DE69912099T2

DE69912099T2 - O6-benzylguanin-enthaltende oligodesoxyribonukleotide und deren verwendung

Info

Publication number: DE69912099T2
Application number: DE69912099T
Authority: DE
Inventors: C. Robert MOSCHEL; T. Gary PAULY; E. Anthony PEGG; Eileen M. Dolan
Original assignee: US Department of Health and Human Services; Arch Development Corp; Penn State Research Foundation
Current assignee: US Department of Health and Human Services; Arch Development Corp; Penn State Research Foundation
Priority date: 1998-02-13
Filing date: 1999-02-12
Publication date: 2004-07-22
Anticipated expiration: 2019-02-13
Also published as: CA2320288C; EP1054890B1; EP1054890A1; JP2002503671A; AU2672199A; AU742667B2; ES2209403T3; DE69912099D1; CA2320288A1; WO1999041269A1; ATE252111T1; US6060458A

Description

Technisches Gebiet der Erfindung
Diese Erfindung betrifft Oligodeoxyribonucleotide enthaltend O⁶-Benzylguanin und damit in Beziehung stehende Zusammensetzung. Diese Erfindung betrifft ebenso die Verwendung solcher Oligodeoxyribonucleotide und in Beziehung stehende Zusammensetzungen zur Verbesserung der Wirksamkeit eines antineoplastischen alkyhierenden Mittel in der chemotherapeutischen Behandlung von Krebs in einem Säugetier.
Hintergrund der Erfindung
O⁶-Alkylguanin-DNA-Alkylstransferase (AGT) ist ein DNA-Reparaturprotein. AGT entfernt Alkyl- und Arylalkyl-Gruppen, die an der O⁶-Position von Guanin in DNA sind oder Alkyl-Gruppen an der O⁴-Position von Thymin in DNA, in Folge der Einwirkung mutagner und/oder karzinogener alkylierender Mittel angebunden . Hierzu kommt es durch Herbeiführung eines stöchiometrischen Transfers der an der O⁶-Position eines Guanin-Restes in DNA u. B. an einen Cystein-Rest innerhalb des AGT-Proteins (Pegg, Cancer Research 50: 6119–6129 (1990)). Demgemäß ist AGT für eine normale Zelle vorteilhaft, weil es die Addukte, die in DNA durch toxische, mutagene und karzinogene Mittel gebildet werden, entfernt, wobei der Originalzustand der DNA wieder hergestellt und so geholfen wird, DNA-Mutation, die zur Initiierung einer Tumorbildung führen können, zu verhindern. Bedauerlicherweise ist AGT auch für kanzerogene Zellen zuträglich, weil es ebenso solche Addukte entfernt, die an der O⁶-Position von Guanin in DNA durch antineoplastische aklylierende Mittel, wie monofunktionale methylierende Mittel, z. B. Procarbazin, Dacarbazin und Temozolomid, und chlorethylierende Mittel, d. h. CENUs wie BCNU, ACNU, CCNU, MeCCNU, Fotemustin und Clomeson (Pegg et al., Prog. Nucleid Acid Research Molec. Biol. 51 (1995) 167–223). Das resultierende alkylierte AGT-Molekül ist demzufolge inaktiviert und nicht dazu in der Lage, nachfolgende Dealkylierungs-Reaktion durchzuführen. Die Anwesenheit von mehr AGT in einer Zelle erhöht gegenüber einer Zelle, die weniger AGT besitzt, deren Fähigkeit DNA über diesen Mechanismus zu reparieren.
Die Reduzierung der Wirksamkeit von chemotherapeutischen Krebsmitteln aufgrund von AGT, das ohne die Anwesenheit von zusätzlichen Enzymen oder Co-Faktoren zu erfordern wirkt, und die Existenz einer hohen Korrelation zwischen der AGT-Aktivität und der Verringerung der Empfindlichkeit von Tumorzellen gegenüber Nitrosoharnstoffen hat dazu geführt, dass AGT ein vorrangiges Ziel für Modifizierung geworden ist. Die Modifizierung wurde auf zwei unterschiedlichen Wegen versucht. Ein Weg ist indirekt und betrifft die Verwendung von methylierenden Mitteln, die O⁶-Methylguanin-Schädigungen in DNA für die nachfolgende Reparatur durch AGT einzubringen, wodurch der RGT-Level verringert wird. Der andere Weg ist direkt und betrifft die Verwendung eines Inaktivators von AGT, wie z. B. O⁶-Arylalkylguanin (siehe z. B. Moschel et al. US-Patente US 5, 091, 430 , US 5, 352, 669 und US 5, 358, 952 ).
Das erste O⁶-Alkylguanin, das als potentieller Inaktivator von AGT entwickelt wurde, war O⁶-Methylguanin. Obwohl erste in Zellkulturen erzielte Ergebnisse vielversprechend erschienen, war O⁶-Methylguanin lediglich dazu in der Lage, die AGT-Aktivität um 85% zu reduzieren und war nicht in der Lage, den therapeutischen Index von BCNU in der Behandlung von Mäusen, die xenogene menschliche Tumorzellen in sich trugen, zu verbessern (Pegg et al., (1995), supra). Darüber hinaus war die Verwendung von O⁶-Methylguanin mit Problemen verbunden, wie einer dürftigen Löslichkeit, einer dürftigen Affinität für AGT, einer dürftigen Aufnahme in Zellen und einem Mangel an Selektivität, was hohe Dosen von O⁶-Methylguanin zur Verabreichung über lange Zeitperioden nötig machte (Pegg et al., (1995) supra).
Die Testung von O⁶-Methylguanin führte zur Entwicklung von O⁶-Benzylguanin als einem potentiellen Inaktivator von AGT (Moschel et al., J. Med. Chem. 35(23): 4486–4491 (1992); Pegg et al., Biochem. 32(45): 11998–12006 (1993); Pegg et al., Proc. Amer. Assoc. Cancer Research 34: 565 (1993); und Gerson et al., Proc. Amer. Assoc. Cancer Research 35: 699 (1994)). Es hat sich herausgestellt, dass O⁶-Benzylguanin AGT in mer-Zellen inaktivieren kann, wodurch diese empfindlicher gegenüber zytotoxischen Effekten von alkylierenden Mitteln werden (Pegg et al., (1995), supra). Darüber hinaus besteht eine starke Korrelation zwischen dem Grad der erhöhten Empfindlichkeit gegenüber alkylierenden Mitteln und dem Level der Inhibierung der AGT-Aktivität durch O⁶-Benzylguanin (Pegg et al., 1995), supra). Ebenso hat sich gezeigt, dass O⁶-Benzylguanin die Empfindlichkeit von toxischen und hypoxischen Gehirntumor-Zellen gegenüber BCNU erhöht (Pegg et al., (1995), supra). Eine erhöhte Empfindlichkeit gegenüber McCCNU oder BCNU aufgrund vorheriger Verabreichung von O⁶-Benzylguanin wurde auch in bloßen Mäusen, die den xenogenen SF767-Tuomor tragen (Dolan et al., Cancer Comm. 2(11): 371–377 (1990)), Mäusen, die einen xenogenen D341MED oder einen D456MG-Gehirntumor oder ein xenogenes TE-671 menschliches Rhabdosarkom tragen (Pegg et al. (1995), supra; Friedman et al., J. Natl. Cancer Inst. 84(24): 1926–1931 (1992); und Felker et al., Cancer Chemother. Pharmacol. 32: 471–476 (1993)), festgestellt. Eine signifikante Steigerung des Überlebens-Durchschnitts von Tieren, die vor BCNU mit O⁶-Benzylguanin behandelt wurden im Vergleich zu BCNU alleine, wurde in dem intrakraniellen D341MED-Medulloblastom-Modell gezeigt (Pegg et al., (1995), supra; und Friedman et al. (1992), supra). Gleiche Beobachtungen wurden hinsichtlich des xenogenen Kolon-Tumors, der eine hohe RGT-Aktivität aufweist (Mitchell et al., Cancer Research 52: 1171–1175 (1992); und Dolan et al., Biochem. Pharmacol. 46(2): 285–290 (1993)), und dem Dunning-Tumor-Modell von Ratten-Prostata (Pegg et al. (1995), supra; und Dolan et al., Cancer Chemother. Pharmacol. 32: 221–225 (1993)) gemacht. Es hat sich gezeigt, dass exogen zugeführte DANN, wie einsträngige und doppelsträngige Oligodeoxyribonucleotide mit einer Länge von 4 bis 16 Basen (oder Basenpaaren), insbesondere 12-basige (oder 12 Basenpaare) Oligodeoxyribonucleotide die Produktion von Guanin durch rekombinantes meschliches AGT aus O⁶-Benzylguanin, aber nicht aus 9-substitutieres O⁶-Benzylguanin stimuliert (Goodtzova et al., Biochem. 33(28): 8385–8390 (1994)).
