DE69529680T2 - 2',5'-phosphorthioat/phosphodiester-oligoadenylate und ihre antiviralen verwendungen - Google Patents

2',5'-phosphorthioat/phosphodiester-oligoadenylate und ihre antiviralen verwendungen

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Description

    Technisches Gebiet der Erfindung
  • Die Erfindung betrifft synthetische Analoga von natürlich vorkommenden antiviralen 2',5'-Oligoadenylaten zur Verwendung in der Medizin, worin mindestens eine der internukleotidischen Phosphodiesterbindungen durch optisch aktive Phosphorthioatgruppen ersetzt ist.
    • Technischer Hintergrund der Erfindung
  • Die vollständige Nomenklatur des Gegenstands der vorliegenden Erfindung umfaßt extrem lange Fachausdrücke. Es ist für den Fachmann üblich, die Oligoadenylatanaloga und die verwandten Ausdrücke in einer wohlbekannten Art abzukürzen. Diese allgemeinen und üblichen Abkürzungen sind im Folgenden dargelegt und können im Text dieser Beschreibung benutzt werden.
    • Abkürzungen:
  • 2-5A, 2',5'-Oligoadenylat oder p&sub3;An: Oligomer der Adenylsäure mit 2',5'-Phosphodiesterbindungen und einem Triphosphat am 5'-Ende.
  • A&sub2;, A&sub3; und A&sub4;: Dimer, Trimer und Tetramer der Adenylsäure mit 2',5'-Phosphodiesterbindungen.
  • pA&sub3;, ppA&sub3; (oder p&sub2;A&sub3;), pppA&sub3; (oder p&sub3;A&sub3;): 5'-terminale Mono--, Di- und Triphosphate des A&sub3;.
  • pA&sub4;, ppA&sub4; (or paA&sub4;), pppA&sub4; (or p&sub3;A&sub4;): 5'-terminale Mono-, Di- und Triphosphate von A&sub4;.
  • ApA: Dimer der Adenylsäure mit 2'-5'-Phosphodiesterbindung.
  • Ap·A: Dimer der Adenylsäure mit 2'-5'-Phosphorthioatbindung.
  • PR: Die R-Stereokonfiguration an einem chiralen Phosphoratom in einer Internukleotid-Phosphorthioatbindung.
  • PS: Die S-Stereokonfiguration an einem chiralen Phosphoratom in einer Internukleotid-Phosphorthioatbindung.
  • ARp·ApA: (PR)-P-Thioadenylyl-(2',5')-adenylyl-(2',5')- adenosin.
  • ASp·ApA: (PS)-P-Thioadenylyl-(2',5')-adenylyl-(2',5')- adenosin.
  • ApARp·A: Adenylyl-(2',5')-(PR)-P-thioadenylyl-(2',5')- adenosin.
  • ApASp·A: Adenylyl-(2',5')-(PS)-P-thioadenylyl-(2',5')- adenosin.
  • pARp·ApA, ppARp·ApA, pppARp·ApA, pASp·ApA, ppASp·ApA, pppASp·ApA, pApARp·A, ppApARpA, pppApARp·A, pApASp·A, ppApASp·A, pppApASp·A: 5'-Mono-, Di- und Triphosphate von ARp·ApA, ASp·ApA, ApARp·A, und ApASp·A.
  • ARp·ApApA: (PR)-P-Thioadenylyl-(2',5')-adenylyl-(2',5')- adenylyl-(2',5')-adenosin.
  • ASp·ApApA: (PS)-P-Thioadenylyl-(2',5')-adenylyl-(2',5')- adenylyl-(2',5')-adenosin.
  • ApARp·ApA: Adenylyl-(2',5')-(PR)-P-thioadenylyl-(2',5')- adenylyl-(2',5')-adenosin.
  • ApASp·ApA: Adenylyl-(2',5')-(PS)-P-thioadenylyl-(2',5')- adenylyl-(2',5')-adenosin.
  • ApApARp·A: Adenylyl-(2',5')-(PR)-P-thioadenylyl-(2',5')- adenylyl-(2',5')-adenosin.
  • ApApASp·A: Adenylyl-(2',5')-adenylyl-(2',5')-(PS)-P- thioadenylyl-(2',5')-adenosin.
  • pARp·ApApA, ppARp·ApApA, pppARp·ApApA, pASp·ApApA, ppASp·ApApA, pppASp·ApApA, pApARp·ApA, ppApARp·ApA, pppApARp·ApA, pApASp·ApA, ppApASp·ApA, pppApASp·ApA, pApApARp·A, ppApApARp·A, pppApApARp·A, pApApASp·A, ppApApASp·A, pppApApASp·A: 5'-Mono-, Di- und Triphosphate der obengenannten Tetramere.
  • bz: Benzoyl
  • ce: Cyanethyl
  • CFS: Chronisches Erschöpfungssyndrom
  • DEAE: 2-(Diethylamino)ethyl
  • DBU: 1,8-Diazabicyclo[5.3.0]undec-7-en
  • HIV: Humanes Immundefizienzvirus
  • MeOTr: Monomethoxytrityl
  • M.O.I: Infektionsdosis (infektiöse Einheiten je Zelle)
  • mRNA: Boten-RNS
  • npe: 2-(4-Nitrophenyl)ethyl
  • PBL: Lymphozyten im peripheren Blut
  • pCp: Cytidin-3'-5'-bisphosphat
  • (PS)-ATP-alpha-S: Adenosin-5'O-(PS)-(1-thiotriphosphat).
  • RNase L: 2-5A-abhängige Endoribonuklease.
  • rmA: Ribosomale RNS
  • RT: Reverse Transkriptase
  • SCP: Spezifische Spaltprodukte
  • tbds: t-Butyldimethylsilyl
  • Tris: Trishydroxymethylaminomethan
  • tRNA: Transfer-RNS
  • Es wird allgemein angenommen, daß die Aktivierung der RNase L durch 2-5A der Schlüssel des antiviralen Abwehrmechanismus ist. Interferon induziert die Transkription des Enzyms 2-5A- Synthetase, die nach Aktivierung der doppelsträngigen RNS 2',5'-verknüpfte Oligoadenylate erzeugt. Bisher ist die Aktivierung der RNase L der einzige bekannte Effekt des 2-5A. Dieses Enzym hydrolysiert mRNS und rRNS und führt so zur Inhibierung der Proteinsynthese. Wenn 2-5A nicht fortwährend synthetisiert wird, ist die Aktivierung der RNAse L nur vorübergehend, weil 2-5A rasch abgebaut wird. Daher spielt die Aktivierung der RNase L eine entscheidende Rolle bei der Inhibierung der Replikation und somit bei der Abwehr einer Virusinfektion.
  • Auch zwischen dem 2-5A-Stoffwechsel und dem Wachstumszyklus des HIV-1 wurde ein Zusammenhang festgestellt, d. h. hohe Gehalte von 2-5A und aktivierter RNase L korrelieren mit Ausbleiben der Freisetzung von HIV-1 durch infizierte Zellen, Schröder et al., J. Biol. Chem. 264, 5669-5673 (1989). Wenn umgekehrt der 2-5A-Vorrat in der Zelle abnimmt, kann die RNase nicht aktiviert werden und die Erzeugung von HIV-1 nimmt zu. Mit Berichten darüber, daß 2-5A-Trimer- und -Tetramerkerne, 5'-Monophosphate und 5'-Triphosphate die Bildung des Komplexes aus reverser Transkriptase des HIV-1 und Primer inhibieren, wurde eine Mitwirkung von 2-5A-Kernen als Inhibitoren der HIV-1-Replikation festgestellt, Montefiori et al., Proc. Natl. Acad. Bei. USA 86, 7191-7194 (1989); Müller et al., Biochemistry 30, 2027-2033 (1991); Sobol et al., Biochemistry 32, 1211-1218 (1993).
  • Die Einführung der Phosphorthioatgruppe in die Internukleotidbindungen des 2-5A erzeugt eine größere metabolische Stabilität als beim authentischen 2-5A und führte zu den ersten 2-5A-Kernen (d. h. 2-5A ohne 5'-Phosphatanteile), die RNase aktivieren können (Kariko et al., Biochemistry 26, 7136- 7142 (1987); Charachon et al., Biochemistry 29, 2550-2556 (1990)). Desweiteren ist RNase L ein funktionell stereoselektives Enzym und 2-5A-Trimere und -Tetramere mit mindestens einer der internukleotidischen 2',5'-Phosphorthioatbindungen in PS-Konfiguration besitzen eine stark erhöhte metabolische Stabilität. Die chemische Synthese der vollständig freigesetzten Trimer- und Tetramerkerne des 2',5'- Phosphorthioatadenylats wurde mitgeteilt, Suhadolnik et al., US-Patent 4,924,624. Wegen der Stereospezifität der 2-5A- Synthetase für das Substrat (PS)-ATP-alpha-S, das ausschließlich Trimer- und Tetramerprodukte der PR- Konfiguration ergibt, ist die Herstellung der Stereoisomere durch enzymatische Synthese nicht möglich. Obwohl desweiteren Lebleu et al., US-Patent 4,981,957, die enzymatische Synthese eines mit Phosphorthioat substituierten Derivats des 2',5'-Oligoadenylats offenbaren, sind die offenbarten Verbindungen nicht stereospezifisch.
    • Zusammenfassung der Erfindung
  • Zur Inhibierung der viralen Infektion bei Säugetieren brauchbare erfindungsgemäße Verbindungen haben eine erhöhte metabolische Stabilität und/oder antivirale Aktivität.
  • Die Verbindungen und deren wasserlösliche Salze haben die Formel
  • wobei m 0, 1, 2 oder 3 ist; n und q sind ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus 0 und 1, vorausgesetzt, daß n und q nicht beide 0 sind; und wobei R, R&sub1; und R&sub2; unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Sauerstoff und Schwefel, vorausgesetzt, daß nicht sämtliche R, R&sub1; und R&sub2; Sauerstoff sind, und des Weiteren vorausgesetzt, daß nicht sämtliche R, R&sub1; und R&sub2; Schwefel sind.
  • Die Erfindung umfaßt auch ein Verfahren zur Inhibierung der viralen Infektion bei Säugetieren durch Verabreichung einer antiviral wirksamen Menge einer Verbindung der oben genannten Formel oder eines wasserlöslichen Salzes davon, und antivirale Zusammensetzungen, die solche Verbindungen mit einem Träger enthalten.
  • Verbindungen der Formel, in denen n 1 und q 1 ist können zur Bildung von Konjugaten mit dem makromolekularen Träger Poly(L-Lysin) für den intrazellulären Transport verwendet werden. Solche Konjugate von Poly(L-Lysin) und 2',5'- Phosphorthioat/Phosphodiester-Oligoadenylat haben die Formel
  • worin q eine ganze Zahl von etwa 60 bis etwa 70 und R zufällig ausgewählt R' oder
  • ist. Etwa 5 bis etwa 10 der Gruppen R umfassen R'. R' hat die folgende Formel, wobei m 0, 1, 2 oder 3 ist; und wobei R&sub3;, R&sub4; und R&sub5; unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Sauerstoff und Schwefel, vorausgesetzt, dass nicht sämtliche R&sub3;, R&sub4; und R&sub5; Sauerstoff sind, und des Weiteren vorausgesetzt, dass nicht sämtliche R&sub3;, R&sub4; und R&sub5; Schwefel sind.
  • Bevorzugt hat mindestens eine der internukleotidischen Phosphorthioatgruppen
  • des Konjugats aus Poly(L-Lysin) und 2',5'- Phosphorthioat/Phosphodiester-Oligoadenylat die PR- Konfiguration.
    • Beschreibung der Figuren
  • Fig. 1A stellt die Ergebnisse eines Radiobindungstests dar, welche die Fähigkeit von 2',5'-Phosphorthioat/Phosphodiester-Oligoadenylatkern-2-5A-Derivaten zur Aktivierung teilhydrolysierter RNase L aus L929-Zellextrakten zur Hydrolyse des Substrats Poly(U) [³²P]pCp, jedoch nicht des Poly (C), anzeigen. Die Aktivierung der RNase L wurde bestimmt durch Umwandlung von Poly(I) [³²P]pCp in wasserlösliche Fragmente bestimmt. 100% bedeuten 25 000 dpm (417 Bq) Poly(U) [³²P]pCp, gebunden an Glasfaserfilter. Zum Vergleich ist 2- 5A-Oligomer (internukleotidische Phosphodiesterbindung) beigefügt. Die Kurven sind wie folgt bezeichnet: p&sub3;A&sub3; ( ); A&sub3; ( ); ARp·ApA ( ); ASp·ApA ( ); ApASp·A ( ) und ApASp·A ( ).
  • Fig. 1B stellt die Ergebnisse eines nach dem Verfahren von Fig. 1A durchgeführten Radiobindungstests für 2-5A-Derivate mit 2',5'-Phosphorthioat/Phosphodiestertrimer-5'- monophosphat dar. Die Kurven sind wie folgt bezeichnet: P&sub3;A&sub3; ( ); pA&sub3; ( ); pARp·ApA ( ); pASp·ApA ( ); pApARp·A ( ) und pApASp·A ( ).
  • Fig. 1C stellt die Ergebnisse eines nach dem Verfahren von Fig. 1A durchgeführten Radiobindungstests für 2-5A-Derivate mit 2',5'-Phosphorthioat/Phosphodiestertetramerkern dar. Die Kurven sind wie folgt bezeichnet: p3A4 ( ); ARp·ApApA ( ); ASp·ApApA ( ); ApARp·ApA ( ); ApASp·ApA ( ); ApApARp·A ( ) und ApApASp·A ( ).
  • Fig. 1D stellt die Ergebnisse eines nach dem Verfahren von Fig. 1A durchgeführten Radiobindungstests für 2-5A-Derivate mit 2',5'-Phosphorthioat/Phosphodiestertetramer-5'- monophosphat dar. Die Kurven sind wie folgt bezeichnet: p&sub3;A&sub4; ( ); pA4 ( ); pARp·ApApA ( ); pASp·ApApA ( ); pApARp·ApA ( ); pApASp·ApA ( ); pApApARp·A ( ) und pApApASp·A ( ).
  • Fig. 2A stellt die Ergebnisse eines Spaltungstests mit ribosomaler RNS mit 2-5A-Derivaten mit 2',5'-Phosphorthioat/Phosphodiestertrimerkern dar. Der Prozeß wurde nach dem Verfahren von Kariko et al., Biochemistry 26, 7127-7135 (1087), durchgeführt. Zum Vergleich ist auch das 2-5A- Oligomer (internukleotidische Phosphodiesterbindung) eingeschlossen. L929-Zellextrakte wurden in Abwesenheit (Streifen 1) oder Anwesenheit von 10&supmin;&sup8; mol/l p&sub3;A&sub3; (Streifen 2), 10&supmin;&sup6; mol/l ARp·ApA (Streifen 3), 10&supmin;&sup6; mol/l ASp·ApA (Streifen 4) 10&supmin;&sup6; mol/l ApARp·A (Streifen 5), 10&supmin;&sup6; mol/l ApASp·A (Streifen 6) oder 10&supmin;&sup6; mol/l A&sub3; (Streifen 7) inkubiert. Gezeigt sind die Positionen der rRNS 28S und 18S; die Pfeile weisen auf die gut charakterisierten spezifischen Spaltprodukte (SCP) der RNase L.
  • Fig. 2B stellt die Ergebnisse eines nach dem Verfahren von Fig. 2A durchgeführten Spaltungstests mit ribosomaler RNS mit 2-5A-Derivaten mit 2',5'-Phosphorthioat/Phosphodiestertrimer-5'-monoester dar. L929-Zellextrakte wurden in Abwesenheit (Streifen 1) oder Anwesenheit von 2 · 10&supmin;&sup9; mol/l p&sub3;A&sub3; (Streifen 2), 10&supmin;&sup6; mol/l pA&sub3; (Streifen 3), 10&supmin;&sup7; mol/l pARp·ApA (Streifen 4), 10&supmin;&sup7; mol/l pASp·ApA (Streifen 5), 2·10&supmin;&sup9; mol/l pApARp·A (Streifen 6) oder 10&supmin;&sup7; mol/l pApASp·A (Streifen 7) inkubiert.
  • Fig. 3A stellt die Ergebnisse eines nach dem Verfahren von Fig. 2A durchgeführten Spaltungstests mit ribosomaler RNS mit 2-5A-Derivaten von 2',5'-Phosphorthioat/Phosphodiestertetramerkernen dar. Zum Vergleich ist auch 2-5A-Oligomer (internukleotidische Phosphodiesterbindung) eingeschlossen. L929-Zellextrakte wurden in Abwesenheit (Streifen 1) oder in Anwesenheit von 10&supmin;&sup8; mol/l p&sub3;A&sub4; (Streifen 2), 10&supmin;&sup5; mol/l A&sub4; (Streifen 3), 10&supmin;&sup5; mol/l ARp·ApApA (Streifen 4), 10&supmin;&sup5; mol/l ASp·ApApA (Streifen 5), 10&supmin;&sup5; mol/l ApARp·ApA (Streifen 6), 10&supmin;&sup5; mol/l ApASp·ApA (Streifen 7), 10&supmin;&sup5; mol/l ApApARp·A (Streifen 8) oder 10&supmin;&sup5; mol/l ApApASp·A (Streifen 9) inkubiert.
  • Fig. 3B stellt die Ergebnisse eines nach dem Verfahren von Fig. 2A durchgeführten Spaltungstests mit ribosomaler RNS mit 2',5'-Phosphorthioat/Phosphodiestertetramer-5'- monophosphatderivaten dar. L929-Zellextrakte wurden in Abwesenheit (Streifen 1) oder in Anwesenheit von 10&supmin;&sup8; mol/l p&sub3;A&sub4; (Streifen 2), 10&supmin;&sup6; mol/l pA&sub4; (Streifen 3), 10&supmin;&sup6; mol/l pARp·ApApA (Streifen 4), 10&supmin;&sup6; mol/l pASp·ApApA (Streifen 5), 10&supmin;&sup8; mol/l pApARp·ApA (Streifen 6), 10&supmin;&sup5; mol/l pApASp·ApA (Streifen 7), 10&supmin;&sup7; mol/l pApApARp·A (Streifen 8) oder 10&supmin;&sup7; mol/l pApApASp·A (Streifen 9) inkubiert.
  • Fig. 4A stellt die Ergebnisse eines nach dem Verfahren von Fig. 2A durchgeführten ribosomalen Spaltungstests dar und zeigt die Inhibierung der RNase L-Aktivierung durch pApASp·A in L929-Zellextrakten und durch teilgereinigte RNase L. L929-Zellextrakte wurden in Anwesenheit von 10&supmin;&sup9; mol/l p&sub3;A&sub3; (Streifen 1 und 2), 10&supmin;&sup8; mol/l p&sub3;A&sub3; (Streifen 3 und 4), 10&supmin;&sup9; mol/l pApRp·A (Streifen 5 und 6), 10&supmin;&sup8; mol/l pApARp·A (Streifen 7 und 8) und 10&supmin;&sup6; mol/l pApASp·A (Streifen 2, 4, 6 und 8) inkubiert.
  • Fig. 4B stellt die Ergebnisse eines Radiobindungstests dar und zeigt die Aktivierung der teilgereinigten RNase L aus L929-Zellextrakten. Die Aktivierung der RNase L wurde durch Umwandlung von Poly(U) [³²P]pCp in säurelösliche Fragmente durch Immobilisierung auf 2-5A&sub4;-Kern-Cellulose bestimmt. 100 % bedeutet 25 000 dpm (417 Bq) von an Glasfaserfilter gebundenem Poly(U) [³²P]pCp. 2-5A-Oligomer (internukleotidische Phosphodiesterbindung) ist ebenfalls zum Vergleich beigefügt. Die Kurven sind wie folgt bezeichnet: pA ( ); p&sub3;A&sub3; + pApASp·A, 10&supmin;&sup6; mol/l, ( ).
  • Fig. 5A stellt die Ergebnisse eines Tests, der nach dem Verfahren von Henderson et al., Virology 182, 186-198 (1991), durchgeführt wurde und zeigt die Inhibierung der durch HIV-1 (IIIB) induzierten Synzytienbildung durch Adenosin, 2-5A-Trimer- oder Tetramerkerne oder 2',5'- Phosphorthioat/Phosphodiester-Trimerderivate: ARp·ApA, ASp·ApA, ApARp·A, ApASp·A, ARp·ApApA, ASp·ApApA, ApARp·ApA, ApASp·ApA, ApApARp·A, ApApASp·A.
  • Fig. 5B ist das Ergebnis eines nach dem Verfahren von Fig. 5A durchgeführten Tests mit den 2',5'-Phosphorthioat/Phosphodiester-Tetramerderivaten des 2-5A-Kerns.
    • Eingehende Beschreibung der Erfindung
  • Die einzelnen Nukleotidbindungen der Trimer- und Tetramerderivate des 2',5'-Oligoadnylats (2-5A) wurden stereochemisch durch chemische Synthese über die Phosphorthioatsubstitution mittels Phosphotriester und Phosphoramidit modifiziert. Der hier beschriebene Weg verwendet voll geschützte monomere Bausteine (Reaktionsschemata 1 und 2, unten), die individuell bearbeitet werden können. Die Schutzgruppen bleiben während der chemischen Synthese der Oligonukleotidkette an ihrem Platz und werden am Schluß der Reaktionsfolge durch β- Eliminierung entfernt.
  • Die Phosphorthioat/Phosphodiestertrimerkerne ARp·ApA 10, ASp·ApA 11, ApARp·A 23 und ApASp·A 24 wurden chemisch synthetisiert und durch Dünnschichtchromatographie an Silicagel getrennt, die Schutzgruppen entfernt und durch Auftragen des Restes auf eine DEAE Sephadex-Säule gereinigt. Die vier Trimerkerne wurden aus den Phophoramidit-Zwischenprodukten 4 und 15 hergestellt. Die Synthese beruht auf der Trennung der vollständig umgewandelten geschützten Zwischenprodukte 8, 9, 21 und 22 mit nachfolgender Entfernung aller Schutzgruppen, wobei sich die einzelnen substituierten 2',5'-Phosphorthioat/Phosphodiester-Adenylattrimerkerne ergeben. Zur Vollständigkeit ist die Herstellung des Dimerkerns 6 mit angegeben, obwohl sie nicht zur Erfindung gehört.
