JPH11228597A - ペプチド置換クマリン誘導体 - Google Patents
ペプチド置換クマリン誘導体Info
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- JPH11228597A JPH11228597A JP10037362A JP3736298A JPH11228597A JP H11228597 A JPH11228597 A JP H11228597A JP 10037362 A JP10037362 A JP 10037362A JP 3736298 A JP3736298 A JP 3736298A JP H11228597 A JPH11228597 A JP H11228597A
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- carbobenzoxy
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- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups
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- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】蛋白質分解酵素であるリジル−ジンジパインの
活性を特異的かつ高感度に測定できる蛍光性の合成基質
等として有用な新規化合物を提供すること。 【解決手段】一般式 【化１】 （式中、Ｒはカルボベンゾキシ基又はＮα−カルボベン
ゾキシ−ヒスチジル基を示す。）で表されるペプチド置
換クマリン誘導体又はその塩、並びに上記一般式（１）
のペプチド置換クマリン誘導体又はその塩を含有するリ
ジル−ジンジパイン（Lys-gingipain）の活性を測定す
る試薬。
活性を特異的かつ高感度に測定できる蛍光性の合成基質
等として有用な新規化合物を提供すること。 【解決手段】一般式 【化１】 （式中、Ｒはカルボベンゾキシ基又はＮα−カルボベン
ゾキシ−ヒスチジル基を示す。）で表されるペプチド置
換クマリン誘導体又はその塩、並びに上記一般式（１）
のペプチド置換クマリン誘導体又はその塩を含有するリ
ジル−ジンジパイン（Lys-gingipain）の活性を測定す
る試薬。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、蛋白質分解酵素活
性測定用の蛍光性基質等として有用な、新規なペプチド
置換クマリン誘導体に関する。
性測定用の蛍光性基質等として有用な、新規なペプチド
置換クマリン誘導体に関する。
【０００２】
【従来の技術】多くの歯周病は歯周局所の常在微生物に
よって惹起される一種の感染症と考えられている。その
中でも特に、グラム陰性嫌気性桿菌のポルフィロモナス
・ジンジバリス（Porphyromonas gingivalis）が成人
性歯周炎や急速進行性歯周炎において最も重要な病因菌
であることが明らかにされている（J. Clin. Periodont
ol., 15, 85-93, 1988；J. Clin. Periodontol., 15, 3
16-323, 1988；J. Dent.Res., 63, 441-451, 1984）。
近年、そのP. gingivalisが産生するプロテアーゼ群が
その機能、即ちコラーゲンをはじめとする歯周組織成分
や生体防御系に関与する血清蛋白質を分解することが知
られ、病原性と深く関係していることが明らかにされて
いる（Greiner D., Mayrand D.:Biology of the Specie
s Porphyromonas gingivalis, Edited by Shah H. N.,
Mayrand D. and Genco R. J., pp227-243, CRC Press,
Boca Raton, Ann Arbor, London, Tokyo, 1993）。この
P. gingivalisが産生する蛋白質分解酵素であるリジル
−ジンジパイン（Lys-gingipain）（KGP）も高分子キニ
ノーゲンやフィブリノーゲンに高い分解能を示すことが
知られ、歯周炎の発現や歯周組織の破壊に関与するもの
と考えられている（J.Biol. Chem., 269, 406-411, 199
4）。
よって惹起される一種の感染症と考えられている。その
中でも特に、グラム陰性嫌気性桿菌のポルフィロモナス
・ジンジバリス（Porphyromonas gingivalis）が成人
性歯周炎や急速進行性歯周炎において最も重要な病因菌
であることが明らかにされている（J. Clin. Periodont
ol., 15, 85-93, 1988；J. Clin. Periodontol., 15, 3
16-323, 1988；J. Dent.Res., 63, 441-451, 1984）。
近年、そのP. gingivalisが産生するプロテアーゼ群が
その機能、即ちコラーゲンをはじめとする歯周組織成分
や生体防御系に関与する血清蛋白質を分解することが知
られ、病原性と深く関係していることが明らかにされて
いる（Greiner D., Mayrand D.:Biology of the Specie
s Porphyromonas gingivalis, Edited by Shah H. N.,
Mayrand D. and Genco R. J., pp227-243, CRC Press,
Boca Raton, Ann Arbor, London, Tokyo, 1993）。この
P. gingivalisが産生する蛋白質分解酵素であるリジル
−ジンジパイン（Lys-gingipain）（KGP）も高分子キニ
ノーゲンやフィブリノーゲンに高い分解能を示すことが
知られ、歯周炎の発現や歯周組織の破壊に関与するもの
と考えられている（J.Biol. Chem., 269, 406-411, 199
4）。
【０００３】従来より種々の酵素阻害活性測定用の蛍光
性の基質が知られており、特開昭５５−２４１４７号公
報には、７−（Ｎα−置換又は未置換リジル）−アミノ
−４−メチルクマリンがトリプシン等の合成基質として
