JP6651735B2 - クラミジア・トラコマチスを検出するためのオリゴヌクレオチドプライマーおよび当該プライマーを用いたクラミジア・トラコマチスの検出方法 - Google Patents

Description

本発明は、試料中に含まれるクラミジア・トラコマチスを迅速、高感度かつ特異的に検出するためのオリゴヌクレオチドプライマー、および当該プライマーを用いたクラミジア・トラコマチスの検出方法に関する。

クラミジア・トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）はクラミジア科に属するグラム陰性の偏性細胞内寄生性の真正細菌であり、性器クラミジア感染症の原因微生物である。性器クラミジア感染症は、主に性行為で感染し、男性では尿道炎や精巣上体炎を、女性では子宮頚管炎や骨盤内炎症性疾患を発症するが、特別な症状が見られない場合（無症候性感染）も多い。クラミジア・トラコマチスは感染症法に基づいて、定点医療機関により感染者数が報告されているが、２０１４年１１月時点でその感染者数は性感染症の中でも最も多い（非特許文献１）。

近年、性行動の多様化を反映して、咽頭や直腸感染など、性器外の感染例も増加している。性器の淋菌またはクラミジアの陽性者や性産業従業女性を対象に、咽頭の淋菌およびクラミジア検査を行なった結果、前記陽性患者の多くは、咽頭発赤や扁桃腫脹など他覚的所見が見られない無症候性感染者であった（非特許文献２）。そのため、前記患者が無自覚のうちに他者への感染源となる可能性が考えられる。さらに無症候性感染者のうち、女性の場合、そのまま放置すると、子宮外妊娠、不妊症、分娩時の産道感染による新生児結膜炎など、重篤な合併症が生じる可能性がある。したがって、クラミジア・トラコマチスへの感染が判明した場合、確実に治療することが必要であり、感染が疑われる患者や妊婦に対し、クラミジア・トラコマチスの検査を実施することは非常に重要である。

臨床的に用いられているクラミジア・トラコマチスの検出法として、クラミジア・トラコマチス抗原に対する抗体を用いて検出する方法や、クラミジア・トラコマチス特有の塩基配列を増幅して検出する方法等があげられる。中でも核酸増幅による検出法は、感度、特異性とも極めて高いため、現在主流となりつつある。

しかしながら増幅対象核酸がクラミジア・トラコマチス２３Ｓ ｒＲＮＡまたはその遺伝子の場合、他の菌種の２３Ｓ ｒＲＮＡ（またはその遺伝子）との間で塩基配列の相同性が高いものが多数存在するため、クラミジア・トラコマチス２３Ｓ ｒＲＮＡまたはその遺伝子を高感度かつ特異的に検出するプライマーセットやオリゴヌクレオチドプローブを設計することは極めて困難であった。特に比較的低温の一定温度（例えば、４０℃から５０℃）条件下でＲＮＡの増幅が可能な増幅方法を利用する場合、増幅対象核酸が高次構造を形成しやすくなるため、当該プライマーセットやオリゴヌクレオチドプローブの設計はさらに困難であった。

比較的低温の一定温度条件下でクラミジア・トラコマチス２３Ｓ ｒＲＮＡの増幅が可能なプライマーセットおよび当該増幅した核酸を検出可能なオリゴヌクレオチドプローブは、特許文献１で開示されている。しかしながら、特許文献１で開示のプライマーセットやオリゴヌクレオチドプローブを用いて試料を測定したところ、稀に偽陽性が発生するという課題があった。

特開２０１２−１３０２９０号公報

感染症発生動向調査、１６（５０）、７−８（２０１４） 日本性感染症学会、性感染症 診断・治療 ガイドライン、３７（２０１１）

本発明の目的は、試料中に存在するクラミジア・トラコマチスを特異的に増幅し、かつ偽陽性が発生しないオリゴヌクレオチドプライマー、および当該プライマーを用いたクラミジア・トラコマチスの検出方法を提供することにある。

本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、本発明を完成するに至った。

すなわち本発明の第一の態様は、
試料中に含まれるクラミジア・トラコマチス２３Ｓ ｒＲＮＡの特定塩基配列の一部と相同的な配列を有する第一のプライマーと、前記特定塩基配列の一部と相補的な配列を有する第二のプライマーとからなる、前記特定塩基配列または前記特定塩基配列の相補配列を含む核酸を増幅するためのプライマーセットであって、
第一のプライマーが、配列番号５に記載の塩基配列とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドであり、
第二のプライマーが、配列番号１６に記載の塩基配列とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドである、
前記プライマーセットである。

また本発明の第二の態様は、
第一のプライマーが、配列番号２５に記載の塩基配列中、少なくとも連続する２０塩基からなるオリゴヌクレオチドであり、
第二のプライマーが、配列番号１８に記載の塩基配列中、少なくとも連続する２２塩基からなるオリゴヌクレオチドである、
前記第一の態様に記載のプライマーセットである。

また本発明の第三の態様は、
第一のプライマーが配列番号６から８および１０から１５のいずれかに記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであり、
第二のプライマーが、配列番号１７または１８に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである、
前記第二の態様に記載のプライマーセットである。