Es hat sich herausgestellt, dass p-Chlorobenzyl- und p-Methylbenzyl-Analoga von O⁶-Benzylguanin AGT schnell und irreversibel inaktivieren (Dolan et al., PNAS USA 87; 5368–5372 (1990); und Dolan et al., Cancer Research 51: 3367–3372 (1991)). Es hat sich gezeigt, dass solche Analoga genau so gut wie O⁶-Benzylguanin die Zytotoxizität von chlorethylierenden Mitteln gegenüber SF767-Glioma-Zellen und HT29-Kolon-Tumorzellen verbessern (Dolan et al. (1990), supra; und Dolan et al. (1991), supra). Basierend auf diesen Ergebnissen wurde angedeutet, dass O⁶-Benzylguanin möglicherweise für die Behandlung von mer-Tumoren als Hilfsstoff zu einem alkylierenden Mittel, das eine toxische Schädigung an der O⁶-Position von Guanin-Resten in DNA erzeugt, vorteilhaft ist (Dolan et al., (1991), supra).
O⁶-Benzylguanin, in Kombination mit BCNU, ist mittlerweile in klinischen Versuchen.
Obwohl derzeit O⁶-Benzylguanin deutlich die meistversprechende Verbindung zur Inaktivierung von AGT ist, ist es kein optimales Arzneimittel. Es besitzt lediglich eine begrenzte Löslichkeit in Wasser und zeichnet sich durch schnelle Entfernung aus dem Blutplasma aufgrund metabolischer Umwandlung in andere Verbindungen aus (Dolan et al., Cancer Research 54: 5123– 5130 (1994)).
Weiterhin deuten in vitro-Daten darauf hin, dass O⁶-Benzylguanin nicht zur Inaktivierung mutanter Formen von AGT, die aus durch chemotherapeutischer Arzneimittel, wie chlorethylierenden oder methylierenden Mitteln, induzierten Mutationen resultieren könnten, in vivo fähig ist. Da das E. coli Ada-C-Protein, Ogt-Alkyltransferase und das Hefe-AGT unempfindlich gegenüber O⁶-Benzylguanin sind, wurde eine ortsgerichtete Mutagenese (Crone et al., Cancer Research 53: 4750–4753 (1993); Crone et al., Cancer Research 54: 6221–6227 (1994); und Edara et al., Cancer Research 56; 5571–5575 (1996)) eingesetzt, um mutante AGT's herzustellen, die sich von der natürlichen AGT durch einen oder mehrere Aminosäure-Wechsel unterscheiden. Es hat sich herausgestellt, dass einige mutante AGT's bei der Inaktivierung durch O⁶-Benzylguanin deutlich weniger empfindlich sind als natürliches AGT (Crone et al. (1993), supra; Crone et al. (1994), supra; und Edara et al. (1996), supra).
Bei der Bemühung sich mit der begrenzten Löslichkeit in Wasser zu beschäftigen, wurde O⁶-Benzylguanin in einem auf Polyethylenglykol-400 basierenden Träger formuliert (Pegg et al. (1995), supra). Es hat sich herausgestellt, dass die Formulierung hinsichtlich der Sensibilisierung von xenogenem D456MG-Glioblastom in bloßen Mäusen gegenüber BCNU bei geringeren Dosen als früheren Cremophor-EL basierende Formulierungen wirksam ist (Pegg et al. (1995), supra).
Zwei neue Typen von Verbindungen, nämlich 8-substituiertes O⁶-Benzylguanin und 5-substituiertes 2,4-Diamino-6-(benzyloxy)pyrimidin, haben sich als signifikant wirksamer als O⁶-Benzylguanin hinsichtlich der Inaktivierung von AGT in menschlichen HT29-Kolon-Tumorzellen-Extrakten und intakten HT29-Kolon-Tumor zellen herausgestellt (Chae et al., J. Med. Chem. 38: 359–365 (1995)). Demzufolge wurde angeregt, dass diese neuen Verbindungen als chemotherapeutische Hilfsstoffe zur Verbesserung der Wirksamkeit von Antitumor-Arzneimitteln, die die O⁶-Position von Guanin-Resten in DNA modifizieren, gegenüber O⁶-Benzylguanin überlegen sein könnten (Chae et al. (1995), supra). Dennoch scheinen einige der Pyrimidine zu metabolisieren und schnell ausgeschieden zu werden (Roy et al., Drug Metab. Disposition, 24: 1205–1211 (1996)).
Es sind 16-basige Oligonucleotide enthaltend eine oder zwei O⁶-Methyl- oder O⁶-Benzyl-2'-deoxyguanosin-Rest(e) hergestellt worden. Diese besitzen die Sequenzen des H-ras-Gens von Ratten, die sich vom Kodon 9 bis zur ersten Base vom Kodon 14 erstrecken. Diese Oligonucleotide wurden verwendet, um zu ermitteln, ob die Art des O⁶-substituierten 2'-Deoxyguanosin-Restes oder dessen Position zu einer signifikant unterschiedlichen Störung der Duplex-Stabilität oder Konformation führt, was letztlich zu der Erwartung einer scheinbaren selektiven Mutabilität des zweiten Guanin-Restes des Kodon 12 von H-ras in Brust-Karzinomen von Ratten auf Aktivierung gefolgt von einer einzelnen Dosis von NMU beisteuern könnte (Pauly et al., Chem. Research Toxicol. 1 (6): 391–398 (1988)). Ähnliche 16-basige Oligonucleotide sind in eine Plasmid-Kassette zur Verwendung in E. coli eingebaut worden, um die Mutagenität von karzinogen-modifizierten Basen in einem einfach sektorierten Kolonie-Assay zu beobachten (Pauly et al., Biochemistry 30: 11700–11706 (1991)) und deren Reparatur durch Säugetier- und bakterielle AGT's zu vergleichen (Elder et al., Biochem. J. 298: 231–235 (1994)). Es hat sich gezeigt, dass ein Beispiel eines solchen 16-basigen Oligonucleotids die AGT-Aktivität schnell erschöpft und es wurde als mögliches gutes Substrat für AGT beschrieben (Dolan et al. (1990), supra). Das US-Patent US 5,691,307 offenbart gewisse O⁶-Benzylguanin enthaltende Oligonucleotide zur Verwendung bei der Verringerung von AGT.
