JP2016198018A - 淋菌を検出するためのオリゴヌクレオチドプライマーおよび当該プライマーを用いた淋菌の検出方法 - Google Patents

Abstract

【課題】 試料中に存在する淋菌を特異的に検出するためのオリゴヌクレオチドプライマー、および当該プライマーを用いた淋菌の検出方法を提供すること。【解決手段】 試料中に含まれる淋菌１６Ｓ ｒＲＮＡの特定塩基配列の一部と相同的な配列を有する第一のプライマーと、前記特定塩基配列の一部と相補的な配列を有する第二のプライマーとからなる、前記特定塩基配列または前記特定塩基配列の相補鎖を含む核酸を増幅するためのプライマーセットを最適化することで、前記課題を解決する。【選択図】 なし

Description

本発明は、試料中に存在する淋菌を迅速、高感度かつ特異的に検出するためのオリゴヌクレオチドプライマー、および当該プライマーを用いた淋菌の検出方法に関する。

淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）はナイセリア属に属するグラム陰性の双球菌であり、淋菌感染症の原因微生物である。淋菌感染症は、性感染症の中では性器クラミジア感染症と並んで、頻度の高い感染症である。主に性行為で感染し、男性では尿道炎、女性では子宮頸管炎や尿道炎を引き起こす。また重症例では、男性における精巣上体炎、女性では骨盤内炎症性疾患を生じる。

近年、性行動の多様化を反映して、咽頭や直腸感染など、性器外の感染例が増加している。性器での淋菌またはクラミジア陽性患者や性産業従業女性を対象に、咽頭での淋菌およびクラミジア検査を行なった結果、前記陽性患者の多くは、咽頭発赤や扁桃腫脹など他覚的所見が見られない無症候性感染者であった（非特許文献１）。そのため、前記患者が無自覚のうちに他者への感染源となる可能性が考えられる。さらに無症候性感染者のうち、女性の患者は、そのまま放置すると、子宮外妊娠、不妊症、分娩時の産道感染による新生児結膜炎など、重篤な合併症が生じる可能性がある。したがって、淋菌への感染が判明した場合、確実に治療することが必要であり、感染が疑われる患者や妊婦に対し、淋菌検査を実施することは非常に重要である。

従来から臨床的に用いられている淋菌感染症の検出法には、尿道分泌物のグラム染色標本の検鏡、分離培養、核酸増幅などがあげられる。グラム染色標本の検鏡による検査は、迅速な検査法であるものの、他の雑菌が存在することで、淋菌の確認が困難となる問題点がある。分離培養による検査は、淋菌が熱、乾燥および温度変化に弱く、検体輸送中に菌が死滅しやすいこと、また雑菌が混入すると淋菌の確認が困難となること、操作が繁雑であること、結果に数日間を要するため迅速検査には向かないこと、等の問題点がある。

一方、核酸増幅による検査は淋菌に特異的な遺伝子（ＤＮＡやＲＮＡ）を検出する方法であり、感度、特異性ともに前述した従来の検査と比較して極めて高く、また検体として、非侵襲的である尿検体を使用できるため、現在主流となりつつある。核酸増幅による淋菌検査法としては、ＰＣＲ法を利用した方法（特許文献１）、ＳＤＡ（Ｓｔｒａｎｄ Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法を利用した方法（特許文献２）、ＴＭＡ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法を利用した方法（特許文献３）、ＴＲＣ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｒｅｖｅｒｓｅ−ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｃｏｎｃｅｒｔｅｄ ｒｅａｃｔｉｏｎ）法を利用した方法（特許文献４）が開示されている。

しかしながら増幅対象核酸が淋菌１６Ｓ ｒＲＮＡまたはその遺伝子の場合、他の菌種の１６Ｓ ｒＲＮＡ（またはその遺伝子）との間で塩基配列の相同性が高いものが多数存在するため、淋菌１６Ｓ ｒＲＮＡまたはその遺伝子を高感度かつ特異的に検出するプライマーセットやプローブを設計することは極めて困難であった。特に比較的低温の一定温度（例えば、４０から５０℃）条件下でＲＮＡの増幅が可能な増幅方法を利用する場合、オリゴヌクレオチドプローブが高次構造を形成しやすくなるため、当該プライマーセットやプローブの設計はさらに困難であった。

