DE3855135T2

DE3855135T2 - 2',5'-phosphorothioat-oligoadenylate und deren antivirale verwendungen

Info

Publication number: DE3855135T2
Application number: DE3855135T
Authority: DE
Inventors: Wolfgang Pfleiderer; Robert Suhadolnik
Original assignee: Temple University of Commonwealth System of Higher Education
Current assignee: Temple University of Commonwealth System of Higher Education
Priority date: 1987-10-22
Filing date: 1988-10-18
Publication date: 1996-09-05
Anticipated expiration: 2008-10-19
Also published as: JPH04500795A; EP0694559B1; US4924624A; WO1989003683A1; US5405939A; DE3856326D1; EP0389521A1; ATE135579T1; DE3855135D1; EP0694559A3; CA1339953C; JP2733777B2; EP0389521A4; EP0389521B1; US5556840A; EP0694559A2; ATE178902T1; DE3856326T2; AU2628088A

Description

Gebiet der Erfindung

Die Erfindung bezieht sich auf synthetische Analoga natürlich vorkommender antiviraler 2,',5'-Oligoadenylate, in denen die Internukleotid-Phosphodiesterbindungen durch optisch aktive Phosphorothioatgruppen ersetzt sind. Die Verbindungen haben eine erhöhte metabolische Stabilität, wenn die Stereokonfiguration an einem oder mehreren der chiralen Phosphoratome die Sp-Konfiguration ist.

Hinweis auf eine staatliche Unterstützung

Die hierin beschriebene Erfindung wurde zum Teil im Verlauf einer Arbeit gemacht, die von der Beihilfe der National Institutes of Health PO1 CA-29545 und der Beihilfe der National Science Foundation DMB84-15002 unterstützt wurde.

Hintergrund der Erfindung

Die vollständige Nomenklatur des Gegenstandes der vorliegenden Erfindung umfaßt äußerst lange Ausdrücke. Für den Fachmann ist es üblich, Oligoadenylatanaloga und verwandte Ausdrücke in einer ihm wohlbekannten Weise abzukürzen. Diese allgemeinen und gebräuchlichen Abkürzungen werden nachstehend hier angegeben und können im Text dieser Beschreibung benützt werden.

Abkürzungen:

2-5A, 2',5'-Oligoadenylat oder p&sub3;An: Oligomer aus Adenylsäure mit 2',5'-Phosphodiesterbindungen und einer 5'-terminalen Triphosphatgruppe.
A&sub2;, A&sub3; und A&sub4;: Dimer, Trimer und Tetramer aus Adenylsäure mit 2',5'-Phosphodiesterbindungen.
pA&sub3;, ppA&sub3; (oder p&sub2;A&sub3;), pppA&sub3; (oder p&sub3;A&sub3;): 5'-terminale
Mono-, Di- und Triphosphate von A&sub3;.
AMPS: Adenosin-5'-O-phosphorothioat.
SVDP: Schlangengift-Phosphodiesterase.
2'-PDE: 2'-Phosphodiesterase.
Rp: Die R-Stereokonfiguration am chiralen Phosphoratom in einer Phosphorothioat-Internukleotidbindung.
Sp: Die S-Stereokonfiguration am chiralen Phosphoratom in einer Phosphorothioat-Internukleotidbindung.
RNase L: 2-5A-abhängige Endoribonuklease.
ARpARpA: (Rp)-P-Thioadenylyl-(2'-5')-(Rp)-P-thioadenylyl(2'-5')-adenosin.
ASpARpA: (Sp)-P-Thioadenylyl-(2'-5')-(Rp)-P-thioadenylyl- (2'-5')-adenosin.
ARpASpA: (Rp)-P-Thioadenylyl-(2'-5')-(Sp)-P-thioadenylyl- (2'-5')-adenosin.
ASpASpA: (Sp)-P-Thioadenylyl-(2'-5')-(Sp)-P-thioadenylyl- (2'-5')-adenosin.
pARpARpA, ppARpARpA, pppRpARpA, pASpARpA, ppASpARpA, pppASpARpA, pARpASpA, ppARpASpA, pppARpASpA, pASpASpA, ppASpASpA und pppASpSSpA: 5'-Mono-, Di- und Triphosphate von ArpArpA, ASpARpA, ARpASpA und ASpASpA.
ARpARpARpA: (Rp)-P-Thioadenylyl-(2'-5')-(Rp)-P-thioadenylyl- (2'-5')-(Rp)-P-thioadenylyl-(2'-5')-adenosin.
ARpASpARpA: (Rp)-P-Thioadenylyl-(2'-5')-(Sp)-P-thioadenylyl- (2'-5')-(Rp)-P-thioadenylyl-(2'-5')-adenosin.
ARpARpASpA: (Rp)-P-Thioadenylyl-(2'-5')-(Rp)-P-thioadenylyl- (2'-5')-(Sp)-P-thioadenylyl-(2'-5')-adenosin.
ARpASpASpA: (Rp)-P-Thioadenylyl-(2'-5')-(Sp)-P-thioadenylyl- (2'-5')-(Sp)-P-thioadenylyl-(2'-5')-adenosin.
ASpARpARpA: (Sp)-P-Thioadenylyl-(2'-5')-(Rp)-P-thioadenylyl- (2'-5')-(Rp)-P-thioadenylyl-(2'-5')-adenosin.
ASpASpARpA: (Sp)-P-Thioadenylyl-(2'-5')-(Sp)-P-thioadenylyl- (2'-5')-(Rp)-P-thioadenylyl-(2'-5')-adenosin.
ASpARpASpA: (Sp)-P-Thioadenylyl-(2'-5')-(Rp)-P-thioadenylyl- (2'-5')-(Sp)-P-thioadenylyl-(2'-5')-adenosin.
ASpASpASpA: (Sp)-P-Thioadenylyl-(2'-5')-(Sp)-P-thioadenylyl- (2'-5')-(Sp)-P-thioadenylyl-(2'-5')-adenosin.
pARpARpARpA, ppARpARpARpA, pppARpARpARpA, pARpASpARpA, ppARpASpARpA, pppARpASpARpA, pARpARpASpA, ppARpARpASpA, pppARpARpASpA, pARpASpASpA, ppARpASpASpA, pppARpASpASpA, pASpARpARpA, ppASpARpARpA, pppASpARpARpA, pASpASpARpA, ppASpASpARpA, pppASpASpARpA, pASpARpASpA, ppASpARpASpA, pppASpARpASpA, pASpASpASpA, ppASpASpASpA, pppASpASpASpA: 5'-Mono-, Di - und Triphosphate der vorstehenden Tetrameren.
(Sp)-ATP-alpha-S: Adenosin-5'-O-(Sp)-(1-thiotriphosphat).

Hintergrund der Erfindung

Vom 2-5A-System wird weitverbreitet angenommen, daß es an der antiviralen Wirkungsweise von Interferon beteiligt ist und auch an der Regulierung des Zellwachstums und der Differenzierung beteiligt sein kann. Aus ATP durch 2'-5'- Oligoadenylatsynthetase [ATP: (2'-5'-oligo(A)-Adenyltransferase (EC 2.7.7.19)] synthetisiertes 2-5A übt seine biologischen Wirkungen durch Binden an und Aktivieren seines einzigen bekannten Zielenzyms, die einzige 2-5A- abhängige Endoribonuklease RNase L (EC 3.1.27), aus. RNase L spaltet Virus- und Zell-mRNA oder -rRNA, wodurch die Proteinsynthese gehemmt wird; Hovanessian et al., Eur. J. Biochem. 93:515-526 (1979); Kerr et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75:256-260 (1978). Es ist berichtet worden, daß 2-5A Pflanzengewebe vor der Infektion durch den Tabakmosaikvirus schützt; Devash et al., Science 216:415 (1982). 2-5A ist jedoch metabolisch instabil. Es wird durch Zell-2'-phosphodiesterase und Phosphatasen abgebaut; Knight et al., Meth. Enzymol. 79:216-227 (1981); Minks et al., Nucleic Acids Res. 6:767-780 (1979); Williams et al., Eur. J. Biochem. 92:455-462 (1978).
Die Literatur ist voll von strukturell modifizierten 2- 5A-Molekülen mit Änderungen an der Adenyl- oder Ribosylstruktureinheit, die zum Untersuchen der biologischen Rolle des 2-5A-Synthetase/RNase-L-Systems ausgelegt sind. Der hauptsächliche Ursprung der konformativen Beweglichkeit im 2-5A-Molekül liegt 3',5'-verknüpfter RNA und DNA ähnlich im Rückgrat; Srinivasan et al., Nucleic Acids Res. 13:5707-5716 (1985). Theoretische und experimentelle Analysen haben jedoch gezeigt, daß sich die Konformation 2',5'-verknüpfter Dinukleotide und von Polynukleotidketten von 3',5'-verknüpften Nukleotiden deutlich unterscheidet; id. Von dem Ribosephosphat-Rückgrat von 2-5A ist auch gezeigt worden, daß es in dem Molekül die hauptsächliche antigene Determinante ist; Johnston et al., Biochemistry 22:3453-3460 (1983).
Wenig Berichte sind über die Synthese von 2-5A-Analoga mit Rückgratänderungen erschienen. Methylphosphonat- und Methylphosphotriestergruppen enthaltende Kernanaloga sind synthetisiert worden; Eppstein et al., J. Biol. Chem. 257:13390-13397 (1982); Jager et al., Nucleic Acids Res. Sym. Ser. No. 9:149-152 (1981). Bei den "ungeladenen" Methylphosphotriesteranaloga wurde jedoch ein vollständiger Aktivitätsverlust beobachtet; Eppstein et al., oben. Der Ersatz der 2',5'-Phosphodiesterbindungen durch 3',5'- Bindungen hat ebenfalls zu einer wesentlichen Abnahme der biologischen Aktivität geführt; Lesiak et al., J. Biol. Chem. 258:13082-13088 (1983). Der Ersatz nur einer 2',5'- Internukleotidbindung hat zu Aktivitätsverlust von wenigstens einer Größenordnung geführt. Ein nahezu vollständiger Verlust der biologischen Aktivität wurde beobachtet, wenn in dem 2-5A-Trimer beide 2',5'-Phosphodiesterbindungen durch 3',5'-Bindungen ersetzt wurden.
Haugh et al., Eur. J. Biochem. 132:77-84 (1983), berichteten, daß die Affinität von pA&sub3; gegenüber RNase L in Maus-L929-Zellextrakten ungefähr 1000 Mal größer als die von A&sub3; ist.
Nelson et al., J. Org. Chem. 49:2314-2317 (1984), beschreiben Diastereomerenpaare des Phosphorothiatanalogons von A&sub3; ohne Trennung der einzelnen Enantiomeren. Eppstein et al., J. Biol. Chem. 261:5999-6003 (1986), berichten über die metabolischen Stabilitäten und die antivirale Aktivität angeblicher ARpARpA/ASpARpA- und ARpASpA/ASpASpA-Gemische ohne Trennung der einzelnen Enantiomeren.
Lee und Suhadolnik, Biochemistry 24:551-555 (1985), und Suhadolnik und Lee in "The 2-5A System: Molecular and Clinical Aspects of the Interferon-Regulator Pathway", Williams, B.R.G. und Silverman, R.H., Hrsg. (1985), Alan R. Liss, Inc., New York, S. 115-122, offenbaren die enzymatische Synthese von alpha-Phosphorothioat-5'-triphosphaten von ARpARpA und ARpARpARpA aus (Sp)-ATP-alpha-S. Derartige Verbindungen sind metabolisch instabil. Die Herstellung der entsprechenden Stereoisomeren mit Sp-Internukleotid-Phosphorothioatbindungen war aufgrund der Stereospezifität von 2-5A-Synthetase auf das Substrat (Sp)- ATP-alpha-S nicht möglich, welche unter Liefern von Trimer- und Tetramerprodukten, die 2',5'-Phosphorothioat- Internukleotidbindungen mit ausschließlich RP-Konfiguration enthalten, entgegengesetzt ist. Da Nukleosidtransferasen ausschließlich die entgegengesetzte Konfiguration liefern, wenn Sp-ATP-alpha-S das Substrat ist, können 2',5'-Phosphorothioatoligoadenylate, die Internukleotid- Phosphorothioatgruppen mit der Sp-Konfiguration enthalten, nicht enzymatisch synthetisiert werden.

Zusammenfassung der Erfindung

Zum Hemmen von Virusinfektionen in Säugern brauchbare Verbindungen der vorliegenden Erfindung besitzen eine erhöhte metabolische Stabilität und/oder antivirale Aktivität.
Die Verbindungen sind optische Isomere mit der Formel
welche im wesentlichen frei von einer Verunreinigung durch andere optische Isomere derselben Formel sind, worin m null, 1, 2 oder 3 ist, n 1 oder 2 ist und wenigstens eine Internukleotid-Phosphorothioatgruppe
die Sp-Konfiguration hat, und wasserlösliche Salze derselben.
Die Erfindung umfaßt auch ein Verfahren zum Bekämpfen einer Virusinfektion in Säugern oder Pflanzen durch Verabreichen einer antiviral wirksamen Menge einer Verbindung gemäß der vorstehenden Formel oder eines wasserlöslichen Salzes derselben und antivirale Zusammensetzungen, die derartige Verbindungen mit einem Träger enthalten.