  • Die selektiv substituierten Tetramerkerne 38 und 39, 51 und 52 und 57 und 58 wurden von den voll geschützten Trimerkernen 30 und 31 abgeleitet und nachfolgender Abspaltung des Trityls unterworfen, um die Tetramergruppe zuzufügen.
  • Die erfindungsgemäßen Verbindungen umfassen 2-5A-Derivate, die (i) gegen Nuklease beständig, (ii) nicht toxisch, (iii) fähig zur Aktivierung oder Inaktivierung der RNase L und (iv) fähig zur Inhibierung der HIV-1-Replikation sind. Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind chemisch synthetisierte 2-5A-Derivate von Phosphorthioat/Phosphodiestertrimer und -tetramer, bei denen mindestes eine 2',5'-Phosphodiesterbindung selektiv durch eine 2',5'-Phosphorthioatbindung ersetzt ist. Die chemische Synthese dieser Phosphorthioat/Phosphodiesterderivate nutzt den Weg über Phosphotriester und Phosphoramidit, wobei funktionelle Gruppen durch Schutzgruppen blockiert sind, die einzeln bearbeitet werden können. Die 2-5A-Derivate der Phosphorthioat/Phosphodiestertrimere und -tetramere eröffnen bislang unbekannte Aspekte der stereochemischen Anforderungen für die Aktivierung der RNase L, nämlich, daß die Aktivierung der RNase L eine PR- Chiralität in der zweiten Internukleotidbindung vom 5'-Ende des 2-5A-Moleküls aus erfordert und daß PS-Chiralität in der zweiten Internukleotidbindung zu 2-5A-Derivaten führt, die Antagonisten der RNase-Aktivierung sind. Ohne daß man sich auf irgendeine Theorie festlegen möchte, scheint es, daß PR- Chiralität in der zweiten Internukleotidbindung vom 5'-Ende aus dazu dienen könnte, die Bildung eines produktiven Komplexes zwischen RNase L, dem allosterischen Aktivator (ApARp·A oder ApARp·ApA) und dem RNS-Substrat zu fördern, so daß Hydrolyse der RNS des HIV-1 eintreten kann.
  • Die Phosphorthioatsubstitution einzelner Internukleotidbindungen im 2-5A-Molekül hat ergeben, daß die Inhibierung der HIV-1-Replikation durch Stellung und Stereokonfiguration der chiralen Phosphorthioatgruppe in den Phosphorthioat/Phosphodiesterderivaten beeinflußt wird. Von den vier Phosphorthioat/Phosphodiester-Trimerkernderivaten waren ApARp·A und ApASp·A die wirksamsten Inhibitoren der durch HIV-1 induzierten Synzytiumbildung (Fig. 4A). Von den sechs Phosphorthioat/Phosphodiester-Tetramerkernderivaten waren ApApARp·A und ApApASp·A die wirksamsten Inhibitoren (Fig. 4B). ARp·A, ASp·A, 3',5'-A4, Adenosin und Adenin inhibierten die HIV-1- RT-Aktivität nicht. Während ApARp·A und ApASp·A sowohl beständig gegen Phosphodiesterase sind als auch HIV-1-RT inhibieren, kann das ApARp·A-Enantiomer (jedoch nicht das ApASp·A-Enantiomer) auch RNase L aktivieren.
  • Diesbezüglich scheint es, wobei damit wiederum keine Festlegung auf irgendeine Theorie verbunden sein soll, daß die relativen Unterschiede in der Inhibierung der HIV-1-Replikation durch die Phosphorothiat/Phosphodiestertrimere und -tetramere durch deren Beständigkeit gegen Hydrolyse durch Serum-Phosphodiesterasen erklärt werden kann (siehe Tabelle 1, unten). Im Gegensatz zu 2',5'-Phosphodiesterbindungen in authentischem A&sub2; und A&sub3; die in serumhaltigem Medium in 20 min vollständig hydrolysiert werden, sind sowohl PR- als auch PS-2',5'-Phosphorthioatbindungen stabiler gegen Hydrolyse durch Phosphodiesterasen. Die stereochemisch am 5'-Ende modifizierten Phosphorthioat/Phosphodiester-Tetramerkernderivate (ARp·ApApA und ASp·ApApA) werden vom 2',3'-Ende rasch zu den entsprechenden Dimeren ARp·A und ASp·A hydrolysiert. Obwohl sie gegen weitere Hydrolyse beständig sind, können diese Dimere weder RNase L aktivieren noch die HIV-1- Replikation inhibieren. Die übrigen vier Phosphorthioat/Phosphodiester-Tetramerkernderivate (ApARp·ApA, ApASp·ApA, ApApARp·A und ApApASp·A) werden vom 5'-Ende hydrolysiert und bilden die entsprechenden Trimerkerne ARp·ApA, ASp·ApA, ApARp·A bzw. ApASp·A. Weil ApARp·A und ApASp·A wirksame Inhibitoren der HIV-1-Replikation sind, bedingt diese Hydrolyse höchstwahrscheinlich die antivirale Wirkung der Tetramerderivate ApApARp·A und ApApASp·A. Daher ist die bei ApARp·ApA und ApASp·ApA beobachtete (relativ zu ApApARp·A und ApApASp·A) verminderte Anti-HIV-1-Aktivität wahrscheinlich auf die Hydrolyse vom 5'-Ende unter Bildung von ApARp·A und ApASp·A zurückzuführen, die sehr wirksame Inhibitoren der durch HIV-1 induzierten Synzytiumbildung sind (vgl. Fig. 4A und 4B).
  • In Vorversuchen wurde gezeigt, daß alle erfindungsgemäßen Phosphorathioat/Phosphodiestertrimer- und -tetramer-2-5A- Derivate HIV-1-RT inhibieren. Der Bereich der Inhibierung reichte von 22% bis 70%. ARp·A, ASp·A, 3',5'-A&sub4;, Adenosin und Adenin inhibierten die Aktivität der HIV-1-RT nicht. Während die ApARp·A- und ApASp·A-Enatiomere sowohl beständig gegen Phosphodiesterase sind als auch HIV-1-RT inhibieren, kann das ApARp·A-Enantiomer (jedoch nicht das ApASp·A- Enantiomer) auch RNase aktivieren.
  • Diese drei biologischen Eigenschaften (d. h. Hydrolysebeständigkeit gegen Phosphodiesterasen, Inhibierung der reversen Transkriptase und Aktivierung der RNase L) könnten die mit ApARp·A beobachtete hundertprozentige Inhibierung der HIV-1-Replikation erklären.
  • Die erfindungsgemäßen Verbindungen werden vorteilhaft als lösliche Natrium-, Ammonium- oder Kaliumsalze hergestellt. Der Syntheseplan beginnt mit 6-N-Benzoyl-3'-O-t- butyldimethylsilyl-5'-O-monomethoxytrityladenosin 1, das vorteilhaft nach dem Verfahren von Flockerzi et al., Liebigs Ann. Chem. 1568-1585 (1981) hergestellt wird. Die Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen wird eingehender mit Bezug auf die folgenden, nicht einschränkenden Beispiele veranschaulicht.
  • In den Beispielen benutztes 3-Nitro-1,2,4-triazol und p- Nitrophenylethanol kann vorteilhaft nach veröffentlichten Verfahren hergestellt werden: Chattopadhyaya et al., Nucleic Acids Res. 8, 2039-2053 (1980); Schwarz et al., Tetrahedron Lett., 5513-5516 (1984); Uhlmann et al., Helv. Chim. Acta 64, 1688-1703 (1981). Diese Verbindungen sind in den Vereinigten Staaten auch im Handel erhältlich. 3- Nitro-1,2,4-triazol ist erhältlich von Aldrich Chemical Co., P. O. Box 355, Milwaukee, WI 53201 (Nummer 24,179.2 im Katalog 1986-1987). p-Nitrophenylethanol ist erhältlich von Fluka Chemical Corp. (Katalognummer 73,610).
  • In den Beispielen benutztes Pyridin und Triethylamin wurde durch Destillation über KOH, Tosylchlorid und Calciumhydrid gereinigt. Dichlormethan wurde über Calciumchlorid destilliert und dann durch basisches Aluminiumoxid gegeben. Reines Acetonitril erhielt man durch Destillation über Calciumhydrid.
  • Die Reinigung der geschützten Nukleotide erfolgte durch präparative Säulenchromatographie auf Silicagel 60 (0,063-0,2 mesh, Merck) und präparative Dünnschichtchromatographie auf Silicagel 60 PF254 (Merck). Die Dünnschichtchromatographie ("TLC") wurde auf vorbeschichteten Dünnschichtfolien F 1500 LS 254 und Cellulose-Dünnschichtfolien F 1440 von Schleicher & Schuell durchgeführt.
  • Schema 1 ist das Reaktionsschema für die Herstellung der völlig freigesetzten Trimere mit Phosphorthioatsubstitution der ersten Internukleotidbindung ARp·ApA 10 und ASp·ApA 11 aus den geschützten Zwischenprodukten 8 und 9, wobei "bz" das Benzoylradikal, "tbds" das t-Butylsilylradikal, "ce" das Cyanoethylradikal, "npe" das Nitrophenylethoxyradikal und "MeOTr" das Monomethoxytritylradikal darstellen. Die Herstellung der Trimerkerne 10 und 11 ist in den Synthesen 1 bis 4 und in Beispiel 1 ausgeführt. Die Synthese 4 veranschaulicht den völlig geschützten Trimerkern, während Bei¬ spiel 1 die Entfernung der Schutzgruppen und die chemische Reinigung der völlig getrennten Isomere zeigt.
    • Synthese 1 a. Bis-(diisopropylamino)-(β-cyanoethoxy)-phosphan 3:
  • Die Synthese der Titelverbindung entsprach dem Verfahren von Kraszewski & Norris, Nucleic Acids Research Symp. Ser. 18, 177-80 (1987). β-Cyanoethanol (7 g, 0,1 mol) in absolutem CH&sub3;CN (40 ml) wurde tropfenweise innerhalb von 30 min zu einer Lösung von frisch destilliertem PCl&sub3; (40 ml, 0,4 mol) bei Raumtemperatur ("RT") unter Stickstoffatmosphäre zugegeben. Nach 3,5 h Rühren wurden Lösungsmittel und PCl&sub3;-Überschuß im Hochvakuum entfernt, der Rückstand in 450 ml absolutem Ether gelöst und bei -10ºC mit N,N-Diisopropylamin (127 ml, 0,9 mol) durch tropfenweise Zugabe innerhalb von 1 h unter Stickstoff umgesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde 30 min bei -10ºC und 15 h bei RT gerührt. Der Niederschlag wurde unter Stickstoff abfiltriert und das Lösungsmittel im Vakuum entfernt. Das gelbe Rohprodukt wurde über CaH&sub2; fraktioniert destilliert und ergab 14,7 g (49%) reines 3 mit einem Siedepunkt von 114-118ºC. Dieses Reagens wurde bei -20ºC unter Stickstoff aufbewahrt. ¹H-NMR (CDCl&sub3;): 3,75 (s, 2H, CH&sub2;); 3,52 (m, 4H, 4 N-CH); 2,60 (t, 2H, β-CH&sub2;); 1,17 + 1,14 (2d, 24H, 4 N-C(CH&sub3;)&sub2;). ³¹P-NMR (CDCl&sub3;): 124,6 ppm.
    • b. 6-N-Benzoyl-3'-O-[(t-butyl)dimethylsilyl]-5'-O-(monomethoxytrityl)-adenosin-2'-O-[(β-cyanoethyl)-N,N-diisopropylamino]-phosphoramidit 4
  • VERFAHREN A: Die Synthese der Titelverbindung entsprach den Verfahren von Sinha et al., Nucleic Acids Res. 12, 4539 - 4557 (1984); Flockerzie et al. (1981), a. a. O., wobei Verbindung 1 (3,79 g, 5 mmol) und Diisopropylethylamin (3,5 ml) in trockenem CH&sub2;Cl&sub2; (20 ml) gelöst und Chlor-N,N-diisopropylaminocyanoethoxyphosphan (2,37 g, 10 mmol) zugesetzt wurden. Nach 1,5 h Rühren unter Stickstoff bei RT wurde das Reaktionsgemisch mit EtOAc (100 ml) verdünnt und die organische Phase mit gesättigter NaHCOs/NaCl-Lösung (2 · 80 ml) gewaschen. Die organische Schicht wurde über NaSO&sub4; getrocknet, filtriert und zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wurde in CH&sub2;Cl&sub2; (10 ml) gelöst und tropfenweise zu n-Hexan bei -60 ºC zugesetzt. Das Produkt wurde abgetrennt und 8 h im Hochvakuum zur Trockne eingedampft. Man erhielt 4,3 g (89%) eines farblosen amorphen Feststoffs.
  • VERFAHREN B: Als Alternative wurde die Titelverbindung nach dem Verfahren von Kraszewski und Norris (1987), a. a. O., hergestellt. Bei diesem Verfahren wurden die Verbindung 1 (3,79 g, 5 mmol) und Tetrazol (0,175 g, 2,5 mmol) in trockenem CH&sub2;Cl&sub2; (20 ml) gelöst und dann Bis-(diisopropylamino)-(β- cyanoethoxy)-phosphan 3 (3 g, 10 mmol) zugesetzt. Nach 17 h Rühren unter Argon bei RT wurde das Reaktionsgemisch mit EtOAc (100 ml) extrahiert und mit gesättigter NaHCO&sub3;/NaCl- Lösung (80 ml) gewaschen. Dies wurde zweimal wiederholt und die Aufarbeitung analog zu Verfahren A durchgeführt. Man erhielt 4,49 g (94%) eines farblosen amorphen Pulvers. Analyse berechnet für C&sub5;&sub2;H&sub6;&sub4;N&sub7;O&sub7;PSi · 2 H&sub2;O (994,2): C 62,82, H 6,89, N 9,86. Gefunden: C 62,52, H 7,08, N 10,35. UV (MeOH): λmax (log ε) 279 nm (4,33); 229 nm (4,43). Rf auf Silicagel mit Toluol/EtOAc (1/1, v/v): 0,64, 0,61 (Diastereomere). ³¹P- NMR (CDCl&sub3;): 150,98, 151,34.
    • Synthese 2 6-N-Benzoyl-3'-O-[(t-butyl)dimethylsilyl]-5'-O- (monomethoxytrityl)adenylyl-2'-[OP-(2-cyanoethyl)-5'-]-6-N- benzoyl-2',3'-di-O-[(t-butyl)dimethylsilyl]adenosin 6:
  • Das Phosphoramidit 4 (2,88 g, 3 mmol) und 6-N-Benzoyl-2',3'- di-O-[(t-butyl)dimethylsilyl]adenosin 5, Flockerzie et al., (1981), a. a. O., (1,2 g, 2 mmol) wurden bei RT im Hochvakuum 24 h lang getrocknet und in trockenem CH&sub2;Cl&sub2; (30 ml) gelöst. Tetrazol (0,5 g, 8 mmol) wurde zugesetzt und nach 3 h Rühren bei RT unter Argon wurde tropfenweise eine Lösung von 12 [0,5 g, H&sub2;O/Pyridin/CH&sub2;Cl&sub2; (1/3/1, v/v/v)] zugefügt, bis die braune Farbe nicht mehr verschwand. Das Gemisch wurde 15 min gerührt, dann mit CHCl&sub3; (300 ml) verdünnt. Die organische Phase wurde mit Na&sub2;S&sub2;O&sub3;/NaCl (3 · 80 ml) gesättigt, über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet und zur Trockne eingedampft. Schließlich wurde mit Toluol eingedampft (3 · 20 ml). Das Rohprodukt wurde durch Chromatographie auf einer Silicagel-Säule (15 · 2,5 cm) unter Verwendung von CHCl&sub3; (100 ml), CHCl&sub3;/MeOH (100/0,5, v/v, 1,5 l) und CHCl&sub3;/MeOH (100/1, v/v) zum Eluieren des Produkts gereinigt. Die Produktfraktionen wurden aufgefangen, zur Trockne eingedampft und ergaben 2,33 g (79%) des Dimers 6 in Form eines festen Schaums. Analyse berechnet für C&sub7;&sub5;H&sub9;&sub4;N&sub1;&sub1;O&sub1;&sub3;PSi&sub3; (1490,9): C 60,42, H 6,49, N 10,33. Gefunden: C 60,50, H 6,49, N 10,22. UV (MeOH): λmax (log ε) 278 nm (4,62), 230 nm (4,62). Rf auf Silicagel mit CHCl&sub3;/MeOH (95/5, v/v,) = 0,56. ³²P-NMR (CDCl&sub3;): -0,74 und -1,07 ppm (Diastereomere).
    • Synthese 3 6-N-Benzoyl-3'-O-[(t-butyl)dimethylsilyl]-adanylyl-2'-[OP-(2- cyanoethyl)-5']-6-N-benzoyl-2',3'-O-di-[(t-butyl)dimethylsilyl]-adenosin 7
  • Verbindung 6 (2,22 g, 1,51 mmol) wurde mit 2% p-TsOH in CH&sub2;Cl&sub2;/MeOH (4/1, v/v, 30 ml) bei RT 30 min lang gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde mit CH&sub2;Cl&sub2; (300 ml) verdünnt, mit Phosphatpuffer, pH 7,0, (2 · 100 ml) gewaschen, über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet und zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wurde auf eine Silicagel-Säule (9 · 4,5 cm), gewaschen mit CHCl&sub3; (0,7 l) und CHCl&sub3;/MeOH (100/1, v/v, 300 ml), aufgetragen. Das Produkt wurde mit CHCl&sub3;/MeOH (50/1, v/v, 300 ml, und 100/3, v/v, 300 ml) eluiert. Die vereinigten Fraktionen des Produkts wurden im Hochvakuum zur Trockne eingedampft und ergaben 11,65 g (90%) des 5'-Hydroxydimers 7 als amorphen Feststoff. Analyse berechnet für C&sub5;&sub5;H&sub7;&sub8;N&sub1;&sub1;O&sub1;&sub2;PSi&sub3; · H&sub2;O (1218,5): C 54,21, H 6,62, N 12,64. Gefunden: C 54,53, H 6,58, N 12,62. UV (MeOH): λmax (log ε) 278 nm (4,60), 232 nm (4,42). Rf auf Silicagel mit CHCl&sub3;/MeOH (95/5, v/v,) = 0,36. ³²P-NMR (CDCl&sub3;): -0,77 und -1,30 ppm (Diastereomere).
    • Synthese 4 a. 6-N-Benzoyl-3'-O-[(t-butyl)dimethylsilyl]-5'-O- (monomethoxytrityl)-(PR)-thioadenylyl-2'-[OP-(2-cyanoethyl)- 5']-6-N-benzoyl-3'-O-[(t-butyl)dimethylsilyl]adenylyl-2'-[OP- (2-cyanoethyl)-5']-6-N-benzoyl-2',3'-di-O-[(t- butyl)dimethylsilyl]adenosin ARp·ApA 8 b. 6-N-Benzoyl-3'-O-[(t-butyl)dimethylsilyl]-5'-O- (monomethoxytrityl)-(PS)-thioadenylyl-2'-[Op-(2-cyanoethyl)- 5']-6-N-benzoyl-3'-O-[(t-butyl)dimsthylsilyl]adenylyl-2'-[OP- (2-cyanoethyl)-5']-6-N-benzoyl-2',3'-di-O-[(t- butyl) dimethylsilyl]adenosin ASp·ApA 8
  • Das Phosphoramidit 4 (2,79 g, 2,92 mmol), das 5'-Hydroxydimer 7 (1,94 g, 1,62 mmol) und Tetrazol (0,567 g, 8,1 mmol) wurden in trockenem CH&sub3;CN (8,1 ml) gelöst und bei RT unter Stickstoff gerührt. Nach 3 h wurden S&sub8; (1,66 g, 6,48 mmol) und Pyridin (7,8 ml) zugegeben und 20 h bei RT weitergerührt. Das Reaktionsgemisch wurde dann mit CH&sub2;Cl&sub2; (300 ml) verdünnt, mit gesättigtem NaCl (2 · 200 ml) gewaschen, über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet und zur Trockne eingedampft. Schließlich wurde mit Toluol (3 · 20 ml) eingedampft. Die rohe Mischung der Diastereomeren (ARp·ApA 8 + ASp·ApA 9) wurde in CH&sub2;Cl&sub2; gelöst und auf eine Silicagel-Säule (21 · 3,5 cm) aufgetragen. Die Säule war mit CH&sub2;Cl&sub2; (450 ml) und CH&sub2;Cl&sub2;/MeOH (99/1, v/v, 200 ml) gewaschen und das Produkt wurde mit CH&sub2;Cl&sub2;/MeOH (97/3, v/v, 400 ml) eluiert. Die Produktfraktionen wurden aufgefangen und zur Trockne eingedampft. Man erhielt 3,16 g (93%) eines Isomerengemischs von ARp·ApA 8 und ASp·ApA 9. Die Trennung in die reinen Diastereomeren wurde durch Mitteldruckchromatographie wie oben beschrieben durch Eluieren mit CHCl&sub3;/MeOH (99/1, v/v, 800 ml; 20 ml je Fraktion; Fraktionen 1-40) und nachfolgendes Eluieren mit CHCl&sub3;/MeOH (95/5, v/v, 800 ml; 20 ml je Fraktion; Fraktionen 41-80) erreicht. Das völlig geschützte ARp·ApA-Isomer 8 (0,287 g) wurde in den Fraktionen 21-56 (20 ml-Fraktionen) eluiert. Die Fraktionen 57-61 ergaben das Isomerengemisch (0,07 g) und das völlig geschützte ASp·ApA-Isomer 9 (0,132 g) wurde mit den Fraktionen 62-64 eluiert. Die chromatographische Trennung wurde mit je 0,5 g des Rohgemischs wiederholt und ergab 1,62 g (51%) ARp·ApA 8 und 0,94 g (30%) ASp·ApA 9. Analyse berechnet für ARp·ApA - C&sub1;&sub0;&sub1;H&sub1;&sub2;&sub7;N&sub1;&sub7;O&sub1;&sub9;P&sub2;SSi&sub4; (2089,6): C 58,05, H 6,13, N 11,40. Gefunden: C 58,65, H 6,24, N 11,50. UV (Me-OH): λmax (log ε) 279 nm (4,76), 260 nm (4,56), 236 nm (4,73). Rf auf Silicagel mit CHCl&sub3;/MeOH (97/3, v/v) = 0,35. ³²P-NMR (CDCl&sub3;): 69,35 und -1,10 ppm. Analyse berechnet für ASp·ApA - C&sub1;&sub0;&sub1;H&sub1;&sub2;&sub7;N&sub1;&sub7;O&sub1;&sub9;P&sub2;SSi&sub4; (2089,6): C 58,05, H 6,13, N 11,25. Gefunden: C 57,03, H 6,33, n 11,14. UV (MeOH): λmax (log ε) 279 nm (4,77), 260 nm (4,57), 236 nm (4,73). ³²P-NMR (CDCl&sub3;): 68,33 und -0,84 ppm.
