JP5518471B2 - 性感染病の原因である3つの細菌種のリアルタイムマルチプレックス検出 - Google Patents
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Description
有意な特徴として、本発明は、リアルタイムPCR、マルチプレックスPCR、またはマルチプレックス リアルタイムPCRにおいて導入しうる。
本発明は、従って、リアルタイム マルチプレックス増幅におけるCTおよび/またはMGおよび/またはNGの検出に適した、CTプライマー、CTプライマー対、CTプローブ、MGプライマー、MGプライマー対、MGプローブ、NGプライマー、NGプライマー対およびNGプローブを提供する。
本発明の手段は、さらに、高い感度と再現能を有する(以下の例4を参照)。
−CTリアルタイム増幅系であって、各CTリアルタイム増幅系が、本発明の少なくとも2つのCTプライマーおよび本発明の少なくとも1つのCTプローブを含むもの、
−MGリアルタイム増幅系であって、各MGリアルタイム増幅系が、本発明の少なくとも2つのMGプライマーおよび本発明の少なくとも1つのMGプローブを含むもの、および
−NGリアルタイム増幅系であって、各NGリアルタイム増幅系が、少なくとも2つのNGプライマーおよび少なくとも1つのNGプローブを含むもの。
−本発明のこのようなCTリアルタイム増幅系はまた、特異的にはMGおよびNGのリアルタイム増幅系と、あるいはこれらのMGおよびNG系によって生産されたであろうアンプリコンとのあらゆる顕著な交差反応性を示さずに、CTを検出する。
−前記プライマーによる少なくとも1つのアンプリコンの産生に適した条件下(すなわち、CTおよび/またはMGおよび/またはNGが前記サンプル中に存在していた場合、検出されるべき前記少なくとも1つのCTおよび/またはMGおよび/またはNGからの少なくとも1つのアンプリコンの、前記プライマーによる産生に適した条件下)、前記サンプルまたはこの核酸物質を少なくとも2つの増幅プライマーと接触させる工程と、
−前記プライマーによって、例えば、前記少なくとも2つのプライマーによって産生されたアンプリコンにアニールする少なくとも1つの検出プローブによって、好ましくは本発明の少なくとも1つのプローブを含むリアルタイム増幅において、少なくとも1つのアンプリコンが産生された、あるいは産生されるか否かについて判定する工程。
−CTをターゲットにし、かつリアルタイム マルチプレックス増幅においてCTの検出に適した、少なくとも2つのプライマー、および/または
−MGをターゲットにし、かつリアルタイム マルチプレックス増幅においてMGの検出に適した、少なくとも2つのプライマー、および/または
−NGをターゲットにし、かつリアルタイム マルチプレックス増幅においてNGの検出に適した、少なくとも2つのプライマー。
−リアルタイム マルチプレックス増幅においてCTの検出に適した、少なくとも1つのCT標的プローブ、および/または
−リアルタイム マルチプレックス増幅においてMGの検出に適した、少なくとも1つのMG標的プローブ、および/または
−リアルタイム マルチプレックス増幅においてNGの検出に適した、少なくとも1つのNG標的プローブ。
−配列番号2(MG接着遺伝子;X91074の5'領域)のMG配列の、あるいは適切な参照鋳型配列になる性質を保持した、その保存的亜断片の位置1-270(配列番号13)。これらはMG標的プライマーを構築および産生し、MGのリアルタイム マルチプレックス検出を可能にする。
−配列番号2のMG配列の位置2-259(配列番号14)からなる断片、もしくは前記断片の全長にわたって前記断片に完全に相補的である配列、または
−配列番号3のMG配列の位置1144-1283(配列番号20)からなる断片、もしくは前記断片の全長にわたって前記断片に完全に相補的である配列、または
−配列番号3のMG配列の位置1064-1249(配列番号26)からなる断片、もしくは前記断片の全長にわたって前記断片に完全に相補的である配列、または
−配列番号3のMG配列の位置1527-1704(配列番号32)からなる断片、もしくは前記断片の全長にわたって前記断片に完全に相補的である配列、または
−配列番号3のMG配列の位置1501-1704(配列番号38)からなる断片、もしくは前記断片の全長にわたって前記断片に完全に相補的である配列。
−配列番号15の1つのオリゴヌクレオチド(フォワードプライマー)またはその保存的変異体、および配列番号18の1つのオリゴヌクレオチド(リバースプライマー)またはその保存的変異体であり、または
−配列番号21;27;33;39、またはその保存的変異体からなる群から選択された少なくとも1つのオリゴヌクレオチドまたはその保存的変異体、および配列番号24;30;36からなる群から選択された少なくとも1つのオリゴヌクレオチドまたはその保存的変異体である。
−55〜65℃で8時間にわたって5×SSC、2%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、100マイクログラム/mL 一本鎖DNA中、フィルター結合DNAとハイブリダイゼーションさせ、0.2×SSCおよび0.2%SDS中50〜55℃で30分間にわたって洗浄する。
−55〜65℃で8時間にわたって5×SSC、2%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、100マイクログラム/mL 一本鎖DNA中、フィルター結合DNAとハイブリダイゼーションさせ、0.2×SSCおよび0.2%SDS中60〜65℃で30分間にわたって洗浄する。
−55〜65℃で8時間にわたって5×SSC、2%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、100マイクログラム/mL 一本鎖DNA中、フィルター結合DNAとハイブリダイゼーションさせ、0.1×SSCおよび0.1%SDS中60〜65℃で30分間にわたって洗浄する。
i.前記CT参照鋳型配列の少なくとも15ヌクレオチドの断片、または前記参照鋳型配列の全長にわたって前記CT参照鋳型配列と完全に相補的である配列の断片、または
ii.少なくとも1つのヌクレオチドの欠失および/または置換および/または付加によって、前記iの断片から誘導され、かつCT-特異的プローブである能力を保持した、その保存的変異体であって、前記NGまたはMG参照鋳型配列とアニールしない断片、例えば、その配列が前記iの断片の全長にわたって前記iの断片と少なくとも90%の同一性を有する、前記iの断片の保存的変異体。
iii.前記MG参照鋳型配列の少なくとも15ヌクレオチドの断片、または前記参照鋳型配列の全長にわたって前記MG参照鋳型配列と完全に相補的である配列の断片、または
iv.少なくとも1つのヌクレオチドの欠失および/または置換および/または付加によって、前記iの断片から誘導され、かつMG-特異的プローブである能力を保持した、その保存的変異体であって、前記CTまたはNG参照鋳型配列とアニールしない断片、例えば、その配列が前記iiiの断片の全長にわたって前記iiiの断片と少なくとも90%の同一性を有する、前記iiiの断片の保存的変異体。
v.前記NG参照鋳型配列の少なくとも15ヌクレオチドの断片、または前記参照鋳型配列の全長にわたって前記NG参照鋳型配列と完全に相補的である配列の断片、または
vi.少なくとも1つのヌクレオチドの欠失および/または置換および/または付加によって、前記iの断片から誘導され、かつNG-特異的プローブである能力を保持した、その保存的変異体であって、前記CTまたはMG参照鋳型配列とアニールしない断片、例えば、その配列が前記vの断片の全長にわたって前記vの断片と少なくとも90%の同一性を有する、前記vの断片の保存的変異体(グローバル アライメント、「ニードル」アライメントとも呼ばれている)。
模式的に、前記プローブは、以下の式(分子ビーコンフォーマット)を有することができる。
5'クエンチャー-(arm1)-プローブ-(arm2)-フルオロフォア3'
ここで、arm1およびarm2は、適切なストリンジェンシー条件下でヘアピン構造の形成を可能にする、例えば3〜10ヌクレオチド、好ましくは5、6、7ヌクレオチドの範囲内において任意の短いヌクレオチド配列とすることができる。すなわち、arm1およびarm2は、所望のストリンジェンシー条件下でアニールするために完全に相補的である(標準的なPCRストリンジェンシー条件は、例えば、55〜65℃のアニーリング温度および4〜8mMのMg濃度を含む)。しかしながら、arm1およびarm2は、プローブの標的配列と関連性がない、すなわち、arm1とarm2との間のアニーリングから生じるヘアピン構造は、主としてプローブについての唯一の可能な二次構造である。当業者は、所与のプローブについてのこのようなアームを選択する方法を知るであろう。
−前記少なくとも2つのCT標的プライマーは、配列番号7の1つのオリゴヌクレオチドおよび配列番号12の1つのオリゴヌクレオチドであり、かつ
−前記少なくとも2つのMG標的プライマーは、配列番号15の1つのオリゴヌクレオチドおよび配列番号18の1つのオリゴヌクレオチド;または配列番号21の1つのオリゴヌクレオチドおよび配列番号24の1つのオリゴヌクレオチド;または配列番号27の1つのオリゴヌクレオチドおよび配列番号30の1つのオリゴヌクレオチド;または配列番号33の1つのオリゴヌクレオチドおよび配列番号36の1つのオリゴヌクレオチド;または配列番号39の1つのオリゴヌクレオチドおよび配列番号36の1つのオリゴヌクレオチドであり、および
−前記少なくとも2つのNG標的プライマーは、配列番号44の1つのオリゴヌクレオチドおよび配列番号47の1つのオリゴヌクレオチドである。
−前記少なくとも2つのCT特異的プライマーは、配列番号7の1つのオリゴヌクレオチドおよび配列番号12の1つのオリゴヌクレオチドであり、かつ前記少なくとも1つのCT特異的プローブは、配列番号8、9、10または11の配列、またはこの配列番号の配列の全長にわたって、この配列番号の配列に完全に相補的な配列であり、および