Beschreibung der Figuren

Figur 1A stellt die Ergebnisse eines Radiobindungstestes dar, welcher die Fähigkeit von 2',5'-Phosphorothioat- Adenylattrimer-Kernen und 5'-Monophosphaten zum Konkurrieren mit p&sub3;A&sub4;[³²P]pCp um das Binden an die RNase L in L929-Zellextrakten anzeigt. Ungefähr 60% der Sonde wurden in Abwesenheit zugesetzten Oligonukleotids gebunden (Gesamt-dpm = 23000). Die Kurven sind wie folgt bezeichnet: A&sub3; (o); p&sub3;A&sub3; (x); pA&sub3; ( ); ARpARpA ( ); ASpARpA ( ); ARpASpA (Δ); ASpASpA ( ); pARpARpA ( ); pASpARpA ( ); pARpASpA ( ); pASpASpA ( ).
Fig. 1B stellt die Ergebnisse eines Kern-Cellulose-Tests dar, welche die Fähigkeit der 2',5'-Phosphorothioat- Adenylat-Trimer-Kerne und 5'-Monophosphate zum Aktivieren teilgereinigter RNase L aus L929-Zellextrakten unter Hydrolysieren des Substrats poly(U)-3'-[³²P]pCp anzeigen. Die Aktivierung von RNase L wurde durch Überführung von poly(U)-3'-[³²P]pCp in säurelösliche Fragmente bestimmt. 100% stellen 30000 cpm markiertes poly(U)-3'-[³²P]pCp dar, das an Glasfaserfilter gebunden ist. Die Kurven werden in derselben Weise wie Figur 1A bezeichnet.

Genaue Beschreibung der Erfindung

Die Aktivierung der einzigen 2-5A-abhängigen Endoribonuklease, RNase L, durch 2',5'-Oligoadenylate und ihre Hydrolyse von rRNA, tRNA und Zell- und Virus-mRNA ist bei der Hemmung der Virusreplikation und der Regulierung des Zellwachstums wichtig. Von RNase L ist bekannt, daß sie das Zielsubstrat für 2-5A ist. Sie ist eines der bedeutendsten funktionellen Enzyme der durch Interferon ausgelösten biologischen Kaskade. Wenn auch von modifizierten 2-5A-Analoga berichtet wurde, so sind sie metabolisch nicht stabil oder aktivieren RNase L nicht. Die Einführung der Phosphorothioatgruppe in die 2',5'-Internukleotid-Bindungen von 2-5A ruft physikalische, chemische und biologische Änderungen bei dem 2-5A-Molekül hervor, die (i) Rp/Sp-Chiralität, (ii) erniedrigten pKa, (iii) veränderte Metallionenchelatierung, (iv) Ladungsmodulation, (v) erhöhte Bindungslänge, (vi) veränderten Hydratationsgrad und (vii) erhöhte metabolische Stabilitäten einschließen.
Die metabolische Stabilität der 2',5'-Phosphorothioatoligoadenylate ist größer als die von authentischem 2-5A. Diese metabolische Stabilität ist stark erhöht, wo wenigstens eine Internukleotid-Phosphorothioat-2',5'-Bindung die Sp-Konfiguration hat. Obschon von racemischen Gemischen der Trimerkerne berichtet worden ist, Nelson et al., J. Org. Chem. 49:2314-2317 (1984), und Eppstein et al., J. Biol. Chem. 261:5999-6003, sind Versuche zum Trennen der Verbindungen fehlgeschlagen. Die Höhe der antiviralen Aktivität der von Eppstein et al. berichteten Trimerkernracemate ist solcherart, daß die zur Behandlung erforderlichen Dosierungen verboten toxisch wären. Wenigstens eines der angeblichen Racemate von Eppstein et al., das ARpASpA/ASpASpA-Racemat, ist von geringem Wert, da, wie wir gefunden haben, das ASpASpA-Stereoisomer selektiv RNase L inaktiviert, wodurch ARpASpA daran gehindert wird, seine antivirale Wirkung durch die Aktivierung von RNase L auszuüben. Dies ist äußerst unerwünscht, da, wie wir gefunden haben, ARpASpA das attraktivste der vier Trimerkernstereoisomeren ist, da es sowohl RNase L aktiviert als auch metabolisch stabil ist.
Wir waren beim Herstellen der vollständig getrennten 2',5'-Phosphorothioat-Adenylat-Trimerkerne erfolgreich, wodurch auf diese Weise die praktische Verwendung des wichtigen ARpASpA-Stereoisomers möglich gemacht wurde. Unser Verfahren der stereospezifischen chemischen Synthese macht auch die Herstellung der acht getrennten Stereoisomeren des 2',5'-Phosphorothioattetramers möglich. Die Herstellung der Tetramermoleküle ermöglicht die Konjugation mit dem Träger (poly)-L-Lysin, von dem gezeigt wurde, daß es ein wirkungsvoller Vektor zum Einführen von 2',5'-Oligoadenylaten und Analoga in unversehrte Zellen ist. Aufgrund der Zerstörung der 2'-terminalen Ribosyl- Struktureinheit und der nachfolgenden Inaktivierung des Moleküls ist die poly(L-Lysin)-Konjugation mit Trimermolekülen nicht möglich. Die Konjugation mit poly(L-Lysin) gestattet den wirksamen intrazellulären Transport der 2',5'-Phosphorothioatoligoadenylate, während die Trimer- Struktureinheit innerhalb des Konjugats unversehrt gehalten wird, was als für eine gute biologische Aktivität notwendig erachtet wird.
Die Korrelation der biologischen Eigenschaften mit der absoluten Konfiguration ist nur mit der Herstellung der hierin beschriebenen, vollständig getrennten 2',5'-Phosphorothioat-Adenylat-Trimerkerne möglich gewesen. Von den Trimerkernverbindungen ist jedoch gefunden worden, daß sie RNase L nur mäßig binden und/oder aktivieren. Wir haben gefunden, daß die RNase L-Aktivierung durch die 2',5'-Phosphorothioatkernmoleküle durch die 5'-Phosphorylierung bedeutend verstärkt wird.
Die RNase L-Aktivierung durch authentisches 2-5A erfordert die Triphosphatform des Trimers. Die 5'-Monophosphatform von 2-5A ist ein wirksamer Hemmer der RNase L- Aktivierungsaktivität des Triphosphats; Miyamoto et al., J. Biol. Chem. 258:15232-15237 (1983); Black et al., FEBS Let. 191:154-158 (1985); Torrence et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:5993-5997 (1981). Wir haben überraschenderweise gefunden, daß die Kerne und Monophosphate der vorliegenden Phosphorothioat-Analoga von 2-5A anders als authentisches 2-5A RNase L aktiviert.
Die Phosphorothioattrimerkerne ARpARpA, ARpASpA und ASpASpA werden chemisch synthetisiert und durch Dünnschichtchromatographie auf Kieselgel getrennt. Die vier Trimerkerne werden aus 6-N-Benzoyl-3'-O-tert-butyldimethylsilyl-5'-O-monomethoxytrityladenosin-2-O-(p-nitrophenylethyl)-octahydroazonino-phosphoramidit durch stereospezifische Synthese hergestellt, welche auf der Trennung der vollständig getrennten, geschützten Zwischenprodukte, gefolgt vom Entfernen aller Schutzgruppen unter Liefern der vollständig getrennten 2',5'-Phosphorothioattrimer-Adenylatkerne beruht.
Die Trimerkerne werden gemäß dem folgenden Reaktionsschema hergestellt, worin "BZ" den Benzoylrest bezeichnet, "Si" den tert-Butyldimethylsilylrest bezeichnet und "MMTr" den Monomethoxytritylrest bedeutet. Obschon die Herstellung der Dimerkern-Enantiomeren ARpA (6A) und ASpA (6B) kein Teil der Erfindung ist, ist sie der Vollständigkeit wegen enthalten.
Die Schutzgruppen werden aus den vollständig geschützten Zwischenprodukten 7A, 7B, 8A und 8B unter Liefern der entsprechenden vollständig gespaltenen Trimerkerne ARpARpA (9A), ASpARpA (9B), ARpASpA (10A) und ASpASpA (10B) entfernt:
Die Verbindungen der Erfindung werden vorteilhafterweise als lösliche Natrium-, Ammonium- oder Kaliumsalze hergestellt. Das Herstellungsschema beginnt mit 6-N-Benzoyl- 3'-O-tert-butyldimethylsilyl-5'-O-monomethoxytrityladenosin (Verbindung 1E), welches vorteilhafterweise aus Adenosin gemäß dem Verfahren von Flockerzi et al., Liebigs Ann. Chem., 1568-1585 (1981), hergestellt wird.
Die Herstellung der Verbindungen der vorliegenden Erfindung wird in größerer Einzelheit durch Bezug auf die folgenden, nicht beschränkenden Beispiele veranschaulicht. In den Beispielen verwendetes 3-Nitro-1,2,4-triazol, Chloroctahydroazonino-p-nitrophenylethoxyphosphat, 2,5- Dichlorphenylphosphoro-dichloridat und p-Nitrophenylethanol kann vorteilhafterweise nach veröffentlichten Verfahren hergestellt werden: Chattopadhyaya et al., Nucleic Acids Res. 8:2039-2053 (1980); Schwarz et al., Tetrahedron Lett. 5513-5516 (1984); Uhlmann et al., Helv. Chim. Acta 64:1688-1703 (1981). Diese Verbindungen sind in den Vereinigten Staaten auch im Handel erhältlich. 2,5-Dichlorphenylphosphorodichloridat kann von Fluka Chemical Corp., 980 S. Second St., Ronkonkoma, New York, 11779 ("Catalog 15: Chemika-Biochemika" 1986/1987, Nr. 36212) erhalten werden. 3-Nitro-1,2,4-triazol ist von Aldrich Chemical Co., Postfach 355, Milwaukee, WI 53201 (1986- 1987 Kat.nr. 24,179.2) erhältlich. p-Nitrophenylethanol ist von Fluka Chemical Corp. (Kat.nr. 73,610) erhältlich. Chloroctahydroazonino-p-nitrophenylethoxyphosphat kann gemäß dem nachstehenden Beispiel 1A hergestellt werden.
In den Beispielen verwendetes Pyridin und Triethylamin wurden durch Destillation über KOH, Tosylchlorid und Calciumhydrid gereinigt. Dichlormethan wurde über Calciumchlorid destilliert und anschließend durch basisches Aluminiumoxid geleitet. Reines Acetonitril wurde durch Destillation über Calciumhydrid erhalten.
Die Reinigung der geschützten Nukleotide wurde durch präparative Säulenchromatographie an Kieselgel 60 (0,063-0,2 mesh, Merck) und durch präparative Dickschichtchromatographie an Kieselgel 60 PF&sub2;&sub5;&sub4; (Merck) erreicht. Die Dünnschichtchromatographie ("DSC") wurde auf vorbeschichteten Dünnschichtfolien F 1500 LS 254 und Cellulosedünnschichtfolien F 1440 von Schleicher & Schuell durchgeführt.
Das Ausgangsmaterial, 6-N-Benzoyl-3-O-tert-butyldimethylsilyl-5'-O-(4-monomethoxytrityl)adenosin (Verbindung 1E) und das Reagenz 6-N-Benzoyl-2',3,-bis-O-(tert-butyldimethylsilyl)-adenosin (Verbindung 1G) werden gemäß Beispiel 1 hergestellt.

BEISPIEL 1

a. N&sup6;,N&sup6;,2',3',5'-O-Pentabenzoyladenosin:

(1A) Einer Suspension von 5,34 g (20 mMol) Adenosin (Sigma, 24 h bei 80ºC/10&supmin;³ Torr getrocknet) in 100 ml trockenem Pyridin wurden tropfenweise 33,74 g (240 mMol) Benzoylchlorid zugesetzt. Nach 20 h Rühren bei Raumtemperatur ("RT") wurde das Gemisch mit 16 ml trockenem MeOH behandelt und anschließend mit CHCl&sub3; (3 x 250 ml) extrahiert. Die organische Phase wurde mit Wasser (3 x 250 ml) gewaschen, über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet und zur Trockene eingedampft. Das letzte Eindampfen wurde zusammen mit Toluol ausgeführt. Der Rückstand wurde durch Erhitzen in CHCl&sub3;/MeOH 2/1 gelöst und nach Kühlen auf RT wurde Petrolether (Diethylether) zugesetzt, bis die Lösung trübe wurde. Nach 12 h Stehen bei 0ºC wurden 12,18 g erhalten und aus der Mutterlauge wurden 2,66 g Produkt als farblose Nadeln mit Schmp. 183-184ºC isoliert; Ausbeute 14,84 g (94%).

b. 6-N-Benzovladenosin (1B):

Eine Lösung von 7,88 g (10 mMol) des Pentabenzoyladenosins (1A) in 150 ml trockenem Pyridin und 50 ml trockenem MeOH wurde mit 50 ml 1 M Natriummethylatlösung behandelt. Nach 15 min wurde die Lösung auf eine eiskalte Lösung von 110 ml DOWEX-Ionenaustauscher 50 x 4 (Pyridiniumform) in ca. 20 ml Wasser gegossen. Nach 5 h Rühren war der pH 5,5-6,0. Nach Abfiltrieren vom Ionenaustauscher wurde der Rückstand mit siedendem MeOH/Wasser (3/1) gewaschen. Das Filtrat wurde zur Trokene eingedampft und aus MeOH/Wasser 2/1 unter Ergeben von 3,25 g (83%) Produkt als farblose Nadeln, Schmp. 151-153ºC, kristallisiert.

c. 6-N-Benzoyl-5'-O-(4-methoxytrityl)adenosin (1C):