Angesichts des oben Beschriebenen besteht nach wie vor das Bedürfnis nach einen Inhibitor von AGT, der (i) wasserlöslicher als O⁶-Benzylguanin ist, (ii) bei deutlich geringeren Konzentrationen als O⁶-Benzylguanin wirksam ist, (iii) dazu in der Lage ist, mutante Formen von AGT, die resistent gegenüber der Inaktivierung durch O⁶-Benzylguanin sind, zu inaktivieren und (iv) noch wirksamer als O⁶-Methylguanin und dessen Analoga ist.
Demgemäß ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung solch einen Inaktivator bereitzustellen. Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine solch einen Inaktivator enthaltende Zusammensetzung bereitzustellen. Es ist jedoch eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Verwendung solcher Inaktivatoren und Zusammensetzungen bereitzustellen.
Kurze Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt ein einsträngiges Oligodeoxyribonucleotid bereit, das (i) nicht weniger als 5 und nicht mehr als 11 Basen enthält, von denen wenigstens eine ein substituiertes oder ein unsubstituiertes O⁶-Benzylguanin ist, und welches (ii) menschliches AGT inaktiviert. Die vorliegende Erfindung stellt ebenso ein einsträngiges Oligodeoxyribonucleotid bereit, das mutantes menschliches AGT, welches entweder durch O⁶-Benzylguanin nicht inaktiviert oder durch O⁶-Benzylguanin weniger als durch das be sagte einsträngige Oligodeoxyribonucleotid, inaktiviert wird, inaktivieren kann. Ein oder mehrere Phosphate des einsträngigen Oligodeoxyribonucleotids können modifiziert werden, z. B. durch Ersetzung durch ein Methylphosphonat oder ein Phosphorothioat. Die vorliegende Erfindung stellt ebenso eine solch ein Oligodeoxyribonucleotid enthaltende Zusammensetzung bereit. Zusätzlich stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Verbesserung der Wirkung eines antineoplastischen alkylierenden Mittels, das die O⁶-Position des Guanin-Restes in DNA alkyliert, bei der chemotherapeutischen in-vitro-Behandlung von Krebszellen bereit. Außerdem umfasst die vorliegende Erfindung solche Oligodeoxyribonucleotide und Zusammensetzungen zur Verwendung in der Behandlung und als Arzneimittel genauso wie zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Tumor und Krebs. Weiterhin umfasst es die Co-Verabreichung einer für die Krebsbehandlung wirksamen Menge eines antineoplastischen alkylierenden Mittels und eine die chemotherapeutische Behandlung verbessernde Menge eines vorliegend erfindungsgemäßen Oligodeoxyribonucleotids oder einer Zusammensetzung hiervon bei Säugetieren.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Die 1A–C sind Diagramme der prozentualen verbleibenden Alkyltransferase-Aktivität (% verbleibende AGT-Aktivität) aufgetragen gegen die Konzentration eines einsträngigen Oligodeoxyribonucleotids (3-11 nts in der Länge, genannt 3-mer, 5-mer, 7-mer, 9-mer und 11-mer) enthaltend O⁶-Benzylguanin (nM-Inhibitor) für natürliche menschliche Alkyltransferase (AGT, 1A) und mutante menschliche Alkyltransferasen (G156A, 1B, und P140A, 1C).
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung basiert auf der Entdeckung, dass ein einsträngiges Oligodeoxyribonukleotid, das 5 und nicht mehr als 11 Basen enthält, von denen wenigstens eine ein nicht weniger als substituiertes oder ein unsubstituiertes O⁶-Benzylguanin ist, ein wirksamerer Inaktivator von menschlichem AGT als die freie Base O⁶-Benzylguanin ist. Das einsträngige Oligodeoxyribonucleotid ist nicht nur wirksamer bei der Aktivierung von menschlichem AGT, es leidet auch nicht unter dem Hauptnachteil, der mit der freien Base O⁶-Benzylguanin, nämlich dessen begrenzter Löslichkeit im Wasser, verbunden ist. Eine weitere Charakteristik, die das einsträngige Oligodeoxyribonucleotid von der freien Base O⁶-Benzylguanin unterscheidet, ist deren Fähigkeit, mutante menschliche AGT's zu inaktivieren, die durch verschiedene chemotherapeutische Arzneimittel, wie chlorethylierende oder methylierende Mittel, in vivo hergestellt werden können und die entweder durch O⁶-Benzylguanin nicht aktiviert oder durch O⁶-Benzylguanin weniger als durch das einsträngige Oligodeoxyribonucleotid aktiviert werden. Zusätzlich sind die erfindungsgemäßen einsträngigen Oligodeoxyribonucleotide entworfen worden, dass sie nicht länger als nötig sind, um an die aktive Stelle des menschlichen AGT zu passen, wodurch sie einfacher herzustellen und zu reinigen als vergleichbar längere einsträngige Oligodeoxyribonucleotide und doppelsträngige Oligodeoxyribonucleotide gemacht wurden.
In Anbetracht des oben gesagten, stellt die vorliegende Erfindung ein einsträngiges Oligodeoxyribonucleotid bereit, das (i) nicht weniger als 5 und nicht mehr als 11 Basen enthält, von denen mindestens eine ein substituiertes oder ein unsubstituiertes O⁶-Benzylguanin ist, und (ii) menschliches AGT inaktiviert. Vorzugsweise enthält das einsträngige Oligodeoxyribonucleotid von 7 bis 11 Basen, besonders bevorzugt von 9 bis 11 Basen. Beispiele solcher Oligodeoxyribonucleotide werden in Tabelle 1 dargestellt.
Obwohl es nur notwendig ist, dass eine einzige Base in dem einsträngigen Oligodeoxyribonucleotid ein substituiertes oder ein unsubstituiertes O⁶-Benzylguanin ist, können so viel wie 2, 3, 4 oder sogar jede Base in dem einsträngigen Oligodeoxyribonucleotid ein substituiertes oder ein unsubstituiertes O⁶-Benzylguanin sein. Wenn mehr als ein substituiertes oder unsubstituiertes O⁶-Benzylguanin in dem einsträngigen Oligodeoxyribonucleotid anwesend ist, können diese gleich oder unterschiedlich sein. Ein bevorzugtes einsträngiges Oligodeoxyribonucleotid ist ein solches, in dem die mittlere Base ein substituiertes oder ein unsubstituiertes O⁶-Benzylguanin ist.
Obwohl das mindestens eine O⁶-Benzylguanin vorzugsweise unsubstituiert ist, kann das O⁶-Benzylguanin substituiert sein. Die Art, in der das O⁶-Benzylguanin substituiert ist, und der Umfang, in dem das O⁶-Benzylguanin substituiert ist, ist für die Durchführung der vorliegenden Erfindung nicht als beschränkend kritisch anzusehen. Alles, worauf es ankommt, ist, dass das resultierende einsträngige Oligodeoxyribonukleotid menschliches AGT inhibiert.
Vorzugsweise inaktiviert das einsträngige Oligodeoxyribonucleotid menschliches AGT wirksamer als die freie Base O⁶-Benzylguanin. Bevorzugt inaktiviert das einsträngige Oligodeoxyribonucleotid ein mutantes menschliches AGT, das durch verschiedene chemothera peutische Arzneimittel, wie chlorethylierende oder methyliernde Mittel in vivo hergestellt werden kann und dass entweder durch O⁶-Benzylguanin nicht inaktiviert oder weniger als durch das einsträngige Oligodeoxyribonucleotid inaktiviert wird.