記載されている。しかし、該公報には、本発明化合物は
具体的には開示されていない。
性の基質が知られており、特開昭５５−２４１４７号公
報には、７−（Ｎα−置換又は未置換リジル）−アミノ
−４−メチルクマリンがトリプシン等の合成基質として
記載されている。しかし、該公報には、本発明化合物は
具体的には開示されていない。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、歯周病がPo
rphyromonas gingivalisによって引き起こされること、
P. gingivalisの歯周病に関与する成分には蛋白質分解
酵素であるリジル−ジンジパイン（Lys-gingipain）が
寄与していることに着目してなされたもので、本発明の
目的は、この蛋白質分解酵素の活性を特異的かつ高感度
に測定できる蛍光性の合成基質等として有用な新規化合
物を提供することにある。
rphyromonas gingivalisによって引き起こされること、
P. gingivalisの歯周病に関与する成分には蛋白質分解
酵素であるリジル−ジンジパイン（Lys-gingipain）が
寄与していることに着目してなされたもので、本発明の
目的は、この蛋白質分解酵素の活性を特異的かつ高感度
に測定できる蛍光性の合成基質等として有用な新規化合
物を提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者は、鋭意研究を
重ねた結果、下記一般式（１）で表されるペプチド置換
クマリン誘導体が簡便で高感度に特定酵素の活性を測定
できる蛍光性の合成基質であることを見出し、これに基
づき本発明を完成させた。
重ねた結果、下記一般式（１）で表されるペプチド置換
クマリン誘導体が簡便で高感度に特定酵素の活性を測定
できる蛍光性の合成基質であることを見出し、これに基
づき本発明を完成させた。
【０００６】即ち、本発明は、一般式
【０００７】
【化３】
【０００８】（式中、Ｒはカルボベンゾキシ基又はＮα
−カルボベンゾキシ−ヒスチジル基を示す。）で表され
るペプチド置換クマリン誘導体又はその塩に係る。
−カルボベンゾキシ−ヒスチジル基を示す。）で表され
るペプチド置換クマリン誘導体又はその塩に係る。
【０００９】また、本発明は、上記一般式（１）のペプ
チド置換クマリン誘導体又はその塩を含有するリジル−
ジンジパイン（Lys-gingipain）の活性を測定する試薬
にも係る。
チド置換クマリン誘導体又はその塩を含有するリジル−
ジンジパイン（Lys-gingipain）の活性を測定する試薬
にも係る。
【００１０】一般式（１）においてＲがカルボベンゾキ
シ基である化合物は、特開昭５５−２４１４７号公報の
特許請求の範囲に形式的には包含されるが、実施例等に
は具体的に記載されておらず、しかも口腔内に常在する
Porphyromonas gingivalisが産生し、歯周病に関与する
蛋白質分解酵素であるリジル−ジンジパイン（Lys-ging
ipain）の活性を特異的かつ高感度に測定できることに
ついては全く知られていない。
シ基である化合物は、特開昭５５−２４１４７号公報の
特許請求の範囲に形式的には包含されるが、実施例等に
は具体的に記載されておらず、しかも口腔内に常在する
Porphyromonas gingivalisが産生し、歯周病に関与する
蛋白質分解酵素であるリジル−ジンジパイン（Lys-ging
ipain）の活性を特異的かつ高感度に測定できることに
ついては全く知られていない。
【００１１】
【発明の実施の形態】本発明の一般式（１）で表される
化合物の塩は、特に限定されず、薬学的に許容される酸
又は塩基性化合物を作用させた酸付加塩及び／又は塩基
塩が挙げられる。この酸付加塩としては、例えば塩酸、
硫酸、リン酸、臭化水素酸等の無機酸との塩、シュウ
酸、マレイン酸、フマール酸、リンゴ酸、酒石酸、クエ
ン酸、安息香酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、ｐ−トルエ
ンスルホン酸、メタンスルホン酸等の有機酸との塩が例
示できる。塩基塩としては、例えばナトリウム、カリウ
ム、マグネシウム、カルシウム等のアルカリ金属及びア
ルカリ土類金属との塩、アンモニア、メチルアミン、ジ
メチルアミン、ピペリジン、シクロヘキシルアミン、ト
リエチルアミン等のアミン類との塩が例示できる。
化合物の塩は、特に限定されず、薬学的に許容される酸
又は塩基性化合物を作用させた酸付加塩及び／又は塩基
塩が挙げられる。この酸付加塩としては、例えば塩酸、
硫酸、リン酸、臭化水素酸等の無機酸との塩、シュウ
酸、マレイン酸、フマール酸、リンゴ酸、酒石酸、クエ
ン酸、安息香酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、ｐ−トルエ
ンスルホン酸、メタンスルホン酸等の有機酸との塩が例
示できる。塩基塩としては、例えばナトリウム、カリウ
ム、マグネシウム、カルシウム等のアルカリ金属及びア
ルカリ土類金属との塩、アンモニア、メチルアミン、ジ
メチルアミン、ピペリジン、シクロヘキシルアミン、ト
リエチルアミン等のアミン類との塩が例示できる。
【００１２】本発明化合物又はその塩は水和物に代表さ
れる溶媒和物の形であってもよい。
れる溶媒和物の形であってもよい。
【００１３】本発明化合物を構成するアミノ酸はＬ−
体、Ｄ−体のいずれであっても良いが、リジン残基はＬ
−体が好ましい。
体、Ｄ−体のいずれであっても良いが、リジン残基はＬ
−体が好ましい。
【００１４】本発明の好ましい化合物は、一般式（１）
においてＲがＮα−カルボベンゾキシ−ヒスチジル基で
ある化合物である。
においてＲがＮα−カルボベンゾキシ−ヒスチジル基で
ある化合物である。
【００１５】また、リジル−ジンジパイン（Lys-gingip
ain）の活性測定用試薬としては一般式（１）において
ＲがＮα−カルボベンゾキシ−ヒスチジル基である化合
物を含有する試薬が好ましい。
ain）の活性測定用試薬としては一般式（１）において
ＲがＮα−カルボベンゾキシ−ヒスチジル基である化合
物を含有する試薬が好ましい。
【００１６】本発明のペプチド置換クマリン誘導体
（１）は、例えば次の反応工程式の方法で製造すること
ができる。
（１）は、例えば次の反応工程式の方法で製造すること
