JPH06501692A

JPH06501692A - オリゴヌクレオチドの合成

Info

Publication number: JPH06501692A
Application number: JP3517413A
Authority: JP
Inventors: ホランド，デービッド; ガーマン，アンドリュー・ジョン; エッジ，マイケル・デレク; マクリーン，マイケル・ジョセフ
Original assignee: ゼネカ・リミテッド
Priority date: 1990-10-04
Filing date: 1991-10-01
Publication date: 1994-02-24
Also published as: CA2093356A1; GB9021625D0; EP0552185A1; WO1992006103A1; AU8650991A; AU665174B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】オリゴヌクレオチドの合成本発明はオリゴヌクレオチドの合成方法、該合成方法の実施中に使用できる新規化合物および自動オリゴヌクレオチドシンセサイザーでの使用に適する固体支持体に関するものである。

比較的低コストの合成オリゴヌクレオチドが利用できることは現代の分子生物学の発展にかなり重要である。ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）技術（ヨーロッパ特許２０１１８４−Ａに記載）は、合成オリゴヌクレオチドプライマーの易利用性に依存する最近開発された重要な技術の例である。この技術の基本はクレッペ（Ｋｌｅｐｐｅ）等（Ｊ、１ｌｏｆ、　Ｂｊｏｌ、（１９７１）、観、３４１〜３６１）によって最初に記載されたが、オリゴヌクレオチドの好都合な供給源が利用できるようになるまで、この技術は重要とは考えられなかった。オリゴヌクレオチド配列を迅速且つ効率的に製造し精製する方法が引き続いてめられている。

オリゴヌクレオチド配列またはその誘導体はリンカ−、アダプター、合成遺伝子用の構築ブロック、合成調節配列、プローブ、プライマーおよび他の目的として使用するために定型的に合成され、そして多（の方法がこのような配列を製造するために開発されてきた。

これらの方法は一般に、先ず適当に保護されたヌクレオシドの開裂可能な結合による固体支持体への最初の結合、次に多数の化学反応に係わるプリカーサ−がそれぞれ付加されている伸長オリゴヌクレオチドストランドに対する個々のヌクレオチドプリカーサ−の逐次反応に依拠している。孤立オリゴヌクレオチドの製造に現在量も一般的に使用される方法はホスホラミダイト化学に基づく方法である。これは、カルザース等のテトラヘドロン　レターズ（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｎｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ）、１９８１２２、（２０）　１８５９〜１８６２頁およびヨーａツバ特許第６１７４６号、および更にはコスタ−（Ｋｏｓｔｅｒ）等の米国特許４７２５６７７（Ｅ−ｏツバ特許１５２４５９）　並びにＭ、　Ｊ−ゲイト（Ｇａｉｔ）　（ｒオリゴヌクレオチド合成、実際の試み」、ＩＲＬプレスオクスフォード、３５〜８１頁）によって十分に記載されている。

ホスホラミダイト化学を使用して合理的な時間で良好な品質のオリゴヌクレオチドを製造できる幾つかのタイプの自動ＤＮＡシンセサイザーが現在市販で入手可能である　−例えば、３０個のヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチド（３０量体）は市販で入手できる自動シンセサイザーを使用して約３乃至５時間で定型的に製造することができる。

オリゴヌクレオチドの急速な需要増加に応えるために、このような市販のシンセサイザーの処理量を高める改良、すなわち１日当たりに合成されるオリゴヌクレオチド数を高める改良が望まれている。

孤立オリゴヌクレオチドが支持体上の個々のヌクレオチドプリカーサ−の逐次反応によってどのようにして製造され得るかについての実例的な説明はアプライドバイオシステムズＤＮＡシンセサイザーモデル（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅ＋ｏｓ　ＤＮＡ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓｅｒ　Ｍｏｄｅｌ）　３８０Ｂのプロトコール、特にその第２節に提供されており、これは本明細書に参照として組み入れるつ本発明者は今、伸長オリゴヌクレオチド鎖に必要であるとして導入された開裂可能なリンカ一部分を使用して、例えば市販の自動シンセサイザーで、同一の支持体上で１つより多いオリゴヌクレオチドを合成できるオリゴヌクレオチドの製造方法を開発した。

本願発明の第１の特徴に従って、本発明者は支持体上の個々のヌクレオチドプリカーサ−の逐次反応によって形成される複数のオリゴヌクレオチドの合成方法を提供する。その際該方法は、（ａ）第１のオリゴヌクレオチドを形成させ、（ｂ）上記第１のオリゴヌクレオチドに開裂可能なリンカ一部分を結合させ、（Ｃ）この開裂可能なリンカ一部分に第２のオリゴヌクレオチドを形成させ、そして（ｄ）このリンカ一部分を開裂させて所望のオリゴヌクレオチドを生じさせる工程からなる。

認められるように、第１のオリゴヌクレオチドは好ましくは支持体上で形成され、支持体は好ましくは自動オリゴヌクレオチドシンセサイザーで使用されるような固体支持体である。支持体の同一性は臨界的でなくそしてオリゴヌクレオチドの自動合成に使用される任意の支持体、例えば米国特許明細書４．４５８．０６６に開示されているような修飾無機ポリマー、シリカゲル、ポラシル（Ｐｏｒａｓ　ｉ　ｌ　）Ｃ１キーゼルグール（Ｋｉｅｓｅｌｇｕｈｒ）　ＰＤＭＡ、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、シリカＣＰＧ　（ＬＣＡＡ）または例えばアプライドバイオシステムズＤＮＡシンセサイザーモデル３８０Ｂで使用されている調節多孔ガラスであることができる。支持体は、開裂できるように結合された第１のヌクレオチドプリカーサ−を有することができ、例えば、固体支持体は例えばＭ、　Ｊ、ゲイトの本に記載されているような慣用の開裂可能なリンクによって任意に保護されたヌクレオシドに結合される。

第１のオリゴヌクレオチドはオリゴヌクレオチド合成に使用される慣用のテクノロジーによって、例えば上記した自動オリゴヌクレオチドシンセサイザーでホスホラミダイト化学を使用して形成させることかできる。第１のオリゴヌクレオチドは好ましくは当該技術分野で既知の加水分解可能な基（例えば塩基不安定基）によって支持体に結合される。

開裂可能なリンカ一部分は試薬、例えば修飾ヌクレオシドによってか、またはヌクレオシド要素を含有していない試薬によって第１のオリゴヌクレオチドに結合することかでき、この試薬は第１のオリゴヌクレオチドに結合でき且つそこに第２のオリゴヌクレオチドを形成でき、そしてオリゴヌクレオチドに有意に影響を与えない条件下で破壊して第１および第２のオリゴヌクレオチドを分離することができる。

「オリゴヌクレオチドに有意に影響を与えない条件」とはオリゴヌクレオチドを分解しない条件を意味する。このような条件の例は当該技術分野の熟練者に明白であり、例えば中性またはアルカリ性ｐＨ１例えば２以上のｐＨを使用しそして強い電子試薬を有さない条件である。強い核試薬、並びに四酸化オスミウムおよび他の既知のオリゴヌクレオチド修飾剤を使用する条件は避けることが好ましい。

本発明の第１の特徴は、Ｍ、　Ｊ、ゲイトが記載した上記方法に従って固体支持体上でリポースの３°ヒドロキシから３′から５°の方向に逐次構築された開裂可能なリンカ一部分Ｌ゛で分離される２′−デオキシアデノシン（ｄＡ　）、２゛−デオキシグアノシン（ｄＧ　）、２゛−デオキシシチジン（ｄＣ）および２ ′−デオキシチミジン（ｄＴ　）のホスホラミダイトの種々の組合せを使用する２オリゴヌクレオチドの形成によって説明することができる。合成後、固体支持体に結合された配列は次のとおりである・５°　３゜ｄ（＾ＣＴＴＬ’＾ＧＣＴＡ）　（１）リンカ一部分Ｌ゛および第１のオリゴヌクレオチドが固体支持体に結合している結合を開裂した後、２つのオリゴヌクレオチドが生じる。

５°　３゛５°　３゛ｄ（ＡＣＴＴ）・　ｄ（ＡＧＣＴＡ）かくして、２つのオリゴヌクレオチドが１つの固体支持体上で合成された。

従って、本願発明の好ましい第１の特徴は（ａ）固体支持体に結合した第１の開裂可能なリンク上に第１のオリゴヌクレオチドを形成させ、（ｂ）第１のオリゴヌクレオチドに開裂可能なリンカ一部分を結合させ、（Ｃ）この開裂可能なリンカ一部分上に第２のオリゴヌクレオチドを形成させ、（ｄ）第１の開裂可能なリンクと開裂可能なリンカ一部分を開裂させて複数のオリゴヌクレオチドを生じさせる、工程からなる複数のオリゴヌクレオチドの合成方法を提供する。

開裂可能なリンカ一部分が各第１および第２のオリゴヌクレオチド上の３′および５′酸素によって、更に好ましくはホスフェート、ホスフィツト、ホスフェートエステル、ホスフィツトエステルまたはＨ−ホスホネートエステルを介して第１および第２のオリゴヌクレオチドを結合させることが好ましい。

第１の開裂可能なリンクの同一性は臨界的であるとは考えられず、好ましくは塩基不安定基であり、そして例えば塩基不安定エステル基を有するリンクのような自動オリゴヌクレオチドシンセサイザーで使用される開裂可能な任意のリンクであることができる。

明らかなように、開裂されたリンカ一部分の有機残基、例えば炭化水素鎖は開裂工程（ｄ）後ヌクレオチドに結合させたままにしていることができる。しかし乍ら、開裂工程（ｄ）後開裂リンカ一部分の有機残基は、このような残基が有する可能性があるオリゴヌクレオチドの特性に対する悪影響を避けるためオリゴヌクレオチドに結合させたままにしないことが好ましい。

本発明の方法には、第１または第２のオリゴヌクレオチドに相補的であるオリゴヌクレオチドを含有する溶液と接触させることによる第１または第２のオリゴヌクレオチドと別のオリゴヌクレオチドとのハイブリッド形成を試みる工程は必要でないので含まれない。

本発明の第１の特徴には、それぞれが開裂可能なリンカ一部分によって連結されている更に多くのオリゴヌクレオチドを製造するために、工程（ｂ）および（Ｃ）を任意の所望の回数、例えば１から１００回、好ましくは１から５回繰り返すことが含まれる。認められるように、工程＜ｂ）および（Ｃ）を繰り返すとき、更に多くのオリゴヌクレオチドかそれまでに形成されたオリゴヌクレオチドに結合した開裂可能なリンカ一部分上に形成され、そしてそれらはそれまでに形成されたオリゴヌクレオチドと同一または異なっていることができる。

開裂可能なリンカ一部分は、例えば塩基加水分解によって開裂させて個々のオリゴヌクレオチドの混合物を生じさせることができ、これらは所望の場合精製しそして分離することができる。

本明細書では用語「オリゴヌクレオチド」には好ましくはオリゴデオキシリボヌクレオチド、オリゴリボヌクレオチドおよびそれらの類似体（例えば、保護基を有するもの）か含まれ、メチルホスホネートおよびホスホロチオエートまたはホスボロジチオエートジエステルバックポーンを有するもの並びにオリゴデオキシリボヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチド、特に本発明の方法で一層普通に合成される２°−オリゴデオキシリボヌクレオチドが含まれる。

好ましいオリゴヌクレオチドは本質的に一本鎖であるオリゴデオキシリボヌクレオチドであり、そして好ましくは少なくとも２個から、更に好ましくは少なくとも５個から、特に好ましくは１０個から２００個の塩基の長さである。

ＤＮＡシンセサイザーの使用者に対して、本発明の方法は該装置を一層有効に使用するという利点を与え、それによってオリゴヌクレオチドの製造および精製の費用が少なくなる。

ＤＮＡシンセサイザーはそのいずれか１つりカラム上に２つまたはそれ以上のオリゴヌクレオチド（これらは同一または異なっていることができる）を、各オリゴヌクレオチド間で再プログラミングしないで製造することができる。かくして、１つのオリゴヌクレオチドの合成が作業日外の時間に完了すると、シンセサイザーは操作を介在させなくてももう１つのオリゴヌクレオチドを製造し続けることができる。これによってこの種の装置の生産性が顕著に高められる。

本発明の方法はポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）技術用のプライマーの合成に特に有用である。現在、合成されるオリゴヌクレオチドの大部分はこの目的用である。このようなプライマーは典型的には対で要求され、本発明の方法は対のすりゴヌクレオチドの製造を可能にするので好都合である。単１カラムのシンセサイザーを使用するとき、および／または作業時間外に施設を十分に使用するために、上記のことは特に有利である。

個々のヌクレオチドのプリカーサ−は、５゛酸素原子で保護されているヌクレオシドホスホラミダイトであり、そして任意に保護された塩基であることが好ましい。ヌクレオシド塩基を保護する方法は当該技術分野で既知であり、例えば温和な酸またはアルカリ処理によって除去可能な保護基によるものである。アデニンおよびシトシンは任意に置換したＮ−ベンゾイル基でそしてグアニンはＮ−イソブチリル基で保護することができる。チミンおよびウラシルは一般的に保護を必要としない。アデノシンおよびグアニンはまたジメチルホルムアミドまたは７ヱノキシアセチル基で、モしてシトシンはイソブチリル基で保護することもできる。保護基は望ましくは、保護されたオリゴヌクレオチドを支持体から分離した後除去する。

リンカ一部分の開裂は、使用する化学に依存して保護基の除去前・除去中または除去後に行うことができる。保護基は水性の塩基、特に濃アンモニア溶液による処理で除去できることが好ましい。本発明の実施態様では、リンカ−は、保護基の除去およびリンカ一部分の開裂か１段階で行えるように塩基性またはアルカリ性条件下で開裂させる。使用される典型的な塩基性条件は保護されたオリゴヌクレオチドを例えば約５５℃で２４時間まで、特に約５乃至２４時間濃アンモニアと混合することである。リンカ一部分は開裂かこれらの条件下で完了するように選択することが好ましい１゜開裂を行うために他の塩基、好ましくは揮発性の塩基を使用することができる。これらは好都合には、好ましくは２０〜７０％の濃度の有機アミン水溶液、例えばピペリジンまたはメチルアミンであることができる。

本方法で使用するのに適する個々のヌクレオチドのプリカーサ−の例としては５°−ジメトキシトリチル−Ｎ−４−ヘンシイルー２゛−デオキシシチジン、５゛−ジメトキシトリチル−Ｎ−２−イソブチリル−２゛−デオキシアデンン、５゛−ンメトキシトリチルーＮ−５−ヘンシイルー２′−デオキシアデノノン、および５゛−ジメトキシトリチルチミジンの２−シアノエチル−Ｎ、Ｎ−ジイソプロピルアミノホスホラミダイトを挙げることができる。