また本発明の第四の態様は、第一または第二のプライマーのいずれか一方の５’末端側にＲＮＡポリメラーゼのプロモーターがさらに付加されている、前記第一から第三の態様のいずれかに記載のプライマーセットである。

さらに本発明の第五の態様は、前記第一から第四の態様のいずれかに記載のプライマーセットで増幅した特定塩基配列または前記特定塩基配列の相補配列を含む核酸を、前記核酸の一部とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能なインターカレーター性蛍光色素を標識したオリゴヌクレオチドプローブを用いて、クラミジア・トラコマチス２３Ｓ ｒＲＮＡを検出する方法である。

また本発明の第六の態様は、インターカレーター性蛍光色素を標識したオリゴヌクレオチドプローブを構成するオリゴヌクレオチドが、配列番号１９に記載の塩基配列またはその相補配列とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドである、前記第五の態様に記載の方法である。

また本発明の第七の態様は、インターカレーター性蛍光色素を標識したオリゴヌクレオチドプローブを構成するオリゴヌクレオチドが、配列番号２０から２４のいずれかに記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである、前記第六の態様に記載の方法である。

さらに本発明の第八の態様は、前記第一から第四の態様のいずれかに記載のプライマーセットと、配列番号１９に記載の塩基配列またはその相補配列とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドにインターカレーター性蛍光色素を標識したオリゴヌクレオチドプローブとを含む、クラミジア・トラコマチス２３Ｓ ｒＲＮＡ検出試薬である。

また本発明の第九の態様は、インターカレーター性蛍光色素を標識したオリゴヌクレオチドプローブを構成するオリゴヌクレオチドが配列番号２０から２４のいずれかに記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである、前記第八の態様に記載の試薬である。

以下に本発明を詳細に説明する。

本発明中において試料とは、食品、飲料水、環境水、糞便および嘔吐物、鼻腔、咽頭および尿道、子宮頸管等のぬぐい液、うがい液、血液、尿、その他の分泌液、体液、組織洗浄液などがあげられる。

本発明において特定塩基配列とは、クラミジア・トラコマチス２３Ｓ ｒＲＮＡのうち、第一のプライマーとの相同領域の５’末端から第二のプライマーとの相補領域の３’末端までの塩基配列のことをいう。すなわち本発明では前記特定塩基配列または前記特定塩基配列の相補配列を含む核酸が増幅されることになる。

本発明におけるストリンジェントな条件の例として、４２℃において、５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミド、０．１％ウシ血清アルブミン、０．１％フィコール、０．１％のポリビニルピロリドン、５０ｍＭのリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．５）、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭのクエン酸ナトリウムが存在する条件や、本明細書の実施例に記載の核酸増幅条件があげられる。すなわち、前述したストリンジェントな条件下で、前記塩基配列と、十分に特異的かつ高効率にハイブリダイゼーション可能であれば、塩基配列の置換、欠失、付加、修飾があってもよい。プライマーの長さは任意に設定できるが、好ましくは１０塩基から５０塩基までの範囲である。

本発明は、試料中に含まれるクラミジア・トラコマチス２３Ｓ ｒＲＮＡの特定塩基配列の一部と相同的な配列を有する第一のプライマーとして、配列番号５に記載の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＨＥ６０１７９４の８５６７３９番目から８５６８０４番目までの塩基配列の相補配列）とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドを、試料中に含まれるクラミジア・トラコマチス２３Ｓ ｒＲＮＡの特定塩基配列の一部と相補的な配列を有する第二のプライマーとして、配列番号１６に記載の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＨＥ６０１７９４の８５６９６５番目から８５６９９２番目までの塩基配列）とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドを、それぞれ用いることを特徴としている。

配列番号５に記載の塩基配列とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドの一例として、配列番号５に記載の塩基配列の相補配列である配列番号２５に記載の塩基配列中、少なくとも連続する２０塩基からなるオリゴヌクレオチドがあげられ、さらに具体的な例として、配列番号６（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＨＥ６０１７９４の８５６７４０番目から８５６７５９番目までの塩基配列）、配列番号７（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＨＥ６０１７９４の８５６７４１番目から８５６７６１番目までの塩基配列）、配列番号８（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＨＥ６０１７９４の８５６７６９番目から８５６７９１番目までの塩基配列）、配列番号１０（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＨＥ６０１７９４の８５６７８１番目から８５６８０４番目までの塩基配列）、配列番号１１（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＨＥ６０１７９４の８５６７８０番目から８５６８０２番目までの塩基配列）、配列番号１２（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＨＥ６０１７９４の８５６７７６番目から８５６８００番目までの塩基配列）、配列番号１３（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＨＥ６０１７９４の８５６７６５番目から８５６７９１番目までの塩基配列）、配列番号１４（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＨＥ６０１７９４の８５６７６７番目から８５６７９１番目までの塩基配列）および配列番号１５（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＨＥ６０１７９４の８５６７３９番目から８５６７６１番目までの塩基配列）に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドがあげられる。

