N° 8 sobre la longitud completa de la 5EC 1D N° 8 (preferiblemente, una identidad de secuencia minima del 96%, 97%, 98%, o 99%), y/o hibrida con la secuencia de referencia de la 5EC 1D N° 8 o con la secuencia que es completamente complementaria a la 5EC 1D N° 8 sobre la longitud completa de la 5EC 1D N° 8 en condiciones altamente rigurosas.

La presente divulgacion se refiere a sondas que son adecuadas para la deteccion de los amplicones obtenibles por el uso de un par de cebadores de 156110 y un par de cebadores de RD9 como cebadores en una reaccion de amplificacion realizada sobre una muestra biologica. Ventajosamente, dicha sonda es:

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la secuencia de la 5EC 1D N° 8, o la secuencia que es completamente complementaria a la 5EC 1D N° 8 sobre la longitud completa de la 5EC 1D N° 8, o un fragmento de al menos 15 nucleotidos de dicha secuencia de la 5EC 1D N° 8 o de dicha secuencia complementaria, o

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la secuencia de la 5EC 1D N° 2, o la secuencia que es completamente complementaria a la 5EC 1D N° 2 sobre la longitud completa de la 5EC 1D N° 2, o un fragmento de al menos 15 nucleotidos de dicha secuencia de la 5EC 1D N° 2 o de dicha secuencia complementaria.

Preferiblemente, dicho fragmento de al menos 15 nucleotidos de dicha 5EC 1D N° 2 o 5EC 1D N° 8 es de menos de 30 nucleotidos, mas preferiblemente es de 15-28 nucleotidos por ejemplo, de 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 o 28 nucleotidos, mucho mas preferiblemente de 20-25 nucleotidos por ejemplo, de 23 nucleotidos. La presente divulgacion mas particularmente se refiere a las siguientes sondas dirigidas a amplicon:

-

la secuencia de la 5EC 1D N° 8, o la secuencia que es completamente complementaria a la 5EC 1D N° 8 sobre la longitud completa de la 5EC 1D N° 8, o un fragmento de al menos 15 nucleotidos y de menos de 29 nucleotidos de dicha secuencia de la 5EC 1D N° 8 o de dicha secuencia complementaria, o

-

la secuencia de la 5EC 1D N° 2, o la secuencia que es completamente complementaria a la 5EC 1D N° 2 sobre la longitud completa de la 5EC 1D N° 2, o un fragmento de al menos 15 nucleotidos y de menos de 29 nucleotidos de dicha secuencia de la 5EC 1D N° 2 o de dicha secuencia complementaria.

Una sonda ventajosa adecuada para la deteccion de un amplicon RD9 es un fragmento de la secuencia que es complementaria a la 5EC 1D N° 8, donde dicho fragmento comprende la secuencia de la 5EC 1D N° 9 (sonda RD441). Preferiblemente, esta sonda dirigida a RD9 tiene menos de 30 nucleotidos, mas preferiblemente 15-28 nucleotidos por ejemplo, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 o 28 nucleotidos, mucho mas preferiblemente 20-25 nucleotidos, por ejemplo 23 nucleotidos. Una sonda ventajosa adecuada para la deteccion de un amplicon 156110, se caracteriza por que es un fragmento de la 5EC 1D N° 2 que comprende la secuencia de la 5EC 1D N° 3 (sonda 15503). Preferiblemente, esta sonda dirigida a 156110 tiene menos de 30 nucleotidos, mas preferiblemente 15-28 nucleotidos por ejemplo, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 o 28 nucleotidos, mucho mas preferiblemente 20-25 nucleotidos por ejemplo, 23 nucleotidos. Las sondas de la divulgacion pueden comprender uno o varios agentes intercalantes dentro de su secuencia, tal como uno o varios colorantes intercalantes. Las sondas de la divulgacion pueden comprender al menos un brazo de baliza, preferiblemente dos brazos de baliza, uno en cada uno de sus extremos terminales (por ejemplo, CGTGCG-(secuencia sonda)-CGCACG; o ATGCGG-(secuencia sonda)-CCGCAT). Las sondas con baliza ventajosas comprenden notablemente la sonda de la 5EC 1D N° 10 (que es la sonda de la 5EC 1D N° 9 en formato baliza), y la sonda de la 5EC 1D N° 4 (que es la sonda de la 5EC 1D N° 3 en formato baliza). Una sonda de la divulgacion puede comprender un fluoroforo en su extremo 5' y/o un inactivador en su extremo 3', por ejemplo Tamra o Fam en su extremo 5', y/o Dabcyl en su extremo 3'.

La presente divulgacion tambien se refiere a una serie de PCR, que consiste en al menos un par de cebadores de la invencion y al menos una sonda de la invencion. Mas particularmente se refiere a una serie de PCR que consiste en al menos un par de cebadores de RD9 de la invencion y al menos una sonda de RD9 de la invencion, y a una serie de PCR que consiste en al menos un par de cebadores de 156110 de la invencion y al menos una sonda de 156110 de la invencion.

Tambien se proporciona control interno (1C) adecuado que esta especialmente adaptado para la implementacion de la invencion. 5e proporcionan oligonucleotidos y polinucleotidos adecuados para su uso como control interno (1C) en la deteccion especifica y sensible de una micobacteria del complejo de Mycobacterium tuberculosis (MtbC), y/o para la discriminacion especifica y sensible de Mycobacterium tuberculosis y Mycobacterium canetti por un lado, de las otras cepas de dicho MtbC por otro lado. Un oligonucleotido o polinucleotido 1C de la presente divulgacion ventajosamente comprende:

a.

dos secuencias de sitio de union a cebador, donde una de dichas dos secuencias de sitio de union a cebador que esta localizado 5' en relacion el otro de dichas dos secuencias de sitio de union a cebador es identica a un miembro de un par de cebadores de la invencion (un par de cebadores de 156110 o un par de cebadores de RD9), y la otra de dichas dos secuencias de sitio de union a cebador es completamente complementaria al otro miembro del mismo par de cebadores de la invencion, y

b.

una secuencia que no esta relacionada con Mycobacterium, que esta localizada entre dichas dos secuencias de sitio de union a cebador.

Preferiblemente, dicha secuencia no relacionada con Mycobacterium tampoco esta relacionada con ningun acido nucleico humano, mas preferiblemente no relacionada con ningun acido nucleico de mamifero.

Un 1C ilustrativo puede constar de 92 bases:

-

17 bases localizadas en la region del extremo 5', y 17 bases localizadas en la region del extremo 3', que son identicas, y respectivamente, completamente complementarias a los cebadores de 156110, respectivamente (15368 y 15569 de la 5EC 1D N° 5 y 6, respectivamente),

-

estando las 58 bases restantes no relacionadas con las micobacterias (secuencia aleatoria).

Por ejemplo, un kit de la divulgacion puede comprender un oligonucleotido o polinucleotido 1C que se amplifica por un par de cebadores de 156110, tal como el oligonucleotido 1C de la 5EC 1D N° 13.

La presente divulgacion proporciona adicionalmente sondas 1C que estan especialmente adaptadas para la deteccion de un oligonucleotido o polinucleotido 1C de la invencion (hibridando con dicha secuencia de control). Una sonda 1C ilustrativa es la sonda de la 5EC 1D N° 14 (51M ATTO 590).

La presente divulgacion tambien se refiere a un kit para la deteccion especifica y sensible de una micobacteria del complejo de Mycobacterium tuberculosis (MtbC), y/o para la discriminacion especifica y sensible de Mycobacterium tuberculosis y Mycobacterium canetti por un lado, de las otras cepas de dicho MtbC por otro lado, y a un kit para el diagnostico in vitro de la tuberculosis. Un kit de la presente divulgacion comprende:

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al menos una serie de dos pares de cebadores de la invencion, y/o

-

al menos un par de cebadores de la invencion, y/o

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al menos un cebador de la invencion, y/o

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al menos una serie de dos oligonucleotidos molde de referencia de la invencion, y/o

-

al menos un polinucleotido molde de referencia de la invencion, y/o

-

al menos una sonda de una cualquiera de la invencion.

Un kit de la divulgacion puede comprender notablemente una serie de PCR de la divulgacion (es decir, al menos un par de cebadores de la divulgacion, y al menos una sonda de la divulgacion). En el kit de acuerdo con la divulgacion, los acidos nucleicos (cebadores, sondas) pueden mantenerse por separado,

o parcialmente mezclados, o totalmente mezclados.