オリゴリボヌクレオチドの合成用プリカーサ−は、Ｔ、　Ｓ−ラオ（Ｒａｏ）等のテトラヘドロン　レターズ、蔓、４８９７　（１９８７）で記載されているように、リポースの２゛位に保護されたヒドロキシル基、例えば第三級ブチルジメチルシリロキシ基またはＣＴＭＰと略される１−［（２−クロロ−４−メチル）フェニル］−４−メトキシピペリジン−４−イルオキシ基があることを除いてオリゴデオキシリボヌクレオチド用のプリカーサ−と同一である。

オリゴヌクレオチドの既知の適用では、即ちＰＣＲ用のプライマーとしては、オリゴヌクレオチドの５゛末端がホスフェート基またはヒドロキシ基を有するかどうかは重要でない。しがし乍ら、５′ホスフエート基を有するオリゴヌクレオチドの使用には関心が高まっている（例えば、Ｈｉｇｕｃｈｉ　＆　Ｏｃｋｍａｎ（１９８９）、Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ、　１７（１４）、５８６５頁参照）。それ故、５′ホスフエート基を有するオリゴヌクレオチドを生じさせる合成方法は価値がある。５゛ポスフエート基を有するオリゴヌクレオチドの更に有利な使用は５°リン酸化したオリゴヌクレオチドが所望される遺伝子の化学合成においてである。

従って、本発明の方法で使用される開裂可能なリンカ一部分は好ましくは、（１）開裂によって所望のオリゴヌクレオチドの５′と３′の両末端にＯＨ基を生じさせる部分かまたは（ＩＩ）開裂によって１つのオリゴヌクレオチドに遊離３’ 　ＯＨ基をそしてもう１つのオリゴヌクレオチドに５′ホスフエート基を生じさせる部分がのいずれかからなる。

かくして、本願発明方法の好ましい特徴では、工程（ｄ）は好ましくは、それぞれが３°および５゛位にヒドロキシ基およびポスフェート基から選択される基を有する所望のオリゴヌクレオチドを生じさせる。

オリゴヌクレオチドを合成するために現在使用される試薬には保護されたヌクレオシドホスホラミダイトが含まれる。それ故、本願力法で使用される開裂可能なリンカ一部分が修飾ヌクレオシドによって結合されると好都合であろう。

従って本発明はまた、上記第１のオリゴヌクレオチドに結合できそしてそこで第２のオリゴヌクレオチドを形成できる一般式（０）の修飾ヌクレオシド試薬も提供する：Ｚ−Ｎｕｃ−Ｌ’−０−ＰＡ　（ＩＩ）式中、Ｎｕｃ　は塩基が任意に保護されているヌクレオシドであり、Ｚ　はＮｕｃの５ °酸素に結合した保護基であり、−〇−ＰΔはホスホラミダイト基、ホスフェートエステル基、Ｈ−ホスホネート基、またはホスホジエステル基に変換できる他の基であり、そしてＬ′　は開裂可能なリンカ一部分であり、これは好ましくはＮｕｃの３′酸素に結合した加水分解可能な基である。

用語「加水分解可能な」は、塩基、例えば水性アルカリ、水酸化アンモニウムまたはピペリジンで処理することによってＬ′が２つまたはそれ以上の部分に開裂または分離され得ることを意味する。

式Ｚ−Ｎｕｃ−Ｌ’−０−ＰＡの修飾ヌクレオシドは好ましくは式（ＩＩＩ）である：式中、Ｚ、　Ｌ’および一〇−ＰＡは上記したとおりであり、Ｂは任意に保護された塩基、例えば任意に保護されたウラシル、チミン、シトシン、アデニン若しくはグアニン、またはそれらの類似体であり、モしてＤはＨまたは保護されたヒドロキシル基である。

ホスフェートエステル基およびＨ−ホスホネート基の例としては、それぞれ式：（式中、Ｚ、は保護基、好ましくは塩基不安定保護基、例えば２−クロロフェニルまたは２，４−ジクロロフェニルである）の遊離酸形ｓの基を挙げることができる。

好ましくは、−０−ＰＡは次の一般構造のホスホラミダイトである：特にＣ１４−アルキル、任意に置換されたアラルキル、特に任意に１換されたベンジル：１０個までの炭素原子を有するシクロアルキルおよびシクロアルキルアルキル、例えばシクロペンチル若しくはシクロヘキシルであるかまたはＲ４とＲ５はそれらが結合している窒素原子と一緒になって任意に置換されたピロリジン若しくはピペリジン環を形成するかまたはＲ４とＲ３はそれらが結合している窒素と一緒になって飽和窒素異項環（これは任意に、窒素、酸素および硫黄からなる群からの１つまたはそれ以上の異項原子を更に含む）を形成する。Ｒ４およびＲ５は好ましくはイソプロピルである。

Ｒ，は水素原子または保護基、例えばホスフェート保護基を表わす。ホスフェート保護基の例としては、任意に置換されたアルキル基、例えばメチル、２−シアノエチル、２−クロロフェニル、２．２．２−トリハロー１，１−ジメチルエチル、５−クロロキン−８−イル、２−メチルチオエチルおよび２−フェニルチオエチル基（その際、）工二ル環は例えば、ハロゲン、例えば塩素またはＮＯ２から選択される基によって任意に置換されている）を挙げることができる。好ましくはＲ６はメチルであり、更に好ましくは２−シアノエチルである。

上記式ＩＩのＮｕｃは慣用のヌクレオシドおよびチオキンヌクレオシド、（デオキシ）シチジン、（デオキシ）７デノシン、（デオキシ）グアノシン、（リボ）チミジンまたは（デオキシ）ウリジン並びにその類似体を表わす。ヌクレオシドの塩基部分は任意に保護基によって保護される。かくして、例えば、アデニン、シトシンおよびグアニン中のアミン置換基は当該技術分野で使用される任意の保護基（例えば、Ｅ　０ｈｔｓｕｋａ等のＮｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、（１９８２）、廷、６５５３〜６５７０に記載されているような）で保護することができる。

更に、２ｉ！ｉｌ；７１な塩基保護基はヌクレオチド化学者に明白であり、そして特にイソブチリルおよび任意に置換されたベンゾイルを含み、イソブチリル基はグアニンの保護基として特に適切でありそして任意に置換されたベンゾイル基はシトシンおよびアデニンの保護基として特に適切である。塩基か保護されているヌクレオシドには例えば、Ｎ４−ヘンジイルシトシン、Ｎ６−ベンゾイルアデニンおよびＮ２−イソブチリルグアニンが含まれる。塩基は必ずしも保護される必要はないと考えられ、その例はチミンおよびウラシルである。

上記式の２はヌクレオシドの５゛−ヒドロキシル基の保護基、特に酸不安定保護基を表わす。適当な保護基は当該技術分野の熟練者に明白であり、そしてＴ、　Ｌ　グリーン（Ｇｒｅｅｎｅ）によって記載された「有機合成における保護基」、ワイリーインターサイエンス（Ｖｉｌｅｙ　Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）で考察されているものを含む。このような保護基の例には、テトラヒドロピラニル、例えばテトラヒドロビラン−２−イル、４−メトキンテトラヒドロピラニル、例えば４−メトキシテトラヒドロピラン−２−イル、メトキシトリチル（好ましくはオリゴリボヌクレオチド合成用のみ）、ジメトキシトリチル、ビキシル、イソブチルオキシカルボニル、Ｌ−ブチルジメチルシリル等の保護基が含まれる。好ましくは、Ｚはジメトキシトリチルである。

理解されるとおり、−０−ＰＡがＨ−ホスホネートまたはホスホラミダイトである°とき、それらはそれぞれ、例えば水性ヨウ素または過酸化水素を使用して本方法の実施中にホスフェートジエステルまたはホスフェートトリエステル基に酸化される。Ｈ−ホスホネートの場合には、酸化は好ましくは工程（Ｃ）の後で且つ工程（ｄ）の前に実施され、一方ホスホラミダイトの場合には、酸化は好ましくは工程（ａ）および工程（Ｃ）の間に行われる。

式（ｒｕ）の修飾ヌクレオシド試薬では、Ｌ′は好ましくは以下で考察する構造を有する３つの部分（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）を含んでなるかまたはこれら３つの部分だけからなる。

部分（１）は好適には、開裂によって、例えば加水分解によって、それまで結合していたオリゴヌクレオチドの３゛末端に３゛ヒドロキシル基を生成させる基からなる。このような基の例としては、カルボニル、Ｃ０ＮＨおよびイミデート基を挙げることができる。好ましくは部分（ｉ）はカルボニル、Ｃ０ＮＨまたは一〇（＝ＮＨ，’）基であり、これはオリゴヌクレオチドの３′ヒドロキシル基の酸素原子と結合して加水分解可能な部分、特にカルボン酸エステル部分を生じさせる。それ故、好ましくは部分（１）は１−　基である。

部分（ｉｉ）は任意のスペーサー基、好ましくは自動オリゴヌクレオチド合成に適合できるスペーサー基、例えば二価の有機スペーサー基または炭化水素スペーサー基であることができる。好都合には、部分（！１）は、例えば長さが２から１５個の原子、好ましくは長さが２から６個の原子の二価の有機スペーサー基である。好ましい二価の有機スペーサー基は、１，２−１１．３−または１，４− フェニレン、シクロへクス１．４−１’ｌ／：／、−５−１−〇−１−ＳＯ２− １−ＮＨＣのような他の基によって任意に中断され、１つまたはそれ以上置換されまたは置換されていないメチレン基を含んでなるかまたはそれらだけからなる。

試薬の合成を促進するためおよび／またはスペーサー基がそれ自体折り重なる可能性を減らす要素を提供するために、任意の中断物が導入される。オリゴヌクレオチドの３′ヒドロキシルから伸長させる特に好都合な方法は無水コハク酸との反応によるものであり、従って部分（１）が−〇〇、−でありそして部分（２）か基−（ｃＨ２）２ＣＯ，Ｏ−であるかまたはそれを含む分離基が特に好適である。

部分（１ｉｉ）はホス７エートエステル基のベータ脱離をもたらし得る基からなることができる。この基は２つのタイプ、即ちタイプＡまたはタイプＢであることができる。

タイプＡは次の構造のものであるＱ　２　ＣＨＲ＋　ＣＲ、Ｒ３一式中、Ｑ２は一５ｏ２−のような電子吸引基であり、そしてＲ１、Ｒ２およびＲ３はそれぞれ独立してＨ若しくはアルキル、特にＣ１４−アルキルのような電子非吸引基、またはベータ脱離反応でそれ自体離脱基でないか或いは一〇−ＰＡによって導入されたホスフェートエステル基が脱離するとき干渉しない置換基である。或いはまた、Ｒ１は電子吸引基であることができる。

タイプＢは次の一般式のものである。

式中、Ｑｌは電子吸引基、例えば−Ｆ、−Ｒ４、−Ｎｏ２、−フェニル、アリール（例えばフェニル、置換フェニル、または好ましくはｐ−ニトロフェニル）、シアノ、−３ｏ１Ｒ（Ｒ＝アルキル）でありモしてＲ２およびＲ３は上記で定義したとおりである。

Ｒ１、Ｒ２およびＲ３はそれぞれ独立してＨまたはＣｌ−４−アルキル、更に好ましくはＨ若しくはメチル、特にＨであることが好ましい。

或いは、部分（ｉｉｉ）は次の式の基である：Ｒｓ　ＣＲｙ（Ｏ２０）　ＣＲｙＲａ−または−ＣＯ，〜０−ＣＲ？Ｒ１□−ＣＲ，Ｒ，。一式中、各Ｒ丁は独立してＨまたはＣｌ−４−アルキルであり、Ｒ８とＲ８のうち１つは単結合でありそして他はＨまたはｃｌ−４−アルキルであり、Ｒ１０とＲ１＋はそれぞれ独立してＨまたはＣｌ４−アルキルであるかまたはＲ７゜はＲ１，およびそれらが結合している炭素原子と一緒になって任意に置換した４、５．６または７員の脂環式環または異項環を形成し、そしてＺ２は保護基、好ましくは塩基不安定保護基である。

基（りは基（ｉｉｉ）の要素Ｑ２として利用できるように十分に電気陰性であることができると考えられる。このような場合には、Ｎｕｃの３゛酸素は基（１ｉｉ）に直接結合されそして基（ｉｉ）は必要でない。

これら部分は好ましくは、（１）、（ｌり、（ｉｉｉ）の順番に一緒に結合され、（１）と（ｉｉｉ）は構造（ＩＩＩ）に示されるようにそれぞれヌクレオシド（Ｎｕｃ）と−〇−ＰＡに結合される。

好ましくは開裂可能なリンカ一部分Ｌ°は次の式のものである・式中、Ｗは部分（！ｌ）で定義された二価の有機スペーサー基、特に−ＣＨ＝　ＣＨ２ＣＯ、ＯＣＨ２ＣＨ２−である。

Ｌ′は式（ＩＶ）であることが好ましい。

本発明の第１の特徴に従う方法を実施して式（ＩＴ）の１つまたは複数の基によって結合された複数のオリゴヌクレオチドを生じさせるとき、塩基で処理すると（ＩＶ）の矢印で示された点で開裂して複数のオリゴヌクレオチドを生成し、その１つは５゛リン酸化されている。

修飾ヌクレオチドは好ましくは式（Ｖ）（式中、Ｚ、ＢおよびＰＡは上記で定義したとおりである）のものである。

式（ＩＩ）または（ＩＩＩ）の−〇−ＦＡがホスホラミダイト基である化合物は、塩基としてジイソプロピルエチルアミンを使用して式Ｚ−Ｎｕｃ−Ｌ’−ＯＨの化合物と弐Ｘ’−ＰＡの化合物をＣＨ，Ｃ１２中で反応させて製造することができ、その際ＰＡは、−〇−が存在しないことを除いて一〇−ＰＡに関して上記で定義したホスホラミダイトであり、モしてＸＩは離脱基、例えばＣＩまたはＢｒである。

式（ＩＩ）または（ＩＩＩ）の−〇−ＰＡがホスフェートエステル基であるとき、式（ＩＩ）または（ＩＩＩ）の化合物はＭ、　Ｊ、ゲイトが上記の本に記載した方法に類似した方法を使用して式Ｚ−Ｎｕｃ−Ｌ’−〇Ｈの化合物と対応する遊離ホスフェートエステルのトリアシライドとの反応によって製造することができる。