配列番号１６に記載の塩基配列とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドの一例として、配列番号１６に記載の塩基配列の相補配列である配列番号１８に記載の塩基配列中、少なくとも連続する２２塩基からなるオリゴヌクレオチドがあげられ、さらに具体的な例として、配列番号１７（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＨＥ６０１７９４の８５６９６５番目から８５６９８６番目までの塩基配列の相補配列）および配列番号１８（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＨＥ６０１７９４の８５６９６５番目から８５６９９２番目までの塩基配列の相補配列）に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドがあげられる。

本発明のプライマーセットは、ＲＴ−ＰＣＲ法等、当業者が通常用いる核酸増幅法を利用した、クラミジア・トラコマチス２３Ｓ ｒＲＮＡの特定塩基配列または前記特定塩基配列の相補配列を含む核酸を増幅するためのプライマーセットとして有用である。なお第一または第二のプライマーのいずれか一方の５’末端側にＲＮＡポリメラーゼのプロモーターをさらに付加させると、前記プロモーターに対応したＲＮＡポリメラーゼを用いて、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーターを付加した特定塩基配列または前記特定塩基配列の相補配列を含む核酸が合成されるため、これら核酸からＮＡＳＢＡ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｂａｓｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＴＭＡ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＴＲＣ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−Ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｃｏｎｃｅｒｔｅｄ ｒｅａｃｔｉｏｎ）法といった一定温度でＲＮＡを増幅する方法を用いて、ＲＮＡを増幅させることができる点で好ましい。プライマーの５’末端側に付加するプロモーターは、ＲＮＡ増幅に用いるＲＮＡポリメラーゼ（例えば、分子生物学の分野で汎用される、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ ＲＮＡポリメラーゼやＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ）に対応したプロモーターを用いればよい。また前記プロモーターに、転写効率に影響を及ぼすことが知られている転写開始領域をさらに付加してもよい。ＲＮＡ増幅に用いるＲＮＡポリメラーゼとしてＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを用いたときの、プライマーの５’末端側に付加するプロモーター（Ｔ７プロモーター）の具体例として、配列番号２６に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドがあげられる。

本発明のプライマーセットを用いて増幅したクラミジア・トラコマチス２３Ｓ ｒＲＮＡの特定塩基配列またはその相補配列を含む核酸の検出は、従来から知られた核酸検出方法を利用することができる。具体的には、
（Ａ）電気泳動や液体クロマトグラフィーを用いた方法、
（Ｂ）検出可能な標識で標識されたオリゴヌクレオチドプローブによるハイブリダイゼーション法、
（Ｃ）当該増幅産物の塩基配列の一部とハイブリダイズすることで蛍光特性が変化するように設計された蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブを用いた方法、
などがあげられる。前記（Ｃ）の蛍光色素標識プローブの一例として、ＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動）を利用した蛍光標識プローブや、インターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドプローブがあげられる。

前記インターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドプローブの一例として、クラミジア・トラコマチス２３Ｓ ｒＲＮＡの特定塩基配列または当該特定塩基配列の相補配列を含む核酸の一部とストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドの３’末端側、５’末端側、リン酸ジエステル部または塩基部分に、適当なリンカーを介してインターカレーター性蛍光色素を標識したオリゴヌクレオチドプローブがある。前記プローブはクラミジア・トラコマチス２３Ｓ ｒＲＮＡの特定塩基配列（または当該特定塩基配列の相補配列）と相補的２本鎖を形成するとインターカレーター性蛍光色素部分が前記相補的２本鎖部分にインターカレートすることで蛍光特性が変化するプローブである。標識するインターカレーター性蛍光色素に特に限定はなく、オキサゾールイエロー、チアゾールオレンジ、エチジウムブロマイド、ヘミシアニン等の汎用されている蛍光色素、およびこれらの誘導体の中から、蛍光強度や蛍光特性を考慮して、適宜選定すればよい。なお３’末端側に蛍光色素を標識する場合を除き、オリゴヌクレオチドの３’末端側は当該末端側からの核酸伸長反応を防止する意味で、グリコール酸などの適当な修飾がされているとよい。

前記インターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドプローブを構成するオリゴヌクレオチドの好ましい例として、配列番号１９に記載の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＨＥ６０１７９４の８５６７６６番目から８５６８５６番目までの塩基配列）またはその相補配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドがあげられ、さらに具体的な例として、配列番号２０（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＨＥ６０１７９４の８５６７６６番目から８５６７８４番目までの塩基配列の相補配列）、配列番号２１（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＨＥ６０１７９４の８５６７９９番目から８５６８１６番目までの塩基配列の相補配列）、配列番号２２（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＨＥ６０１７９４の８５６８３８番目から８５６８５６番目までの塩基配列の相補配列）、配列番号２３（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＨＥ６０１７９４の８５６８４０番目から８５６８５６番目までの塩基配列の相補配列）、および配列番号２４（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＨＥ６０１７９４の８５６８４２番目から８５６８５６番目までの塩基配列の相補配列）に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドがあげられる。