    • Beispiel 1 a. (PR)-P-Thioadanylyl-2'-5'-adenylyl-2'-5'-adenosin ARp·ApA 10; b. (PS)-P-Thioadanylyl-2'-5'-adenylyl-2'-5'-adenosin ASp·ApA 11;
  • Die entsprechenden völlig geschützten Trimere 8 bzw. 9 wurden getrennt von den Schutzgruppen befreit, indem das Trimer (0,06 g, 0,029 mmol) mit 2% p-TsOH in CH&sub2;Cl&sub2;/MeOH (4/1, v/v, 1,2 ml) 1,5 h bei RT gerührt wurde. Das Reaktionsgemisch wurde mit CHCl&sub3; (50 ml) verdünnt, mit H&sub2;O (2 · 25 ml) gewaschen, getrocknet und zur Trockne eingedampft. Das Rohprodukt wurde auf präparativen Silcagelplatten (20 · 20 · 0,2 cm) in CHCl&sub3;/MeOH (8/2, v/v) gereinigt. Die Produktbanden wurden mit CHCl&sub3;/MeOH (4/1, v/v) eluiert, zu einem Schaum eingedampft und ergaben 0,04 g (84%) des ARp·ApA-Isomers 10 und 0,034 g (73%) des ASp·ApA-Isomers 11. Das 5'-Hydroxytrimer (0,034 g, 0,08 mmol) wurde dann mit 0,5 mol/l DBU in Pyridin (5,0 ml) 20 h bei RT gerührt. Die Lösung wurde mit 1 mol/l Essigsäure in trockenem Pyridin (2,5 ml) neutralisiert und zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wurde mit methanolischem Ammoniak (5 ml) behandelt und nach 48 h wurden die Lösungsmittel im Vakuum entfernt. Die Abspaltung der Silylgruppen erfolgte mit 1 mol/l Tetrabutylammoniumfluorid in THF (2 ml). Nach 48 h Rühren wurde das Lösungsmittel im Vakuum entfernt. Der Rückstand wurde in H&sub2;O (10 ml) gelöst und auf eine DEAE-Sephadex A-25-Säule (60 · 1 cm) aufgetragen. Das reine Produkt wurde mit einem linearen Gradienten von 0,14-0,17 mol/l TEAB-Puffer, pH 7,5, eluiert. Nach Eindampfen und einigen Malen Abdampfen mit Wasser wurde das Trimer auf vier Papierblätter (35 · 50 cm) aufgetragen und mit i-PrOH/konz. Ammoniak/H&sub2;O (6/1/3, v/v/v) entwickelt. Die Produktbande wurde ausgeschnitten, mit H&sub2;O eluiert, eingedampft, gefriergetrocknet und ergab 500 O.D.260 nm-Einheiten (79%) des ARp·ApA-Isomers 10 und 410 O.D.260 nm-Einheiten (65 %) des ASp·ApA-Isomers 11. UV: λmax in beiden Fällen war 258 nm in H&sub2;O. ARp·ApA 10: Rf auf Cellulose in i-PrOH/Ammoniak/H&sub2;O (6/1/3, v/v/v) = 0,33. ¹H-NMR (D&sub2;O): 8,20, 8,19, 8,14 (35, 3H, H-C(8)), 7,97 (15, 2H, 2 H-C(2)) und 7,76 (15, 1H, 1 H- C(2)), 6,08, 5,93, 5,82 (3d, 3H, 3 H-C(1')). Retentionszeit bei RP-HPLC war 5,60 min. ASp·ApA 11: Rf auf Cellulose in i- PrOH/Ammoniak/H&sub2;O (6/1/3, v/v/v) = 0,33. ¹H-NMR (D&sub2;O): 8,14, 8,09, 8,02 (35, 3H, H-C(8)), 7,94, 7,89, 7,80 (35, 3H, 2 H- C(2)), 6,03, 5,92, 5,80 (3d, 3H, 3 H-C(1')). Retentionszeit bei RP-HPLC war 6,51 min.
  • Schema 2 ist das Reaktionsschema für die Herstellung des übrigen Paars der Trimerkerne, ApARp·A 23 und ApASp·A 24, aus den geschützten Zwischenprodukten 21 und 22 und ist eingehend beschrieben in den folgenden Synthesen 5 und 6 und Beispiel 2.
    • Synthese 5 a. N,N-Diisopropyltrimethylsilylamin
  • Die Synthese der Titelverbindung erfolgte nach dem Verfahren von Noth und Staudigl, Chem. Ber. 115, 3011-3024 (1982). Methyliodid (37,6 ml, 0,6 mol) in absolutem Ether (50 ml) wurde tropfenweise (über 90 min) zu einer Suspension von 14,6 g (0,6 mol) Magnesium und einigen Kristallen Iod in absolutem Ether (100 ml) zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 30 min gerührt bis alles Magnesium gelöst war. Dann wurde N,N-Diisopropylamin (78 ml, 0,55 mol) innerhalb 10-15 min tropfenweise zugesetzt und 1 h am Rückfluß gekocht. Nach Kühlen auf 0ºC wurde Trimethylsilylchlorid (76 ml, 0,6 mol) zugesetzt und das Reaktionsgemisch wurde wiederum in einem Ölbad unter kräftigem Rühren 20 h auf 80ºC erhitzt. Die überstehende Flüssigkeit wurde dekantiert und der Rückstand mit Ether (4 · 50 ml) extrahiert. Überstehende Flüssigkeit und Etherextrakt wurden vereinigt. Lösungsmittel, überschüssiges Trimethylsilylchlorid und unreagiertes N,N- Diisopropylamin wurden durch Destillation entfernt. Das Produkt wurde dann durch Vakuumdestillation bei einer Ölbadtemperatur von 60ºC isoliert und man erhielt 73 g (80%), Kp&sub1;&sub8; = 36-39ºC. ¹H-NMR (CDCl&sub3;): 0,08 (s, 9H, SiCH&sub3;), 1,04- 1,07 (d, 12 H, N-C-CH&sub3;), 3,2 (m, 2H, N-CH).
    • b. Chlor-N,N-diisopropylamino-2-(4-nitrophenyl)-ethoxyphosphan 14
  • p-Nitrophenylethanol (4,16 g, 25 mmol) wurde portionsweise zu einer Lösung von frisch destilliertem PCl&sub3; (14 ml, 0,16 mol) in absolutem Ether (40 ml) bei -30ºC unter Stickstoff innerhalb 45 min zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 1,5 h bei RT gerührt und Lösungsmittel und überschüssiges PCl&sub3; im Vakuum bei 0ºC entfernt. Der Rückstand wurde mit N,N-- Diisopropyltrimethylsilylamin (Synthese 5a) (4,33 g, 25 mmol) bei 0ºC unter Stickstoff 30 min lang und dann bei RT 20 h lang behandelt. Das entstandene Trimethylsilylchlorid wurde bei RT unter Hochvakuum entfernt und man erhielt ein sirupöses blaßgelbes Produkt (7,1 g, 85%), das beim Lagern bei -20ºC kristallisierte. Dieses Material wurde dann für die nachfolgenden Phosphitylierungsreaktionen benutzt. ¹H-NMR (CDCl&sub3;): 8,1-8,2 (m, 2H, o zu NO&sub2;), 7,39-7,43 (m, 2H, m zu NO&sub2;), 4,04-4,18 (m, 2H, P-O-CH&sub2;), 3,63-3,79 (m, 2H, N- CH), 3,07-3,13 (t, 2H, P-O-C-CH&sub2;), 1,14-1,27 (2d, 12H, N- C-CH&sub3;). ³¹P-NMR (CDCl&sub3;): 181,60 ppm.
    • c. 6-N-Benzoyl-3'-O-[(t-butyl)dimethylsilyl]-5'-O- (monomethoxytrityl)-adenosin-2'-O-[(4-nitrophenyl)ethyl-N,N- diisopropylamino]-phosphoramidit 15
  • VERFAHREN A: Verbindung 1 (3,79 g, 5 mmol) und Diisopropylethylamin (3,5 ml) wurden in trockenem CH&sub2;Cl&sub2; (20 ml) gelöst und dann tropfenweise unter Stickstoff Chlor-N,N- diisopropylamino-2-(4-nitrophenyl)-ethoxyphosphan 14 (2,37 g, 10 mmol) hinzugefügt. Nach 2 h Rühren bei RT wurde das Reaktionsgemisch mit EtOAc (200 ml) verdünnt, die organische Phase mit gesättigter NaHCO&sub3;/NaCl-Lösung (3 · 80 ml) gewaschen, über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet und zur Trockne eingedampft. Das Rohprodukt wurde in Toluol/EtOAc (7/3, v/v) gelöst und auf einer mit EtOAc/NEt&sub3; (95/5, v/v) äquilibrierten Silicagel-Säule (12 · 2 cm) chromatographiert. Die Produktfraktionen wurden mit EtOAc/NEt&sub3; (95/5, v/v) eluiert, aufgefangen und zur Trockne eingedampft. Man erhielt 15 (5,28 g, 79%) als farblosen festen Schaum. Analyse berechnet für C&sub5;&sub7;H&sub6;&sub8;N&sub7;O&sub9;PSi (1054,3): C 64,94, H 6,50, N 9,30. Gefunden: C 64,81, H 6,51, N 9,01. UV (MeOH): λmax (log ε) 277 nm (4,50), 229 nm (4,48). ³¹P-NMR (CDCl&sub3;): 150,27, 150,01 ppm. Rf auf Silicagel in Toluol/EtOAc (1/1, v/v): 0,62 und 0,68 (Diastereomere).
  • VERFAHREN B: Alternativ wurde die Verbindung 15 unter Verwendung von Bis-(diisopropylamino)-[2-(4-nitrophenyl)ethoxy]-phosphan 27, s. u., synthetisiert. Zu einer Lösung von 1,52 g (2 mmol) der Verbindung 1 in absolutem CH&sub3;CN (10 ml) wurden Bis-(diisopropylamino)-[2-(4-nitrophenyl)ethoxy]- phosphan 27 (1,59 g, 4 mmol) und Tetrazol (0,07 g, 1 mmol) unter Stickstoff zugesetzt und das Reaktionsgemisch 17 h bei RT gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde mit EtOAc (120 ml) verdünnt und zweimal mit gesättigter NaHCO&sub3;/NaCl-Lösung (60 ml) gewaschen, über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet und zur Trockne eingedampft. Der rohe feste Schaum wurde auf eine Silicagel- Blitzsäule (20 · 2,5 cm) aufgetragen und mit Toluol/EtOAc (1/1, v/v, 250 ml) chromatographiert. Die Produktfraktion (90 ml) wurde eingedampft und ergab 15 (1,9 g, 90%) als farblosen festen Schaum.
    • d. Bis-(diisopropylamino)-[2-(4-nitrophenyl)ethoxy]-phosphan 27
  • 2-(4-Nitrophenyl)ethanol (8,35 g, 50 mmol) wurde in kleinen Portionen über 30 min zu einer Lösung von destilliertem PCl&sub3; (28 ml, 280 mmol) in absolutem Ether (80 ml) bei -5ºC unter einer Stickstoffatmosphäre zugegeben. Nach 15 min Rühren bei -5ºC und 1,5 h bei RT wurden Lösungsmittel und PCl&sub3;- Überschuß unter Hochvakuum entfernt. Dann wurde der gelbliche Rückstand in 200 ml absolutem Ether gelöst und bei -10 ºC mit N,N-Diisopropylamin (64 ml, 450 mmol) durch tropfenweise Zugabe über 30 min unter Stickstoffatmosphäre umgesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde 15 min bei -10ºC und 16 h bei RT gerührt. Der voluminöse Niederschlag von N,N-Diisopropylaminhydrochlorid wurde unter Stickstoff abfiltriert und das Lösungsmittel im Vakuum entfernt. Das gelbliche sirupöse Produkt (17,6 g, 89%) kristallisierte beim Lagern bei -20ºC und war rein genug für die Verwendung in Phosphitylierungsreaktionen. ¹H-NMR (CDCl&sub3;): 8,10-8,13 (d, 2H, o zu NO&sub2;), 7,36-7,40 (d, 2H, m zu NO&sub2;), 3,75-3,82 (q, 2H, P-O-CH&sub2;), 3,36-3,51 (m, 2H, N-CH), 2,95-3,00 (t, 2H, P-O- C-CH&sub2;), 1,05-1,12 (2d, 12H, N-C-CH&sub3;). ³¹P-NMR (CDCl&sub3;): 123,53 ppm.
    • Synthese 6 a. 6-N-Benzoyl-3'-O-[(t-butyl)dimethylsilyl]-5'-O- (monomethoxytrityl)-adenylyl-2'-[OP-2-(4-nitrophenyl)ethyl- 5']-6-N-benzoyl-3'-O-[(t-butyl)dimethylsilyl]-(PR)-P- thioadenylyl-2'-[OP-2-(4-nitrophenyl)ethyl-5']-6-N-benzoyl- 2',3'-di-O-[(t-butyl)dimethylsilyl]-adenosin ApARp·A 21 b. 6-N-Benzoyl-3'-O-[(t-butyl)dimethylsilyl]-5'-O- (monomethoxytrityl)-adenylyl-2'-[OP-2-(4-nitrophenyl)ethyl- 5']-6-N-benzoyl-3'-O-[(t-butyl)dimethylsilyl]-(PS)-P- thioadenylyl-2'-[OP-2-(4-nitrophenyl)ethyl-5']-6-N-benzoyl- 2',3'-di-O-[(t-butyl)dimethylsilyl]-adenosin ApASp·A 22
  • Triethylammoniumsalz des 6-N-Benzoyl-3'-O-[(t-butyl)dimethylsilyl]-5'-O-(monomethoxytrityl)adenosin-2'-[2-(4- nitrophenyl)ethyl]-phosphats 20 (0,10 g, 0,1 mmol), Charubala et al., Liebigs Ann. Chem. 2392-2406 (1981), und die entsprechenden 5'-Hydroxydimere PR 18 und PS 19 (0,066 g, 0,05 mmol), Charubala und Pfleiderer (1992), s. o., wurden zusammen mit trockenem Pyridin (3 · 5 ml) eingedampft und 2,4,6-Triisopropylbenzolsulfonylchlorid (0,062 g, 0,2 mmol) und 3-Nitro-1,2,4-triazol (0,068 g, 0,6 mmol), Kroger und Mietchen, Z. Chem. 9, 378-379 (1969), Jones et al., Tetrahedron 36, 3075-3085 (1980) wurden zugesetzt. Nach 20 h Rühren bei RT wurde das Reaktionsgemisch mit CHCl&sub3; (100 ml) verdünnt, mit H&sub2;O (2 · 50 ml) gewaschen, getrocknet und eingedampft. Zum Entfernen des Pyridins wurde abschließend mit Toluol (2 · 10 ml) eingedampft. Die rohen Trimere 20 bzw. 21 wurden durch Chromatographie auf einer Silicagel-Säule (15 · 2 cm) gereinigt, wobei zunächst CHCl&sub3; und dann CHCl&sub3;/MeOH (100/1, v/v) als Eluent verwendet wurden. Die Produktfraktion wurde aufgefangen und zu einem festen Schaum eingedampft, der im Hochvakuum getrocknet wurde und 0,08 g (70%) 21 ergab. Analyse berechnet für C&sub1;&sub1;&sub1;H&sub1;&sub3;&sub5;N&sub1;&sub7;O&sub2;&sub3;P&sub2;SSi&sub4; · 2 H&sub2;O (2317,8): C 57,52, H 5,95, N 10,27. Gefunden: C 57,15, H 6,13, N 10,72. UV (MeOH): λmax (log ε) 276 nm (4,87), 227 nm (4,83). Rf auf Silicagel in CH&sub2;Cl&sub2;/EtOAc (1/1) = 0,63. ³¹P-NMR (CDCl&sub3;): 69,88 und -1,0 ppm.
    • Beispiel 2 a. Adenylyl-(2'-5')-(PR)-P-thioadenylyl-(2'-5')-adenosin ApARp·A 23 b. Adenylyl-(2'-5')-(PS)-P-thioadenylyl-(2'-5')-adenosin ApASp·A 24
  • Die völlig geschützten Trimere ApARp·A 21 und ApASp·A 22 wurden getrennt von Schutzgruppen befreit, indem das entsprechende Trimer (0,088 g, 0,037 mmol) mit 2% p-TsOH in CH&sub2;Cl&sub2;/MeOH (4/1, v/v, 0,8 ml) gerührt wurde. Nach 30 min Rühren bei RT wurde das Reaktionsgemisch mit CHCl&sub3; (50 ml) verdünnt und mit H&sub2;O (2 · 25 ml) gewaschen. Die organische Phase wurde über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet und zur Trockne eingedampft. Das Rohprodukt wurde auf einer Silicagel-Säule (5 · 2 cm) gereinigt und das Produkt mit CHCl&sub3;/MeOH (100/1, v/v) eluiert, eingedampft und im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 0,073 g (94%) des 5'-Hydroxytrimers ApARp·A 21 und 0,061 g (84%) des 5'-Hydroxytrimers ApASp·A 22. Das entstandene 5'-Hydroxytrimer (0,04 g, 0,02 mmol) wurde dann mit 10 ml DBU 0,5 mol/l in Pyridin gerührt. Nach 24 h wurde die Lösung mit 1 mol/l Essigsäure in Pyridin (10 ml) neutralisiert und zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wurde mit gesättigtem methanolischem Ammoniak (6 ml) behandelt und nach 48 h Rühren bei RT wurde das Lösungsmittel im Vakuum entfernt und vom Rückstand wurden mit 1 mol/l Bu&sub4;NF in THF (5 ml) über 48 h die Silylgruppen abgespalten. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt, der Rückstand wurde in Wasser (10 ml) gelöst und auf eine DEAE-Sephadex A-25-Säule (60 · 1 cm) aufgetragen. Das Produkt wurde mit einem linearen Gradienten von 0,14-0,17 mol/l TEAB-Puffer, pH 7,5, eluiert. Nach Eindampfen und mehrmals Abdampfen mit Wasser wurde das Trimer auf vier Papierblätter (35 · 50 cm) aufgetragen und mit i-PrOH/konz. Ammoniak/H&sub2;O (6/1/3, v/v/v) entwickelt. Die Produktbande wurde ausgeschnitten, mit Wasser eluiert, eingedampft, gefriergetrocknet und ergab 354 O.D.250 nm-Einheiten (79%) des ApARp·A-Isomers 23 und 410 O.D.250 nm-Einheiten (58 %) des Ap ASp·A-Isomers 24. UV λmax in H&sub2;O war in beiden Fällen 258 nm. ApARp·A 23: Rf auf Cellulose in i-PrOH/Ammoniak/H&sub2;O (6/1/3, v/v/v) = 0,34. ¹H-NMR (D&sub2;O): 8,17, 8,16, 8,09 (35, 3H, H-C(8)), 7,90, 7,78 (25, 3H, 3 · H-C(2)), 6,04, 5,96, 5,80 (3d, 3H, 3 H-C(1')). Die Retentionszeit bei RP-HPLC war 5,98 min. ApASp·A 24: Rf auf Cellulose in i-PrOH/Ammoniak/H&sub2;O (6/1/3, v/v/v) = 0,33. ¹H-NMR (D&sub2;O): 8,17, 8,07, 8,04 (35, 3H, 3 · H-C(8)), 8,01, 7,92, 7,72 (25, 3H, 3 · H-C(2)), 6,04, 5,92, 5,82 (3d, 3H, 3 H-C(1')). Die Retentionszeit bei RP-HPLC war 7,23 min.
  • Mit den Synthesen 7 und 8 beginnt die Synthese der völlig freigesetzten Tetramere ApARp·ApA 38 und ApASp·ApA 39 aus dem entsprechenden Dimer 28 (Schema 1). Das Reaktionsschema fährt fort mit dem Zufügen des Trimeranteils in den Synthesen 9 und 10 (Schema 2).