式（ＩＩ）または（ＩＩＩ）の−０−ＰＡがＨ−ホスホネート基であるとき、式（ＩＩ）または（ＩＩＩ）の化合物はＢ、　Ｃ，フレーヘル（Ｆｒ。

ｅｈｅｒ）等、ヌクレイックアシッズリサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）、（１９８６）、曇、５３９９〜５４０７、が記載した方法に類似した方法を使用して１．２．４−トリアゾールの存在下で式Ｚ−Ｎｕｃ− Ｌ’−ＯＨの化合物とＰＣｌ３との反応によって製造することができる。

式Ｚ−Ｎｕｃ−Ｌ’−ＯＨの化合物は式Ｚ−Ｎｕｃ−ＯＨの化合物と適当な二官能性カルボン酸、例えばコハク酸の無水物との反応、続いてこうして製造された酸誘導体と適当なジヒドロキシ化合物、例えば２，２′−スルホニルジェタノールとのカップリングによって２工程で製造することができる。カルボン酸誘導体とジヒドロキシ化合物を上記のようにカップリングさせるためには、カルボン酸は当該技術分野で既知の方法、例えば、１，３−ジシクロへキシルカルボジイミドのようなカップリング剤の介在によって２分子のカルボン酸誘導体の縮合によって対称形の無水物をその場で形成させることによってヒドロキシル基と反応するように活性化することができる。

ヒドロキシ化合物と活性化カルボン酸誘導体との反応は１モル等量の塩基の存在下非プロトン性溶媒中で行うことができる。このようにして製造された式Ｚ−Ｎｕｃ−Ｌ’−ＯＨの化合物は好ましくは、幾つかの適当な手段、例えばクロマトグラフィーによって反応混合物から精製する。

式Ｚ−Ｎｕｃ−ＯＨの化合物は、好ましくは１モル等量の塩基の存在下非プロトン性溶媒中で式ＨＯ−Ｎｕｃ−ＯＨの化合物と式ｚ−Ｘ１（式中、ＸＩおよびＺは上記で定義したとおりである）の化合物との反応によって製造することができる。好ましくは、ｚ−ｘ’は２つ（またはＨＯ−Ｎｕｃ−ＯＨがリポヌクレオシドである場合には３つ）のうちただ１つの利用可能なヒドロキシル基に優先的に反応する化合物である。好ましくは、ｚ−ｘ’はＨＯ−Ｎｕｃ−ＯＨの５′−位の第一級ヒドロキシルと選択的に反応する。

好都合な修飾ヌクレオシドは式（Ｖｌ）　：（式中、Ｂは上記で定義したとおりである）のちのである。

構造■の例において、開裂可能なリンカ一部分Ｌ′は、第２のオリゴヌクレオチドの３′ヌクレオチドになるヌクレオシドからなる試薬（例えば、構造ＩＩの）によってかまたはヌクレオシド要素を有していない試薬によってかのいずれかで導入することができる。一般式（ＩＩ）の修飾ヌクレオシドは本発明の方法で記載した開裂可能なリンカ一部分を導入するために非常に重要である。しかし乍ら、所望の第２のヌクレオチドの３′ヌクレオシドがＡ、Ｇ、Ｔ、ＣまたはＵのどれであるかに依存して５つの上記ヌクレオシドが要求される。

経済性と便宜性のためには、ヌクレオシド要素を有さず、第１および第２のオリゴヌクレオチドの両方に結合でき、そしてオリゴヌクレオチド合成、例えばＤＮＡシンセサイザーで使用されるホスホラミダイト化学または他の化学に適合でき且つオリゴヌクレオチドから、例えば水酸化アンモニウム処理によって完全に除去できる単一の試薬を有することが望ましいう従って、本願発明は式（ＶＩＩ）の化合物を提供する。

Ｚｌ−０−Ａ’−Ｅ−Ａ２−０−ＦＡ　（ＶＩＩ）式中、ＡＩおよびＡｚはそれぞれ独立して式（Ｖｌｌａ）、（ＶＩＩｂ）、（Ｖｌｌｃ）または（ＹＩ　Ｉｄ）であり、その際星印で示された炭素原子は式（Ｖｌｌ）に示された酸素原子に結合している：Ｚｌ　は保護基であり。

Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｑｌ、Ｃ２および一〇−ＰＡは上記で定義したとおりであり：各Ｒ７は独立してＨまたはＣ１−４−アルキルであり：Ｒ８およびＲ１のうち１つは、式（ＶＩＩａ）の基がＥに結合している単結合であり、他の１つはＨまたはＣ１４−アルキルであり。

Ｚ２　は保護基、好ましくは塩基不安定保護基であり：ＲＩＧおよびＲ１１はそれぞれ独立してＨまたはＣ１１−アルキルであるかまたはＲ１゜とＲ１，およびそれらが結合している炭素原子は一緒になって任意に置換された４、５．６または７員の脂環式環または異項環を形成し。

Ｅ　は共有単結合またはスペーサー基であり、但しＡＩとＡＩが共に式（ＶＩＩｄ）であるとき、Ｅはスペーサー基である。

Ｚｌで表わされる保護基は好ましくは数本安定保護基であり、更に好ましくはＺに関して上記で示した数本安定保護基、特にジメトキシトリチルである。

Ｚ′が塩基不安定保護基であるとき、これは好ましくはＴ−ＩＩｌ、グリーン（Ｇｒｅｅｎ　）の上記水に開示された塩基不安定保護基、特にシリル基、例えばＬ−ブチルジメチルシリル、更に好ましくはＣｌ−４−アルカノイル基、または特に、驚いたことに式（ＶＩＩ）の特に安定な化合物を生じさせることが見い出されている任意に置換したベンゾイル基のようなアシル基から選択される。

Ｒｌ、　Ｒ２、Ｒコ、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１゜およびＲ１、のいずれかがＨまたはＣ７−１−アルキルであるとき、それは好ましくはメチル、更に好ましくはＨである。Ｃ２は好ましくは−５０２−である。

Ｅがスペーサー基であるとき、それは好ましくは上記の部分（１１）で定義したスペーサー基、更に好ましくは任意に置換されたアルキル、脂環式またはアリール基、特にフェニレン若しくは６個までの炭素原子を有するアルキル基である。

好ましい脂環式環は５または６員環、例えばシクロヘキシルまたはシクロペンチル環である。好ましい異項環は５または６員環、例えばフラニルまたはピラニル環である。

Ａ１とＡ２が共に式（ＶＩＩｎ）であるとき、Ｅは共有単結合、−（ＣＨｚ）− 一、−ＣＯ，ＮＨ（ＣＨ２）、ＮＨ−ＣＯ，−１−０−ＣＯ，−Ｇ−ＣＯ，−Ｏ −または−ＣＯ，−０−Ｇ−０−ＣＯ，−であることが好ましく、その際Ｇは− （ＣＨ２）−−、アリール、特にフェニル、またはシクロヘキシル、シクロへキシルメチレン若しくはシクロペンチルのような脂環式基でありそして各ｌは独立して１から６、好ましくは２から６、特に２の値を有する。

Ａ１とＡ２が共に式（ＶＩＩｂ）または（ＶＩＩｃ）から選択されるとき、Ｅは式−（ＣＨ，）、−または−（ＣＨ２）、−０−ＣＯ，−Ｇ−ＣＯ，−０−（ＣＨ２）、−であることが好ましく、その際■およびＧは上記で定義したとおりである。

ＡＩとＡ２が共に式（ＶＩｒａ）であるとき、Ｅは上記で定義した弐Ｇ１特に− （ＣＨ２）２−またはフェニルである゛ことが好ましい。

Ａ１が式（ｖＩＩａ）テアリモシテＡ２カ式（Ｖｌｌｂ）　ｉ！たｌｅｔ　（ＶＩＩｃ）　ｔ’アルドき、Ｅ　ハ式（ＣＢ２）−−１−Ｇ−Ｃｏ、Ｏ（ＣＨ２） −＊たは−Ｇ−０−ＣＯ，−（ＣＨ２）−−であることが好ましく、その際−およびＧは上記で定義したとおりである。

Ａ’、Ｉ＞＜式（ｖＩＩａ）テアリソシテＡ２カ式（ＶＩＩｄ）テアルトキ、Ｅは式−（ｃＨｚ）−−１−０，ＣＯ，−Ｇ−または−〇−ＣＯ，−０−Ｇ−であることが好ましく、その際■およびＧは上記で定義したとおりである。

ＡＩが式（ＶＩＩｂ）またハ（ＶＩＩＣ）　ＴありそしてＡ２が式（ＶＩＩａ）　テあるとき、Ｅは式−（ＣＨ２）、−１−（ＣＨ２）＝−０−ＣＯ，−Ｇ−または−（ＣＨ２）、−ＣＯ，−０−Ｇ−であることが好ましく、その際■およびＧは上記で定義したとおりである。

ＡＩが式（ｖＩＩｂ）マタハ（ｖＩＩＣ）テアリモシテＡ２カ式（ＶＩＩｄ）　テあるとき、Ｅは式−（ＣＨ２）、−または−（ＣＨ２）、ＯＣＯ，Ｇ−であることが好ましく、その際園およびＧは上記で定義したとおりである。

Ａ１が式（’／１ｉｄ）でありモしてＡ２が式（Ｖｌｌａ）であるとき、Ｅは式 −（ＣＨ，）、−１−Ｇ−０−ＣＯ，−Ｇ−または−Ｇ−ＣＯ，−０−Ｇ−であることが好ましく、その際ｍおよびＧは上記で定義したとおりである。

Ａ１が式（ｖＩＩｄ）テアリモシテＡ２カ式（ＶＩＩｂ）またハ（ＶＩＩｃ）　テあるとき、Ｅは式−（ＣＨ２）、−または−（ＣＨ２）、−０ＣＯ，−Ｇ−または−（ＣＨ２）、−ＣＯ，−０−（ＣＨ２）、−であることが好ましく、その際論およびＧは上記で定義したとおりである。

Ａ１およびＡ２は共に独立シテ式（ＶＩ　Ｉａ）、（ＶＩＩｂ）および（Ｖｌｌｄ）から選択されることか好ましく、その際星印で示された炭素原子は式（Ｖｌｌ）に示された酸素原子に結合されている。

式（ＶＩ　Ｉａ）で表わされる基の例としては−”ＣＩ！２−ｃＪｌ（ＯＺ２１ −ダ（２２＜（Ｏ２２）−０１，、＝　ヨヒ−Ｆ−ＯＫ（０２２１−ＣＩ［、。

を挙げることができる。

式＜ｙｏｂ）で表わされる基の例としては一＊Ｃ五２ＣＩ！２−５０２−ＣＩ！２−　オヨＣＦ　−”ＣＢＣＨ３−ＣＢ２−５０２−ＣＨ２−０を挙げることができる。

式（ＶＩＩｃ）で表わされる基の例としてはを挙げることかできる。

式（ＶＩＩｄ）で表わされる基の例としては一會Ｃ！！２ｃＨ２−ＯＣＯ，−オヨヒ−”Ｃ！！（Ｃ！！３１０！２−ＯＣＯ，−。

を挙げることができる。

式（ＶＩＩ）の化合物は本発明の方法で記載した第１と第２のオリゴヌクレオチド間に式−Ａ’−Ｅ−Ａ”−の開裂可能なリンカ一部分を結合するのに適当な試薬である。適当な条件下、例えば水酸化アンモニウムにより処理すると、化合物は開裂して式（ＶＩＩ）の化合物の任意の有機残基を有していない所望のオリゴヌクレオチドが生じる。これは、オリゴヌクレオチドが遊離またはリン酸化３″ または５′末端を有することが望まれる場合に特に価値がある。

式（Ｖｌｌ）の化合物の有用性は上記した式（Ｉ）の配列の製造を参照して説明することができる。例えば、式（１）のＬｌが式（ＶＩＩ）の化合物から誘導されるとき、Ａ２が式（ＶＩＩａ）または（ＶＩＩｄ）である場合には５’　−ＯＨを有する式ｄ（ＡＧＣＴＡ）のオリゴヌクレオチドが生じ、そしてＡＩが式（ＶＩ　Ｉｂ）または（ＶＩＩｃ）であるときには５゛ホスフエート基を有するｄ（ＡＧＣＴＡ）が生じる。従って、式（ＶＩＩ）　ノ化合物（７）Ａ２ヲ（Ｖｌｌａ）、（ＶＩＩｂ）、（ＶＩＩｃ）および（Ｖｌｌｄ）から適切に選択することによって、本発明の方法は、本発明の方法に従って製造される第１、第２およびその後のオリゴヌクレオチドが３゛位にヒドロキシ基を有するのかどうかまたは５′位ｌこヒドロキシ基若しくはホスフェート基を有するのかどうかを選択できるという大きな利点を提供する。

−０−ＰＡがホスホラミダイトである式（ＶＩＩ）の化合物は、塩基としてジ（Ｎ−イソプロピル）エチルアミンを使用してＣＨ２Ｃｌ□中で式Ｚ’−０−Ａ’ −Ｅ−Ａ２−ＯＨの化合物を式Ｘ’−ＰＡ（７）化合物と反応させて製造することができる。、ＰＡは好ましくは、−Ｇ−が無いことを除いて一〇−ＰＡに関して上記で定義したホスホラミダイトであり、そしてＺｌ、Ａ１、ＥおよびＡ２は上記で定義したとおりであり、モしてＸｌは離脱基、例えばＣＩまたはＢｒである。

式（ＶＩＩ）の−０−ＰＡが上記で定義したホスフェートエステル基であるとき、式（ｖＩＩ）の化合物は、Ｍ、　Ｊ、ゲイトの上記率に記載されている方法に類似する方法を使用して式Ｚ’−０−Ａ’−Ｅ−Ａ２−ＯＨの化合物を対応する遊離のホスフェートエステルと反応させて製造することができる。

式（ＶＩＩ）の−〇−ＰＡＨ−が上記で定義したＨ−ホスホネート基であるとき、式（ＶＩＩ）の化合物は、Ｂ、　Ｃ，フレーラ−（Ｆｒｏｅｈｌｅｒ）等、ヌクレイツクアシッドリサーチ、（１９８６）、１４．５３９９〜５４０７、が記載した方法と類似した方法を使用して１，２．４−トリアゾールの存在下で式Ｚ ’−０−Ａ’−Ｅ−Ａ２−ＯＨ（７）化合物とＰＣｌ、との反応で製造することができる。

式Ｚ’−０−Ａ’−Ｅ−Ａ２−ＯＨの化合物はＺｌ−０−Ａ’−Ｅ−Ａ２−０− ＴＢＤＭＳの化合物の脱保護によって製造することができ、その際Ｔ　Ｂ　Ｄ　Ｍ　Ｓはｔ−ブチルジメチルシリル基（これはＴＨＦ中テトラブチルアンモニウム７０リドを使用して除去できる）または中性条件下で除去できる他の保護基である。