17,9 g (46 mMol) 6-N-Benzoyladenosin H&sub2;O (1B) wurde mit trockenem Pyridin (3 x 100 ml) eingedampft und schließlich in 150 ml trockenem Pyridin und 21,31 g (69 mMol) p-Monomethoxytritylchlorid gelöst. Die Reaktionslösung wurde 14 h bei 50C gerührt und trockenes MeOH (50 ml) wurde zugesetzt und man ließ auf RT kommen. Das Produkt wurde mit CHCl&sub3; (3 x 400 ml) extrahiert und mit Wasser (3 x 400 ml) gewaschen. Die organische Phase wurde über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet und zur Trockene eingedampft. Das letzte Eindampfen wurde mit Toluol ausgeführt. Die Reinigung wurde mittels einer Kieselgelsäule (16 x 2,5 cm, Merck) ausgeführt und es wurde mit 3 Liter EtOAc/MeOH 7/3 unter Ergeben von 25,6 g (87%) eines amorphen Pulvers eluiert. Die Kristallisation wurde mit Aceton/Wasser unter Liefern des Produkts, Schmp. 120-125ºC, bewerkstelligt.

d. 6-N-Benzoyl-2'-O-(tert-butyldimethylsilyl)-5'-O-(4- methoxytrityl)adenosin (1D);

6-N-Benzoyl-3'-O-(tert-butyldimethylsilyl)-5'-O-(4- methoxytrityl)adenosin (1E);

6-N-Benzoyl-2',3'-O-bis(tert-butyldimethylsilyl)-5'-O-(4- methoxytrityl)adenosin (1F)

Einer Lösung von 4,05 g (26,9 mMol) tert-Butyldimethylsilylchlorid ("TBDMS-C1") und 3,66 g (53,8 mMol) Imidazol in 100 ml trockenem Pyridin wurden 14,42 g (22,4 mMol) Verbindung 1C zugesetzt, welche zuvor zusammen mit Pyridin eingedampft wurde. Nach 15 h Rühren bei RT wurden 5 ml trockenes MeOH zugesetzt und das Gemisch wurde auf 1/3 des Volumens eingedampft. Das Rohprodukt wurde mit CHCl&sub3; (3 x 250 ml) extrahiert und mit Wasser gewaschen. Nach dem Eindampfen wurde das Rohprodukt zuerst mit CH&sub2;Cl&sub2;/EtOAc (9/1) durch eine Kieselgelsäule (15 x 3 cm) gereinigt und nachfolgend mittels Mitteldruckchromatographie (Kieselgelsäule, GSF-Typ C (N = 9000, VD = 28 ml) bei 8-10 bar Druck mit den folgenden Gemischen aus CH&sub2;Cl&sub2;/Petrolether/EtOAc/EtOH mit zuerst 100:100:10:0,5 (2 Liter) zweitens 100/100/10/1 (3 Liter) und drittens 100/100/31/2 (0,5 Liter) gereinigt. Die Titelverbindungen wurden isoliert. Die Retentionszeit der Peakmaxima war für jede Verbindung wie folgt: 25 min für Verbindung 1F (Ausbeute 1,84 g, 9%); 60 min für Verbindung 1D (Ausbeute 6,62 g, 39%); 105 min für Verbindung 1E (Ausbeute 8,32 g, 49%

e. 6-N-Benzoyl-2',3'-bis-O-(tert-butyldimethylsilyl)adenosin (3):

1,74 g (2 mMol) Verbindung (1F) wurden mit 20 ml 80%iger Essigsäure bei 22ºC gerührt. Nach 20 h war die Spaltung der Monomethoxytritylgruppe vollständig. Das Reaktionsgemisch wurde mit CHCl&sub3; (3 x 200 ml) extrahiert und mit 200 ml 1 M Phosphatpuffer (pH 7) gewaschen. Die organische Phase wurde über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet und zur Trockene eingedampft. Die Reinigung wurde mittels einer Kieselgelsäule (2 x 10 cm) und Eluieren mit CH&sub2;Cl&sub2;/MeOH (96/4) bewerkstelligt. Das hellgelbe Produkt wurde in 5 ml CHCl&sub3; gelöst und bis zur Trübung mit Et&sub2;O behandelt. Es kristallisierten 0,982 g reines Produkt aus. Das reine Produkt kristallisierte aus der Mutterlauge erneut aus; 0,11 g, Schmp. 189ºC. Die Gesamtausbeute war 1,092 g (91%).

BEISPIEL 1A

Chloroctahydroazonino-p-nitrophenylethoxyphosphat

a. p-Nitrophenylphosphorsäuredichlorid.

Phosphortrichlorid (Fluka, N.Y., #79690) (28 ml, 0,317 Mol) werden 80 ml wasserfreier Ether zugesetzt. Das Gemisch wird auf -30ºC gekühlt. p-Nitrophenylethanol (8,35 g, 50 mMol) wird zugesetzt, gefolgt von 1,5 h Rühren. Ether und überschüssiges PCl&sub3; werden im Vakuum unter Liefern von p-Nitrophenylphosphorsäuredichlorid (Ausbeute 80%) entfernt.

b. Octahydroazonin.

Caprylolactam (Fluka, N.Y., #21631) (25 g, 117 mMol) wird mit Lithiumaluminiumhydrid (10,5 g) in Ether vereinigt und 5 h unter Rühren reduziert. Das Reaktionsgemisch wird filtriert und mit Ether eingedampft. Das Produkt ist Octahydroazonin (90% Ausbeute).

c. 1-Trimethylsilyloctahydroazonin.

Das Silylamin von Octahydroazonin wird durch Vereinigen von Octahydroazonin (12,7 g, 0,1 Mol) und Trimethylsilan (0,12 Mol) und 0,5 Mol Hexamethyldisilazan + 150 mg Ammoniumsulfat hergestellt. Das Gemisch wird 90 h unter Rückfluß erhitzt und im Vakuum unter Liefern von 16,5 g 1-Trimethylsilyloctahydroazonin (82%) destilliert.

d. Chloroctahydroazonino-p-nitrophenylethoxyphosphat.

p-Nitrophenylphosphorsäuredichlorid (26,8 g, 100 mMol) und 1-Trimethylsilyloctahydroazonin (19,9 g, 100 mMol) werden unter Stickstoff bei 0ºC vereinigt. Das Gemisch wird auf Raumtemperatur erwärmt und 2-3 h gerührt. Trimethylsilyldichlorid wird im Vakuum entfernt. Das Produkt im Rückstand ist Chloroctahydroazonino-p-nitrophenylethoxyphosphat (33,9 g, 94% Ausbeute)

BEISPIEL 2

6-N-Benzoyl-3'-O-tert-butyldimethylsilyl-5'-O-(4- methoxytrityl)-adenosin-2'-O-(p-nitrophenylethyl)-octahydroazoninophosphoramidit (2).

Verbindung 1E (0,758 g, 1,0 mMol) und Diisopropylethylamin (0,52 g, 4 mMol) wurden in Dichlormethan (5 ml) gelöst und Chloroctahydroazonino-p- nitrophenylethoxyphosphan (0,80 g, 2,22 mMol) wurde tropfenweise zugesetzt. Nach 2 h Rühren bei RT zeigte die DSC den Abschluß der Reaktion an. Das Reaktionsgemisch wurde mittels gesättigtem wäßrigem NaHCO&sub3; (50 ml) in einen Tropftrichter überführt und das Produkt wurde durch Extraktion mit Essigsäureethylester (2 x 50 ml) isoliert. Die organische Schicht wurde mit gesättigtem NaCl gewaschen, getrocknet (Na&sub2;SO&sub4;) und zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wurde in Essigsäureethylester-Triethylamin (95:5 Vol./Vol.) gelöst, an einer Kieselgelsäule (10 x 2 cm) chromatographiert, die zuvor mit Essigsäureethylester-Triethylamin (9/1) kalibriert worden war, und mit Essigsäureethylester-Triethylamin (95:5 Vol./Vol.) eluiert. Die Produktfraktionen wurden gesammelt, zur Trockene eingedampft, schließlich zusammen mit Dichlormethan eingedampft und im Vakuum bei 40ºC unter Ergeben von Verbindung 2 (1,05 g, 97%) getrocknet [Anal. ber. für C&sub5;&sub9;H&sub7;&sub0;N&sub7;O&sub9;PSi 1H&sub2;O: C 64,52; H 6,60; N 8,92. Gefunden: 63,93; H 6,85; N 8,62].

BEISPIEL 3

6-N-Benzoyl-3'-O-tert-butyldimethylsilyl-5'-O-(4- methoxytrityl)-P-thioadenylyl-2'-[OP-(p-nitrophenylethyl)- 5,]-6-N-benzoyl-2',3'-di-O-tert-butyldimethylsilyladenosin (4A + 4B).

Das Phosphoramidit 2 (1,12 g, 1,0 mMol) und 6-N-Benzoyl- 2',3'-di-tert-butyldimethylsilyladenosin (3) (0,478 g, 0,7 mMol) wurden über Nacht im Vakuum in einer Trockenpistole bei 40ºC getrocknet. Der getrocknete Rückstand wurde anschließend in trockenem Acetonitril (6 ml) gelöst und 3-Nitro-1,2,4-triazol (0,285 g, 2,5 mMol) wurde zugesetzt und 3 h bei RT gerührt. Pyridin (6 ml) und Schwefel (0,5 g) wurden zugesetzt und nach 20 h Rühren bei RT wurde das Reaktionsgemisch mit Chloroform (300 ml) extrahiert. Die organische Phase wurde mit gesättigter NaCl- Lösung (2 x 200 ml) gewaschen, getrocknet (Na&sub2;SO&sub4;) und zur Trockene eingedampft. Das letzte Eindampfen wurde zum Entfernen von Pyridin mit Toluol ausgeführt. Der Rückstand wurde in Chloroform gelöst und an einer Kieselgelsäule (15 x 2,5 cm) mit 1 Liter Chloroform unter Ergeben einer Produktfraktion chromatographiert, die sowohl das Rp- als auch das Sp-Isomer enthielt. Die Trennung der Diastereomeren wurde auf präparativen Kieselgelplatten mittels Dichlormethan/Essigsäureethylester/n-Hexan (1:1:1 Vol./Vol) durchgeführt. Die Platten wurden dreimal entwickelt. Das Isomer mit dem höheren Rf (0,47 g; 42%, DSC in Dichlormethan/Essigsäureethylester/n-Hexan, 1:1:1, 0,54) und das Isomer mit dem niedrigeren Rf (0,31 g; 28%, DSC in Dichlormethan/Essigsäureethylester/n-Hexan, 0,46) wurden nach dem Trocknen bei 40C im Vakuum als farblose amorphe Pulver erhalten. Das Isomer mit dem höheren Rf war Verbindung 4A. [Anal. ber. für C&sub8;&sub0;H&sub9;&sub8;N&sub1;&sub0;O&sub1;&sub4;PSi&sub3; 1H&sub2;O: C 59,89; H 6,32; N 9,61. Gefunden: C 59,89; H 6,32; N 9,21]. ³¹P-NMR (400 MHz, CDCl&sub3;, 85% H&sub3;PO&sub4;, 69,841 ppm). Das Isomer mit dem niedrigeren Rf war Verbindung 4B. [Anal. ber. für C&sub8;&sub0;H&sub9;&sub8;N&sub1;&sub0;O&sub1;&sub4;PSi&sub3;S 1H&sub2;O: C 59,89; H 6,28; N 9,61. Gefunden: C 59,91; H 4,61; N 9,28]. ³¹P- NMR (400 MHz, CDCl&sub3;, 85% H&sub3;PO&sub4;, 69,223 ppm).

BEISPIEL 4

6-N-Benzoyl-3'-O-tert-butyldimethylsilyl-P-thioadenylyl- 2'-[OP-(p-nitrophenylethyl)-5']-6-N-benzoyl-2',3'-di-O- tert-butyldimethylsilyladenosin (5A + 5B).

0,258 g (0,164 mMol) reine Isomere 4A und 4B wurden durch 40 min Behandlung bei RT mit jeweils 2% p-Toluolsulfonsäure in Dichlormethan/Methanol (4/1) (3,2 ml) getrennt detrityliert. Das Reaktionsgemisch wurde mit Chloroform (50 ml) verdünnt, mit Phosphatpuffer, pH 7, (2 x 20 ml) gewaschen und zu einem Schaum eingedampft. Der Rückstand wurde durch Kieselgel-Säulenchromatographie (10 x 2,5 cm) gereinigt. Verbindung 5A und 5B wurden an der Säule durch Verwenden von Chloroform und Chloroform/Methanol (100:0,5 bis 100:1) getrennt. Die Produktfraktionen wurden gesammelt und nach dem Eindampfen im Vakuum bei 40ºC unter Ergeben im Falle von 5A von 0,198 g (92%) und im Falle von 5B von 0,192 g (89%) getrocknet. 5A hat einen Rf von 0,27 in Dichlormethan/Essigsäureethylester/n-Hexan (1:1:1). [Anal. ber. für C&sub6;&sub0;H&sub8;&sub2;N&sub1;&sub1;O&sub1;&sub3;PSi&sub3;S 1H&sub2;O: C 54,15; H 6,36; N 11,57. Gefunden: C 53,78; H 6,44; N 11,72]. 5B hat im selben System einen Rf von 0,30. [Anal. ber. für C&sub6;&sub0;H&sub8;&sub2;N&sub1;&sub1;O&sub1;&sub3;PSi&sub3;S: C 54,90; H 6,29; N 11,73. Gefunden: C 54,90; H 6,20; N 11,45].

BEISPIEL 5

P-Thioadenylyl-(2'-5')-adenosin (6A + 6B).