ができる。
【００１７】
【化４】
【００１８】（式中、Ｐ1はアミノ基の保護基を、Ｐ2は
カルボキシル基の保護基を示し、Ｐ3はカルボベンゾキ
シ基あるいは一般式
カルボキシル基の保護基を示し、Ｐ3はカルボベンゾキ
シ基あるいは一般式
【００１９】
【化５】
【００２０】（式中、Ｐ4は水素又はイミダゾール基の
保護基を示す。）を示す。）。
保護基を示す。）を示す。）。
【００２１】Ｐ1、Ｐ2、Ｐ4で示される保護基として
は、カルボベンゾキシ基が安定であるような反応条件で
除去されるものであれば特に制限はなく、例えば、Ｐ1
で示されるアミノ基の保護基としては、ｔ-ブトキシカ
ルボニル基、ｐ-メトキシカルボベンゾキシ基、トリチ
ル基等が挙げられる。Ｐ2で示されるカルボキシル基の
保護基としては、ペプチド合成の分野で通常用いられる
保護基、例えばエステル誘導体等が挙げられ、好ましく
は、ｔ-ブチルエステル、ベンズヒドリルエステル等が
挙げられる。Ｐ4で示されるイミダゾール基の保護基と
しては、ｔ-ブトキシカルボニル基、ｐ−メトキシカル
ボベンゾキシ基、トリチル基等が挙げられる。
は、カルボベンゾキシ基が安定であるような反応条件で
除去されるものであれば特に制限はなく、例えば、Ｐ1
で示されるアミノ基の保護基としては、ｔ-ブトキシカ
ルボニル基、ｐ-メトキシカルボベンゾキシ基、トリチ
ル基等が挙げられる。Ｐ2で示されるカルボキシル基の
保護基としては、ペプチド合成の分野で通常用いられる
保護基、例えばエステル誘導体等が挙げられ、好ましく
は、ｔ-ブチルエステル、ベンズヒドリルエステル等が
挙げられる。Ｐ4で示されるイミダゾール基の保護基と
しては、ｔ-ブトキシカルボニル基、ｐ−メトキシカル
ボベンゾキシ基、トリチル基等が挙げられる。
【００２２】一般式（２）で表される保護合成基質を適
当な方法により、Ｐ1、Ｐ2、Ｐ4を選択的に除去すると
一般式（１）で表される本発明化合物が得られる。反応
の条件はベンジルオキシカルボニル基が安定であるよう
な反応条件であれば特に制限はなく、例えば、不活性溶
媒中あるいは無溶媒で、希酸で処理することによって実
施することができる。溶媒としては反応に関与しないも
のであれば特に制限はなく、例えばクロロホルム、ジク
ロロメタン、ジオキサン、テトラヒドロフラン等が例示
できる。酸としては、例えば塩酸、硫酸等の鉱酸、トリ
フルオロ酢酸、パラトルエンスルホン酸等の有機酸が例
示できる。又反応を促進するために、アニソール、チオ
アニソール等を添加してもよい。
当な方法により、Ｐ1、Ｐ2、Ｐ4を選択的に除去すると
一般式（１）で表される本発明化合物が得られる。反応
の条件はベンジルオキシカルボニル基が安定であるよう
な反応条件であれば特に制限はなく、例えば、不活性溶
媒中あるいは無溶媒で、希酸で処理することによって実
施することができる。溶媒としては反応に関与しないも
のであれば特に制限はなく、例えばクロロホルム、ジク
ロロメタン、ジオキサン、テトラヒドロフラン等が例示
できる。酸としては、例えば塩酸、硫酸等の鉱酸、トリ
フルオロ酢酸、パラトルエンスルホン酸等の有機酸が例
示できる。又反応を促進するために、アニソール、チオ
アニソール等を添加してもよい。
【００２３】上記反応工程式で原料として用いられる一
般式（２）で表わされる保護合成基質はペプチド合成の
分野で通常用いられる方法等、例えば「（社）日本生化
学会編、生化学実験講座１、タンパク質の化学IV、207-
400ページ、1977年、（株）東京化学同人発行」に記載
の方法により製造される。例えば７−アミノ−４−メチ
ルクマリンとＮα−ベンジルオキシカルボニルリジン誘
導体をイソブチルクロロホルメート等の縮合剤の存在下
で縮合させると、７−（Ｎα−カルボベンゾキシ−Ｎε
−保護（Ｐ1）リジル）アミノ−４−メチルクマリンが
得られる。得られた化合物のＮα−保護基を例えば接触
還元等で選択的に脱保護し、再び所望のＮα−カルボベ
ンゾキシアミノ酸誘導体と縮合、あるいは縮合反応で得
られた化合物のＮα−保護基を更に選択的に脱保護し、
再び所望のＮα−カルボベンゾキシアミノ酸誘導体と縮
合することにより所望の一般式（２）で表せられる保護
合成基質が製造される。
般式（２）で表わされる保護合成基質はペプチド合成の
分野で通常用いられる方法等、例えば「（社）日本生化
学会編、生化学実験講座１、タンパク質の化学IV、207-
400ページ、1977年、（株）東京化学同人発行」に記載
の方法により製造される。例えば７−アミノ−４−メチ
ルクマリンとＮα−ベンジルオキシカルボニルリジン誘
導体をイソブチルクロロホルメート等の縮合剤の存在下
で縮合させると、７−（Ｎα−カルボベンゾキシ−Ｎε
−保護（Ｐ1）リジル）アミノ−４−メチルクマリンが
得られる。得られた化合物のＮα−保護基を例えば接触
還元等で選択的に脱保護し、再び所望のＮα−カルボベ
ンゾキシアミノ酸誘導体と縮合、あるいは縮合反応で得
られた化合物のＮα−保護基を更に選択的に脱保護し、
再び所望のＮα−カルボベンゾキシアミノ酸誘導体と縮
合することにより所望の一般式（２）で表せられる保護
合成基質が製造される。
【００２４】上記方法により得られる本発明化合物
（１）及び各化合物は、再結晶、蒸留、各種カラムクロ
マトグラフィー等の通常の分離手段により単離及び精製
して用いることができる。
（１）及び各化合物は、再結晶、蒸留、各種カラムクロ
マトグラフィー等の通常の分離手段により単離及び精製
して用いることができる。
【００２５】このようにして得られた本発明のペプチド
置換クマリン誘導体（１）又はその塩は口腔内中に存在
するポルフィロモナス・ジンジバリス（Porphyromonas
gingivalis）が産生する蛋白質分解酵素Lys-gingipai
nにより加水分解されるのでこの酵素の活性を特異的か
つ高感度に測定するための蛍光性の合成基質として有用
である。
置換クマリン誘導体（１）又はその塩は口腔内中に存在
するポルフィロモナス・ジンジバリス（Porphyromonas
gingivalis）が産生する蛋白質分解酵素Lys-gingipai
nにより加水分解されるのでこの酵素の活性を特異的か
つ高感度に測定するための蛍光性の合成基質として有用
である。
【００２６】
【実施例】以下に参考例、実施例及び試験例を挙げて本