ＡｌまたはＡ２が式（Ｊｌｌａ）であるとき、式Ｚ’−０−Ａ’−Ｅ−Ａ２−０ −ＴＢＤＭＳ（７）化合物は式Ｚ’−０−Ａ’−Ｅ−Ａ４−０−ＴＢＤＭＳ　（式中、ＡＪはｚ２が存在するときにはＨであることを除いてＡＩに関して定義したとおりであり、モしてＡ４はＺ２が存在するときにはＨであることを除いて八２に関して定義したとおりである）の化合物を式Ｚ２ＸＩ（式中、ＸＩは離脱基、例えばＣＩまたはＢｒである）の化合物（例えば、塩化アセチル若しくは臭化プロパノイルのようなＣ１−４−アルカノイルハライドまたは任意に置換されたベンゾイルハライド）との反応によって製造することができる。式Ｚｌ−０−ＡコーＥ−Ａ’−０−ＴＢＤＭＳの化合物はＺｌ−０−Ａ３−Ｅ−Ａ’−ＯＨとＴＢＤＭＳ−ＣＩの反応によって製造することができる。Ｚ’−０−Ａ’−Ｅ−Ａ４−ＯＨは、好ましくは非プロトン性溶媒中１等Ｉのピリジンのような塩基を用いてＨＯ−Ａ’−Ｅ−Ａ４−ＯＨとＺ’−ＣＩを反応させて製造することができ、そしてクロマトグラフィーのような標準的な精製技術でＺ’−０−Ａ’−Ｅ− Ａ４−０−Ｚ’を除去する。

ＡＩおよびＡ２がツレツレ式（ＶＩＩｂ）、（ＶＩＩｃ）またハ（Ｗｉｌｄ）　ｔ？アルとき、式ｚＩ−ｏ−Ａ１−Ｅ−Ａ２−ｏＨの化合物は、好マシくは非プロトン性溶媒中上記のＤＣＣＩまたは１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３ −エチルカルボジイミドのような適当な縮合剤を使Ｊ’ｌｆＮ、ｒ式Ｚｌ−０− ＡＩ−Ｅ−Ｃｏ２Ｈの化合物と式ＨＯ−Ａ２−ＯＨの化合物との反応によって製造することができる。

式Ｚ’−〇−Ａ’−Ｅ−ＣＯ２Ｈの化合物は、好ましくは非プロトン性溶媒中等モル量の塩基の存在下で式Ｚ’−０−Ａ’−ＯＨの化合物と式ＨＯ２Ｃ−Ｅ−Ｃｏ２Ｈの化合物の活性体との反応によって製造することができる。ジカルボン酸は酸無水物、酸クロライド若しくは何らかの他の適当な誘導体として存在することによってヒドロキシル基による攻撃に対して活性化させることができ、またはこの反応に上記したカップリング剤を存在させて介在させることができる。

式Ｚｌ−０−ＡＩ−ＯＨの化合物は、無水の非プロトン性溶媒中等モル量の塩基の存在下で式ＨＯ−Ａ’−ＯＨの化合物とＺｌ−ＣＩの反応によって製造することができる。

式（Ｖｌｌ）の化合物およびそのプリカーサ−を製造する上記方法において、Ｚｌ、Ａ’、Ｅ、Ａ２．０、ＰＡおよびＺ２は、別に記載されている場合およびＤＣＣＩが１，３−ジシクロ口へキシルカルボジイミドであることを除いて、上記で定義したとおりである。

本発明の更にもう１つの特徴に従って、好ましくは３′および５′酸素原子によって、式−ＡＩ−Ｅ−Ａ２−または−Ｌ゛−（式中、Ａ１、ＥおよびＬ゛およびＡ２は上記で定義したとおりである）の開裂可能なリンカ一部分を有する１つまたは複数の基によって結合された２つまたはそれ以上のオリゴヌクレオチドからなる化合物が提供される。開裂可能なリンカ一部分および式−ＡＩ−Ｅ−Ａ２− または−Ｌ′−はＨ−ホスホネート、ホスフェート、ホスフィツト、ホスフェートエステルまたはホスフィツトエステル結合によってそれぞれのオリゴヌクレオチドに結合していることが好ましい。オリゴヌクレオチドの１つは支持体に結合していることが好ましい。

Ｈ−ホスホネート結合は式−ＨＰ（＝Ｏ）−であり、好ましいホスフェートエステル結合は式−Ｐ（＝Ｏ）−ＯＲ，、−であり、そして好ましいホスフィツト結合は式−Ｐ（−ＯＲ，）−であり、その際Ｒ６は上記で定義したとおりである。

支持体上の孤立オリゴヌクレオチドの合成に現在使用される殆どの方法の１つの特徴は、既に結合された第１の（３′）ヌクレオシドを有する市販で入手可能な支持体を用いて開始されることである。

これは主として、孤立オリゴヌクレオチドと固体支持体間に開裂可能なリンクを提供することが必要なためである。これまで、オリゴヌクレオチドにヌクレオチド要素を導入する唯一の手段として保護されたヌクレオシドプリカーサ−を使用することは上記によって妨げられていた。既に結合された第１のヌクレオシドを有する支持体を使用しないで支持体上にオリゴヌクレオチドを合成できる方法の需要がある。

式（ＩＩ）または（ＶＩＩ）の化合物はまた、結合された第１の開裂可能なリンクを有していない支持体を結合された第１の開裂可能なリンクを有している支持体に変換するために使用できることも本発明者は見い出した。

従って、本願発明の更にもう１つの特徴は上記で定義した式（ＩＩ）または（ＶＩＩ）の化合物と開裂可能なリンクを有していない固体支持体の縮合によって開裂可能なリンクを有する固体支持体を製造する方法からなっている。

この更なる特徴においては、固体支持体は好ましくは、ヒドロキシルまたはアミノ基、好ましくはヒドロキシル基、例えば自動オリゴヌクレオチド合成で使用される上記固体支持体の１つを有する慣用の支持体の１つである。式（ＩＩ）または（Ｖｌｌ）の試薬との反応は既知の方法と類似する方法で行うことができる。

試薬（ＩＩ）または（ＶＩＩ）の−〇−ＰＡの性質に依存して、開裂可能なリンクはヌクレオチドプリカーサ−の場合と同様にして自動核酸シンセサイザーによって導入することができる。本発明のこの特徴においては、ベーター脱離部分を有していない式（ＩＩ）または（Ｖｌｌ）の試薬（例えば、Ａ２が式（ＶＩＩａ）または（ＶＩＩｄ）である場合）の使用は、これらが開裂後に固体支持体の望ましくないリン酸化を生じさせないので、好ましい。ベーター脱離基を有していない試薬の好都合な特徴はヒドロキシル含有支持体のヒドロキシル基が再生され、更なるオリゴヌクレオチドを合成するために支持体を再使用できるようになることである。

本発明のこの更なる特徴の一般的な利点は、結合された第１のヌクレオシドを有する支持体の購入または合成を回避することである。

これは、第１の結合されたヌクレオシドを有する支持体が容易に入手できない慣用でない構造のオリゴヌクレオチドの合成に特に有利である。

本願発明の更にもう１つの特徴は、式（ＶＩＩＩ）または（ＩＸ）　：５ＵＰ− Ｐ’−Ｌ’−Ｎｕｃ−Ｚ　（ＶＩＩＩ）ＳＵＰ−ＰＩ−Ａ２−Ｅ−Ａ’−０−Ｚ ’　（ＩＸ）（式中、Ｌ′、Ｎｕｃ、Ｚ、Ａｌ、Ｅ、Ａ’およびＺｌは上記で定義したとおりであり：ＳＵＰ　は固体支持体、好ましくは自動オリゴヌクレオチドシンセサイザーに使用するのに適するヒドロキシまたはアミノ基を有する固体支持体であり、そしてＰｌは式。

（式中、Ｒ６およびＺ３は上記で定義したとおりである）である）の自動オリゴヌクレオチドシンセサイザーに使用するのに適する固体支持体を提供する。

ＳＵＰは好ましくは自動オリゴヌクレオチド合成に使用される上記固体支持体の１つである。

本発明を次の非限定的な実施例によって説明する：実施例１試薬Ｍ１．５°−０−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２゛−デｔ±シチミジンー３゛−イル２−（２−［２−シアノエトキシ）Ｎ、　Ｎ−（ジイソプロピルアミノ）ホスファニロキシ］エチルースルホニル）エチルサクシネートの製造。

これは以下に記載する１から３と番号を付した工程を使用して合試薬Ｍ１は式（ＶＩ）のＢがチミジニルのものである。

工程１：ピリジニウム５“−０（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−デオキシチミジン−３′−イル２−ピリジニウムサクシネート。

この化合物はヌクレイックアシッズリサーチ（１９８０）、８　（５）、１０９０にゲイト等が記載した方法で製造した。

至桿ｌ゛５°−０−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２′−デオキシチミジン−３′ −イル２−（２−ヒドロキシエチル−スルホニル）エチルサクシネート。

５−０　（４，４’−ジメトキシトリチル）−２°−デオキシチミジン−３′− イル２−ピリジニウムサクシネート（３，０ｇ、４．２ミリモル）はアルゴン雰囲気下でジシクロへキシル−カルボジイミド（０，４３ｇ、　２．１ミリモル）のジクロロメタン（４０■ｌ）溶液に添加した。反応混合物は室温で４０分間撹拌し、そしてろ過後、真空下で乾固した。残渣は乾燥した蒸留ピリジン（３０■ ｌ）に溶解させ、そして４５℃未満でトルエンと共に共沸蒸留して乾燥した（爆発の危険性に注意）スルホニルジェタノール（０，３８ｇ　、　３．１４　ミリモル）をアルゴン雰囲気下で上記溶液に加えた。反応混合物は室温で一夜撹拌し、次いで溶媒を減圧下で留去した。粗生成物（２，７ｇ）は、残渣を乾燥トルエン（２×３抛ｌ）と−緒に共沸させた後、淡黄白色の泡状物として得た。生成物（０，３８ｇ、　０．５ミリモル、１２．５％）は溶出液としてメタノール：ジクロロエタン（３４７，２０００ｍ１）を用いるシリカゲル（Ｍｅｒｃｋ　Ａｒｔ　Ｎｏ。

９３８５．２５０　ｇ　）クロマトグラフィーにかけた後白色固形物として得た。

ＩＨＮＭＲ（δ）　（ＣＤＣｌ２．４００ＭＨｚ）：　８．５６　（ＩＨ，ｓ、　ＮＨ）、７−２５　（９Ｌ■、芳香族プロトン）、６．８３（４Ｈ１ｄ、芳香族プロトン）、６．３８（１１１１、ｄｄ、Ｈ−１’　）、５．４６　ＣＬＨ，曹、ト３゛）、４．５８　（２Ｈ，ｔ、２Ｈ−９）、４．１５（Ｉｎ２園、Ｈ− ４’　）、４．８６　（２Ｈ，ｔ、　２Ｈ−１２）、３．８０（６１１、ｓ、　２　Ｘ　０ＣＨ３）、３．４７（４Ｈ，ｓ、２ト１０および２８−５’　）、３．２７　（２１１１，ｔ、　２Ｈ−１１）、２−９０　（ＩＨ，ｔ。

ＯＨ）、２．６８　（４ｆｌ、　ｓ、　２１１−７および２ト８）、２．４７（２１１、■、２Ｈ−２’　）、１．３８（３Ｈ，ｓ、　ＣＨ３）。

工程１５’−０−（４，４’−ジメトキシトリチル）−・２′−デオキシチミジン−３゛−イル２−（２−［２−シアノエトキシ）−Ｎ、Ｎ−（ジイソプロピルアミノ）ホスファニロキシ］エチルスルホニル）エチルサクシネート（即ち、試薬Ｍ　ｌ　）。

５’−０−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２′−デオキシチミジン−３゛ −イル２−（２−ヒドロキシエチルスルホニル）エチルサクシネート（２００１ｇ、０．２６ミリモル）はＮ、Ｎ−（ジイソプロピルエチルアミン（１゜０ミリモル、０．１３ｇ、　０．１７腸ｌ）の乾燥ジクロロメタン（５■り溶液に添加した。撹拌溶液はアルゴン雰囲気下室温で維持し、そしてクロロ−Ｎ、Ｎ−ジイソプロピルアミノ−〇−シアノエチルホスフィン（０，２６ミリモル、６１．５層ｇ１４１マイクロリットル）のジクロロメタン（１ｍｌ）溶液を１０分間で加えた。６０分後、更にクロロ−Ｎ、Ｎ−ジイソプロピルアミノ−Ｏ−シアノエチルホスフィン（０−１３ミリモル、３０、７５１１ｇ、２０．５マイクロリツトル）を添加した。減圧下溶媒を留去して粗生成物を得、そして生成物は溶出液としてトリエチルアミン：酢酸エチル：ジクロロメタン（４：　３　：　３．１００ｍ１）を用いるシリカゲル（Ｍｅｒｃｋ　Ａｒｔ　Ｎｏ、９３８５．１３ｇ）クロマトグラフィーにより無色の油（４５，３■ｇ％１８％）として単離した。

ＩＨＮＭＲ（δ）　（ＣＤＣｌ２．４００ＭＨｚ）；　７．６１　（ＬＨｌｓ、　ＮＨ）、７．２５　（１９Ｈ１讃、芳香族プロトン）、６．８３　（４Ｈ，ｄ、芳香族プロトン）、６．４（ＬＨｌｄｄｌ　■−１゛）、５．４８（１１１，鳳、■−３′）、４．５８（２Ｍ％　ｔｌ　■　９）、４．１７　（ＩＨＳ　園、Ｈ−４°）、４．０８　（２Ｈ，ｍ、２Ｈ−１２）、３．８２（２１１，コンプレックスｖａ、　０（Ｊｊ２０）、３．３０　（２Ｈ，コンプレックス−１２Ｈ−１１）、２．６８　（６Ｆｌ、■、２ドア、２Ｈ−８、Ｃ［１２ＣＮ）、２．４５　（２１’ｌ、■、２Ｈ−２’　）、１．３６　（３１Ｔ、　ｓ、　ＣＨ３）、１．１８（１上記製造３の生成物を下記のようにして使用して、固体支持体に結合した１つのヌクレオシドから２つのオリゴヌクレオチドを合成するために開裂可能なリンカ一部分Ｌ°を導入した。

配列ＴＣＴＡＡＣＡＧＣＴＧＡＴＣＴＬ″ＣＡＧＣＴＧＡＴＣＣの十分に保護されたオリゴデオキシリボヌクレオチドは、調節多孔ガラスに３°−ＯＨおよびサクシニルグリシルグリシルアミノ−プロピルスペーサー（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉ。