−前記少なくとも2つのNG標的プライマーは、配列番号44の1つのオリゴヌクレオチドおよび配列番号47の1つのオリゴヌクレオチドであり、かつ前記少なくとも1つのNG特異的プローブは、配列番号45または46の配列、またはこの配列番号の配列の全長にわたって、この配列番号の配列に完全に相補的な配列であり;および
−前記少なくとも2つのMG標的プライマーおよび前記少なくとも1つのMG特異的プローブは、以下のとおりである:
−前記少なくとも2つのMG標的プライマーは、配列番号15の1つのオリゴヌクレオチドおよび配列番号18の1つのオリゴヌクレオチドであり、前記少なくとも1つのMG特異的プローブは、配列番号16または17であるか、またはこの配列番号の配列の全長にわたって、この配列番号の配列に完全に相補的な配列であり;または
−前記少なくとも2つのMG標的プライマーは、配列番号21の1つのオリゴヌクレオチドおよび配列番号24の1つのオリゴヌクレオチドであり、かつ前記少なくとも1つのMG特異的プローブは、配列番号22または23であり、あるいはこの配列番号の配列の全長にわたって、この配列番号の配列に完全に相補的な配列であり;または
−前記少なくとも2つのMG標的プライマーは、配列番号27の1つのオリゴヌクレオチドおよび配列番号30の1つのオリゴヌクレオチドであり、かつ前記少なくとも1つのMG特異的プローブは、配列番号28または29であり、あるいはこの配列番号の配列の全長にわたって、この配列番号の配列に完全に相補的な配列であり;または
−前記少なくとも2つのMG標的プライマーは、配列番号33の1つのオリゴヌクレオチドおよび配列番号36の1つのオリゴヌクレオチドであり、かつ前記少なくとも1つのMG特異的プローブは、配列番号34または35であり、あるいはこの配列番号の配列の全長にわたって、この配列番号の配列に完全に相補的な配列であり;または
−前記少なくとも2つのMG標的プライマーは、配列番号39の1つのオリゴヌクレオチドおよび配列番号36の1つのオリゴヌクレオチドであり、かつ前記少なくとも1つのMG特異的プローブは、配列番号40または41であり、あるいはこの配列番号の配列の全長にわたって、この配列番号の配列に完全に相補的な配列である。
CTプライマーおよびプローブの設計について:配列番号1(CT pCHL1プラスミド;J03321)のCT配列の位置5571〜5760(配列番号5)からなる断片、またはこれらの保存的サブラグメントであって、適切な参照鋳型配列である性質を保持したもの(CT標的プライマーを構築および産生し、CTのリアルタイムマルチプレックス検出を可能にする)、または前記断片またはサブフラグメントの全長にわたって前記断片またはサブフラグメントに完全に相補的である配列。
−配列番号2(MG接着遺伝子の5’領域;X91074)のMG配列の位置1〜270(配列番号13)、またはこれらの保存的サブフラグメントであって、適切な参照鋳型配列である性質を保持したもの(MG標的プライマーを構築および産生し、MGのリアルタイムマルチプレックス検出を可能にする)、または前記断片またはサブフラグメントの全長にわたって前記断片またはサブフラグメントに完全に相補的である配列、
−配列番号3(MG接着遺伝子;M31431)のMG配列の位置1140〜1290(配列番号19)、またはこれらの保存的サブフラグメントであって、適切な参照鋳型配列である性質を保持したもの(MG標的プライマーを構築および産生し、MGのリアルタイムマルチプレックス検出を可能にする)、または前記断片またはサブフラグメントの全長にわたって前記断片またはサブフラグメントに完全に相補的である配列、
−配列番号3のMG配列の位置1060〜1250(配列番号25)、またはこれらの保存的サブフラグメントであって、適切な参照鋳型配列である性質を保持したもの(MG標的プライマーを構築および産生し、MGのリアルタイムマルチプレックス検出を可能にする)、または前記断片またはサブフラグメントの全長にわたって前記断片またはサブフラグメントに完全に相補的である配列、
−配列番号3のMG配列の位置1520〜1710(配列番号31)、またはこれらの保存的サブフラグメントであって、適切な参照鋳型配列である性質を保持したもの(MG標的プライマーを構築および産生し、MGのリアルタイムマルチプレックス検出を可能にする)、または前記断片またはサブフラグメントの全長にわたって前記断片またはサブフラグメントに完全に相補的である配列、
−配列番号3のMG配列の位置1500〜1710(配列番号37)、またはこれらの保存的サブフラグメントであって、適切な参照鋳型配列である性質を保持したもの(MG標的プライマーを構築および産生し、MGのリアルタイムマルチプレックス検出を可能にする)、または前記断片またはサブフラグメントの全長にわたって前記断片またはサブフラグメントに完全に相補的である配列。
CTプライマーおよびプローブの設計について:配列番号1のCT配列の位置5580〜5754からなる断片(配列番号6)、または前記断片の全長にわたって前記断片に完全に相補的である配列、
−MGプライマーおよびプローブの設計について:
−配列番号2のMG配列の位置2〜259からなる断片(配列番号14)、または前記断片の全長にわたって前期断片またはサブフラグメントに完全に相補的である配列、または
−配列番号3のMG配列の位置1144〜1283からなる断片(配列番号20)、または前記断片の全長にわたって前記断片またはサブフラグメントに完全に相補的である配列、または
−配列番号3のMG配列の位置1064〜1249からなる断片(配列番号26)、または前記断片の全長にわたって前記断片またはサブフラグメントに完全に相補的である配列、または
−配列番号3のMG配列の位置1527〜1704からなる断片(配列番号32)、または前記断片の全長にわたって前記断片またはサブフラグメントに完全に相補的である配列、または
−配列番号3のMG配列の位置1501〜1704からなる断片(配列番号38)、または前記断片の全長にわたって前記断片またはサブフラグメントに完全に相補的である配列。
−配列番号7;12からなる群から選択された、CT標的プライマー、または
−配列番号15;18;21;24;27;30;33;36;39からなる群から選択された、MG標的プライマー、または
−配列番号44、47からなる群から選択された、NG標的プライマー、
−本明細書中に定義された、前記プライマーの保存的変異体。
−配列番号7および配列番号12の少なくとも1つのCT標的プライマー対、および/または
−以下の対から選択された少なくとも1つのMG標的プライマー対:配列番号15および18;配列番号21および24;配列番号27および30;配列番号33および36;配列番号39および36、および/または
−配列番号44および47の少なくとも1つのNG標的プライマー対。
−配列番号8または10のCT特異的プローブ;またはこの配列番号の配列の全長にわたって、この配列番号の配列に完全に相補的である配列からなるもの、または
−配列番号16;22;28;34または40のMG特異的プローブ、またはこの配列番号の配列の全長にわたって、この配列番号の配列に完全に相補的である配列からなるもの、または
−配列番号45のNG特異的プローブ、またはこの配列番号の配列の全長にわたって、この配列番号の配列に完全に相補的である配列からなるもの、または
−本明細書中に定義された、これらのプローブの保存的変異体。
−配列番号17;23;29;35または41のMG特異的プローブ、またはこの配列番号の配列の全長にわたって、この配列番号の配列に完全に相補的である配列からなるもの、または
−配列番号45または46のNG特異的プローブ、またはこの配列番号の配列の全長にわたって、この配列番号の配列に完全に相補的である配列からなるもの、または
−これらのプローブの保存的変異体。
−本発明の少なくとも1つのプライマーの系、および/または
−本発明の少なくとも1つのプローブ
−任意的には、その使用および/またはヌクレオチドのための説明書。
少なくとも1つの抗CTおよび/または抗MGおよび/または抗NG候補薬剤を提供すること、
前記少なくとも1つの候補抗CTおよび/または抗MGおよび/または抗NG薬剤を、細胞培養液または非ヒト動物(前記細胞培養液または動物は、少なくとも1つのCTおよび/またはMGおよび/またはNGであるまたはを含む)に投与することと、
本発明の検出方法によって決定すること(前記候補抗CTおよび/または抗MGおよび/または抗NG薬剤は、前記少なくとも1つのCTおよび/またはMGおよび/またはNGの緩解または消失を誘導する)(ここで、ポジティブ判定は、前記候補薬剤が有効なCTおよび/またはMGおよび/またはNG薬剤であることを示す)。
1.1. トラコーマクラミジア(C. trachomatis (CT))についてのプライマーおよびプローブの選択
適切なCTターゲットの源として、発明者は陰性プラスミドを選択した。これは全てのC. trachomatis血液型亜型(血清型)の中に存在している。このプラスミドは、1ゲノム当たり7〜10コピーで含まれている。
−血清型D株GO/86(受託番号J03321; 7502 bp)の、プラスミドpCHL1、
−血清型Bの、プラスミドpCTT1(受託番号M 19487; 7496 bp)、
−血清型L1の、プラスミドpLGV440(受託番号X06707; 7501 bp)、
−血清型L2のプラスミドCTPLAS75(受託番号X07547.1; 7499 bp)。
−CTフォワードプライマーの配列(U-PC 5580)(下線および太字)、
−2つのCTプローブのそれぞれの配列(括弧間の下線および太字におけるプローブSCT 175b; 括弧間の下線および太字におけるプローブSCT175c)のそれぞれの配列、
−CTリバースプライマーの標的配列(L-PC 5754)(下線および太字)。
ATT TCT GAA TGA GTA CTG CG 配列番号7
CAT CTG CAT AAT AGA CAC TCC ACC TA 配列番号8
ビーコン(登録商標)アーム:5'中 CGC GC;3'中GC GCG
ビーコン(登録商標)フォーマット中のプローブ:
CGC GCC ATC TGC ATA ATA GAC ACT CCA CCT AGC GCG(配列番号9)
色素/クエンチャー: 5'中のFAM;3'中のDabcyl
CCT AGC CTA GGA GGG TTA ACG AAA GAA 配列番号10
ビーコン(登録商標)アーム:5'中 ACG CGC;3'中GCG CGT
ビーコン(登録商標)フォーマット中のプローブ:
ACG CGC CCT AGC CTA GGA GGG TTA ACG AAA GAA GCG CGT(配列番号11)
色素/クエンチャー: 5'中のFAM;3'中のDabcyl
CGA ACT TAA GAA TTC ACG TAT C 配列番号12
MG標的配列は、MgPa接着タンパク質(主要な表面タンパク質)をコードする遺伝子内において選択される。この遺伝子は、接着遺伝子、またはPa遺伝子、またはMgPa遺伝子と呼ばれている。
−受託番号X91074、株M2341;
−受託番号X91073、株M2321;
−受託番号X91071 株2288;
−受託番号X91072、株2300。
選択されたMG標的配列は、次のPa遺伝子の部分配列内に位置する:
GGA TCA TTT GGA TTA GTA AGA AGC 配列番号15
CAG AAG GTA TGA TAA CAA CGG TAG AGC 配列番号16
ビーコン(登録商標)アーム:5'中 TGC GCA;3'中TGC GCA
ビーコン(登録商標)フォーマット中のプローブ:
TGC GCA CAG AAG GTA TGA TAA CAA CGG TAG AGC TGC GCA(配列番号17)
色素/クエンチャー: 5'中のTamra; 3'中のDabcyl
ACC AAA GCC TTT AAA AGG ATC AA 配列番号18
4つの他のMGターゲットは、発明者によって選択された。これらの4つの他のMGターゲットはまた、MG接着遺伝子内、より具体的には、この遺伝子の5'領域内に位置する。これらは、受託番号M31431(配列番号3、図3に示されたもの)で入手可能である、接着遺伝子配列に関して定義される。
−配列番号3の位置1140〜1290(配列番号19の部分配列);
−配列番号3の位置1060〜1250(配列番号25の部分配列);
−配列番号3の位置1520〜1710(配列番号31の部分配列);
−配列番号3の位置1500〜1710(配列番号37の部分配列)。
GGT GTA GGT GGT TAT TTT CTC 配列番号21
ACC AAC CCA AGC AGT TAA GTG TTA A 配列番号22
ビーコン(登録商標)アーム:5'中 CGCGTT;3'中A ACG CG
ビーコン(登録商標)フォーマット中のプローブ:
CGC GTT AC CAA CCC AAG CAG TTA AGT GTT AA A ACG CG(配列番号23)
色素/クエンチャー: 5'中のTamra; 3'中のDabcyl
TTA TTG TTT CAA GTC CAA GGG G 配列番号24
GTATGCACCAACCAAAGAAAAGAC 配列番号27
CAG GTG TAG GTG GTT ATT TTC TCT TTA 配列番号28
ビーコン(登録商標)アーム:5'中 CGCGTT;3'中AAC GCG
ビーコン(登録商標)フォーマット中のプローブ:
CGC GTT CAG GTG TAG GTG GTT ATT TTC TCT TTA AAC GCG
配列番号29
色素/クエンチャー: 5'中のTamra; 3'中のDabcyl
CAA CTG CTT GTT GGT GTT TAA CAC 配列番号30
GCA AAG GGG TTT AAA TGG CGA GCC 配列番号33
ATG AGA TCA AAG GTA AAG TTC CAG TA 配列番号34
ビーコン(登録商標)アーム:5'中のAGC GTC;3'中のGAC GCT
ビーコン(登録商標)フォーマット中のプローブ:
AGC GTC ATG AGA TCA AAG GTA AAG TTC CAG TA GAC GCT (配列番号35)
色素/クエンチャー: 5'中のTamra; 3'中のDabcyl
ATA CTC CAA TAC CAC CTT AGG CAC 配列番号36
GCA AAA ATG GAA AAC CCC TCA ACG G 配列番号39
GAT TGG AAT GAG ATC AAA GGT AAA GTT 配列番号40
ビーコン(登録商標)アーム: 5'中のCGC CCT; 3'中のAGG GCG
ビーコン(登録商標)フォーマット中のプローブ:
CGC CCT GAT TGG AAT GAG ATC AAA GGT AAA GTT AGG GCG(配列番号41)
色素/クエンチャー: 5'中のTamra; 3'中のDabcyl
ATA CTC CAA TAC CAC CTT AGG CAC 配列番号36
適切なヌクレオチド ターゲットの選択は、NGを達成するのが難しい。NGのゲノムは、実際にはM.meningitidisの1つと高い相同性を有し(約98%で)、共生種、例えばN. cinerea, N. lactamica, N. sicca, N. subflava, N. mucosaのゲノムと相同性を有する。
は252 bpである。蛍光(ATTO 647N/Dabcyl)プローブは、アンプリコンにハイブリダイズするように選択された。
CGT CAC CGA GTA TTA CCT G 配列番号44
GGC CCA CAG GGA GAG TTT TTT G 配列番号45
ビーコン(登録商標)アーム:5'中のACT GCG; 3'中のCGC AGT
ビーコン(登録商標)フォーマット中のプローブ:
ACT GCG GGC CCA CAG GGA GAG TTT TTT G CGC AGT (配列番号46)
色素/クエンチャー: 5'中のAtto 647 N; 3'中のDabcyl
TCG TCG GTG CGC GTA AC 配列番号47
内部標準(IC)は、単鎖のランダム配列からなる。
ATTGGATCCCAGCACGCTAATTACCCAGTATCAGATGACGTGGCAGCCATGAGAGTGGGACAGTCGTCCTTCAAGGAGCACATCAGCGGATC
配列番号48
下線部は、ICフォワードプライマーの配列(IS 368)、ICプローブのターゲットの配列、およびリバースプライマーのターゲットの配列(IS 569)を示す。
CAGCACGCTAATTACCC 配列番号49
CCC ACT CTC ATG GCT GCC ACG TC 配列番号50
ビーコンアーム:5'中のCAGGCG; 3'中のCGCCTG
ビーコンフォーマット中のプローブ:
CAGGCG CCC ACT CTC ATG GCT GCC ACG TC CGCCTG(配列番号51)
色素/クエンチャー:5'中のATTO 590; 3'中のDabcyl
GCTGATGTGCTCCTTGA 配列番号52
すべての微生物中に存在する16S rRNAの断片がまた増幅される。
S1-F: AGT TTG ATC ATG GCT CAG 配列番号53
S1-R: GTA TTA CCG CGG CTG CT 配列番号54
−リアルタイム シンプレックスPCR(real-time simplex PCR)における特異性(細菌株のパネル上でのCTまたはMGまたはNGリアルタイム増幅系);
−リアルタイム マルチプレックスPCR(所定量のCT、MGおよびNG DNAの混合物での、同じ混合物中における一緒のCT+MG+NG+IC系)におけるこれらの系の感度。
2.1.1. 抽出方法の説明
溶解は、洗浄剤およびChelexTM X-100ビーズ(すなわち、二価のイオンと結合し、かつカオトロピック剤でもある樹脂)の存在中において行われる。
8%のChelexTM X-100樹脂(Bio-Rad, ref.: 142-1253);0.5% NP-40(Sigma, ref.: Igepal I-3021);Tris 10 mMバッファ(Sigma, ref.: T-6791)中の0.5%Tween 20(VWR, ref.: 28829296);EDTA 1mM(Sigma, ref.: E-1644)pH 8.3。
−1 mLのサンプル(尿素の、または輸送培地のサンプル)を回収し、8000 rpmで10分間にわたってこれを遠心分離し、
−遠心ペレット中に400μL溶解バッファを加え、
−10μLの液体内部標準を加え、
−vortex 30''、
−95℃で10分間にわたるインキュベーション、
−8000 rpmで5分間にわたる遠心分離、
−10μLの上清でのPCR。
* 反応物:
Hot Start Taq Polymerase Qiagen (5U/μL、ref203205)、PCRバッファを含む
dNTP: Promega ref U151(4×25mM)
MgCl2: Sigma, ref M-2670
PVP10: Sigma, ref PVP-10
Glycerol: VWR, ref 24388295
* Thermocyclor: iQ1 (Bio-Rad)
16S rRNAプライマー(S1-F, およびS1-R)によって増幅された産物は、7.5%アクリルアミドゲル上での電気泳動後のBet染色後によって可視化される。
* 混合物の組成
1×PCR混合物中において、以下のものを添加: 0.2μMのSCT 175bプローブ(配列番号9)、0.5μMの各CTプライマー(U-PC 5580 −配列番号7−、et L-PC 5754 −配列番号12−)、5%グリセロール、0.3% PVP 10、2UのTaqポリメラーゼ、1 mM dNTPおよび6 mM最終のMgCl2。
10μLのDNAがこの混合物に加えられる。
第1のサイクル:95℃で15"
第2のサイクル:95℃で30"
第3のサイクル:56℃で45"
第4のサイクル:72℃で30"
サイクル2〜サイクル4までを50回繰り返す。
* 混合物の組成:
1×PCR混合物中において、以下のものを添加: 0.2μMのMGプローブ(SF-MG 258c −配列番号17−)、0.5μMの各MGプライマー(U-MG 1320 −配列番号15−、およびL-MG 1578 −配列番号18−)、5% グリセロール、0.3% PVP 10、2UのTaqポリメラーゼ、1mM dNTPおよび6 mM最終のMgCl2。