Die vollständig geschützten Dimeren 5A beziehungsweise 5B wurden durch das folgende Verfahren getrennt entschützt. Jedes geschützte Dimer (39 mg, 0,03 mMol) wurde mit 0,5 M 1,8- Diazabicyclo[5.4.0]undec-7-en(1,5,5) (Fluka, Kat.nr. 33842, "DBU") in Pyridin (9 ml) behandelt und wurde nach 2 h Rühren bei RT mit 1 M Essigsäure (4,5 ml) neutralisiert und schließlich eingedampft. Der Rückstand wurde in 1 M Tetrabutylammoniumfluorid ("Bu&sub4;NF") in Tetrahydrofuran ("THF") aufgenommen und wurde nach 24 h erneut zur Trockene eingedampft. Die Entacylierung wurde durch 48 h Behandlung mit konz. Ammoniak (20 ml), gefolgt vom Eindampfen des Gemisches erreicht. Der Rückstand wurde anschließend in Wasser (50 ml) gelöst und mit Chloroform (2 x 20 ml) gewaschen. Die Wasserphase wurde zur Elution mit einem linearen Gradienten aus einem Puffer aus 0,001- 0,25 M Et&sub3;NH&spplus;HCO&sub3;-, pH 7,5, auf eine DEAE-Sephadex A-25- Säule (60 x 1 cm) aufgebracht. Das Produkt wurde bei einer Konzentration von 0,08-0,1 M eluiert. Eindampfen zur Trockene, gefolgt vom Eindampfen zusammen mit Wasser (10 x 10 ml) und Endreinigung durch Papierchromatographie mit i-PrOH/konz. Ammoniak/Wasser (7:1:2 Vol./Vol.) lieferte im Fall von 6A 630 OD-Einheiten (87,5%) und im Fall von 6B 648 OD-Einheiten (90%). Der Rf von 6A auf Cellulosefolie war unter Verwenden des vorstehenden Systems 0,29. Der Rf von 6B war 0,30.

BEISPIEL 6

6-N-Benzoyl-3'-O-tert-butyldimethylsilyl-5'-O-monomethoxytrityl-P-thioadenylyl-2'-[OP-(D-nitrophenylethyl)-5']- N-6-benzoyl-3'-O-tert-butyldimethylsilyl-P-thioadenylyl- 2'-[OP-(p-nitrophenylethyl)-5']-6-N-benzoyl-2',3'-bis-O- tert-butyldimethylsilyladenosin (7A, 7B und 8A, 8B).

Das Phosphitamid 2 (0,499 g; 0,41 mMol) wurde mit dem 5'-Hydroxydimer 5A und 5B (0,0262 g; 0,2 mMol) in Anwesenheit von 3-Nitro-1,2,4-triazol (0,114 g; 1,0 mMol) in trockenem Acetonitril (3,2 ml) getrennt kondensiert. Nach 3 h Rühren bei RT wurde Schwefel (0,2 g; 6,25 mMol) in Pyridin (0,4 ml) zur Oxidation zugesetzt. Nach weiteren 24 h Rühren bei RT wurde das Produkt mit Dichlormethan (50 ml) extrahiert, die organische Phase wurde mit gesättigter NaCl-Lösung (2 x 20 ml) gewaschen, getrocknet (Na&sub2;SO&sub4;) und anschließend zur Trockene eingedampft. Das letzte Eindampfen wurde zum Entfernen von Pyridin mit Toluol durchgeführt. Das Rohprodukt wurde an einer Kieselgelsäule (15 x 2 cm) chromatographiert und mit Chloroform/Methanol (100:2) unter Ergeben des Isomerengemisches 7A + 7B beim Kondensieren mit Verbindung 5A eluiert. Das Isomerengemisch 8A + 8B wurde beim Kondensieren des Phosphitamids 2 mit Verbindung 5B in derselben Weise erhalten. Die Diastereomerentrennung jedes Isomerengemisches wurde mittels präparativer Kieselgelplatten (20 x 20 x 0,2 cm) bewerkstelligt, auf welche zur optimalen Trennung etwa 50 mg Isomerengemisch je Platte aufgetragen wurden. Die Platten wurden dreimal in Dichlormethan/Essigsäureethylester/n-Hexan (1:1:0,5 Vol./Vol) entwickelt. Die entsprechenden Banden wurde ausgeschnitten und mit Chloroform/Methanol (4:1) eluiert. Das aus 5A synthetisierte Isomer mit dem höheren Rf hatte in Dichlormethan/Essigsäureethylester/n-Hexan (1:1:1) einen Rf von 0,58 und lieferte 48% (0,218 g) 7A. [Anal. ber. für C&sub1;&sub1;&sub1;H&sub1;&sub3;&sub5;N&sub1;&sub7;O&sub2;&sub2;P&sub2;Si&sub4;S&sub2; 1H&sub2;O: C 57,56; H 5,96; N 10,28. Gefunden: C 57,38; H 5,99; N 10,11]. Das Isomer mit dem niedrigeren Rf hatte in dem vorgenannten System einen Rf von 0,48 und lieferte 34% (0,157 g) 7B. [Anal. ber. für C&sub1;&sub1;&sub1;H&sub1;&sub3;&sub5;N&sub1;&sub7;O&sub2;&sub2;P&sub2;Si&sub4;S&sub2; 1H&sub2;O: C 57,56; H 5,96; N 10,28. Gefunden: C 57,40; H 5,97; N 10,19].
Das aus dem 5'-Hydroxydimer 5B stammende Isomerengemisch wurde in derselben Weise aufgetrennt und lieferte das Isomer 8A mit dem höheren Rf zu 41% (0,186 g) mit einem Rf von 0,53 in dem vorstehenden Lösungsmittelsystem. [Anal. ber. für C&sub1;&sub1;&sub1;H&sub1;&sub3;&sub5;N&sub1;&sub7;O&sub2;&sub2;P&sub2;Si&sub4;S&sub2;: C 58,02; H 5,92; N 10,36. Gefunden: C 58,00; H 5,84; N 10,66]. Das Isomer 8B mit dem niedrigeren Rf zeigte einen Rf-Wert von 0,45 und lieferte 35% (0,161 g). [Anal. ber. für C&sub1;&sub1;&sub1;H&sub1;&sub3;&sub5;N&sub1;&sub7;O&sub2;&sub2;P&sub2;Si&sub4;S&sub2; 1H&sub2;O: C 57,56; H 5,96; N 10,28. Gefunden: 57,30; H 5,78; N 10,03].

BEISPIEL 7 (Vergleichsbeispiel)

(Rp)-P-Thioadenylyl-(2'-5')-(Rp)-P-thioadenylyl-(2'-5')adenosin (9A).

Eine Lösung von 0,116 g (0,05 mMol) vollständig geschütztes Trimer 7A wurde mit 2% p-Toluolsulfonsäure in 1,5 ml Dichlormethan/Methanol (4:1) 90 min detrityliert. Das Gemisch wurde in CHCl&sub3; gelöst, mit Phosphatpuffer (2 x 15 ml) gewaschen, getrocknet (Na&sub2;SO&sub4;) und zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wurde auf Kieselgelpiatten (20 x 20 x 0,2 cm) chromatographiert und mit Dichlormethan/Essigsäureethylester/n-Hexan (5:5:3 Vol./Vol.) entwickelt. Die Produktbande (Rf 0,35) wurde ausgeschnitten, mit Chloroform/Methanol (7:5) eluiert und ergab beim Eindampfen zu einem farblosen Schaum eine Ausbeute von 70-83%. 38,5 mg (18,9 Mikromol) Produkt wurden anschließend 20 h mit 0,5 M DBU in Pyridin (7,5 ml) gerührt, mit 1 M Essigsäure (3,75 ml) neutralisiert und schließlich eingedampft. Das eingedampfte Produkt wurde durch 24 h Behandlung mit 1 M Bu&sub4;NF in THF (6 ml) entsilyliert. Das Gemisch wurde im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wurde in konz. Ammoniak (25 ml) gelöst und 48 h bei RT gerührt. Nach Eindampfen der Lösung wurde der Rückstand in Wasser (20 ml) aufgenommen und mit Chloroform (2 x 10 ml) gewaschen. Die wäßrige Phase wurde auf eine DEAE-Sephadex A-25-Säule (60 x 1 cm) gegeben und das Produkt wurde mit einem linearen Gradienten aus einem Et&sub3;NH&spplus;HCO&sub3;-Puffer eluiert. Die Produkt fraktion wurde gesammelt, eingedampft und durch Papierchromatographie mittels i-PrOH/konz. Ammoniak/Wasser (6:1:3) unter Ergeben der Titelverbindung in 75-80% Ausbeute weiter gereinigt.

BEISPIEL 8

(Sp)-P-Thioadenylyl-(2'-5')-(Rp)-P-thioadenylyl-(2'-5')- adenosin (9B).

Eine Lösung von 0,116 g (0,05 mMol) vollständig geschütztes Trimer 7B wurde dem Verfahren von Beispiel 7 unterzogen. Die Titelverbindung wurde in 75- 80% Ausbeute erhalten.

BEISPIEL 9

(Rp)-P-Thioadenylyl-(2'-5')-(Sp)-P-thioadenylyl-(2'-5')- adenosin (10A).

Eine Lösung von 0,116 g (0,05 mMol) vollständig geschütztes Trimer 8A wurde dem Verfahren von Beispiel 7 unterzogen. Die Titelverbindung wurde in 75- 80% Ausbeute erhalten.

BEISPIEL 10

(Sp)-P-Thioadenylyl-(2'-5')-(Sp)-P-thioadenylyl-(2'-5')- adenosin (10B).

Eine Lösung von 0,116 g (0,05 mMol) vollständig geschütztes Trimer 8B wurde dem Verfahren von Beispiel 7 unterzogen. Die Titelverbindung wurde in 75- 80% Ausbeute erhalten.
Die UV-Absorptionsspektren in Methanol und ¹H-NMR-Spektren der vorstehend hergestellten geschützten Monomer-, Dimer- und Trimerkerne werden in Tabelle 1 beziehungsweise 2 angeführt. TABELLE 1 UV-Absorptionsspektren geschützter Monomer-, Dimer- und Trimerkerne in MeOH Verbindung TABELLE 2 ¹H-NMR-Spektren geschützter Monomer-, Dimer- und Trimerkerne¹ Verbindung Lösungsmittel ¹ λ-Werte in ppm; Standard TMS; charakteristische Signale

Zuordnung der absoluten Konfiguration zu den 2',5'-Phosphorothioatadenylattrimerkernen

Die Bestimmung der absoluten Konfiguration der Trimerkerne wurde durch ³¹P-NMR Massenspektrometrie unter Ionisierung mit schnellen Atomen und enzymatischen Verdau bewerkstelligt.
Es ist bekannt, daß das Enzym SVPD Rp-3',5'- oder 2',5'- Phosphorothioatbindungen vorzugsweise vom 2'/3'-Terminus aus spaltet; Nelson et al., J. Org. Chem. 49:2314-2317 (1984); Eppstein et al., J. Biol. Chem. 261:5999-6003 (1986); Lee et al., Biochemistry 24:551-555 (1985). Die SVDP-Hydrolyse des chemisch synthetisierten Dimerkerns ARpA lieferte Adenosin beziehungsweise AMPS im Molverhältnis 1:1; die Halbwertszeit war 3 Stunden (Tabelle 3). Der ASpA-Dimerkern war unter diesen Bedingungen kein Substrat für SVDP. Der Trimerkern 9A besaß die Konfiguration RpRp an der Internukleotidbindung, wie durch Hydrolyse durch SVDP unter Liefern von AMPS beziehungsweise ARpA im Molverhältnis 1:1 bestimmt wurde. Ähnlich lieferte die SVDP-Hydrolyse des Trimerkerns 9B ASpA und AMPS, wodurch festgestellt wurde, daß der Trimerkern 9B an der Internukleotidbindung die SpRp-Konfiguration besaß (Tabelle 3). Die Trimerkerne 10A und 10B waren für SVDP kein Substrat (Tabelle 3), was die Anwesenheit der Sp-Konfiguration an der Internukleotidbindung zeigte, die den 2'/3'-Termini benachbart ist. TABELLE 3 Analytische Daten, Dimer- und Trimer-2,5-phosphorothioat-adenylatkerne 2,5-Phosphorothioat Hydrolyse durch: L-Zellextrakt Serumphosphodiesterasen Dimerkern isoliert Halbwertszeit zugeordnete Stereokonfiguration Dimerkerne Trimerkerne A&sub3;-Kern A&sub2;-Kern nicht gespalten a entkoppelte Spektren b Zuordnung durch gekoppeltes und entkoppeltes ³¹P-NMR bestätigt c Zuordnung durch gekoppeltes ³¹P-NMR und enzymatische Hydrolyse bestätigt d HPLC-Retentionszeiten
Die vier 2,5-Phosphorothioatadenylattrimerkerne wurden durch Hydrolyse mit dem Enzym 2'-Phosphodiesterase ("2'- PDE"), eine in L-Zellextrakt zu findende Exoribonuklease, weiter charakterisiert. Das Enzym spaltet vom 2'/3'-Terminus aus. Obgleich authentische A&sub2;- und A&sub3;-Kerne mit einer Halbwertszeit von 10 min zu Adenosin und AMP hydrolysiert wurden, waren die Dimerkerne ARpA und ASpA keine Substrate für 2'-PDE (Tabelle 3). Die Tatsache, daß die 2,5-Phosphorothioatdimerkerne keine Substrate für 2'-PDE waren (anders als authentisches 2-5A), half sehr bei der Zuordnung der Stereokonfigurationen der 2',5'-Phosphorothioatadenylattrimerkerne. Der Trimerkern 9A war ein Substrat für 2'-PDE; die Hydrolyseprodukte waren ARpA und AMPS. Der Trimerkern 9B war ein Substrat für SVDP, wobei ASpA und AMPS geliefert wurden; der Trimerkern 10A war ein Substrat, wobei ARpA und AMPS geliefert wurden; Trimer 10B war kein Substrat für 2'-PDE.
Die ³¹P-NMR-Spektroskopie hat gezeigt, daß Sp-Stereoisomere von Phosphorothioaten bei höherem Feld als RP-Diastereomere absorbieren. Weiterhin haben Sp-Diastereomere bei der Umkehrphasen-HPLC eine längere Retentionszeit als Rp- Diastereomere. Der ASpA-Dimerkern absorbiert bei höherem Feld als ARpA (Tabelle 3). Ähnlich absorbieren zwei bei ASpASpA beobachtete Singuletts bei höherem Feld als die bei ARpARpA (Tabelle 3) beobachteten Singuletts. Die Zuordnung der absoluten Konfiguration der Trimerkerne 9A (RpRp) und 10B (SpSp) beruhte auf den beiden Singuletts, die bei derselben Frequenz wie die für die ARpA- und ASpA- Dimerkerne beobachteten Singuletts absorbieren. Die Konfigurationszuordnung bei den Trimerkernen 9B und 10A wurde in Kombination mit dem Enzymabbau und HPLC-Analysen (Tabelle 3) durchgeführt. Die ³¹P-NMR-Spektren zeigten, daß δppm zwischen den beiden Singuletts bei dem ASpASpA- Trimerkern 1,2 ist, wogegen die beiden Singuletts bei dem ARpASpA ein δppm von 0,8 besitzen (die Zuordnung ist 5' zum 2'/3'-Terminus).
Die metabolische Stabilität der 2,5'-Phosphorothioatdimer- und -trimerkerne ist deutlich größer als authentisches 2-5A. Die Geschwindigkeit der Hydrolyse der Trimerkerne durch die 3'-Exonuklease ist in der Reihenfolge abnehmender Stabilität: ASpARpA> ARpARpA> > > A&sub3;. Die Trimerkerne ARpASpA und ASpASpA sind keine Substrate von SVPD (Tabelle 3). Die 3'T'5'-Richtung der schrittweisen Spaltung durch SVPD wird durch eine Sp-Konfiguration blockiert, wodurch die Spaltung der stromaufwärts benachbarten Phosphorothioatbindung verhindert wird. Bei 2'-PDE waren die ARpARpA- ASpARpA- und ARpASpA-Trimerkerne, nicht aber der ASpASpA-Trimerkern Substrate. Sowohl bei SVDP als auch 2'- PDE reichem sich die Dimerkerne (entweder ARpA oder ASpA) auf die Hydrolyse der ARpARpA-, ASpARpA- und ARpASpA-Trimerkerne folgend an. Die Hydrolyse des 2-5A-Moleküls durch SVDP und 2'-PDE verläuft vom 2'/3'-Terminus aus. Deshalb führt die Einführung der Phosphorothioatgruppe in den Trimerkern zu Anreicherung der ARpA- oder ASpA-Dimerkerne vom 5'-Terminus aus und der Anreicherung von AMPS vom 2'/3'-Terminus aus (Tabelle 3). Mit authentischem A&sub3; erfolgt keine nachweisbare Anreicherung von A&sub2; auf die Hydrolyse durch SVDP oder 2'-PDE folgend.
Keiner der eine Sp-Bindung enthaltenden Trimerkerne wurde durch SVDP gespalten. Obschon sich die Halbwertszeit von ASpARpA bei der Spaltung mit L-Zellextrakt (15 Stunden) nicht wesentlich von der von ARpARpA (18 Stunden) unterschied, war die Halbwertszeit für das ARpASpA-Trimer um Größenordnungen länger (20 Tage). ASpASpA wurde durch L- Zellextrakt nicht gespalten (Tabelle 3).