    • Synthese 7 6-N-Benzoyl-3'-O-[(t-butyl)dimethylsilyl]-5'- (monomethyltrityl)-adenylyl-2'-[Op-2-(4-nitrophenyl)ethyl- 5']-6-N-benzoyl-2',3'-di-O-[(t-butyl)dimethylsilyl]adenosin A(Rp,Sp)·A 28
  • Das Phosphoramidit 15 (1,41 g, 1,34 mmol), 6-N-Benzoyl- 2',3'-di-O-[(t-butyl)dimethylsilyl]-adenosin,5 (0,36 g, 0,93 mmol) und Tetrazol (0,188 g, 2,68 mmol) wurden bei RT unter einer Stickstoffatmosphäre in absolutem CH&sub3;CN (9 ml) gerührt. Nach 4 h wurde eine Lösung von 12 [0,5 g in CH&sub2;Cl&sub2;/H&sub2;O/- Pyridin (1/1/1, v/v/v)] tropfenweise zugefügt, bis die braune Farbe nicht mehr verschwand. Das Gemisch wurde weitere 15 min gerührt und dann mit CH&sub2;Cl&sub2; (3 · 60 ml) und gesättigter Na&sub2;S&sub2;O&sub3;/NaCl-Lösung (2 · 60 ml) extrahiert. Die CH&sub2;Cl&sub2;-Phase wurde aufgefangen, über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet, eingedampft und zur Entfernung des Pyridins mit Toluol (2 · 20 ml) eingedampft. Das rohe Dimer (1,85 g) wurde in CH&sub2;Cl&sub2; gelöst, auf eine Silcagel-Blitzsäule (12 · 2.5 cm) aufgetragen und unter Verwendung von CH&sub2;Cl&sub2;/1 % MeOH (400 ml), 2% MeOH (200 ml) und 3% MeOH (200 ml) zur Elution des Produkts (600 ml) chromatographiert. Diese Fraktion wurde zur Trockne eingedampft und ergab 1,45 g (quantitative Ausbeute) des Dimers 28 als farblosen amorphen Feststoff. Die Identität des isolierten Dimers 28 wurde durch spektralphotometrischen Vergleich mit authentischem Material bewiesen. Das authentische Material wurde nach dem Phosphotriester-Verfahren synthetisiert. Analyse berechnet für ApA 28 = C&sub8;&sub0;H&sub9;&sub8;N&sub1;&sub1;O&sub1;&sub5;PSi&sub3; (1569,0): C 61,24, H 6,30, N 9,82. Gefunden: C 61,24, H 6,24, N 9,65. UV (MeOH): λmax (log ε) 277 nm (4,69), [260 nm (4,54)], [231 nm (4,66)]. Rf auf Silicagel mit CHCl&sub3;/MeOH (49/1, v/v) = 0,37.
    • Synthese 8 6-N-Benzoyl-3'-O-(t-butyl)dimethylsilyl-adenylyl-2'-[OP-2-(4- nitrophenyl)ethyl-5']-6-N-benzoyl-2',3'-di-O-[(t- butyl)dimethylsilyl]adenosin-5'-OH A(Rp,Sp)·A 29
  • Das rohe Dimerengemisch 28 (2,24 g, 1,43 mmol) wurde 30 min bei RT in 2% TsOH in CH&sub2;Cl&sub2;/MeOH (4/1, v/v, 20 ml) gerührt.
  • Das Reaktionsgemisch wurde mit CH&sub2;Cl&sub2; (200 ml) verdünnt, mit H&sub2;O (2 · 80 ml) gewaschen, über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet und zur Trockne eingedampft. Der farblose amorphe Rückstand (2,0 g) wurde auf eine Silcagel-Blitzsäule (21 · 2,5 cm) aufgetragen und mit CH&sub2;Cl&sub2; (200 ml), CH&sub2;Cl&sub2;/2% MeOH (400 ml) chromatographiert und das Produkt mit wurde mit CH&sub2;Cl&sub2;/2% MeOH (500 ml) eluiert. Die Produktfraktion wurde eingedampft, im Hochvakuum getrocknet und ergab 1,2 g (75%, berechnet auf Verbindung 5 über 2 Stufen) des Dimers 29 als amorphen Feststoff. Die Identität des isolierten Dimers 29 wurde durch chromatographischen und spektralphotometrischen Vergleich mit authentischem Material bewiesen. Analyse berechnet für 5'-OH-ApA 29 = C&sub6;&sub0;H&sub8;&sub2;N&sub1;&sub1;O&sub1;&sub4;PSi&sub3; (1296,6): C 55,58, H 6,37, N 11,88. Gefunden: C 55,33, H 6,38, N 11,78. UV (MeOH): λmax (log ε) 278 (4,68), [259 (4,51)], 233 (4,46). Rf auf Silicagel mit Toluol/EtOAc/MeOH (5/4/1) = 0,53. ³¹P-NMR (CDCl&sub3;): -0,36 und -0,73 ppm.
    • Synthese 9 a. 6-N-Benzoyl-3'-O-[(t-butyl)dimethylsilyl]-5'-O- (monomethoxytrityl)-(PR)-P-Thioadenylyl-2'-[Op-2-(4- nitrophenyl)ethyl-5']-6-N-benzoyl-3'-O-[(t- butyl)dimethylsilyl]-adenylyl-2'-[OP-2-(4-nitrophenyl)ethyl- 5'-]-6-N-benzoyl-2',3'-di-O-[(t-butyl)dimethylsilyl]- adenosin ARp·ApA 30 b. 6-N-Benzoyl-3'-O-[(t-butyl)dimethylsilyl]-5'-O- (monomethoxytrityl)-(PS)-P-Thioadenylyl-2'-[OP-2-(4- nitrophenyl)ethyl-5']-6-N-benzoyl-3'-O-[(t- butyl)dimethylsilyl]-adenylyl-2'-[OP-2-(4-nitrophenyl)ethyl- 5'-]-6-N-benzoyl-2',3'-di-O-[(t-butyl)dimethylsilyl]- adenosin ASp·ApA 31
  • Das Phosphoramidit 15 (0,59 g, 0,56 mmol), das 5'-Hydroxy- ApA-dimer 29 (0,52 g, 0,40 mmol) und Tetrazol (0,079 g, 1,12 mmol) wurden in trockenem CH&sub3;CN (4 ml) gelöst und unter einer Stickstoffatmosphäre bei RT gerührt. Nach 3 h wurden wiederum Phosphoramidit 15 (0,464 g, 0,44 mmol) und Tetrazol (0,062 g, 0,88 mmol) zugesetzt und das Gemisch weitere 3 h gerührt. Dann ließ man Oxidation durch S&sub8; (0,257 g, 1 mmol) und Pyridin (2,6 ml) innerhalb 16 h bei RT folgen. Das Reaktionsgemisch wurde mit CH&sub2;Cl&sub2; (200 ml) verdünnt, mit gesättigter NaCl-Lösung (2 · 80 ml) gewaschen, über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet und zur Trockne eingedampft. Zur Entfernung des Pyridins wurde abschließend mit Toluol (3 · 20 ml) abgedampft. Das rohe Diastereomerengemisch A(Rp,Sp)·ApA 30 + 31 wurde in CH&sub2;Cl&sub2; (20 ml) gelöst, auf eine Silicagel-Blitzsäule (11 · 2,5 cm) aufgetragen und mit CH&sub2;Cl&sub2; (400 ml), CH&sub2;Cl&sub2;/0,5% MeOH (200 ml), 1% MeOH (200 ml) chromatographiert und das Produkt mit CH&sub2;Cl&sub2;/1,5% MeOH (200 ml) eluiert. Die Produktfraktion wurde zur Trockne eingedampft und ergab 0,713 g (78 %) des Isomerengemischs 30 + 31. Die Trennung in die reinen Diastereomere wurde durch Auftragen auf präparative Silicagelplatten (40 · 20 · 0,2 cm, 8 Platten) in Toluol/EtOAc (1/1, v/v, 4 Entwicklungen) erreicht. Die Produktbanden der Isomeren wurden getrennt mit CH&sub2;Cl&sub2;/MeOH (4/1, v/v) eluiert und zu festen Schäumen eingedampft, die im Hochvakuum getrocknet wurden und 0,311 g (34%) des voll geschützten ARp·ApA-Isomers 30 sowie 0,245 g (27%) des voll geschützten ASp·ApA-Isomers 3 ergaben. Analyse berechnet für ARp·ApA 30 = C&sub1;&sub1;&sub1;H&sub1;&sub3;&sub5;N&sub1;&sub7;O&sub2;&sub3;P&sub2;SSi&sub4; · H&sub2;O (2299,8): C 57,97, H 6,00, N 10,35. Gefunden: C 57,63, H 6,11, N 10,39. UV (MeOH): λmax (log ε) 278 (4,87), [260 (4,72)], [231 (4,75)]. Rf auf Silicagel mit Toluol/EtOAc (1/1, v/v, 2 Entwicklungen) und Toluol/EtOAc (1/2, v/v, eine Entwicklung) = 0,37. Analyse berechnet für ASp·ApA 21 = C&sub1;&sub1;&sub1;H&sub1;&sub3;&sub5;N&sub1;&sub7;O&sub2;&sub3;P&sub2;SSi&sub4; · 2 H&sub2;O (2317,8): C 57,52, H 6,05, N 10,27. Gefunden: C 57,44, H 6,19, N 10,41. UV (MeOH): λmax (log ε) 277 (4,86), [260 (4,72)], [231 (4,75)].
  • Rf auf Silicagel mit Toluol/EtOAc (1/1, v/v, 2 Entwicklungen) und Toluol/EtOAc (1/2, v/v, eine Entwicklung) = 0,27.
    • Synthese 10 a. 6-N-Benzoyl-3'-O-[(t-butyl)dimethylsilyl]-(PR)-P- thioadenylyl-2'-[OP-2-(4-nitrophenyl)ethyl-5']-6-N-benzoyl- 3'-O-[(t-butyl)dimethylsilyl]-adenylyl-2'-[OP-2-(4- nitrophenyl)ethyl-5']-6-N-benzoyl-2',3'-di-O-[(t- butyl)dimethylsilyl]-adenosin 5'-Hydroxy-ARp·ApA 32. b. 6-N-Benzoyl-3'-O-[(t-butyl)dimethylsilyl]-(PS)-P- thioadenylyl-2'-[OP-2-(4-nitrophenyl) ethyl-5']-6-N-benzoyl- 3'-O-[(t-butyl)dimethylsilyl]-adenylyl-2'-[OP-2- (4- nitrophenyl)ethyl-5']-6-N-benzoyl-2',3'-di-O-[(t- butyl)dimethylsilyl]-adenosin 5'-Hydroxy-ASp·ApA 33.
  • Die entsprechenden voll geschützten Trimere 30 bzw. 31 wurden getrennt durch 75 min Rühren des Trimers (ARp·ApA 30: 0,263 g, 0,115 mmol; ASp·ApA 31: 0,21 g, 0,92 mmol) mit 2% p-TsOH in CH&sub2;Cl&sub2;/MeOH (4/1, v/v, für 30 3,2 ml, für 31 2,6 ml) bei RT von den Tritylgruppen befreit. Das Reaktionsgemisch wurde mit CH&sub2;Cl&sub2; (120 ml) verdünnt, mit H&sub2;O (2 · 40 ml) gewaschen, über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet und zur Trockne eingedampft. Das Rohprodukt wurde auf präparativen Silicagelplatten (40 · 20 · 0,2 cm) in Toluol/EtOAc (3/7, v/v) gereinigt, die Produktbanden wurden mit CH&sub2;Cl&sub2;/MeOH (4/1, v/v) eluiert, zu einem festen Schaum eingedampft und ergaben 0,2 g (86%) des 5'-Hydroxy-ARp·ApA 32 bzw. 0,121 g (66%) des 5'-Hydroxy- ASp·ApA 33. Analyse berechnet für 5'-OH-ARp·ApA 32 = C&sub9;&sub1;H&sub1;&sub1;&sub9;N&sub1;&sub7;O&sub2;&sub2;P&sub2;SSi&sub4; (2009,4): C 54,39, H 5,97, N 11,85. Gefunden: C 54,12, H 6,13, N 11,74. UV (MeOH): λmax (log ε) 278 (4,86), [260 (4,71)], [233 (4,64)]. Rf auf Silicagel mit Toluol/EtOAc (3/7, 2 Entwicklungen) = 0,35 (Diastereomere). ³¹P-NMR: 69,60, 68,91, -0,36 und -0,56 ppm (Diastereomere). Analyse berechnet für 5'-OH-ASp·ApA 33 = C&sub9;&sub1;H&sub1;&sub1;&sub9;N&sub1;&sub7;O&sub2;&sub2;P&sub2;SSi&sub4;
  • (2009,4): C 54,39, H 5,97, N 11,85. Gefunden: C 54,29, H 6,23, N 11,51. UV (MeOH): λmax (log ε) 277 (4,85), [260 (4,71)], [233 (4,63)]. Rf auf Silicagel mit Toluol/EtOAc (3/7, 2 Entwicklungen) = 0,42 (Diastereomere). ³¹P-NMR: 69,28, 69,09, -0,33 und -0,56 ppm (Diastereomere).
  • Schema 3 ist das Reaktionsschema für die Synthese der völlig freigesetzten Tetramere ApARp·ApA 38 und ApASp·ApA 39 aus den geschützten Zwischenprodukte 34 und 35. Die Synthese dieser Verbindungen ist in den Synthesen 11 und 12 und in Beispiel 3 beschrieben.
    • Synthese 11 a. 6-N-Benzoyl-3'-O-[(t-butyl)dimethylsilyl]-5'-O- (monomethoxytrityl)-adenylyl-2'-[Op-2-(4-nitrophenyl)ethyl- 5']-6-N-benzoyl-3'-O-[(t-butyl)dimethylsilyl]-(PR)-P- thioadenylyl-2'-[OP-2-(4-nitrophenyl)ethyl-5']-6-N-benzoyl- 3'-O-[(t-butyl)dimethylsilyl]-adenylyl-2'-[Op-2-(4- nitrophenyl)ethyl-5']-6-N-benzoyl-2',3'-di-O-(t- butyl)dimethylsilyl-adenosin ApARp·ApA 34 b. 6-N-Benzoyl-3'-O-[(t-butyl)dimethylsilyl]-5'-O- (monomethoxytrityl)-adenylyl-2'-[Op-2-(4-nitrophenyl)ethyl- 5']-6-N-benzoyl-3'-O-[(t-butyl)dimethylsilyl]-(PS)-P- thioadenylyl-2'-[OP-2-(4-nitrophenyl)ethyl-5']-6-N-benzoyl- 3'-O-[(t-butyl)dimethylsilyl]-adenylyl-2'-[OP-2-(4- nitrophenyl)ethyl-5']-6-N-benzoyl-2',3'-di-O-(t- butyl)dimethylsilyl-adenosin ApASp·ApA 35
  • Die Kondensationen zu den voll geschützten Tetrameren 34 bzw. 35 wurden getrennt durchgeführt, indem Triethylammonium-6-N-benzoyl-3'-O-[(t-butyl)dimethylsilyl]-5'-O- (monomethoxytrityl)adenosin-2'-[2-(4-nitrophenyl)ethyl]- Phosphat 20 (0,108 g, 0,1 mmol) und das 5'-Hydroxy-PR-Trimer 32 bzw. das PS-Trimer 3 (0,1 g, 0,05 mmol) mit trockenem Pyridin (3 · 2 ml) gemeinsam eingedampft wurde, in trockenem Pyridin (0,5 ml) gelöst wurde, und dann 2,4,6- Triisopropylbenzolsulfonylchlorid (0,061 g, 0,2 mmol) und 3- Nitro-1,2,4-triazol (0,068 g, 0,6 mmol) zugesetzt wurden. Die Lösung wurde bei RT 21 h lang gerührt und dann mit CH&sub2;Cl&sub2; (2 · 20 ml) und H&sub2;O (3 · 20 ml) extrahiert. Die organische Phase wurde aufgefangen, über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet, eingedampft und zur Entfernung von Pyridin mit Toluol (3 · 20 ml) eingedampft. Die rohen Tetramere 34 bzw. 35 wurden getrennt auf präparativen Silicagelplatten (40 · 20 · 0,2 cm) mit Toluol/EtOAc/MeOH (5/4/0,5, v/v/v) gereinigt, die Produktbanden wurden mit CH&sub2;Cl&sub2;/MeOH (4/1, v/v) eluiert und zu festen Schäumen eingedampft, die unter Hochvakuum getrocknet wurden und 0,116 g (78%) ApARp·ApA 34 und 0,12 g (81%) ApASp·ApA 35 ergaben. Analyse berechnet für ApARp·ApA 34 = C&sub1;&sub4;&sub2;H&sub1;&sub7;&sub2;N&sub2;&sub3;O&sub3;&sub2;P&sub3;SSi&sub5; · 2 H&sub2;O (3014,5): C 56,58, H 5,89, N 10,69. Gefunden: C 56,22, H 6,07 N 10,57. UV (MeOH): λmax (log ε) 277 (4,99), [260 (4,85)], [231 (4,85)]. Rf auf Silicagel mit Toluol/EtOAc/MeOH (5 : 4 : 0,5) = 0,63 (Diastereomere). Analyse berechnet für ApASp·ApA 35 = C&sub1;&sub4;&sub2;H&sub1;&sub7;&sub2;N&sub2;&sub3;O&sub3;&sub2;P&sub3;SSi&sub5; · H&sub2;O (2996,5): C 56,92, H 5,85, N 10,75. Gefunden: C 56,40, H 5,89, N 10,61. UV (MeOH): λmax (log ε) 277 (5,01), [260 (4,88)], [232 (4,89)]. Rf auf Silicagel mit Toluol/EtOAc/MeOH (5/4/0,5, v/v/v) = 0,62 (Diastereomere).
    • Synthese 12 a. 6-N-Benzoyl-3'-O-[(t-butyl)dimethylsilyl]-adenylyl-2'-[OP- 2-(4-nitrophenyl)ethyl-5']-6-N-benzoyl-3'-O-[(t- butyl)dimethylsilyl]-(PR)-P-thioadenylyl-2'-[OP-2-(4- nitrophenyl)ethyl-5']-6-N-benzoyl-3'-O-[(t- butyl)dimethylsilyl]-adenylyl-2'-[OP-2-(4-nitrophenyl)ethyl- 5']-6-N-benzoyl-2',3'-di-O-[(t-butyl)dimethylsilyl]-adenosin 5'-OH-ApARp·ApA 36 b. 6-N-Benzoyl-3'-O-[(t-butyl)dimethylsilyl]-adenylyl-2'-[OP- 2-(4-nitrophenyl)ethyl-5']-6-M-benzoyl-3'-O-[(t- butyl)dimethylsilyl]-(PS)-P-thioadenylyl-2'-[OP-2-(4- nitrophenyl)ethyl-5']-6-N-benzoyl-3'-O-[(t- butyl)dimethylsilyl]-adenylyl-2'-[OP-2-(4-nitrophenyl)ethyl- 5']-6-N-benzoyl-2',3'-di-O-[(t-butyl)dimethylsilyl]-adenosin 5'-OH-ApASp·ApA 37
  • Die voll geschützten Tetramere (0,105 g, 0,035 mmol) 34 bzw. 35 wurden getrennt durch Behandlung mit 2% p-TsOH in CH&sub2;Cl&sub2;/MeOH (4/1, v/v, 1,2 ml) über 1 h bei RT von Tritylgruppen betreit. Das Reaktionsgemisch wurde mit CH&sub2;Cl&sub2; (3 · 40 ml) extrahiert und mit H&sub2;O (3 · 30 ml) gewaschen. Die organische Phase wurde aufgefangen, über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet und zur Trockne eingedampft. Der entstandene Rückstand wurde auf präparativen Silicagelplatten (20 · 20 · 0,2 cm) in Toluol/EtOAc/MeOH (5/4/0,5, v/v/v) gereinigt. Die Produktbanden wurden mit CH&sub2;Cl&sub2;/MeOH (4 : 1) eluiert und zu einem festen Schaum eingedampft, der im Hochvakuum getrocknet wurde und 0,064 g (67%) des 5'-OH-ApARp·ApA 36 und 0,057 g (60%) des entsprechenden PS-Tetramers 37 ergab. Analyse berechnet für 5'-OH-ApARp·ApA 36 = C&sub1;&sub2;&sub2;H&sub1;&sub5;&sub6;N&sub2;&sub3;O&sub3;&sub1;P&sub3;SSi&sub5; · H&sub2;O (2724,1): C 53,79, H 5,85, N 11,83. Gefunden: C 53,62, H 5,87 N 11,51. UV (MeOH): λmax (log ε) 277 (5,00), [260 (4,87)], [235 (4,81)]. Rf auf Silicagel mit Toluol/EtOAc/MeOH (5 : 4 : 0,5) = 0,41. Analyse berechnet für 5'-OH-ApASp·ApA 37 = C&sub1;&sub2;&sub2;H&sub1;&sub5;&sub6;N&sub2;&sub3;O&sub3;&sub1;P&sub3;SSi&sub5; · H&sub2;O (2724,1): C 53,79, H 5,85, N 11,83. Gefunden: C 53,58, H 5,97, N 11,32. UV (MeOH): λmax (log ε) 277 (4,96), [260 (4,82)], [234 (4,74)]. Rf auf Silicagel mit Toluol/EtOAc/MeOH (5/4/0,5, v/v/v) = 0,39.
    • Beispiel 3 a. Adenylyl-(2'-5')-(PR)-P-thioadenylyl-(2'-5')-adenylyl- 2(2'-5')-adenosin ApARp·ApA 38 b. Adenylyl-(2'-5')-(PS)-P-thioadenylyl-(2'-5')-adenylyl- 2(2'-5')-adenosin ApASp·ApA 39
  • Die entsprechenden 5'-Hydroxytetramere 36 bzw. 37 wurden getrennt von Schutzgruppen befreit, indem jedes 5'- Hydroxytetramer (0,056 g, 0,021 mmol) mit 0,5 mol/l DBU in absolutem CH&sub3;CN (2,5 ml) bei RT gerührt, nach 22 h die Lösung mit 1 mol/l AcOH in absolutem CH&sub3;CN (1,25 ml) neutralisiert und zur Trockne eingedampft wurde. Die Rückstandsmischung wurde dann mit methanolischem Ammoniak behandelt und nach 60 h Rühren bei RT wurde das Lösungsmittel im Vakuum entfernt und schließlich vom Rückstand die Silylgruppen mit 1 mol/l Bu&sub4;NF in THF (5 ml) über drei Tage abgespalten. Das Lösungsmittel wurde dann entfernt, der Rückstand in H&sub2;O (10 ml) gelöst, auf eine DEAE-Sephadex A25-Säule (30 · 2 cm) aufgetragen und zunächst mit H&sub2;O (200 ml) und dann mit einem linearen Gradienten von 0-0,4 mol/l TEAB-Puffer, pH 7,5, innerhalb von 3000 ml (Flußgeschwindigkeit 2 ml/min) chromatographiert. Unter diesen Bedingungen wurde das ApARp·ApA- Tetramer 38 bei 0,23-0,28 mol/l TEAB-Puffer bzw. das ApASp·ApA-Tetramer 39 bei 0,245-0,305 mol/l TEAB-Puffer eluiert. Die Produktfraktionen wurden aufgefangen, eingedampft und mehrmals mit MeOH eingedampft. Zur weiteren Reinigung wurde Papierchromatographie mit einem System aus i- PrOH/Ammoniak/H&sub2;O (55/10/35, v/v/v) durchgeführt. Die Produktbande wurde ausgeschnitten, mit H&sub2;O eluiert, eingeengt, schließlich gefriergetrocknet und ergab 728 O.D.260 nm- Einheiten (73%) des ApARp·ApA-Isomers 38 bzw. 686 O.D.260 nm- Einheiten (69%) des ApASp·ApA-Isomers 39. ApARp·ApA 38: Rf auf Cellulose in i-PrOH/Ammoniak/H&sub2;O (55 : 10 : 35) = 0,36. UV (H&sub2;O): λmax 257 nm. ¹H-NMR (D&sub2;O): 8,15, 8,07, 8,06, 7,93 (45, 4H, 4 · H-C(8)), 7,92 (s, 2H, 2 · H-C(2)), 6,03, 5,89, 5,86, 5,79 (4d, 4 · C-H(1')). HPLC auf PR-18: A: 50 mmol/l NH&sub4;H&sub2;PO&sub4; (pH 7,24). B: MeOH/H&sub2;O (1/1, v/v); Gradient 0-1 min: 80% A, 20% B, 1-31 min: 30% A, 70% B; Retentionszeit 9,55 min. ApASp·ApA 39: Rf auf Cellulose in i-PrOH/Ammoniak/H&sub2;O (55/10/35, v/v/v) = 0,40. UV (H&sub2;O): λmax 257 nm. HPLC auf PR- 18: A: 50 mmol/l NH&sub4;H&sub2;PO&sub4; (pH 7,24). B: MeOH/H&sub2;O (1/1, v/v); Gradient 0-1 min: 80% A, 20% B, 1-31 min: 30% A, 70% B; Retentionszeit 10,37 min.