Dichos acidos nucleicos pueden proporcionarse en forma seca, o solubilizados en un disolvente adecuado, segun el criterio del especialista en la tecnica. Disolventes adecuados incluyen TE, agua de calidad PCR, y similares. Dichos reactivos son conocidos para los especialistas en la tecnica, e incluyen agua, como agua sin nucleasa, agua sin ADNasa, agua calidad PCR; sales, como magnesio, potasio; tampones tales como Tris; enzimas, incluyendo polimerasas, tales como Taq, Vent, Pfu (todas ellas marcas registradas), polimerasa activable, transcriptasa inversa, y similares; nucleotidos como desoxinucleotidos, didesoxinucleotidos, dNTP, dATP, dTTP, dCTP, dGTP, dUTP; otros reactivos, como DTT y/o inhibidores de RNasa; y polinucleotidos como poliT, polidT, y otros oligonucleotidos, por ejemplo cebadores. El kit de acuerdo con la divulgacion puede comprender controles de PCR. Dichos controles son conocidos en la tecnica, e incluyen controles de calidad, controles positivos, controles negativos, controles internos (1C), controles cuantitativos, controles cuantitativos internos, asi como rangos de calibracion. El control interno para dicha etapa de PCR puede ser un molde que no este relacionado con el molde diana en la etapa de PCR. Dichos controles tambien pueden comprender cebadores de control y/o sondas de control. Por ejemplo, en el caso de deteccion de micobacterias del MtbC, es posible usar como control interno, un polinucleotido elegido dentro de un gen cuya presencia se excluye en una muestra originaria de un cuerpo humano (por ejemplo, de un gen vegetal), y cuyo tamafo y contenido en GC es equivalente a los de la secuencia diana. Un kit de la divulgacion puede contener un oligonucleotido o polinucleotido 1C de la invencion, y/o una sonda 1C de la invencion. Un kit de acuerdo con la divulgacion puede contener medios para extraer y/o purificar el acido nucleico de una muestra biologica, por ejemplo de aspirado bronquial, lavado bronquial, esputo, fluido cefalorraquideo, orina, sangre, suero, plasma. Dichos medios son bien conocidos para los especialistas en la tecnica. Un kit de la divulgacion puede comprender un tampon de lisis para la extraccion del acido nucleico, por ejemplo un tampon de lisis que contenga una resina anionica que se una a iones divalentes. La lisis se realiza preferiblemente en presencia de detergentes y en presencia de una resina anionica que se une a iones divalentes tales como las perlas Chelex X-100. Como caracteristica ventajosa, dicha resina anionica tambien es un agente caotropico. Ejemplos de un tampon de lisis apropiado comprenden el tampon de lisis que contiene un 8% de resina Chelex X-100 (Bio-Rad, ref: 142-1253), NP-40 al 0,5% (5igma, ref: 1gepal 1-3021), Tween 20 al 0,5% (VWR, ref: 28829296) en tampon Tris 10 mM (5igma, ref: T-6791), EDTA 1 mM, (5igma ref: E-1644) pH 8,3. El kit de acuerdo con la divulgacion puede contener instrucciones para el uso del mismo. Dichas instrucciones pueden ser ventajosamente un panfleto, una tarjeta, o similares. Dichas instrucciones tambien pueden estar presentes en dos formas: una detallada, que reune informacion exhaustiva acerca del kit y el uso del mismo, incluyendo posiblemente tambien datos bibliograficos; y una forma de guia rapida o memo, por ejemplo en forma de una tarjeta, que reune informacion esencial necesaria para el uso del mismo. En una realizacion preferida, dicho kit es un kit de diagnostico, especialmente un kit de diagnostico in vitro, es decir un kit de diagnostico de la tuberculosis.

La presente invencion tambien se refiere a un metodo para detectar una micobacteria del complejo de Mycobacterium tuberculosis (MtbC) en una muestra biologica, y/o para discriminar Mycobacterium tuberculosis y Mycobacterium canetti por un lado, de las otras cepas de dicho MtbC por otro lado. Un metodo de la invencion comprende la deteccion de dos secuencias de acido nucleico diana, donde una de dichas dos secuencias diana es 156110 o un fragmento de la misma, y la otra secuencia diana es RD9 o un fragmento de la misma, donde la deteccion de la presencia de dicha diana RD9 y de la presencia o ausencia de dicha diana 156110 es indicativa de la presencia en dicha muestra biologica de una micobacteria que pertenece al MtbC, que es M. tuberculosis o M. canetti, donde la deteccion de la ausencia de dicha diana RD9 y de la presencia de dicha diana 156110 es indicativa de la presencia en dicha muestra biologica de una micobacteria que pertenece al MtbC, que no es M. tuberculosis, donde la deteccion de la ausencia de dicha diana RD9 y la ausencia de dicha diana 156110 es indicativa de la ausencia en dicha muestra biologica de una micobacteria que pertenece al MtbC.

La deteccion de la presencia de dicha diana RD9, y de la presencia o ausencia de dicha diana 156110 es notablemente indicativa de la presencia en dicha muestra biologica de una micobacteria que pertenece al MtbC, que no es M. bovis.

Ventajosamente, notablemente para una implementacion de PCR combinada del metodo, dicha secuencia diana RD9 consiste en la secuencia de la 5EC 1D N° 8, o en la secuencia que es completamente complementaria a la 5EC 1D N° 8 sobre la longitud completa de la 5EC 1D N° 8, y dicha secuencia diana 156110 consiste en la secuencia de la 5EC 1D N° 2, o en la secuencia que es completamente complementaria a la 5EC 1D N° 2 sobre la longitud completa de la 5EC 1D N° 2.

La deteccion de la presencia de dicha diana RD9 y de la ausencia de dicha diana 156110 es indicativa de la presencia en dicha muestra biologica de una micobacteria que pertenece al MtbC, que es M. canetti, o una cepa ancestral de M. tuberculosis. La deteccion de la presencia de dicha diana RD9 y de la presencia de dicha diana 156110 es indicativa de la presencia en dicha muestra biologica de una micobacteria que pertenece al MtbC, que es M. canetti, o una cepa de tipo moderno de M. tuberculosis. La deteccion de la ausencia de dicha diana RD9 y de la presencia de dicha diana 156110 es indicativa de la presencia en dicha muestra biologica de una micobacteria que pertenece al MtbC, que es M. bovis, M. africanum, M. caprae, M. microti, o M. pinnipedii. De acuerdo con una caracteristica ventajosa, el metodo puede implementarse por PCR. De acuerdo con una caracteristica muy ventajosa, el metodo puede implementarse en PCR combinada, notablemente mediante el uso de al menos un par de cebadores de la invencion (al menos un par de cebadores de 156110 y/o al menos uno de RD9) como cebadores de amplificacion. Un metodo de la invencion puede comprender el uso de al menos una sonda de la invencion como sonda de hibridacion y/o como sonda de deteccion.

La presente invencion se refiere a un metodo in vitro para el diagnostico de la tuberculosis, caracterizado por que se determina la presencia o ausencia de una micobacteria del MtbC en una muestra biologica, y/o la presencia o ausencia de una cepa de M. tuberculosis o M. canetti en una muestra biologica, y/o la presencia o ausencia de una micobacteria del MtbC, que no es M. tuberculosis, en una muestra biologica, mediante implementacion de dicho metodo de deteccion de MtbC y/o de discriminacion de especies del MtbC sobre dicha muestra biologica.

Adicionalmente se proporciona un metodo para extraer el acido nucleico de una muestra biologica para el analisis del MtbC. La lisis se realiza preferiblemente en presencia de detergentes y en presencia de una resina anionica que se une a iones divalentes tal como las perlas Chelex X-100. Como caracteristica ventajosa, dicha resina anionica tambien es un agente caotropico. Ejemplos del tampon de lisis apropiado comprenden el tampon de lisis que contiene un 8% de resina Chelex X-100 (Bio-Rad, ref: 142-1253), NP-40 al 0,5% (5igma, ref: 1gepal 1-3021), Tween 20 al 0,5% (VWR, ref: 28829296) en tampon Tris 10 mM (5igma, ref: T-6791), EDTA 1 mM, (5igma, ref: E-1644) pH 8,3.

La presente invencion se ilustra mediante los siguientes ejemplos, dados solamente con fines ilustrativos.