Wenn das O⁶-Benzylguanin substituiert ist, ist es vorzugsweise mit 1 bis 5 Substituenten substituiert, die gleich oder verschieden sein können und Wasserstoff, Halogen, Halogenalkyl, Hydroxy, Hydroxyamino, Hydrazino, ein Alkyl, ein Aryl, Nitro, ein polycyclisches aromatisches Alkyl, ein Cycloalkyl, ein Alkenyl, ein Alkinyl, ein Hydroxyalkyl, ein Alkoxy, ein Alkoxyalkyl, ein Aryloxy, ein Acyloxy, ein Acyloxyalkyl, ein Monoalkylamino, ein Dialkylamino, ein Acylamino, ein Ureid, ein Thioureid, ein Carboxy, ein Carboxyalkyl, ein Cyano, ein Cyaloalkyl, C-Formyl, C-Acyl, ein Dialkoxyalkyl und SO_nR₁, wobei N eine ganze Zahl zwischen 0 und 3 ist und R₁ Wasserstoff, ein C₁-C₆-Alkyl, ein substituiertes C₁-C₄-Alkyl oder ein unsubstituiertes Aryl ist, sind. Besonders bevorzugt ist das Halogenalkyl ein geradkettiges C₂-C₆-Alkyl oder ein verzweigtes C₃-C₆-Alkyl, die mit einem bis drei Halogengruppen substituiert sind, das Alkyl ist ein geradkettiges C₂-C₆-Alkyl oder ein verzweigtes C₃-C₆-Alkyl, das Aryl mit einem geradkettigen C₁-C₈-Alkyl oder einem verzweigten C₃-C₈-Alkyl substituiert ist, das polycyclische aromatische Alkyl zwischen zwei bis vier aromatische Ringe und ein geradkettiges C₁-C₆-Alkyl oder ein verzweigtes C₃-C₆-Alkyl enthält, das Cycloalkyl ein C₃-C₈-Cycloalkyl ist, das Alkenyl ein geradkettiges C₂-C₆-Alkenyl oder ein verzweigtes C₄-C₆-Alkenyl ist, das Alkinyl ein geradkettiges C₂-C₆-Alkinyl oder ein verzweigtes C₄-C₆-Alkinyl ist, das Hydroxyalkyl ein geradkettiges C₁-C₆-Hydroxyalkyl oder ein verzweigtes C₃-C₆-Hydroxyalkyl ist, das Alko xy ein geradkettiges C₁-C₈-Alkoxy oder ein verzweigtes C₃-C₈-Alkoxy ist, das Alkoxyalkyl ein C₂-C₈-Alkoxyalkyl ist, das Acyloxyalkyl ein geradkettiges C₁-C₆-Alkyl oder ein verzweigtes C₃-C₆-Alkyl enthält, das Monoalkylamino und das besagte Dialkylamino ein geradkettiges C₁-C₆-Alkyl oder ein verzweigtes C₂-C₆-Alkyl enthält, das Carboxyalkyl ein geradkettiges C₁-C₆-Alkyl oder ein verzweigtes C₃-C₆-Alkyl enthält, das Cyanoalkyl ein geradkettiges C₁-C₆-Alkyl oder ein verzweigtes C₃-C₆-Alkyl enthalten und das Dialkoxyalkyl ein geradkettiges C₁-C₆-Alkoxy oder ein verzweigtes C₃-C₆-Alkoxy enthalten, die gleich oder unterschiedlich sein können und ein geradkettiges C₁-C₆-Alkyl oder ein verzweigtes C₃-C₆-Alkyl.
O⁶-Benzylguanin kann in Übereinstimmung mit dem in Bowles et al., J. Med. Chem. 6; 471–480 (1963), oder Frihart et al., J. Am. Chem. Soc. 95: 7144–7175 (1973) beschriebenen Verfahren hergestellt werden. Substituierte O⁶-Benzylguanine können durch Reaktion von 2-Amino-6-chloropurin mit den Alkoxiden eines Benzylalkohols, der einen gewünschten Ortho-, Meta- oder Para-Substituenten enthält, synthetisiert werden. Verfahren, die zur Herstellung substituierter O⁶-Benzylguanine eingesetzt werden können, werden in Dolen et al. (1990), supra beschrieben. Die Behandlung von O⁶-Benzylguanin in dessen anionischer Form mit alkylierenden Mitteln, wie Ethylbromoacetat, 2-Bromoacetamid, 1,2-Epoxybutan, Bromoacetonitril oder 1,3,4,6-Tetra-O-acetyl-2-deoxy-2-(chloroacetamido)-β-D-glukose, wird in Moschel et al. (1992), supra, und Fondy et al., J. Med. Chem. 21: 1222–1225 (1978) beschrieben. α-Aminosäure-Adukte von O⁶-Benzylguanin können durch nukleophile Ersetzung von O⁶-Benzylguanin oder dessen Anion mit ausgewählten Reagenzien, wie dem geschützten β-Lacton von L-Serin (Pansare et al., Org. Syn. 70: 1–9 (1991)) oder (S)-3-Amino-2-oxethanon) (Pansare et al., Org. Syn. 70: 10–17 (1991)) hergestellt werden. Spezifische Beispiele der Synthese von substituiertem O⁶-Benzylguanin sind in Moschel et al. US-Patent Nr. 5,691,307 beschrieben.
Einsträngige Oligodeoxyribonucleotide, die mindestens ein O⁶-Benzylguanin enthalten, können in Übereinstimmung mit den dem Fachmann bekannten Verfahren synthetisiert werden. Zum Beispiel können automatisierte DNR-Syntheseverfahren verwendet werden, um ein geeignetes geschütztes Phosphoramidit von O⁶-Benzyl-2'-deoxyguanosin in eine DNA-Sequenz an jeder Position einzufügen (Pauly et al. (1988), supra und Pauly et al. (1991), supra). O⁶-Benzylguanin kann, wenn gewünscht, über einen Linker an einer Hydroxyl-Gruppe an einen endständigen Kohlenwasserstoffrest eines Oligodeoxyribonucleotid angebunden werden, z. B. durch Reaktion von 2-Amino-6-benzyloxy-9-carboethoxymethylpurin mit der Hydroxylgruppe des endständigen Kohlenwasserstoffrestes des Oligodeoxyribonecleotids.
Das oben beschriebene einsträngige Oligodeoxyribonucleotid kann modifiziert werden, z. B. um dessen Widerstandsfähigkeit gegen die Verdauung durch Nuklease in vivo zu steigern. Diesbezüglich ist wenigstens ein Phosphat, es können aber auch mehr sein, modifiziert, vorzugsweise durch Ersetzung mit einem Methylphosphonat oder einem Phosphorothioat. Besonders bevorzugt ist wenigstens eines der endständigen Phosphate durch ein Methylphosphonat oder ein Phosphorothioat ersetzt. Noch bevorzugter ist es, dass beide der endständigen Phosphate unabhängig voneinander durch ein Methylphosphonat oder ein Phosphorothioat ersetzt sind, d. h. die Ersetzungen können gleich oder verschieden sein. Solche Modifizierungen liegen inner halb des gewöhnlichen Fachwissens (siehe z. B. Marcus-Sekura et al., Nucleic Acids Research 15: 5749– 5763 (1998) und hierin zitierte Druckschriften). Es sollte sorgsam sichergestellt werden, dass nicht so viele Phosphate in jedem der gegebenen Oligodeoxyribonucleotide modifiziert werden, dass die Fähigkeit des Oligodeoxyribonucleotids negativ beeinflusst wird, menschliches AGT zu inaktivieren.