  • Schema 4 ist der Beginn des Reaktionsschemas für die Synthese der übrigen Tetramere aus ihren Zwischenprodukten, dem ARp·Ap-Diester 45 und dem ASp·Ap-Diester 46, mit vorhandenen Schutzgruppen. Die Synthese der Diester ist in den Synthesen 13 und 14 geschildert.
    • Synthese 13 a. 6-N-Benzoyl-3'-O-[(t-butyl)dimethylsilyl]-5'-(monomethoxytrityl)-adenylyl-2'-[OP-2-(4-nitrophenyl)ethyl-5']-6-N- benzoyl-3'-O-[(t-butyl)dimethylsilyl]-adenosin-2'-[2,5- dichlorphenyl,2-(4-nitrophenyl)-ethylphosphat] ApAp-Triester 41 und 41a
  • 6-N-Benzoyl-3'-O-[(t-butyl)dimethylsilyl]-adenosin-2'-[2,5- dichlorphenyl,2-(4-nitrophenyl)ethylphosphat] 5'-OH-Ap- Triester 40 (0,43 g, 0,5 mmol) und das Phosphoramidit 15 (0,735 g, 0,7 mmol) wurden in absolutem CH&sub3;CN (5 ml) in Gegenwart von Tetrazol (0,098 g, 1,5 mmol) unter Stickstoff gelöst. Nach 3,5 h Rühren bei RT wurden nochmals Phosphoramidit (0,2 g, 0,19 mmol) und Tetrazol (0,026 g, 0,37 mmol) zugesetzt und das Reaktionsgemisch weitere 30 min gerührt. Eine Lösung von 12 [0,5 g in CH&sub2;Cl&sub2;/H&sub2;O/Pyridin (1/1/3, v/v/v)] wurde tropfenweise zugegeben, bis die braune Farbe nicht mehr verschwand. Das Gemisch wurde weitere 10 min gerührt, mit CH&sub2;Cl&sub2; (20 ml) verdünnt und mit gesättigter Na&sub2;S&sub2;O&sub3;/NaCl-Lösung (2 · 80 ml) gewaschen. Die organische Phase wurde aufgefangen, über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet, eingedampft und zur Entfernung des Pyridins mit Toluol (3 · 30 ml) eingedampft. Das Rohprodukt wurde durch Blitzchromatographie
  • auf Silicagel (15 · 2 cm) unter Verwendung von Toluol/EtOAc (1/1, v/v), EtOAc und EtOAc/2-4% MeOH als Elutionsmittel gereinigt. Die Produktfraktion wurde zu einem festen Schaum eingedampft, der im Hochvakuum bei 30ºC getrocknet wurde und 0,610 g (67%) der ApAp-Triester 41 und 41a ergab. Die Identität der isolierten Verbindung mit authentischem Material wurde durch spektralphotometrischen Vergleich bewiesen. Das authentische Material wurde aus dem Ap-Diester 20 (Charuba et al., 1981) mit dem 5'-Hydroxy-P-triester 40 nach dem Phosphotriesterverfahren synthetisiert. Analyse berechnet für ApAp-Triester = C&sub8;&sub8;H&sub9;&sub4;N&sub1;&sub2;O&sub2;&sub0;Cl&sub2;P&sub2;SSi&sub2; (1828,8): C 57,80, H 5,18, N 9,9. Gefunden: C 57,77, H 5,20, N 9,02. UV (MeOH): λmax (log ε) 277 (4,75), [260 (4,62)], [228 (4,72)]. Rf auf Silicagel mit Toluol/EtOAc/MeOH (5/4/1, v/v/v) = 0,78.
    • b. 6-N-Benzoyl-3'-O-[(t-butyl)dimethylsilyl]-5'-(monomethoxytrityl)-(PR,PS)-P-thioadenylyl-2'-[OP-2-(4-nitrophenyl)ethyl-5']-6-N-benzoyl-3'-O-[(t-butyl)dimethylsilyl]- adenosin-2'-[2,5-dichlorphenyl-2-(4-nitrophenyl)ethylphosphat] A(Rp,Sp)·Ap-Triaster 43 und 44
  • 6-N-Benzoyl-3'-O-[(t-butyl)dimethylsilyl]-adenosin-2'-[2,5- dichlorphenyl,2-(4-nitrophenyl)ethylphosphat] 5'-OH-Ap- Triester 40 (0,52 g, 0,6 mmol) und das Phosphoramidit 15 (0,95 g, 0,9 mmol) wurden in absolutem CH&sub3;CN (6,5 ml) in Gegenwart von Tetrazol (0,126 g, 1,8 mmol) unter Stickstoff gelöst. Nach 3 h Rühren bei RT wurden S&sub8; (0,39 g, 1,51 mmol) und absolutes Pyridin (3,9 ml) zugesetzt und 20 h weitergerührt. Dann wurde mit CH&sub2;Cl&sub2; (2 · 80 ml) und H&sub2;O (2 · 80 ml) extrahiert. Die organische Phase wurde aufgefangen, über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet und zur Trockne eingedampft. Abschließend wurde mit Toluol (4 · 20 ml) abgedampft, um Pyridin zu entfernen. Das rohe Diastereomerengemisch A(Rp,Sp)·Ap-Triester 43 + 44 wurde durch Blitzsäulenchromatographie auf Silicagel (14 · 2,5 cm) unter Verwendung von 200 ml CH&sub2;Cl&sub2;, CH&sub2;Cl&sub2;/1% MeOH, 2% MeOH und schließlich 200 ml CH&sub2;Cl&sub2;/3% MeOH als Elutionsmittel gereinigt. Die Produktfraktion (150 ml) wurde zu einem festen Schaum eingedampft, der im Hochvakuum getrocknet wurde und 0,975 g (88%) von 43 und 44 als Diastereomerengemisch ergab. Analyse berechnet für A(Rp,Sp)Ap-Triester 43 + 44 = C&sub8;&sub8;H&sub9;&sub4;N&sub1;&sub2;O&sub1;&sub9;C&sub1;&sub2;P&sub2;SSi&sub2; (1844,9): C 57,29, H 5,14, N 9,11. Gefunden: C 56,96, H 5,16, N 9,09. UV (MeOH): λmax (log ε) 277 (4,75), [228 (4,72)]. Rf auf Silicagel mit Toluol/- EtOAc/CHCl&sub3; (1/1/1, v/v/v) = 0,21. ³¹P-NMR (CDCl&sub3;): 69,87, 69,25, -6,89, -7,22 und -7,31 ppm.
    • Synthese 14 a. Triethylammonium-N-6-benzoyl-3'-O-[(t-butyl)dimethylsilyl]-5'-O-(monomethoxytrityl)-(PR)-P-thioadenylyl-2'-[OP-2- (4-nitrophenyl)ethyl-5']-N-6-benzoyl-3'-O-[(t-butyl)dimethylsilyl]adenosin-2'-[2-(4-nitrophenylethyl)-phosphat] ASp·Ap-Diester 45 b. Triethylammonium-N-6-benzoyl-3'-O-[(t-butyl)dimethylsilyl]-5'-O-(monomethoxytrityl)-(PS)-P-thioadenylyl-2'-[OP-2- (4-nitrophenyl)ethyl-5']-N-6-benzoyl-3'-O-[(t-butyl)dimethylsilyl]adenosin-2'-[2-(4-nitrophenylethyl)-phosphat] ASp·Ap-Diester 46
  • Die Lösung von 0,558 g (3,36 mmol) 4-Nitrobenzaldehydoxim in 15 ml H&sub2;O/Dioxan/Et&sub3;N (1 : 1 : 1) wurde 30 min bei RT gerührt. Dann wurden 0,62 g (0,336 mmol) des Diastereomerengemischs der A(Rp,Sp)·Ap-Triester 43 + 44 zugesetzt und 2,5 h bei RT gerührt. Das Gemisch wurde eingedampft, und dann mit Pyridin, (3 · 15 ml), Toluol (3 · 15 ml) und schließlich mit CH&sub2;Cl&sub2; (3 · 15 ml) eingedampft. Der Rückstand wurde in einer kleinen Menge CHCl&sub3; gelöst und auf einer Silicagel-Blitzsäule (15 · 2,5 cm) mit CHCl&sub3; (150 ml), CHCl&sub3;/2% MeOH (200 ml), 4 % MeOH (100 ml), 6% MeOH (200 ml), CHCl&sub3;/6% MeOH/0,5% Et&sub3;N (300 ml) und CHCl&sub3;/6% MeOH/2% Et&sub3;N (250 ml) chromatographiert. Die Produktfraktion (600 ml) wurde zu einem festen Schaum eingedampft, der im Hochvakuum getrocknet wurde und 0,55 g (91%) des Isomerengemischs 45 + 46 ergab. Die Trennung in die reinen Diastereomeren wurde durch Chromatographie auf präparativen Silcagelplatten (7 Platten, 40 · 20 · 0,2 cm) und drei Entwicklungen in CHCl&sub3;/MeOH (9/1, v/v) erreicht. Die Produktbanden wurden mit CHCl&sub3;/MeOH (4/1, v/v), das 1% Et&sub3;N enthielt, eluiert, zu einem festen Schaum eingedampft und ergaben 0,262 g (43%) des ARp·Ap-Diesters 45, 0,144 g (24%) des ASp·Ap-Diesters 46 und 0,045 g (7%) A(Rp,Sp)·Ap-Diester 45 + 46. Analyse berechnet für ARp·Ap- Diester 45 = C&sub8;&sub8;H&sub1;&sub0;&sub7;N&sub1;&sub3;O&sub1;&sub9;P&sub2;SSi&sub2; · 2 H&sub2;O (1837,1): C 57,53, H 6,09, N 9,91. Gefunden: C 57,30, H 6,70, N 9,75. UV (MeOH): λmax (log ε) 277 (4,69), [260 (4,56)], [231 (4,61)]. Rf auf Silicagel mit CHCl&sub3;/MeOH (9/1, v/v) = 0,37. ³¹P-NMR (CDCl&sub3;): 69,66 und -0,06 ppm. Analyse berechnet für ASp·Ap-Diester 46 = C&sub8;&sub8;H&sub1;&sub0;&sub7;N&sub1;&sub3;O&sub1;&sub9;P&sub2;SSi&sub2; · 2 H&sub2;O (1837,1): C 57,53, H 6,09, N 9,91. Gefunden: C 56,44, H 7,15, N 8,61. UV (MeOH): λmax (log ε) 276 (4,60), [260 (4,49)], [232 (4,52)]. Rf auf Silicagel mit CHCl&sub3;/MeOH (9/1, v/v) = 0,28. ³¹P-NMR (CDCl&sub3;): 68,96 und -0,06 ppm.
  • Schema 5 ist das Reaktionsschema für die Synthese der verbleibenden völlig freigesetzten Tetramere ApApARp·A 51, ApApASp·A 52, ARpApApA 57 und ASpApApA 58 aus den betreffenden geschützten Zwischenprodukten 47, 48, 53 und 54. Die entsprechenden Synthesen sind in den Synthesen 15, 16 und 17 und im Beispielen 4 und 5 geschildert.
    • Synthese 15 a. 6-N-Benzoyl-3'-O-[(t-butyl)dimethylsilyl]-5'-O- (monomethoxytrityl)-adenylyl-2'-[OP-2-(4-nitrophenyl)ethyl- 5']-6-N-benzoyl-3'-O-[(t-butyl)dimethylsilyl]-adenylyl-2'- [OP-2-(4-nitrophenyl)ethyl-5']-6-N-benzoyl-3'-O-[(t- butyl)dimethylsilyl]-(PR)-P-thioadenylyl-2'-[OP-2-(4- nitrophenyl)ethyl-5']-6-N-benzoyl-2',3'-di-O-[(t- butyl)dimethylsilyl]-adenosin ApApARp·A 4J7
  • Triethylammonium-6-N-Benzoyl-3'-O-[(t-butyl)dimethylsilyl]- 5'-O-(monomethoxytrityl)-adenylyl-2'-[OP-2-(4- nitrophenyl)ethyl-5']-6-N-benzoyl-3'-O-[(t- butyl)dimethylsilyl]-adenosin-2'-[2-(4-nitrophenyl)ethylphosphat] 42 (0,14 g, 0,078 mmol) und das 5'- Hydroxy-PR-dimer 18 (0,08 g, 0,06 mmol) wurden mit trockenem Pyridin (4 · 0,5 ml) eingedampft, in trockenem Pyridin (0,6 ml) gelöst, und dann wurden 2,4,6-Triisopropylbenzolsulfonylchlorid (0,047 g, 0,156 mmol) und 3-Nitro-1,2,4- triazol (0,053 g, 0,47 mmol) zugesetzt. Die Lösung wurde bei RT 22 h gerührt, mit CH&sub2;Cl&sub2; (2 · 30 ml) extrahiert, mit H&sub2;O (2 · 20 ml) gewaschen, über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet und zur Trockne eingedampft. Pyridin wurde durch Eindampfen mit Toluol (3 · 20 ml) entfernt. Das rohe Tetramer 47 wurde durch Blitzsäulenchromatographie (15 · 1 cm) auf Silicagel gereinigt und zunächst mit CH&sub2;Cl&sub2; (50 ml), dann mit CH&sub2;Cl&sub2;/1% MeOH (100 ml), 2% MeOH (50 ml) und schließlich mit CH&sub2;Cl&sub2;/3% MeOH (100 ml) eluiert. Die Produktfraktion (80 ml) wurde zur Trockne eingedampft und ergab nach Trocknen unter Hochvakuum bei 35ºC 0,11 g (62%) des voll geschützten Tetramers ApApARp·A 47 als farblosen Schaum. Analyse berechnet für C&sub1;&sub4;&sub2;H&sub1;&sub7;&sub2;N&sub2;&sub3;O&sub3;&sub2;P&sub3;SSi&sub5; · H&sub2;O (2996,5): C 56,92, H 5,85, N 10,75. Gefunden: C 56,51, H 5,91, N 10,37. UV (MeOH): λmax (log ε) 277 (4,99), [259 (4,84)], [233 (4,85)]. Rf auf Silicagel mit CHCl&sub3;/MeOH (19/1, v/v) = 0,46.
    • b. 6-N-Benzoyl-3'-O-[(t-butyl)dimethylsilyl]-5'-O-(monomethoxytrityl)-adenylyl-2'-[OP-2-(4-nitrophenyl)ethyl-5']-6-N- benzoyl-3'-O-[(t-butyl)dimethylsilyl]-adenylyl-2'-[OP-2-(4- nitrophenyl)ethyl-5']-6-N-benzoyl-3'-O-[(t-butyl)dimethylsilyl]-(PS)-P-thioadenylyl-2'-[OF-2-(4-nitrophenyl)ethyl-5']- 6-M-benzoyl-2',3'-di-O-[(t-butyl)dimethylsilyl]-adenosin ApApASp·A 48
  • Der ApAp-Diester 41 (0,14 g, 0,078 mmol) und das 5'-Hydroxy- PS-dimer 19 (0,08 g, 0,06 mmol) wurden mit trockenem Pyridin (4 · 0,5 ml) eingedampft, in trockenem Pyridin (0,6 ml) gelöst, und dann wurden 2,4,6-Triisopropylbenzolsulfonylchlorid (0,047 g, 0,156 mmol) und 3-Nitro-1,2, 4-triazol (0,053 g, 0,46 mmol) zugesetzt. Nach 4,5 h Rühren bei RT wurden wiederum 2,4,6-Triisopropylbenzolsulfonylchlorid (0,024 g, 0,078 mmol) und 3-Nitro-1,2,4-triazol (0,027 g, 0,234 mmol) zugesetzt. Die Lösung wurde bei RT 16,5 h gerührt, dann mit CH&sub2;Cl&sub2; (4 · 20 ml) und zugesetztem H&sub2;O (3 · 20 ml) extrahiert, über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet und eingedampft. Zur Entfernung des Pyridins wurde zum Schluß mit Toluol (4 · 15 ml) eingedampft. Das rohe Tetramer 48 wurde durch Blitzsäulenchromatographie auf Silicagel (15 · 1 cm) gereinigt und analog zum Tetramer 47 mit CH&sub2;Cl&sub2; und CH&sub2;Cl&sub2;/1-3% MeOH eluiert und ergab nach Trocknen unter Hochvakuum bei 35ºC 0,107 g (60%) des voll geschützten Tetramers ApApASp·A 48 als farblosen Schaum. Analyse berechnet für C&sub1;&sub4;&sub2;H&sub1;&sub7;&sub2;N&sub2;&sub3;O&sub3;&sub2;P&sub3;SSi&sub5; · H&sub2;O (2996,5): C 56,92, H 5,85, N 10,75. Gefunden: C 56,51, H 5,91, N 10,85. UV (MeOH): λmax (log ε) 277 (4,99), [259 (4,85)], [231 (4,86)]. Rf auf Silicagel mit CHCl&sub3;/MeOH (19/1, v/v) = 0,46.
    • Synthese 16 a. 6-N-Benzoyl-3'-O-[(t-butyl)dimethylsilyl]-adenylyl-2'-[OP- 2-(4-nitrophenyl)ethyl-5']-6-H-benzoyl-3'-O-[(t-butyl)dimethylsilyl]-adenylyl-2'-[Op-2-(4-nitrophenyl)ethyl-5']-6- N-benzoyl-3'-O-[(t-butyl)dimethylsilyl]-(PR)-P-thioadenylyl- 2'-[OP-2-(4-nitrophenyl)ethyl-5']-6-N-benzoyl-2',3'-di-O-[(t- butyl)dimethylsilyl]-adenosin-5'-OH-ApApARp·A 49 b. 6-N-Benzoyl-3'-O-[(t-butyl)dimethylsilyl]-adenylyl-2'-[OP- 2-(4-nitrophenyl)ethyl-5']-6-N-benzoyl-3'-O-t(t-butyl)dimethylsilyl]-adenylyl-2'-[OP-2-(4-nitrophenyl)ethyl-5']-6- N-benzoyl-3'-O-[(t-butyl)dimethylsilyl]-(PS)-P-thioadenylyl- 2'-[OP-2-(4-nitrophenyl)ethyl-5']-6-N-benzoyl-2',3'-di-O-[(t- butyl)dimethylsilyl]-adenosin-5'-OH-ApApASp·A 50
  • Das voll geschützte Tetramer ApApARp·A 47 (0,104 g, 0,035 mmol) wurde mit 2% p-TsOH in CH&sub2;Cl&sub2;/MeOH (4/1, v/v, 1,4 ml) bei RT gerührt. Nach 1,5 h wurde das Reaktionsgemisch mit CH&sub2;Cl&sub2; (3 · 40 ml) und H&sub2;O (2 · 40 ml) extrahiert. Die vereinigte organische Phase wurde über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet und zur Trockne eingedampft. Das Rohprodukt wurde auf einer Silicagel-Blitzsäule (11 · 1 cm) gereinigt und das Produkt mit 20 ml CH&sub2;Cl&sub2; und 50 ml CH&sub2;Cl&sub2;/1-5% MeOH eluiert. Die Produktfraktion wurde eingedampft und im Hochvakuum getrocknet und ergab 0,075 (80%) des Hydroxy-Tetramers ApApARp·A 49. Analyse berechnet für C&sub1;&sub2;&sub2;H&sub1;&sub5;&sub6;N&sub2;&sub3;O&sub3;&sub1;P&sub3;SSi&sub5; · H&sub2;O (2706,5): C 54,15, H 5,81, N 11,90. Gefunden: C 53,97, H 6,02, N 11,65. UV (Me-OH): λmax (log ε) 277 (5,00), [260 (4,85)], [234 (4,77)]. Rf auf Silicagel mit CHCl&sub3;/MeOH (19/1, v/v) = 0,43.
  • Das voll geschützte Tetramer ApApASp·A 48 wurde bis zur Reinigungsstufe in analoger Weise behandelt. Das Rohprodukt 50 wurde auf zwei präparativen Silicagelplatten (20 · 20 · 0,2 cm) in CHCl&sub3;/MeOH (19/1, v/v) gereinigt, die Produktbande wurde mit CH&sub2;Cl&sub2;/MeOH (4/1, v/v) eluiert, zu einem festen Schaum eingedampft und ergab 0,068 g (72%) des 5'-Hydroxytetramers ApApASp·A 50.