Eiemplo 1 (muestras bacterianas in vitro - especificidad sensibilidad):

1. Material metodos: 1.1. Extracci6n del acido nucleico:

5e recogieron celulas bacterianas de 100 cultivos de diferentes cepas (54 cepas bacterianas diferentes de Mycobacterium; 26 cepas de Mycobacterium que no pertenecen al MtbC; 5 cepas de M. bovis, incluyendo 4 BCG de

M. bovis; 23 cepas de M. tuberculosis; 6 cepas diferentes de M. tuberculosis o M. bovis, pero que pertenecen al MtbC - M. pinnipedii, M. caprae, 3 cepas de M. africanum, M microti-; 1 cepa de M. canetti).

La lisis se realiza en presencia de detergentes y en presencia de perlas Chelex X-100 (es decir, una resina anionica que se une a iones divalentes). Como caracteristica ventajosa, dicha resina anionica tambien es un agente caotropico.

Composicion del tampon de lisis: 8% de resina Chelex X-100 (Bio-Rad, ref: 142-1253), NP-40 al 0,5% (5igma, ref: 1gepal 1-3021), Tween 20 al 0,5% (VWR, ref: 28829296) en tampon Tris 10 mM (5igma, ref: T-6791), EDTA 1 mM, (5igma, ref: E-1644) pH 8,3.

Procedimiento:

-

200 !l de muestra biologica

-

400 !l de tampon de lisis

-

afadir 10 !l de control interno (1C) liquido

-

agitar con vortice 30quot;

-

incubacion 10 min. a 95°C

-

centrifugacion 5 min. a 8000 rpm

-

PCR sobre 10 !l de sobrenadante

El control negativo se consigue remplazando los 200 !l de muestra biologica, por 200 !l de tampon fosfato, pH 6,8 a 25 mM.

El 1C se afade en la fase de extraccion. Esta en forma liquida. 5e afaden diez !l del 1C a los 200 !l de muestra biologica. La solucion de 1C contiene 9,6 104 copias de 1C en 10 !l, para obtener 1,6 103 copias por ensayo de PCR despues de la extraccion (dilucion 1/60).

1.2. Cebadores v sondas:

1.2.1. 5istema 156110 Datos de EMBL sobre 156110 � LOCU5 MT156110 ADN lineal de 1360 pb BCT 07-JUL-2002 DEF1N1C1ON elemento tipo 15 156110 de Mycobacterium tuberculosis ACCE5O X17348 M29899 VER51ON X17348.1 Gl:48695 PALABRA5 CLAVE elemento de insercion 156110; transposon FUENTE Mycobacterium tuberculosis H37Rv 5ubsecuencia seleccionada dentro de 156110 �

361 gctcgaccgg ccagcacgct aattaacggt tcatcgccga tcatcagggc caccgcgagg 421 gccccgatgg tttgcggtgg ggtgtcgagt cgatctgcac acagctgacc gagctgggtg481 tgccgatcgc cccatcgacc tactacgacc acatcaaccg ggagcccagc cgccgcgagc 541 tgcgcgatgg cqaactcaag gagcacatca gccgcgtcca cgccgccaac tacggtgttt

(= SEC ID N° 1 = de 361 hasta 600)

En la anterior 5EC 1D N° 1, se muestran subrayadas las secuencias de los cebadores y la sonda que se usan en el sistema 156110:

-

de 372 a 387: cebador directo 15368;

-

de 506 a 528: sonda 15503;

-

de 556 a 572: secuencia complementaria del cebador inverso 15569. 5ecuencia diana de amplificacion de 156110 en formato monocatenario�

372 cagcacgct aattaacggt tcatcgccga tcatcagggc caccgcgagg421 gccccgatgg tttgcggtgg ggtgtcgagt cgatctgcac acagctgacc gagctgggtg481 tgccgatcgc cccatcgacc tactacgacc acatcaaccg ggagcccagc cgccgcgagc541 tgcgcgatgg cgaactcaag gagcacatca gc

(= SEC ID N° 2 = de 372 hasta 572)

5onda de 156110:

5onda 15503 � CGACCACATCAACCGGGAGCCCA (SEC ID N° 3) Brazos Molecular Beacon® � ATGCGG y CCGCAT Colorante indicador e inactivador � Tamra® y Dabcyl® 15503 en formato Beacon®: sonda 15503MB � 5'-Tamra-ATGCGGCGACCACATCAACCGGGAGCCCACCGCAT- Dabcyl-3' (SEC ID N° 4)

Cebador directo de 156110:

Cebador 15368 � 5'-CAGCACGCTAATTACCC-3' (SEC ID N° 5)

Cebador inverso de 156110: Cebador 15569 � 5'-GCTGATGTGCTCCTTGA-3' (SEC ID N° 6)

1.2.2. 5istema RD9: LOCU5 BX842578 ADN lineal de 1464 pb BCT 10-JUN-2004 DEF1N1C1ON genoma completo de Mycobacterium tuberculosis H37Rv; segmento 7/13 ACCE5O BX842578 REG1ON: complemento (252713..254176) Desde la posicion 250.271 hasta la posicion 254.176: secuencia de RD9

Desde la posicion 252.713 hasta la posicion 254.176 de BX842578: secuencia de Rv2075c (subsecuencia de RD9). 5ubsecuencia seleccionada dentro de RD9 (subsecuencia seleccionada dentro de la secuencia Rv2075c contenida dentro de RD9):

351 tgaccccgca atcggtcatc gccggcacct tcqgcqqggt aagcgcctgc 401 ggattggccg gtggacgggt cgggttggcc aacgccgtgg ccagcgtgga451 gtcctcgtaa tagcqgacca gtcgccaagc gtagacaccg cggccatagg501 tggcatcgca ggccgggtat ggccggtagc cggagttcga gccgctttcc 551 agctcaacgc cqctccagtc gaagacggcg gccgaccaac ctggcgcaca

(= SEC ID N° 7 = de 351 hasta 600)

En la anterior 5EC 1D N° 7, se muestran subrayadas las secuencias de los cebadores y la sonda que se usan en el sistema RD9:

-

de 390 a 406: cebador directo RD389;

-

de 441 a 464: secuencia complementaria de la sonda RD441;

-

de 545 a 561: secuencia complementaria del cebador inverso RD561. 5ecuencia diana de amplificacion de RD9 en formato monocatenario �

390 t aagcgcctgc 401 ggattggccg gtggacgggt cgggttggcc aacgccgtgg ccagcgtgga451 gtcctcgtaa tagcggacca gtcgccaagc gtagacaccg cggccatagg501 tggcatcgca ggccgggtat ggccggtagc cggagttcga gccgctttcc551 agctcaacgc c

(= SEC ID N° 8 = de 390 hasta 561)

5onda de RD9: 5onda RD441 � GCTATTACGAGGACTCCACGCTGG (SEC ID N° 9) Brazos Molecular Beacon® � CGTGCG y CGCACG Colorante indicador e inactivador � Fam y Dabcyl® RD441 en formato Beacon®: sonda RD441 MB � 5'-Fam-CGTGCGGCTATTACGAGGACTCCACGCTGGCGCACG-Dabcyl-3' (SEC ID N° 10) Cebador directo de RD9: RD389 � 5'-TAAGCGCCTGCGGATTG-3' (SEC ID N° 11) Cebador inverso de RD9: RD 561 � 5'-GGCGTTGAGCTGGAAAG- 3' (SEC ID N° 12)

1.3. Control interno {/CJ:

El control interno (1C) consiste en una secuencia monocatenaria. El 1C se selecciona para que comprenda una secuencia que no este relacionada con las secuencias diana de amplificacion, estando flanqueada dicha secuencia no relacionada en 5' y 3' por secuencias que son secuencias diana apropiadas para uno de los pares de cebadores que se usan en la reaccion de PCR (par de cebadores de 156110, o par de cebadores de RD9).

El 1C comprende una secuencia en su region final 5', y otra secuencia en su region final 3', donde dicha secuencia contenida en 3' hibrida con un miembro del par de cebadores de 156110, y dicha secuencia contenida en 5' hibrida con la secuencia complementaria del otro miembro del mismo par de cebadores de 156110. Preferiblemente, dicha secuencia contenida en 3' es completamente complementaria a un miembro del par de cebadores de 156110, y dicha secuencia contenida en 5' tiene la misma secuencia que el otro miembro del mismo par de cebadores de 156110. Como alternativa, puede usarse un par de cebadores de RD9 en lugar de un par de cebadores de 156110: el proposito es tener un 1C que se amplifique por uno de los pares de cebadores que se implementan en la ejecucion de PCR, pero que comprende entre dicha secuencia contenida en 5' y dicha secuencia contenida en 3' una secuencia que no esta relacionada con Mycobacterium, preferiblemente no relacionada con acidos nucleicos bacterianos y de mamifero.