本発明のプライマーセットを用いてクラミジア・トラコマチス２３Ｓ ｒＲＮＡを検出するには、例えば以下の（１）から（６）に示す工程により実施すればよい。
（１）配列番号１６に記載の塩基配列とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドである第二のプライマーがクラミジア・トラコマチス２３Ｓ ｒＲＮＡにハイブリダイズし、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素により、特定塩基配列に相補的なｃＤＮＡを合成し、前記ＲＮＡとのＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖を生成する工程、
（２）リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ Ｈ）活性を有する酵素により、前記ＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖のＲＮＡを分解する工程（１本鎖ＤＮＡの生成）、
（３）該１本鎖ＤＮＡに、配列番号５に記載の塩基配列とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドである第一のプライマーがハイブリダイズし（ここで前記第一または第二のプライマーのいずれか一方はその５’末端側にＲＮＡポリメラーゼのプロモーターが付加される）、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素により、特定塩基配列または特定塩基配列に相補的な配列のＲＮＡを転写可能なプロモーターを含む２本鎖ＤＮＡを生成する工程、
（４）ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素により前記２本鎖ＤＮＡを鋳型とするＲＮＡ転写産物を生産する工程、
（５）該ＲＮＡ転写産物が、前記（１）の反応におけるｃＤＮＡ合成の鋳型となることで、連鎖的にＲＮＡ転写産物を生成する工程、
（６）配列番号１９またはその相補配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドにインターカレーター性蛍光色素を標識したオリゴヌクレオチドプローブを用いて、前記ＲＮＡ転写産物量を経時的に測定する工程、
前記（１）の工程で用いるＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素、前記（２）の工程で用いるＲＮａｓｅ Ｈ活性を有する酵素、および前記（３）の工程で用いるＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素は、それぞれ別個あるいは種々の組合せで添加することもできるが、前記活性を併せ持つレトロウイルス由来の逆転写酵素を使用することもできる。該逆転写酵素は特に限定されないが、分子生物学の分野で汎用される、ＡＭＶ（Ａｖｉａｎ Ｍｙｅｌｏｂｌａｓｔｏｓｉｓ Ｖｉｒｕｓ）逆転写酵素、ＭＭＬＶ（Ｍｏｌｏｎｙ Ｍｕｒｉｎｅ Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｖｉｒｕｓ）逆転写酵素、ＲＡＶ（Ｒｏｕｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ）逆転写酵素、ＨＩＶ（Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｖｉｒｕｓ）逆転写酵素などが使用できる。

前述した態様において、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーターを第一のプライマーの５’末端側に付加した場合は、前記（１）の工程を実施する前に、クラミジア・トラコマチス２３Ｓ ｒＲＮＡのうち特定塩基配列の５’末端部位があらかじめ切断されていると好ましい。特定塩基配列の５’末端部位で切断されることで、ｃＤＮＡ合成後に、ｃＤＮＡにハイブリダイズした第一のプライマーのプロモーター配列に相補的なＤＮＡ鎖を、前記ｃＤＮＡの３’末端を伸長することにより効率的に合成することができ、結果としてＲＮＡを転写可能なプロモーターを含む２本鎖ＤＮＡを生成することができる。前記切断方法の好ましい例として、クラミジア・トラコマチス２３Ｓ ｒＲＮＡ内の特定塩基配列の５’末端部位（当該特定塩基配列内で５’末端を含む部分配列）に重複して５’方向に隣接する領域に対して相補的な配列を有するオリゴヌクレオチド（以下、切断用オリゴヌクレオチドとする）を添加することによって形成されたＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドのＲＮＡ部分をＲＮａｓｅ Ｈ活性を有する酵素などにより切断する方法があげられる。なお当該切断用オリゴヌクレオチドの３’末端にある水酸基は、伸長反応を防止するために適当な修飾（例えばアミノ化）がされていると好ましい。

前記切断用オリゴヌクレオチドの好ましい例として、配列番号１に記載の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＨＥ６０１７９４の８５６７３０番目から８５６７９１番目までの塩基配列）とストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドがあげられ、さらに具体的な例として、配列番号２（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＨＥ６０１７９４の８５６７３０番目から８５６７４９番目までの塩基配列の相補配列）、配列番号３（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＨＥ６０１７９４の８５６７５６番目から８５６７７８番目までの塩基配列の相補配列）および配列番号４（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＨＥ６０１７９４の８５６７６９番目から８５６７９１番目までの塩基配列の相補配列）に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドがあげられる。なお、
第一のプライマーとして配列番号６、７、１５のいずれかに記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを用いる場合は、配列番号２に記載の塩基配列からなる切断用オリゴヌクレオチドを、
第一のプライマーとして配列番号８、１３、１４のいずれかに記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを用いる場合は、配列番号３に記載の塩基配列からなる切断用オリゴヌクレオチドを、
第一のプライマーとして配列番号１０から１２のいずれかに記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを用いる場合は、配列番号４に記載の塩基配列からなる切断用オリゴヌクレオチドを、
それぞれ用いると好ましい。