    • Beispiel 4 a. Adenylyl-(2'-5')-adenylyl-(2'-5')-(PR)-P-thioadenylyl- (2'-5')-adenosin ApApARp·A 51 b. Adenylyl-(2'-5')-adenylyl-(2'-5')-(PS)-P-thaioadenylyl- (2'-5')-adenosin ApApASp·A 52
  • Die entsprechenden 5'-Hydroxytetramere 49 bzw. 50 wurden getrennt von Schutzgruppen befreit, indem das 5'-Hydroxytetramer (0,067 g, 0,025 mmol) mit 0,5 mol/l DBU in absolutem CH&sub3;CN (3 ml) 20 h bei RT gerührt, die Lösung mit 1 mol/l AcOH in absolutem CHsCN (1,5 ml) neutralisiert und zur Trockne eingedampft wurde. Der Rückstand wurde dann mit methanolischem Ammoniak (10 ml) behandelt und nach 3 Tagen Reaktionszeit das Lösungsmittel im Vakuum entfernt. Die Abspaltung der Silylgruppen erfolgte mit 1 mol/l Bu&sub4;NF in THF (5 ml). Das Reaktionsgemisch wurde 48 h bei RT gerührt und dann das Lösungsmittel im Vakuum verdampft. Der Rückstand wurde mit H&sub2;O (10 ml) aufgenommen und auf eine DEAE-Sephadex A25-Säule (30 · 2 cm) aufgetragen. Bei einer Flußgeschwindigkeit von 2 ml/min wurde das reine Tetramer ApApARp·A mit 0,15-0,20 mol/l TEAB-Puffer, pH 7,5, eluiert; im Fall des Tetramers ApApASp·A mit 0,24-0,32 mol/l TEAB-Puffer, pH 7,5. Nach Eindampfen und mehrmals Abdampfen mit Methanol wurde das Tetramer auf acht Papierblätter 25 · 50 cm) aufgetragen und mit i-PrOH/Ammoniak/H&sub2;O (6/1/3, v/v/v) entwickelt. Die Produktbande wurde ausgeschnitten, mit H&sub2;O eluiert, eingeengt, schließlich gefriergetrocknet und ergab 675 O.D.260 nm- Einheiten (57%) des ApApARp·A-Isomers 51 und 753 O.D.260 nm- Einheiten (65%) des ApApASp·A-Isomers 52. ApApARp·A 51: Rf auf Cellulose in i-PrOH/Ammoniak/H&sub2;O (6/1/3, v/v/v) = 0,33.
  • UV (H&sub2;O): λmax 258 nm. HPLC auf PR-18: A: 50 mmol/l NH&sub4;H&sub2;PO&sub4; (pH 7,2). B: MeOH/H&sub2;O (1/1, v/v); Gradient 0-1 min: 80% A, 20% B, 1-31 min: 30% A, 70% B; Retentionszeit 9,70 min. ApApASp·A 52: Rf auf Cellulose in i-PrOH/Ammoniak/H&sub2;O (6/1/3, v/v/v) = 0,21. UV (H&sub2;O): λmax 258 nm. HPLC auf PR-18: A: 50 mmol/l NH&sub4;H&sub2;PO&sub4; (pH 7,2). B: MeOH/H&sub2;O (1/1, v/v); Gradient 0 -1 min: 80% A, 20% B, 1-31 min: 30% A, 70% B; Retentionszeit 13,49 min.
    • Synthese 17 a. 6-N-Benzoyl-3'-O-[(t-butyl)dimethylsilyl]-5'-O-(monomethoxytrityl)-(PR)-P-Thioadenylyl-2'-[OP-2-(4-nitrophenyl)ethyl- 5']-6-N-benzoyl-3'-O-[(t-butyl)dimethylsilyl]-adenylyl-2'- [OP-2-(4-nitrophenyl)ethyl-5']-6-N-benzoyl-3'-O-[(t-butyl)dimethylsilyl]-adenylyl-2'-[OP-2-(4-nitrophenyl)ethyl-5']-6- N-benzoyl-2',3'-di-O-t(t-butyl)dimethylsilyl]-adenosin ARp·ApApA 53
  • Triethylammonium-N-6-benzoyl-3'-O-[(t-butyl)dimethylsilyl]- 5'-O-(monomethoxytrityl)-(PR)-P-thioadenylyl-2'-[OP-2-(4- nitrophenyl)ethyl-5']-N-6-benzoyl-3'-O-[(t-butyl)dimethylsilyl]adenosin-2'-[2-(4-nitrophenylethyl)-phosphat] ARp·Ap- Diester 45 (0,141 g, 0,078 mmol) und das 5'-Hydroxydimer 29 (0,078 g, 0,06 mmol) wurde mit trockenem Pyridin (4 · 0,5 ml) eingedampft und schließlich in trockenem Pyridin (0,6 ml) gelöst. Dann wurden 2,4,6-Triisopropylbenzolsulfonylchlorid (0,047 mg, 0,156 mmol) und 3-Nitro-1,2,4-triazol (0,053 g, 0,47 mmol) zugesetzt und 21 h bei RT gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde mit CH&sub2;Cl&sub2; (60 ml) verdünnt und mit H&sub2;O (2 · 30 ml) gewaschen, über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet und zur Trockne eingedampft. Pyridin wurde durch Eindampfen mit Toluol (3 · 20 ml) entfernt. Das rohe Tetramer 53 wurde durch Blitzsäulenchromatographie auf Silicagel (11 · 1 cm) gereinigt und zunächst mit CH&sub2;Cl&sub2; (50 ml), dann mit CH&sub2;Cl&sub2;/1% Me-OH (100 ml), 2% MeOH (200 ml), 3% MeOH (50 ml) und schließlich mit CH&sub2;Cl&sub2;/5% MeOH (50 ml) eluiert. Die Produktfraktion (200 ml) wurde zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wurde nochmals auf zwei präparativen Silicagelplatten (20 · 20 · 0,2 cm) in Toluol/EtOAc/MeOH (5/4/0,5, v/v/v) chromatographiert, um eine geringe Menge 5'-Hydroxydimer zu entfernen. Die Bande des Tetramerprodukts wurde mit CH&sub2;Cl&sub2;/MeOH (4/1, v/v) eluiert und zu einem festen Schaum eingedampft, der nach Trocknen im Hochvakuum bei 35ºC 0,053 g (30%) des Tetramers ARp·ApApA 53 ergab. Analyse berechnet für C&sub1;&sub4;&sub2;H&sub1;&sub7;&sub2;N&sub2;&sub3;O&sub3;&sub2;P&sub3;SSi&sub5; · 3 H&sub2;O (3032,5): C 56,24, H 5,92, N 10,62. Gefunden: C 55,75, H 5,71, N 9,83. UV (MeOH): λmax (log ε) 277 (4,96), [260 (4,82)], [232 (4,82)]. Rf auf Silicagel mit Toluol/EtOAc/MeOH (5 : 4 : 1) = 0,78.
    • b. 6-N-Benzoyl-3'-O-[(t-butyl)dimethylsilyl]-5'-O-(monomethoxytrityl)-(PS)-P-Thioadenylyl-2'-[OP-2-(4-nitrophenyl)ethyl- 5']-6-N-benzoyl-3'-O-[(t-butyl)dimethylsilyl]-adenylyl-2'- [OP-2-(4-nitrophenyl)ethyl-51]-6-N-benzoyl-3'-O-[(t-butyl)dimethylsilyl]-adenylyl-2'-[OP-2-(4-nitrophenyl)ethyl-5']-6- N-benzoyl-2',3'-di-O-[(t-butyl)dimethylsilyl]-adenosin ASp·ApApA 54
  • ASp·A-diester 46 (0,141 g, 0,078 mmol) und das 5'-Hydroxydimer 29 wurden mit trockenem Pyridin (4 · 0,5 ml) eingedampft und in trockenem Pyridin (0,6 ml) gelöst. 2,4,6- Triisopropylbezolsulfonylchlorid (0,047 g, 0,156 mmol) und 3-Nitro-1,2,4-triazol (0,053 g, 0,47 mmol) wurden zugesetzt und das Gemisch bei RT gerührt. Nach 21 h wurden nochmals 2,4,6-Triisopropylsulfonylchlorid (0,024 g, 0,079 mmol) und 3-Nitro-1,2,4-triazol (0,027 g, 0,24 mmol) zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde eine weitere Stunde gerührt, dann mit CH&sub2;Cl&sub2; (60 ml) verdünnt und mit H&sub2;O (2 · 30 ml) gewaschen, über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet und zur Trockne eingedampft. Die weitere Aufarbeitung erfolgte analog zu der für das Tetramer 53 beschriebenen und ergab 43 mg (24%) ASp·ApApA 54 in Form eines festen Schaums. Analyse berechnet für C&sub1;&sub4;&sub2;H&sub1;&sub7;&sub2;N&sub2;&sub3;O&sub3;&sub2;P&sub3;SSi&sub5; · H&sub2;O (2996,5): C 56,92, H 5,85, N 10,75. Gefunden: C 56,63, H 6,08, N 10,18. UV (MeOH): λmax (log ε) 277 (4,98), [260 (4,84)], [232 (4,85)]. Rf auf Silicagel mit Toluol/EtOAc/MeOH (5/4/1, v/v/v) = 0,78.
    • Beispiel 5 a. (PR)-P-Thioadenylyl-(2'-5')-adenylyl-(2'-5')-adenylyl- (2'-5')-adenosin ARp·ApApA 57 b. (PS)-P-Thioadenylyl-(2'-5')-adenylyl-(2'-5')-adenylyl- (2'-5')-adenosin ASp·ApApA 58
  • Die entsprechenden voll geschützten Tetramere 53 und 54 wurden durch 1 h Rühren einer Lösung von 0,047 g (0,016 mmol) des PR-Tetramers 53 (PS-Tetramer 54: 0,032 g, 0,012 mmol) in 2% p-TsOH in CH&sub2;Cl&sub2;/MeOH (4/1, v/v; für PR: 0,5 ml, für PS: 0,38 ml) bei RT von den Schutzgruppen befreit. Das Reaktionsgemisch wurde mit CH&sub2;Cl&sub2; (60 ml) verdünnt, mit H&sub2;O (2 · 30 ml) gewaschen, über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet und zur Trockne eingedampft. Das Rohprodukt wurde auf präparativen Silicagelplatten (20 · 20 · 0,2 cm) mittels CHCl&sub3;/MeOH (19/1, v/v) gereinigt, die Produktbanden mit CHCl&sub3;/MeOH (4/1, v/v) eluiert, zu festen Schäumen eingedampft und ergaben 0,034 g (80%) des 5'-Hydroxy- ARp·ApApA-isomers 55 und 0,02 g (68%) des 5'- Hydroxy-ASp·ApApA-isomers 56. Die Lösungen des 5'-Hydroxytetramers 55 (0,034 g, 0,013 mmol) bzw. 56 (0,02 g, 0,007 mmol) wurden getrennt mit 0,5 mol/l DBU in absolutem CH&sub3;CN (55: 1,5 ml, 56: 0,9 ml) 18 h bei RT gerührt, dann durch Zugabe von 1 mol/l AcOH (55: 0,75 ml, 56: 0,45 ml) neutralisiert und eingedampft. Der Rückstand wurde mit 10 ml gesättigtem methanolischem Ammoniak behandelt und die Lösung nach 60 h Rühren bei RT zur Trockne eingedampft. Die Abspaltung der Silylgruppen erfolgte durch Behandlung mit 1 mol/l Bu&sub4;NF in THF (2,5 ml). Nach 60 h Rühren bei RT wurde das Lösungsmittel im Vakuum entfernt. Etwas H&sub2;O (10 ml) wurde zum entstandenen Rückstand zugefügt und auf eine DEAE-Sephadex A- 25-Säule (32 · 2 cm) aufgetragen und mit 0-0,5 mol/l TEAB- Puffer, pH 7,5, eluiert. Die Fraktionen des Hauptpeaks wurden aufgefangen, eingedampft und mehrmals mit MeOH abgedampft. Weitere Reinigung durch Papierchromatographie (i-PrOH/Ammoniak/H&sub2;O, 55/10/35, v/v/v) ergab nach Gefriertrocknung 347 O.D.260 nm-Einheiten (58%) ARp·ApApA 57 bzw. 111 O.D.260 nm-Einheiten ASp·ApApA 58. ARp·ApApA 57: UV (H&sub2;O) = 257 nm. Rf auf Cellulose in i-PrOH/Ammoniak/H&sub2;O (6/1/3, v/v/v) = 0,21. HPLC: PR-18, A: 50 mmol/l NH&sub4;H&sub2;PO&sub4; (pH 7,2). B: MeOH/H&sub2;O (1/1, v/v), Gradient: 0-1 min, 80% A, 20% B; 1-31 min, 30% A, 70% B, Retentionszeit: 7,47 min. ASp·ApApA 58: UV (H&sub2;O) = 257 nm. Rf auf Cellulose in i- PrOH/Ammoniak/H&sub2;O (6/1/3, v/v/v) = 0,32. HPLC: PR-18, A: 50 mmol/l NH&sub4;H&sub2;PO&sub4; (pH 7,2). B: MeOH/H&sub2;O (1/1, v/v), Gradient: 0 -1 min, 80% A, 20% B; 1-31 min, 30% A, 70% B, Retentionszeit: 9,84 min.
    • Herstellung der 2',5'-Phosphorthioat/Phosphodiester- Oligoadenylat-5'-monophosphate
  • Die Phosphorthioat/Phosphodiester-Trimer- und -Tetramerkerne wurden wie oben in den Beispielen 1, 2, 3, 4 und 5 beschrieben synthetisiert. Die Trimer- und Tetramer-5'-monophosphate wurden enzymatisch nach dem Verfahren von Sambrock et al., Molecular Cloning - A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Seiten 5.68-5.71 (1989) aus den entsprechenden Kernen und ATP mit T4-Polynucleotidkinase synthetisiert. Die 5'-Monophosphorylierung wurde durch RP-HPLC-Analyse festgestellt und durch nachfolgende Hydrolyse eines jeden 5'-Monophosphatderivats durch 5'- Nucleotidase bestätigt (Daten nicht aufgeführt). Die Ausbeute der Phosphorylierung reichte von 15% bis 68%.
    • Herstellung von 2',5'-Phosphorthioat/Phosphodiester- Oligoadenylat-5'-diphosphat und -5'-triphosphat
  • Das 5'-Diphosphat und 5'-Triphosphat der 2',5'- Phosphorthioat/Phosphodiester-Oligoadenylate kann aus den 5'-Monophosphaten nach der Vorschrift des Beispiels 6 hergestellt werden.
    • Beispiel 6
  • Alle Reaktionen werden in Glasapparaturen durchgeführt, die 18-24 h bei 125ºC im Trockenschrank getrocknet wurden. Ein 2',5'-Phosphorthioat/Phosphodiester-Stereoisomer (Trimer oder Tetramer, 400 O.D.-Einheiten bei 260 nm) wird in 500 ul trockenem Dimethylformamid ("DMF") gelöst und im Vakuum in einem 10 ml-Spitzkolben bei 35ºC getrocknet. Dieser Vorgang wird dreimal wiederholt. Zum trockenem Rückstand werden 50 umol Triphenylphosphin, 100 umol Imidazol und 50 umol Dipyridinyldisulfid zugefügt. Das Gemisch wird in 500 ul trockenem DMF plus 50 ul trockenem Dimethylsulfoxid gelöst. Die Lösung wird mit einem Rührstäbchen 2 h bei RT gerührt. Nach 2 h ist die Lösung homogen (nach 30 min beginnt die Lösung, gelb zu werden). Die Lösung wird tropfenweise in 10 ml einer 1% NaI-Lösung in trockenem Aceton (w/v) überführt. Der sich bildende klare farblose Niederschlag ist das Natriumsalz des 5'-Phosphorimidazolidats. Der Niederschlag wird bei RT abzentrifugiert, der Überstand abdekantiert und der Niederschlag dreimal mit 10 ml trockenem Aceton gewaschen. Das Zentrifugieren wird wiederholt. Der Niederschlag wird 2 h im Vakuum über P&sub2;O&sub5; getrocknet. Der Niederschlag wird in 200 ul frisch bereitetem 0,5 mol/l Tributylammoniumpyrophosphat in trockenem DMF gelöst. Die Lösung wird 18 h bei RT aufbewahrt/ danach wird das DMF im Vakuum entfernt. Der Rückstand wird in 0,25 mol/l Triethylammoniumbicarbonat-Puffer ("TEAB") (pH 7,5) gelöst. Die 5'-Di- und 5'-Triphosphatprodukte werden unter Verwendung einer DEAE-Sephadex A25- Säule (HCO&sub3;-Form, 1 · 20 cm) mit einem linearen Gradienten von 0,25 bis 0,75 mol/l TEAB getrennt. 10 ml-Fraktionen werden aufgefangen. Das Produkt wird mittels UV-Spektroskopie bei 254 nm beobachtet. Die Fraktionen mit den 5'-Di- bzw. 5'-Triphosphaten werden getrennt voneinander zusammengefaßt und im Vakuum getrocknet. TEAB wird durch wiederholte Zugabe von Wasser und nachfolgende Gefriertrocknung entfernt. Die Ausbeute an 5'-Diphosphat ist etwa 5%, die an 5'- Triphosphat etwa 60%.
    • Stabilität der Phosphorothiaot/phosphodiester-Trimer- und -Tetramerkernderivate gegenüber Serum-Phosphodiesterase
  • Die Stabilität von authentischem 2-5A und Phosphorthioat/Phosphodiester-Trimer- und -Tetramerkernderivaten (300 umol) wurde durch Inkubieren in 200 ul Medium RPMI-1640, ergänzt durch 10% fötales Kalbsserum, in Luft mit 5% CO&sub2; bei 37ºC bestimmt. Zur Zeit 0 und nach 6 h wurden Aliquote (30 ul) entnommen. Die Hydrolyseprodukte wurden mittels HPLC identifiziert, wie von Kariko et al., Biochemistry 26, 7127-7135 (1987), beschrieben. Unter den dort beschriebenen Bedingungen wurden authetisches A&sub2; und A&sub3; in 20 min vollständig zu Inosin und Hypoxanthin hydrolysiert (Tabelle 1), während ARp·A und ASp·A nicht hydrolysiert wurden.
  • Hydrolyse der Phosphorthioat/Phosphodiester-Trimerkernderivate wurde nicht beobachtet. Jedoch wurden die Phosphorthioat/Phosphodiester-Tetramerkernderivate vom 5'- oder 2',3'- Ende her hydrolysiert, abhängig von der Lage der mit Phosphorthioat substituierten Internukleotidbindung. Tabelle 1. Hydrolyse der Phosphorthioat/Phosphodiester- Trimer- und -Tetramer-2-5A-Kernderivate durch Serum- Phosphodiesterase
  • a Inkubation über 6 h wie im Text beschrieben. Die Zahl in Klammern zeigt an, nach welcher Zeit 100% Hydrolyse beobachtet wurde.
  • b Identifiziert wie von Kariko et al., Biochemistry 26, 7127 -7135 (1987) beschrieben.
  • Beispielsweise wurden ARp·ApApA und ASp·ApApA zu 50% zu den entsprechenden Dimerkernen, ARp·A und ASp·A, abgebaut, während ApARp·ApA und ApASp·ApA vom 2',3'-Ende her unter Bildung der Trimerkerne ApARp·A und ApASp·A abgebaut wurden. ApApARp·A und ApApASp·A werden vom 5'-Ende her abgebaut und ergeben ApARp·A bzw. ApASp·A.
    • Bindung von 2',5'-Phosphorthioat/Phosphodiester- Oligoadenylten an RNase L
  • Die Affinität der Phosphorthioat/Phosphodiester-2-5A- Derivate zu RNase L wurde in Radiobindungstests nach dem Verfahren von Knight et al., Meth. Enzymol. 79, 216-227 (1981) bestimmt. Authentisches A&sub3;, pA&sub3; und p&sub3;A&sub3; binden an RNase L mit IC&sub5;&sub0;-Werten von 1 · 10&supmin;&sup6; mol/l, 1 · 10&supmin;&sup9; mol/l bzw. 1 · 10 mol/l. Erfindungsgemäß ist die Bindung der Phosphorthioat/Phosphodiesterkerne und ihrer 5'-Monophosphate an RNase L gleichwertig oder etwas besser als die der authentischen 2-5A-Kerne und 5'-Monophosphate, mit IC&sub5;&sub0;- Werten von 8 · 10&supmin;&sup7; bis 8 · 10&supmin;&sup6; für die Kerne und 1 · 10&supmin;&sup8; bis 1 · 10&supmin;&sup9; für die 5'-Monophosphate. Die trimeren und tetrameren 2-5A-Kernderivate mit Phosphorthioatsubstitution in der ersten Internukleotidbindung vom 5'-Ende zeigten relativ zu jenen mit Phosphorthioatsubstitution in der zweiten oder dritten Internukleotidbindung geringere Affinität.
    • Aktivierung von RNase L durch Phosphorthioat/Phosphodiesterderivate des 2-5A
  • Die Korrelation der biologischen Eigenschaften mit der absoluten Konfiguration war nur durch Synthese der voll freigesetzten 2',5'-Phosphorthioat/Phosphodiesteradenylattrimerkerne möglich. Es wurde jedoch gefunden, daß die Trimerkernverbindungen RNase L nur mäßig binden und/oder aktivieren. Die RNase-Aktivierung durch die 2',5'-Phosphorthioatkernmoleküle wird durch 5'-Phosphorylierung wesentlich verstärkt.
