JP3593590B2

JP3593590B2 - ペプチド置換クマリン誘導体

Info

Publication number: JP3593590B2
Application number: JP03736298A
Authority: JP
Inventors: 健二山本; 真治岡崎; 哲次浅尾
Original assignee: Taiho Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Taiho Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1998-02-19
Filing date: 1998-02-19
Publication date: 2004-11-24
Anticipated expiration: 2018-02-19
Also published as: JPH11228597A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、蛋白質分解酵素活性測定用の蛍光性基質等として有用な、新規なペプチド置換クマリン誘導体に関する。
【０００２】
【従来の技術】
多くの歯周病は歯周局所の常在微生物によって惹起される一種の感染症と考えられている。その中でも特に、グラム陰性嫌気性桿菌のポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）が成人性歯周炎や急速進行性歯周炎において最も重要な病因菌であることが明らかにされている（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｏｌ．，１５，８５−９３，１９８８；Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｏｌ．，１５，３１６−３２３，１９８８；Ｊ．Ｄｅｎｔ．Ｒｅｓ．，６３，４４１−４５１，１９８４）。近年、そのＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓが産生するプロテアーゼ群がその機能、即ちコラーゲンをはじめとする歯周組織成分や生体防御系に関与する血清蛋白質を分解することが知られ、病原性と深く関係していることが明らかにされている（ＧｒｅｉｎｅｒＤ．，ＭａｙｒａｎｄＤ．：ＢｉｏｌｏｇｙｏｆｔｈｅＳｐｅｃｉｅｓＰｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ，ＥｄｉｔｅｄｂｙＳｈａｈＨ．Ｎ．，ＭａｙｒａｎｄＤ．ａｎｄＧｅｎｃｏＲ．Ｊ．，ｐｐ２２７−２４３，ＣＲＣＰｒｅｓｓ，ＢｏｃａＲａｔｏｎ，ＡｎｎＡｒｂｏｒ，Ｌｏｎｄｏｎ，Ｔｏｋｙｏ，１９９３）。このＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓが産生する蛋白質分解酵素であるリジル−ジンジパイン（Ｌｙｓ−ｇｉｎｇｉｐａｉｎ）（ＫＧＰ）も高分子キニノーゲンやフィブリノーゲンに高い分解能を示すことが知られ、歯周炎の発現や歯周組織の破壊に関与するものと考えられている（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９，４０６−４１１，１９９４）。
【０００３】
従来より種々の酵素阻害活性測定用の蛍光性の基質が知られており、特開昭５５−２４１４７号公報には、７−（Ｎ^α−置換又は未置換リジル）−アミノ−４−メチルクマリンがトリプシン等の合成基質として記載されている。しかし、該公報には、本発明化合物は具体的には開示されていない。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、歯周病がＰｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓｇｉｎｇｉｖａｌｉｓによって引き起こされること、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓの歯周病に関与する成分には蛋白質分解酵素であるリジル−ジンジパイン（Ｌｙｓ−ｇｉｎｇｉｐａｉｎ）が寄与していることに着目してなされたもので、本発明の目的は、この蛋白質分解酵素の活性を特異的かつ高感度に測定できる蛍光性の合成基質等として有用な新規化合物を提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、鋭意研究を重ねた結果、下記一般式（１）で表されるペプチド置換クマリン誘導体が簡便で高感度に特定酵素の活性を測定できる蛍光性の合成基質であることを見出し、これに基づき本発明を完成させた。
【０００６】
即ち、本発明は、一般式
【０００７】
【化３】