特表２００９−５３３０２３号公報 特開平１１−２２５７８１号公報 特表平１１−５０７２３９号公報 特開２０１３−１８８１８１号公報

日本性感染症学会、性感染症 診断・治療 ガイドライン、３７（２０１１）

本発明の目的は、試料中に存在する淋菌を特異的に検出するためのオリゴヌクレオチドプライマー、および当該プライマーを用いた淋菌の検出方法を提供することにある。

本発明者らは、上記目的に鑑みて鋭意研究を重ねた結果、本発明を完成するに至った。

すなわち本発明の第一の態様は、
試料中に含まれる淋菌１６Ｓ ｒＲＮＡの特定塩基配列の一部と相同的な配列を有する第一のプライマーと、前記特定塩基配列の一部と相補的な配列を有する第二のプライマーとからなる、前記特定塩基配列または前記特定塩基配列の相補配列を含む核酸を増幅するためのプライマーセットであって、
第一のプライマーが、配列番号１３に記載の塩基配列とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドであり、
第二のプライマーが、配列番号２０に記載の塩基配列とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドである、
前記プライマーセットである。

また本発明の第二の態様は、
第一のプライマーが、配列番号２７に記載の塩基配列中、少なくとも連続する１５塩基からなるオリゴヌクレオチドであり、
第二のプライマーが、配列番号２８に記載の塩基配列中、少なくとも連続する１４塩基からなるオリゴヌクレオチドである、
前記第一の態様に記載のプライマーセットである。

また本発明の第三の態様は、
第一のプライマーが、配列番号７から１２のいずれかに記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであり、
第二のプライマーが、配列番号１５から１９のいずれかに記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである、
前記第二の態様に記載のプライマーセットである。

また本発明の第四の態様は、第一または第二のプライマーのいずれか一方の５’末端側にＲＮＡポリメラーゼのプロモーターがさらに付加されている、前記第一から第三の態様のいずれかに記載のプライマーセットである。

さらに本発明の第五の態様は、前記第一から第四の態様のいずれかに記載のプライマーセットで増幅した特定塩基配列または前記特定塩基配列の相補配列を含む核酸を、前記核酸の一部とストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズ可能なインターカレーター性蛍光色素を標識したオリゴヌクレオチドプローブを用いて、淋菌１６Ｓ ｒＲＮＡを検出する方法である。

また本発明の第六の態様は、インターカレーター性蛍光色素を標識したオリゴヌクレオチドプローブを構成するオリゴヌクレオチドが、配列番号２５に記載の塩基配列またはその相補配列とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドである、前記第五の態様に記載の方法である。

また本発明の第七の態様は、インターカレーター性蛍光色素を標識したオリゴヌクレオチドプローブを構成するオリゴヌクレオチドが配列番号２２から２４のいずれかに記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである、前記第六の態様に記載の方法である。

さらに本発明の第八の態様は、前記第一から第四の態様のいずれかに記載のプライマーセットと、配列番号２５に記載の塩基配列またはその相補配列とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドにインターカレーター性蛍光色素を標識した核酸プローブとを含む、淋菌１６Ｓ ｒＲＮＡ検出試薬である。

また本発明の第九の態様は、インターカレーター性蛍光色素を標識した核酸プローブを構成するオリゴヌクレオチドが配列番号２２から２４のいずれかに記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである、前記第八の態様に記載の試薬である。

以下、本発明を詳細に説明する。

本発明中において試料とは、食品、飲料水、環境水、糞便および嘔吐物、鼻腔、咽頭および尿道、子宮頸管等のぬぐい液、うがい液、血液、尿、その他の分泌液、体液、組織洗浄液などがあげられる。

本発明において特定塩基配列とは、淋菌１６Ｓ ｒＲＮＡのうち、第一のプライマーとの相同領域の５’末端から第二のプライマーとの相補領域の３’末端までの塩基配列のことをいう。すなわち本発明では前記特定塩基配列または前記特定塩基配列の相補配列を含む核酸が増幅されることになる。

本発明におけるストリンジェントな条件の例として、４２℃において、５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミド、０．１％ウシ血清アルブミン、０．１％フィコール、０．１％のポリビニルピロリドン、５０ｍＭのリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．５）、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭのクエン酸ナトリウムが存在する条件や、本明細書の実施例に記載の核酸増幅条件があげられる。すなわち、前述したストリンジェントな条件下で、前記塩基配列と、十分に特異的かつ高効率にハイブリダイゼーション可能であれば、塩基配列の置換、欠失、付加、修飾があってもよい。プライマーの長さは任意に設定できるが、好ましくは１０塩基から５０塩基までの範囲である。