Herstellung von Phosphorothioattetramerkernen

Die folgenden, nicht begrenzenden Beispiele veranschaulichen die Herstellung vollständig getrennter Tetramerkernverbindungen der Erfindung.

BEISPIEL 11

a. (Sp)-P-Thioadenylyl-(2'-5')-(Sp)-P-thioadenylyl-(2'- 5')-(Sp)-P-thioadenylyl-(2'-5)-adenosin

b. (Rp)-P-Thioadenylyl-(2'-5')-(Sp)-P-thioadenylyl-(2'- 5')-(Sp)-P-thioadenylyl-(2'-5)-adenosin

Eine Lösung von 0,149 g (0,065 mMol) vollständig geschütztes Trimer 8B, das die SpSp-Stereokonfiguration besitzt, wurde mit 2% p-Toluolsulfonsäure in 1,5 ml Dichlormethan/Methanol (4:1) 3 h bei Raumtemperatur detrityliert. Das Gemisch wurde mit 50 ml CHCl&sub3; verdünnt, mit Phosphatpuffer (2 x 15 ml) gewaschen, getrocknet (Na&sub2;SO&sub4;) und zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wurde auf Kieselgelpiatten (20 x 20 x 0,2 cm) chromatographiert, die mit Dichlormethan/Essigsäureethylester/n-Hexan (5:5:3 Vol./Vol.) entwickelt wurden. Die Produktbande, Rf 0,55, wurde ausgeschnitten, mit Chloroform/Ethanol (1:1) eluiert und ergab nach Eindampfen zu einem farblosen Schaum 0,108 g (Ausbeute 88%). Das 5'-entblockierte SpSp-Trimer 8B (101 mg; 0,05 mM) wurde in 0,5 ml Acetonitril über Nacht mit Phosphitamid 2 (0,105 g; 0,1 mMol) gelöst. 3- Nitro-1,2,4-triazol (0,023 g; 0,2 mMol) wurde zugesetzt. Nach 3 h Rühren bei Raumtemperatur wurde zur Oxidation Schwefel (0,042 g; 1,3 mMol) in Pyridin (0,084 ml) zugesetzt. Nach weiteren 24 h Rühren bei Raumtemperatur wurde das Produkt mit Dichlormethan (50 ml) extrahiert, die organische Phase wurde mit gesättigter NaCl-Lösung (2 x 20 ml) gewaschen, über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet und anschließend zur Trockene eingedampft. Das letzte Eindampfen wurde zum Entfernen von Pyridin mit Toluol ausgeführt. Das Rohprodukt wurde mittels präparativer Kieselgelplatten (20 x 20 x 0,2 cm) gereinigt, auf welche zur optimalen Trennung durch dreimaliges Entwickeln in Dichlormethan/Essigsäureethylester/n-Hexan (1:1:0,5 Vol./Vol.) etwa 50 mg je Platte aufgetragen wurden. Die das vollständig geschützte SpSpSp-Tetramer (Rf 0,3) enthaltende Bande und die das vollständig geschützte RpSpRp-Tetramer (Rf 0,4) enthaltende Bande wurde ausgeschnitten und mit Chloroform/Methanol (4:1) eluiert. Die Ausbeute des vollständig geschützten SpSpSp-Tetramers war 43 mg; 29%. Die Ausbeute der vollständig geschützten RpSpSp-Verbindung war 53 mg; 35,5%. Die beiden Isomeren (7,3 Mikromol; 0,22 mg) wurden durch 20 h Rühren mit 0,5 M DBU in Pyridin (5,0 ml) entblockiert, mit 1 M Essigsäure/Pyridin (0,5 ml) neutralisiert und schließlich eingedampft. Die nachfolgende Entsilylierung wurde mit 1M Tetrabutylammoniumfluorid in Tetrahydrofuran (3,6 ml) 48 h bei RT erreicht. Das Gemisch wurde im Vakuum eingeengt, der Rückstand wurde in konz. Ammoniak (15 ml) gelöst und 48 h bei RT gerührt. Nach dem Eindampfen der Lösung wurde der Rückstand in 5 ml 80%iger Essigsäure aufgenommen und 20 h bei RT stehen lassen. Der Rückstand wurde in etwa 5 ml Wasser gelöst und auf eine DEAE-Sephadex A-25-Säule gegeben (60 x 1 cm) und das Produkt wurde mit einem linearen Gradienten aus Et&sub3;NH&spplus;CO&sub3;-Puffer (pH 7,5) (Gradient 0,001 - 1 M) eluiert. Die Produktfraktionen wurden gesammelt, eingedampft und durch Papierchromatographie mittels i-PrOH/konz. Ammoniak/Wasser (6:1:3) weiter gereinigt. Die Tetramerisomeren wurden mit Wasser unter Ergeben von ASpASpASpA (72% Ausbeute; Rf 0,23) und ARpASpASpA (73% Ausbeute; Rf 0,29) als Ammoniumsalz eluiert.

BEISPIEL 12

a. (Rp)-P-Thioadenylyl-(2'-5')-(Rp)-P-thioadenylyl-(2'- 5')-(Rp)-P-thioadenylyl-(2'-5')-adenosin

b. (Sp)-P-Thioadenylyl-(2'-5')-(Rp)-P-thioadenylyl-(2'- 5')-(Rp)-P-thioadenylyl-(2'-5')-adenosin

Die Titelverbindungen werden hergestellt, indem man dem Verfahren von Beispiel 11 folgt, aber 8B als Ausgangsmaterial durch das vollständig geschützte Trimer 7A ersetzt.

BEISPIEL 13

a. (Rp)-P-Thioadenylyl-(2'-5')-(Sp)-P-thioadenylyl-(2'- 5')-(Rp)-P-thioadenylyl-(2'-5')-adenosin

b. (Sp)-P-Thioadenylyl-(2'-5')-(Sp)-P-thioadenylyl-(2'- 5')-(Rp)-P-thioadenylyl-(2'-5')-adenosin

Die Titelverbindungen werden hergestellt, indem man dem Verfahren von Beispiel 11 folgt, aber 8B als Ausgangsmaterial durch das vollständig geschützte Trimer 7B ersetzt.

BEISPIEL 14

a. (Sp)-P-Thioadenylyl-(2'-5')-(Sp)-P-thioadenylyl-(2'- 5')-(Sp)-P-thioadenylyl-(2'-5')-adenosin

b. (Sp)-P-Thioadenylyl-(2'-5')-(Sp)-P-thioadenylyl-(2'- 5')-(Sp)-P-thioadenylyl-(2'-5')-adenosin

Die Titelverbindungen werden hergestellt, indem man dem Verfahren von Beispiel 11 folgt, aber 8B als Ausgangsmaterial durch das vollständig geschützte Trimer 8A ersetzt.

Herstellung von 2',5,-Phosphorothioatoligoadenylat-5-monophosphaten

5'-Monophosphate von 2',5'-Oligoadenylaten werden leicht durch Umsetzen der entsprechenden Kernverbindungen mit POCl&sub3; hergestellt. Eine derartige Behandlung führt zur Eliminierung von Schwefel aus den Phosphorothioat-Internukleotidbindungen der Verbindungen der vorliegenden Erfindung und zur Bildung von 2-5A. So müssen die 5'- Monophosphate der Phosphorothioatoligoadenylate aus den entsprechenden vollständig geschützten Kernverbindungen hergestellt werden, aus welchen die Monomethoxytrityl- Blockierungsgruppe an dem 5'-terminalen Nukleotid entfernt worden ist. Die Phosphorylierungsbedingungen müssen derart sein, daß die p-Nitrophenylethyl-Blockierungsgruppen an den Internukleotid-Phosphoratomen unversehrt bleiben.
Das 5'-Monophosphat jedes getrennten Trimerkerns der vorliegenden Erfindung wurde aus dem 5'-Hydroxyanalogon des entsprechenden vollständig geschützten Trimers 7A, 7B, 8A oder 8B hergestellt. Das 5'-Phosphotriester-Zwischenprodukt (11A, 11B, 12A oder 12B) wurde gemäß Beispiel 15 hergestellt und anschließend gemäß Beispiel 16 unter Liefern des 5'-Monophosphats von allen Schutzgruppen befreit. Das Verfahren von Beispiel 15 und 16 kann zum Bilden des 5'-Monophosphats von allen vier Trimerkernstereoisomeren verwendet werden.

BEISPIEL 15

5'-O-(2,5-Dichlorphenyl-p-nitrophenylethyl)-phosphoryl-6- N-benzoyl-3'-O-tert-butyldimethylsilyl-P-thioadenylyl-2'- [OP-(p-nitrophenylethyl)-5']-6-N-benzoyl-3"-O-tert-butyldimethylsilyl-P-thioadenylyl-2'-[OP-(p-nitrophenylehtyl)- 5']-6-N-benzoyl-2,3'-di-O-tert-butyldimethylsilyladenosin (11A, 11B, 12A oder 12B):

Einer Lösung von 1,2,4- Triazol (0,011 g, 0,16 mMol) und 2,5-Dichlorphenylphosphorodichloridat (0,022 g; 0,078 mMol) in trockenem Pyridin (0,5 ml) wurde das 5'-entblockierte Analogon von entweder 7A, 7B, 8A oder 8B (0,1 g; 0,049 mMol) (als Zwischenprodukt in Beispiel 11 hergestellt) zugesetzt und nach 30 min Rühren wurde p-Nitrophenylethanol (0,02 g; 0,119 mMol) zugesetzt und das Rühren wurde 20 h fortgesetzt. Die Lösung wurde anschließend mit Chloroform (50 ml) extrahiert, die organische Phase wurde mit Wasser (2 x 20 ml) gewaschen, zur Trockene eingedampft und schließlich zusammen mit Toluol eingedampft. Der Rückstand wurde durch Kieselgelchromatographie auf präparativen Platten (20 x 20 x 0,2 cm) mittels des Systems Dichlormethan/n- Hexan/Essigsäureethylester (1:1:1 Vol./Vol.) gereinigt. Die Produktbande wurde mit Chloroform/Methanol (4:1) eluiert und im Vakuum unter Ergeben von 11A 11B, 12A beziehungsweise 12B in 70-80% Ausbeute eingedampft.