El 1C del presente ejemplo contiene en su region final 5' una secuencia que es identica a un miembro del par de cebadores de 156110, y en su region final 3', una secuencia que es completamente complementaria al otro miembro del mismo par de cebadores de 156110.

El 1C del presente ejemplo consta de 92 bases:

-

17 bases localizadas en la region final 5' y 17 bases localizadas en la region final 3', que son identicas y, respectivamente, completamente complementarias a los cebadores de 156110 (15368 y 15569 de la 5EC 1D N° 5 y 6, respectivamente),

-

estando las 58 bases restantes no relacionadas con micobacterias (secuencia aleatoria).

El 1C del presente ejemplo tiene la siguiente secuencia:

ATTGGATCCCAGCACGCTAATTACCCAGTATCAGATGACGTGGCAGCCATGA GAGTGGGACAGTCGTCCTTCAAGGAGCACATCAGCGGATC (SEC ID N° 13)

En la anterior 5EC 1D N° 13, se muestran subrayados (de 5' a 3'):

-

15368 (cebador directo de 156110 de la 5EC 1D N° 5),

-

la sonda 1C, y

-

la secuencia diana de 15569 (es decir, la secuencia complementaria del cebador inverso de 156110 de la 5EC 1D N° 6).

5onda 1C � 51M ATTO 590 � GACGTGGCAGCCATGAGAGTGGG (SEC ID N° 14), a la cual se afaden brazos de baliza en sus extremos 5' y 3' terminales.

1... Condiciones experimentales ilustrativas para PCR triple:

Reactivos:

Hot 5tart Taq Polimerasa Qiagen (5U/!l, ref 203205), que contiene el tampon de PCR dNTP: Promega ref U151x (4X 25 mM) MgC12: 5igma, ref M-2670 PVP10: 5igma, ref: PVP-10 Glicerol: VWR, ref: 24388295

Termociclador.

iQ1 (Bio-Rad)

Composici6n de la mezcla de PCR 1X:

En la mezcla de PCR 1X, se afaden: 0,2 !M de la sonda de RD9 en formato baliza (5EC 1D N° 10), 0,2 !M de la sonda 1C (5EC 1D N° 14) en formato baliza, 0,4 !M de la sonda de 156110 en formato baliza (5EC 1D N° 4), 0,5 !M de cada uno de dichos cuatro cebadores, glicerol al 5%, PVP 10 al 0,3%, 2U de Taq Polimerasa, 1 mM de dNTP y 5 mM final de MgC12. 5e afaden diez microlitros de ADN a esta mezcla.

Thermociclado:

-

Primer ciclo: 15' a 95°C,

-

Repetido 50 veces:

5egundo ciclo: 30quot; a 95°C Tercer ciclo: 30quot; a 59°C Cuarto ciclo: 30quot; a 72°C

-

Temperatura mantenida a 20°C hasta la abertura del aparato

2. Resultados:

5 2.1. Especificidad de los cebadores v sondas cuando se usan en combinaci6n:

Los cebadores y sondas seleccionados de 156110 y RD9 son especificos de MtbC: no muestran homologia significativa con un acido nucleico diferente del de las micobacterias del MtbC. Ventajosamente, los cebadores y sonda seleccionados de 156110 y RD9 siguen siendo especificos incluso cuando

10 se usan en combinacion triple.

5u especificidad de quot;calidad triplequot; puede ilustrarse sobre lisados bacterianos. 5e comprobo la presencia de ADN por amplificacion eficaz de ADN 165. Una respuesta 1C positiva valida el ensayo de tuberculosis por PCR.

15 Los resultados en combinacion triple fueron los siguientes:

Tabla 4:

Cepas bacterianas

156110 RD9 1C

54 cepas bacterianas diferentes de Mycobacterium

- - +

26 cepas de Mycobacterium que pertenecen al MtbC

- - +

5 cepas de M. bovis, incluyendo 4 BCG de M. bovis

+ - +

23 cepas de M. tuberculosis

+ + +

6 cepas diferentes de M. tuberculosis o M. bovis, pero que pertenecen al MtbC (M. pinnipedii, M caprae, 3 cepas de M. africanum, M microtiJ

+ - +

M. canetti

+ + +

Los resultados detallados se muestran en la siguiente tabla 5. Tabla 5:

Cepas bacterianas

IS6110 RD9

Escherichia coli, cepa clinica

- -

Citrobacterfreundii, cepa clinica

- -

Salmonella tvphi, cepa clinica

- -

Enterococcus faecalis, cepa clinica

- -

Enterococcus faecium, cepa clinica

- -

Corvnebacterium pseudodiphtheriticum, C1P 103420 T

- -

Corvnebacterium diphteriae, C1P 100161T

- -

Aeromonas hvdrophila, C1P 103561

- -

Enterobactercloacae, C1P 103624

- -

Staphvlococcus aureus, C1P 76,25

- -

Pseudomonas aeruginosa, C1P 76,10

- -

Neisseria meningitidis, cepa clinica

- -

Serratia marcescens, cepa clinica

- -

Acinetobacter /woffi, cepa clinica

- -

Klebsiella pneumoniae, C1P 104298

- -

Enterobacter aerogenes, C1P 103656

- -

Streptococcus oralis, C1P 103216

- -

Streptococcus mutans, C1P 103694

- -

Streptococcus pvogenes, C1P 104226

- -

Streptococcus pneumoniae, C1P 104340

- -

Acinetobacter baumanii, C1P 103572

- -

Burkholderia cepacia, C1P 80.24T

- -

Klebsiella pneumoniae subsp ozaenae, C1P 52.212

- -

Cepas bacterianas

IS6110 RD9

Staphvlococcus epidermidis, ATCC 14990

- -

Haemophilus parainfluenzae, C1P 102513T

- -

Haemophilus influenzae, cepa clinica

- -

Mvcobacterium avium, C1P 104244

- -

Pasteurella multocida, cepa veterinaria

- -

Mvcoplasma pneumoniae, cepa clinica

- -

Mvcobacterium aurum, cepa clinica

- -

Mvcobacterium flavescens, cepa clinica

- -

Mvcobacterium nonchromogenicum, cepa clinica

- -

Mvcobacterium smegmatis, cepa clinica

- -

Mvcobacterium paraforfuitum, cepa clinica

- -

Mvcobacterium gordonae, ATCC 14470

- -

Mvcobacterium forfuitum, ATCC 68410

- -

Mvcobacterium kansasii, C1P 104589

- -

Mvcobacterium phlei, cepa clinica

- -

Mvcobacterium xenopi, cepa clinica

- -

Mvcobacterium tuberculosis, cepa clinica

+ +

Mvcobacterium tuberculosis, cepa clinica

+ +

Mvcobacterium tuberculosis, cepa clinica

+ +

Mvcobacterium tuberculosis, cepa clinica

+ +

Mvcobacterium tuberculosis, cepa clinica

+ +

Mvcobacterium tuberculosis, cepa clinica

+ +

Mvcobacterium tuberculosis, cepa clinica

+ +

Mvcobacterium tuberculosis, cepa clinica

+ +

Mvcobacterium tuberculosis, cepa clinica

+ +

Mvcobacterium tuberculosis, cepa clinica

+ +

Mvcobacterium tuberculosis, cepa clinica

+ +

Mvcobacterium tuberculosis, cepa clinica

+ +

Mvcobacterium tuberculosis, cepa clinica

+ +

Mvcobacterium tuberculosis, cepa clinica

+ +

Mvcobacterium tuberculosis, cepa clinica

+ +

Mvcobacterium tuberculosis, cepa clinica

+ +

Mvcobacterium tuberculosis, cepa clinica

+ +

Mvcobacterium tuberculosis, cepa clinica

+ +

Mvcobacterium mac, cepa clinica

- -

Mvcobacterium canetti, cepa clinica

+ +

Mvcobacterium bovis, cepa clinica

+ -

Mvcobacterium simiae, cepa clinica

- -

Mvcobacterium tuberculosis, cepa clinica

+ +

Mvcobacterium africanum, cepa clinica

+ -

Mvcobacterium marinum, cepa clinica

- -

Mvcobacterium tuberculosis, C1P 64.31 T

+ +

Mvcobacterium kansasii, cepa clinica

- -

Mvcobacterium tuberculosis, cepa clinica

+ +

Mvcobacterium bovis BCG, cepa clinica

+ -

Mvcobacterium bovis BCG, cepa clinica

+ -

Mvcobacterium avium, ATCC25291

- -

Cepas bacterianas

IS6110 RD9

Mvcobacterium tuberculosis cepa H37rv, ATCC25618

+ +

Neisseria mucosa, cepa clinica

- -

Bacteroides fragilis, C1P 77.16

- -

Fusobacterium nucleatum, C1P 101130

- -

Nocardia asteroids, cepa clinica

- -

Rhodococcus equi, cepa clinica

- -

Bordetella pertussis, cepa clinica

- -

Mvcoplasma orale, ATCC23714

- -

Mvcobacterium mucogenicum, cepa clinica

- -

Mvcobacterium bovis BCG, cepa clinica

+ -

Mvcobacterium bovis BCG, cepa clinica

+ -

Mvcobacterium africanum, cepa clinica

+ -

Mvcobacterium africanum, cepa clinica

+ -

Mvcobacterium africanum, cepa clinica

+ -

Bacteroides fragilis, cepa clinica

- -

Bacteroides fragilis, cepa clinica

- -

Bacteroides fragilis, cepa clinica

- -

Mvcobacterium chelonae, D5MZ 43804

- -

Mvcobacterium haemophilum, D5MZ 44634

- -

Neisseria cinerea, cepa clinica

- -

Mvcobacterium celatum, D5MZ 44243

- -

Mvcobacterium scrofulaceum, D5MZ 43992

- -

Mvcobacterium malmoense, D5MZ 44163

- -

Propionibacterium acnes, D5MZ 1897

- -

Moraxella catarrhalis, D5MZ 9143

- -

Mvcobacterium peregrinum, D5MZ 43271

- -

Eikenella corrodens, D5MZ 8340

- -

Micromonas micros, D5MZ 20468

- -

Prevotella melaninogenica, D5MZ 7089

- -

Veillonella parvula, D5MZ 2007

- -

Mvcobacterium tuberculosis, ATCC 25177

+ +

Mvcobacterium microti, ATCC 11152

+ -

Actinomvces naeslundii ATCC 12104

- -

Legionella pneumophila, ATCC 33152

- -

Streptomvces coelicolor ATCC BAA-471

- -

Chlamvdia pneumoniae, cepa CWL-029, ATCC VR-1310

- -

Chlamvdia trachomatis, serovar D cepa UW-3/CX

- -

Lactobacillus acidophilus, cepa clinica

- -

Neisseria gonorrhoeae, cepa clinica

- -

Salmonella enteritidis, cepa clinica

- -

Legionella micdadei, cepa clinica

- -

Mvcobacterium genavense, D5MZ 44424

- -

Mvcobacterium interjectum, D5MZ 44064

- -

Mvcobacterium saskatcewanense, D5MZ 44616

- -

Mvcobacterium pinnipedii, 1nstitut Pasteur

+ -

Mvcobacterium caprae, 1nstitut Pasteur

+ -

2.2. Sensibilidad de la PCR:

5e realizo PCR triple por duplicado sobre un lisado de M. tuberculosis H37Rv pre-contada. Los resultados fueron los siguientes (tabla 6):

Tabla 6:

Soluci6n bacteriana

Ct Media Desviaci6n tipica RFU

UFC/ml

UFC/10 l 1 2 1 2

IS 6110 Tamra

1,2 107 1,2 105 17,3 17,3 17,3 0 900 900

1,2 105

1,2 103 23,3 23,4 23,35 0,07 875 875

1,2 103

12 31,2 30,3 30,75 0,63 500 575

1,2 102

1,2 35,5 35,8 35,65 0,21 300 400

12

0,12 41,3 41,3 41,3 0 150 200

RD9 FAM

1,2 107 1,2 105 20,3 19,7 20 0,42 2250 2250

1,2 105

1,2 103 27,2 27 27,1 0,14 2000 1750

1,2 103

12 34,8 34,3 34,55 0,35 1300 1300

1,2 102

1,2 38,3 38,4 38,35 0,07 1000 1000

12

0,12 // // // // // //

IC ATTO 590

1,2 107 1,2 105 33,2 33,3 33,25 0,07 80 800

1,2 105

1,2 103 32,2 31,9 32,05 0,212 800 900

1,2 103

12 31,3 31,4 31,35 0,07 1200 1200

1,2 102

1,2 31,0 31,1 31,05 0,07 1300 1300

12

0,12 31,6 31,1 31,35 0,35 1600 1400

Umbral de detecci6n de PCR:

-

12 UFC/ml para 156110, que corresponde a 0,12 copias por PCR 10 -120 UFC/ml para RD9, que corresponde a 1,2 copias por PCR

Los cebadores seleccionados de 1561110 y RD9 ventajosamente tienen una especificidad por M. tuberculosis (+ la muy rara M. canetti), y retienen esta especificidad cuando se usan en combinacion. Adicionalmente permiten una deteccion altamente sensible (casi tan poco como 1 copia por muestra).

Eiemplo 2 (muestras recogidas de seres humanos -eiemplo comparativo):

5e realizo PCR combinada como se ha descrito en el anterior ejemplo 1, pero sobre muestras recogidas de pacientes humanos (Percy Hospital, Francia):

-

muestra de fluido cefalorraquideo (C5F),

-

muestra de lavado bronquial,

-

muestra de aspirado bronquial,

-

muestra de esputo.

25 Antes del analisis, las muestras respiratorias se sometieron a pre-tratamiento de digestion-descontaminacion. De hecho, la mayoria de las muestras sometidas para cultivo micobacteriano estan contaminadas con una diversidad de organismos que pueden superar rapidamente a las micobacterias. Por tanto, las micobacterias se recuperan de forma optima de las muestras clinicas a traves del uso de procedimientos que reducen o eliminan las bacterias

30 contaminantes liberando al mismo tiempo a las micobacterias atrapadas en mucina y celulas. El metodo de digestion-descontaminacion mas ampliamente usado es el metodo de N-Acetil-L-Cisteina (NALC)-NaOH. Las muestras se descontaminaron con hidroxido sodico al 1% (concentracion final)-N-acetilcisteina y se concentraron por centrifugacion a 3.000 x g durante 20 min. de acuerdo con procedimientos convencionales (Metchock, B. G., F.

5. Nolte, y R. J. Wallace, Jr. 1999, Mycobacterium, p. 399-437. En P. R. Murray, E. J. Baron, M. A. Pfaller, F. C.

35 Tenover, y R. H. Yolken (ed.), Manual of clinical microbiology, 7a ed. American 5ociety for Microbiology, Washington, D.C.). Los sedimentos se resuspenden con tampon fosfato (0,067 M, pH 6,8). Las muestras entonces estan listas para analizarse por ensayo de microscopia, cultivo o biologia molecular. Las muestras de fluido cefalorraquideo (C5F) se analizan directamente.

40 5e realizo analisis comparativo por:

-

cultivos bacterianos y microscopia, o

-

con el ensayo Gen-Probe MTD.

5 5e realizaron cultivos bacterianos como se describe en Kent y Kubica (quot;Public health mycobacteriology: a guide for the level 111 laboratoryquot;, 1985, U.5. Dpt. Of Public Health and Human 5ervices, Atlanta, GA, EEUU), y en Roberts, Koneman y Kim (quot;Mycobacteriumquot;, 1991, paginas 304-339; En A. Barlows et al. (ed.), Manual of Clinical Microbiology, American 5ociety for Microbiology, Washington D.C., EEUU).

10 Mas particularmente, se realizaron cultivos de Lowenstein-Jensen (LJ) como se describe en Petran et al. 1971, Health Lab. 5ci. 8: 225-230. El medio de cultivo LJ comprende sales minerales, almidon de patata, glicerina, verde malaquita (antiseptico), y huevo (albumina). Los cultivos se realizan en tubos con tapon a rosca. 5e resuspenden tres gotas del sedimento de centrifugacion en tampon fosfato y se depositan sobre la parte superior de la gelosa inclinada. 5e inoculan de dos a seis tubos (dependiendo del volumen de la muestra) y se incuban a 37°C. Los tubos

15 se cierran sin apretar (para permitir la evaporacion de cualquier exceso de liquido) y se incuban en una posicion inclinada. Las muestras se observan una vez a la semana durante al menos 8 semanas. La observacion hecha en la semana 1 permite detectar la contaminacion por bacterias comensales o la presencia de una micobacteria de crecimiento rapido. Cuando a parece una colonia, se hace un frotis tefido de Ziehl-Neelsen para comprobar que hay bacilos resistentes a acido-alcohol presentes, antes de declarar que el cultivo es positivos a micobacterias.