発明を一層詳細に説明する。
発明を一層詳細に説明する。
【００２７】参考例１ ７−（Ｎα−カルボベンゾキシ−Ｎε−ｔ−ブトキシカ
ルボニル−Ｌ−リジル）アミノ−４−メチルクマリンの
合成 Ｎα−カルボベンゾキシ−Ｎε−ｔ−ブトキシカルボニ
ル−Ｌ−リジン３．２６ｇ（８．６ｍｍｏｌ）とトリエ
チルアミン１．２ｍｌ（８．６ｍｍｏｌ）のＤＭＦ２０
ｍｌ溶液に、−２０℃〜−３０℃でイソブチルクロロホ
ルメート１．１２ｍｌ（８．６ｍｍｏｌ）を加え、１０
分間撹拌した後、７−アミノ−４−メチルクマリン１．
０ｇ（５．７ｍｍｏｌ）のＤＭＦ１０ｍｌ溶液を加え、
氷冷下１．５時間撹拌した。精製水２ｍｌを加え反応を
停止させた後、反応液に飽和食塩水を加え酢酸エチル抽
出した。酢酸エチル層を１Ｎ塩酸水、飽和食塩水、５％
炭酸水素ナトリウム水、飽和食塩水で順次洗浄し、硫酸
ナトリウムで乾燥した。溶媒を留去し、残渣をシリカゲ
ルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒；クロロホル
ム：アセトン＝１０：１（ｖ／ｖ）で溶出後、クロロホ
ルム：エタノール＝２０：１（ｖ／ｖ）で溶出）により
精製した。エーテル−ｎ−ヘキサンより結晶化し、標記
化合物を１．０６ｇ（収率３４．４％）得た。物性を下
記に示す。
ルボニル−Ｌ−リジル）アミノ−４−メチルクマリンの
合成 Ｎα−カルボベンゾキシ−Ｎε−ｔ−ブトキシカルボニ
ル−Ｌ−リジン３．２６ｇ（８．６ｍｍｏｌ）とトリエ
チルアミン１．２ｍｌ（８．６ｍｍｏｌ）のＤＭＦ２０
ｍｌ溶液に、−２０℃〜−３０℃でイソブチルクロロホ
ルメート１．１２ｍｌ（８．６ｍｍｏｌ）を加え、１０
分間撹拌した後、７−アミノ−４−メチルクマリン１．
０ｇ（５．７ｍｍｏｌ）のＤＭＦ１０ｍｌ溶液を加え、
氷冷下１．５時間撹拌した。精製水２ｍｌを加え反応を
停止させた後、反応液に飽和食塩水を加え酢酸エチル抽
出した。酢酸エチル層を１Ｎ塩酸水、飽和食塩水、５％
炭酸水素ナトリウム水、飽和食塩水で順次洗浄し、硫酸
ナトリウムで乾燥した。溶媒を留去し、残渣をシリカゲ
ルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒；クロロホル
ム：アセトン＝１０：１（ｖ／ｖ）で溶出後、クロロホ
ルム：エタノール＝２０：１（ｖ／ｖ）で溶出）により
精製した。エーテル−ｎ−ヘキサンより結晶化し、標記
化合物を１．０６ｇ（収率３４．４％）得た。物性を下
記に示す。
【００２８】融点：１２７−１２９℃。
【００２９】1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ：9.08 (1H,
s), 7.66 (1H, s), 7.48-7.35 (7H,m), 6.17 (1H, s),
5.73 (1H, brs), 5.13 (2H, s), 4.69 (1H, brt), 4.33
(1H, brs), 3.16-3.07 (2H, m), 2.40 (3H, s), 2.03-
1.94 (1H, m), 1.80-1.68 (1H, m), 1.55-1.42 (13H,
m)。
s), 7.66 (1H, s), 7.48-7.35 (7H,m), 6.17 (1H, s),
5.73 (1H, brs), 5.13 (2H, s), 4.69 (1H, brt), 4.33
(1H, brs), 3.16-3.07 (2H, m), 2.40 (3H, s), 2.03-
1.94 (1H, m), 1.80-1.68 (1H, m), 1.55-1.42 (13H,
m)。
【００３０】ＩＲ（ＫＢｒ）cm-1：3327, 2977, 2936,
1695, 1619, 1584, 1526, 1455, 1415, 1393, 1368, 13
30, 1308, 1270, 1252, 1224, 1173, 1069。
1695, 1619, 1584, 1526, 1455, 1415, 1393, 1368, 13
30, 1308, 1270, 1252, 1224, 1173, 1069。
【００３１】参考例２ ７−（Ｎα−カルボベンゾキシ−γ−ｔ−ブチル−Ｌ−
グルタミル−Ｎε−ｔ−ブトキシカルボニル−Ｌ−リジ
ル）アミノ−４−メチルクマリンの合成 参考例１で得た縮合体９００ｍｇ（１．６７ｍｍｏ
ｌ）、１０％パラジウムカーボン２００ｍｇ、酢酸３
滴、メタノール５０ｍｌの混合物を３．５ｋｇ／ｃ
ｍ2、３時間接触水素還元した。反応後、不溶物を濾去
し、溶媒を留去した。得られた残渣とＮ−メチルモルホ
リン１８７μｌ（１．７ｍｍｏｌ）のＤＭＦ２ｍｌ溶液
をＮα−カルボベンゾキシ−γ−ｔ−ブチル−Ｌ−グル
タミン酸５４０ｍｇ（１．６ｍｍｏｌ）、１−ヒドロキ
シベンゾトリアゾール水和物２３０ｍｇ（１．７ｍｍｏ
ｌ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピ
ル）カルボジイミド塩酸塩３２６ｍｇ（１．７ｍｍｏ
ｌ）のＤＭＦ８ｍｌ溶液に氷冷下、滴下し、室温で１２
時間撹拌した。反応後、反応液に飽和食塩水を加え酢酸
エチル抽出した。酢酸エチル層を５％クエン酸水、飽和
食塩水、５％炭酸水素ナトリウム水、飽和食塩水で順次
洗浄、硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を留去し、残渣
をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒；ク
ロロホルム：エタノール＝４８：１（ｖ／ｖ）で溶出）
により精製した。標記化合物のアモルファスを９１４ｍ
ｇ（収率７５．５％）得た。物性を下記に示す。
グルタミル−Ｎε−ｔ−ブトキシカルボニル−Ｌ−リジ
ル）アミノ−４−メチルクマリンの合成 参考例１で得た縮合体９００ｍｇ（１．６７ｍｍｏ
ｌ）、１０％パラジウムカーボン２００ｍｇ、酢酸３
滴、メタノール５０ｍｌの混合物を３．５ｋｇ／ｃ
ｍ2、３時間接触水素還元した。反応後、不溶物を濾去
し、溶媒を留去した。得られた残渣とＮ−メチルモルホ
リン１８７μｌ（１．７ｍｍｏｌ）のＤＭＦ２ｍｌ溶液
をＮα−カルボベンゾキシ−γ−ｔ−ブチル−Ｌ−グル
タミン酸５４０ｍｇ（１．６ｍｍｏｌ）、１−ヒドロキ
シベンゾトリアゾール水和物２３０ｍｇ（１．７ｍｍｏ