BEISPIEL 16

a. 5'-O-Phosphoryl-(Rp)-thioadenylyl-(2'-5')-(Rp)-thioadenylyl-(2'-5') -adenosin (13A)

b. 5'-O-Phosphorvl-(Sp)-thioadenylvl-(2'-5')-(Rp)-thioadenylyl-(2'-5')-adenosin (13B)

c. 5'-O-Phosphoryl-(Rp)-thioadenylyl-(2'-5')-(Sp)-thioadenylyl-(2'-5')-adenosin (14A)

d. 5'-O-Phosphoryl-(Sp)-thioadenylyl-(2'-5')-(Sp)-thioadenylyl-(2'-5')-adenosin (14B)

p-Nitrobenzaldoxim (0,036 g; 0,216 mMol) wurde 30 min in Dioxan/Triethylamin/Wasser (jeweils 0,5 ml) gerührt, der entsprechende 5'-Phosphotriester 11A, 11B, 12A oder 12B (0,05 g, 0,02 mMol) wurde zugesetzt und das Gemisch wurde 4 h bei RT gehalten. Die Lösung wurde zur Trockene eingedampft, gefolgt vom Eindampfen zusammen mit Toluol (2 x 5 ml), und der Rückstand wurde durch präparative DSC auf Platten (20 x 20 x 0,2 cm) in Chloroform/Methanol (95:5) gereinigt. Die Produktbande wurde mit Chloroform/Methanol/Triethylamin (5:1:1) eluiert und zur Trockene eingedampft. Dieses Material (0,022 g; 10 Mikromol) wurde mit 0,5 M DBU in Pyridin (8 ml) 24 h bei RT gerührt, die Lösung wurde mit 1M Essigsäure (4 ml) neutralisiert und zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wurde 48 h mit 1 M Bu&sub4;NF in THF (6 ml) behandelt und nach dem Eindampfen wurde die Entbenzoylierung durch 48 h Behandlung mit konz. Ammoniak (25 ml) bei RT bewerkstelligt. Die Lösung wurde eingedampft. Das entblockierte rohe Trimer-5'-monophosphat wurde in Wasser (25 ml) aufgenommen und mit Chloroform (2 x 10 ml) gewaschen. Die wäßrige Phase wurde zur Elution mit einem linearen Gradienten aus 0,001-1M Et&sub3;NH&spplus;HCO&sub3;&supmin;-Puffer auf eine DEAE-Sephadex A-25-Säule (60 x 1 cm) gegeben. Die Produktfraktionen wurden gesammelt, zur Trockene eingedampft und wurden nach mehreren Eindampfungen zusammen mit Wasser durch Papierchromatographie mittels des i-PrOH/konz. Ammoniak/Wasser-Systems (55:10:35) weiter gereinigt. Die Produktbande wurde mit Wasser eluiert und ergab bei der Lyophilisierung das trimere P-Thioadenylat-5'-monophosphat 13A, 13B, 14A oder 14B als Ammoniumsalz in 68-74% Ausbeute.
Das ¹H-NMR der 5'-Monophosphate ist wie folgt: TABELLE 4 ¹H-NM-Spektren von 5'-O-Phosphoryl- P-thioadenylyl-(2'-5')-P-thioadenylyl-(2'-5')-adenosin-Stereoisomeren² Verbindung Lösungsmittel ² δ-Werte in ppm; Standard TMS; charakteristische Signale
Die Monophosphorylierung der 5'-entblockierten geschützten Trimeren unter Bilden der 5'-Phosphotriester 11A, 11B, 12A oder 12B verläuft in hoher Ausbeute, 70-80%, gefolgt von dem weiteren Schritt des vollständigen Entschützens in hoher Ausbeute (68-74%), woraus sich die Trimer-5'-monophosphate 13A, 13B, 14A oder 14B ergeben.
Die 5-Monophosphate jeder getrennten Tetramerkernverbindung der vorliegenden Erfindung werden in derselben Weise hergestellt, wobei die identischen molaren Mengen wie in Beispiel 15 und 16 verwendet werden, außer daß das Ausgangsmaterial für die Synthese das 5'-Hydroxyanalogon des vollständig geschützen Tetramers statt des 5'-Hydroxyanalagons des vollständig geschützten Trimers ist. Die folgenden vollständig getrennten Tetramer-5'-monophosphate werden auf diese Weise hergestellt:
5'-O-Phosphoryl-(Rp)-thioadenylyl-(2'-5')-(Rp)-thioadenylyl-(2'-5')-(Rp)-thioadenylyl-(2'-5')-adenosin
5'-O-Phosphoryl-(Rp)-thioadenylyl-(2'-5')-(Rp)-thioadenylyl-(2'-5')-(Sp)-thioadenylyl-(2'-5')-adenosin
5'-O-Phosphorvl-(Rp)-thioadenylyl-(2'-5')-(Sp)-thioadenylyl-(2'-5')-(Sp)-thioadenylyl-(2'-5')-adenosin
5'-O-Phosphorvl-(Sp)-thioadenylyl-(2'-5')-(Sp)-thioadenylyl-(2'-5')-(Sp)-thioadenylyl-(2'-5")-adenosin
5'-O-Phosphoryl-(Sp)-thioadenylyl-(2'-5')-(Rp)-thioadenylyl-(2'-5')-(Sp -thioadenylyl-(2'-5')-adenosin
5'-O-Phosphoryl-(Sp)-thioadenylyl-(2'-5')-(Rp)-thioadenylyl-(2'-5')-(Rp)-thioadenylyl-(2'-5')-adenosin
5'-O-Phosphoryl-(Sp)-thioadenylyl-(2'-5')-(Sp)-thioadenylyl-(2'-5')-(Rp)-thioadenylyl-(2'-5')-adenosin
5'-O-Phosphoryl-(Rp)-thioadenylyl-(2'-5'-(Sp)-thioadenylyl-(2'-5')-(Rp)-thioadenylyl-(2'-5')-adenosin

Herstellung von 2',5'-Phosphorothioatoligoadenylat-5'-diphosphaten und -5'-triphosphaten

Das 5'-Diphosphat und 5-Triphosphat der 2',5'-Phosphorothioatoligoadenylate können aus dem 5'-Monophosphat hergestellt werden, indem man dem Verfahren von Beispiel 17 folgt.

BEISPIEL 17

Alle Reaktion wurden in 18-24 h bei 125ºC getrockneten Glasgeräten ausgeführt. Ein 2',5'-Phosphorothioatoligoadenylatstereoisomer (Trimer oder Tetramer, 400 OD-Einheiten bei 260 nm) wird in 500 Mikroliter trockenem Dimethylformamid ("DMF") gelöst und bei 35ºC in einem 10 ml- Erlenmeyerkolben getrocknet. Dieses Verfahren wird drei Mal wiederholt. Dem trockenen Rückstand werden 50 Mikromol Triphenylphosphin, 100 Mikromol Imidazol und 50 Mikromol Dipyridinyldisulfid zugesetzt. Das Gemisch wird in 500 Mikroliter trockenem DMF plus 50 Mikroliter trockenem Dimethylsulfoxid gelöst. Die Lösung wird mit einem Rührstab 2 h bei Raumtemperatur gerührt. Nach 2 h ist die Lösung homogen (nach 30 Minuten beginnt sich die Lösung gelb zu färben). Die Lösung wird tropfenweise in 10 ml einer Lösung von 1% NaI/trockenes Aceton (Gew./Vol.) überführt. Der helle, weiße Niederschlag, der sich bildet, ist das Natriumsalz des 5'-Phosphoroimidazolidats. Der Niederschlag wird bei Raumtemperatur zentrifugiert, der Überstand wird dekantiert und der Niederschlag wird dreimal mit 10 ml trockenem Aceton gewaschen. Das Zentrifugieren wird wiederholt. Der Niederschlag wird im Vakuum 2 h über P&sub2;O&sub5; getrocknet. Der Niederschlag wird in 200 Mikroliter frisch hergestellten 0,5 M Tributylammoniumpyrophosphats in trockenem DMF gelöst. Die Lösung wird 18 h bei Raumtemperatur gehalten, wonach das DMF im Vakuum entfernt wird. Der Rückstand wird in 0,25 M Triethylammoniumbicarbonatpuffer ("TEAB") (pH 7,5) gelöst. Die 5'-Di- und 5'-Triphosphatprodukte werden mittels einer DEAE-Sephadex A25-Säule (HCO&sub3;-Form; 1 x 20 cm) mit einem linearen Gradienten von 0,25 M bis 0,75 M TEAB getrennt. Fraktionen (10 ml) werden gesammelt. Das Produkt wird durch Ultraviolettspektroskopie bei 254 nm überwacht. Die Fraktionen, welche die 5'-Di- und 5'- Triphosphate enthalten, werden getrennt zusammengefaßt und im Vakuum getrocknet. Der TEAB wird durch wiederholte Wasserzugabe gefolgt von der Lyophilisierung entfernt. Die Ausbeute des 5'-Diphosphats ist etwa 5%; die Ausbeute des 5'-Triphosphats ist etwa 60%.
Die Aktivierung von RNase L durch 2-5A wird allgemein als Schlüssel für den antiviralen Verteidigungsmechanismus angesehen. Interferon löst die Transkription des Enzyms 2-5A-Synthetase aus, welches bei der Aktivierung doppelsträngiger RNA 2',5'-verknüpfte Oligoadenylate erzeugt. Die einzige bekannte biochemische Wirkung von 2-5A ist die RNase L-Aktivierung. Dieses Enzym hydrolysiert mRNA und rRNA, was dadurch zur Hemmung der Proteinsynthese führt. Die RNase L-Aktivierung ist vorübergehend, so lange 2-5A nicht kontinuierlich synthetisiert wird, da 2- 5A rasch abgebaut wird. Die RNase L-Aktivierung spielt somit eine kritische Rolle bei der Replikationshemmung und deswegen beim Verteidigen gegen Infektionen durch Viren.
Gemäß der Erfindung binden alle vier 2',5'-Phosphorothioatadenylattrimerkerne und ihre 5'-Monophosphate an RNase L, wie durch einen Radiobindungstest gemäß dem Verfahren von Knight et al., Meth. Enzymol. 79:216-227 (1981), bestimmt wurde. Die 2',5'-Phosphorothioatadenylattrimerkerne und authentisches A&sub3; konnten die p&sub3;A&sub4;[³²P]pCp-Sonde aus RNase L in L929-Zellextrakten in konzentrationsabhängiger Weise verdrängen (Fig. 1A). Die IC&sub5;&sub0; schwankte von 2 x 10&supmin;&sup6; bis 5 x 10&supmin;&sup6; M. Die 5'-monophosphorylierten Trimeren hatten jedoch eine 1000fach höhere Bindungsaffinität zu RNase L als ihre entsprechenden Kerne, das heißt, die IC&sub5;&sub0; reichte von 2 x 10&supmin;&sup9; bis 5 x 10&supmin;&sup9; M (Fig. 1A). Ohne an eine bestimmte Theorie gebunden werden zu wollen, kann diese Zunahme der Fähigkeit der 5'-Monophosphate zugeschrieben werden, aufgrund der erhöhten Polarität das Molekül wirksamer an RNase L zu verankern.
Die 2',5'-Phosphorothioatkerne haben mit einer Ausnahme die zum Aktivieren von RNase L richtige Stereokonfiguration. Die Aktivierung teilweise gereinigter RNase L durch die 2',5'-Phosphorothioate wurde gemäß dem Kern-Cellulose-Test von Silverman, Analyt. Biochem. 144:450-460 (1985), gemessen, welcher auf der Hydrolyse des Substrats poly(U)-3-[³²P]pCp beruht. Überraschenderweise konnten drei der vier 2',5'-Phosphorothioatadenylatkerne RNase L unter Spalten von poly(U)-3'-[³²P]pCp in dem Kern-Cellulose-Test aktivieren (Figur 1B). Die Reihenfolge der Aktivierung der Trimerkerne und der entsprechenden 5'-Monophosphate ist; RpRp> SpRp> RpSp (Fig. 1B). Obschon pARpARpA der wirksamste Aktivator von RNase L war, ist die Verbindung metabolisch instabil und wird leicht von Phosphodiesterasen angegriffen (siehe Tabelle 3). Der SpSp-Trimerkern aktivierte RNase L selbst bei einer Konzentration von 10&supmin;³ M nicht. Wie bei dem Bindungstest (Fig. 1A) beobachtet wurde, bestand bei der Aktivierung von RNase L durch die 5'-Monophosphate der 2',5'-Phosphorothioattrimeren verglichen mit ihren entsprechenden Kernen eine 1000fache Zunahme.
Die Aktivierung von RNase L durch 2',5'-Phosphorothioatadenylattrimerkerne und ihre 5'-Monophosphate wurde auch mittels L929-Zellextrakten in einem rRNA-Spaltungstest gemessen. ARpARpA und ASpARpA aktivierten RNase L unter Spalten von 28S- und 18S-rRNA zu spezifischen Spaltungsprodukten bei 10&supmin;&sup5; M. ARpASpA und ASpASpA aktivierten jedoch RNase L bei bis zu 10&supmin;&sup4; M hohen Konzentrationen nicht. Es scheint, daß der rRNA-Spaltungstest zum Nachweisen der Aktivierung von RNase L durch ARpASpA nicht empfindlich genug war. Unter den verwendeten experimentellen Bedingungen war authentischer A&sub3;-Kern ebenfalls inaktiv, was in Übereinstimmung mit früheren Berichten ist (Haugh et al., Eur. J. Biochem. 132:77-84 (1983)).
Die entsprechenden 5'-Monophosphate pARpARpA, pASpARpA (bei 10&supmin;&sup8; M) und pARpASpA (bei 10&supmin;&sup7; M) aktivierten RNase L unter Spalten von 28S- und 18S-rRNA. Authentisches pA&sub3; war bei 10&supmin;&sup6; M ebenfalls aktiv. Die Inkubation mit pASpASpA führte selbst bei bis zu 10&supmin;&sup5; M hohen Konzentrationen nicht zu einem nachweisbaren rRNA-Abbau.
Die erhöhte Bindungsfestigkeit des 5'-phosphorylierten Trimerkerns ARpASpA liefert einen metabolisch verhältnismäßig stabilen und äußerst wirksamen Aktivator für RNase L.
Von ASpASpA und dem entsprechenden 5'-Monophosphat wurde beobachtet, daß es sowohl im Kern-Cellulose- als auch rRNA-Spaltungstest die RNase L-Aktivierung hemmt. Nichtsdestotrotz sind diese Verbindungen als Sonden bei der Bewertung der Rolle von RNase L in der Interferon-induzierten biologischen Kaskade äußerst nützlich. Am wichtigsten hemmt pASpAApA selektiv die Aktivierung von RNase L in physiologischen Konzentrationen und ist gegen spezifische und unspezifische Phosphodiesterasen metabolisch stabil. Das Molekül stellt ein Mittel zum selektiven Abschalten der RNase L-Aktivierung bereit.
Von chronischer myelogener Leukäinie ("CML") befallene Personen zeigen eine stark erhöhte RNase L-Aktivität, wie durch neue rRNA-CML-spezifische Spaltungsprodukte bewiesen wird. Somit besitzt pASpASpA, das ein metabolisch stabiler RNase L-Hemmer ist, eine mögliche Verwendung beim Behandeln myelogener Leukämie.
pASpASpA ist der wirksamste, bis heute berichtete RNase L- Hemmer. Trotz seiner RNase L-Hemmwirkung wird jedoch bei pASpASpA weiter beobachtet, daß es die reverse Transkriptase-Aktivität von HIV und die Tabakmosaikvirus-Replikation hemmt.
Zur pharmazeutischen Verwendung können die Verbindungen der Erfindung in pharmazeutisch annehmbaren Trägern wie etwa Lösungen, Suspensionen, Tabletten, Kapseln, Salben, Elixieren und einer injizierbaren Zusammensetzung und dergleichen aufgenommen werden. Sie werden an Patienten verabreicht, die an einer Virusinfektion leiden. Die verabreichte Dosis hängt von der Art und Schwere der Infektion, dem Krankheitsstadium und, wenn sie systemisch verabreicht werden, von der Größe und dem Gewicht der infizierten Person ab.
Die Verbindungen werden im allgemeinen in Form wasserlöslicher Salze verabreicht. Pharmazeutisch annehmbare wasserlösliche Salze schließen zum Beispiel die Natrium-, Kalium- oder Ammoniumsalze der aktiven Verbindungen ein. Sie werden in Wasser oder Kochsalziösung leicht gelöst. So umfaßt die bevorzugte Formulierung zur pharmakologischen Verwendung eine Kochsalziösung der gewünschten Verbindung in Salzform. Die Formulierung kann weiter ein Mittel zum Aufrechterhalten des osmotischen Gleichgewichts, wie etwa einen Zucker oder ein Protein, enthalten. Die Salzform der Verbindung ist aufgrund der verhältnismäßig großen relativen Säurestärke (etwa pH 3) der Säureform der Verbindungen bevorzugt.
Die Verbindungen der Erfindung können zum Behandeln oder Schützen von Mensch und Tier vor Virusinfekten verwendet werden, wie etwa Herpes simplex, Rhinovirus, Eppstein- Barr-Virus, Masernvirus, multiple Sklerose (die durch ein Virus hervorgerufen werden kann) und die verschiedenen Humanimmunschwäche-Viren ("HIV"), wie etwa HIV-1, das ein kutanes T-Zellenlymphom verursacht, HIV-23 das ein Sezary-Lymphom hervorruft, und HIV-3, das für das erworbene Immunschwächesyndrom ("AIDS") verantwortlich ist. Die Verbindungen der Erfindung hemmen die reverse Transkriptase-Aktivität von HIV.
Die Verbindungen können zum Behandeln von Hautkrebs, der durch Strahlung, Karzinogene oder Viren hervorgerufen wurde, topisch angewandt werden. Ein derartiger Hautkrebs schließt das kutane T-Zellenlymphom, Sezany-Lymphom, Xeroderma pigmentosium, Ataxia telangiectasia und das Bloom-Syndrom ein. Eine ausreichende Menge einer eine Verbindung der Erfindung enthaltenden Zubereitung wird unter Bedecken der Läsion oder der befallenen Fläche angewandt. Eine wirksame Konzentration des aktiven mittels liegt zwischen etwa 10&supmin;³ M und 10&supmin;&sup5; M, wobei 10&supmin;&sup4; M bevorzugt sind.

