JP2022119505A - 歯周病の原因菌を判別する試薬、菌種判別方法、口臭リスク判定方法および蛍光測定装置 - Google Patents
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Abstract
Description
本実施形態に係る試薬は、アルギニン残基を認識するプロテアーゼの酵素活性を測定することができる蛍光測定用試薬であり、次の式(1)で表される。
iBoc-Gly-Gly-Arg-MCA・・・(1)
[但し、式(1)中、iBocは、イソブチルオキシカルボニル基、Glyは、グリシン残基、Argは、アルギニン残基、MCAは、4-メチルクマリル-7-アミド基を表す。]
図1では、ポルフィロモナス・ジンジバリス(Pg菌)が産生するArg-ジンジパインの酵素活性と、トレポネマ・デンティコラ(Td菌)が産生するプロテアーゼの酵素活性と、タネレラ・フォーサイシア(Tf菌)が産生するプロテアーゼの酵素活性とを比較している。式(1)で表される試薬を基質として酵素反応を行い、所定の反応時間後の蛍光強度を測定した結果である。図中の縦軸は、酵素反応を開始して3分後に測定された蛍光強度、横軸は、酵素反応のpHを示す。
図2では、ポルフィロモナス・ジンジバリス(Pg菌)が産生するArg-ジンジパインの酵素活性と、トレポネマ・デンティコラ(Td菌)が産生するプロテアーゼの酵素活性と、トレポネマ・デンティコラ(Td菌)が産生するプロテアーゼの酵素活性とを比較している。図1の測定と同様に、式(1)で表される試薬を基質として酵素反応を行い、所定の反応時間後の蛍光強度を測定して、反応初期の蛍光強度の時間的変化量を求めた結果である。図中の縦軸は、酵素反応を開始して2分後から3分後までの蛍光強度の時間的変化量を示す。
図3には、ポルフィロモナス・ジンジバリス(Pg菌)を3日間にわたって培養したときに生成した揮発性硫黄化合物(VSC)の量を、Pg菌の菌株毎に測定した結果を示す。培養器の気相部のガスをシリンジで吸引して測定試料とし、ガスクロマトグラフ「OralChroma」(abimedical社製)で測定した結果である。図中の縦軸は、VSCの濃度[ppb]を示す。
図4には、fimA遺伝子の遺伝子型がII型であるTDC60株を培養し、波長660nmにおける光学濃度(OD660)が0.1、0.2および0.6のそれぞれに達したときに培養器中の揮発性硫黄化合物(VSC)の量を測定した結果を示す。培養器の気相部のガスをシリンジで吸引して測定試料とし、ガスクロマトグラフ「OralChroma」(abimedical社製)で測定した結果である。図中の縦軸は、VSCの濃度[ppb]を示す。
本実施形態に係る菌種判別方法は、式(1)で表される試薬を用いて歯周病の原因菌を判別する方法である。この菌種判別方法では、判別対象の供試物中の酵素を産生した口腔内細菌としてポルフィロモナス・ジンジバリス(Pg菌)が含まれるか否か、または、判別対象の供試物中の酵素を産生した口腔内細菌として含まれるポルフィロモナス・ジンジバリス(Pg菌)の量を判別する。判別は、式(1)で表される試薬を基質としたプロテアーゼの酵素活性に基づいて行い、Pg菌の量の判別では、比較対象に対してPg菌が多いか少ないかを判別する。酵素活性は、式(1)で表される試薬を添加した液体試料を用いて蛍光測定法によって評価する。
図5には、種々の供試物と、式(1)で表される試薬と、を添加した液体試料を蛍光測定した場合に得られる複数の蛍光測定結果を示している。図中の横軸は、酵素反応の開始時から起算される時間、縦軸は、蛍光強度を示す。
図6に示すように、本実施形態に係る菌種判別方法は、酵素反応工程S10と、蛍光測定工程S20と、判別工程S30と、を含む。酵素反応工程S10と蛍光測定工程S20は、判別対象の供試物を含む液体試料および比較対象の供試物を含む液体試料のそれぞれについて行う。