第1のサイクル:95℃で15"
第2のサイクル:95℃で30"
第3のサイクル:57℃で45"
第4のサイクル:72℃で30"
サイクル2〜サイクル4までを50回繰り返す。
* 混合物の組成
1×PCR混合物中において、以下のものを添加: 0.2μMのNGプローブ(pilEc −配列番号:46−)、0.5μMの各NGプライマー(U pilE 159 −配列番号44−、et L-pilE 406 −配列番号47−)、5% グリセロール、0.3% PVP 10、2UのTaqポリメラーゼ、1mM dNTPおよび4mM最終のMgCl2。
第1のサイクル:95℃で15"
第2のサイクル:95℃で30"
第3のサイクル:57℃で45"
第4のサイクル:72℃で30"
サイクル2〜サイクル4までを50回繰り返す。
* 混合物の組成
1×PCR混合物中において、以下のものを添加:
0.125μMのCTフォワードプライマーU-PC 5580(配列番号7)、
0.5μMのCTリバースプライマー L-PC 5754(配列番号12)、
0.025μMのMGフォワードプライマーU-MG 1320(配列番号15)、
1.25μMのMGリバースプライマーL-MG 1578(配列番号18)、
0.85μMのNGフォワードプライマーU-pilE 159(配列番号44)、
0.25μMのNGリバースプライマーL-pilE 406(配列番号47)、
0.5μMのICフォワードプライマーIS 368(配列番号49)、および
0.5μMのICリバースプライマーIS 569(配列番号52)。
0.15μMのCTプローブSCT 175b(配列番号9)(フルオロフォアFAM)、
0.2μMのMGプローブSF-MG 258c(配列番号17)(フルオロフォア TAMRA)、および0.2μMのNGプローブpilEc(配列番号46)(フルオロフォアATTO 647N)。
5%グリセロール、0.3%PVP 10、2UのTaqポリメラーゼ、1mM dNTPおよび5mM最終のMgCl2。
第1のサイクル:95℃で15"
第2のサイクル:95℃で30"
第3のサイクル:58℃で50"
第4のサイクル:72℃で30"
サイクル2〜サイクル4までを50回繰り返す。
CT DNA: トラコーマクラミジア LGVII株434、ABi、ロット141-115、1.63 1010基本体/ml、50 ng/μLで100μLから入手可能。
CNCM (Collection de l’Institut Pasteur, BP 52, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris cedex 15, France)からの株107031、抗菌ディスク感受性試験のための参照株(カウントはペトリ皿上で行われた)。
CTおよびMGのプライマーおよびプローブは、完全な特異性を有する:これらは、それぞれCTまたはMGの核酸以外の全ての核酸と交差反応せず;これらは、他の細菌の核酸またはヒトの核酸とほとんど交差反応しない。
アンプリコンは175 bpである。
アンプリコンは、258 bpである。
アンプリコンは252 bpである。
PCR感度
本発明のCT、MG、NGおよびICプライマーおよびプローブは、CT、MGおよびNG DNAの所定量の混合物で4重にアッセイした(実験は二重に行われた)。
−リアルタイム マルチプレックスPCR(細菌株のパネル上で試験された、同じ混合物中におけるマルチプレックスにおいて一緒の、本発明のCT+MG+NG+ICリアルタイム増幅系)における特異性;
−リアルタイム マルチプレックスPCR(CT、MGおよびNG DNAの所定量の混合物上で試験された、同じ混合物中におけるマルチプレックスにおいて一緒の、CT+MG+NG+IC系)における感度。
リアルタイム マルチプレックスPCR
* 第1の混合物の組成
1×PCR混合物において、以下のプライマーを加えた:
0.125μMのCTフォワードプライマーU-PC 5580(配列番号7)、
0.5μMのCTリバースプライマーL-PC 5754(配列番号12)、
0.5μMのMGフォワードプライマーU-MG 1144(配列番号21)、
0.5μMのMGリバースプライマーL-MG 1283(配列番号24)、
0.85μMのNGフォワードプライマーU-pilE 159(配列番号44)、
0.25μMのNGリバースプライマーL-pilE 406(配列番号47)、
0.5μMのICフォワードプライマーIS 368(配列番号49)、および
0.5μMのICリバースプライマーIS 569(配列番号52)。
0.15μM(フルオロフォアFAM)のCTプローブSCT 175b(配列番号9)、
0.2μM(フルオロフォアTAMRA)のMGプローブMGBR 140c(配列番号23)、
0.2μM(フルオロフォアATTO 647N)のNGプローブpilEc(配列番号46)および
0.15μM(フルオロフォアATTO-590)のICプローブSIMB(配列番号51)。
1×PCR混合物において、以下のプライマーを加えた:
0.125μMのCTフォワードプライマーU-PC 5580(配列番号7)、
0.5μMのCTリバースプライマーL-PC 5754(配列番号12)、
0.5μMのMGフォワードプライマーU-MG 1087(配列番号27)、
0.5μMのMGリバースプライマーL-MG 1249(配列番号30)、
0.85μMのNGフォワードプライマーU-pilE 159(配列番号44)、
0.25μMのNGリバースプライマーL-pilE 406(配列番号47)、
0.5μMのICフォワードプライマーIS 368(配列番号49)、および
0.5μMのICリバースプライマーIS 569(配列番号52)。
0.15μMのCTプローブSCT 175b(配列番号9)(フルオロフォアFAM)、
0.2μM(フルオロフォアTAMRA)のMGプローブMGBR 186j(配列番号29)
0.2μM(フルオロフォアATTO 647N)のNGプローブpilEc(配列番号46)および
0.15μM(フルオロフォアATTO-590)のICプローブSIMB(配列番号51)。
1×PCR混合物において、以下のプライマーを加えた:
0.125μMのCTフォワードプライマーU-PC 5580(配列番号7)、
0.5μMのCTリバースプライマーL-PC 5754(配列番号12)、
0.5μMのMGフォワードプライマーU-MG 1527(配列番号33)、
0.5μMのMGリバースプライマーL-MG 1704(配列番号36)、
0.85μMのNGフォワードプライマーU-pilE 159(配列番号44)、
0.25μMのNGリバースプライマーL-pilE 406(配列番号47)、
0.5μMのICフォワードプライマーIS 368(配列番号49)、および
0.5μMのICリバースプライマーIS 569(配列番号52)。
0.15μMのCTプローブSCT 175b(配列番号9)(フルオロフォアFAM)
0.2μMのMGプローブMGBR 178q(配列番号35)(フルオロフォアTAMRA)
0.2μM(フルオロフォアATTO 647N)のNGプローブpilEc(配列番号46)および
0.15μM(フルオロフォアATTO-590)のICプローブSIMB(配列番号51)。
1×PCR混合物において、以下のプライマーを加えた:
0.125μMのCTフォワードプライマーU-PC 5580(配列番号7)、
0.5μMのCTリバースプライマーL-PC 5754(配列番号12)、
0.5μMのMGフォワードプライマーU-MG 1501(配列番号39)、
0.5μMのMGリバースプライマーL-MG 1704(配列番号36)、
0.85μMのNGフォワードプライマーU-pilE 159(配列番号44)、
0.25μMのNGリバースプライマーL-pilE 406(配列番号47)、
0.5μMのICフォワードプライマーIS 368(配列番号49)、および
0.5μMのICリバースプライマーIS 569(配列番号52)。
0.15μMのCTプローブSCT 175b(配列番号9)(フルオロフォアFAM)、
0.2μMのMGプローブMGBR 204u(配列番号41)(フルオロフォアTAMRA)
0.2μMのNGプローブpilEc(配列番号46)(フルオロフォアATTO 647N)および
0.15μMのICプローブSIMB(配列番号51)(フルオロフォアATTO-590)。
5%グリセロール、0.3% PVP 10、2UのTaqポリメラーゼ、1mM dNTPおよび5 mM最終のMgCl2。
第1のサイクル:95℃で15"
第2のサイクル:95℃で30"
第3のサイクル:58℃で50"
第4のサイクル:72℃で30"
サイクル2からサイクル4を50回繰り返す。
1.6.1章参照
3.2.1. リアルタイム マルチプレックスPCRにおけるMG系についての特異性試験
本発明のMGプライマーおよびプローブは、試験された9つのMG株を検出する(株G-37、2282、2288、2300、2321、2341、M30、UTMB1およびTW-10-51)。
本発明のCT、MG、NGおよびICプライマーおよびプローブは、所定量のCT、MGおよびNG DNAの混合物上で4重にアッセイした(実験は4重において行なわれた)。4つのマルチプレックスについて試験を行い、1つのMGシンプレックスを含む各マルチプレックスについて記載した。
同じ混合物中におけるマルチプレックスにおいて一緒に、CT+MG+NG+ICリアルタイム増幅系;
Roche Amplicor CT試験、ハウスMG PCR試験、およびNG培養試験で比較。
4.1.1. サンプル:
サンプルを、ヒトの患者 (Saint Louis Hospital, France) から収集する。最初のボイド(void)尿を使用するまで−20℃で貯蔵する。
例2を参照
4.1.3. 先行技術CTまたはMGまたはNG検出方法:
CT検出:Roche Diagnostics (Amplicor CT/NG増幅キット 参照:ART:07 59 41 4、およびCobas Amplicor CT検出キット 参照:Art 07 5749 7)から利用可能なCOBAS Amplicor(登録商標)CT試験