20 5e realizo ensayo de microscopia por tincion con fucsina como se describe en Kent y Kubica (quot;Public health mycobacteriology: a guide for the level 111 laboratoryquot;, 1985, U.5. Dpt. Of Public Health and Human 5ervices, Atlanta, GA, EEUU). Las interpretaciones recomendadas para presentar los resultados del frotis se dan en la Tabla 7.

Tabla 7 (valores de microscopia):

Observacion en microscopia (aumento x1000)

Valor de microscopia

observacion directa es negativa

ZO

1-9 bacilos por 100 campos

Z1

1-9 bacillos por 10 campos

Z2

1-9 bacilos por campo

Z3

mas de 10 bacilos por campo

Z4

25 El ensayo Gen-Probe MTD se realizo de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. 5e implementa con el kit Gen-Probe® comercializado como kit quot;de ensayo directo de Mycobacterium tuberculosis Amplified™quot; (Gen-Probe 1nc., 5an Diego, California 92121, EEUU). El ensayo Gen-Probe MTD utiliza la amplificacion y deteccion de ARNr especifico de MtbC. En resumen, se sonicaron muestras biologicas, se sometieron a desnaturalizacion por calor,

30 despues se sometieron a amplificacion de acuerdo con el metodo Gen-Probe TMA (amplificacion mediada por transcripcion), y se sometieron a deteccion de amplicon de acuerdo con el metodo Gen-Probe HPA (ensayo de proteccion por hibridacion). Un ensayo MTD positivo indica que la muestra contiene micobacterias del MtbC (debido a problemas de inhibicion, y de insuficiente sensibilidad, un ensayo MTD negativo no excluye, sin embargo, la posibilidad de aislar un organismo

35 del MtbC de la muestra).

Los resultados fueron los siguientes:

Tabla 8:

Microscopia

Ensa o de cultivo Ensa o Gen-Probe Presente invenci6n RD9(Fam) IS6110(Tamra) IC (ATTO590) Resultado del MtbC Especies delMtbC

Muestra

valor Resultado del cultivo Duraci6n del cultivo Especiesidentificadas Detecci6n del MtbC

(dias)

Ct Ct Ct

ba

ZO positivo 24 M. gordonae np ND ND 34,7 negativo negativo

pus

Z3 positivo 12 M. tuberculosis positivo 29,6 +/0,14 28,5 +/0,56 32,4 positivo M. tuberculosis�

ba

Z4 positivo 13 M. tuberculosis positivo 35,425 +/-0,17 29,665 +/0,148 36,235 +/0,219 positivo M. tuberculosis�

bw

Z4 positivo 13 M. tuberculosis positivo 33,1 +/1,13 37,75 +/1,34 32,25 positivo M. tuberculosis�

ba

ZO positivo 22 M. tuberculosis positivo 1 valor 40,72 1 valor 40,08 36,34 +/0,18 positivo debil M. tuberculosis�

ba

Z4 positivo 14 M. tuberculosis positivo 34,16 +/0,09 28,49 +/0,41 35,485 +/0,19 positivo M. tuberculosis�

bw

Z3 positivo 14 M. tuberculosis np 35,1 32,6 +/0,98 32,45 +/0,4 positivo M. tuberculosis�

C5F

ZO negativo // // negativo ND ND 33,15 +/0,21 negativo negativo

ba (con adiciones de M. africanum)

np M. africanum np ND 33,45 +/0,77 31,44 +/0,43 MtbC diferente de Mt o Mc

ba (con adiciones de M. bovis)

np M. bovis np ND 46,289 +/0,44 30,89 +/0,5 positivo MtbC diferente de Mt o Mc

� M. tuberculosis, o la muy rara M. canettiND � no detectadonp � no realizadoMtbC diferente de Mt o Mc � cepa micobacteriana que pertenece al MtbC, pero que no es M. tuberculosis (Mt) ni M. canetti (Mc) ba � aspirado bronquial b� � lavado bronquialcon adiciones� muestra que se ha infectado artificialmenteCSF � fluido cefalorraquideo

Los resultados obtenidos con los cebadores y sondas de la presente invencion implementados en PCR combinada se correlacionan con los obtenidos con el metodo de cultivo tradicional, y con el kit Gen-Probe. La presente invencion es mucho mas rapida que el metodo de cultivo tradicional. La presente invencion tambien es mas precisa que el ensayo Gen-Probe MTD: el ensayo MTD da una respuesta

5 solamente MtbC positiva / MtbC negativa; la conclusion de M. tuberculosis que habitualmente se obtiene del ensayo MTD es solamente una suposicion basada en el hecho de que hay una alta probabilidad de que el paciente que tiene sintomas de tipo tuberculosis, y que es MTD positivo, este infectado por una cepa de M. tuberculosis. La presente invencion determina directamente que la cepa es M. tuberculosis (o la muy rara -y facilmente identificable -

M. canetti), y que no es otra cepa del MtbC, y particularmente que no es M. bovis (es decir, una cepa que puede estar presente en la muestra debido a vacunacion con BCG). La presente invencion permite adicionalmente discriminar entre aquellas M. tuberculosis del tipo ancestral (respuesta RD9+ 156110-), y aquellas M. tuberculosis del tipo moderno (respuesta RD9+ 156110+).

L15TADO DE 5ECUENC1A5 15

�110gt; B1O-RAD PA5TEUR

�120gt; Uso tanto de RD9 como de 156110 como dianas de acido nucleico para el diagnostico de la tuberculosis, y provision de dianas 156110 y RD9 combinadas-adaptables

�130gt;B6377-FP/KP

�160gt;20

25 �170gt; Patentln version 3.3

�210gt; 1

�211gt; 240

�212gt; ADN

�213gt; Mvcobacterium tuberculosis

�400gt; 1

�210gt;2

�211gt;201

�212gt; ADN

�213gt; Mvcobacterium tuberculosis

�400gt; 2

45 �210gt;3

�211gt;23

�212gt; ADN

�213gt; Mvcobacterium tuberculosis

�400gt; 3 cgaccacatc aaccgggagc cca 23

5

�210gt;4 �211gt; 35 �212gt; ADN �213gt; Mvcobacterium tuberculosis �400gt; 4 atgcggcgac cacatcaacc gggagcccac cgcat 35

10

�210gt;5 �211gt; 17 �212gt; ADN �213gt; Mvcobacterium tuberculosis

15

�400gt; 5 cagcacgcta attaccc 17

20

�210gt;6 �211gt; 17 �212gt; ADN �213gt; Mvcobacterium tuberculosis

�400gt; 6 gctgatgtgc tccttga

17

25

�210gt;7 �211gt; 250 �212gt; ADN �213gt; Mvcobacterium tuberculosis

30

�400gt; 7

�210gt;8 35 �211gt; 172

�212gt; ADN

�213gt; Mvcobacterium tuberculosis

�400gt; 8 40

�210gt;9

�211gt; 24 45 �212gt; ADN

�213gt; Mvcobacterium tuberculosis

�400gt; 9

gctattacga ggactccacg ctgg 24 50

�210gt; 10

�211gt;36

�212gt; ADN

�213gt; Mvcobacterium tuberculosis

�400gt; 10 cgtgcggcta ttacgaggac tccacgctgg cgcacg 36

�210gt; 11

�211gt;17

�212gt; ADN

�213gt; Mvcobacterium tuberculosis

�400gt; 11 taagcgcctg cggattg 17

�210gt; 12

�211gt; 17

�212gt; ADN

�213gt; Mvcobacterium tuberculosis

�400gt; 12 ggcgttgagc tggaaag 17

�210gt; 13

�211gt;92

�212gt; ADN

�213gt; 5ecuencia artificial

�220gt;

�223gt; Control interno de PCR

�400gt; 13

�210gt; 14

�211gt; 23

�212gt; ADN

�213gt; 5ecuencia artificial

�220gt;

�223gt; 5onda PCR para control interno

�400gt; 14 gacgtggcag ccatgagagt ggg 23

�210gt; 15

�211gt; 20

�212gt; ADN

�213gt; Mvcobacterium tuberculosis

�400gt; 15 cgttcaaccc caaacaggta20

�210gt; 16

�211gt;20

�212gt; ADN

�213gt; Mvcobacterium tuberculosis

�400gt; 16 aatcgaactc gtggaacacc 20

�210gt; 17

�211gt; 20

�212gt; ADN

�213gt; Mvcobacterium tuberculosis

5 10

�400gt; 17 ctacctcatc ttccggtcca 20 �210gt; 18 �211gt; 20 �212gt; ADN �213gt; Mvcobacterium tuberculosis �400gt; 18 catagatccc ggacatggtg 20