Vorzugsweise inaktiviert das einsträngige Oligodeoxyribonukleotid auch eine mutante menschliche Alkyltransferase. Die mutante humane Alkyltransferase wird vorzugsweise durch O⁶-Benzylguanin entweder nicht inaktiviert oder durch O⁶-Benzylguanin weniger als durch das einsträngige Oligodeoxyribonucleotid inaktiviert.
Durch Messung der Alkyltransferase-Verringerung kann bestimmt werden, ob ein gegebenes einsträngiges Oligodeoxyribonucleotid eine natürliche oder mutante menschliche Alkyltransferase inaktiviert oder nicht. Zum Beispiel kann eine Standard-Lösung (100 mM) eines gegebenen einsträngigen Oligodeoxyribonucleotids in einem wässrigen oder einem gemischten wässrigen/organischen Lösungsmittel hergestellt werden. Lösungen des menschlichen natürlichen AGT, mutanten menschlichen AGT oder des AGT von HT29-Zellen und Zellextrakten (Domoradzki et al., Carcinogenesis 5: 1641–1647 (1984)) können mit variierenden Konzentrationen (z. B. zwischen 0 und 400 μM) des Oligodeoxyribonucleotids 30 Minuten lang in einem Puffer, enthaltend 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 0,1 mM EDTA und 5 mM Dithiothreitol inkubiert werden und die Verringerung der Alkyltransferase kann gemessen werden. Alternativ können die Zellen bei einer Dichte von 5 × 10⁶ Zellen/T75 Kolben plattiert und über drei Tage herange zogen werden, zu welchem Zeitpunkt das Medium durch ein Medium, enthaltend eine gegebene Konzentration eines Oligodeoxyribonucleotids, ersetzt werden kann. Nach vier Stunden können die Zellen eingesammelt und bei –80°C für die spätere Analyse der Alkyltransferase-Verringerung tiefgefroren werden. Die Alkyltransferase-Verringerung wird durch Messung des Verlusts an O⁶-[³H]Methylguanin, z. B. von einem [³H]methylierten DNA-Substrat, das z. B. durch Reaktion von [³H]Methylnitrosoharnstoff (21,5 Ci/mmol) mit Thymus-DNA vom Kalb wie zuvor beschrieben (Domoradzki et al. (1984, supra; und Dolan et al. (1990), supra) hergestellt werden kann, b stimmt werden.
Von jedem Oligodeoxyribonucleotid gemäß der vorliegenden Erfindung, das Tumorzellen der Alkyltransferase-Aktivität, wie gemessen, z. B. in dem oben beschriebenen Assay wirksam verringert, wird erwartet, die Wirkung eines antineoplastischen alkylierenden Mittels, das die O⁶-Position von Guanin-Resten in DNA alkyliert, in der chemotherapeutischen Behandlung von Krebs in einem Säugetier zu steigern. Dies stellte sich im Zusammenhang mit dem schwachen Alkyltransferase-Verringerer O⁶-Methylguanin (Dolan et al., Cancer Research 46: 4500–4504 (1986)) und den wirksameren Alkyltransferase-Veringerern O⁶-Benzylguanin und O⁶- (p-chlorobenzyl) – und O⁶-(p-methylbenzyl) -guanin (Dolan et al. (1990), supra; Dolan et al. (1991), supra; Dolan et al. (1993), supra; Mitchell et al., Cancer Research 52: 1171–1175 (1992; und Moschel et al., US-Patent Nr. 5,691,307) als richtig heraus.
Zusätzlich zu den oben beschriebenen Oligodeoxyribonucleotiden stellt die vor Liegende Erfindung auch eine Zusammensetzung bereit, die ein einsträngiges Oligoeoxyribonucleotid und einen pharmazeutisch verträg lichen Carrier umfasst. Geeignete pharmazeutisch verträgliche Carrier, Vehikel, Hilfsstoffe, Träger und Verdünnungsmittel sind aus dem Stand der Technik bekannt. Die oben beschriebenen Oligodeoxyribonucleotide oder pharmazeutisch verträglichen Salz hiervon können in festen, semi-festen, flüssigen oder gasförmigen Formulierungen präpariert werden. Beispiele solcher Formulierung schließen Tabletten, Kapseln, Puder, Granulate, Salben, Lösungen, Zäpfchen, Injektionen, Inhalationsmittel und Aerosole ein. Die Wahl der Formulierung wird zum Teil durch den jeweiligen Weg der gewählten Verabreichung bestimmt. Die folgenden Formulierungen sind lediglich beispielhaft und keinesfalls beschränkend.
Zusammensetzungen für die orale Verabreichung (auch bukkal oder sublingual) können Zusatzstoffe, wie Lactose, Mannitol, Speisestärke oder Kartoffelstärke, Binder wie kristalline Cellulose, cellulose Derivate, Akazie, Speisestärke oder Gelatine, mit Natriumcarboxymethylcellulose, Gleitmittel, wie Talk oder Magnesiumstearat und, wenn gewünscht, Verdünnungsmittel, Puffermittel, Feuchtigkeitsmittel, Konservierungsmittel und Aromastoffe enthalten. Solche Zusammensetzungen können z. B. die Form von Tabletten, Pudern, Granulaten oder Kapseln haben. Formen von Dosierungseinheiten für die orale Verabreichung wie Sirupe, Elixiere und Suspensionen, bei denen jede Dosierungseinheit, d. h, teelöffelvoll oder esslöffelvoll, eine vorbestimmte Menge eines erfindungsgemäßen Oligodeoxyribonucleotids enthält, kann mit sterilem Wasser zur Injektion (USP) oder mit normaler Kochsalzlösung kombiniert werden.
Zusammensetzungen zur Verabreichung in Form von Zäpfchen können eine Base enthalten. Geeignete Basen schließen emulgierende Basen und wasserlösliche Basen ein. Vehikel, wie Kakaobutter, Carbowax und Polyethylenglykol, die bei Raumtemperatur fest sind und bei Körpertemperatur schmelzen, können ebenfalls verwendet werden.
Zusammensetzungen für die perkutane Verabreichung enthalten ein geeignetes Vehikel oder Salz. Die Adsorption kann durch die Verwendung eines elektrischen Stroms oder Feldes unterstützt werden.
Zusammensetzungen für die Verabreichung von Injektionen können durch Lösungen, Suspensionen oder Emulsionen eines erfindungsgemäßen Oligodeoxyribonucleotids in einem wässrigen oder nicht-wässrigen Lösungsmittel wie Pflanzenöl, synthetischse aliphatisches Säureglycerid, Ester von höher-aliphatischen Säuren oder Propylenglykol hergestellt werden. Löslichkeitsmittel, isotonische Mittel, Suspensionsmittel, Emulsionsmittel, Stabilisatoren und Konservierungsmittel können, wenn gewünscht, zugesetzt werden.
Zusammensetzungen für die Verabreichung als Aerosol können in der Form einer Flüssigkeit oder eines feinen Pulvers hergestellt werden. Ein Aerosolbehälter kann mit gasförmigen oder flüssigen Spraymitteln und, wenn gewünscht, konventionellen Hilfsstoffen, wie Befeuchtungsmitteln gefüllt werden. Geeignete Treibgase schließen Dichlordifluormethan, Propan, Stickstoff u. ä. ein. Wenn gewünscht, kann die Zusammensetzung für nicht unter Druck stehende Zubereitungen, wie einem Vernebler oder einem Zerstäuber, formuliert werden.