５ｙｓｔｅ■ｓ　Ｉｎｃ）を介して結合した５゛−ジメトキシトリチル−Ｎ−４ −ベンゾイル−２′−デオキシシチジンと、５゛−ジメトキシトリチル−Ｎ−４ −ベンゾイル−２゛−デオキシシチジン、５°−ジメトキシトリチル−Ｎ−２−イソブチリル−２゛−デオキシアデンン、５°−ジフトキントリチル−Ｎ−６−ペンゾイルー２゛−デオキシアデノシン、５゛−ジメトキシトリチルチミジン（Ｃｒｕａｃｈｅ■Ｌｔｄ）および２−（２ −［（２−シアノエトキシ）Ｎ、Ｎ−（ジイソプロピルアミノ）ホスファニロキシ］エチルスルホニル）エチルサクシネート（試薬Ｍ＋）の２シアノエチル−Ｎ、Ｎジイソプロピルアミノホスホラミダイトからアプライドバイオシステムズ３８０Ｂ　ＤＮＡシンセサイザーで製造した。この実施例では、Ｌｏは次の構造で表わされる：理解されるように、１つのオリゴヌクレオチド末端の３′酸素はり。

（示されている）の左側に直接結合しそして他のオリゴヌクレオチド末端の５° 酸素はＬｏの右側にホスフィツト結合−０−Ｐ（＝Ｏ）（−０ＣＨ２ＣＨ，ＣＮ）−を介して結合している。

上記配列にＴＬ’を導入する試薬Ｍ１を導入するために、５位の通常のホスホラミダイトの代わりに１．２−ジクロロエタン：無水のアセトニトリル（ＬＯ：９．０．９５ｍ１．０．１Ｍ）中の５’−〇−（４，４−ジメトキシトリチル）− ２′−デオキシチミジン−３゛−イル２−（２−［（２−シアノエトキシ）Ｎ、　Ｎ−（ジインプロピルアミノ）ホスファニロキシ］エチルスルホニル）エチルサクシネート（９０ｍｇ）をアプライドバイオシテムズ３８０Ｂ　ＤＮＡシンセサイザーで使用した。本方法は簡単に言えば、（１）ジクロロメタン中３％のトリクロロ酢酸によるジメトキシトリチル基の除去：　（２）テトラゾールで１分間活性化した５′−０−（４，４−ジメトキシトリチル）−２′−デオキシチミジン−３°−イル２−（２−［（２−シアノエトキシ）Ｎ、Ｎ−（ジイソプロピルアミノ）ホスプアニロキシコエチルスルホニル）エチルサクシネート（１，２ −ジクロロエタン：無水のアセトニトリル、ｌＯ：９中０．１Ｍ溶液）のカップリング：　（３）中間ホスフィツト結合のホスフェート結合へのヨウ素酸化：　（４）無水酢酸によるキャップ形成工程からなっている。

脱トリチル化したオリゴデオキシリボヌクレオチド配列は固体支持体から開裂させそして更に開裂可能な結合部分（Ｌ′）でも開裂させ、そして水酸化アンモニウム溶液（比重０．８８）を用いて５５℃で１６時間処理して完全に脱保護化させる。水酸化アンモニウム溶液を留去し、モして残渣を滅菌水（１■ｌ）に溶解させた。この生成物は、溶出液Ａ（６０％ホルムアミド）および溶出液Ｂ（６０％ホルムアミド中０．３Ｍのオルトリン酸二水素カリウム）を用いて、溶出液Ｂカ３０分間で０〜８５％になるように傾斜させてバーチシル（Ｐａｒｔｉｓｉｌ）　ＳＡＸ　１（１ミクロンカラム（Ｊｏｎｅｓ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）を使用するｌ’１ＰＬｃで分析した。このクロマトグラフィーによって、１Ｏ９５，１３，９および１４．８分後にカラムから溶出された概ね等容量の３つのオリゴヌクレオチド配列の存在が明らかになった。これらの生成物はそれらの溶較して同定し、そして配列・ｄＣＡＧＣＴＧＡＴＣＣ（溶出時間、１０．５分）−一５”−リン酸化ｄＣＡＧＣＴＧＡＴＣＣ（溶出時間、１４．９分）およびｄＴＣＴＡＡＣＡＧＣＴＧＡＴＣＴ　（溶出時間、１４．８分）のオリゴヌクレオチドであることが示された。１０．５分後に溶出した配列は試薬Ｍｌとオリゴヌクレオチド配列ＣＡＧＣＴＧＡＴＣＣの部分的カップリング反応およびキャップ形成法による更なる鎖伸長の終結の結果であった。

害屋廻１本発明方法は、固体相に結合した１つのデオキシヌクレオシドから２つのオリゴデオキシリボヌクレオチドＰ、　Ｃ，Ｒ，プライマーを合成する際に使用した。

配列の十分に保護されたオリゴデオキシリボヌクレオチドは、調節多孔ガラス支持体に３’　−ＯＨおよびサクシニルグリシルグリシルアミノプロビルスペーサーを介して結合した５’　−（４，４’−ジメトキシトリチル）−Ｎ−６−ペンゾイルー２′−デオキシアデノシンからアプライドバイオシステムズ３８０Ａ　ＤＮＡシンセサイザーで製造した。２つのＰ、　Ｃ，Ｒ，プライマーは、試薬Ｍがテトラゾールによる２、５分間の活性化で２回処理して導入されたことを除いて、実施例２に記載したのと同一の試薬、合成方法、開裂および脱保護化方法により得られた。

合成完了後、固体支持体からの開裂、開裂可能なリンカ一部分の開裂および塩基保護基の除去は全て、通常のオリゴ合成プロトコールに従って、アンモニア溶液中でのインキュベーションで達成された。次いで、オリゴマー対を有するアンモニア溶液を凍結乾燥し、残渣は１■ｌの水に再溶解し、そしてＤＮＡ濃縮物を分光光度計で測定した。このようにして製造されたオリゴデオキシリボヌクレオチド混合物は以下「プライマー　ミックス１」と称する。

他の２つのＰＣＲプライマーは標準的な手段によって個々に製造し、プライマー　ミックス１を使用して行われるＰＣＨの有効性の比較として使用した。プライマーの配列は次のとおりである：−オ’Ｊ　コ１：　５°−ＣＴＡＴＴＣＡＡＡＡＴＣＧＧＡＧＣＴＣＴＡＡＧＡＴ　３’オリコ２：５°−ＴＡＧＧＧＡＴＴＴＧＡＴＴＴＴＡＣＧＡＧＡＧＡＧＡ　３’ポリメラ一ゼ鎖反応アッセイは次のようにして開始した：総容ｊ１１００ｍｌ中、各管ハ５０　ｄ　ＫＣＬ　１０　ｍＷ　トＩＪ　スＣＩ　（ｐＨ９，０）、１．５ｄ　ＭｇＣｌ２．０．０１％ゼアｆ−／（ｖ／ｖ％）、０．１％　トリトンＸ　１００　（７）最終濃度を有していた。容管はまたｄＡＴＰ、　ｄＧＴＰ、　ｄＣＴＰＳｄＴＴＰのそれぞれ５０マイクロモルの最終濃度も有していた。容管は３０ｎｇのトラコーマクラミジア（Ｓｅｒｏｖａｒ　Ｌ２）ゲノムＤＮＡおよび２．５単位のＴａｇ　ＤＮＡポリメラーゼを有していた。容管のＰＣＲプライマーの量は次の通りであった・管１．１００ピコモルのオリゴ１．１００ピコモルのオリゴ２：管２．７５ピコモルのオリゴＬ１００ピコモルのオリゴ２：管３．５０ピコモルのオリゴ１．１００ピコモルのオリゴ２；管４．２５ピコモルのオリゴＬ１００ピコモルのオリゴ２；管５、ｌｏピコモルのオリゴ１．１００ピコモルのオリゴ２：管６．１００ピコモルのプライマーミックス　１：管７．２００ピコモルのプライマー　ミックス　１０１００マイクロリツトルのヌジョール油を各溶液の頂部に置き、そして容管は６０℃で１分間、７２℃で２分間、９４℃で１分間の加熱プロトコールの熱サイクラ−中でインキュベートし、そしてこのサイクルを４０回繰り返した。

容管から得た２０マイクロリツトルは、０．１％のブロモフェノールブルー、０．１％のキシレンシアツールを含有スる５０％のグリセリン２マイクロリツトルと混合し、そしてこの混合物は臭化エチジウム（０，５マイクログラム／■Ｉ）を含有する１％アガロースゲル上に載せた。ゲルにはＱｘ１７４のサイズマーカーも入れた。予期された１７７　ｂｐのＰＣＲ生成物の存在がレーン１〜５のみならずレーン６および７にはっきりと見られたので、ＰＣＲは本発明方法に従って製造されたプライマ一対を使用して作動することが証明される。

阻上記したＰＣＲ生成物の電気泳動分析。レーン１〜７はそれぞれ上記の’１１〜７からの試料を含有している。レーンＭは０Ｘ１７４のサイズマーカーである。

実施例４試薬Ｍ２：　１Ｏ（４，４°−シメトキ’、ｒ　トリチル）−２，３−シー０　ヘンシイルー４−０−（２シアノエチル−Ｎ、Ｎ−ジイソプロピル）ホスホラミジトスーし追ヒニ土Δ聚虞よこれは以下に記載した１から５と番号を付した製造を使用して合試薬Ｍ２の構造は次のとおりである式中、ＤＭＴは：である。

工程１）１０−（４，４−ジメトキシトリチルヌレイトールの覧潰スレイトール（Ａｌｄｒｉｃｈ、　６．１ｇ、　５０ミリモル）の乾燥ピリジン（Ａｌｄｒｉｃｈ、　２００■Ｉ）溶液に室温で４，４′ジメトキシトリチル塩化物（Ｃ。

ｕｒｔａｕｌｄｓ、１７ｇ、５０ミリモル）を撹拌し乍ら添加した。溶解が完了したとき、４−（Ｎ、Ｎ−ジメチルアミノ）ピリジン（Ａｌｄｒｉｃｈ、　１００ｍｇ）を添加した。この溶液を室温で一夜撹拌した。溶媒はロータリー二バポレーションで留去し、そして残っているピリジンはトルエン（ＢＤＨ）との共沸を繰返して除去した。残渣はジクロロメタン（ＢＤＨ）に再溶解し、そして等容量の飽和重炭酸す）　ＩＪウム溶液（Ａｔｄｒｉｃｈ）で３回洗浄した。有機溶液は無水の硫酸ナトリウム（Ｉｎｔｅｒｃｈｅ態、英国）を添加して乾燥させ、そしてろ過した。ろ液を蒸発させてゴムとし、最少量のジクロロメタン：メタノール（１９：１）に再溶解し、そしてシリカゲルカラム（１［ｅｒｃｋ　７７３４）に適用した。同じ溶媒で溶出して表題の化合物を無色のゴムとして得た（７ｇ、３３％）。

ＩＨＮＭＲ：　δ（ＣＤＣ１３）＋　３．４〜３．２．２Ｈ１２個のダブルダブレット、ＣＨ、Ｏ，ＤＭＴ；　３．７〜３．６．２ＬコンプレツクスマルチプレツトＣＨ，ＯＲ，３，８５〜３．７５．８Ｌコンプレツクスマルチプレツト、２ｘ−ＯＣＨ３および２ｘ　Ｃ−Ｈ；　６．８４〜６．８１．４Ｈ，コンプレ、クスマルチプレット、芳香族、７．４２〜７６２５．９１’ｌ、コンプレックスマルチプレット、芳香族。

工程２）１−０−（４，４−ジメトキシトリチル）−４−Ｏ−（Ｌ、）−ブチルジメチルシリルスレイトールの製造。

工程１）の生成物（７ｇ、１６．５ミリモル）の乾燥ピリジン（１０ｈ＋１）溶液に第三級ブチルジメチルシリルクロライド（Ａｌｄｒｉｃｈ、　２．７ｇ。

１８、１５　ミリモル）を撹拌し乍ら添加した。溶解が完了したとき、４−（Ｎ、Ｎ−ジメチルアミノ）ピリジン（１００■ｇ）を加え、そしてこの溶液を室温で一夜撹拌したときジクロロメタン：メタノール（１９：１）でのＴＬＣは出発物質が存在しないことを示した。溶媒は減圧下で留去し、そして残っているピリジンはトルエンとの共沸を繰返して除去した。残渣をジクロロメタン（３００■ ｌ）に再溶解し、そしてこの溶液は等容量の飽和重炭酸ナトリウムで３回洗浄し、乾燥しく硫酸ナトリウム）、ろ過しそして減圧下で留去してゴムを得、これを最少量のジクロロメタン：メタノール（１９：１）に溶解させそしてシリカカラムに適用した。同じ溶媒で溶出して表題の化合物を無色のゴムとして得た（６．５ｇ、７３％）。

”ＨＮＭＲ：　δ（ＣＤＣ１３）ニー０．０４２．６Ｈ１２個のシングレット、２ｘ　ＣＨ３・Ｓｉ；０．８．９■、シングレット、（ＣＨ＊）３−Ｃ−３ｉ　：３．３〜３．１．２Ｈ１２個のダブルダブレット、Ｃシ０−Ｄ１１τ：３．７〜３．５５．２■、２個のダブルダブレット、ＣＨ，−０−３ｉ；　３．８．８Ｂ、コンプレックスマルチプレット、２ｘ　ＯＣＲ，および２ｘＣ−Ｈ，６，８，４Ｈ、コンプレックスマルチプレット、芳香族ニア、３〜７．１．９Ｈ，コンプレ。

クスマルチプレット、芳香族。

工程３）１−０−（４，４−ジメトキシトリチル）−２，３−ジーＯ−ベンゾイル１−０（Ｌ、）ブチルジメチルシリルスレイトールの製造。

工程２）の生成物（２，２ｇ、４．１２５ミリモル）の乾燥ピリジン（１０ｈｌ）溶液に塩化ベンゾイル（Ａｌｄｒｉｃｈ、　１．０５ｍ１９．０７５ミリモル）を撹拌し乍ら滴加した。この溶液を室温で３時間撹拌したとき、ジクロロメタンでのＴＬＣは出発物質が存在しないことを示した。溶媒は減圧下で留去し、そして残っているピリジンはトルエンとの共沸を繰返して除去したつ残渣をジクロロメタンに再溶解し、そしてこの溶液は等容量の飽和重炭酸すｌ−ＩＪウムで３回洗浄し、乾燥しく硫酸ナトリウム）、ろ過しそして減圧下で留去してゴムを得、これを最少量のジクロロメタンに溶解させそしてシリカカラムに適用した。同じ溶媒で溶出して表題の化合物を白色の泡状物として得た（２．７ｇ、８７．６％）。