  • Kern-Cellulose-Tests wurden nach dem Verfahren von Silverman, Anal. Biochem. 144, 450-460 (1985) und Kariko et al., (1987), s. o., durchgeführt, bei dem RNase L aus L929- Zellextrakten durch Immobilisierung auf 2-5A&sub4;-Kern-Cellulose teilweise gereinigt wurde. Die Aktivierung der RNase L wurde mittels der Umwandlung von poly(U) [³²P]pCp in säurelösliche Fragmente gemessen. Die Ergebnisse deuten an, daß authentische p&sub3;A&sub3;, p&sub3;A&sub4;, pA&sub3; und pA&sub4; IC&sub5;&sub0;-Werte von 5 · 10&supmin;¹&sup0; mol/l, 5 · 10&supmin;¹&sup0; mol/l, 2 · 10&supmin;&sup7; mol/l bzw. 2 · 10&supmin;&sup8; mol/l haben, während überraschenderweise von den Phosphorthioat/Phosphodiestertrimerkernderivaten nur ApARp·A RNase L aktivieren kann (IC&sub5;&sub0; von 5 · 10&supmin;&sup7; mol/l) (Fig. 1A, ). Drei der Phosphorthioat/Phosphodiestertrimer-5'-monophosphate können RNase L aktivieren, wobei pApASp·A der wirkungsvollste Aktivator für RNase L ist (IC&sub5;&sub0; von 1 · 10&supmin;&sup9; mol/l) (Fig. 1B, Δ). pARp·ApA ( ) und pASp·ApA ( ) sind hundertfach schwächere Aktivatoren für RNase L. Von den sechs Phosphorthioat/Phosphodiestertetramerkernderivaten können nur ApARp·ApA ( ) und ApApARp·A ( ) RNase L aktivieren (IC&sub5;&sub0; von 5 · 10&supmin;&sup7; mol/l bzw. 5 · 10&supmin;&sup7; mol/l) (Fig. 1C). Fünf der sechs Phosphorthioat/Phosphodiestertetramer-5'-monophosphate aktivieren RNase L (IC&sub5;&sub0;-Werte von > 6 · 10&supmin;&sup7; mol/l bis 8 · 10&supmin;¹&sup0; mol/l). Das pApASp·ApA-Enantiomer aktivierte RNase L nicht, selbst bei Konzentrationen von 1 · 10&supmin;&sup6; mol/l (Fig. 1D, ).
  • Die Aktivierung der RNase L durch die Phosphorthioat/Phosphodiestertrimer- und -tetramer-2-5A-derivate wurde auch in einem rRNS-Spaltungstest unter Verwendung von L929- Zellextrakten nach dem Verfahren von Kariko et al. (1987), s. o., gemessen, bei dem Extrakte von L929-Zellen 1 h bei 30 ºC in Gegenwart oder in Abwesenheit von 2-5A oder 2-5A- Derivaten inkubiert wurden. Übereinstimmend mit den Ergebnissen der Kern-Cellulosetests (Fig. 1A) war ApARp·A (1 · 10&supmin;&sup6; mol/l) der einzige Trimerkern, der RNase L zur Spaltung der rRNS in die gut charakterisierten spezifischen Spaltprodukte (SCP) der RNase L aktivieren kann (Fig. 2A, Streifen 5). ARp·ApA, ASp·ApA und ApASp·A, wie auch authentisches A&sub3; aktivierten RNase L auch bei Konzentrationen von 1 · 10&supmin;&sup6; mol/l nicht (Fig. 2A, Streifen 3, 4, 6 und 7). Die entsprechenden 5'-Monophosphate pARp·ApA, pASp·ApA und pApASp·A aktivierten bei 1 · 10&supmin;&sup7; mol/l, 1 · 10&supmin;&sup7; mol/l bzw. 2 · 10&supmin;&sup9; mol/l (Fig. 2B, Streifen 4-6), während pA&sub3; bei 1 · 10&supmin;&sup6; mol/l aktiv war (Streifen 3). Inkubation mit pApASp·A führte selbst bei Konzentrationen von 5 · 10&supmin;&sup6; nicht zu nachweisbarem Abbau der rRNS (Daten nicht aufgeführt).
  • Ein vergleichbarer Abbau der rRNS wurde mit zwei der sechs Phosphorthioat/Phosphodiestertetramerkernderivate relativ zu authentischem p&sub3;A&sub3; als Vergleich beobachtet. ApARp·ApA und ApApARp·A aktivierten RNase L bei 1 · 10&supmin;&sup5; mol/l (Fig. 3A, Streifen 6 und 8). Wie bei den Kern-Cellulosetests (Fig. 1D) beobachtet, konnten fünf der sechs Phosphorthioat/Phosphodiestertetramer-5'-monophosphate RNase L aktivieren (pARp·ApApA, pASp·ApApA, pApARp·ApA, pApApARp·A und pApApASp·A) (Fig. 3B, Streifen 4, 5, 6, 8 bzw. 9). Der wirksamste Aktivator für RNase L war pApARp·ApA (1 · 10&supmin;&sup8; mol/l) (Fig. 3B, Streifen 6), während pApASp·ApA ein Antagonist der RNase L- Aktivierung war und RNase L selbst bei Konzentrationen von 1 · 10&supmin;&sup5; mol/l nicht aktivieren konnte (Fig. 3B, Streifen 7).
    • Inhibierung der RNase L-Aktivierung durch pApASp·A
  • Die hohe Affinität von pApASp·A zu RNase L und die Beobachtung, daß pApASp·A RNase L nicht aktiviert, legen nahe, daß es ein spezifischer Inhibitor für RNase L sein könnte. Tatsächlich inhibiert pApASp·A die Aktivierung der RNase L durch p&sub3;A&sub3; oder pApARp·A (Fig. 4A). Authentisches p&sub3;A&sub3; aktiviert bei 10&supmin;&sup9; oder 10&supmin;&sup8; mol/l RNase L, 28S- und 185-rRNS zu SCP zu hydrolysieren (Streifen 1 und 3). Zusatz von pApASp·A (10&supmin;&sup6; mol/l) führt jedoch zur Inhibierung der durch RNase L katalysierten Hydrolyse der rRNS (Streifen 2 und 4). Ebenso aktiviert pApARp·A die RNase L bei 10&supmin;&sup9; oder 10&supmin;&sup8; mol/l (Streifen 5 und 7) und Zusatz von pApASp·A (10&supmin;&sup6; mol/l) inhibiert diese Aktivierung (Streifen 6 und 8). Die inhibierende Aktivität des pApASp·A wurde auch mit teilgereinigter RNase L beobachtet (Fig. 4B). p&sub3;A&sub3; aktiviert RNase L mit einem IC&sub5;&sub0;- Wert von 5 · 10&supmin;¹&sup0; mol/l ( ); bei Zusatz von pApASp·A (1 · 10&supmin;&sup6; mol/l) verschiebt sich der beobachtete IC&sub5;&sub0;-Wert jedoch zu 1 · 10 mol/l ( ), was die spezifische Inhibierung der p&sub3;A&sub3;-vermittelten Aktivierung der RNase L durch pApASp·A demonstriert.
  • Nichtsdestoweniger ist pApASp·A als Sonde bei der Bewertung der Rolle der RNase L bei der durch Interferon induzierten biologischen Kaskade brauchbar. Hauptsächlich inhibiert pApASp·A in physiologischen Konzentrationen selektiv die Aktivierung der RNase L und es ist metabolisch stabil gegenüber spezifischen und unspezifischen Phosphodiesterasen. Das Molekül liefert ein Mittel zur selektiven Inhibierung der RNase L-Aktivierung.
  • Darüber hinaus wird erwartet, daß pApASp·A eine therapeutische Aktivität hat. An chronisch myeloischer Leukämie ("CML") leidende Personen zeigen eine stark erhöhte RNase L- Aktivität, wie durch neue CML-spezifische rRNS-Spaltprodukte bewiesen wird. Daher ist pApASp·A als metabolisch stabiler Inhibitor der RNase L-Aktivität potentiell nützlich zur Behandlung der chronisch myeloischen Leukämie.
  • Zudem zeigen Personen, die am chronischen Erschöpfungssyndrom ("CFS") (auch bekannt als myalgische Encephalomyelitis (ME) oder natürliche Killerzellen("NK")-Mangelkrankheit) und anderen HHV-6-bezogenen Störungen leiden, ebenfalls eine stark erhöhte RNase L-Aktivität im Vergleich zu Vergleichspersonen (mittlerer Grundpegel = 466 ± 23 verglichen mit 123 ± 12 bei Vergleichspersonen, p < 0,0001), Suhadolnik et al., Clinical Infectious Deseases 18 (Ergänzungsband 1), 96-104 (1994). In Versuchen, die unter Verwendung von Extrakten aus Monozyten des peripheren Bluts ("PBMC") von Personen mit CFS vor und während der Therapie mit Poly-(I)-poly(C&sub1;&sub2;U) (nicht passender dsRNS, Ampligen®), einem Modifizierer der biologischen Antwort, durchgeführt wurden, war der mittlere latente Grundpegel der 2-5A-Synthetase in den PMBC-Extrakten nach der Therapie im Vergleich zu gesunden Personen wesentlich erniedrigt (610 ± 220 umol 2-5A/mg Protein/h) gegenüber den Vergleichspersonen (2035 ± 325 umol 2-5A/mg Protein/h, p < 0,0001), a. a. O. Desweiteren waren alle PMBC-Extrakte vor der Therapie positiv hinsichtlich der Replikation der humanen Herpesviren 6 (HHV-6). Die Therapie führte zu einer wesentlichen Senkung der HHV-6-Aktivität (p < 0,01) und Abregelung des 2-5A-Synthetase/RNase L-Pfads in zeitlichem Zusammenhang mit klinischer und neuropsychologischer Erholung. Ohne auf eine Theorie festgelegt werden zu wollen scheint es, daß der bei CFS vor der Therapie beobachtete hochgeregelte 2-5A-Pfad mit einer Hypothese konsistent ist, nach der ein aktivierter Immunzustand und anhaltende Virusinfektion die Pathogenese des CFS darstellen könnte. Daher hat pApASp·A als, wie oben dargestellt, metabolisch stabiler Inhibitor der RNase L potentielle Brauchbarkeit zur Behandlung von CFS.
    • Inhibierung des Zellwachstums durch Phosphorthioat/Phosphodiester-2-5A-kernderivate
  • Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde durch Trypanblau- Ausschluß bestimmt. Die Koloniebildungsfähigkeit nach der Behandlung wurde in Näpfen von Mikrotüpfelplatten bestimmt, wie in der Vorschrift von Kraemer et al., Mutation Res. 72, 285-292 (1980) umrissen. Die Ergebnisse zeigen, daß keine Verminderung im Überleben oder Inhibierung des Wachstums der Sup T1-Zellen in den Mikrotüpfelplatten mit irgend einem der dimeren, trimeren oder tetrameren Phosphorthioat/Phosphodiester-2-5A-Kernderivate beobachtet wurde. Wegen der fehlenden Zytotoxizität und der geschätzten Aufnahme von 1% aufgrund eines früheren Berichts von Suhadolnik et al., Nucleosides and Nucleotides 2, 351-366 (1983) wurde 3 · 10&supmin;&sup4; mol/l als Konzentration für Siebversuche zur Anti-HIV-1- Aktivität der Phosphorthioat/Phosphodiesterderivate gewählt.
    • Einfluß der 2',5'-Phosphorthioat/phhosphodiester-Oligoadenylate auf die Inhibierung der HIV-1-induzierten Bildung von Synzytia
  • Der von Henderson et al., Virology 182, 186-198 (1991) beschriebene Infizierte-Zentren-Test wurde angewendet, um die Fähigkeit der Phosphorthioat/Phosphodiesterderivate der 2- 5A-Trimer- und -Tetramerkerne zur Inhibierung der HIV-1- induzierten Bildung von Synzytia zu messen, die ein Indikator der HIV-1-Replikation in T-Zellen ist. Frisch isolierte Lymphozyten des peripheren Bluts (PBL) wurden mit 2-5A oder Derivaten 2 h lang behandelt und mit dem HIV-1-Stamm IIIB bei einer Infektionsdosis (multiplicity of infection, m. o. i.) von angenähert 0,1 infiziert. Die infizierten PBL wurden in RPMI-1640-Medium, das mit 10% (v/v) hitzeinaktiviertem fötalem Kalbsserum ergänzt war, bei 37ºC in einer befeuchteten Atmosphäre von 5% CO&sub2; in Luft gehalten. Nach 48 h wurden die Zellen zweimal mit Hankscher isotonischer Salzlösung gewaschen, reihenweise verdünnt und in mehrere Näpfe einer 96-er Mikrotüpfelplatte ausgesät. Sofort wurden 2 · 10&supmin;&sup5; exponentiell wachsende Sup-T1-Zellen zu jedem Napf zugefügt; diese Zellen bilden leicht ein Synzytium mit einer Zelle, die produktiv mit HIV-1 infiziert ist. Die Näpfe wurden täglich mit einem Gewebekulturmikroskop auf die Anwesenheit von Synzytia untersucht. Die ersten Anzeichen der Synzytiumbildung sind nach 12 h zu erkennen, wobei sich einige komplette Synzytia nach 24 h entwickeln. Die endgültigen Ergebnisse wurden nach 72 h erfaßt. Jedes Synzytium wurde als einzelne infizierte Zelle gezählt. Die Zahl der Synzytia je ausgesäte Zelle wird bestimmt und als infiziertes Zentrum je infizierte Zelle ausgedrückt. Im Vergleich (ohne Zusatz von 2-5A- Derivaten) war 100% Synzytiabildung gleichwertig mit 12 ± 3 Synzytia je 200 HIV-1-infizierte Zellen.
  • Die Daten sind in Fig. 5A und 5B gezeigt. Wie in Fig. 5A gezeigt war ApARp·A ein hochwirksamer Inhibitor der Synzytiabildung, wobei 100% Inhibierung bei 3 · 10&supmin;&sup4; mol/l beobachtet wurden. Sein PS-Enantiomer, ApASp·A, inhibierte die Synzytiabildung zu 78%. ARp·ApA und ASp·ApA inhibierten die Synzytiabildung nur zu 10 bzw. 15%. Authentisches A&sub3; und A&sub4; (3 · 10&supmin;&sup4; mol/l) inhibierten die Synzytiabildung zu 21 bzw. 15%, während Adenosin (9 · 10&supmin;&sup4; mol/l) die Synzytiabildung nicht inhibierte. Von den sechs Phosphorothiat/phosphodiestertetramerkernderivaten waren ApApARp·A und ApApASp·A die meist inhibierenden (90 bzw. 76% Inhibierung) (Fig. 5B). ApARp·ApA, ApASp·ApA, ARp·ApApA und ASp·ApApA inhibierten die Synzytiabildung zu 26, 32, 16 bzw. 18%. Adenosin und A&sub4; (Fig. 5B), wie auch die Dimere ARp·A und ASp·A, Adenin oder 3',5'-A&sub4; (Daten nicht gezeigt), konnten die Synzytiabildung nicht inhibieren.
    • Einfluß von 2',5'-Phosphorthioat/Phosphodiester-Oligoadenylaten auf die Aktivität der reversen Transkriptase des HIV-1
  • Sup T1-Zellen wurden mit 2-5A oder einem Phosphorthioat/Phosphodiesterderivat bei 300 umol 6 h lang behandelt und dann mit HIV-1 und einer Infektionsdosis (m. o. i.) von angenähert 0,1 infiziert. Adenosin und Adenin wurden bei 900 umol/l geprüft. 96 h nach der Infektion wurde der Überstand der Kulturen entfernt und die HIV-1-Aktivität in dreifacher Ausführung geprüft, wie von Henderson et al., Virology 182, 186-198 (1991) beschrieben. Bei diesem Verfahren wurden, kurz gesagt, 25 ul des Kulturüberstands zu einem 50 ul- Cocktail mit 50 mmol/l TRIS (pH 8,0), 20 mmol/l Dithiothreit, 10 mmol/l MgCL&sub2;, 60 mmol/l NaCl, 0,05 (?) Nonidet p- 40, 5 ug/ml Oligodesoxythymidylsäure, 10 ug/ml Polyriboadenylsäure, 10 ug/ml Desoxythymidintriphosphat und 1 mCi (37 MBq) [³²P]Thymidin-5'-triphosphat zugesetzt. Das Gemisch wurde bei 37ºC 2 h inkubiert. 50 ul des Cocktails wurden dann auf Diethylaminoethyl(DEAE)-Papier getüpfelt, getrocknet, mit 2 · SSC-Lösung (dreimal je 10 min) und 95proz. Ethanol (zweimal je 5 min) gewaschen, getrocknet und 18-24 h bei -80ºC auf Radiographiefilm gelegt. Die Filter wurden geschnitten und die endgültige Menge mittels Szintillationsspektrometrie bestimmt.
  • Die Daten der HIV-1-Aktivität sind in Tabelle 2 gezeigt. Wie angedeutet war das Trimer ApASp·A der wirksamste Inhibitor der HIV-1-Aktivität (78%). Andererseits inhibierte sein PR- Enantiomer, ApARp·A, die reverse Transkription des HIV-1 zu 31%. Ähnlich konnte das Tetramer mit der PS-Phosphorthioat/Phosphodiesterbindung in Nachbarschaft zur 2'- terminalen Bindung, ApApASp·A, die RT-Aktivität zu 62% unterdrücken, während sein PR-Gegenstück nur zu 38% bei der Inhibierung dieser Aktivität wirksam war.
    • Tabelle 2. Inhibierung der reversen Transkriptase des HIV-1 durch Phosphorthioat/Phosphodiester-2-5A
  • 2-5A oder Derivat / Prozent Inhibierung der reversen transkriptase des HIV- 1¹
  • 2'5'-ARp·ApA 32
  • 2'5'-ASp·ApA 56
  • 2'5'-ApARp·A 31
  • 2'5'-ApASp·A 78
  • 2'5'-ARp·ApApA 57
  • 2'5'-ASp·ApApA 54
  • 2'5'-ApARp·ApA 52
  • 2'5'-ApASp·ApA 42
  • 2'5'-ApApARp·A 38
  • 2'5'-ApApASp·A 62
  • 2',5'-A&sub4; 26
  • 3',5'-A&sub4; 8
  • Adenosin 0
  • Adenin 4
  • ¹ Mittelwert von Dreifachbestimmungen. Schwankung der Wiederholungsmessungen untereinander war < 10%.
  • Die erfindungsgemäßen Verbindungen können mit angemessenen pharmazeutischen oder landwirtschaftlichen Trägern zur Bildung einer antiviralen Zusammensetzung kombiniert werden.
  • Für die pharmazeutische Anwendung können die erfindungsgemäßen Verbindungen in pharmazeutische zulässigen Trägern, wie Lösungen, Suspensionen, Tabletten, Kapseln, Salben, Heiltränken und injizierbaren Zusammensetzungen und dergleichen aufgenommen werden. Sie werden Personen verabreicht, die an viralen Infektionen leiden. Die verabreichte Dosis hängt von der Art und Schwere der Infektion, dem Krankheitsstadium und bei systemischer Verabreichung von der Größe und vom Gewicht der infizierten Person ab.
  • Die Verbindungen werden im allgemeinen als wasserlösliche Salze verabreicht. Pharmazeutisch zulässige wasserlösliche Salze umfassen beispielsweise die Natrium-, Kalium- oder Ammoniumsalze der aktiven Verbindungen. Sie werden leicht in Wasser oder Kochsalzlösung gelöst. Daher umfaßt die bevorzugte Rezeptur für die pharmazeutische Verwendung eine Kochsalzlösung der gewünschten Verbindung in Salzform. Die Rezeptur kann weiterhin ein Agens, wie einen Zucker oder Protein, zur Erhaltung des osmotischen Gleichgewichts enthalten. Wegen der relativ hohen Azidität (etwa pH 3) der Säureform der Verbindungen ist deren Salzform bevorzugt.
  • Die erfindungsgemäßen Verbindungen können zur Behandlung oder zur Prophylaxe viraler Infektionen, bei Mensch und Tier verwendet werden, wie Herpes simplex, Rhinoviren, Hepatitis und andere Infektionen der Herpesfamilie, Epstein-Barr- Virus, Masernvirus, Multiple Sklerose (die von einem viralen Agens verursacht sein könnte) und die verschiedenen humanen T-lymphotropen Viren ("HTLV"), wie HTLV-1, der das kutane T- Zell-Lymphom verursacht, HTLV-2, der das Sézary-Lymphom hervorruft, und HTLV-3 (auch als "HIV-1" bekannt), der für das erworbene Immunschwächesyndrom ("AIDS") verantwortlich ist.
  • Die Verbindungen können topisch zur Behandlung von Hautkrebsen, die durch Strahlung, karzinogene oder virale Agentien hervorgerufen wurden, angewendet werden. Zu diesen Hautkrebsen gehört das kutane T-Zell-Lymphom, das Sézary-Lymphom, Xeroderma pigmentosa, Ataxia telangiectasia und das Bloom- Syndrom. Eine ausreichende Menge der eine erfindungsgemäße Verbindung enthaltenden Zubereitung wird aufgetragen, um die Läsion oder das betroffene Gebiet abzudecken. Eine wirksame Konzentration des Wirkstoffs liegt zwischen 10&supmin;³ und 10&supmin;&sup5; mol/l, wobei 10&supmin;&sup4; mol/l bevorzugt ist.
  • Die erfindungsgemäßen Verbindungen können auch zur Behandlung von pflanzeninfizierenden Viren angewendet werden, insbesondere des Tabakmosaikvirus und anderer Viren, die Nekrose bei Rüben, Gurken, Orchideen und anderen Pflanzen verursachen. Zu diesen Viren gehören, jedoch nicht beschränkend, Tabakaderfleckenvirus (tobacco vein mottling virus), vesikulares Stomatitisvirus, Vacciniavirus, Rübennekrosevirus und Cymbidiumorchideenvirus.
  • Die Verbindungen können den Pflanzen wirksam durch topische Anwendung verabreicht werden, und zwar durch Abreiben der Blattoberfläche, Aerosolspray, Behandlung des Bodens, Spritzen oder Stäuben.
  • Eine wirksame antivirale Zusammensetzung kann durch Kombinieren einer oder mehrerer der erfindungsgemäßen Verbindungen mit einem zur Verwendung in der Landwirtschaft geeigneten Träger gebildet werden. Während zur pharmazeutischen Anwendung die einzelnen Stereoisomere bevorzugt werden, können bei Verwendung in der Landwirtschaft Gemische von einem oder mehreren Stereoisomeren eingesetzt werden. Die aktive Verbindung kann auch durch Sprühen von Insektenvektoren wie Blattlaus, Thrips und weiße Fliege verabreicht werden, die das Virus zu den Pflanzen tragen. Die verabreichte Dosis hängt von der Schwere der Infektion ab.