ｌ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピ
ル）カルボジイミド塩酸塩３２６ｍｇ（１．７ｍｍｏ
ｌ）のＤＭＦ８ｍｌ溶液に氷冷下、滴下し、室温で１２
時間撹拌した。反応後、反応液に飽和食塩水を加え酢酸
エチル抽出した。酢酸エチル層を５％クエン酸水、飽和
食塩水、５％炭酸水素ナトリウム水、飽和食塩水で順次
洗浄、硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を留去し、残渣
をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒；ク
ロロホルム：エタノール＝４８：１（ｖ／ｖ）で溶出）
により精製した。標記化合物のアモルファスを９１４ｍ
ｇ（収率７５．５％）得た。物性を下記に示す。
【００３２】融点：７９−８３℃。
【００３３】1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ：9.16 (1H,
s), 7.73 (1H, s), 7.54-7.52 (1H,m), 7.46 (1H, d, J
=8.5Hz), 7.31-7.30 (5H, m), 6.98 (1H, brs), 6.23
(1H,brs), 6.16 (1H, s), 5.13 (2H, s), 4.72 (1H, br
s), 4.57-4.52 (1H, m), 4.25-4.21 (1H, m), 3.10 (2
H, brs), 2.50-2.42 (2H, m), 2.39 (3H, s), 2.19-2.1
1 (1H, m), 2.03-1.99 (2H, m), 1.70-1.67 (1H, m),
1.50-1.38 (22H,m)。
s), 7.73 (1H, s), 7.54-7.52 (1H,m), 7.46 (1H, d, J
=8.5Hz), 7.31-7.30 (5H, m), 6.98 (1H, brs), 6.23
(1H,brs), 6.16 (1H, s), 5.13 (2H, s), 4.72 (1H, br
s), 4.57-4.52 (1H, m), 4.25-4.21 (1H, m), 3.10 (2
H, brs), 2.50-2.42 (2H, m), 2.39 (3H, s), 2.19-2.1
1 (1H, m), 2.03-1.99 (2H, m), 1.70-1.67 (1H, m),
1.50-1.38 (22H,m)。
【００３４】ＩＲ（ＫＢｒ）cm-1：3322, 2978, 1703,
1620, 1584, 1527, 1455, 1416, 1393, 1368, 1328, 13
06, 1253, 1226, 1159。
1620, 1584, 1527, 1455, 1416, 1393, 1368, 1328, 13
06, 1253, 1226, 1159。
【００３５】参考例３ ７−（Ｎα−カルボベンゾキシ−Ｎim−トリチル−Ｌ−
ヒスチジル−γ−ｔ−ブチル−Ｌ−グルタミル−Ｎε−
ｔ−ブトキシカルボニル−Ｌ−リジル）アミノ−４−メ
チルクマリンの合成 参考例２で得た縮合体４５０ｍｇ（０．６２３ｍｍｏ
ｌ）、１０％パラジウムカーボン１６０ｍｇ、酢酸３
滴、メタノール４０ｍｌの混合物を３．５ｋｇ／ｃ
ｍ2、３．５時間接触水素還元した。反応後、不溶物を
濾去し、溶媒を留去した。得られた残渣のＤＭＦ２ｍｌ
溶液をＮα−カルボベンゾキシ−Ｎim−トリチル−Ｌ−
ヒスチジン３９７ｍｇ（０．７５ｍｍｏｌ）、１−ヒド
ロキシベンゾトリアゾール水和物１０１ｍｇ（０．７５
ｍｍｏｌ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプ
ロピル）カルボジイミド塩酸塩１４３ｍｇ（０．７５ｍ
ｍｏｌ）のＤＭＦ４ｍｌ溶液に氷冷下、滴下し、室温で
１２時間撹拌した。反応後、反応液に飽和食塩水を加え
酢酸エチル抽出した。酢酸エチル層を５％クエン酸水、
飽和食塩水、５％炭酸水素ナトリウム水、飽和食塩水で
順次洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を留去
し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開
溶媒；クロロホルム：エタノール＝５５：１（ｖ／ｖ）
で溶出）により精製した。標記化合物のアモルファスを
４６０ｍｇ（収率６７．１％）を得た。物性を下記に示
す。
ヒスチジル−γ−ｔ−ブチル−Ｌ−グルタミル−Ｎε−
ｔ−ブトキシカルボニル−Ｌ−リジル）アミノ−４−メ
チルクマリンの合成 参考例２で得た縮合体４５０ｍｇ（０．６２３ｍｍｏ
ｌ）、１０％パラジウムカーボン１６０ｍｇ、酢酸３
滴、メタノール４０ｍｌの混合物を３．５ｋｇ／ｃ
ｍ2、３．５時間接触水素還元した。反応後、不溶物を
濾去し、溶媒を留去した。得られた残渣のＤＭＦ２ｍｌ
溶液をＮα−カルボベンゾキシ−Ｎim−トリチル−Ｌ−
ヒスチジン３９７ｍｇ（０．７５ｍｍｏｌ）、１−ヒド
ロキシベンゾトリアゾール水和物１０１ｍｇ（０．７５
ｍｍｏｌ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプ
ロピル）カルボジイミド塩酸塩１４３ｍｇ（０．７５ｍ
ｍｏｌ）のＤＭＦ４ｍｌ溶液に氷冷下、滴下し、室温で
１２時間撹拌した。反応後、反応液に飽和食塩水を加え
酢酸エチル抽出した。酢酸エチル層を５％クエン酸水、
飽和食塩水、５％炭酸水素ナトリウム水、飽和食塩水で
順次洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を留去
し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開
溶媒；クロロホルム：エタノール＝５５：１（ｖ／ｖ）
で溶出）により精製した。標記化合物のアモルファスを
４６０ｍｇ（収率６７．１％）を得た。物性を下記に示
す。
【００３６】融点：１０５−１０８℃。
【００３７】1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ：9.04 (1H,
brd), 8.84 (1H, s), 8.41 (1H, s), 7.86 (1H, s), 7.