前述した態様によるクラミジア・トラコマチス２３Ｓ ｒＲＮＡ検出方法における反応温度は、使用する各酵素の耐熱性や活性、ならびにプライマー／プローブのＴｍ等に依存するが、使用する酵素がＡＭＶ逆転写酵素およびＴ７ ＲＮＡポリメラーゼであり、プライマー／プローブの長さが１５から２８塩基の範囲である場合は、３５から６５℃の範囲で反応温度を設定すればよく、４０から５０℃の範囲で設定するとより好ましい。

前述した態様によるクラミジア・トラコマチス２３Ｓ ｒＲＮＡ検出方法は、蛍光強度を経時的に測定することから有意な蛍光増加が認められた任意の時間で測定を終了することが可能であり、核酸増幅および測定をあわせて通例２０分以内で終了することが可能である。

前述した態様によるクラミジア・トラコマチス２３Ｓ ｒＲＮＡ検出方法は、前述した第一のプライマー、第二のプライマー、およびインターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドプローブを含むクラミジア・トラコマチス２３Ｓ ｒＲＮＡ試薬に試料を添加し、経時的に蛍光検出可能な温調ブロックに載置することで、自動的にクラミジア・トラコマチス２３Ｓ ｒＲＮＡを増幅し検出することができる。

本発明のプライマーセットはクラミジア・トラコマチス２３Ｓ ｒＲＮＡに特異的な配列（特定塩基配列）およびその相補配列の一部にそれぞれハイブリダイズすることより、クラミジア・トラコマチス２３Ｓ ｒＲＮＡの特定塩基配列またはその相補配列を特異的に増幅させることができる。

本発明のプライマーセットを用いたクラミジア・トラコマチス２３Ｓ ｒＲＮＡ検出法は、試料中に含まれるクラミジア・トラコマチスを迅速、高感度に検出でき、かつ偽陽性の発生もなく、特異性が高い。そのため、検査結果を早急に医師に提示することが可能となり、感染拡大防止や、適切な薬剤の投与による耐性菌の発生防止に寄与するものと考えられる。

以下、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明はこれら実施例により限定されるものではない。

実施例１ 標準ＲＮＡ調製
後述の実施例で使用する、クラミジア・トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）標準ＲＮＡ、クラミドフィラ・シッタシ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ ｐｓｉｔｔａｃｉ、オウム病の起因菌）標準ＲＮＡ、クラミドフィラ・ニューモニエ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、クラミジア肺炎の起因菌）標準ＲＮＡ、および淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）標準ＲＮＡを以下に示す方法でそれぞれ調製した。なお調製した各標準ＲＮＡの定量は、２６０ｎｍにおける吸光度を基に実施した。
（１）クラミジア・トラコマチス標準ＲＮＡ
クラミジア・トラコマチスＵＷ−３／Ｃｘ株（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＶＲ−８８５）の核酸抽出物からクラミジア・トラコマチス２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子をクローニングし、インビトロ転写した後、転写産物を精製することで、クラミジア・トラコマチス標準ＲＮＡを調製した。
（２）クラミドフィラ・シッタシ標準ＲＮＡ
クラミドフィラ・シッタシの２３Ｓ ｒＲＮＡ配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．Ｕ６８４４７）に基づき人工的に２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を作成し、インビトロ転写した後、転写産物を精製することで、クラミドフィラ・シッタシ標準ＲＮＡを調製した。
（３）クラミドフィラ・ニューモニエ標準ＲＮＡ
クラミドフィラ・ニューモニエ（ＴＷ−１８３株）の核酸抽出物から２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子をクローニングし、インビトロ転写した後、転写産物を精製することで、クラミドフィラ・ニューモニエ標準ＲＮＡを調製した。
（４）淋菌標準ＲＮＡ
淋菌（ＡＴＣＣ Ｎｏ．１９４２４）の核酸抽出物から淋菌１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子をクローニングし、インビトロ転写後、転写産物を精製することで、淋菌標準ＲＮＡを調製した。

実施例２ インターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドの調製
下記（Ａ）から（Ｆ）に示す、インターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドプローブ（以下、ＩＮＡＦプローブと記載する）を特開２０００−３１６５８７号公報で開示の方法に基づき作製した。
（Ａ）配列番号２０に記載の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＨＥ６０１７９４の８５６７６６番目から８５６７８４番目までの塩基配列の相補配列）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドのうち、５’末端から９番目のグアニンと１０番目のアデニンとの間に、リンカーを介して式（１）に記載の色素を標識したＩＮＡＦプローブＰ５。