本発明は、
試料中に含まれる淋菌１６Ｓ ｒＲＮＡの特定塩基配列の一部と相同的な配列を有する第一のプライマーとして、配列番号１３に記載の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＮＲ＿１０３９１７の６６番目から９５番目までの塩基配列の相補配列）とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドを、
試料中に含まれる淋菌１６Ｓ ｒＲＮＡの特定塩基配列の一部と相補的な配列を有する第二のプライマーとして、配列番号２０に記載の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＮＲ＿１０３９１７の１７９番目から２２６番目までの塩基配列）とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドを、
それぞれ用いることを特徴としている。

配列番号１３に記載の塩基配列とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドの一例として、配列番号１３に記載の塩基配列の相補配列である配列番号２７に記載の塩基配列中、少なくとも連続する１５塩基からなるオリゴヌクレオチドがあげられ、さらに具体的な例として、配列番号７（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＮＲ＿１０３９１７の７５番目から９４番目までの塩基配列）、配列番号８（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＮＲ＿１０３９１７の６６番目から８５番目までの塩基配列）、配列番号９（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＮＲ＿１０３９１７の７９番目から９５番目までの塩基配列）、配列番号１０（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＮＲ＿１０３９１７の６８番目から８２番目までの塩基配列）、配列番号１１（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＮＲ＿１０３９１７の６８番目から８８番目までの塩基配列）および配列番号１２（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＮＲ＿１０３９１７の６８番目から９１番目までの塩基配列）に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドがあげられる。

配列番号２０に記載の塩基配列とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドの一例として、配列番号２０に記載の塩基配列の相補配列である配列番号２８に記載の塩基配列中、少なくとも連続する１４塩基からなるオリゴヌクレオチドがあげられ、さらに具体的な例として、配列番号１５（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＮＲ＿１０３９１７の１７９番目から１９６番目までの塩基配列の相補配列）、配列番号１６（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＮＲ＿１０３９１７の２０７番目から２２６番目までの塩基配列の相補配列）、配列番号１７（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＮＲ＿１０３９１７の１８３番目から１９６番目までの塩基配列の相補配列）、配列番号１８（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＮＲ＿１０３９１７の１７９番目から２０３番目までの塩基配列の相補配列）および配列番号１９（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＮＲ＿１０３９１７の１８２番目から２０５番目までの塩基配列の相補配列）に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドがあげられる。

本発明のプライマーセットは、ＲＴ−ＰＣＲ法等、当業者が通常用いる核酸増幅法を利用した、淋菌１６Ｓ ｒＲＮＡの特定塩基配列または前記特定塩基配列の相補配列を含む核酸を増幅するためのプライマーセットとして有用である。なお第一または第二のプライマーのいずれか一方の５’末端側にＲＮＡポリメラーゼのプロモーターをさらに付加させると、前記プロモーターに対応したＲＮＡポリメラーゼを用いて、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーターを付加した特定塩基配列または前記特定塩基配列の相補配列を含む核酸が合成されるため、これら核酸からＮＡＳＢＡ法、ＴＭＡ法、ＴＲＣ法といった一定温度でＲＮＡを増幅する方法を用いて、ＲＮＡを増幅させることができる点で好ましい。プライマーの５’末端側に付加するプロモーターは、ＲＮＡ増幅に用いるＲＮＡポリメラーゼ（例えば、分子生物学の分野で汎用される、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ ＲＮＡポリメラーゼやＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ）に対応したプロモーターを用いればよい。また前記プロモーターに、転写効率に影響を及ぼすことが知られている転写開始領域をさらに付加してもよい。ＲＮＡ増幅に用いるＲＮＡポリメラーゼとしてＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを用いたときの、プライマーの５’末端側に付加するプロモーター（Ｔ７プロモーター）の具体例として、配列番号２６に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドがあげられる。

本発明のプライマーセットを用いて増幅した淋菌１６Ｓ ｒＲＮＡの特定塩基配列またはその相補配列を含む核酸の検出は、従来から知られた核酸検出方法を利用することができる。具体的には、
（Ａ）電気泳動や液体クロマトグラフィーを用いた方法、
（Ｂ）検出可能な標識で標識された核酸プローブによるハイブリダイゼーション法、
（Ｃ）当該増幅産物の塩基配列の一部とハイブリダイズすることで蛍光特性が変化するように設計された蛍光色素標識プローブを用いた方法、
などがあげられる。前記（Ｃ）の蛍光色素標識プローブの一例として、ＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動）を利用した蛍光標識プローブや、インターカレーター性蛍光色素で標識された核酸プローブがあげられる。