Angesichts des oben gesagten stellt die vorliegende Erfindung auch ein Verfahren zur Verbesserung der Wirkung eines antineoplastischen alkylierenden Mit tels, das die O⁶-Position von Guanin-Resten in DNA alkyliert, für die chemotherapeutische Behandlung von Krebs in einem Säugetier, insbesondere einem Menschen, bereit. Das Verfahren umfasst die Co-Verabreichung einer für die Krebsbehandlung wirksamen Menge eines antineoplastischen alkylierenden Mittels und einer die chemotherapeutische Behandlung steigernden Menge eines einsträngigen Oligodeoxyribonucleotids gemäß der vorliegenden Erfindung bei einem Säugetier.
Mit „Verbesserung der Wirkung eines antineoplastischen alkylierenden Mittels" ist gemeint, dass das antineoplastische alkylierende Mittel eine größere Wirkung in Gegenwart eines erfindungsgemäßen Oligodeoxyribonucleotid als in Abwesenheit eines erfindungsgemäßen Oligodeoxyribonucleotids besitzt. Wenn eine Alkyltransferase auf das Oligodeoxyribonucleotid wirkt, wird es inaktiviert und ist damit nicht in der Lage, auf die DNA in einer Krebszelle, die durch das antineoplastische alkylierende Mittel alkyliert wurde, zu wirken. Vorausgesetzt, dass die Alkyltransferase nicht in der Lage ist, auf die alkylierte DNA in einer Krebszelle zu wirken, wird die DNA in der Krebszelle nicht repariert, was zum Absterben der Krebszelle führt.
Mit „Co-Verabreichung" ist gemeint, dass das antineoplastische alkylierende Mittel und das Oligodeoxyribonucleotid genügend zeitnah verabreicht werden, so dass das Oligodeoxyribonucleotid die Wirkung des antineoplastischen alkylierenden Mittels verbessern kann. In diesem Zusammenhang kann das Oligodeoxyribonucleotid zuerst verabreicht werden und das antineoplastische alkylierende Mittel als zweites verabreicht werden oder umgekehrt. Alternativ können das Oligodeoxyribonucleotid und das antineoplastische al- kylierende Mittel gleichzeitig verabreicht werden. Zusätzlich kann eine Kombination von Oligodeoxyribonucleotiden verabreicht werden und ein oder mehrere Oligodeoxyribonucleotide können in Kombination mit anderen bei der Krebsbehandlung nützlichen Mitteln verabreicht werden.
Mit „einer für die Krebsbehandlung wirksamen Menge eines antineoplastischen alkylierenden Mittels" ist gemeint, dass das antineoplastische alkylierende Mittel in einer für die Behandlung des Krebses ausreichenden Dosis verabreicht wird. Solche Dosen sind aus dem Stand der Technik bekannt (siehe z. B. Physicians' Desk Reference). Zum Beispiel kann 1,3-bis(2-chloroethyl)-1-nitrosoharnstoff(Carmustin oder BCNU, Bristol-Myers, Evansville, IN) bei einer Dosis von 150–200 mg/m² alle sechs Wochen intravenös verabreicht werden. Ein anderes alkylierendes Mittel, nämlich 1-(2-Chloroethyl)-3-cyclohexyl-1-nitrosoharnstoff (Lomustin oder CCNU, Bristol-Myers) kann bei einer Dosis von etwa 130 mg/m² alle sechs Wochen verabreicht werden.
Mit „einer die chemotherapeutische Behandlung steigernden Menge eines einsträngigen Oligodeoxyribonucleotids" ist gemeint, dass das Oligodeoxyribonucleotid in einer zur Verbesserung der Wirkung des antineoplastischen alkylierenden Mittels ausreichenden Menge verabreicht wird. Eine geeignete Dosis ist eine solche, die zu einer Konzentration des Oligodeoxyribonucleotids in der zu behandelnden Krebszelle führt, die ausreichend ist, um die Alkyltransferase-Aktivität zu verringern, d. h. von 10 nM bis 200 nM intrazellulär, was eine extrazellulärer Konzentration von 10 μM bis 50 μM erfordern kann. Die Dosis kann so eingestellt werden, wie es notwendig ist, um die Wir kung des antineoplastischen alkylierenden Mittels zu verbessern.
Die erfindungsgemäßen Oligodeoxyribonucleotide sind nützlich zur Verbesserung der Wirkung von jedem antineoplastischen alkylierenden Mittel, vorausgesetzt, dass das Mittel die O⁶-Position von Guanin-Resten in DNA alkyliert. Beispiele von antineoplastischen alkylierenden Mitteln schließen chlorethylierende Mittel ein. Die am häufigsten verwendeten chlorethylierenden Mittel schließen 1-(2-Chlorethyl)-3-cyclohexyl-1-nitrosoharnstoff (CCNU, Lomustin), 1,3-bis (2-Chlorethyl)-nitrosoharnstoff(BCNU, Carmustin), 1-(2-Chlorethyl)-3-(4-methylcyclohexyl)-1-nitrosoharnstoff (MeCCNU, Semustin) und 1-(2-Chlorethyl)-3-(4-amino-2-methyl-5-pyrimidinyl)methyl-1-nitrosoharnstoff (ACNU) ein. Solche Mittel sind klinisch gegen Tumore des zentralen Nervensystems, Plasmozytom, Melanoma, Lymphoma, Tumore des Magen-Darm-Traktes und andere feste Tumore eingesetzt worden (Colvin und Chabner, Alkylating Agents, In: Cancer Chemotherapy: Principles and Practice. Hrsg. B. A. Chabner and J. M. Collins, Lippincott, Philadelphia, P. A. pp. 276–313 (1990); und McCormick et al., Eur. J. Cancer 26: 207– 221 (1990). Chlorethylierende Mittel, die weniger Nebeneffekte zeigen und derzeit in der Entwicklung sind, schließen 1-(2-Chlorethyl)-3-(2-hydroxyethyl)-1-nitrosoharnstoff (HECNU), 1-Chlorethylmethylsulfonylmethansulfonat (Clomeson) und 1-[N-(2-Chloroethyl)-N-nitrosoureido]ethylphosphonsäurediethylester (Fotemustin) ein. (Colvin und Chabner (1990), supra; und McCormick et al. (1990), supra). Methylierende Mittel schließen Streptozotocin (2-Deoxy-2-(3-methyl-3-nitrosoureido)-D-glucopyranose), Procarbazin (N-(1-Methylethyl)-1-[(2-methylhydrazino)methyl]benzamid), Dacarbazin oder DTIC (5-(3,3-Dimethyl-1-triazenyl)- 1H-imidazol-4-carboxamid) und Temozolomid (8-Carbamoyl-3-methylimidazo[5,1-d]-1,2,3,5-tetrazin-4-(3H)-on ein.
Temozolomid ist wirksam gegen maligne Melanome, Gehirntumore und Mycosis funguides. Streptozotocin ist wirksam gegen Tumore des Pankreas. Procarbazin wird verwendet zur Behandlung der Hodgkin-Krankheit und Gehirntumore. DTIC wird zur Behandlung von Melanomen und Lymphomen verwendet (Colvin und Chabner (1990), supra; und Longo, Semin. Concol. 17: 716–735 (1990)).
Das antineoplastische alkylierende Mittel kann über jeden Weg verabreicht werden. Herkömmliche Mittel zur Verabreichung sind in Wasserman et al. (Cancer 36: 1258–1268 (1975)) und in Physicians' Desk Reference (44^th Ed., Edward R. Rarnhart, Hrsg., 1990) beschrieben.