（Ｂ）配列番号２１に記載の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＨＥ６０１７９４の８５６７９９番目から８５６８１６番目までの塩基配列の相補配列）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドのうち、５’末端から１２番目のシトシンと１３番目のアデニンとの間に、リンカーを介して式（１）に記載の色素を標識したＩＮＡＦプローブＰ８。
（Ｃ）配列番号２２に記載の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＨＥ６０１７９４の８５６８３８番目から８５６８５６番目までの塩基配列の相補配列）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドのうち、５’末端から１０番目のシトシンと１１番目のグアニンとの間に、リンカーを介して式（１）に記載の色素を標識したＩＮＡＦプローブＰ２。
（Ｄ）配列番号２３に記載の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＨＥ６０１７９４の８５６８４０番目から８５６８５６番目までの塩基配列の相補配列）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドのうち、５’末端から１０番目のシトシンと１１番目のグアニンとの間に、リンカーを介して式（１）に記載の色素を標識したＩＮＡＦプローブＰ３。
（Ｅ）配列番号２４に記載の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＨＥ６０１７９４の８５６８４２番目から８５６８５６番目までの塩基配列の相補配列）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドのうち、５’末端から１０番目のシトシンと１１番目のグアニンとの間に、リンカーを介して式（１）に記載の色素を標識したＩＮＡＦプローブＰ４。
（Ｆ）配列番号２３に記載の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＨＥ６０１７９４の８５６８４０番目から８５６８５６番目までの塩基配列の相補配列）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドのうち、５’末端から５番目のグアニンと６番目のアデニンとの間に、リンカーを介して式（１）に記載の色素を標識したＩＮＡＦプローブＰ６。

実施例３ クラミジア・トラコマチス２３Ｓ ｒＲＮＡ検出用オリゴヌクレオチドの検討（その１）
表１に示す、第一のプライマー、第二のプライマー、切断用オリゴヌクレオチドおよびＩＮＡＦプローブの組み合わせ（以下、オリゴヌクレオチドの組み合わせと記載する）を用いて、以下に示す方法で評価した。なお表１に記載のＩＮＡＦプローブのうち、２３（Ｐ３）は実施例２（Ｄ）で、２３（Ｐ６）は実施例２（Ｆ）で、それぞれ作製したプローブである。またオリゴヌクレオチドの組み合わせＡ０４は、特開２０１２−１３０２９０号公報で開示の組み合わせである。
（１）実施例１で調製した標準ＲＮＡのうち、クラミジア・トラコマチス標準ＲＮＡ（実施例１（１））は、ＲＮＡ希釈液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５．０ｍＭ ＤＴＴ）を用いて３００コピー／２μＬになるように、クラミドフィラ・シッタシ標準ＲＮＡ（実施例１（２））、クラミドフィラ・ニューモニエ標準ＲＮＡ（実施例１（３））および淋菌標準ＲＮＡ（実施例１（４））は、前記ＲＮＡ希釈液を用いて１０^７コピー／２μＬになるように、それぞれ希釈し、これらをＲＮＡ試料として用いた。
（２）以下の組成からなる反応液を市販の０．５ｍＬ容量ＰＣＲ用チューブ（Ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ Ｄｏｍｅ Ｃａｐ ＰＣＲ Ｔｕｂｅ、ＳＳＩ製）に分注し、これに前記ＲＮＡ試料を添加した。なおＲＮＡ試料添加後の液量は２５μＬとなる。

反応液の組成：濃度は酵素液添加後（３０μＬ中）の最終濃度
６０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．６）
１７ｍＭ 塩化マグネシウム
１００ｍＭ 塩化カリウム
１ｍＭ ＤＴＴ
各０．２５ｍＭ ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ
各３．０ｍＭ ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ、ＧＴＰ
３．６ｍＭ ＩＴＰ
０．１６μＭ 切断用オリゴヌクレオチド（３’末端の水酸基をアミノ基で修飾）
０．２から１．０μＭ 第一のプライマー（各配列番号記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドの５’末端側にＴ７プロモータ（配列番号２６）が付加したもの）
０．２μＭ 第二のプライマー
４０ｎＭ ＩＮＡＦプローブ（実施例２で調製したもの）
１０．９から１３．０％ ＤＭＳＯ
（３）上記の反応液を４６℃で５分間保温後、予め４６℃で２分間保温した、以下の組成からなる酵素液５μＬを添加した。

酵素液の組成：反応時（３０μＬ中）の最終濃度
２から２３％ グリセロール
３００ｍＭ トレハロース
３３．３ｍＭ 塩化カリウム
５．１から６．４Ｕ ＡＭＶ逆転写酵素
７１から１４２Ｕ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ
０．０２５ｍｇ／ｍＬ 牛血清アルブミン
（４）引き続きＰＣＲ用チューブを直接測定可能な温調機能付き蛍光分光光度計を用い、４６℃で反応させると同時に反応溶液の蛍光強度（励起波長４５０ｎｍ−蛍光波長４９５ｎｍ）を経時的に２０分間測定した。

酵素液を加えた時点を０分として、反応液の蛍光強度比（所定時間の蛍光強度値をバックグラウンドの蛍光強度比で割った値）が１．５を超えた場合を陽性判定とし、そのときの時間を検出時間とした結果を表１および２に示す。なお表１の「ＴＥ」はＲＮＡ試料の代わりにＴＥ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ）を添加したときの結果である。また表１および２の「Ｎ．Ｄ．」は反応開始後２０分後の蛍光強度比が１．５未満（陰性判定）であったことを意味する。