’ＨＮＭＲ：　δ（ＣＤＣＩ＋ｌ）：　０．０〜（−）０．１．６■、複数のシングレット、２ｘＣ口、−３ｉ：　０．８〜０，９．９１１．複数のシングレット、（ＣＨ７）３−Ｃ−３ｔ：　３．６５．３Ｌシングレツト、ｏｃＨＪ：　３．７５．３■、シングレット、ＯＣＨ３：　４．１〜３．８５．４Ｈ，コンプレックスマルチプレット、ＣＩ（２−０−ＤＭＴおよびＣＨ２−０−Ｓｔ：　５．７５〜５．４５．２Ｈ，コンプレックスマルチプレット、２ｘ　ＣＨ：　６．６５〜６．５５．２Ｈｓ　コンプレックスマルチプレット、芳香族＋６．８５〜６．７５．２Ｈ１コンプレツクスマルチプレツト、芳香族ニア、３〜７．０５．９Ｈ，コンプレックス　マルチプレット、芳香族ニア、６〜７．３５．６ＦＩ、コンプレックスマルチプレット、芳香族：８．１〜７．８．４１１、コンプレックスマルチプレット、芳香族。

工程４）　１　０−（４，４−ジメトキシトリチル）−２，３−ジＯ−ベンゾイルスレイトールの製造。

工程３）の生成物（２，７ｇ、３．６ミリモル）はテトラヒドロフラン（Ａｌｄｒｉｃｈ）、ピリジンおよび水の混合物（１００■ｌ、それぞれ８：１：１）に溶解し、そしてフッ化テトラブチルアンモニウムのテトラヒドロフラン（＾１ｄｒｉｃｈ、　１Ｍ％　１５麿り溶液を加えた。溶液は室温で３日間維持し、次いで減圧下で留去して油とし、これはジクロロメタン１００■ｌに再溶解した。この溶液は等容量の水で４回および等容量の飽和塩化ナトリウム溶液で１回洗浄し、乾燥しく硫酸ナトリウム）、ろ過し、そして減圧下で留去してゴムとした。これを最少量のジクロロメタン：メタノール（１９：１）に再溶解しそしてシリカカラムに適用した。同じ溶媒で溶出して表題の化合物を白色泡状物として得た（１．２ｇ、　５２．７％）ｕ’ＨＮＭＲ・δ（ＣＤＣｌ２）：　３．６〜３．３５．２Ｈ，コンプレックスマルチプレット、ＣＨ２−ＯＨ：　３．８〜３．７．６Ｈ１複数のシングレット、２ｘ　ＯＣＬ：　４．５５〜４．３５．２Ｌコンプレツクスマルチプレツト、ＣＨＣＨ２−０−Ｄ；４．７２〜４．６、ＬＬコンプレックスマルチプレット、Ｃ−Ｈ：　５．６〜５，３５、ＩＨ，コンプレックスマルチプレット、ＣＨ：　６．８５〜６．７．４■、コンプレックスマルチプレット、芳香族：７．６〜７．Ｌ　１５Ｈ，コンプレックスマルチプレット、芳香族：８．１〜７．８５．４Ｈ、コンプレックス　マルチプレット、芳香族。

工程５）試薬Ｍ２の製造工程４）の生成物（１，２ｇ、１．９ミリモル）の乾燥ジクロロメタン（５（１＊Ｉ　）溶液に乾燥（カルシウムヒドリドから蒸留）ジイソプロピルエチルアミン（１，４■１１２５ミリモル）を乾燥アルゴン（＾ｉｒ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）流下でシリンジ移送によって添加した。この撹拌溶液に２−シアノエチル−Ｎ、Ｎ−ジイソプロピルアミノ　りロロホスフイン（Ａｌｄｒｉｃｈ、０．５１ｍ１．２．３ミリモル）を撹拌し乍ら滴加した（これもシリンジによって）。　この溶液を乾燥アルゴン流下室温で３０分間撹拌したとき、ジクロロメタン・トリエチルアミン（１９：１）でのＴＬＣは出発物質が存在しないことを示した。乾燥メタノール（５１）を加え、そしてこの溶液を酢酸エチル（ＢＤＨ）２００ｍｌで希釈した。この溶液を等容量の飽和塩化ナトリウム溶液で３回そして水で１回洗浄した。有機層を分離し、乾燥しく硫酸ナトリウム）、ろ過しそして留去してゴムとし、これを最少量のジクロロメタン、ヘキサン。

トリエチルアミン（４２：　５５　：　３）に溶解し、そしてシリカカラムに適用した。同じ溶媒で溶出し、次いでジクロロメタン・エチェチルアミン（１９：１）で溶出して表題の化合物を無色のゴムとして得た（０．６ｇ、３８％）。

ＩＨＮＭＲ・δ（ＣＤＣｌ２）：　１．３〜１．０．１４Ｈ１コンプレツクスマルチプレブト、２ｘ　（ＣＨａ）＊Ｃ１１−＋　２．５．２Ｈ，プソイドトリブレット、（Ｊｌ、ＣＮ；　３．８〜３．４．１０Ｈ１コンプレックスマルチプレット、２ｘＯＣＨ３、ＣＨ２−０−ＤｌｌＴおよびＣ１１２−０−Ｐ：　４．７〜４．４５．３Ｈ。

コンプレックスマルチプレット、ＣＨ２−０−ＰおよびＣ−Ｈ；　５．８〜５．５５、ＩＨ、コンプレックスマルチプレット、Ｃ−Ｈ：　６．８〜６．６．４１１゜コンプレックスマルチプレット、芳香族ニア、６〜７．１．１５Ｈ，コンプレックスマルチプレット、芳香族：８．１〜７．８．４Ｈ，コンプレックス　マルチプレット、芳香族。

オリゴヌクレオチドは、５゛−ジメトキシトリチル−Ｎ４−ベンゾイル−２°デオキシシチジン、５゛− ジメトキシトリチル−Ｎ２−イソブチリル−２′デオキシグアノシン、５゛−ジメトキシトリチル−Ｎ６−ペンゾイルー２′−デオキシアデノシンおよび５゛−ジメトキシトリチルチミジン（Ｃｒｕａｃｈｅ層）の３’−（２−シアノエチル−Ｎ、Ｎ−ジイソプロピルアミノホスホラミダイトを個々のヌクレオチドのプリカーサ−として使用して、アプライドバイオシステムズ３８０Ｂ　ＤＮＡシンセサイザーで提供されたプロトコールを使用して第１の（慣用の）開裂可能なリンクを介して固体支持体上に形成させた。開裂可能なリンカ一部分を試薬Ｍ２によって第１のオリゴヌクレオチドに結合させた。試薬Ｍ２は無水のアセトニトリルに溶解させて（ＬＩＭの濃度とし、そしてこの溶液を含有するボトルをＤＮＡシンセサイザーの予備の試薬口の１つに取り付けた。（慣用の）開裂可能なリンカ−サクシニルグリシルグリシルアミノプロビル（Ｃｒｕａｃｈｅ■）によって結合した５゛−保護ヌクレオシド（この場合にはデオキシアデノシン）を有する調節多孔ガラスを有するカラムをシンセサイザーに取り付けた。次いで、シンセサイザーは、アプライドバイオシステムズ３８０Ｂ　ＤＮＡシンセサイザーで使用される標準の合成サイクルを使用して次の配列を合成するようにプログラミングした：（５’）　ＣＴＡ？ＴＣＡＡＡＡＴＣＧＧＡＧＣ？ＣＴＡＡＧＡＴ−Ｌ’−ＴＡＧＧＧＡＴＴＴＧＡＴＴＴＴＡＣＧＡ　（３′）式中、開裂可能なリンカ一部分Ｌ°は試薬Ｍ２によって導入される。

反応工程の時間並びにカップリング、酸化、キャップ形成および脱トリチル化に使用する試薬の量は試薬Ｍ２を含めて各カップリングについて同一であった。シンセサイザーはカラムを慣用の濃アンモニアで洗浄してオリゴヌクレオチドを採集バイアルに放出させるようにプログラミングした。

このようにし〔、シンセサイザーは、ａ）１１節多孔ガラスに３′−ＯＨ基と（慣用の）第１の開裂可能なリンクを介して連結されたヌクレオシドプリカーサ− の連続反応によって配列（５°−３’　）　ＴＡＧＧＧＡＴＴＴＧＡＴＴＴＴＡＣＧＡの第１のオリゴヌクレオチドを形成させ、ｂ）ＩＪＩ（’）オリゴヌクレオチドに開裂可能なリンカ一部分を試薬Ｍ２によって結合させ、モしてＣ）配列（５’−３′）　ＣＴＡＴＴＣＡＡＡＡＴＣＧＧＡＧＣＴＡＡＧＡＴを有する第２のオリゴヌクレオチドを開裂可能なリンカ一部分１：形成させる工程を遂行して、式・（式中、−Ｌ’−はそれぞれ式−Ｐ（ＯＸＯＣＩ’ｆ、Ｃ１１２ＣＮ）−０−の基によって第１および第２のオリゴヌクレオチドの５°および３゛酸素に結合した式−Ｃ１２−ＣＨＣＯ−ベンゾイル）−Ｃ）Ｉ（Ｑ−ベンゾイル）−ＣＨ２− の開裂可能なリンカ−であり、モしてＸはサクシニルグリシルグリシル−アミノプロピルスペーサーに含まれる第１の開裂可能なリンクである）によって示されるように、開裂可能なリンカ一部分によって分離されそして開裂可能なリンクによって固体支持体に結合した２つのオリゴヌクレオチドを得た。シンセサイザーはまた本発明方法の工程ｄ）と同じくアンモニア処理によって第１の開裂可能なリンクＸの開裂を行う。

アンモニア溶液中に溶出されたオリゴヌクレオチドは５５℃で１６時間インキュベートし、そして減圧下で蒸発乾固した。残渣は水１１ｏ１１こ再溶解し、そしてこの溶液１００μｌをピペリジン１００μｌと混合し、そして５５℃で１６時間から７２時間インキュベートした。

このようにして、開裂可能なリンクＬ°は本発明方法の工程ｄ）で記載したように開裂させる。

他の３つのオリゴヌクレオチドも上記した慣用の方法で合成したが、ピペリジン処理はしなかった。これらは上記ピペリジン処理で生じた生成物の分析に使用される対照分子を示すように設計された。

これらのオリゴヌクレオチドは次の配列を有していた：かくして、オリゴヌクレオチド２）および３）は開裂可能なリンクを有するオリゴヌクレオチドの開裂で予期される生成物と長さおよび配列が同一である。

このようにして製造されたオリゴヌクレオチドの３°および５°末端のヒドロキシル基の存在は下記のようにしてこれらの位置に放射性リンを導入して測定した。

オリゴヌクレオチドの５゛　に　ホスフェート濃水酸化アンモニウムかまたは５０％ピペリジンかのいずれかでオリゴヌクレオチドを処理した後、溶液を凍結乾燥し、そしてオリゴヌクレオチドを約１腸ｇ／■ｌの濃度になるよう水に再溶解した。次いで、この溶液１マイクロリツトルを水（６μｍ）、１０ｘ反応緩衝液（ｒｏｎｅ　Ｐｈｏｒ　ＡＩＩＪ、ｌ’ｈａｒｍａｃｉａ、　１　ｕ　１）、［ガンマ１！ｐ］アデノシントリホスフエート（Ａｍｅｒｓｈａ厘、１μｍ）およびＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｐｈａｒ謙ａｃｉａ、　１μＬ）を含有するエツペンドルフ管に加えた。次いで、この混合物を３７℃で１時間インキュベートした。

エタノール（３０μｌ）を加え、内容物は管を繰返し逆にして混合し、そしてこの試料を一７０℃で１５分間インキュベートした。管はエツペンドルフ遠心器（ｉｌｏｄｅｌ　５４１５）中１４００Ｏｒｐｍで１５分間回転させ、そして上清液を捨てた。ベレットを真空下で短時間乾燥させ、そして８０％のホルムアミド、０．１％のブロモフェノールブルー、０．１％のキシレンシアツールおよび１０μｍのＥＤＴＡを含有する溶液１０μｌに再溶解した。この溶液は、放射性標識した適当なサイズマーカーに近接した変性ポリアクリルアミドゲル（８％アクリルアミド、５０％ウレア）のウェルの１つに入れ、ゲルは４０Ｗで約２時間移動させた。標識したＤＮＡフラグメントの位置および大きさはオートラジオグラフィーで測定した。

２５残基（２５ホスフエート）および１９残基（１９ホスフエート）のオリゴヌクレオチドによるバンドと一緒に移動する強いバンドの存在は開裂可能なリンクの切断が生じ、その結果所望の生成物が生成したことを示していた。

オリゴヌクレオチドの３′−端に　ホスフェート　人上記したオリゴヌクレオチド溶液１マイクロリツトルは、水（５μｌ）、５ｘ反応緩衝液（ｒＴｄＴ　Ｔａｉｌｊｎｇ　ＢｕｆｆｅｒＪ、ＢＲＬ、２μＩ）、［アルファｊ！ｐ］２−−デオキシアデノシン　トリホスフェート（λ１１ｅｒＳ１１ａｌ　１μｌ）および末端デオキシヌクレオチジル　トランスフェラーゼ（ＢＲＬ、１μｍ）を含有するエッペンドルフ管に加えた。次いで、この混合物を３７℃で１時間インキュベートした。放射性標識したＤＮＡをエタノールから沈殿させて回収し、次いで、５′−末端−標識フラグメントに関して上記したのと全く同じようにして変性ゲル電気泳動で分析した。

２６残基（２５ホスフエート）および２０残基（１９ホスフエート）のオリゴヌクレオチドによるバンドと一緒に移動する強いバンドの存在は開裂可能なリンクの切断が生じ、その結果所望の生成物が生成したことを示していた。

上記した工程（ｄ）で製造されたオリゴヌクレオチド混合物は緩衝液人中θ〜３０％の緩衝液Ｂ（その際、緩衝液Ａは０，１Ｍの酢酸トリエチルアンモニウム（ｐＨ７，５）であり緩衝液Ｂは０．１Ｍの酢酸トリエチルアンモニウム中８０％のアセトニトリル（ｐＨ７，５）である）による４５分間の直線傾斜を使用してウォーターズμポンダパック（Ｗａｔｅｒｓ　μＢｏｎｄａｐａｋ）　ＣＩ８カラムで逆相ＨＰＬＣによって分析した。これらの条件下で１９残基（１８ホスフエート）の対照オリゴヌクレオチドは保持時間が２８分であり、２５残基（２４ホスフエート）は保持時間が３１分であり、モして４４残基（４３ホスフエート）は保持時間が３４分であった。

上記工程（ｄ）で製造されたオリゴヌクレオチド混合物のＨＰＬＣプロフィールは１９および２５残基（それぞれ１８および２４ホスフエート）のオリゴヌクレオチドの存在に相当する（実験誤差の範囲内）ピークを示したので、開裂可能なリンクの切断が生じて所望の生成物が生成したことが確認された。