MG検出:組織内MG PCR試験: プライマーセット、MgPa-1(5'-AGT TGA TGA AAC CTT AAC CCC TTG G-3'; 配列番号55)およびMgPa-3(5'-CCG TTG AGG GGT TTT CCA TTT TTG C-3'; 配列番号56)を使用して、主要な接着遺伝子の281塩基対の断片を増幅した (Jensen JS, Uldum SA, J Sondergard-Andersen, J Vuust, and K Lind, “Polymerase chain reaction for detection of Mycoplasma genitalium in clinical samples” J. Clin. Microbiol., 1991; 29: 46-50)。281塩基対の増幅した断片の特異性は、ECLオリゴヌクレオチド3-テール ラベリング系(Amersham International, Amersham UK)の使用を含むフルオレセイン11 dUTPでラベルされた、25 mer MgPa 2プローブ (5’- GAC CAT CAA GGT ATT TCT CAA CAG C 3’; 配列番号57) でのハイブリダイゼーションによって検証した。内部プローブを含むサザンブロットハイブリダイゼーション後に可視できる、281塩基対DNA断片は、検体から得られ、ポジティブとみなされた (Casin I, Vexiau-Robert D, De La Salmoniere P, Eche A, Grandry B, Janier M. “High prevalence of Mycoplasma genitalium in the lower genitourinary tract of women attending a sexually transmitted disease clinic in Paris, France”, Sex Transm Dis., June 2002; 29: 353-359)。
例2を参照。
* 混合物の組成
1×PCR混合物において、以下のプライマーを加えた:
0.125μMのCTフォワードプライマーU-PC 5580(配列番号6)、
0.5μMのCTリバースプライマーL-PC 5754(配列番号12)、
0.025μMのMGフォワードプライマーU-MG 1320(配列番号15)、
1.25μMのMGリバースプライマーL-MG 1578(配列番号18)、
0.85μMのNGフォワードプライマーU-pilE 159(配列番号44)、
0.25μMのNGリバースプライマーL-pilE 406(配列番号47)、
0.5μMのICフォワードプライマーIS 368(配列番号49)、および
0.5μMのICリバースプライマーIS 569(配列番号52)。
0.15μM(フルオロフォアFAM)のCTプローブSCT 175b(配列番号9)、
0.2μM(フルオロフォアTAMRA)のMGプローブSFMG 258c(配列番号17)、および
0.2μM(フルオロフォアATTO 647N)のNGプローブpilEc(配列番号46)、
0.15μM(フルオロフォアATTO-590)のICプローブSIMB(配列番号51)。
5% グリセロール、0.3% PVP 10、2UのTaqポリメラーゼ、1 mM dNTPおよび5mM最終のMgCl2。
本発明のリアルタイムマルチプレックス系で得られた検出結果は、少なくとも先行技術で得られたものと同様、正確である。
Claims (41)
- サンプル中の、トラコーマクラミジア(CT)および/または性器マイコプラズマ(MG)および/または淋菌(NG)の検出方法であって、
前記検出は、
a/ CTの検出については:リアルタイムマルチプレックス増幅におけるCTの検出に適している、少なくとも2つのCT標的プライマーおよび少なくとも1つのCT特異的プローブ、および/または
b/ MGの検出については:リアルタイムマルチプレックス増幅におけるMGの検出に適している、少なくとも2つのMG標的プライマーおよび少なくとも1つのMG特異的プローブ、および/または
c/ NGの検出については:リアルタイムマルチプレックス増幅におけるNGの検出に適している、少なくとも2つのNG標的プライマーおよび少なくとも1つのNG特異的プローブ
によるリアルタイムマルチプレックス増幅によって、少なくとも1つのアンプリコンが、前記サンプルまたはその核酸物質から産生されたか否か、または産生されるか否かの判定を含み、
上記のa/、b/およびc/の少なくとも2つが、同一の増幅チューブ内にあり、
ポジティブの判定が、少なくとも1つのCTおよび/または少なくとも1つのMGおよび/または少なくとも1つのNGが前記サンプル中に存在することを示し、
a/について、
前記少なくとも2つのCT標的プライマーが、配列番号7および12のオリゴヌクレオチドであり、前記少なくとも1つのCT特異的プローブが、配列番号8の配列またはその相補配列であり、前記配列は、少なくとも1つの検出ラベルおよび/または少なくとも1つのビーコンアームに任意に連結され、
b/について、
前記少なくとも2つのMG標的プライマーが、配列番号15および18のオリゴヌクレオチドであり、前記少なくとも1つのMG特異的プローブが、配列番号16の配列またはその相補配列であり、前記配列は、少なくとも1つの検出ラベルおよび/または少なくとも1つのビーコンアームに任意に連結されるか、または
前記少なくとも2つのMG標的プライマーが、配列番号21および24のオリゴヌクレオチドであり、前記少なくとも1つのMG特異的プローブが、配列番号22の配列またはその相補配列であり、前記配列は、少なくとも1つの検出ラベルおよび/または少なくとも1つのビーコンアームに任意に連結されるか、または
前記少なくとも2つのMG標的プライマーが、配列番号27および30のオリゴヌクレオチドであり、前記少なくとも1つのMG特異的プローブが、配列番号28の配列またはその相補配列であり、前記配列は、少なくとも1つの検出ラベルおよび/または少なくとも1つのビーコンアームに任意に連結されるか、または
前記少なくとも2つのMG標的プライマーが、配列番号33および36のオリゴヌクレオチドであり、前記少なくとも1つのMG特異的プローブが、配列番号34の配列またはその相補配列であり、前記配列は、少なくとも1つの検出ラベルおよび/または少なくとも1つのビーコンアームに任意に連結されるか、または
前記少なくとも2つのMG標的プライマーが、配列番号39および36のオリゴヌクレオチドであり、前記少なくとも1つのMG特異的プローブが、配列番号40の配列またはその相補配列であり、前記配列は、少なくとも1つの検出ラベルおよび/または少なくとも1つのビーコンアームに任意に連結され、
c/について、
前記少なくとも2つのNG標的プライマーが、配列番号44および47のオリゴヌクレオチドであり、前記少なくとも1つのNG特異的プローブが、配列番号45の配列またはその相補配列であり、前記配列は、少なくとも1つの検出ラベルおよび/または少なくとも1つのビーコンアームに任意に連結される、
方法。 - 請求項1に記載の検出方法であって、上記のa/、b/およびc/のそれぞれを同一の増幅チューブ内に含んでなる方法。
- 請求項1または2に記載の検出方法であって、前記少なくとも2つのCT標的プライマーは、前記配列番号7のオリゴヌクレオチドおよび前記配列番号12のオリゴヌクレオチドであり、かつ前記少なくとも1つのCT特異的プローブは、配列番号8もしくは9の配列であるかまたはこの配列番号の配列の全長にわたってこの配列番号の配列に完全に相補的な配列であり、前記配列は、少なくとも1つの検出ラベルに任意に連結される、方法。
- 請求項1〜3のいずれか1項に記載の検出方法であって、前記少なくとも1つのCT特異的プローブが、フルオロフォアに連結される、方法。
- 請求項1〜4のいずれか1項に記載の検出方法であって、前記少なくとも2つのMG標的プライマーは、前記配列番号15のオリゴヌクレオチドおよび前記配列番号18のオリゴヌクレオチドであり、かつ前記少なくとも1つのMG特異的プローブは、配列番号16もしくは17の配列であるかまたはこの配列番号の配列の全長にわたってこの配列番号の配列に完全に相補的な配列であり、前記配列は、少なくとも1つの検出ラベルに任意に連結される、方法。
- 請求項1〜4のいずれか1項に記載の検出方法であって、前記少なくとも2つのMG標的プライマーは、前記配列番号21のオリゴヌクレオチドおよび前記配列番号24のオリゴヌクレオチドであり、かつ前記少なくとも1つのMG特異的プローブは、配列番号22もしくは23の配列であるかまたはこの配列番号の配列の全長にわたってこの配列番号の配列に完全に相補的な配列であり、前記配列は、少なくとも1つの検出ラベルに任意に連結される、方法。
- 請求項1〜4のいずれか1項に記載の検出方法であって、前記少なくとも2つのMG標的プライマーは、前記配列番号27のオリゴヌクレオチドおよび前記配列番号30のオリゴヌクレオチドであり、かつ前記少なくとも1つのMG特異的プローブは、配列番号28もしくは29の配列であるかまたはこの配列番号の配列の全長にわたってこの配列番号の配列に完全に相補的な配列であり、前記配列は、少なくとも1つの検出ラベルに任意に連結される、方法。
- 請求項1〜4のいずれか1項に記載の検出方法であって、前記少なくとも2つのMG標的プライマーは、前記配列番号33のオリゴヌクレオチドおよび前記配列番号36のオリゴヌクレオチドであり、かつ前記少なくとも1つのMG特異的プローブは、配列番号34もしくは35の配列であるかまたはこの配列番号の配列の全長にわたってこの配列番号の配列に完全に相補的な配列であり、前記配列は、少なくとも1つの検出ラベルに任意に連結される、方法。
- 請求項1〜4のいずれか1項に記載の検出方法であって、前記少なくとも2つのMG標的プライマーは、前記配列番号39のオリゴヌクレオチドおよび前記配列番号36のオリゴヌクレオチドであり、かつ前記少なくとも1つのMG特異的プローブは、配列番号40もしくは41の配列であるかまたはこの配列番号の配列の全長にわたってこの配列番号の配列に完全に相補的な配列であり、前記配列は、少なくとも1つの検出ラベルに任意に連結される、方法。