本実施形態に係る口臭リスク判定方法は、式(1)で表される試薬を用いて口臭のリスクを判定する方法である。この口臭リスク判定方法では、被験者の口腔から得られる供試物を判定対象として被験者毎の口臭が発現するリスクの高さを判定する。口臭のリスクの判定は、式(1)で表される試薬を基質としたプロテアーゼの酵素活性に基づいて行う。酵素活性は、式(1)で表される試薬を添加した液体試料を用いて蛍光測定法によって評価する。
図7に示すように、本実施形態に係る口臭リスク判定方法は、酵素反応工程S11と、蛍光測定工程S21と、判定工程S31と、を含む。酵素反応工程S11と蛍光測定工程S21は、判定対象の供試物を含む液体試料および比較対象の標準物を含む液体試料のそれぞれについて行う。
次に、本発明の一実施形態に係る蛍光測定装置について、図を参照しながら説明する。
図8に示すように、本実施形態に係る蛍光測定装置100は、光源(照射手段)1と、試料ホルダ2と、光学レンズ3a,3bと、フィルタ4と、検出素子(検出手段)5と、増幅器6と、アナログ処理器7と、A/D変換器8と、制御装置(判別手段)9と、試料容器10と、入力手段11と、表示手段12と、pH測定手段13と、温度測定手段14と、温調装置15と、を備えている。
図9に示すように、蛍光測定装置100が備える制御装置9は、測定結果データ取得部90と、測定結果データ処理部91と、測定結果データ比較部92と、測定条件データ取得部93と、制御部94と、記憶部95と、表示制御部96と、温度制御部97と、を備えている。
図10に示すように、蛍光測定装置100では、歯周病の原因菌を判別する用途の場合、菌種や菌量が未知である判別対象の供試物を含む液体試料を測定対象として蛍光測定を行い、測定データに基づく歯周病の原因菌の判別の結果をユーザに対して表示させることができる。一方、口臭のリスクを判定する用途の場合、被験者の口腔から採取した判定対象の供試物を含む液体試料を測定対象として蛍光測定を行い、測定データに基づく口臭のリスクの判定の結果をユーザに対して表示させることができる。
2 試料ホルダ
3a 光学レンズ
3b 光学レンズ
4 フィルタ
5 検出素子(検出手段)
6 増幅器
7 アナログ処理器
8 A/D変換器
9 制御装置(判別手段)
10 試料容器
11 入力手段
12 表示手段
13 pH測定手段
14 温度測定手段
15 温調装置
90 測定結果データ取得部
91 測定結果データ処理部
92 測定結果データ比較部
93 測定条件データ取得部
94 制御部
95 記憶部
96 表示制御部
97 温度制御部
100 蛍光測定装置
Claims (25)
- 歯周病の原因菌を判別するために使用される試薬であって、
前記原因菌は、ポルフィロモナス・ジンジバリスであり、
次の式(1)で表される試薬。
iBoc-Gly-Gly-Arg-MCA・・・(1)
[但し、式(1)中、iBocは、イソブチルオキシカルボニル基、Glyは、グリシン残基、Argは、アルギニン残基、MCAは、4-メチルクマリル-7-アミド基を表す。] - 請求項1に記載の試薬であって、
ポルフィロモナス・ジンジバリス、トレポネマ・デンティコラ、および、タネレラ・フォーサイシアのうちの一種以上の菌体または菌体抽出物を含む液体試料に添加されている試薬。 - 口臭のリスクを判定するために使用される試薬であって、
次の式(1)で表される試薬。
iBoc-Gly-Gly-Arg-MCA・・・(1)
[但し、式(1)中、iBocは、イソブチルオキシカルボニル基、Glyは、グリシン残基、Argは、アルギニン残基、MCAは、4-メチルクマリル-7-アミド基を表す。] - 歯周病の原因菌を判別する菌種判別方法であって、
口腔内細菌の菌体または菌体抽出物と、次の式(1)で表される試薬と、を酵素反応させた液体試料に励起光を照射し、
前記液体試料から放出された蛍光の強度に基づいて、前記口腔内細菌としてポルフィロモナス・ジンジバリスが含まれるか否か、または、前記口腔内細菌として含まれるポルフィロモナス・ジンジバリスの量を判別する菌種判別方法。