Das vorliegende erfindungsgemäße Verfahren kann zur Behandlung von jeder Krebsart, die einer Behandlung durch ein antineoplastisches alkylierendes Mittel zugänglich ist, verwendet werden.
Beispiele für solche Krebsarten schließen Prostatakrebs, Gehirnkrebs, Lymphom, Leukämie, Brustkrebs, Eierstockkrebs, Lungenkrebs, Wilms-Tumor, Rhabdomyosarkom, Plasmozytom, Magenkrebs, Sarcom des Weichgewebes, Hodgkin-Krankheit und Non-Hodgkin-Lymphomein.
Das folgende Beispiel verdeutlicht die vorliegende Erfindung weiter. Das Beispiel darf natürlich nicht in einer Weise ausgelegt werden, die den Schutzumfang der vorliegenden Erfindung beschränkt.
O⁶-Benzylguanin wurde wie zuvor beschrieben, synthetisiert (Dolan et al. (1990), supra). Einsträngige Oligodeoxyribonucleotide wurden ebenso in Übereinstimmung mit den durch die Pauly et al. (1991), supra beschriebenen Verfahren synthetisiert. O⁶-Benzylguanin wurde durch Kristallisation aus Wasser gereinigt und die Oligodeoxyribonucleotide wurden durch HPLC gereinigt (Pauly et al. (1988), supra). Die Zusammensetzung der Oligodeoxyribonucleotide wurde durch enzymatische Verdauung zu 2'-Deoxyribonucleotiden bestätigt (Pauly et al. (1988), supra).
Beispiel
Dieses Beispiel zeigt, dass natürliche und mutierte menschliche Alkyltransferasen empfindlicher gegenüber der Inaktivierung durch ein einsträngiges Oligodeoxyribonucleotide enthaltend O⁶-Benzylguanin als durch O6-Benzylguanin alleine sind.
Natürliches menschliches AGT und Mutationen hiervon, nämlich P140A und G156A, wurden unter Verwendung des pIN-Vektor-Expressionssystems hergestellt (pIN-AGT, pIN-P140A(Pro-140 bis Ala) und pIN-G156A (Gly-156 bis Ala) (Crone et al. (1993), supra; Crone et al. (1994), supra; und Pegg et al. (1993), supra).
Die aus den pIN-Vektoren exprimierten natürlichen und mutierten AGT-Proteine wurden bis zur Homogenität durch Ammoniumsulfat-Fällung, Mono-S-Chromatographie und Gel-Filtration, wie zuvor beschrieben (Pegg et al. (1993), supra; und Kanugula et al. (1995), supra), aufgereinigt. Das gereinigte Protein wurde anschließend mit O⁶-Benzylguanin, O⁶-Benzyl-2'-deoxyguanosin oder einem einsträngigen Oligodeoxyribonucleotid mit einer Länge von drei bis elf Basen und enthaltend O⁶-Benzylguanin in 0,1 ml von 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 0,1 mM EDTA und 5,0 mM Dithiothreitol 30 Minuten lang bei 37°C inkubiert. Anschließend wurde die restliche AGT-Aktivität durch eine 30 minütige Inkubation mit einem [³H]-methylierten DNA-Substrat (1,0 ml Volumen), das durch eine Reaktion mit N-[³H]-Methyl-N-Nitrosoharnstoff, wie zuvor beschrieben (Dolan et al. (1993), supra; und Dolan et al. (1991), supra), methyliert worden war, bestimmt.
Die Ergebnisse wurden in Prozent der verbleibenden AGT-Aktivität ausgedrückt und dann zur Berechnung des ED₅₀-Wertes (die Konzentration, die zur Reduzierung der AGT-Aktivität um 50 o benötigt wird) für den Inaktivator, wie in Tabelle I zu sehen, verwendet.
Tabelle I
Daten zuvor veröffentlicht
Die Ergebnisse zeigen, dass ein einsträngiges Oligodeoxyribonucleotid, das O⁶-Benzylguanin (b⁶G) enthält, selbst wenn es so kurz wie drei Nucleotide ist, bei der Inaktivierung von natürlichen und mutanten AGTs wirksamer war als die freie Base O⁶-Benzylguanin oder O⁶-Benzyl-2'-deoxyguanosin. Im Hinblick hierauf inaktivierten Oligodeoxyribonucleotide, die eine Länge von 5 bis 11 Nucleotiden hatten und welche O⁶-Benzylguanin enthielten, die mutanten AGTs P140A und G156A bei 4-fach und 11-fach höheren Konzentrationen bezüglich der für die Inaktivierung des natürlichen AGT erforderlichen Konzentration, wohingegen O⁶- Benzylguanin die mutierten AGTs P140A und G156A bei 25-fach und 300-fach höheren Konzentrationen bezüglich der für die Inaktivierung des natürlichen AGT erforderlichen Konzentration inaktivierten. Maximale Wirksamkeit wurde für Oligodeoxyribonucleotide beobachtet, die eine Länge von 5 bis 11 Nucleotiden besaßen. Es gab keinen signifikanten Verlust (> 5%) der AGT-Aktivität in der Abwesenheit eines Inaktivators.
Sequenz-Protokoll
Sequenz-Protokoll

Claims

Einsträngiges Oligodeoxyribonukleotid, das (i) nicht weniger als fünf und nicht mehr als elf Basen enthält, von denen wenigstens eine ein substituiertes oder ein unsubstituiertes O⁶-Benzylguanin ist und (ii) die humane Alkyltransferase inaktiviert.
Einsträngiges Oligodeoxyribonukleotid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das besagte Oligodeoxyribonukleotid nicht weniger als sieben Basen enthält.
Einsträngiges Oligodeoxyribonukleotid nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das besagte Oligodeoxyribonukleotid nicht weniger als neun Basen enthält.
Einsträngiges Oligodeoxyribonukleotid nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass das besagte Oligodeoxyribonukleotid aus elf Basen besteht.
Einsträngiges Oligodeoxyribonukleotid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das besagte O⁶-Benzylguanin mit einem bis fünf Substituenten substituiert ist, die gleich oder unterschiedlich sein können und ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Halogen, Halogenalkyl, Hydroxy, Hydroxyamino, Hydrazino, einem Alkyl, einem Aryl, Nitro, einem polycyclischen aromatischen Alkyl, einem Cycloalkyl, einem Alkenyl, einem Alkinyl, einem Hydroxyalkyl, einem Alkoxy, einem Alkoxyalkyl, einem Aryloxy, einem Acyloxy, einem Acyloxyalkyl, einem Monoalkylamino, einem Dialkylamino, einem Acylamino, einem Ureid, einem Thioureid, einem Carboxy, einem Carboxyalkyl, einem Cyano, einem Cyanoalkyl, C-Formyl, C-Acyl, einem Dialkoxyalkyl und SO_nR₁, wobei N eine ganze Zahl zwischen 0 und 3 ist und R₁ Wasserstoff, ein C₁-C₆-Alkyl, ein substituiertes C₁-C₄-Alkyl oder ein unsubstituiertes Aryl ist.
Einsträngiges Oligodeoxyribonukleotid nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die besagten ein bis fünf Substituenten unabhängig voneinander substituiert oder unsubstituiert sind.