62 (1H, d, J=8.3Hz), 7.35-7.19 (16H, m), 6.91-6.89
(6H, m), 6.58 (1H, s), 6.15 (1H, s), 6.00 (1H, br
s), 5.11 (1H, d, J=12.4Hz), 5.04 (1H, d, J=12.4H
z), 4.71-4.59 (2H, m), 4.40 (1H, m), 4.29-4.26 (1
H, m), 3.12-3.04 (4H, m), 2.53-2.46 (2H, m), 2.28
(3H, s), 2.28-2.12 (3H, m), 1.64-1.37 (23H, m)。
brd), 8.84 (1H, s), 8.41 (1H, s), 7.86 (1H, s), 7.
62 (1H, d, J=8.3Hz), 7.35-7.19 (16H, m), 6.91-6.89
(6H, m), 6.58 (1H, s), 6.15 (1H, s), 6.00 (1H, br
s), 5.11 (1H, d, J=12.4Hz), 5.04 (1H, d, J=12.4H
z), 4.71-4.59 (2H, m), 4.40 (1H, m), 4.29-4.26 (1
H, m), 3.12-3.04 (4H, m), 2.53-2.46 (2H, m), 2.28
(3H, s), 2.28-2.12 (3H, m), 1.64-1.37 (23H, m)。
【００３８】ＩＲ（ＫＢｒ）cm-1：3327, 1711, 1619,
1579, 1522, 1448, 1413, 1392, 1368, 1328, 1251, 11
56, 751, 702。
1579, 1522, 1448, 1413, 1392, 1368, 1328, 1251, 11
56, 751, 702。
【００３９】実施例１ ７−（Ｎα−カルボベンゾキシ−Ｌ−グルタミル−Ｌ−
リジル）アミノ−４−メチルクマリン塩酸塩の合成 参考例２で得た縮合体３１４ｍｇ（０．４３ｍｍｏ
ｌ）、アニソール０．３ｍｌ、トリフルオロ酢酸５ｍｌ
の混合物を氷冷下１５分、室温１．５時間撹拌した。反
応後、反応混合物を減圧下濃縮した。残渣にジエチルエ
ーテルを加え、析出した結晶を瀘取した。得られた結晶
を０．５Ｎ塩酸に溶解し、ＭＣＩゲル（三菱化学社製、
ＣＨＰ−２０（７５〜１５０μ））を担体としたカラム
クロマトグラフィー（展開溶媒；４０％アセトニトリル
で溶出）により精製した。得られた画分を減圧下濃縮
し、更に０．５Ｎ塩酸を加え凍結乾燥し、標記化合物２
２０ｍｇ（収率８４．０％）を得た。物性を下記に示
す。
リジル）アミノ−４−メチルクマリン塩酸塩の合成 参考例２で得た縮合体３１４ｍｇ（０．４３ｍｍｏ
ｌ）、アニソール０．３ｍｌ、トリフルオロ酢酸５ｍｌ
の混合物を氷冷下１５分、室温１．５時間撹拌した。反
応後、反応混合物を減圧下濃縮した。残渣にジエチルエ
ーテルを加え、析出した結晶を瀘取した。得られた結晶
を０．５Ｎ塩酸に溶解し、ＭＣＩゲル（三菱化学社製、
ＣＨＰ−２０（７５〜１５０μ））を担体としたカラム
クロマトグラフィー（展開溶媒；４０％アセトニトリル
で溶出）により精製した。得られた画分を減圧下濃縮
し、更に０．５Ｎ塩酸を加え凍結乾燥し、標記化合物２
２０ｍｇ（収率８４．０％）を得た。物性を下記に示
す。
【００４０】融点：１５２−１５６℃（分解）。
【００４１】比旋光度：［α］25 D＝−４４.３６°（ｃ
＝0.523, MeOH）。
＝0.523, MeOH）。
【００４２】1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ3ＯＤ）δ：7.85 (1H,
s), 7.65 (1H, d, J=8Hz),7.56 (1H, d, J=8Hz), 7.35-
7.24 (5H, m), 6.21 (1H, s), 5.13 (1H, d, J=12.4H
z), 5.08 (1H, d, J=12.4Hz), 4.55-4.51 (1H, m), 4.1
6-4.12 (1H, m), 2.95-2.91 (2H, m), 2.43 (3H, s),
2.35-2.29 (2H, m), 2.11-1.98 (3H, m), 1.86-1.79 (1
H, m), 1.76-1.62 (2H, m), 1.59-1.45 (2H, m)。
s), 7.65 (1H, d, J=8Hz),7.56 (1H, d, J=8Hz), 7.35-
7.24 (5H, m), 6.21 (1H, s), 5.13 (1H, d, J=12.4H
z), 5.08 (1H, d, J=12.4Hz), 4.55-4.51 (1H, m), 4.1
6-4.12 (1H, m), 2.95-2.91 (2H, m), 2.43 (3H, s),
2.35-2.29 (2H, m), 2.11-1.98 (3H, m), 1.86-1.79 (1
H, m), 1.76-1.62 (2H, m), 1.59-1.45 (2H, m)。
【００４３】ＩＲ（ＫＢｒ）cm-1：3427, 3306, 3069,
2948, 1701, 1665, 1619, 1581, 1529, 1454, 1394, 13
71, 1329, 1309, 1266, 1233。
2948, 1701, 1665, 1619, 1581, 1529, 1454, 1394, 13
71, 1329, 1309, 1266, 1233。
【００４４】実施例２ ７−（Ｎα−カルボベンゾキシ−Ｌ−ヒスチジル−Ｌ−