前記インターカレーター性蛍光色素で標識された核酸プローブの一例として、淋菌１６Ｓ ｒＲＮＡの特定塩基配列または当該特定塩基配列の相補配列を含む核酸の一部とストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドの３’末端側、５’末端側、リン酸ジエステル部もしくは塩基部分に、適当なリンカーを介してインターカレーター性蛍光色素を標識したオリゴヌクレオチドプローブがある。前記プローブは淋菌１６Ｓ ｒＲＮＡの特定塩基配列（または当該特定塩基配列の相補配列）と相補的２本鎖を形成するとインターカレーター性蛍光色素部分が前記相補的２本鎖部分にインターカレートすることで蛍光特性が変化するプローブである。標識するインターカレーター性蛍光色素に特に限定はなく、オキサゾールイエロー、チアゾールオレンジ、エチジウムブロマイド、ヘミシアニン等の汎用されている蛍光色素、およびこれらの誘導体の中から、蛍光強度や蛍光特性を考慮して、適宜選定すればよい。なお３’末端側に蛍光色素を標識する場合を除き、オリゴヌクレオチドの３’末端側は当該末端側からの核酸伸長反応を防止する意味で、グリコール酸などの適当な修飾がされているとよい。

前記インターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドプローブを構成するオリゴヌクレオチドの好ましい例として、配列番号２５に記載の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＮＲ＿１０３９１７の１２６番目から１４５番目までの塩基配列）またはその相補配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドがあげられ、さらに具体的な例として、配列番号２２（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＮＲ＿１０３９１７の１３０番目から１４５番目までの塩基配列の相補配列、ただし１３６番目の塩基はＮ）、配列番号２３（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＮＲ＿１０３９１７の１３０番目から１４５番目までの塩基配列の相補配列）および配列番号２４（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＮＲ＿１０３９１７の１２６番目から１４５番目までの塩基配列の相補配列、ただし１３６番目の塩基はＮ）に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドがあげられる。

本発明のプライマーセットを用いて淋菌１６Ｓ ｒＲＮＡを検出するには、例えば以下の（１）から（６）に示す工程により実施すればよい。
（１）配列番号２０に記載の塩基配列とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドである第二のプライマーが淋菌１６Ｓ ｒＲＮＡにハイブリダイズし、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素により、特定塩基配列に相補的なｃＤＮＡを合成し、前記ＲＮＡとのＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖を生成する工程、
（２）リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ Ｈ）活性を有する酵素により、前記ＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖のＲＮＡを分解する工程（１本鎖ＤＮＡの生成）、
（３）該１本鎖ＤＮＡに、配列番号１３に記載の塩基配列とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドである第一のプライマーがハイブリダイズし（ここで前記第一または第二のプライマーのいずれか一方はその５’末端側にＲＮＡポリメラーゼのプロモーターが付加される）、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素により、特定塩基配列または特定塩基配列に相補的な配列のＲＮＡを転写可能なプロモーターを含む２本鎖ＤＮＡを生成する工程、
（４）ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素により前記２本鎖ＤＮＡを鋳型とするＲＮＡ転写産物を生産する工程、
（５）該ＲＮＡ転写産物が、前記（１）の反応におけるｃＤＮＡ合成の鋳型となることで、連鎖的にＲＮＡ転写産物を生成する工程、
（６）配列番号２５またはその相補配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドにインターカレーター性蛍光色素を標識したオリゴヌクレオチドプローブを用いて、前記ＲＮＡ転写産物量を経時的に測定する工程、
前記（１）の工程で用いるＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素、前記（２）の工程で用いるＲＮａｓｅ Ｈ活性を有する酵素、および前記（３）の工程で用いるＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素は、それぞれ別個あるいは種々の組合せで添加することもできるが、前記活性を併せ持つレトロウイルス由来の逆転写酵素を使用することもできる。該逆転写酵素は特に限定されないが、分子生物学の分野で汎用される、ＡＭＶ（Ａｖｉａｎ Ｍｙｅｌｏｂｌａｓｔｏｓｉｓ Ｖｉｒｕｓ）逆転写酵素、ＭＭＬＶ（Ｍｏｌｏｎｙ Ｍｕｒｉｎｅ Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｖｉｒｕｓ）逆転写酵素、ＲＡＶ（Ｒｏｕｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ）逆転写酵素、ＨＩＶ（Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｖｉｒｕｓ）逆転写酵素などが使用できる。