Einsträngiges Oligodeoxyribonukleotid nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass das besagte Halogenalkyl ein geradkettiges C₂-C₆-Alkyl oder ein verzweigtes C₃-C₆-Alkyl ist, die mit einem bis drei Halogengruppen substituiert sind, das besagte Alkyl ein geradkettiges C₂-C₆-Alkyl oder ein verzweigtes C₃-C₆-Alkyl ist, das besagte Aryl mit einem geradkettigen C₁-C₈-Alkyl oder einem verzweigten C₃-C₈-Alkyl substituiert ist, das besagte polycyclische aromatische Alkyl zwischen zwei bis vier aromatische Ringe und ein geradkettiges C₁-C₆-Alkyl oder ein verzweigtes C₃-C₆-Alkyl enthält, das besagte Cycloalkyl ein C₃-C₈-Cycloalkyl ist, das besagte Alkenyl ein geradkettiges C₂-C₆-Alkenyl oder ein verzweigtes C₄-C₆-Alkenyl ist, das besagte Alkinyl ein ge radkettiges C₂-C₆-Alkinyl oder ein verzweigtes C₄-C₆-Alkinyl ist, das besagte Hydroxyalkyl ein geradkettiges C₁-C₆-Hydroxyalkyl oder ein verzweigtes C₃-C₆-Hydroxyalkyl ist, das besagte Alkoxy ein geradkettiges C₁-C₈-Alkoxy oder ein verzweigtes C₃-C₈-Alkoxy ist, das besagte Alkoxyalkyl ein C₂-C₈-Alkoxyalkyl ist, das besagte Acyloxyalkyl ein geradkettiges C₁-C₆-Alkyl oder ein verzweigtes C₃-C₆-Alkyl enthält, das besagte Monoalkylamino und das besagte Dialkylamino ein geradkettiges C₁-C₆-Alkyl oder ein verzweigtes C₂-C₆-Alkyl enthält, das besagte Carboxyalkyl ein geradkettiges C₁-C₆-Alkyl oder ein verzweigtes C₃-C₆-Alkyl enthält, das besagte Cyanoalkyl ein geradkettiges C₁-C₆-Alkyl oder ein verzweigtes C₃-C₆-Alkyl enthält und das besagte Dialkoxyalkyl ein geradkettiges C₁-C₆-Alkoxy oder ein verzweigtes C₃-C₆-Alkoxy enthält, die gleich oder unterschiedlich sein können und ein geradkettiges C₁-C₆-Alkyl oder ein verzweigtes C₃-C₆-Alkyl sein können.
Einsträngiges Oligodeoxyribonukleotid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass eine mittlere Base ein substituiertes oder ein unsubstituiertes O⁶-Benzylguanin ist.
Einsträngiges Oligodeoxyribonukleotid nach Anspruch 1, in dem wenigstens ein Phosphat modifiziert ist.
Einsträngiges Oligodeoxyribonukleotid nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens ein Phosphat durch ein Methylphosphonat oder ein Phosphorothioat ersetzt ist.
Einsträngiges Oligodeoxyribonukleotid nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens ein Phosphat eine Phosphat-Endgruppe ist.
Einsträngiges Oligodeoxyribonukleotid nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass zwei internukleoside Phosphat-Endgruppen unabhängig voneinander ersetzt sind.
Einsträngiges Oligodeoxyribonukleotid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es die durch Mutation bedingte humane Alkyltransferase inhibiert, die durch O⁶-Benzylguanin nicht oder weniger inaktiviert wird als mit dem besagten einsträngigen Oligodeoxyribonukleotid.
Einsträngiges Oligodeoxyribonukleotid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Oligodeoxyribonukleotid ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus 5'-d(GAb⁶GCT)-3', 5'-d (TGAb⁶GCTG)-3', 5'-d (GTGAb⁶GCTGT)-3' und 5'-d (TGTGAb⁶GCTGTG)-3', wobei b⁶G ein substituiertes oder unsubstituiertes O⁶-Benzylguanin ist.
Einsträngiges Oligodeoxyribonukleotid, das die humane Alkyltransferase inaktiviert, enthaltend die Sequenz 5'-dGAb⁶GCT-3', wobei b⁶G ein substituiertes oder unsubstituiertes O⁶-Benzylguanin ist.
Einsträngiges Oligodeoxyribonukleotid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens eine der fünf bis elf Basen, die nicht das substituierte oder unsubstituierte O⁶-Benzylguanin ist, substituiert ist.
Einsträngiges Oligodeoxyribonukleotid nach Anspruch 1, enthaltend mindestens eine modifizierte internukleoside Phosphat-Bindung.
Einsträngiges Oligodeoxyribonukleotid nach Anspruch 17, enthaltend zwei oder mehr internukleoside Phosphat-Bindungen.
Einsträngiges Oligodeoxyribonukleotid nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass die modifizierte internukleoside Phosphat-Bindung eine modifizierte internukleoside Phosphat-Endgruppen-Bindung ist.
Einsträngiges Oligodeoxyribonukleotid nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass die besagte modifizierte internukleoside Phosphat-Endgruppen-Bindung ein Methylphosphonat oder ein Phosphorothioat ist.
Einsträngiges Oligodeoxyribonukleotid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es eine Vielzahl von substituierten oder unsubstituierten O⁶-Benzylguanin-Basen einschließt.
Einsträngiges Oligodeoxyribonukleotid nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, dass es mindestens drei substituierte oder unsubstituierte O⁶-Benzylguanin-Basen einschließt.
Einsträngiges Oligodeoxyribonukleotid nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, dass es wenigstens vier substituierte oder unsubstituierte O⁶-Benzylguanin-Basen einschließt.
Einsträngiges Oligodeoxyribonukleotid nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, dass es min destens fünf substituierte oder unsubstituierte O⁶-Benzylguanin-Basen einschließt.
Einsträngiges Oligodeoxyribonukleotid nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass es eine Vielzahl von substituierten oder unsubstituierten O⁶-Benzylguanin-Basen einschließt.
Einsträngiges Oligodeoxyribonukleotid nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, dass es mindestens drei substituierte oder unsubstituierte O⁶-Benzylguanin-Basen einschließt.
Einsträngiges Oligodeoxyribonukleotid nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, dass es mindestens vier substituierte oder unsubstituierte O⁶-Benzylguanin-Basen einschließt.
Einsträngiges Oligodeoxyribonukleotid nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, dass es mindestens fünf substituierte oder unsubstituierte O⁶-Benzylguanin-Basen einschließt.
Zusammensetzung enthaltend ein einsträngiges Oligodeoxyribonukleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 28 und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger.
Verfahren zur Steigerung der Wirkung eines alkylierenden Anti-Krebsmittels, das die O⁶-Position von Guanin-Resten in DNA alkyliert, in der chemotherapeutischen Behandlung von Krebszellen in vitro, wobei das Verfahren die zusätzliche Verabreichung eines alkylierenden Anti-Krebsmittels und eines einsträngigen Oligodeoxyribonukleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 28 gegenüber den Krebszellen umfasst.
Oligodeoxyribonukleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 28 oder einer Zusammensetzung nach Anspruch 29 zur Verwendung als Arzneimittel.
Oligodeoxyribonukleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 28 oder eine Zusammensetzung nach Anspruch 29 zur Verwendung in der Therapie.
Oligodeoxyribonukleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 28 oder eine Zusammensetzung nach Anspruch 29 zur Verwendung in der Behandlung von Tumoren oder Krebs.
Oligodeoxyribonukleotid oder Zusammensetzung nach Anspruch 33 zur Verwendung bei der Behandlung von Krebs durch gleichzeitige Verabreichung eines alkylierenden Anti-Krebsmittels, das die O⁶-Position des Guanin-Rests in DNA alkyliert.
Verwendung eines Oligodeoxyribonukleotids nach einem der Ansprüche 1 bis 28 oder Zusammensetzung nach Anspruch 29 für die Herstellung eines Arzneimittels für die Behandlung eines Tumors oder Krebs.