- 請求項1〜9のいずれか1項に記載の検出方法であって、前記少なくとも1つのMG特異的プローブが、フルオロフォアに連結される、方法。
- 請求項1〜10のいずれか1項に記載の検出方法であって、前記少なくとも2つのNG標的プライマーは、前記配列番号44のオリゴヌクレオチドおよび前記配列番号47のオリゴヌクレオチドであり、かつ前記少なくとも1つのNG特異的プローブは、配列番号45もしくは46の配列であるかまたはこの配列番号の配列の全長にわたってこの配列番号の配列に完全に相補的な配列であり、前記配列は、少なくとも1つの検出ラベルに任意に連結される、方法。
- 請求項1〜11のいずれか1項に記載の検出方法であって、前記少なくとも1つのNG特異的プローブが、フルオロフォアに連結される、方法。
- 請求項1〜12のいずれか1項に記載の検出方法であって、その配列がCT、MGおよびNGと無関係である内部標準が、増幅されたか否か、または増幅されるか否かの判定をさらに含む、方法。
- 請求項13に記載の検出方法であって、前記内部標準が、増幅されたか否か、または増幅されるか否かの判定が、配列番号49および52のプライマーの使用を含む、方法。
- 請求項13または14に記載の検出方法であって、前記内部標準が、増幅されたか否か、または増幅されるか否かの判定が、配列番号50のプローブ配列またはその相補配列の使用を含み、前記プローブ配列は、少なくとも1つの検出ラベルおよび/または少なくとも1つのビーコンアームに任意に連結される、方法。
- 請求項13〜15のいずれか1項に記載の検出方法であって、前記内部標準が、a/、b/およびc/の前記少なくとも2つと同一の増幅チューブ内に含有される、方法。
- 前記増幅がPCRである、請求項1〜16のいずれか1項に記載の検出方法。
- CTからアンプリコンを産生する方法であって、同一の増幅チューブ内でプライマーおよびプローブを用いてリアルタイムマルチプレックス増幅により、CT含有サンプルまたはその核酸材料から前記アンプリコンを産生することを含み、前記プライマーおよびプローブは、
a/ 少なくとも2つのCT標的プライマーおよび少なくとも1つのCT特異的プローブ
を含み、前記プライマーおよびプローブは、
b/ 少なくとも2つのMG標的プライマーおよび少なくとも1つのMG特異的プローブ、および/または
c/ 少なくとも2つのNG標的プライマーおよび少なくとも1つのNG特異的プローブ
を更に含み、
a/について:
前記少なくとも2つのCT標的プライマーが、配列番号7および12のオリゴヌクレオチドであり、前記少なくとも1つのCT特異的プローブが、配列番号8の配列またはその相補配列であり、前記配列は、少なくとも1つの検出ラベルおよび/または少なくとも1つのビーコンアームに任意に連結され、
b/について:
前記少なくとも2つのMG標的プライマーが、配列番号15および18のオリゴヌクレオチドであり、前記少なくとも1つのMG特異的プローブが、配列番号16の配列またはその相補配列であり、前記配列は、少なくとも1つの検出ラベルおよび/または少なくとも1つのビーコンアームに任意に連結されるか、または
前記少なくとも2つのMG標的プライマーが、配列番号21および24のオリゴヌクレオチドであり、前記少なくとも1つのMG特異的プローブが、配列番号22の配列またはその相補配列であり、前記配列は、少なくとも1つの検出ラベルおよび/または少なくとも1つのビーコンアームに任意に連結されるか、または
前記少なくとも2つのMG標的プライマーが、配列番号27および30のオリゴヌクレオチドであり、前記少なくとも1つのMG特異的プローブが、配列番号28の配列またはその相補配列であり、前記配列は、少なくとも1つの検出ラベルおよび/または少なくとも1つのビーコンアームに任意に連結されるか、または
前記少なくとも2つのMG標的プライマーが、配列番号33および36のオリゴヌクレオチドであり、前記少なくとも1つのMG特異的プローブが、配列番号34の配列またはその相補配列であり、前記配列は、少なくとも1つの検出ラベルおよび/または少なくとも1つのビーコンアームに任意に連結されるか、または
前記少なくとも2つのMG標的プライマーが、配列番号39および36のオリゴヌクレオチドであり、前記少なくとも1つのMG特異的プローブが、配列番号40の配列またはその相補配列であり、前記配列は、少なくとも1つの検出ラベルおよび/または少なくとも1つのビーコンアームに任意に連結され、
c/について:
前記少なくとも2つのNG標的プライマーが、配列番号44および47のオリゴヌクレオチドであり、前記少なくとも1つのNG特異的プローブが、配列番号45の配列またはその相補配列であり、前記配列は、少なくとも1つの検出ラベルおよび/または少なくとも1つのビーコンアームに任意に連結される、
方法。 - 請求項18に記載の方法であって、前記プライマーおよびプローブが、
a/ 前記少なくとも2つのCT標的プライマーおよび前記少なくとも1つのCT特異的プローブ、
b/ 前記少なくとも2つのMG標的プライマーおよび前記少なくとも1つのMG特異的プローブ、および
c/ 前記少なくとも2つのNG標的プライマーおよび前記少なくとも1つのNG特異的プローブ
を含む、方法。 - 請求項18または19に記載の方法であって、前記少なくとも1つのCT特異的プローブが、フルオロフォアに連結される、方法。
- 請求項18〜20のいずれか1項に記載の方法であって、前記サンプルが、MGおよび/またはNGを更に含有する、方法。
- MGからアンプリコンを産生する方法であって、同一の増幅チューブ内でプライマーおよびプローブを用いてリアルタイムマルチプレックス増幅により、MG含有サンプルまたはその核酸材料から前記アンプリコンを産生することを含み、前記プライマーおよびプローブは、
a/ 少なくとも2つのMG標的プライマーおよび少なくとも1つのMG特異的プローブ
を含み、前記プライマーおよびプローブは、
b/ 少なくとも2つのCT標的プライマーおよび少なくとも1つのCT特異的プローブ、および/または
c/ 少なくとも2つのNG標的プライマーおよび少なくとも1つのNG特異的プローブ
を更に含み、
b/について:
前記少なくとも2つのCT標的プライマーが、配列番号7および12のオリゴヌクレオチドであり、前記少なくとも1つのCT特異的プローブが、配列番号8の配列またはその相補配列であり、前記配列は、少なくとも1つの検出ラベルおよび/または少なくとも1つのビーコンアームに任意に連結され、
a/について:
前記少なくとも2つのMG標的プライマーが、配列番号15および18のオリゴヌクレオチドであり、前記少なくとも1つのMG特異的プローブが、配列番号16の配列またはその相補配列であり、前記配列は、少なくとも1つの検出ラベルおよび/または少なくとも1つのビーコンアームに任意に連結されるか、または
前記少なくとも2つのMG標的プライマーが、配列番号21および24のオリゴヌクレオチドであり、前記少なくとも1つのMG特異的プローブが、配列番号22の配列またはその相補配列であり、前記配列は、少なくとも1つの検出ラベルおよび/または少なくとも1つのビーコンアームに任意に連結されるか、または
前記少なくとも2つのMG標的プライマーが、配列番号27および30のオリゴヌクレオチドであり、前記少なくとも1つのMG特異的プローブが、配列番号28の配列またはその相補配列であり、前記配列は、少なくとも1つの検出ラベルおよび/または少なくとも1つのビーコンアームに任意に連結されるか、または
前記少なくとも2つのMG標的プライマーが、配列番号33および36のオリゴヌクレオチドであり、前記少なくとも1つのMG特異的プローブが、配列番号34の配列またはその相補配列であり、前記配列は、少なくとも1つの検出ラベルおよび/または少なくとも1つのビーコンアームに任意に連結されるか、または
前記少なくとも2つのMG標的プライマーが、配列番号39および36のオリゴヌクレオチドであり、前記少なくとも1つのMG特異的プローブが、配列番号40の配列またはその相補配列であり、前記配列は、少なくとも1つの検出ラベルおよび/または少なくとも1つのビーコンアームに任意に連結され、
c/について:
前記少なくとも2つのNG標的プライマーが、配列番号44および47のオリゴヌクレオチドであり、前記少なくとも1つのNG特異的プローブが、配列番号45の配列またはその相補配列であり、前記配列は、少なくとも1つの検出ラベルおよび/または少なくとも1つのビーコンアームに任意に連結される、
方法。 - 請求項22に記載の方法であって、前記プライマーおよびプローブが、
a/ 前記少なくとも2つのMG標的プライマーおよび前記少なくとも1つのMG特異的プローブ、
b/ 前記少なくとも2つのCT標的プライマーおよび前記少なくとも1つのCT特異的プローブ、および
c/ 前記少なくとも2つのNG標的プライマーおよび前記少なくとも1つのNG特異的プローブ
を含む、方法。 - 請求項22または23に記載の方法であって、前記少なくとも1つのMG特異的プローブが、フルオロフォアに連結される、方法。
- 請求項22〜24のいずれか1項に記載の方法であって、前記サンプルが、CTおよび/またはNGを更に含有する、方法。
- NGからアンプリコンを産生する方法であって、同一の増幅チューブ内でプライマーおよびプローブを用いてリアルタイムマルチプレックス増幅により、NG含有サンプルまたはその核酸材料から前記アンプリコンを産生することを含み、前記プライマーおよびプローブは、
a/ 少なくとも2つのNG標的プライマーおよび少なくとも1つのNG特異的プローブ
を含み、前記プライマーおよびプローブは、
b/ 少なくとも2つのCT標的プライマーおよび少なくとも1つのCT特異的プローブ、および/または
c/ 少なくとも2つのMG標的プライマーおよび少なくとも1つのMG特異的プローブ
を更に含み、
b/について:
前記少なくとも2つのCT標的プライマーが、配列番号7および12のオリゴヌクレオチドであり、前記少なくとも1つのCT特異的プローブが、配列番号8の配列またはその相補配列であり、前記配列は、少なくとも1つの検出ラベルおよび/または少なくとも1つのビーコンアームに任意に連結され、