iBoc-Gly-Gly-Arg-MCA・・・(1)
[但し、式(1)中、iBocは、イソブチルオキシカルボニル基、Glyは、グリシン残基、Argは、アルギニン残基、MCAは、4-メチルクマリル-7-アミド基を表す。] - 請求項4に記載の菌種判別方法であって、
前記液体試料は、単離された前記口腔内細菌の菌体または菌体抽出物を含み、
前記液体試料について測定された蛍光強度値または蛍光強度の時間的変化量が、予め設定された閾値以上であるとき、前記口腔内細菌がポルフィロモナス・ジンジバリスであると判定する菌種判別方法。 - 請求項4に記載の菌種判別方法であって、
前記液体試料は、単離されたポルフィロモナス・ジンジバリス、単離されたトレポネマ・デンティコラ、または、単離されたタネレラ・フォーサイシアの菌体または菌体抽出物を含み、
前記液体試料について測定された蛍光強度値または蛍光強度の時間的変化量が、予め設定された閾値以上であるとき、前記口腔内細菌がポルフィロモナス・ジンジバリスであると判定し、
前記液体試料について測定された蛍光強度値または蛍光強度の時間的変化量が、予め設定された閾値未満であるとき、前記口腔内細菌がトレポネマ・デンティコラまたはタネレラ・フォーサイシアであると判定する菌種判別方法。 - 請求項4に記載の菌種判別方法であって、
前記液体試料は、単離されていない前記口腔内細菌の細菌群の菌体または菌体抽出物を含み、
前記液体試料について測定された蛍光強度値または蛍光強度の時間的変化量が、予め設定された閾値以上であるとき、前記口腔内細菌として含まれるポルフィロモナス・ジンジバリスの量が多いと判定する菌種判別方法。 - 請求項4から請求項7のいずれか一項に記載の菌種判別方法であって、
前記励起光の波長は、355nm以上375nm以下である菌種判別方法。 - 請求項4から請求項8のいずれか一項に記載の菌種判別方法であって、
前記蛍光の波長は、430nm以上455nm以下である菌種判別方法。 - 歯周病の原因菌を判別する蛍光測定装置であって、
口腔内細菌の菌体または菌体抽出物と、次の式(1)で表される試薬と、を酵素反応させた液体試料に励起光を照射する照射手段と、
前記液体試料から放出される蛍光を検出する検出手段と、
検出された蛍光の強度に基づいて、前記口腔内細菌としてポルフィロモナス・ジンジバリスが含まれるか否か、または、前記口腔内細菌として含まれるポルフィロモナス・ジンジバリスの量を判別する判別手段と、を備える蛍光測定装置。
iBoc-Gly-Gly-Arg-MCA・・・(1)
[但し、式(1)中、iBocは、イソブチルオキシカルボニル基、Glyは、グリシン残基、Argは、アルギニン残基、MCAは、4-メチルクマリル-7-アミド基を表す。] - 請求項10に記載の蛍光測定装置であって、
前記液体試料は、単離された前記口腔内細菌の菌体または菌体抽出物を含み、
前記液体試料について測定された蛍光強度値または蛍光強度の時間的変化量が、予め設定された閾値以上であるとき、前記口腔内細菌がポルフィロモナス・ジンジバリスであると判定する蛍光測定装置。 - 請求項10に記載の蛍光測定装置であって、
前記液体試料は、ポルフィロモナス・ジンジバリス、トレポネマ・デンティコラ、および、タネレラ・フォーサイシアのうちの一種以上の菌体または菌体抽出物を含み、
前記液体試料について測定された蛍光強度値または蛍光強度の時間的変化量が、予め設定された閾値以上であるとき、前記口腔内細菌ポルフィロモナス・ジンジバリスであると判定し、
前記液体試料について測定された蛍光強度値または蛍光強度の時間的変化量が、予め設定された閾値未満であるとき、前記口腔内細菌がトレポネマ・デンティコラまたはタネレラ・フォーサイシアであると判定する蛍光測定装置。 - 請求項10に記載の蛍光測定装置であって、
前記液体試料は、単離されていない前記口腔内細菌の細菌群の菌体または菌体抽出物を含み、