Wirkung von 2',5'-Phosphorothioatoligoadenylaten auf die reverse Transkrintaseaktivität von HIV

Die reverse Transkriptase-Aktivität von HIV (RNA-abhängige DNA-Nukleotidyltransferase) wurde durch eine Abänderung des Verfahrens von Poiesz et al. (Poiesz, B. J., Ruscetti, F. W., Gazdar, A. F., Bunn, P. S., Minna, J. D. und Gallo, R. C., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 77:7415-7419 (1980)) bestimmt.
Kultivierte H-9-Zellen werden zu 10&sup6; Zellen/ml in RPMI- 1640-Medium und 20% hitzeinaktiviertem fetalem Kälberserum gezüchtet. Die Zeilsuspensionen werden zentrifugiert (1000 x g, 10 min) und der Überstand wird entfernt. Virusteuchen werden aus diesem zelifreien Überstand gefällt, welchem 0,3 ml 4 M NaCl und 3,6 ml 30% (Gewicht/Volumen) Polyethylenglykol zugesetzt werden. Die Suspension wird 2 h auf Eis gestellt, gefolgt von 30 min Zentrifugieren bei 15000 x g und 0ºC. Der Niederschlag wird in 200 Mikroliter 50%igem Glycerin (Vol./Vol)/25 mM Tris-HCl (pH 7,5)/5 mM Dithiothreit/50 mM KCl/0,025% Triton X-100 erneut suspendiert. Die Virusteuchen werden durch Zusatz von 100 Mikroliter 0,9% Triton X-100/1,5 M KCl lysiert. Die Bestimmungen der reversen Transkriptase werden mit 10 Mikroliter der lysierten Viruslösung in einem Reaktionsendvolumen von 100 Mikroliter 1 h bei 37ºC ausgeführt, welches 40 mM Tris-HCl (pH 7,8), 4 mM Dithiothreit, 45 mM KCl und 2,5 Mikrogramm Matrizenstarter [poly(A)-dT&sub1;&sub5;, 0,5 Mikrogramm/Mikroliter] (mit einer Mg&spplus;&spplus;- Endkonzentration von 10 mM) enthält. Zu diesem Zeitpunkt werden 10 Mikroliter des 2',5'-Phosphorothioatoligoadenylats auf eine Endkonzentration von 200 mikromolar zugesetzt. Die Reaktionsgemische enthalten auch 4 Mikromol [³H]dTTP. Die Reaktionen werden durch Zusatz kalter 5%iger Trichloressigsäure abgebrochen und durch Nitrocellulosescheiben futriert. Die Scheiben werden getrocknet und die an die Scheiben gebundene Radioaktivität wird bestimmt. Die Aktivität der reversen Transkriptase wird in Prozent bezogen auf eine Kontrolle ausgedrückt.
Die Daten werden in Tabelle 5 dargestellt. Die Verbindungen wurden in der vorstehenden Weise in zwei Reihen bestimmt, wobei jede Reihe einen getrennten Probensatz hat. Die Verbindungen der Reaktionen 1-4 wurden gegen Kontrolle #1 bestimmt, welche 187 x 10³ cpm zeigte. Die in den Reaktionen 5-13 verwendeten Verbindungen wurden gegen Kontrolle 2 bestimmt, welche 273 x 10³ cpm zeigte. TABELLE 5 Hemmung der reversen Transkriptase-Aktivität von HIV (HTLV-IIIBH-9) durch 2',5'-Phosphorothioatoligoadenylate Reaktion Verbindung Konzentration reverse Transkroptase-Aktivität Prozent Hemmung
Obschon p&sub3;A&sub3;, pA&sub3; und A&sub3; in Säugerzellen gefunden werden, hemmt nur das Monophosphat die reverse Transkriptase von HIV. Andererseits wird beobachtet, daß die Kernverbindungen der vorliegenden Erfindung die reverse Transkriptase von HIV hemmen. Wenn auch alle Verbindungen der Erfindung (Reaktion Nr. 5, 6, 7, 9, 10, 11, 12 und 13) die Transkriptase in einem gewissen Ausmaß hemmen, sind die Tetrameren besonders wirkungsvoll.
Die Verbindungen der Erfindung können zum Hemmen der reversen Transkriptase von HIV und zum Behandeln von HIV in Mengen von etwa 10 Mikromol bis etwa 200 Mikromol verabreicht werden.
Die Verbindungen besitzen auch eine Antivirus-Aktivität gegen Pflanzen infizierende Viren, insbesondere Tabakmosaikvirus. Ähnliche Ergebnisse können gegen andere Viren erhalten werden, die bei Rüben, Gurken, Orchideen und bei anderen Pflanzen eine Nekrose hervorrufen. Derartige Viren schließen den Tabakringfleckvirus, Stomatitis vesiculosa-Virus, Vaccinia-Virus, Rübennekrosevirus und Cymbidium-Orchideenvirus ein, sind aber nicht darauf beschränkt.
Die Verbindungen können durch topische Anwendung durch Abtragen der Blattoberfläche, Aerosolspray, Bodenbehandlung, Sprühen oder Stäuben wirksam an Pflanzen verabfolgt werden.
Eine wirkungsvolle Antivirus-Zusammensetzung kann durch Kombinieren einer oder mehr Verbindungen der Erfindung mit einem geeigneten Trägermaterial gebildet werden. Wenngleich die einzelnen Stereoisomeren zur pharmazeutischen Verwendung bevorzugt sind, können Gemische eines oder mehrerer Stereoisomeren bei landwirtschaftlichen Anwendungen eingesetzt werden. Die aktive Verbindung kann auch durch Besprühen von Insektenvektoren, wie etwa Ameisen, Thripse und Weiße Fliege, verabfolgt werden, welche den Virus zu den Pflanzen bringen. Die verabfolgte Dosis hängt von der Schwere der Infektion ab.
Die Verbindungen der Erfindung können zum Bekämpfen im Keimplasma enthaltener Viren auf Pflanzensamen vor dem Keimen angewandt werden. Die Samen können in einer Polyethylenglykoliösung ("PEG"), die eine oder mehr Verbindungen enthält, eingeweicht werden. PEG veranlaßt die Samen zu physiologischer Aktivität und Hemmung. Die relative Konzentration von aktiver Verbindung zu PEG hängt von dem in Behandlung befindlichen Samentyp ab.
Pflanzen werden mit einer wäßrigen Formulierung, die Konzentrationen von etwa 10&supmin;¹ bis etwa 10&supmin;² M aktivem Bestandteil enthält, wirkungsvoll behandelt. Die Verbindungen der Erfindung können in sehr niedrigen Konzentrationen angewandt werden. Eine wirksame Menge aktiver Bestandteil auf der Pflanzenoberfläche beträgt etwa 10&supmin;&sup8; bis etwa 10&supmin;¹² Mol je cm² Pflanzenoberfläche, wobei etwa 10&supmin;¹&sup0; Mol bis etwa 10&supmin;¹² Mol je cm² bevorzugt sind. Bei der typischen Tabakpflanze mit 1000 cm² sind 10&supmin;&sup5; M Verbindung wirksam. Bei dieser Menge reicht ein Pfund aktiver Bestandteil zum Behandeln von 2 x 10&sup8; Tabakpflanzen.
Zur landwirtschaftlichen Anwendung werden die Verbindungen vorzugsweise in Form wasserlöslicher Salze, z.B. Ammonium- oder Kaliumsalze, verabfolgt. Natriumsalze werden im allgemeinen beim Behandeln eßbarer Pflanzen vermieden.
Die Verbindungen der Erfindung werden leicht in Wasser, insbesondere bei niedrigen Konzentrationen, gelöst. Wäßrige Formulierungen zur landwirtschaftlichen Verwendung können gegebenenfalls ein Haftmittel und/oder einen UV-Stabilisator enthalten. Derartige Mittel sind dem Fachmann wohlbekannt. Fettsäuren (1%) sind brauchbare Spritzhaftmittel. Wirksame UV-Stabilisatoren schließen zum Beispiel p-Aminobenzoesäure ein.