c/について:
前記少なくとも2つのMG標的プライマーが、配列番号15および18のオリゴヌクレオチドであり、前記少なくとも1つのMG特異的プローブが、配列番号16の配列またはその相補配列であり、前記配列は、少なくとも1つの検出ラベルおよび/または少なくとも1つのビーコンアームに任意に連結されるか、または
前記少なくとも2つのMG標的プライマーが、配列番号21および24のオリゴヌクレオチドであり、前記少なくとも1つのMG特異的プローブが、配列番号22の配列またはその相補配列であり、前記配列は、少なくとも1つの検出ラベルおよび/または少なくとも1つのビーコンアームに任意に連結されるか、または
前記少なくとも2つのMG標的プライマーが、配列番号27および30のオリゴヌクレオチドであり、前記少なくとも1つのMG特異的プローブが、配列番号28の配列またはその相補配列であり、前記配列は、少なくとも1つの検出ラベルおよび/または少なくとも1つのビーコンアームに任意に連結されるか、または
前記少なくとも2つのMG標的プライマーが、配列番号33および36のオリゴヌクレオチドであり、前記少なくとも1つのMG特異的プローブが、配列番号34の配列またはその相補配列であり、前記配列は、少なくとも1つの検出ラベルおよび/または少なくとも1つのビーコンアームに任意に連結されるか、または
前記少なくとも2つのMG標的プライマーが、配列番号39および36のオリゴヌクレオチドであり、前記少なくとも1つのMG特異的プローブが、配列番号40の配列またはその相補配列であり、前記配列は、少なくとも1つの検出ラベルおよび/または少なくとも1つのビーコンアームに任意に連結され、
a/について:
前記少なくとも2つのNG標的プライマーが、配列番号44および47のオリゴヌクレオチドであり、前記少なくとも1つのNG特異的プローブが、配列番号45の配列またはその相補配列であり、前記配列は、少なくとも1つの検出ラベルおよび/または少なくとも1つのビーコンアームに任意に連結される、
方法。 - 請求項26に記載の方法であって、前記プライマーおよびプローブが、
a/ 前記少なくとも2つのNG標的プライマーおよび前記少なくとも1つのNG特異的プローブ、
b/ 前記少なくとも2つのCT標的プライマーおよび前記少なくとも1つのCT特異的プローブ、および
c/ 前記少なくとも2つのMG標的プライマーおよび前記少なくとも1つのMG特異的プローブ
を含む、方法。 - 請求項26または27に記載の方法であって、前記少なくとも1つのNG特異的プローブが、フルオロフォアに連結される、方法。
- 請求項26〜28のいずれか1項に記載の方法であって、前記サンプルが、CTおよび/またはMGを更に含有する、方法。
- a/ 少なくとも2つのCT標的プライマーおよび少なくとも1つのCT特異的プローブ
を含み、
b/ 少なくとも2つのMG標的プライマーおよび少なくとも1つのMG特異的プローブ、および/または
c/ 少なくとも2つのNG標的プライマーおよび少なくとも1つのNG特異的プローブ
を更に含む、オリゴヌクレオチド組であって、
a/について:
前記少なくとも2つのCT標的プライマーが、配列番号7および12のオリゴヌクレオチドであり、前記少なくとも1つのCT特異的プローブが、配列番号8の配列またはその相補配列であり、前記配列は、少なくとも1つの検出ラベルおよび/または少なくとも1つのビーコンアームに任意に連結され、
b/について:
前記少なくとも2つのMG標的プライマーが、配列番号15および18のオリゴヌクレオチドであり、前記少なくとも1つのMG特異的プローブが、配列番号16の配列またはその相補配列であり、前記配列は、少なくとも1つの検出ラベルおよび/または少なくとも1つのビーコンアームに任意に連結されるか、または
前記少なくとも2つのMG標的プライマーが、配列番号21および24のオリゴヌクレオチドであり、前記少なくとも1つのMG特異的プローブが、配列番号22の配列またはその相補配列であり、前記配列は、少なくとも1つの検出ラベルおよび/または少なくとも1つのビーコンアームに任意に連結されるか、または
前記少なくとも2つのMG標的プライマーが、配列番号27および30のオリゴヌクレオチドであり、前記少なくとも1つのMG特異的プローブが、配列番号28の配列またはその相補配列であり、前記配列は、少なくとも1つの検出ラベルおよび/または少なくとも1つのビーコンアームに任意に連結されるか、または
前記少なくとも2つのMG標的プライマーが、配列番号33および36のオリゴヌクレオチドであり、前記少なくとも1つのMG特異的プローブが、配列番号34の配列またはその相補配列であり、前記配列は、少なくとも1つの検出ラベルおよび/または少なくとも1つのビーコンアームに任意に連結されるか、または
前記少なくとも2つのMG標的プライマーが、配列番号39および36のオリゴヌクレオチドであり、前記少なくとも1つのMG特異的プローブが、配列番号40の配列またはその相補配列であり、前記配列は、少なくとも1つの検出ラベルおよび/または少なくとも1つのビーコンアームに任意に連結され、
c/について:
前記少なくとも2つのNG標的プライマーが、配列番号44および47のオリゴヌクレオチドであり、前記少なくとも1つのNG特異的プローブが、配列番号45の配列またはその相補配列であり、前記配列は、少なくとも1つの検出ラベルおよび/または少なくとも1つのビーコンアームに任意に連結される、
オリゴヌクレオチド組。 - 請求項30に記載のオリゴヌクレオチド組であって、
a/について:
前記少なくとも2つのCT標的プライマーが、配列番号7および12のオリゴヌクレオチドであり、前記少なくとも1つのCT特異的プローブが、配列番号8もしくは9の配列またはその相補配列であり、前記配列は、少なくとも1つの検出ラベルに任意に連結され、
b/について:
前記少なくとも2つのMG標的プライマーが、配列番号15および18のオリゴヌクレオチドであり、前記少なくとも1つのMG特異的プローブが、配列番号16もしくは17の配列またはその相補配列であり、前記配列は、少なくとも1つの検出ラベルに任意に連結されるか、または
前記少なくとも2つのMG標的プライマーが、配列番号21および24のオリゴヌクレオチドであり、前記少なくとも1つのMG特異的プローブが、配列番号22もしくは23の配列またはその相補配列であり、前記配列は、少なくとも1つの検出ラベルに任意に連結されるか、または
前記少なくとも2つのMG標的プライマーが、配列番号27および30のオリゴヌクレオチドであり、前記少なくとも1つのMG特異的プローブが、配列番号28もしくは29の配列またはその相補配列であり、前記配列は、少なくとも1つの検出ラベルに任意に連結されるか、または
前記少なくとも2つのMG標的プライマーが、配列番号33および36のオリゴヌクレオチドであり、前記少なくとも1つのMG特異的プローブが、配列番号34もしくは35の配列またはその相補配列であり、前記配列は、少なくとも1つの検出ラベルに任意に連結されるか、または
前記少なくとも2つのMG標的プライマーが、配列番号39および36のオリゴヌクレオチドであり、前記少なくとも1つのMG特異的プローブが、配列番号40もしくは41の配列またはその相補配列であり、前記配列は、少なくとも1つの検出ラベルに任意に連結され、
c/について:
前記少なくとも2つのNG標的プライマーが、配列番号44および47のオリゴヌクレオチドであり、前記少なくとも1つのNG特異的プローブが、配列番号45もしくは46の配列またはその相補配列であり、前記配列は、少なくとも1つの検出ラベルに任意に連結される、
オリゴヌクレオチド組。 - 請求項30または31に記載のオリゴヌクレオチド組であって、前記少なくとも1つのCT特異的プローブが、フルオロフォアに連結される、オリゴヌクレオチド組。
- a/ 少なくとも2つのMG標的プライマーおよび少なくとも1つのMG特異的プローブ
を含み、
b/ 少なくとも2つのCT標的プライマーおよび少なくとも1つのCT特異的プローブ、および/または
c/ 少なくとも2つのNG標的プライマーおよび少なくとも1つのNG特異的プローブ
を更に含む、オリゴヌクレオチド組であって、
b/について:
前記少なくとも2つのCT標的プライマーが、配列番号7および12のオリゴヌクレオチドであり、前記少なくとも1つのCT特異的プローブが、配列番号8の配列またはその相補配列であり、前記配列は、少なくとも1つの検出ラベルおよび/または少なくとも1つのビーコンアームに任意に連結され、
a/について:
前記少なくとも2つのMG標的プライマーが、配列番号15および18のオリゴヌクレオチドであり、前記少なくとも1つのMG特異的プローブが、配列番号16の配列またはその相補配列であり、前記配列は、少なくとも1つの検出ラベルおよび/または少なくとも1つのビーコンアームに任意に連結されるか、または
前記少なくとも2つのMG標的プライマーが、配列番号21および24のオリゴヌクレオチドであり、前記少なくとも1つのMG特異的プローブが、配列番号22の配列またはその相補配列であり、前記配列は、少なくとも1つの検出ラベルおよび/または少なくとも1つのビーコンアームに任意に連結されるか、または
前記少なくとも2つのMG標的プライマーが、配列番号27および30のオリゴヌクレオチドであり、前記少なくとも1つのMG特異的プローブが、配列番号28の配列またはその相補配列であり、前記配列は、少なくとも1つの検出ラベルおよび/または少なくとも1つのビーコンアームに任意に連結されるか、または
前記少なくとも2つのMG標的プライマーが、配列番号33および36のオリゴヌクレオチドであり、前記少なくとも1つのMG特異的プローブが、配列番号34の配列またはその相補配列であり、前記配列は、少なくとも1つの検出ラベルおよび/または少なくとも1つのビーコンアームに任意に連結されるか、または
前記少なくとも2つのMG標的プライマーが、配列番号39および36のオリゴヌクレオチドであり、前記少なくとも1つのMG特異的プローブが、配列番号40の配列またはその相補配列であり、前記配列は、少なくとも1つの検出ラベルおよび/または少なくとも1つのビーコンアームに任意に連結され、