前記液体試料について測定された蛍光強度値または蛍光強度の時間的変化量が、予め設定された閾値以上であるとき、前記口腔内細菌として含まれるポルフィロモナス・ジンジバリスの量が多いと判定する蛍光測定装置。 - 請求項10から請求項13のいずれか一項に記載の蛍光測定装置であって、
前記励起光の波長は、355nm以上375nm以下である蛍光測定装置。 - 請求項10から請求項14のいずれか一項に記載の蛍光測定装置であって、
前記蛍光の波長は、430nm以上455nm以下である蛍光測定装置。 - 口臭のリスクを判定する口臭リスク判定方法であって、
歯垢、歯肉浸出液、唾液、または、これらに含まれる菌体の菌体抽出物と、次の式(1)で表される試薬と、を反応させた液体試料に励起光を照射し、
前記液体試料から放出された蛍光の強度に基づいて、口臭が発現するリスクの高さを判定する口臭リスク判定方法。
iBoc-Gly-Gly-Arg-MCA・・・(1)
[但し、式(1)中、iBocは、イソブチルオキシカルボニル基、Glyは、グリシン残基、Argは、アルギニン残基、MCAは、4-メチルクマリル-7-アミド基を表す。] - 請求項16に記載の口臭リスク判定方法であって、
前記液体試料について測定された蛍光強度値または蛍光強度の時間的変化量が、予め設定された閾値以上であるとき、口臭が発現するリスクが高いと判定する口臭リスク判定方法。 - 請求項16または請求項17に記載の口臭リスク判定方法であって、
前記口臭のリスクは、ポルフィロモナス・ジンジバリスによるメチルメルカプタンの生成に起因するリスクである口臭リスク判定方法。 - 請求項16から請求項18のいずれか一項に記載の口臭リスク判定方法であって、
前記励起光の波長は、355nm以上375nm以下である口臭リスク判定方法。 - 請求項16から請求項19のいずれか一項に記載の口臭リスク判定方法であって、
前記蛍光の波長は、430nm以上455nm以下である口臭リスク判定方法。 - 口臭のリスクを判定する蛍光測定装置であって、
歯垢、歯肉浸出液、唾液、または、これらに含まれる菌体の菌体抽出物と、次の式(1)で表される試薬と、を反応させた液体試料に励起光を照射する照射手段と、
前記液体試料から放出される蛍光を検出する検出手段と、
検出された蛍光の強度に基づいて、口臭が発現するリスクの高さを判定する判定手段と、を備える蛍光測定装置。
iBoc-Gly-Gly-Arg-MCA・・・(1)
[但し、式(1)中、iBocは、イソブチルオキシカルボニル基、Glyは、グリシン残基、Argは、アルギニン残基、MCAは、4-メチルクマリル-7-アミド基を表す。] - 請求項21に記載の蛍光測定装置であって、
前記液体試料について測定された蛍光強度値または蛍光強度の時間的変化量が、予め設定された閾値以上であるとき、口臭が発現するリスクが高いと判定する蛍光測定装置。 - 請求項21または請求項22に記載の蛍光測定装置であって、
前記口臭のリスクは、ポルフィロモナス・ジンジバリスによるメチルメルカプタンの生成に起因するリスクである蛍光測定装置。 - 請求項21から請求項23のいずれか一項に記載の口臭リスク判定装置であって、
前記励起光の波長は、355nm以上375nm以下である口臭リスク判定装置。 - 請求項21から請求項24のいずれか一項に記載の口臭リスク判定装置であって、
前記蛍光の波長は、430nm以上455nm以下である口臭リスク判定装置。
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三浦真由美ほか: "異なる線毛タイプをもつPorphyromonas gingivalis 臨床分離株のプロテアーゼ活性と共凝集について", 日本歯周病学会学術大会プログラムおよび講演抄録集, vol. 47, JPN6020036980, 25 September 2004 (2004-09-25), pages 95, ISSN: 0005087039 * |
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