前述した態様において、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーターを第一のプライマーの５’末端側に付加した場合は、前記（１）の工程を実施する前に、淋菌１６Ｓ ｒＲＮＡのうち特定塩基配列の５’末端部位があらかじめ切断されていると好ましい。特定塩基配列の５’末端部位で切断されることで、ｃＤＮＡ合成後に、ｃＤＮＡにハイブリダイズした第一のプライマーのプロモーター配列に相補的なＤＮＡ鎖を、前記ｃＤＮＡの３’末端を伸長することにより効率的に合成することができ、結果としてＲＮＡを転写可能なプロモーターを含む２本鎖ＤＮＡを生成することができる。前記切断方法の好ましい例として、淋菌１６Ｓ ｒＲＮＡ内の特定塩基配列の５’末端部位（当該特定塩基配列内で５’末端を含む部分配列）に重複して５’方向に隣接する領域に対して相補的な配列を有するオリゴヌクレオチド（以下、切断用オリゴヌクレオチドとする）を添加することによって形成されたＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドのＲＮＡ部分をＲＮａｓｅ Ｈ活性を有する酵素などにより切断する方法があげられる。なお当該切断用オリゴヌクレオチドの３’末端にある水酸基は、伸長反応を防止するために適当な修飾（例えばアミノ化）がされていると好ましい。

前記切断用オリゴヌクレオチドの好ましい例として、配列番号５に記載の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＮＲ＿１０３９１７の５２番目から８７番目までの塩基配列）とストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドがあげられ、さらに具体的な例として、配列番号２（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＮＲ＿１０３９１７の６１番目から８４番目までの塩基配列の相補配列）、配列番号３（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＮＲ＿１０３９１７の５２番目から７５番目までの塩基配列の相補配列）および配列番号４（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＮＲ＿１０３９１７の６５番目から８７番目までの塩基配列の相補配列）に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドがあげられる。

前述した態様による淋菌１６Ｓ ｒＲＮＡ検出方法における反応温度は、使用する各酵素の耐熱性や活性、ならびにプライマー／プローブのＴｍ等に依存するが、使用する酵素がＡＭＶ逆転写酵素およびＴ７ ＲＮＡポリメラーゼであり、プライマー／プローブの長さが１４から２５塩基の範囲である場合は、３５から６５℃の範囲で反応温度を設定すればよく、４０から５０℃の範囲で設定するとより好ましい。

前述した態様による淋菌１６Ｓ ｒＲＮＡ検出方法は、蛍光強度を経時的に測定することから有意な蛍光増加が認められた任意の時間で測定を終了することが可能であり、核酸増幅および測定をあわせて通例２０分以内で終了することが可能である。

前述した態様による淋菌１６Ｓ ｒＲＮＡ検出方法は、前述した第一のプライマー、第二のプライマー、およびインターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドプローブを含む淋菌１６Ｓ ｒＲＮＡ試薬に試料を添加し、経時的に蛍光検出可能な温調ブロックに載置することで、自動的に淋菌１６Ｓ ｒＲＮＡを増幅し検出することができる。

本発明のプライマーセットは淋菌１６Ｓ ｒＲＮＡに特異的な配列（特定塩基配列）およびその相補配列の一部にそれぞれハイブリダイズすることより、淋菌１６Ｓ ｒＲＮＡの特定塩基配列またはその相補配列を特異的に増幅させることができる。

本発明のプライマーセットを用いた淋菌１６Ｓ ｒＲＮＡ検出法は、試料中に含まれる淋菌を高感度に検出することができ、さらに従来技術と比較して迅速である、という特徴を有している。そのため、検査結果を早急に医師に提示することが可能となり、感染拡大防止や、適切な薬剤の投与による耐性菌の発生防止に寄与するものと考えられる。

以下実施例により本発明の実施の形態を説明するが、本発明はこれら実施例により限定されるものではない。

実施例１ インターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドの調製
下記（Ａ）から（Ｄ）に示す、インターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドプローブ（以下、ＩＮＡＦプローブと記載する）を特開２０００−３１６５８７号公報で開示の方法に基づき作製した。
（Ａ）配列番号２１に記載の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＮＲ＿１０３９１７の２１６番目から２３２番目までの塩基配列の相補配列）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドのうち、５’末端から７番目のグアニンと８番目のアデニンとの間に、リンカーを介してチアゾールオレンジを標識したＩＮＡＦプローブ。
（Ｂ）配列番号２２に記載の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＮＲ＿１０３９１７の１３０番目から１４５番目までの塩基配列の相補配列、ただし１３６番目の塩基はＮ）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドのうち、５’末端から４番目のチミンと５番目のアデニンとの間に、リンカーを介してチアゾールオレンジを標識したＩＮＡＦプローブ。
（Ｃ）配列番号２３に記載の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＮＲ＿１０３９１７の１３０番目から１４５番目までの塩基配列の相補配列）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドのうち、５’末端から４番目のチミンと５番目のアデニンとの間に、リンカーを介してチアゾールオレンジを標識したＩＮＡＦプローブ。
（Ｄ）配列番号２４に記載の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＮＲ＿１０３９１７の１２６番目から１４５番目までの塩基配列の相補配列、ただし１３６番目の塩基はＮ）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドのうち、５’末端から４番目のチミンと５番目のアデニンとの間に、リンカーを介してチアゾールオレンジを標識したＩＮＡＦプローブ。