グルタミル−Ｌ−リジル）アミノ−４−メチルクマリン
塩酸塩の合成 参考例３で得た縮合体３１０ｍｇ（０．２８ｍｍｏ
ｌ）、アニソール０．３２ｍｌ、トリフルオロ酢酸６ｍ
ｌの混合物を氷冷下１５分、室温２時間撹拌した。反応
後、反応混合物を減圧下濃縮した。残渣にジエチルエー
テルを加え、析出した結晶を瀘取した。得られた結晶を
０．５Ｎ塩酸に溶解し、ＭＣＩゲル（三菱化学社製、Ｃ
ＨＰ−２０（７５〜１５０μ））を担体としたカラムク
ロマトグラフィー（展開溶媒；２５％アセトニトリルで
溶出）により精製した。得られた画分を減圧下濃縮し、
更に０．５Ｎ塩酸を加え凍結乾燥し、標記化合物１７７
ｍｇ（収率８１．０％）を得た。物性を下記に示す。
グルタミル−Ｌ−リジル）アミノ−４−メチルクマリン
塩酸塩の合成 参考例３で得た縮合体３１０ｍｇ（０．２８ｍｍｏ
ｌ）、アニソール０．３２ｍｌ、トリフルオロ酢酸６ｍ
ｌの混合物を氷冷下１５分、室温２時間撹拌した。反応
後、反応混合物を減圧下濃縮した。残渣にジエチルエー
テルを加え、析出した結晶を瀘取した。得られた結晶を
０．５Ｎ塩酸に溶解し、ＭＣＩゲル（三菱化学社製、Ｃ
ＨＰ−２０（７５〜１５０μ））を担体としたカラムク
ロマトグラフィー（展開溶媒；２５％アセトニトリルで
溶出）により精製した。得られた画分を減圧下濃縮し、
更に０．５Ｎ塩酸を加え凍結乾燥し、標記化合物１７７
ｍｇ（収率８１．０％）を得た。物性を下記に示す。
【００４５】融点：１６６−１６９℃（分解）。
【００４６】比旋光度：［α］25 D＝−４９.６０°（ｃ
＝1.004, MeOH）。
＝1.004, MeOH）。
【００４７】1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ3ＯＤ）δ：7.93 (1H,
s), 7.65-7.58(3H, m), 7.30-7.25(5H, m), 6.91 (1H,
s), 6.21 (1H, d, J=1.2Hz), 5.08 (1H, d, J=12.4Hz),
5.04 (1H, d, J=12.4Hz), 4.52-4.48 (1H, m), 4.35-
4.26 (2H, m), 3.15-3.01 (1H, m), 2.94-2.90 (2H,
m), 2.43 (3H, s), 2.38-2.26 (2H, m), 2.14-2.02 (3
H, m), 1.89-1.81 (1H, m), 1.74-1.46 (4H, m)。
s), 7.65-7.58(3H, m), 7.30-7.25(5H, m), 6.91 (1H,
s), 6.21 (1H, d, J=1.2Hz), 5.08 (1H, d, J=12.4Hz),
5.04 (1H, d, J=12.4Hz), 4.52-4.48 (1H, m), 4.35-
4.26 (2H, m), 3.15-3.01 (1H, m), 2.94-2.90 (2H,
m), 2.43 (3H, s), 2.38-2.26 (2H, m), 2.14-2.02 (3
H, m), 1.89-1.81 (1H, m), 1.74-1.46 (4H, m)。
【００４８】ＩＲ（ＫＢｒ）cm-1：3401, 3285, 3089,
2958, 1700, 1659, 1619, 1577, 1558, 1530, 1454, 14
40, 1394, 1371, 1328, 1309, 1268, 1233。
2958, 1700, 1659, 1619, 1577, 1558, 1530, 1454, 14
40, 1394, 1371, 1328, 1309, 1268, 1233。
【００４９】試験例 次に本発明化合物が蛋白質分解酵素リジル−ジンジパイ
ンの特異的かつ高感度の蛍光性の合成基質となることを
示す。
ンの特異的かつ高感度の蛍光性の合成基質となることを
示す。
【００５０】試験例１ リジル−ジンジパインに対する
本発明化合物の活性の測定 リジル−ジンジパインは岡本、山本らの方法［K.Okamot
o,K.Yamamoto, et al.J.Biochem.120,398-406（199
6）］によりPorphyromonas gingivalis 381の培養瀘液
の上清より調製されたものを使用した。所定の酵素溶液
をｐＨ７．５に調整された５ｍＭシステインを含んだ２
０ｍＭリン酸ナトリウムバッファーの各所定の濃度の合
成基質溶液に添加し、４０℃で反応させた。反応は経時
的に１０ｍＭのヨード酢酸を含んだ酢酸ナトリウム緩衝
液でｐＨ５に調整し、反応を停止させ、遊離した７−ア
ミノ−４−メチルクマリンを蛍光分光光度計を用い、波
長３８０ｎｍで励起した４６０ｎｍの蛍光波長の蛍光強
度を測定した。得られた蛍光強度から予め作成した検量
線を用いて反応速度ｖを算出した。各基質濃度［Ｓ］0
とｖから［Ｓ］0/20〜［Ｓ］0プロットを行い、Ｋm値を
算出した。
本発明化合物の活性の測定 リジル−ジンジパインは岡本、山本らの方法［K.Okamot
o,K.Yamamoto, et al.J.Biochem.120,398-406（199
6）］によりPorphyromonas gingivalis 381の培養瀘液
の上清より調製されたものを使用した。所定の酵素溶液
をｐＨ７．５に調整された５ｍＭシステインを含んだ２
０ｍＭリン酸ナトリウムバッファーの各所定の濃度の合
成基質溶液に添加し、４０℃で反応させた。反応は経時
的に１０ｍＭのヨード酢酸を含んだ酢酸ナトリウム緩衝
液でｐＨ５に調整し、反応を停止させ、遊離した７−ア
ミノ−４−メチルクマリンを蛍光分光光度計を用い、波