実施例へタン−２−イル−１−（１，４−ジカルボキシ）ブタノニー１４−（１，２−ジヒドロキシ−２−（２−シアノエチル−Ｎ、Ｎ−ジイソプロピルホスホラミダイト）エタン−１−イルエステルの製造。

これは下記で１から４と番号を付した製造を使用して製造した。

試薬Ｍ３の構造は次のとおりである、ＤＭＴ−０−ＣＨ２ＣＨ，−０Ｈ１，２−ジヒドロキシエタン（入１ｄｒｉｃｈ、　６．２ｇ、１００ミリモル）の乾燥ピリジン（２００■１）溶液に４．４′−ジメトキシトリチルクロライド（３３，８ｇ、　１００ミリモル）を撹拌し乍ら加えた。溶解が完了したとき、４−（Ｎ、Ｎ−ジメチルアミノ）ピリジン（２００＋ａｇ）を加えた。この溶液を室温で一夜撹拌した。次いで、溶媒を減圧下で除去し、そして残っているピリジンはトルエンとの共沸を繰返して除去した。残渣をジクロロメタン（３００ｍｌ）に再溶解し、そして等容量の飽和重炭酸ナトリウム溶液で３回洗浄した。有機層を分離し、乾燥しく硫酸ナトリウム）、ろ過しそして減圧下で留去してゴムとし、これをジクロロメタン・メタノール（１９：１）に再溶解しそしてシリカカラムに適用した。同じ溶媒による溶出によって表題化合物を無色のゴムとして得た（９ｇ、２５％）。

’ＨＮＭＦＩ：　δ（ＣＤＣＩ、）・３．３．２Ｌプソイド　トリプレット、Ｃ１’！２−ＯＤｉＩＴ、３．８．８Ｈ，？ルチプレット、２ｘ　０ＣＨｊおよびＣＨ２０Ｈ：　６．８５〜６．７５．４■、マルチプレット、芳香族ニア、４〜７．１，９Ｈ、コンプレックスマルチプレット、芳香族。

工程２）１−０−（４，４−ジメトキシトリチル）−１，２ジヒドロキシエタン −２−イル−１−（１，４−ジカルボキシ）ブタノニー１・の製造工程１）の生成物（９ｇ、２４．７ミリモル）を乾燥ピリジン（１００ｍ１）　ニ溶解させ、そして無水コハク酸（Ａｌｄｒｉｃｈ、　２．７２ｇ　、　２７．２ミリモル）を加えた。溶解が完了したとき、４−（Ｎ、Ｎ−ジメチルアミノ）ピリジン（５０ｍｇ）を加え、そしてこの溶液を室温で一夜撹拌した。

溶媒を減圧下で留去し、そして残っているピリジンはトルエンとの共沸を繰返して除去した。残渣をジクロロメタン（３００■ｌ）に再溶解し、そしてこの溶液は等容量の水冷した１０％クエン酸で３回そして水で１回洗浄した。有機層を分離し、乾燥しく硫酸ナトリウム）、ろ過しそして減圧下で留去してゴムとし、これを最少量のジクロロメタン：メタノール（１９：１）に再溶解しそしてシリカカラムに適用した。同じ溶媒による溶出によって表題化合物を無色のゴムとして得た（９ｇ、７８．５％）。

ＩＨＮＭＲ：　δ（ＣＤＣＩ、）：　２．７．４Ｈ，シングレット、２ｘ　ＣＨ２Ｃｏ；　３．２５．２Ｆ［、トリプレブト、ＣＨＣＨ２−０−Ｄ：　３．８．６Ｌシングレツト、２ｘ　−０ＣＲ３：　４．２５．２■、コンプレックスマルチプレット、ＣＨ２０ＣＯ；　ａ−ａｓ〜６．７５．４Ｈ，コンプレックスマルチプレット、芳香族；７．４５〜７．１．９ＦＩ、コンプレックスマルチプレット、芳香族。

工程３　）　１−０−（４，４−ジメトキシトリチル）−１，２−ジヒドロキシエタン−２−イル−１−（１，４−ジカルボキシ）ブタノエート−４−（１，２ −ジヒドロキ工程２）の生成物（８ｇ、　１７．ｕミリモル）は１．２−ジヒドロキシエタン（６，２ｇ、　１００ミリモル）を含有する乾燥ピリジン（２００ｍｌ）に溶解させた。この溶液に１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（Ａｌｄｒｉｃｈ、　３．７５ｇ、　１９．５ミリモル）を加えた。この溶液を室温で一夜撹拌したとき、ジクロロメタン：メタノール（１９：１）でのＴＬＣは出発物質が存在しないことを示した。溶媒を減圧下で留去し、そして残っているピリジンはトルエンとの共沸を繰返して除去した。

残渣を酢酸エチルに再溶解しそして等容量の飽和塩化ナトリウム溶液で３回そして水で１回洗浄した。

有機層を分離し、乾燥しく硫酸ナトリウム）、ろ過し、そして減圧下で留去してゴムとし、これを最少量のジクロロメタン：メタノール（１９：１）に再溶解しそしてシリカカラムに適用した。同じ溶媒による溶出によって表題化合物を無色のゴムとして得た（２ｇ、２２゜６％）。

一’ＨＮＭＲ，δ（ＣＤＣＩ、）：　２．７．４Ｈ，シングレット、２ｘ　ＣＨ２Ｃｏ；　３．２５．２■、プソイド　トリプレット、ＣＨＣＨ２−０−Ｄ＋　３゜８５〜３．７．８■、コンプレックスマルチプレット、２ｘ　−０ＣＲ３およびＣＩ’１２０Ｈ，４，３〜４．２．４Ｈ。

コンプレックスマルチプレット、２Ｘ　ＣＨ２０ＣＯ，６，８５〜６．７５．４ ■、コンプレックスマルチプレット、芳香族ニア、４〜７．１．９Ｈ，コンプレックスマルチプレット、芳香族。

工程４）試薬Ｍ３のｔａ工程３）の生成物（２ｇ、３．９ミリモル）を乾燥ジクロロメタン（５０■ｌ）に溶解させ、そしてこの溶液を乾燥アルゴン流下で撹拌した。この溶液に乾燥ジイソプロピルエチルアミン（２，７ｓｌ、　１６ミリモル）および２−シアノエチル−Ｎ、Ｎ−ジイソプロピルアミノクロロホスフィン（１，０５ｍ１．４．７２　ミリモル）を加えた。この溶液を乾燥アルゴン流下室温で３０分間撹拌したとき、ジクロロメタン：メタノール（１９：１）でのＴＬＣは出発物質が存在しないことを示した。反応は乾燥メタノール（５ｓｌ）を添加して抑制し、そしてこの溶液を酢酸エチル（２００■ｌ）で希釈した。この溶液を等容量の飽和塩化ナトリウム溶液で３回そして水で１回洗浄した。有機層を分離し、乾燥しく硫酸ナトリウム）、ろ過し、そして減圧下で留去してゴムとし、これを最少量のジクロロメタン：トリエチルアミン（１９：１）に再溶解しそしてシリカカラムに適用した。同じ溶媒による溶出によって表題化合物を無色のゴムとして得た（１．８ｇ、６５％）。

ＩＨＮＭＲ：　δ（ＣＤＣＩ３）：　１．２５〜１．１．１４Ｈ１コンプレツクスマルチプレツト、（ＣＨ３）２Ｃ１１ｘ２：　２．６．２Ｈ、トリプレット、ＣＨ２ＣＮ：　２．６５．４Ｈ，シングレット、２ＸＣＦＩ２ＣＯ；　３．２５．２Ｈ１トリプレツト、ＣＨＣＨ２−０−Ｄ：３．７〜３．５．４Ｌコンプレツクスマルチプレツト、２ｘ　ＣＨ２−０Ｐ：　３．８．６Ｌシングレツト、２ｘ　−ｏｃＬ；　４．２５．４Ｈ，プソイド　トリプレット、２ｘ　ＣＨｚＯＣＯ；　６．８５〜６．７５．４１’ｌ、コンプレックスマルチプレット、芳香族ニア。

４〜７．１５．９１１、コンプレックスマルチプレット、芳香族。

寒應ガニ試薬Ｍ２の代わりに、無水のアセトニトリルで０．１５Ｍの濃度に溶解した試薬Ｍ３を使用した以外は実施例５）の方法を繰り返して、固体支持体に結合した２つのオリゴデオキシリボヌクレオチドを合成した。

開裂可能なリンクで固体支持体に結合した２つのオリゴヌクレオチドは、実施例５、工程Ｃ（その際Ｌ゛は式：％式％の開裂可能なリンカ一部分である）に表わされる式で示される。

工程（ｄ）の後に見られる２つのオリゴヌクレオチドは実施例５に記載したようにして分析し、そして電気泳動およびＨＰＬＣによって実施例５に記載したものと同一であることが見い出され、開裂可能なリンクの切断を証明していた。

実施例８試薬Ｍ４：　１０−（４，４’　ジメトキシトリチル）１．２−ジヒドロキシエタンイｐＬ（２−［ｆ２シアノエトキ”ｉ　ｌ−Ｎ、　Ｎ−１シイツブ’ａｅ４７主））ホスファ二町七シ］エチルスルホニル）エチルサクシネートの製これは下記で１から２と番号を付した製造を使用して製造した。

試薬Ｍ４の構造は次のとおりである：工程１）　１０−（４，４’−ジメトキシトリチル）−４，２ジヒドロキシエタン−２イル−２（２−ヒドロキシスルホニル）エチルサクシネートの製上記実施例６．２に記載したようにして製造した１　−０−（４，４”−ジメトキシトリチル）−１，２ジヒドロキシエタン−２−イル−１−（１％４−ジカルボキシ）ブタノエート（１，７４ｇ）のジクロロメタン（２０■ｌ）溶液に１．３−　Ｎ、　Ｎ−ジシクロへキシルカルボジイミド（３８３ｍｇ、　０．５ミリ等量）を加え、そしてこの混合物を室温で４５分間撹拌した。ジシクロへキシルウレアをろ去し、そしてジクロロメタン（４ｓｌ）で洗浄した。ろ液および洗浄液を合わせ、そして減圧下で留去して黄色の油を得、これを乾燥ピリジン（１５■ｌ）に再溶解した。これに、乾燥ピリジン（５ｓｌ）中スルホニルジェタノール（１，５４ｇ、　２．７ミリ等量。

Ａｌｄｒｉｃｈから供給される６５％の水性材料のトルエン共沸脱水化によって製造した）を加えた。この溶液を室温で２３時間撹拌しそして減圧下で留去した。残っているピリジンはトルエンとの共沸を繰返して除去した。残っている油をジクロロメタン：メタノール（１９１）に再溶解し、そしてシリカカラムに適用した。同じ溶媒による溶出によって表題化合物を黄色のガラスとして得た（５４３−ｇ、４８．４％ＩＨＮＭＲ・δ（ＣＤＣＩ：＋）：　２．７．４Ｈ，コンプレックスマルチプレット、２ｘ　ＣＨ２ＣＯＯ：　３．２２．３Ｌプソイド　トリプレット、ＣＨ２−０−ＤＩＥＴおよび一〇〇＋３．３．２Ｈ１トリプレツト、ＣＢ２０Ｈ；　３．４３．２Ｈ，トリプレット、ＣＨ２ＳＯ２：３．７６．６Ｈ，シングレット、２ｘ　ＯＣＨ：＋：　４．０３．２■、トリプレット、ＣＨ，ＳＯ２；　４．２７．２■、トリプレット、ＣＩ、ＯＣＯ；　４．５３．２■ 、トリプレット、Ｃ１ｌ、ＯＣＯ；　６．８．４■、マルチプレット・、芳香族ニア、３．９１１．コンプレックスマルチプレット、芳香族。

工程２）試薬Ｍ４の製造工程１）の生成物を乾燥ジクロロメタン（５０鵬ｌ）に溶解させ、そしてこの溶液を乾燥アルゴン流下で撹拌した。この溶液に乾燥ジイソプロピルエチルアミン（０，６１ｍＬ　３．６ミリモル）および２−シアノエチル−Ｎ、Ｎ−ジイソプロピルアミノクロロホスフィン（０，２４請１．１゜０８ミリモル）を加えた。

この溶液を乾燥アルゴン流下室温で３０分間撹拌したとき、ジクロロメタン・メタノール（１０：１）でのＴＬＣは出発物質が存在しないことを示した。反応は乾燥メタノール（５騙りを添加して抑制しそしてこの溶液を酢酸エチル（２００ｍｌ）で希釈した。この溶液は飽和塩化ナトリウム溶液で３回そして水で１回洗浄した。有機層を分離し、乾燥（硫酸ナトリウム）し、ろ過しそして減圧下で留去してゴムとし、これを最少量のジクロロメタン　トリエチルアミン（１９：ｌ）に再溶解しそしてシリカカラムに適用した。同じ溶媒で溶出して表題の化合物を無色のゴムとして得た（０゜４８ｇ、６６．６％）。

、ＣＨｘ２：　２．７４〜２．５８．６■、コンプレックスマルチプレット、２ｘ　−ＣＨ２ＣＯＯオヨヒＣＨ２ＣＮ；　３．３３〜３．２５．２１１．　Ｃ１１，−ＯＤＭＴ；　３．４５．２Ｈ％　？／ｌ／チプレット、ＣＥＩ、ＳＯ２；　３．６５〜３．５１．４■、コンプレックスマルチプレット、２ｘ　−ＣＨｚＯＰ：　３．８１．６■、シングレット、２ｘ　ＯＣＨ３；　４．１５〜４゜０５．２Ｈ，マルチプレット、ＣＨ２ＳＯ２：　４．２５．２■、プソイド　トリプレット、ＣＨｚＯＣＯ：　６．８４〜６．８０．４Ｈ，マルチプレット、芳香族、７．４５〜７．１４．９Ｈ，コンプレックスマルチプレット、芳香族。

実施例９試薬Ｍ４を無水のアセトニトリルに０．１５Ｍの濃度に溶解して試薬Ｍ２の代わりに使用した以外は実施例５の方法を繰り返して、固体支持体に結合した２つのオリゴヌクレオチドを合成した。

開裂可能なリンクで固体支持体に結合した２つのオリゴヌクレオチドは、実施例５、工程Ｃ（その際Ｌ′は式：％式％の開裂可能なリンカ一部分である）に表わされる式で示される。

工程（ｄ）の後に見られる２つのオリゴヌクレオチドは実施例５に記載したようにして分析し、そして実施例５に記載したものと同一であることが見い出され、開裂可能なリンクの切断を証明していた。