実施例２ 淋菌１６Ｓ ｒＲＮＡ検出用オリゴヌクレオチドの評価（その１）
表１に示す、第一のプライマー、第二のプライマー、切断用オリゴヌクレオチドおよびＩＮＡＦプローブの組み合わせ（以下、オリゴヌクレオチドの組み合わせと記載する）を用いて、以下に示す方法で淋菌１６Ｓ ｒＲＮＡの検出を試みた。
（１）淋菌（ＡＴＣＣ Ｎｏ．１９４２４）のＲＮＡ抽出物から淋菌１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子をクローニングし、インビトロ転写後、転写産物を精製することで、淋菌１６Ｓ ｒＲＮＡを調製した（以下、標準ＲＮＡと記載する）。なお標準ＲＮＡの定量は、２６０ｎｍにおける吸光度を基に実施した。
（２）（１）で調製した標準ＲＮＡを、ＲＮＡ希釈液（１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．２５Ｕ／μＬ リボヌクレアーゼインヒビター、５．０ｍＭ ＤＴＴを含む１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０））を用いて、１０^４コピー／５μＬとなるよう希釈し、これをＲＮＡ試料として用いた。
（３）以下の組成からなる反応液２０μＬを市販の０．５ｍＬ容量ＰＣＲ用チューブ（Ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ Ｄｏｍｅ Ｃａｐ ＰＣＲ Ｔｕｂｅ、ＳＳＩ製）に分注し、これに前記ＲＮＡ試料５μＬを添加した。

反応液の組成：濃度は酵素液添加後（３０μＬ中）の最終濃度
６０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．６）
１７ｍＭ 塩化マグネシウム
１００ｍＭ 塩化カリウム
１ｍＭ ＤＴＴ
各０．２５ｍＭ ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ
各３．０ｍＭ ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ、ＧＴＰ
３．６ｍＭ ＩＴＰ
０．１６μＭ 切断用オリゴヌクレオチド（３’末端の水酸基をアミノ基で修飾）
１．０μＭ 第一のプライマー（各配列番号記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドの５’末端側にＴ７プロモータ（配列番号２６）を付加したもの）
１．０μＭ 第二のプライマー
２５ｎＭ ＩＮＡＦプローブ（実施例１で調製したもの）
６Ｕ リボヌクレアーゼインヒビター
１３％ ＤＭＳＯ
（４）上記の反応液を４６℃で５分間保温後、予め４６℃で２分間保温した、以下の組成からなる酵素液を５μＬを添加した。

酵素液の組成：反応時（３０μＬ中）の最終濃度
２３％ グリセロール
４００ｍＭ トレハロース
３３．３ｍＭ 塩化カリウム
５．１から６．４Ｕ ＡＭＶ逆転写酵素
７１から１４２Ｕ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ
０．０２５ｍｇ／ｍＬ 牛血清アルブミン
（５）引き続きＰＣＲチューブを直接検出可能な温調機能付き蛍光分光光度計に供し、４６℃で反応させると同時に反応溶液の蛍光強度（励起波長５００ｎｍ−蛍光波長５４５ｎｍ）を経時的に３０分間測定した。

反応液の蛍光強度比（酵素液を添加してから３０分後の蛍光強度値をバックグラウンドの蛍光強度値で割った値）をまとめた結果を表１に示す。今回検討した全てのオリゴヌクレオチドの組み合わせで蛍光強度比が１．２以上を示したことから、これらのオリゴヌクレオチドの組み合わせを用いることで１０^４コピー／ｔｅｓｔの淋菌１６Ｓ ｒＲＮＡの検出が可能であることを確認した。なかでもＡ４の組み合わせ（第一のプライマー：配列番号８、第二のプライマー：配列番号１５、切断用オリゴヌクレオチド：配列番号３、ＩＮＡＦプローブ：配列番号２２）が最も蛍光強度比が高かった。