クラミジア・トラコマチス２３Ｓ ｒＲＮＡの検出性能（表１）については、本実施例で検討したオリゴヌクレオチドの組み合わせ（Ａ０１からＡ２１）いずれもが３００コピー／ｔｅｓｔのクラミジア・トラコマチス２３Ｓ ｒＲＮＡを１５分以内に検出した。特に、オリゴヌクレオチドの組み合わせＡ０１、Ａ０３からＡ０７、Ａ１２からＡ１９、およびＡ２１は３００コピー／ｔｅｓｔのクラミジア・トラコマチス２３Ｓ ｒＲＮＡを１０分以内に検出しており、クラミジア・トラコマチス２３Ｓ ｒＲＮＡを迅速に検出可能なオリゴヌクレオチドの組み合わせといえる。

交差反応性（表２）については、本実施例で検討したオリゴヌクレオチドの組み合わせ（Ａ０１からＡ２１）いずれもが１０^７コピー／ｔｅｓｔのクラミドフィラ・シッタシ２３Ｓ ｒＲＮＡ、クラミドフィラ・ニューモニエ２３Ｓ ｒＲＮＡおよび淋菌１６Ｓ ｒＲＮＡは検出せず、クラミジア・トラコマチス２３Ｓ ｒＲＮＡに対して高い特異性を有していた。特にオリゴヌクレオチドの組み合わせＡ０４からＡ０６、およびＡ１５からＡ２１は、クラミドフィラ・シッタシ２３Ｓ ｒＲＮＡまたはクラミドフィラ・ニューモニエ２３Ｓ ｒＲＮＡ共存下においても３００コピー／ｔｅｓｔのクラミジア・トラコマチス２３Ｓ ｒＲＮＡを１０分以内に検出しており、クラミジア・トラコマチス２３Ｓ ｒＲＮＡを迅速かつ特異的に検出可能なオリゴヌクレオチドの組み合わせといえる。

実施例４ クラミジア・トラコマチス２３Ｓ ｒＲＮＡ検出用オリゴヌクレオチドの検討（その２）
オリゴヌクレオチドの組み合わせとして表３に示す組み合わせを用いた他は、実施例３と同様な方法で評価した。なおオリゴヌクレオチドの組み合わせＡ０４は、特開２０１２−１３０２９０号公報で開示の組み合わせである。

酵素液を加えた時点を０分として、反応液の蛍光強度比（所定時間の蛍光強度値をバックグラウンドの蛍光強度比で割った値）が１．５を超えた場合を陽性判定とし、そのときの時間を検出時間とした結果を表３および４に示す。なお表３の「ＴＥ」はＲＮＡ試料の代わりにＴＥ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ）を添加したときの結果である。また表３および４の「Ｎ．Ｄ．」は反応開始後２０分後の蛍光強度比が１．５未満（陰性判定）であったことを意味する。

クラミジア・トラコマチス２３Ｓ ｒＲＮＡの検出性能（表３）については、本実施例で新たに検討したオリゴヌクレオチドの組み合わせ（Ａ０３１、Ａ０３２、Ａ０２１およびＢ０１）いずれもが３００コピー／ｔｅｓｔのクラミジア・トラコマチス２３Ｓ ｒＲＮＡを２０分以内に検出した。中でも、オリゴヌクレオチドの組み合わせＡ０３１およびＡ０３２は、実施例３（表１）でクラミジア・トラコマチス２３Ｓ ｒＲＮＡを迅速に検出していたオリゴヌクレオチドの組み合わせ（Ａ０３およびＡ０４）よりも迅速または同等に３００コピー／ｔｅｓｔのクラミジア・トラコマチス２３Ｓ ｒＲＮＡを検出していた。

交差反応性（表４）については、本実施例で新たに検討したオリゴヌクレオチドの組み合わせ（Ａ０３１、Ａ０３２、Ａ０２１およびＢ０１）いずれもが１０^７コピー／ｔｅｓｔのクラミドフィラ・シッタシ２３Ｓ ｒＲＮＡ、クラミドフィラ・ニューモニエ２３Ｓ ｒＲＮＡおよび淋菌１６Ｓ ｒＲＮＡは検出せず、クラミジア・トラコマチス２３Ｓ ｒＲＮＡに対して高い特異性を有していた。

実施例５ クラミジア・トラコマチス２３Ｓ ｒＲＮＡ検出用オリゴヌクレオチドの検討（その３）
表５に示すオリゴヌクレオチドの組み合わせを用いて、以下に示す方法で陰性試料（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０））を測定した。なおオリゴヌクレオチドの組み合わせＡ０４は、特開２０１２−１３０２９０号公報で開示の組み合わせである。
（１）以下の組成からなる反応液を市販の０．５ｍＬ容量ＰＣＲ用チューブ（Ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ Ｄｏｍｅ Ｃａｐ ＰＣＲ Ｔｕｂｅ、ＳＳＩ製）に分注し、これに前記陰性試料を添加した。なお陰性試料添加後の液量は３０μＬとなる。