Wirkung von 2',5'-Phosphorothioatoligoadenylaten auf die Replikation des Tabakmosaikvirus (TMV) in unversehrten Tabakdflanzen

Die Wirksamkeit der 2',5'-Phosphorothioatoligoadenylate gegen Pflanzenviren wurde durch Infektionsfähigkeitstests auf unversehrten Nicotiana glutinosa-Pflanzen wie folgt gezeigt:
Carborundum (400 mesh) wurde leicht auf Blätter gesprüht. 0,2 Mikrogramm TMV je ml und 2 x 10&supmin;&sup5; M 2',5'-Phosphorothioatoligoadenylat in Phosphatpuffer enthaltende Lösungen wurden auf Blatthälften von N. glutinosa entweder mit einem behandschuhten Finger oder mit einem Pipettiergerät aufgebracht. Die restlichen Blatthälften waren Kontrollen (mit der TMV aber keine aktive Verbindung enthalten Pufferlösung beimpft). Man ließ die Infektion unter ständiger Beleuchtung mit etwa 1500 Lx 48 h ablaufen, nach welcher Zeit örtliche Virusläsionen auftraten. Die Hemmung der TMV-Replikation wurde als Prozent örtliche Läsionen, die bei mit 2',5'-Phosphorothioatoligoadenylat behandelten Blatthälften erzeugt wurden, verglichen mit den Kontrollblatthälften berechnet. Die Daten werden in Tabelle angeführt. TABELLE 6 Verbindung³ Prozent TMV-Hemmung&sup4; ³ Alle Verbindungen wurden der Infektionsiösung zu 2 x 10&supmin;&sup5; M zugesetzt. &sup4; Die Hemmung der TMV-Replikation wurde 48 h nach der Infektion nachgewiesen und wurde als Prozent örtliche Läsionen, die bei behandelten Blatthälften von N. glutinosa erzeugt wurden, verglichen mit den Kontroliblatthälften berechnet.
Nicht infizierte Pflanzen wurden mit 2 x 10&supmin;&sup6; M und 2 x 10&supmin;&sup5; M 2',5'-Phosphorothioatkern und 5'-Monophosphatanalogen behandelt. Während des Testzeitraums von zwei Wochen wurde keine Toxizität (Chiorose oder Nekrose) beobachtet.
Von den zehn getesteten Phosphorothioattrimer- und -tetramerkernen und 5'-Monophosphaten hemmt der SpSp- Phosphorothioattrimerkern die TMV-Replikation am höchsten (80%). Ähnlich hemmte der entsprechende Tetramerkern, SpSpSp, die TMV-Replikation um 70%. Der RpSpSp-Tetramerkern hemmte die TMV-Replikation um 80%. Der bemerkenswerten Hemmung sowohl durch ASpASpA, ASpASpASpA und ARpASpASpA als auch 70%igen Hemmung durch ARpASpA steht nur eine 16% Hemmung durch authentisches A&sub3; gegenüber. Durch Einführen sowohl der Chiralitätseigenschaft als auch der erhöhten metabolischen Stabilität erfolgt eine merkliche Zunahme der Hemmung der TMV-Replikation gegenüber 2-5A durch die Verbindungen der Erfindung.
Außer der Verabfolgung mit herkömmlichen Trägern können die Verbindungen der vorliegenden Erfindung durch eine Vielfalt besonderer Oligonukleotid- oder Nukleinsäurezuführungstechniken verabfolgt werden. 2-5A und seine Analoga sind erfolgreich in unilamellaren Liposomen verkapseit. und mit Hilfe monoklonaler Antikörper Zellen zugeführt worden (Bayard et al., Eur. J. Biochem. 151:319-325 (1985)). Wiederhergestellte Sendai-Virushüllen sind erfolgreich zum Zuführen von RNA und DNA an Zellen verwendet worden (Arad et al., Biochem. Biophys. Acta 859:88-94 (1986)). Diese Techniken können zur Einführung der vorliegenden 2',5' -Phosphorothioatoligoadenylate in Zellen benützt werden.
Es wird weiter erwartet, daß die Verbindungen der Erfindung in Form von Prodrugs verabreicht werden können, bei denen lipophile Gruppen zum Beispiel an die 5'-terminale Hydroxylgruppe der Kernverbindung gebunden sind.

Liposomenverkadselung von 2',5'- Phosphorothioatoligoadenylaten

Die Verkapselung der Verbindungen der vorliegenden Erfindung umfaßt eine weitere attraktive nicht-zerstörende Technik zur Einführung in Zellen. Die Liposomenverkapselung kann vorteilhaft gemäß der durch Kondorosi et al., FEBS Lett. 120:37-40 (1980) beschriebenen Technik bewerkstelligt werden.

BEISPIEL 19

Herstellung großer unilamellarer Vesikeln (Lidosomen). die mit 2',5'- Phosphorothioatoligoadenylaten beladen sind

Kurz gesagt wird ein Phospholipidgemisch aus Rinderhirn (Sigma Chemical Co., aus 80-85% Phosphatidylserin bestehende Folch-Fraktion III, wobei sich die restlichen 15% aus anderen Himlipiden zusammensetzten; 35 mg) in 5 ml Puffer A [0,1 M NaCl, 2 mM Histidin, 2 mM N-Tris(hydroxymethyl)methyl-2-aminoethansulfonsäure ("TES"), 0,4 mM EDTA (pH 7,4) durch Verwirbeln suspendiert. Die Suspension wird unter Stickstoff 10 Minuten bei 0ºC beschallt. Die Suspension wird nach Einstellen der Ca&spplus;&spplus;- Endkonzentration durch Zugabe von 125 Mikroliter 800 mM CaCl&sub2; 1 h bei 37ºC weiter inkubiert. Den sich daraus ergebenden Niederschlag läßt man durch Zentrifugieren (2500 x g, 10 min), Verwirbeln und Mischen mit 100 Mikroliter 1 x 10&supmin;&sup4; M 2',5'-Phosphorothioatoligoadenylat absitzen und löst in phosphatgepufferter Kochsalziösung. Die EDTA-Endkonzentration wird anschließend durch Zugabe von 400 Mikroliter Puffer B [150 mM EDTA, pH 7,4, 0,1 M NaCl, 2 mM Histidin, 2 mM TES] auf 120 mM eingestellt. Liposomen werden nach 30 Minuten Inkubation des Gemisches bei 37ºC gebildet. Der EDTA-Überschuß und unverkapselte Bestandteile werden entfernt, indem man die Liposomen durch eine Sephadex G-25-Säule gehen läßt, welche mit phosphatgepufferter Kochsalziösung äguilibriert ist. Etwa 10% des 2',5'-Phosphorothioatoligoadenylats werden durch dieses Verfahren in Liposomen verkapselt. Die Liposomensuspension ist nach der Herstellung bei 4ºC eine Woche stabil.

Herstellung wiederhergestellter Sendai-Virushüllen. welche 2',5,-Phosphorothioatoligoadenylat enthalten

Wiederhergestellte Sendai-Virushüllen können als wirkungsvolle Träger zur Einführung von Polynukleotiden in Zellen verwendet werden. Arad et al., Biochimica et Biophysica Acta 859:88-94 (1986), offenbaren die Einführung von poly(I) poly(C) in kultivierte Zellen durch die Verwendung wiederhergestellter Sendai-Virushüllen. Die Fusionierung der auf diese Weise beladenen, wiederhergestellten Sendai-Virushüllen führt zur Einführung der eingeschlossenen Makromoleküle in das Cytoplasma der Empfängerzelle.
Wiederhergestellte Sendai-Virushüllen können erhalten werden, indem unversehrte Sendai-Virusteilchen durch ein Detergenz in Lösung gebracht werden. Die wiederhergestellten Hüllen sind fusogene Träger, die aus den Virushüllen-Phospholipiden und ihren Glycoproteinen bestehen, welchen die Virusgenom-RNA fehlt.
Der Einbau der Verbindungen der vorliegenden Erfindung in die wiederhergestellten Sendai-Virushüllen für die fusionsvermittelte Mikroinjektion kann dadurch bewerkstelligt werden, daß dem Verfahren von Arad et al. gefolgt wird. Kurz gesagt wird ein Pellet aus Sendai- Virusteuchen (1,5 mg Protein) in 30 Mikroliter einer Lösung gelöst, die 10% Triton X-100, 100 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl (pH 7,4) und 0,1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (Verhältnis Triton X-100:Protein 2:1, Gew./Gew.) enthält. Dem nach dem Zentrifugieren erhaltenen klaren Überstand wird in einer Lösung A (160 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, (pH 7,4)) gelöstes 2',5'-Phosphorothioatoligoadenylat unter Ergeben einer Endkonzentration des aktiven Bestandteils von 5-20 mg/ml und eines Endvolumens von 150 Mikroliter zugesetzt. Triton X-100 wird aus dem Überstand durch direkte Zugabe von 40 mg SM-2 Bio-Beads entfernt. Die erhaltene trübe Suspension (die wiederhergestellte Sendai- Virushüllen enthält) wird 1 h bei 100000 x g zentrifugiert. Das etwa 10% ursprüngliches Virusprotein enthaltende Pellet wird anschließend in Lösung A unter Ergeben einer Proteinendkonzentration von 25 Mikrogramm/ml suspendiert.

Claims

1. Verbindung, weiche ein optisches Isomer der Formel

ist und im wesentlichen frei von einer Verunreinigung durch andere optische Isomeren derselben Formel ist, worin m null, 1, 2 oder 3 ist, n 1 oder 2 ist und wenigstens eine Internukleotid-Phosphorothioatgruppe

die Sp-Konfiguration hat, und wasserlösliche Salze derselben.

2. Verbindung gemäß Anspruch 1, wobei m 1 ist.

3. Verbindung gemäß Anspruch 1, wobei m 3 ist.

4. Verbindung gemäß Anspruch 1, wobei n 2 ist.

5. Verbindung gemäß Anspruch 1, wobei die der 2'/3'- Adenylat-Endstruktureinheit benachbarte Internukleotid- Phosphorothioatgruppe die Sp-Konfiguration hat.

6. (Rp)-P-Thioadenylyl-(2'-5')-(Sp)-P-thioadenylyl-(2'- 5')-adenosin, welches eine Verbindung von Anspruch 1 ist.

7. (Sp)-P-Thioadenylyl-(2'-5')-(Rp)-P-thioadenylyl-(2'- 5')-adenosin, welches eine Verbindung von Anspruch 1 ist.

8. (Sp)-P-Thioadenylyl-(2'-5')-(SP)-P-thioadenylyl-(2'- 5')-adenosin, welches eine Verbindung gemäß Anspruch 1 ist.

9. 5'-O-Phosphoryl-(Rp)-P-thioadenylyl-(2'-5')-(Sp)-P- thioadenylyl-(2'-5')-adenosin, welches eine Verbindung von Anspruch 1 ist.

10. 5'-O-Phosphoryl-(Sp)-P-thioadenylyl-(2'-5')-(Rp)-P- thioadenylyl-(2'-5')-adenosin, welches eine Verbindung von Anspruch 1 ist.

11. 5'-O-Phosphoryl-(Sp)-P-thioadenylyl-(2'-5')-(Sp)-P- thioadenylyl-(2'-5')-adenosin, welches eine Verbindung gemäß Anspruch 1 ist.

12. (Rp)-P-Thioadenylyl-(2'-5')-(Sp)-P-thioadenylyl-(2'- 5')-(Rp)-P-thioadenylyl-(2'-5')-adenosin und 5'-Mono-, Di- und Triphosphate desselben, welche Verbindungen gemäß Anspruch 1 sind.

13. 5'-Monophosphat gemäß Anspruch 12.

14. (Rp)-P-Thioadenylyl-(2'-5')-(RP)-P-thioadenylyl-(2'- 5')-(Sp)-P-thioadenylyl-(2'-5')-adenosin und 5'-Mono-, Di- und Triphosphate desselben, welche Verbindungen gemäß Anspruch 12 sind.

15. 5'-Monophosphat gemäß Anspruch 14.

16. (Rp)-P-Thioadenylyl-(2'-5')-(Sp)-P-thioadenylyl-(2'- 5')-(Sp)-P-thioadenylyl-(2'-5')-adenosin und 5'-Mono-, Di- und Triphosphate desselben, welche Verbindungen gemäß Anspruch 1 sind.

17. 5'-Monophosphat gemäß Anspruch 16.

18. (Sp)-P-Thioadenylyl-(2'-5')-(Sp)-P-thioadenylyl-(2'- 5')-(Rp)-P-thioadenylyl-(2'-5')-adenosin und 5'-Mono-, Di- und Triphosphate desselben, welche Verbindungen gemäß Anspruch 1 sind.

19. 5'-Monophosphat gemäß Anspruch 18.

20. (Sp)-P-Thioadenylyl-(2'-5')-(Rp)-P-thioadenylyl-(2'- 5')-(Sp)-P-thioadenylyl-(2'-5')-adenosin und 5'-Mono-, Di- und Triphosphate desselben, welche Verbindungen gemäß Anspruch 1 sind.

21. 5'-Monophosphat gemäß Anspruch 20.

22. (Sp)-P-Thioadenylyl-(2'-5')-(Sp)-P-thioadenylyl-(2'- 5')-(Sp)-P-thioadenylyl-(2'-5')-adenosin und 5'-Mono-, Di- und Triphosphate desselben, welche Verbindungen gemäß Anspruch 1 sind.

23. 5'-Monophosphat gemäß Anspruch 22.

24. Pharmazeutische Zusammensetzung umfassend eine Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 23 und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger.

25. Antivirale Zusammensetzung umfassend eine Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 23, welche in einer wiederhergestellten Sendaivirushülle enthalten ist.

26. Antivirale Zusammensetzung umfassend eine Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 23, welche in einem Liposom verkapselt ist.

27. Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 23 zur Verwendung in der Medizin.

28. Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 23 zur Verwendung beim Bekämpfen einer Virusinfektion.

29. Verwendung einer Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 23 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Verwendung beim Bekämpfen einer Virusinfektion.

30. Verfahren zum Bekämpfen einer Virusinfektion in Pflanzen, welches das Verabreichen einer antiviral wirksamen Menge einer Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 23 umfaßt.

31. Verfahren gemäß Anspruch 30, wobei die Verbindung (Sp)-P-Thioadenylyl-(2'-5')-(Sp)-P-thioadenylyl-(2'-5')- adenosin oder dessen 5'-Monophosphat ist.

32. Verfahren gemäß Anspruch 30, wobei die Verbindung (Rp)-P-Thioadenylyl-(2'-5')-(Sp)-P-thioadenylyl-(2'-5')- adenosin ist.

33. Verfahren gemäß Anspruch 30, wobei die Verbindung (Rp)-P-Thioadenylyl-(2'-5')-(Sp)-P-thioadenylyl-(2'-5')- (Sp)-P-thioadenylyl-(2'-5')-adenosin ist.

34. Verfahren gemäß Anspruch 30, wobei die Verbindung (Sp)-P-Thioadenylyl-(2'-5')-(Sp)-P-thioadenylyl-(2'-5')- (Sp)-P-thioadenylyl-(2'-5')-adenosin ist.