15

�210gt; 19 �211gt; 1464 �212gt; ADN �213gt; Mvcobacterium tuberculosis

20

�400gt; 19

�210gt; 20

�211gt; 1360

�212gt; ADN

�213gt; Mvcobacterium tuberculosis

�400gt; 20

Claims (43)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   5erie de cebadores, que comprende al menos dos pares de cebadores, adecuados para la deteccion especifica y sensible de una micobacteria del complejo de Mycobacterium tuberculosis (MtbC), y/o para la discriminacion especifica y sensible de Mycobacterium tuberculosis y Mycobacterium canetti por un lado, de las otras cepas de dicho MtbC por otro lado, donde dichos dos pares de cebadores tienen secuencias tales que pueden usarse en combinacion en una unica ejecucion de amplificacion ofreciendo aun al mismo tiempo una deteccion y discriminacion especificas y sensibles, donde dichos dos pares de cebadores son un par de cebadores de 156110 que consiste en un cebador directo de 156110 y un cebador inverso de 156110, y un par de cebadores de RD9 que consiste en un cebador directo de RD9 y un cebador inverso de RD9, donde dicho cebador directo de RD9 es un fragmento 5'-terminal de 10 a 18 nucleotidos de la secuencia de la 5EC 1D N° 8, partiendo dicho fragmento 5'-terminal del primer nucleotido 5' de dicha 5EC 1D N° 8, donde dicho cebador inverso de RD9 es un fragmento 5'-terminal de 10 a 18 nucleotidos de la secuencia que es completamente complementaria de dicha 5EC 1D N° 8 sobre la longitud completa de dicha 5EC 1D N° 8, partiendo dicho fragmento 5'-terminal del primer nucleotido 5' de dicha secuencia complementaria, donde dicho cebador directo de 156110 es un fragmento 5'-terminal de 10 a 18 nucleotidos de la secuencia de la 5EC 1D N° 2, partiendo dicho fragmento 5'-terminal del primer nucleotido 5' de dicha 5EC 1D N° 2, donde dicho cebador inverso de 156110 es un fragmento 5'-terminal de 10 a 18 nucleotidos de la secuencia que es completamente complementaria de dicha 5EC 1D N° 2 sobre la longitud completa de dicha 5EC 1D N° 2, partiendo dicho fragmento 5'-terminal del primer nucleotido 5' de dicha secuencia complementaria.

2. 2.

   5erie de cebadores de acuerdo con la reivindicacion 1, caracteri�ada por �ue dicho cebador directo de RD9 comprende la secuencia de la 5EC 1D N° 11.

3. 3.

   5erie de cebadores de acuerdo con la reivindicacion 1, caracteri�ada por �ue dicho cebador inverso de RD9 comprende la secuencia de la 5EC 1D N° 12.

4. 4.

   5erie de cebadores de acuerdo con la reivindicacion 1, caracteri�ada por �ue dicho cebador directo de 156110 comprende la secuencia de la 5EC 1D N° 5.

5. 5.

   5erie de cebadores de acuerdo con la reivindicacion 1, caracteri�ada por �ue dicho cebador inverso de 156110 comprende la secuencia de la 5EC 1D N° 6.

6. 6.

   5erie de dos polinucleotidos, donde uno de dichos dos polinucleotidos es un fragmento de RD9, siendo el otro un fragmento de 156110, donde dicho fragmento de RD9 consta de la secuencia de la 5EC 1D N° 8, o la secuencia que es completamente complementaria a la 5EC 1D N° 8 sobre la longitud completa de la 5EC 1D N° 8, y donde dicho fragmento de 156110 consta de la secuencia de la 5EC 1D N° 2, o la secuencia que es completamente complementaria a la 5EC 1D N° 2 sobre la longitud completa de la 5EC 1D N° 2.

7. 7.

   Composicion de amplificacion, que comprende la serie de cebadores de una cualquiera de las reivindicaciones 15, y al menos uno de los dos siguientes amplicones:

   -un amplicon 156110, que tiene un tamafo que varia de 190 a 210 nucleotidos, y que comparte un minimo del 95% de identidad de secuencia con la secuencia de la 5EC 1D N° 2 o con la secuencia que es completamente complementaria a la 5EC 1D N° 2 sobre la longitud completa de la 5EC 1D N° 2; -un amplicon RD9, que tiene un tamafo que varia de 160 a 185 nucleotidos, y que comparte un minimo del 95% de identidad de secuencia con la secuencia de la 5EC 1D N° 8 o con la secuencia que es completamente complementaria a la 5EC 1D N° 8 sobre la longitud completa de la 5EC 1D N° 8.

8. 8.

   La composicion de amplificacion de la reivindicacion 7, que comprende al menos uno de los dos siguientes amplicones:

   -un amplicon 156110, que tiene un tamafo que varia de 199 a 203 nucleotidos, y que comparte un minimo del 98% de identidad de secuencia con la secuencia de la 5EC 1D N° 2 o con la secuencia que es completamente complementaria a la 5EC 1D N° 2 sobre la longitud completa de la 5EC 1D N° 2; -un amplicon RD9, que tiene un tamafo que varia de 170 a 174 nucleotidos, y que comparte un minimo del 98% de identidad de secuencia con la secuencia de la 5EC 1D N° 8 o con la secuencia que es completamente complementaria a la 5EC 1D N° 8 sobre la longitud completa de la 5EC 1D N° 8.

9. 9.

   La composicion de amplificacion de la reivindicacion 7 u 8, que comprende dicho amplicon 156110 y dicho amplicon RD9.

10. 10.

    Uso de una sonda en la deteccion de un amplicon producido in vitro por la serie de cebadores de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, donde dicha sonda es:

    i) la secuencia de la 5EC 1D N° 8, o la secuencia que es completamente complementaria a la 5EC 1D N° 8 sobre la longitud completa de la 5EC 1D N° 8, o un fragmento de al menos 15 nucleotidos y de menos de 29 nucleotidos de dicha secuencia de la 5EC 1D N° 8 o de dicha secuencia complementaria, o ii) la secuencia de la 5EC 1D N° 2, o la secuencia que es completamente complementaria a la 5EC 1D N° 2 sobre la longitud completa de la 5EC 1D N° 2, o un fragmento de al menos 15 nucleotidos y de menos de 29 nucleotidos de dicha secuencia de la 5EC 1D N° 2 o de dicha secuencia complementaria.

11. 11.

    El uso de la reivindicacion 10, donde dicho amplicon esta contenido en una composicion de amplificacion que comprende la serie de cebadores de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5.

12. 12.

    El uso de reivindicacion 10 u 11, donde dicho amplicon esta contenido en la composicion de amplificacion de una cualquiera de las reivindicaciones 7-9.

13. 13.

    El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 10-12, donde dicha deteccion del amplicon se usa para el diagnostico in vitro de la tuberculosis o para la deteccion de una micobacteria del complejo de Mycobacterium tuberculosis (MtbC) en una muestra biologica.

14. 14.

    El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 10-13, donde dicha sonda es un fragmento de la secuencia que es complementaria a la 5EC 1D N° 8, donde dicho fragmento comprende la secuencia de la 5EC 1D N° 9.

15. 15.

    El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 10-13, donde dicha sonda es un fragmento de la 5EC 1D N° 2, donde dicho fragmento comprende la secuencia de la 5EC 1D N° 3.

16. 16.

    El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 10-15, donde dicha sonda comprende adicionalmente al menos un brazo de baliza.

17. 17.

    El uso de acuerdo con la reivindicacion 16, donde dicha sonda es la secuencia de la 5EC 1D N° 10.

18. 18.

    El uso de acuerdo con la reivindicacion 16, donde dicha sonda es la secuencia de la 5EC 1D N° 4.

19. 19.

    El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 10-18, donde dicha sonda comprende adicionalmente un fluoroforo en su extremo 5' y/o un inactivador en su extremo 3'.

20. 20.

    Uso de al menos dos sondas en el diagnostico in vitro de la tuberculosis o en la deteccion de una micobacteria del complejo de Mycobacterium tuberculosis (MtbC) en una muestra biologica o para discriminar Mycobacterium tuberculosis y Mycobacterium canetti por un lado, de las otras cepas de dicho MtbC por otro lado, donde una de dichas al menos dos sondas es:

    i) la secuencia de la 5EC 1D N° 8, o la secuencia que es completamente complementaria a la 5EC 1D N° 8 sobre la longitud completa de la 5EC 1D N° 8, o un fragmento de al menos 15 nucleotidos y de menos de 29 nucleotidos de dicha secuencia de la 5EC 1D N° 8 o de dicha secuencia complementaria,

    y donde la otro de dichas al menos dos sondas es:

    ii) la secuencia de la 5EC 1D N° 2, o la secuencia que es completamente complementaria a la 5EC 1D N° 2 sobre la longitud completa de la 5EC 1D N° 2, o un fragmento de al menos 15 nucleotidos y de menos de 29 nucleotidos de dicha secuencia de la 5EC 1D N° 2 o de dicha secuencia complementaria.