  • Die erfindungsgemäßen Verbindungen können bei Pflanzensamen vor der Keimung angewendet werden, um die im Keimplasma enthaltenen Viren zu begrenzen. Die Samen können in eine Lösung von Polyethylenglykol /"PEG") eingeweicht werden, welche eine oder mehrere der Verbindungen enthält. PEG bringt die Samen zu physiologischer Aktivität und Hemmung. Die relative Konzentration der aktiven Verbindung bezogen auf PEG hängt von der Art des behandelten Saatguts ab.
  • Pflanzen können mit einer wäßrigen Rezeptur mit einer Konzentration des Wirkstoffs von etwa 10&supmin;¹ bis etwa 10&supmin;² mol/l wirksam behandelt werden. Die erfindungsgemäßen Verbindungen können bei sehr geringen Konzentrationen angewendet werden. Eine wirksame Menge des aktiven Bestandteils auf der Blatt- Oberfläche liegt zwischen etwa 10&supmin;&sup8; und 10&supmin;¹² mol je cm² der Blattoberfläche, wobei 10&supmin;¹&sup0; bis 10&supmin;¹² mol je cm² bevorzugt sind. Für eine typische Tabakpflanze von 1000 cm² sind 10&supmin;&sup5; mol der Verbindung wirksam. Bei diesem Wert reicht ein Pfund (453 g) des Wirkstoffs für die Behandlung von 2 · 10&supmin;&sup8; Tabakpflanzen aus.
  • Für die Anwendung in der Landwirtschaft werden die Verbindungen vorteilhaft als wasserlösliche Salze, z. B. Ammonium- oder Kaliumsalze, verabreicht. Natriumsalze werden im allgemeinen für die Behandlung von Speisepflanzen vermieden.
  • Die erfindungsgemäßen Verbindungen werden leicht in Wasser gelöst, insbesondere bei solch geringen Konzentrationen. Wäßrige Rezepturen für die landwirtschaftliche Anwendung können optional ein Haftmittel und/oder einen UV- Stabilisator enthalten. Solche Agentien sind dem Fachmann wohlbekannt. Fettsäuren (1%) sind als Spreit-Haftmittel brauchbar. Wirksame UV-Stabilisatoren umfassen z. B. p- Aminobenzoesäure.
  • Zur antiviralen Anwendung bei Säugetieren werden die erfindungsgemäßen Verbindungen parenteral verabreicht, wie intravenös, intraarteriell, intramuskulär, subkutan oder, bei Anwendung als Krebsmedikament, intratumoral. Der bevorzugte Verabreichungsweg für die antivirale Therapie ist intravenöse Injektion. Die erfindungsgemäßen Verbindungen können Säugetieren in sehr niedrigen Konzentrationen verabreicht werden. Die tatsächlich verabreichte Dosis kann berücksichtigen: Größe und Gewicht des Patienten; ob die Behandlung prophylaktischer oder therapeutischer Art ist; Alter, Gesundheit und Geschlecht des Patienten; den Verabreichungsweg, die Art und das Stadium der Erkrankung und andere Faktoren. Basierend auf in vivo-Untersuchungen mit anderen 2-5A- Analoga ist eine wirksame Tagesdosis des Wirkstoffs zwischen etwa 0,25 g bis etwa 2,5 g je 70 kg Körpergewicht (angenähert 152 lbs). Die bevorzugte Tagesdosis ist etwa 0,5 g je 70 kg Körpergewicht. Der Fachmann sollte leicht in der Lage sein, angemessene Dosierungen und Verabreichungspläne abzuleiten, um den besonderen Verhältnissen und Bedürfnissen des Patienten zu entsprechen.
  • Es wird erwartet, daß ein wirksamer Behandlungsplan die Verabreichung der Tagesdosis über zwei Tage umfaßt. Die Behandlung wird zumindest fortgesetzt, bis der Krankheitszustand wesentlich gemildert ist.
  • Bevorzugt wird das Ende der Therapie durch Test auf fortgesetzte Anwesenheit von viraler DNS festgelegt. Solche Tests können durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ausgeführt werden, bei der die Anwesenheit von viraler DNA nach herkömmlicher PCR bestimmt wird. PCR-Primer mit angemessener Nukleotidsequenz zur Vervielfältigung der viralen DNS können aus bekannten viralen Nukleotidsequenzen hergestellt werden. Um DNS zum Testen zu erhalten, werden periphere Monozyten des Patienten mit einem geeigneten Lysemittel, wie NP-40, lysiert.
  • Alternativ kann die Prüfung auf fortdauernde Anwesenheit des Virus durch einen Antigen-Antikörper-Test unter Verwendung eines der bekannten monoklonalen oder polyklonalen Antisera gegen ein Hüllprotein-Antigen des Zielvirus ausgeführt werden. Beispielsweise kann ein Antigen-Antikörper-Test zum Nachweis eines der Proteinantigene in der Proteinhülle des HIV eingesetzt werden, beispielsweise des gp120, p17 oder p24. Das Zielantigen ist darüber hinaus nicht bloß auf die Hüllproteinantigene beschränkt. Antisera können auf ein geeignetes Nichthüllen-Proteinantigen ausgerichtet werden, wie das Molekül der reversen Transkriptase (RT) des HIV. Monoklonale Antikörper für HIV-RT sind bekannt. Sobol et al., Biochemistry 30, 10623-10631 (1991).
  • Außerdem könnte die Prüfung auf Anwesenheit des infizierenden Virus während oder nach der Behandlung durch einen Test erfolgen, der die virale Beladung im Blutstrom des Patienten beurteilt. Dies kann durch Bestimmung des Ausmaßes der Synzytiabildung, z. B. durch Messung der Bildung von viralen Teilchen, ausgeführt werden. Siehe das bei Henderson et al., Virology 182, 186-198 (1994) umrissenen Verfahren.
  • Zusätzlich zur Verabreichung mit herkömmlichen Trägern können die erfindungsgemäßen Verbindungen mittels einer Vielzahl spezieller Techniken zur Abgabe von Oligonukleotiden und Nukleinsäuren verabreicht werden. 2-5A und seine Analoga wurden erfolgreich in verschiedene Verkapselungsmaterialien, wie in unilamellare Liposomen, eingekapselt und mit Hilfe monoklonaler Antikörper in Zellen eingeführt, Bayard et al., Eur. J. Biochem. 151, 319-325 (1985). Wiederaufgebaute Hüllen des Sendaivirus wurden erfolgreich zur Einführung von RNS und DNS in Zellen verwendet, Arad et al.; Biochem. Biophys. Acta 859, 88-94 (1986). Auch ist die Virushülle nicht auf den Sendaivirus beschränkt, sondern kann Verkapselung in jedes retrovirale amphotrophe Teilchen umfassen.
  • Beispielsweise könnte eine HIV-Hülle aus jedem Teil oder aus der gesamten äußeren Proteinhülle eines nicht-infektiösen HIV-Teilchens gebildet werden. Solche Teilchen wie gp120 können mittels bekannter Rekombinationstechniken geklont werden. Diese Techniken können zur Einführung der vorliegenden 2',5'-Phosphorthioat/Phosphodiesteroligoadenylate in Zellen benutzt werden. Es wird weiter erwogen, daß die erfindungsgemäßen Verbindungen als Prodrugs verabreicht werden, in denen lipophile Gruppen beispielsweise an die 5'- terminale Hydroxylgruppe der Kernverbindung gebunden sind.
    • Konjugation der 2',5'-Phosphorthioattetrameradenylate
  • Die erfindungsgemäßen 2',5'-Phosphorthioat/Phosphodiestertetramere können mit dem Träger Poly(L-Lysin) konjugiert werden. Poly(L-Lysin) hat sich als wirksamer Vektor für das Einschleusen von 2',5'-Oligoadenylaten und Analoga in intakte Zellen erwiesen. Bayard et al., Biochemistry 25, 3730- 3736 (1986). Konjugation von Poly(L-Lysin) an Trimermoleküle ist wegen der Zerstörung der 2'-terminalen Ribosylgruppe und nachfolgender Inaktivierung des Moleküls nicht möglich. Konjugation an Poly(L-Lysin) ermöglicht wirksamen intrazellulären Transport der erfindungsgemäßen Phosphorthioat/Phosphodiesteroligoadenylate, indem sie die für gute biologische Aktivität als notwendig geltende Trimergruppe innerhalb des Konjugats intakt hält.
  • Die Konjugate werden gebildet, indem zwei Aldehydfunktionen durch Periodatoxidation der alpha-Glykolgruppe des Riboserests am 2'-Ende des Tetramers eingeführt werden. Die entstandenen Aldehydgruppen werden dann zufällig mit den epsilon-Aminogruppen der Lysinreste des Poly-L-Lysins durch Bildung von Schiff-Basen gekoppelt und dann mit Natriumcyanoborhydrid bei pH 8,0 reduziert. Dieses Verfahren wandelt den 2',3'-terminalen Ribosering in eine Morpholinstruktur um. Das Poly(L-Lysin)peptid enthält vorzugsweise etwa 60 bis etwa 70 Lysinreste. Etwa 5 bis etwa 10 der Lysinreste werden auf diese Art an die Tetrameranteile gekoppelt. Die entstehenden 2',5'-Phosphorthioat/Phosphodiester/Poly(L-Lysin)- Konjugate können dann durch Gelfiltrationschromatographie auf einer Sephadex G-50-Säule isoliert werden.
  • Die 2',5'-Phosphorthioat/Phosphodiesteroligoadenylat-Poly-L- Lysin-Konjugate haben die Formel:
  • worin q eine ganze Zahl von etwa 60 bis etwa 70 und jedes R unabhängig R' oder
  • ist.
  • Etwa fünf bis etwa 10 der Gruppen R umfassen R'. Die Gruppe R' hat folgende Formel:
  • wobei m 0, 1, 2 oder 3 ist; und wobei R&sub3;, R&sub4; und R&sub5; unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Sauerstoff und Schwefel, vorausgesetzt, daß nicht sämtliche R&sub3;, R&sub4; und R&sub5; Sauerstoff sind, und des Weiteren vorausgesetzt, daß nicht sämtliche R&sub3;, R&sub4; und R&sub5; Schwefel sind.
  • Die Konjugate können vorteilhaft nach der Vorschrift von Bayard et al., Biochemistry 25, 3730-3736 (1986) hergestellt werden.
    • Beispiel 7 Herstellung von Poly(L-Lysin)/2',5'-Phosphorthioat/Phosphodiester-Oligoadenylat-Konjugaten
  • Ein 4 pl-Aliquot von Natriummetaperiodat (0,6 umolin 0,1 mol/l Natriumacetatpuffer, pH 4,75) wird zu einer eiskalten Lösung von 2',5'Phosphorthioat/Phosphodiestertetrameradenylat in 400 ul destilliertem Wasser zugegeben. Das Reaktionsgemisch wird auf Eis 30 min lang gerührt; 400 ul Poly(L-Lysin) (0,14 umol in 0,2 mol/l Phosphatpuffer, pH 8,0) und 200 ul Natriumcyanoborhydrid (20 umol in 0,2 mol/l Phosphatpuffer, pH 8,0) werden zugesetzt. Das Gemisch wird 2 h bei RT inkubiert und dann auf eine Sephadex G-50-Säule, die mit 0,1 mol/l Natriumacetatpuffer, pH 4,75, äquilibriert war, aufgetragen. Jede Fraktion wird nach dem Verfahren von Lowry et al., J. Biol. Chem. 193, 265-275 (1951), und durch Extinktion bei 260 nm auf ihren Gehalt an Phosphorthioat/Phosphodiester-Oligoadenylat/Poly-L-Lysin geprüft.
  • Die Konjugation des 2',5'-Phosphorthioat/Phosphodiestertetramers an Poly(L-Lysin) läßt die verbleibenden drei 2',5'-verbundenen Phosphorthioat/Phosphodiesteradenylylreste intakt zur optimalen RNase L-Bindung und -Aktivierung.
    • Liposom-Verkapselung von 2',5'-Phosphorthioat/Phosphodiester-Oligoadenylaten
  • Die Verkapselung der erfindungsgemäßen Verbindungen umfaßt ein anderes attraktives und zerstörungsfreies Verfahren zur Einführung in die Zelle. Die Liposom-Verkapselung kann vorteilhaft nach der von Kondorosi et al., FEBS Lett. 120, 37- 40 (1980) beschriebenen Technik erreicht werden.
    • Beispiel 8 Herstellung von großen unilamellaren, mit 2',5'-Phosphorthioat/Phosphodiester-Oligoadenylaten gefüllten Bläschen (Liposomen)
  • Kurz gesagt wird ein Phospholipidgemisch aus Rinderhirn (Sigma Chemical Co., Folch-Fraktion III bestehend aus 80- 85% Phosphatidylserin und zu den verbleibenden 15% aus anderen Hirnlipiden; 35 mg) in 5 ml Puffer A (0,1 mol/l NaCl, 2 mmol/l Histidin, 2 mmol/l N-Tris-hydroxymethyl-methyl-2- aminoethansulfonsäure ("TES"), 0,4 mmol/l EDTA, pH 7,4) mit einem Schnellmischer suspendiert. Die Mischung wird unter Stickstoff bei 0ºC 10 min mit Ultraschall behandelt. Die Suspension wird 1 h weiter bei 37ºC inkubiert, nachdem die Endkonzentration an Ca&spplus;&spplus; durch Zusatz von 125 ul CaCl&sub2;, 800 mmol/l, auf 20 mmol/l eingestellt wurde. Der entstandene Niederschlag wird durch Zentrifugieren sedimentiert (2500 · g, 10 min), schnellgemischt und mit 100 ul 1 2',5'-Phosphorthioat/Phosphodiester-Oligoadenylat, 1 · 10&supmin;&sup4; mol/l, gelöst in phosphatgepufferter Kochsalzlösung, gemischt. Die Endkonzentration der EDTA wird dann durch Zusatz von 400 ul 1 Puffer B (150 mmol/l EDTA, pH 7,4, 0,1 mol/l NaCl, 2 mmol/l Histidin, 2 mmol/l TES) auf 120 mmol/l eingestellt. Nach 30 min Inkubieren dieses Gemischs bei 37ºC bilden sich Liposomen. Der Überschuß der EDTA und die nicht verkapselten Bestandteile werden entfernt, indem die Liposomen durch eine Sephadex G-25-Säule geführt werden, die mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung äquilibriert ist. Etwa 10% des 2',5'-Phosphorthioat/Phosphodiesteroligoadenylats ist durch dieses Vorgehen in Liposomen verkapselt. Die Liposomsuspension ist bei 4ºC eine Woche nach Herstellung stabil.
    • Herstellung von 2',5'-Phosphorthioat/Phosphodiesteroligoadenylat enthaltenden wiederaufgebauten Sendaivirus-Hüllen
  • Wiederaufgebaute Sendaivirus-Hüllen können als wirksame Vehikel für die Einführung von Polynukleotiden in Zellen verwendet werden. Arad et al., Biochimica et Biophysica Acta 859, 88-94 (1986), offenbaren die Einführung von Poly(I) Poly(C) in kultivierte Zellen durch Anwendung von wiederaufgebauten Sendaivirus-Hüllen. Fusion der vorgenannten wiederaufgebauten Sendaivirus-Hüllen führt zur Einbringung der eingeschlossenen Makromoleküle in das Zytoplasma der empfangenden Zelle. Wiederaufgebaute Sendaivirus-Hüllen können durch Solubilisierung von intakten Sendaivirusteilchen mit einem Detergens erhalten werden. Die wiederaufgebauten Hüllen sind fusogene Vesikel, die aus den Phospholipiden der viralen Hülle und ihren Glycoproteinen bestehen und frei von der viralen Genom-RNS sind.
  • Die Inkorporierung der erfindungsgemäßen Verbindungen in wiederaufgebaute Sendaivirus-Hüllen zur fusionsvermittelten Mikroinjektion kann nach der Vorschrift von Arad et al., Biochimica et Biophysica Acta 859, 88-94 (1986), erreicht werden. Kurz gesagt wird ein Pellet aus Sendaivirusteilchen (1,5 mg Protein) in 30 ul einer Lösung gelöst, die 10% Triton X-100, 100 mmol/l NaCl, 50 mmol/l TRIS-HCl (pH 7,4) und 0,1 mmol/l Phenylmethylsulfonylfluorid enthält (Verhältnis Triton X-100: Protein = 2 : 1, w/w). Zu dem nach Zentrifugieren erhaltenen klaren Überstand wird 2',5'-Phosphorthioat/Phosphodiesteroligoadenylat, gelöst in einer Lösung A (160 mmol/l NaCl, 20 mmol/l TRIS-HCl (pH 7,4)), zugegeben, so daß sich eine Endkonzentration des aktiven Bestandteils von 5-20 mg/ml und ein Endvolumen von 150 ul ergibt. Triton X-100 wird aus dem Überstand durch direkte Zugabe von 20 mg SM-2 Bio-Beads entfernt. Die erhaltene trübe Suspension (enthaltend die wiederaufgebauten Sendaiviruss-Hüllen) wird bei 100.000 · g 1 h lang zentrifugiert. Das Pellet mit etwa 10% des ursprünglichen Virusproteins wird dann in Lösung A suspendiert und ergibt eine Endkonzentration von 25 ug/ml Protein.
  • Alle hinsichtlich synthetischer, präparativer und analytischer Verfahren zitierten Literaturstellen sind durch Zitat in die Beschreibung aufgenommen.

Claims (16)

1. Verbindung gemäß der Formel:
wobei m 0, 1, 2 oder 3 ist; n und q sind ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus 0 und 1, vorausgesetzt, dass n und q nicht beide 0 sind; und wobei R, R&sub1; und R&sub2; unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Sauerstoff und Schwefel, vorausgesetzt, dass nicht sämtliche R, R&sub1; und R&sub2; Sauerstoff sind, und des Weiteren vorausgesetzt, dass nicht sämtliche R, R&sub1; und R&sub2; Schwefel sind; oder ein wasserlösliches Salz derselben, zur Verwendung in der Medizin.
2. Verbindung nach Anspruch 1, wobei m 1 ist, zur Verwendung in der Medizin.
3. Verbindung nach Anspruch 1, wobei m 0 ist, zur Verwendung in der Medizin.
4. Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei n 0 ist und q 1 ist, zur Verwendung in der Medizin.
5. Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei n 1 ist und q 1 ist, zur Verwendung in der Medizin.
6. Verbindung nach Anspruch 5, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Adenylyl-(2",5")-adenylyl-(2',5")-P-thioadenylyl-(2",5')-adenosin, die 5"-Mono-, Di-, und Triphosphate desselben, und wasserlösliche Salze von einem beliebigen von diesen, zur Verwendung in der Medizin.
7. Verbindung nach Anspruch 4 oder 5, wobei R&sub2; Schwefel ist, zur Verwendung in der Medizin.
8. Verbindung nach Anspruch 7 ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus
Adenylyl-(2',5')-P-thioadenylyl-(2',5')-adenosin,
Adenylyl-(2',5')-P-thioadenylyl-(2',5')-adenylyl-(2',5')- adenosin,
Adenylyl-(2'5')-P-thioadenylyl-(2',5')-P-thioadenylyl- (2',5')-adenosin,
die 5'-Mono-, Di- und Triphosphate derselben, und wasserlösliche Salze von einem beliebigen von diesen, zur Verwendung in der Medizin.
9. Isoliertes optisches Isomer nach einem der Ansprüche 1 bis 8, oder wasserlösliches Salz eines derartigen isolierten optischen Isomers, zur Verwendung in der Medizin.
10. Isomer nach Anspruch 9 mit einer oder zwei Internucleotid- Phosphorothioat-Gruppen
wobei wenigstens eine derselben die PR-Konfiguration aufweist, zur Verwendung in der Medizin.
11. Isomer nach Anspruch 10 ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus
Adenylyl-(2',5')-adenylyl-(2'5')-(PR)-P-thioadenylyl- (2'5')-adenosin,
Adenylyl-(2',5')-adenylyl-(2',5')-(PS)-P-thioadenylyl- (2',5')-adenosin,
den 5'Mono-, Di- und Triphosphaten derselben, und wasserlösliche Salze von einem beliebigen von diesen, zur Verwendung in der Medizin.
12. Isomer nach Anspruch 10 ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus
Adenylyl-(2',5')-(PR)-P-thioadenylyl-(2',5')-adenosin,
Adenylyl-(2',5')-(PS)-P-thioadenylyl-(2',5')adenosin,
Adenylyl-(2',5')-(PR)-P-thioadenylyl-(2',5')-adenylyl- (2',5')-adenosin,
Adenylyl-(2',5')-(PS)-P-thioadenylyl-(2',5')-adenylyl- (2',5')-adenosin,
den 5'Mono-, Di- und Triphosphaten derselben, und wasserlösliche Salze von irgendeinem von diesen, zur Verwendung in der Medizin.
13. Pharmazeutische Zusammensetzung enthaltend einen pharmazeutischen Träger und Verbindung oder Isomer nach einem der Ansprüche 1 bis 12.
14. Verwendung einer Verbindung oder eines Isomers nach einem der Ansprüche 1 bis 12 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung einer viralen Infektion in Säugetieren.
15. Konjugat von Poly(L-Lysin) und einem 2'-5'Phosphorothioat/Phosphodiester-Oligoadenylat, wobei das Konjugat die folgende Formel aufweist
wobei q eine ganze Zahl von ungefähr 60 bis ungefähr 70 ist und jedes R unabhängig voneinander R' oder
ist, vorausgesetzt, dass ungefähr 5 bis ungefähr 10 der R- Gruppen R' sind, wobei R' die folgende Formel aufweist
wobei m 0, 1, 2 oder 3 ist; und wobei R&sub3;, R&sub4; und R&sub5; unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Sauerstoff und Schwefel, vorausgesetzt, dass nicht sämtliche R&sub3;, R&sub4; und R&sub5; Sauerstoff sind, und des Weiteren vorausgesetzt, dass nicht sämtliche R&sub3;, R&sub4; und R&sub5; Schwefel sind, zur Verwendung in der Medizin.
16. Verwendung eines Konjugats nach Anspruch 15 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung einer viralen Infektion in einem Säugetier.
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