実施例３ 淋菌１６Ｓ ｒＲＮＡ検出用オリゴヌクレオチドの評価（その２）
表２に示す、オリゴヌクレオチドの組み合わせを用いて、以下に示す方法で淋菌１６Ｓ ｒＲＮＡの検出を試みた。なお今回検討したオリゴヌクレオチドの組み合わせは、実施例２で検討したＡ４の組み合わせからＩＮＡＦプローブを変更している。
（１）実施例２（１）で調製した標準ＲＮＡを、ＲＮＡ希釈液（１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．２５Ｕ／μＬ リボヌクレアーゼインヒビター、５．０ｍＭ ＤＴＴを含む１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０））を用いて、１０００コピー／２μＬ、３００コピー／２μＬ、１００コピー／２μＬとなるよう希釈し、これをＲＮＡ試料として用いた。（２）髄膜炎菌（ＡＴＣＣ Ｎｏ．７００５３２）をＴＲＣＲ核酸精製キット（東ソー製）を用いて核酸抽出し、得られた核酸抽出物を１０^６ｃｆｕ／２μＬとなるよう希釈することで陰性コントロールを調製した。
（３）以下の組成からなる反応液２０μＬを市販の０．５ｍＬ容量ＰＣＲ用チューブ（Ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ Ｄｏｍｅ Ｃａｐ ＰＣＲ Ｔｕｂｅ、ＳＳＩ製）に分注し、これに前記ＲＮＡ試料または前記陰性コントロール２μＬおよびＲＮＡ希釈液３μＬを添加した。

反応液の組成：濃度は酵素液添加後（３０μＬ中）の最終濃度
６０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．６）
１７ｍＭ 塩化マグネシウム
１００ｍＭ 塩化カリウム
１ｍＭ ＤＴＴ
各０．２５ｍＭ ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ
各３．０ｍＭ ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ、ＧＴＰ
３．６ｍＭ ＩＴＰ
０．１６μＭ 切断用オリゴヌクレオチド（３’末端の水酸基をアミノ基で修飾）
１．０μＭ 第一のプライマー（各配列番号記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドの５’末端側にＴ７プロモータ（配列番号２６）を付加したもの）
１．０μＭ 第二のプライマー
４０ｎＭ ＩＮＡＦプローブ（実施例１で調製したもの）
１０．９から１３．０％ ＤＭＳＯ
（４）上記の反応液を４６℃で５分間保温後、予め４６℃で２分間保温した、以下の組成からなる酵素液を５μＬを添加した。

酵素液の組成：反応時（３０μＬ中）の最終濃度
２から２３％ グリセロール
３００ｍＭ トレハロース
３３．３ｍＭ 塩化カリウム
５．１から６．４Ｕ ＡＭＶ逆転写酵素
７１から１４２Ｕ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ
０．０２５ｍｇ／ｍＬ 牛血清アルブミン
（５）引き続きＰＣＲチューブを直接検出可能な温調機能付き蛍光分光光度計に供し、４６℃で反応させると同時に反応溶液の蛍光強度（励起波長５００ｎｍ−蛍光波長５４５ｎｍ）を経時的に２０分間測定した。

酵素液を添加した時点を０分として、反応液の蛍光強度比（所定時間の蛍光強度値をバックグラウンドの蛍光強度比で割った値）が１．２を超えた場合を陽性判定とし、そのときの時間を検出時間とした結果を表２に示す。今回検討した全てのオリゴヌクレオチドの組み合わせで１００コピー／ｔｅｓｔの淋菌ＲＮＡ試料を２０分以内に検出した。なお検討したオリゴヌクレオチドの組み合わせのいずれも陰性コントロール（髄膜炎菌核酸抽出物）は検出しなかった。

実施例４ 淋菌１６Ｓ ｒＲＮＡ検出用オリゴヌクレオチドの評価（その３）
オリゴヌクレオチドの組み合わせとして表３に示す組み合わせを用い、ＲＮＡ試料として、うがい液に淋菌をスパイクした試料の核酸抽出物（ＴＲＣＲ核酸精製キット（東ソー製）で核酸抽出し、１０^６ｃｆｕ（スパイクした淋菌）／２μＬとなるよう希釈）を用いた他は、実施例３と同様な方法で淋菌１６Ｓ ｒＲＮＡの検出を試みた。