長３８０ｎｍで励起した４６０ｎｍの蛍光波長の蛍光強
度を測定した。得られた蛍光強度から予め作成した検量
線を用いて反応速度ｖを算出した。各基質濃度［Ｓ］0
とｖから［Ｓ］0/20〜［Ｓ］0プロットを行い、Ｋm値を
算出した。
【００５１】Ｋmは最大速度Ｖの半分の速度が得られる
基質濃度であり、それによりＶを算出した。
基質濃度であり、それによりＶを算出した。
【００５２】Ｋcatはターンオーバー数であり、酵素の
活性部位１個について単位時間に転化される基質分子の
最大数を示しており、ＫcatはＶ／［Ｅ］0で表される。
ここで［Ｅ］0は酵素濃度を示す。また、Ｋcat／Ｋmは
遊離の酵素と遊離の基質との反応に関連した速度定数で
あり、その値の極限は酵素−基質複合体の生成初期速度
定数と考えられ、特異性定数とも呼ばれている。算出し
た各化合物の反応速度定数を表１に示す。
活性部位１個について単位時間に転化される基質分子の
最大数を示しており、ＫcatはＶ／［Ｅ］0で表される。
ここで［Ｅ］0は酵素濃度を示す。また、Ｋcat／Ｋmは
遊離の酵素と遊離の基質との反応に関連した速度定数で
あり、その値の極限は酵素−基質複合体の生成初期速度
定数と考えられ、特異性定数とも呼ばれている。算出し
た各化合物の反応速度定数を表１に示す。
【００５３】
【表１】
【００５４】表１における記号は、次のものを示す。Ｂ
ｏｃ：ｔ−ブトキシカルボニル基、Ｖａｌ：バリン、Ｌ
ｅｕ：ロイシン、Ｌｙｓ：リジン、Ｇｌｕ：グルタミン
酸、Ｈｉｓ：ヒスチジン、ＭＣＡ：７−アミノ−４−メ
チルクマリン、Ｚ：カルボベンゾキシ基。
ｏｃ：ｔ−ブトキシカルボニル基、Ｖａｌ：バリン、Ｌ
ｅｕ：ロイシン、Ｌｙｓ：リジン、Ｇｌｕ：グルタミン
酸、Ｈｉｓ：ヒスチジン、ＭＣＡ：７−アミノ−４−メ
チルクマリン、Ｚ：カルボベンゾキシ基。
【００５５】上記表１より、本発明合成基質である化合
物１及び化合物２は、公知化合物であるBoc-Val-Leu-Ly
s-MCAに比べ、リジル−ジンジパインに対し１０〜１０
０倍大きい反応速度定数を有しており、従ってリジル−
ジンジパインの活性を特異的かつ高感度で測定できるこ
とが明らかである。
物１及び化合物２は、公知化合物であるBoc-Val-Leu-Ly
s-MCAに比べ、リジル−ジンジパインに対し１０〜１０
０倍大きい反応速度定数を有しており、従ってリジル−
ジンジパインの活性を特異的かつ高感度で測定できるこ
とが明らかである。
【００５６】また、門脇、山本等の方法（The Journal
of Biological Chemistry, 269, 21371-21378（199
4））に従って測定した本発明化合物である合成基質の
ポルフィロモナス・ジンジバリス（P.gingivalis）の産
生する他の主要なトリプシン様システインプロテアーゼ
（アルグージンジパイン（Arg-gingipain））による分
解活性は認められなかった。
of Biological Chemistry, 269, 21371-21378（199
4））に従って測定した本発明化合物である合成基質の
ポルフィロモナス・ジンジバリス（P.gingivalis）の産
生する他の主要なトリプシン様システインプロテアーゼ
（アルグージンジパイン（Arg-gingipain））による分
解活性は認められなかった。
【００５７】また、Ａ．Ｊ．Ｂａｒｒｅｔｔらの方法
（Biochemical Journal、201、189-198(1982)）に従っ
て測定した本発明化合物である合成基質のカテプシンＢ
及びＬに対する酵素分解活性は弱いものであり、本発明
化合物である合成基質はリジル−ジンジパインに対する
酵素分解活性を特異的に測定できることが示唆された。
（Biochemical Journal、201、189-198(1982)）に従っ
て測定した本発明化合物である合成基質のカテプシンＢ
及びＬに対する酵素分解活性は弱いものであり、本発明
化合物である合成基質はリジル−ジンジパインに対する
酵素分解活性を特異的に測定できることが示唆された。
【００５８】
【発明の効果】本発明化合物である合成基質によれば、
口腔内中に存在しているポルフィロモナス・ジンジバリ
ス（P. gingivalis）が産生し、歯周病に関与する蛋白
質分解酵素であるリジル−ジンジパインの活性を特異的
かつ高感度で測定することができる。
口腔内中に存在しているポルフィロモナス・ジンジバリ
ス（P. gingivalis）が産生し、歯周病に関与する蛋白
質分解酵素であるリジル−ジンジパインの活性を特異的
かつ高感度で測定することができる。
Claims (4)
- 【請求項１】一般式 【化１】 （式中、Ｒはカルボベンゾキシ基又はＮα−カルボベン
ゾキシ−ヒスチジル基を示す。）で表されるペプチド置
換クマリン誘導体又はその塩。 - 【請求項２】Ｒが、Ｎα−カルボベンゾキシ−ヒスチジ
ル基である請求項１に記載の化合物又はその塩。 - 【請求項３】一般式 【化２】 （式中、Ｒはカルボベンゾキシ基又はＮα−カルボベン
ゾキシ−ヒスチジル基を示す。）で表されるペプチド置
換クマリン誘導体又はその塩を含有するリジル−ジンジ
パイン（Lys-gingipain）の活性を測定する試薬。 - 【請求項４】Ｒが、Ｎα−カルボベンゾキシ−ヒスチジ
ル基である請求項３に記載の試薬。
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1998
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