c/について:
前記少なくとも2つのNG標的プライマーが、配列番号44および47のオリゴヌクレオチドであり、前記少なくとも1つのNG特異的プローブが、配列番号45の配列またはその相補配列であり、前記配列は、少なくとも1つの検出ラベルおよび/または少なくとも1つのビーコンアームに任意に連結される、
オリゴヌクレオチド組。 - 請求項33に記載のオリゴヌクレオチド組であって、
b/について:
前記少なくとも2つのCT標的プライマーが、配列番号7および12のオリゴヌクレオチドであり、前記少なくとも1つのCT特異的プローブが、配列番号8もしくは9の配列またはその相補配列であり、前記配列は、少なくとも1つの検出ラベルに任意に連結され、
a/について:
前記少なくとも2つのMG標的プライマーが、配列番号15および18のオリゴヌクレオチドであり、前記少なくとも1つのMG特異的プローブが、配列番号16もしくは17の配列またはその相補配列であり、前記配列は、少なくとも1つの検出ラベルに任意に連結されるか、または
前記少なくとも2つのMG標的プライマーが、配列番号21および24のオリゴヌクレオチドであり、前記少なくとも1つのMG特異的プローブが、配列番号22もしくは23の配列またはその相補配列であり、前記配列は、少なくとも1つの検出ラベルに任意に連結されるか、または
前記少なくとも2つのMG標的プライマーが、配列番号27および30のオリゴヌクレオチドであり、前記少なくとも1つのMG特異的プローブが、配列番号28もしくは29の配列またはその相補配列であり、前記配列は、少なくとも1つの検出ラベルに任意に連結されるか、または
前記少なくとも2つのMG標的プライマーが、配列番号33および36のオリゴヌクレオチドであり、前記少なくとも1つのMG特異的プローブが、配列番号34もしくは35の配列またはその相補配列であり、前記配列は、少なくとも1つの検出ラベルに任意に連結されるか、または
前記少なくとも2つのMG標的プライマーが、配列番号39および36のオリゴヌクレオチドであり、前記少なくとも1つのMG特異的プローブが、配列番号40もしくは41の配列またはその相補配列であり、前記配列は、少なくとも1つの検出ラベルに任意に連結され、
c/について:
前記少なくとも2つのNG標的プライマーが、配列番号44および47のオリゴヌクレオチドであり、前記少なくとも1つのNG特異的プローブが、配列番号45もしくは46の配列またはその相補配列であり、前記配列は、少なくとも1つの検出ラベルに任意に連結される、
オリゴヌクレオチド組。 - 請求項33または34に記載のオリゴヌクレオチド組であって、前記少なくとも1つのMG特異的プローブが、フルオロフォアに連結される、オリゴヌクレオチド組。
- a/ 少なくとも2つのNG標的プライマーおよび少なくとも1つのNG特異的プローブ
を含み、
b/ 少なくとも2つのCT標的プライマーおよび少なくとも1つのCT特異的プローブ、および/または
c/ 少なくとも2つのMG標的プライマーおよび少なくとも1つのMG特異的プローブ
を更に含む、オリゴヌクレオチド組であって、
b/について:
前記少なくとも2つのCT標的プライマーが、配列番号7および12のオリゴヌクレオチドであり、前記少なくとも1つのCT特異的プローブが、配列番号8の配列またはその相補配列であり、前記配列は、少なくとも1つの検出ラベルおよび/または少なくとも1つのビーコンアームに任意に連結され、
c/について:
前記少なくとも2つのMG標的プライマーが、配列番号15および18のオリゴヌクレオチドであり、前記少なくとも1つのMG特異的プローブが、配列番号16の配列またはその相補配列であり、前記配列は、少なくとも1つの検出ラベルおよび/または少なくとも1つのビーコンアームに任意に連結されるか、または
前記少なくとも2つのMG標的プライマーが、配列番号21および24のオリゴヌクレオチドであり、前記少なくとも1つのMG特異的プローブが、配列番号22の配列またはその相補配列であり、前記配列は、少なくとも1つの検出ラベルおよび/または少なくとも1つのビーコンアームに任意に連結されるか、または
前記少なくとも2つのMG標的プライマーが、配列番号27および30のオリゴヌクレオチドであり、前記少なくとも1つのMG特異的プローブが、配列番号28の配列またはその相補配列であり、前記配列は、少なくとも1つの検出ラベルおよび/または少なくとも1つのビーコンアームに任意に連結されるか、または
前記少なくとも2つのMG標的プライマーが、配列番号33および36のオリゴヌクレオチドであり、前記少なくとも1つのMG特異的プローブが、配列番号34の配列またはその相補配列であり、前記配列は、少なくとも1つの検出ラベルおよび/または少なくとも1つのビーコンアームに任意に連結されるか、または
前記少なくとも2つのMG標的プライマーが、配列番号39および36のオリゴヌクレオチドであり、前記少なくとも1つのMG特異的プローブが、配列番号40の配列またはその相補配列であり、前記配列は、少なくとも1つの検出ラベルおよび/または少なくとも1つのビーコンアームに任意に連結され、
a/について:
前記少なくとも2つのNG標的プライマーが、配列番号44および47のオリゴヌクレオチドであり、前記少なくとも1つのNG特異的プローブが、配列番号45の配列またはその相補配列であり、前記配列は、少なくとも1つの検出ラベルおよび/または少なくとも1つのビーコンアームに任意に連結される、
オリゴヌクレオチド組。 - 請求項36に記載のオリゴヌクレオチド組であって、
b/について:
前記少なくとも2つのCT標的プライマーが、配列番号7および12のオリゴヌクレオチドであり、前記少なくとも1つのCT特異的プローブが、配列番号8もしくは9の配列またはその相補配列であり、前記配列は、少なくとも1つの検出ラベルに任意に連結され、
c/について:
前記少なくとも2つのMG標的プライマーが、配列番号15および18のオリゴヌクレオチドであり、前記少なくとも1つのMG特異的プローブが、配列番号16もしくは17の配列またはその相補配列であり、前記配列は、少なくとも1つの検出ラベルに任意に連結されるか、または
前記少なくとも2つのMG標的プライマーが、配列番号21および24のオリゴヌクレオチドであり、前記少なくとも1つのMG特異的プローブが、配列番号22もしくは23の配列またはその相補配列であり、前記配列は、少なくとも1つの検出ラベルに任意に連結されるか、または
前記少なくとも2つのMG標的プライマーが、配列番号27および30のオリゴヌクレオチドであり、前記少なくとも1つのMG特異的プローブが、配列番号28もしくは29の配列またはその相補配列であり、前記配列は、少なくとも1つの検出ラベルに任意に連結されるか、または
前記少なくとも2つのMG標的プライマーが、配列番号33および36のオリゴヌクレオチドであり、前記少なくとも1つのMG特異的プローブが、配列番号34もしくは35の配列またはその相補配列であり、前記配列は、少なくとも1つの検出ラベルに任意に連結されるか、または
前記少なくとも2つのMG標的プライマーが、配列番号39および36のオリゴヌクレオチドであり、前記少なくとも1つのMG特異的プローブが、配列番号40もしくは41の配列またはその相補配列であり、前記配列は、少なくとも1つの検出ラベルに任意に連結され、
a/について:
前記少なくとも2つのNG標的プライマーが、配列番号44および47のオリゴヌクレオチドであり、前記少なくとも1つのNG特異的プローブが、配列番号45もしくは46の配列またはその相補配列であり、前記配列は、少なくとも1つの検出ラベルに任意に連結される、
オリゴヌクレオチド組。 - 請求項36または37に記載のオリゴヌクレオチド組であって、前記少なくとも1つのNG特異的プローブが、フルオロフォアに連結される、オリゴヌクレオチド組。
- 医薬組成物または増幅組成物であって、
CT、MGおよびNG含有サンプルに対して請求項1〜17のいずれか1項の検出方法を実施することにより得られる少なくとも1つのCTおよび/またはMGおよび/またはNGアンプリコンを含み、前記検出方法のリアルタイムマルチプレックスプライマーおよびプローブを更に含むか、または
請求項18〜21のいずれか1項の産生方法により得られるCTアンプリコンを含み、前記産生方法のリアルタイムマルチプレックスプライマーおよびプローブを更に含むか、または
請求項22〜25のいずれか1項の産生方法により得られるMGアンプリコンを含み、前記産生方法のリアルタイムマルチプレックスプライマーおよびプローブを更に含むか、または
請求項26〜29のいずれか1項の産生方法により得られるNGアンプリコンを含み、前記産生方法のリアルタイムマルチプレックスプライマーおよびプローブを更に含むか、または
同一の増幅チューブ内で請求項30〜32のいずれか1項のオリゴヌクレオチド組を用いてCT核酸からリアルタイムマルチプレックス増幅により得られるCTアンプリコンを含み、前記オリゴヌクレオチド組を更に含むか、または
同一の増幅チューブ内で請求項33〜35のいずれか1項のオリゴヌクレオチド組を用いてMG核酸からリアルタイムマルチプレックス増幅により得られるMGアンプリコンを含み、前記オリゴヌクレオチド組を更に含むか、または
同一の増幅チューブ内で請求項36〜38のいずれか1項のオリゴヌクレオチド組を用いてNG核酸からリアルタイムマルチプレックス増幅により得られるNGアンプリコンを含み、前記オリゴヌクレオチド組を更に含む、
組成物。 - CTおよび/またはMGおよび/またはNGによる感染を診断するためのキットであって:
−請求項30〜38の何れか1項の少なくとも1つのオリゴヌクレオチド組;
−任意に、その使用および/またはヌクレオチドのための説明書
を含むキット。 - 請求項40に記載のキットであって、更に、配列番号48のオリゴヌクレオチド、および/または配列番号49および52のプライマー対、および/または配列番号50のプローブ、および/または配列番号51のプローブを含んでなるキット。
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