結果を表３に示す。今回検討した全てのオリゴヌクレオチドの組み合わせでうがい液にスパイクした淋菌を検出することができた。特に、Ｃ２（第一のプライマー：配列番号８、第二のプライマー：配列番号１８、切断用オリゴヌクレオチド：配列番号３、ＩＮＡＦプローブ：配列番号２３）、Ｃ３（第一のプライマー：配列番号８、第二のプライマー：配列番号１９、切断用オリゴヌクレオチド：配列番号３、ＩＮＡＦプローブ：配列番号２３）、Ｃ８（第一のプライマー：配列番号１１、第二のプライマー：配列番号１８、切断用オリゴヌクレオチド：配列番号３、ＩＮＡＦプローブ：配列番号２３）およびＣ９（第一のプライマー：配列番号１１、第二のプライマー：配列番号１９、切断用オリゴヌクレオチド：配列番号３、ＩＮＡＦプローブ：配列番号２３）の組み合わせは迅速に検出していた。

実施例４ 淋菌１６Ｓ ｒＲＮＡ検出用オリゴヌクレオチドの評価（その４）
オリゴヌクレオチドの組み合わせとして表４に示す組み合わせを用いた他は実施例２と同様な方法で淋菌１６Ｓ ｒＲＮＡの検出を試みた。なお表４中、Ｄ１（第一のプライマー：配列番号６、第二のプライマー：配列番号１４、切断用オリゴヌクレオチド：配列番号１、ＩＮＡＦプローブ：配列番号２１）は特開２０１３−１８８１８１号公報で開示の組み合わせ、Ｄ２はＣ９の組み合わせからＩＮＡＦプローブを変更したものである。

結果を表４に示す。Ｃ９およびＤ２の組み合わせは、特開２０１３−１８８１８１号公報で開示のオリゴヌクレオチドの組み合わせ（Ｄ１）と比較し、迅速に淋菌１６Ｓ ｒＲＮＡを検出していることがわかる。なお検討したオリゴヌクレオチドの組み合わせのいずれも陰性コントロール（髄膜炎菌核酸抽出物）は検出しなかった。

Claims (9)

1. 試料中に含まれる淋菌１６Ｓ ｒＲＮＡの特定塩基配列の一部と相同的な配列を有する第一のプライマーと、前記特定塩基配列の一部と相補的な配列を有する第二のプライマーとからなる、前記特定塩基配列または前記特定塩基配列の相補配列を含む核酸を増幅するためのプライマーセットであって、
   第一のプライマーが、配列番号１３に記載の塩基配列またはその相補配列とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドであり、
   第二のプライマーが、配列番号２０に記載の塩基配列またはその相補配列とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドである、
   前記プライマーセット。
2. 第一のプライマーが、配列番号２７に記載の塩基配列中、少なくとも連続する１５塩基からなるオリゴヌクレオチドであり、
   第二のプライマーが、配列番号２８に記載の塩基配列中、少なくとも連続する１４塩基からなるオリゴヌクレオチドである、
   請求項１に記載のプライマーセット。
3. 第一のプライマーが、配列番号７から１２のいずれかに記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであり、
   第二のプライマーが、配列番号１５から１９のいずれかに記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである、
   請求項２に記載のプライマーセット。
4. 第一または第二のプライマーのいずれか一方の５’末端側にＲＮＡポリメラーゼのプロモーターがさらに付加されている、請求項１から３のいずれかに記載のプライマーセット。
5. 請求項１から４のいずれかに記載のプライマーセットで増幅した特定塩基配列または前記特定塩基配列の相補配列を含む核酸を、前記核酸の一部とストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズ可能なインターカレーター性蛍光色素を標識したオリゴヌクレオチドプローブを用いて、淋菌１６Ｓ ｒＲＮＡを検出する方法。
6. インターカレーター性蛍光色素を標識したオリゴヌクレオチドプローブを構成するオリゴヌクレオチドが、配列番号２５に記載の塩基配列またはその相補配列とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドである、請求項５に記載の方法。
7. インターカレーター性蛍光色素を標識したオリゴヌクレオチドプローブを構成するオリゴヌクレオチドが配列番号２２から２４のいずれかに記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである、請求項６に記載の方法。
8. 請求項１から４のいずれかに記載のプライマーセットと、配列番号２５に記載の塩基配列またはその相補配列とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドにインターカレーター性蛍光色素を標識した核酸プローブとを含む、淋菌１６Ｓ ｒＲＮＡ検出試薬。
9. インターカレーター性蛍光色素を標識した核酸プローブを構成するオリゴヌクレオチドが配列番号２２から２４のいずれかに記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである、請求項８に記載の試薬。