21. 21.

    El uso de la reivindicacion 20, donde dicha sonda definida en la reivindicacion 20 i) es un fragmento de la secuencia que es complementaria a la 5EC 1D N° 8, donde dicho fragmento comprende la secuencia de la 5EC 1D N° 9.

22. 22.

    El uso de la reivindicacion 20 o 21, donde dicha sonda definida en la reivindicacion 20 ii) es un fragmento de la 5EC 1D N° 2 que comprende la secuencia de la 5EC 1D N° 3.

23. 23.

    El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 20-22, donde cada una de dichas al menos dos sondas comprende adicionalmente al menos un brazo de baliza.

24. 24.

    El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 20-23, donde cada una de dichas al menos dos sondas comprende adicionalmente un fluoroforo en su extremo 5' y/o un inactivador en su extremo 3'.

25. 25.

    5erie de PCR, que consiste en al menos una sonda, cuya secuencia es la definida en una cualquiera de las reivindicaciones 10-19, y en la serie de cebadores de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5.

26. 26.

    Kit para la deteccion especifica y sensible de una micobacteria del complejo de Mycobacterium tuberculosis (MtbC), y/o para la discriminacion especifica y sensible de Mycobacterium tuberculosis y Mycobacterium canetti por un lado, de las otras cepas de dicho MtbC por otro lado, caracteri�ado por �ue comprende:

    -

    al menos una serie de cebadores de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, y/o

    -

    al menos una serie de dos polinucleotidos de la reivindicacion 6.

27. 27. Kit para el diagnostico in vitro de la tuberculosis, caracteri�ado por �ue comprende al menos uno entre los siguientes elementos:

    -

    al menos una serie de cebadores de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5,

    -

    al menos una serie de dos polinucleotidos de la reivindicacion 6.

28. 28.

    El kit de la reivindicacion 26 o 27, que comprende adicionalmente al menos una sonda, cuya secuencia es la definida en una cualquiera de las reivindicaciones 10-19.

29. 29.

    El kit de una cualquiera de las reivindicaciones 26-28, que comprende adicionalmente un oligonucleotido o polinucleotido adecuado para su uso como control interno (1C) en la deteccion especifica y sensible de una micobacteria del complejo de Mycobacterium tuberculosis (MtbC), y/o para la discriminacion especifica y sensible de Mycobacterium tuberculosis y Mycobacterium canetti por un lado, de las otras cepas de dicho MtbC por otro lado, caracteri�ado por �ue dicho oligonucleotido o polinucleotido 1C comprende:

    a.

    dos secuencias de sitio de union a cebador, donde una de dichas dos secuencias de sitio de union a cebador que esta localizada en 5' con relacion a la otra de dichas dos secuencias de sitio de union a cebador es identica a un miembro de un par de cebadores seleccionado entre los dos pares de cebadores definidos en una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, y la otra de dichas dos secuencias de sitio de union a cebador es completamente complementaria al otro miembro del mismo par de cebadores seleccionado, y

    b.

    una secuencia que no esta relacionada con Mycobacterium, que esta localizada entre dichas dos secuencias de sitio de union a cebador;

    y/o la sonda 1C de la 5EC 1D N° 14.

30. 30.

    El kit de la reivindicacion 29, donde la secuencia de dicho oligonucleotido 1C es la secuencia de la 5EC 1D N° 13.

31. 31.

    El kit de una cualquiera de las reivindicaciones 26-30, caracteri�ado por �ue comprende adicionalmente un tampon de lisis para la extraccion del acido nucleico.

32. 32.

    Kit de acuerdo con la reivindicacion 31, caracteri�ado por �ue dicho tampon de lisis contiene una resina anionica que se une a iones divalentes.

33. 33.

    Metodo para detectar una micobacteria del complejo de Mycobacterium tuberculosis (MtbC) en una muestra biologica, y/o para discriminar Mycobacterium tuberculosis y Mycobacterium canetti por un lado, de las otras cepas de dicho MtbC por otro lado, caracteri�ado por �ue comprende la deteccion de dos secuencias de acido nucleico diana por PCR usando los dos pares de cebadores de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5 como cebadores de amplificacion, donde una de dichas dos secuencias diana es 156110 o un fragmento de la misma, y la otra secuencia diana es RD9 o un fragmento de la misma, donde la deteccion de la presencia de dicha diana RD9 y de la presencia o ausencia de dicha diana 156110 es indicativa de la presencia en dicha muestra biologica de una micobacteria que pertenece al MtbC, que es M. tuberculosis o M. canetti, donde la deteccion de la ausencia de dicha diana RD9 y de la presencia de dicha diana 156110 es indicativa de la presencia en dicha muestra biologica de una micobacteria que pertenece al MtbC, que no es M. tuberculosis, donde la deteccion de la ausencia de dicha diana RD9 y la ausencia de dicha diana 156110 es indicativa de la ausencia en dicha muestra biologica de una micobacteria que pertenece al MtbC.

34. 34.

    Metodo de acuerdo con la reivindicacion 33, caracteri�ado por �ue dicha secuencia diana RD9 consta de la secuencia de la 5EC 1D N° 8, o la secuencia que es completamente complementaria a la 5EC 1D N° 8 sobre la longitud completa de la 5EC 1D N° 8, y dicha secuencia diana 156110 consta de la secuencia de la 5EC 1D N° 2, o la secuencia que es completamente complementaria a la 5EC 1D N° 2 sobre la longitud completa de la 5EC 1D N° 2.

35. 35.

    Metodo de acuerdo con la reivindicacion 33 o 34, caracteri�ado por �ue la deteccion de la presencia de dicha diana RD9 y de la ausencia de dicha diana 156110 es indicativa de la presencia en dicha muestra biologica de una micobacteria que pertenece al MtbC, que es M. canetti, o una cepa ancestral de M. tuberculosis.

36. 36.

    Metodo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 33-35, caracteri�ado por �ue la deteccion de la presencia de dicha diana RD9 y de la presencia de dicha diana 156110 es indicativa de la presencia en dicha

    muestra biologica de una micobacteria que pertenece al MtbC, que es M. canetti, o una cepa de tipo moderno de M. tuberculosis.

37. 37.

    Metodo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 33-36, caracteri�ado por �ue la deteccion de la ausencia de dicha diana RD9 y de la presencia de dicha diana 156110 es indicativa de la presencia en dicha muestra biologica de una micobacteria que pertenece al MtbC, que es M. bovis, M. africanum, M. caprae, M. microti, o M. pinnipedii.

38. 38.

    Metodo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 33-37, caracteri�ado por �ue dicha PCR se implementa en combinacion.

39. 39.

    El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 33-38, caracteri�ado por �ue dicha PCR se implementa usando al menos una sonda, cuya secuencia se define en una cualquiera de las reivindicaciones 10-19, como sonda de deteccion.

40. 40.

    El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 33-39, donde la composicion de amplificacion producida por dicha PCR comprende un amplicon producido por uno de dichos dos pares de cebadores y/o un amplicon producido por el otro de dichos dos pares de cebadores.

41. 41.

    El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 33-40, donde la composicion de amplificacion producida por dicha PCR comprende uno o los dos amplicones definidos en una cualquiera de las reivindicaciones 7-9.

42. 42.

    Metodo in vitro para el diagnostico de la tuberculosis, caracteri�ado por �ue la presencia o ausencia de una micobacteria del MtbC en una muestra biologica, y/o la presencia o ausencia de una cepa de M. tuberculosis o M. canetti en una muestra biologica, y/o la presencia o ausencia de una micobacteria del MtbC, que no es M. tuberculosis, en una muestra biologica, se determina por implementacion del metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 33-41 sobre dicha muestra biologica.

43. 43.

    Uso de:

    -

    al menos una serie de cebadores de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, y/o

    -

    al menos una serie de dos polinucleotidos de la reivindicacion 6,

    en el diagnostico in vitro de la tuberculosis o en la deteccion de una micobacteria del complejo de Mycobacterium tuberculosis (MtbC) en una muestra biologica o para discriminar Mycobacterium tuberculosis y Mycobacterium canetti por un lado, de las otras cepas de dicho MtbC por otro lado.