タン−２−イル−１−（１，４−ジカルボキシ）ベンゾエート４−（１，２−ジヒドロキシ２−（２−シアノエチル−Ｎ、Ｎ−ジイソプロビルホスホラミメ止モタン１−イルエステルの讐虞よこれは下記に１から３と番号を付した製造を使用して合成した。

試薬Ｍ５の構造は次のとおりである・ＩＷＩ）１．４−ビス（１−０４４，４’〜ジメトキントリチル］−１，２−ジヒド虻シエタン＝２−イル）−ベンゼン−１，４−ジカルボキシレートの製造１ −０−（４，４°−ジメトキシトリチル）−１，２−ジヒドロキシエタン（上記実施例６、工程１に記載したようにして製造した）（約１０ｇ、２７ミリモル）の乾燥ピリジン（７０■ｌ）撹拌溶液に固体のテレフタール酸クロライド（１，８３ｇ、９ミリモル）および４−Ｎ、Ｎ−ジメチルアミノピリジン（５０＋ｓｇ）を加えた。固形物の大部分が溶解したように見えた後、上記懸濁液を室温で一夜撹拌した。次いで、溶媒を減圧下で除去した。残渣をジクロロメタン（２０ｈｌ）に溶解し、そして等容量の飽和重炭酸ナトリウム溶液で３回洗浄した。有機層を分離し、乾燥しく硫酸ナトリウム）、ろ過しそして減圧下で留去した。残っているピリジンはトルエンとの共沸によって除去してゴムを得、これをジクロロメタン・メタノール（１９：１）に再溶解しそしてシリカカラムに適用した。同じ溶媒で溶出して表層の化合物を無色のゴムとして得た（２．７４　ｇ、３５％）。

’ＨＮＭＲ：　δ（ＣＤＣＩ＊）：　３．４３．４Ｈ、トリプレット、２ｘ　− ＣＨ２０ＤＭＴ；　３゜７９〜３．７７．１２１１．２個のシングレット、４Ｘ　ＯＣＨ：ｌ：　４．５２．４■、トリプレット、２ｘ　ＣＬｏｃｏ：　６．８３〜６．７６．８Ｆ＋、コンプレックスマルチプレット、芳香族、７．４９〜７．１３．１８１’ｌ、コンプレックスマルチプレット、芳香族：８．１９．４Ｈ、シングレット、芳香族。

工程２）　１−０−（４，４’−ジメトキシトリチル）−１，２−ジヒドロキシニー■−−１−―−−■■―■−−−−１−−−―■■−―■−−−、、エタン２−イル＋（１，４−ジカルボキシ）ベンゾエート＋（１，３−ジヒドロ□−― −−―−−−−−−―、キシ）エタン−１−イルエステルの製造工程１の生成物（、２，７ｇ、３．５ミリモル）を乾燥ジクロロメタン（５０１１１）に溶解し、そしてトリクロロ酢酸のジクロロメタン（Ｃｒｕａｃｈ相、３％Ｔ　ＣＡ　、　７６＋ａｌ）溶液を加えた。この溶液を室温で撹拌したとき、ＴＬＣは生成物の混合物が存在していることを示した。溶液を飽和重炭酸ナトリウム溶液（４Ｘ２０抛ｌ）で洗浄し、乾燥しく硫酸ナトリウム）、ろ過しそして留去して油とし、これをジクロロメタン、メタノール（１９：１）に再溶解させそしてシリカカラムに適用した。同じ溶媒で溶出して、ＴＬＣで出発物質より遅く動く化合物３０ｈｇを得た。（この物質の試料をＴＣＡで更に処理すると付随して深橙色を形成する更に極性の物質に変換されたので、ジメトキシトリチル基の存在を示していた。）この生成物はそれ以上特徴を分析しないで次の工程で使用した。

工程３）試薬Ｍ５の製造工程２の生成物（０，３ｇ、　０．５４ミリモル）を乾燥ジクロロメタン（５０ｍｌ）に溶解させ、そしてこの溶液を乾燥アルゴン流下で撹拌した。この溶液に乾燥ジイソプロピルエチルアミン（０，０３７■１，２．１６ミリモル）および２−シアノエチルーＮ、Ｎ−ジイソプロピルアミノクロロホスフィン（０，１５ｍ１．０．６５　ミリモル）を加えた。この溶液を乾燥アルゴン流下室温で３０分間撹拌したとき、ジクロロメタン　メタノール（１９：１）でのＴＬＣは出発物質が存在しないことを示した。

乾燥メタノール（５腸ｌ）を添加して反応を抑え、そして溶液を酢酸エチル（２００＊Ｉ　）で希釈した。この溶液を等容量の飽和塩化ナトリウム溶液で３回そして水で１回洗浄した。有機層を分離し、乾燥しく硫酸ナトリウム）、ろ過しそして減圧下で留去してゴムを得、これをジクロロメタン：トリエチルアミン（１９：１）に再溶解しそしてシリカカラムに適用した。同じ溶媒で溶出して表題の化合物を無色のゴムとして得た（０．３７ｇ、９０％）。

’ＨＮＭＲ：　δ（ＣＤＣＩ、）：　１．２６〜１．１５．１４Ｈ１コンプレツクスマルチプレツト、（ＣＬ）ｚｃＨｘ２；　２．６．２Ｈ１トリプレツト、ＣＨ２ＣＮ；　３．４５．２Ｆｌ、ｌ−リプレット、ＣＩ’１２１２−０Ｄ；　３．７２〜３．５２．４Ｈ，コンプレックスマルチプレット、２Ｘ　ＣＨ２−０Ｐ：　３．７９．６Ｈ，シングレット、２ｘ　−ｏｃＬ；４５２．４Ｈ、トリプレット、２ｘ　−Ｃ１１２−ＯＣＯ：　８．８．４Ｆ１．　ｖルチプレット、芳香族ニア、４９〜７．１９．９Ｌコンプレツクスマルチプレツト、芳香族：８．１６．４Ｈ、シングレット、芳香族。

寒奥男１ユ試薬Ｍ２の代わりに試薬Ｍ５の無水の０．１３Ｍアセトニトリル溶液を使用した以外は実施例５の方法を繰り返して、固体支持体に結合した２つのオリゴデオキシリボヌクレオチドを合成した。

開裂可能なリンクで固体支持体に結合した２つのオリゴヌクレオチドは実施例５、工程Ｃ（その際、Ｌ′は式：％式％の開裂可能なリンカ一部分である）に示した式によって示される。

工程（ｄ）の後に見い出された２つのオリゴヌクレオチドは実施例５に記載したようにして分析し、そして実施例５に記載したものと同一であることが見い出され、開裂可能なリンクの切断を証明していた。

補正婁のＵ訳文謀出喜（待粁法￥１１６４条の６）平成　５年　４月　５日−

Claims

【特許請求の範囲】

１．オリゴヌクレオチドを支持体上の個々のヌクレオチドプリカーサーの逐次反応によって形成する複数のオリゴヌクレオチドの合成方法であって、該方法は（ａ）第１のオリゴヌクレオチドを形成させ；（ｂ）上記第１のオリゴヌクレオチドに開裂可能なリンカー部分を結合させ；（ｃ）この開裂可能なリンカー部分に第２のオリゴヌクレオチドを形成させ；そして（ｄ）このリンカー部分を開裂させて所望のオリゴヌクレオチドを生成させる工程からなる合成方法。
２．開裂可能なリンカー部分が第１のオリゴヌクレオチドに結合し得る試薬によって上記第１のオリゴヌクレオチドに結合しており、この開裂可能なリンカー部分に第２のオリゴヌクレオチドが形成されそしてこのリンカー部分をオリゴヌクレオチドに有意な影響を与えない条件下で破壊して第１および第２のオリゴヌクレオチドを分離し得ることからなる請求の範囲第１項に記載の方法。
３．（ａ）固体支持体に結合した第１の開裂可能なリンク上に第１のオリゴヌクレオチドを形成させ；（ｂ）上記第１のオリゴヌクレオチドに開裂可能なリンカー部分を結合させ；（ｃ）この開裂可能なリンカー部分に第２のオリゴヌクレオチドを形成させ：そして（ｄ）上記第１の開裂可能なリンクと開裂可能なリンカー部分を開裂させて複数のオリゴヌクレオチドを生成させる工程からなる複数のオリゴヌクレオチドの合成方法。
４．工程（ｄ）が行われた後に開裂されたリンカー部分の有機残基がオリゴヌクレオチドに結合したまま残っていないことからなる請求の範囲第１項または第３項に記載の方法。
５．第１または第２のオリゴヌクレオチドと更にもう１つのオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーシヨンを試みる工程を含んでいないことからなる請求の範囲第１または３項に記載の方法。
６．開裂可能なリンカー部分の開裂がオリゴヌクレオチドの３′および５′位にヒドロキシ基およびホスフェート基から選択される基を各々が有する複数のオリゴヌクレオチドをもたらすことからなる請求の範囲第１または３項に記載の方法。
７．開裂可能なリンカー部分が修飾ヌクレオシドによって結合されることを特徴とする請求の範囲第１または３項に記載の方法。
８．工程（ｂ）および（ｃ）を１から１００回繰り返すことを特徴とする請求の範囲第１または３項に記載の方法。
９．式ＩＩ：Ｚ−Ｎｕｃ−Ｌ′−Ｏ−ＰＡ（ＩＩ）（式中、Ｎｕｃは塩基が任意に保護されているヌクレオシドであり；ＺはＮｕｃの５′酸素に結合した保護基であり；−Ｏ−ＰＡはホスホラミダイト基、ホスフェートエステル基、Ｈ−ホスホネート基またはホスホジエステル基に変換できる他の基であり：そしてＬ′は開裂可能なリンカー部分である）の修飾ヌクレオシド。
１０．式（ＩＩＩ）： ▲数式、化学式、表等があります▼（ＩＩＩ）（式中、Ｚ、Ｌ′および−Ｏ−ＰＡは請求の範囲第９項で定義したとおりであり；Ｂは任意に保護された塩基であり；そしてＤはＨまたは保護されたヒドロキシル基である）の修飾ヌクレオシド。
１１．Ｌ′が式： −（ｉ）−（ｉｉ）−（ｉｉｉ）− である請求の範囲第９または１０項に記載の修飾ヌクレオシドであって、その際、（ｉ）はカルボニル、−ＣＯＮＨ−または−Ｃ（＝ＮＨ２＋）−であり；（ｉｉ）はスペーサー基であり：そして（ｉｉｉ）はホスフェートエステル基のベータ脱離を生じさせ得る基、または式Ｒ９−ＣＲ７（ＯＺ２）−ＣＲ７Ｒ８−または−ＣＯ．−Ｏ−ＣＲ７Ｒ１１−ＣＲ７Ｒ１０−（式中、各Ｒ７は独立してＨまたはＣ１４−アルキルであり；Ｒ■とＲ９のうち１つは単結合でありそしてもう１つはＨまたはＣ１−４−アルキルであり；Ｒ１ｕとＲ１１は各々独立してＨ若しくはＣ１−４−アルキルであるかまたはＲ１０はＲ１１およびそれらが結合している炭素原子と一緒になって任意に置換された４、５、６または７員の脂環式環または異項環を形成し；そしてＺ２は保護基である）である。
１２．Ｌ′が式： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｗは２価の有機スペーサー基である）である請求の範囲第９または１０項に記載の修飾ヌクレオシド。
１３．式（ＶＩＩ）：Ｚ１−Ｏ−Ａ１−Ｅ−Ａ２−Ｏ−ＰＡ（ＶＩＩ）の化合物であって、その際、Ａ１およびＡ２はそれぞれ独立して式（ＶＩＩａ）、（ＶＩＩｂ）、（ＶＩＩｃ）または（ＶＩＩｄ）：（ＶＩＩａ）▲数式、化学式、表等があります▼（ＶＩＩｂ）▲数式、化学式、表等があります▼（ＶＩＩｃ）▲数式、化学式、表等があります▼（ＶＩＩｄ） ▲数式、化学式、表等があります▼（式中、Ｚ１は保護基であり：Ｒ１、Ｒ２およびＲ３はそれぞれ独立してＨまたはアルキルであり；Ｑ１は電子吸引基であり；Ｑ２は−ＳＯ２−であり； −Ｏ−ＰＡはホスホラミダイト基、ホスフェートエステル基またはＨ−ホスホネート基であり；各Ｒ７は独立してＨまたはＣ１−４−アルキルであり；Ｒ■とＲ９のうち１つは式（ＶＩＩａ）の基がＥに結合している単結合でありそしてもう１つはＨまたはＣ１−４−アルキルであり；Ｚは保護基であり；Ｒ１０とＲ１１は各々独立してＨ若しくはＣ１−４−アルキルであるかまたはＲ１０はＲ１１およびそれらが結合している炭素原子と一緒になって任意に置換された４、５、６または７員の脂環式環または異項環を形成し；Ｅは共有単結合またはスペーサー基であり；但しＡ１とＡ２が共に式（ＶＩＩｄ）であるとき、Ｅはスペーサー基である）であり、その際星印で示された炭素原子は式（ＶＩＩ）に示された酸素原子に結合している。
１４．Ｅが任意に置換されたアルキル、脂環式またはアリールスペーサー基である請求の範囲第１３項に記載の化合物。
１５．Ｅがフェニレンまたは６個までの炭素原子を有するアルキル基である請求の範囲第１３項に記載の化合物。
１６．Ａ１およびＡ２がそれぞれ独立して式（ＶＩＩａ）、（ＶＩＩｂ）および（ＶＩＩｄ）から選択される（その際、星印を有する炭素原子は式（ＶＩＩ）に示される酸素に結合している）請求の範囲第１３項に記載の化合物。
１７．式−Ａ１−Ｅ−Ａ２−または−Ｌ′−（その際、Ａ１、ＥおよびＡ２は請求の範囲第１３項で定義したとおりでありそしてＬ′は請求の範囲第９項で定義したとおりである）の開裂可能なリンカー部分を有する１つまたは複数の基によって結合された２つまたはそれ以上のオリゴヌレオチドからなる化合物。
１８．自動オリゴヌクレオチドシンセサイザーでの使用に適する式（ＶＩＩＩ）または（ＩＸ）： ▲数式、化学式、表等があります▼（ＶＩＩＩ）▲数式、化学式、表等があります▼（ＩＸ）の固体支持体であって、その際、ＳＵＰは固体支持体であり；Ｌ′、ＮｕｃおよびＺは請求の範囲第９項で定義したとおりであり；Ａ２、Ｅ、Ａ１およびＺ１は請求の範囲第１３項で定義したとおりであり；そしてｐ１は式： ▲数式、化学式、表等があります▼▲数式、化学式、表等があります▼▲数式、化学式、表等があります▼または▲数式、化学式、表等があります▼（式中、Ｒ６はＨまたは保護基であり；そしてＺ３は保護基である）である。