反応液組成：
６０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．６）
１７ｍＭ 塩化マグネシウム
１００ｍＭ 塩化カリウム
１ｍＭ ＤＴＴ
各０．２５ｍＭ ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ
各３．０ｍＭ ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ、ＧＴＰ
３．６ｍＭ ＩＴＰ
０．１６μＭ 切断用オリゴヌクレオチド（３’末端の水酸基をアミノ基で修飾）
１．０μＭ 第一のプライマー（各配列番号記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドの５’末端側にＴ７プロモータ（配列番号２６）が付加したもの）
０．２μＭ 第二のプライマー
４０ｎＭ ＩＮＡＦプローブ（実施例２で調製したもの）
１０．９から１３．０％ ＤＭＳＯ
２から２３％ グリセロール
３００ｍＭ トレハロース
３３．３ｍＭ 塩化カリウム
５．１から６．４Ｕ ＡＭＶ逆転写酵素
７１から１４２Ｕ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ
０．０２５ｍｇ／ｍＬ 牛血清アルブミン
（２）陰性試料添加後のＰＣＲ用チューブを直接測定可能な温調機能付き蛍光分光光度計に載置し、４６℃で３０分間反応させた。

反応３０分後の蛍光強度比（所定時間の蛍光強度値をバックグラウンドの蛍光強度比で割った値）を算出した結果を表５に示す。特開２０１２−１３０２９０号公報で開示のオリゴヌクレオチドの組み合わせであるＡ０４では、偽陽性が約１４％（２／１４）発生した。一方、本発明のオリゴヌクレオチドの組み合わせ（Ａ０１からＡ０３およびＡ０５からＡ０７）では偽陽性は発生せず、実施例３の結果と合わせ、クラミジア・トラコマチス２３Ｓ ｒＲＮＡを特異的に検出していることがわかる。

実施例６ クラミジア・トラコマチス変異株の測定
クラミジア・トラコマチスにはｃｒｙｐｔｉｃ ｐｌａｓｍｉｄ ＤＮＡの一部が欠損した変異株（Ｓｗｅｄｅｎ株）が知られており、ｃｒｙｐｔｉｃ ｐｌａｓｍｉｄ ＤＮＡを標的としたＰＣＲ法では前記変異株を検出することができなかった（病原体検出情報、２９（９）、９−１０（２００８））。そこで本発明のオリゴヌクレオチドの組み合わせが前記変異株を検出するか検証した。検証は、ＲＮＡ試料としてクラミジア・トラコマチス標準ＲＮＡ（実施例１（１））３００コピー／ｔｅｓｔおよび前記変異株標準ＲＮＡ（前記変異株の２３Ｓ ｒＲＮＡ配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＮＣ＿０１７４４１）に基づき人工的に２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を作成し、インビトロ転写した後、転写産物を精製することで調製）３００コピー／ｔｅｓｔを、オリゴヌクレオチドの組み合わせとしてＡ０３２（表３）を用いた他は、実施例５と同様な方法で行なった。

結果を表６に示す。変異株も標準株と同様、３００コピー／ｔｅｓｔの標準ＲＮＡを検出することができた。

Claims (7)

1. 試料中に含まれるクラミジア・トラコマチス２３Ｓ ｒＲＮＡの特定塩基配列の一部と相同的な配列を有する第一のプライマーと、前記特定塩基配列の一部と相補的な配列を有する第二のプライマーとからなる、前記特定塩基配列または前記特定塩基配列の相補配列を含む核酸を増幅するためのプライマーセットであって、
   第一のプライマーが、配列番号６から８および１０から１５のいずれかに記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであり、
   第二のプライマーが、配列番号１７または１８に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである、
   前記プライマーセット。
2. 第一または第二のプライマーのいずれか一方の５’末端側にＲＮＡポリメラーゼのプロモーターがさらに付加されている、請求項１に記載のプライマーセット。
3. 請求項１または２のいずれかに記載のプライマーセットで増幅した特定塩基配列または前記特定塩基配列の相補配列を含む核酸を、前記核酸の一部とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能なインターカレーター性蛍光色素を標識したオリゴヌクレオチドプローブを用いて、クラミジア・トラコマチス２３Ｓ ｒＲＮＡを検出する方法。
4. インターカレーター性蛍光色素を標識したオリゴヌクレオチドプローブを構成するオリゴヌクレオチドが、配列番号１９に記載の塩基配列またはその相補配列とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドである、請求項３に記載の方法。
5. インターカレーター性蛍光色素を標識したオリゴヌクレオチドプローブを構成するオリゴヌクレオチドが、配列番号２０から２４のいずれかに記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである、請求項４に記載の方法。
6. 請求項１または２に記載のプライマーセットと、配列番号１９に記載の塩基配列またはその相補配列とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドにインターカレーター性蛍光色素を標識した核酸プローブとを含む、クラミジア・トラコマチス２３Ｓ ｒＲＮＡ検出試薬。
7. インターカレーター性蛍光色素を標識した核酸プローブを構成するオリゴヌクレオチドが配列番号２０から２４のいずれかに記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである、請求項６に記載の試薬。