【０００８】
（式中、Ｒはカルボベンゾキシ基又はＮ^α−カルボベンゾキシ−ヒスチジル基を示す。）で表されるペプチド置換クマリン誘導体又はその塩に係る。
【０００９】
また、本発明は、上記一般式（１）のペプチド置換クマリン誘導体又はその塩を含有するリジル−ジンジパイン（Ｌｙｓ−ｇｉｎｇｉｐａｉｎ）の活性を測定する試薬にも係る。
【００１０】
一般式（１）においてＲがカルボベンゾキシ基である化合物は、特開昭５５−２４１４７号公報の特許請求の範囲に形式的には包含されるが、実施例等には具体的に記載されておらず、しかも口腔内に常在するＰｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓｇｉｎｇｉｖａｌｉｓが産生し、歯周病に関与する蛋白質分解酵素であるリジル−ジンジパイン（Ｌｙｓ−ｇｉｎｇｉｐａｉｎ）の活性を特異的かつ高感度に測定できることについては全く知られていない。
【００１１】
【発明の実施の形態】
本発明の一般式（１）で表される化合物の塩は、特に限定されず、薬学的に許容される酸又は塩基性化合物を作用させた酸付加塩及び／又は塩基塩が挙げられる。この酸付加塩としては、例えば塩酸、硫酸、リン酸、臭化水素酸等の無機酸との塩、シュウ酸、マレイン酸、フマール酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、ｐ−トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸等の有機酸との塩が例示できる。塩基塩としては、例えばナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム等のアルカリ金属及びアルカリ土類金属との塩、アンモニア、メチルアミン、ジメチルアミン、ピペリジン、シクロヘキシルアミン、トリエチルアミン等のアミン類との塩が例示できる。
【００１２】
本発明化合物又はその塩は水和物に代表される溶媒和物の形であってもよい。
【００１３】
本発明化合物を構成するアミノ酸はＬ−体、Ｄ−体のいずれであっても良いが、リジン残基はＬ−体が好ましい。
【００１４】
本発明の好ましい化合物は、一般式（１）においてＲがＮ^α−カルボベンゾキシ−ヒスチジル基である化合物である。
【００１５】
また、リジル−ジンジパイン（Ｌｙｓ−ｇｉｎｇｉｐａｉｎ）の活性測定用試薬としては一般式（１）においてＲがＮ^α−カルボベンゾキシ−ヒスチジル基である化合物を含有する試薬が好ましい。
【００１６】
本発明のペプチド置換クマリン誘導体（１）は、例えば次の反応工程式の方法で製造することができる。
【００１７】
【化４】

【００１８】
（式中、Ｐ_１はアミノ基の保護基を、Ｐ_２はカルボキシル基の保護基を示し、Ｐ_３はカルボベンゾキシ基あるいは一般式
【００１９】
【化５】

【００２０】
（式中、Ｐ_４は水素又はイミダゾール基の保護基を示す。）を示す。）。
【００２１】
Ｐ_１、Ｐ_２、Ｐ_４で示される保護基としては、カルボベンゾキシ基が安定であるような反応条件で除去されるものであれば特に制限はなく、例えば、Ｐ_１で示されるアミノ基の保護基としては、ｔ−ブトキシカルボニル基、ｐ−メトキシカルボベンゾキシ基、トリチル基等が挙げられる。Ｐ_２で示されるカルボキシル基の保護基としては、ペプチド合成の分野で通常用いられる保護基、例えばエステル誘導体等が挙げられ、好ましくは、ｔ−ブチルエステル、ベンズヒドリルエステル等が挙げられる。Ｐ_４で示されるイミダゾール基の保護基としては、ｔ−ブトキシカルボニル基、ｐ−メトキシカルボベンゾキシ基、トリチル基等が挙げられる。
【００２２】
一般式（２）で表される保護合成基質を適当な方法により、Ｐ_１、Ｐ_２、Ｐ_４を選択的に除去すると一般式（１）で表される本発明化合物が得られる。反応の条件はベンジルオキシカルボニル基が安定であるような反応条件であれば特に制限はなく、例えば、不活性溶媒中あるいは無溶媒で、希酸で処理することによって実施することができる。溶媒としては反応に関与しないものであれば特に制限はなく、例えばクロロホルム、ジクロロメタン、ジオキサン、テトラヒドロフラン等が例示できる。酸としては、例えば塩酸、硫酸等の鉱酸、トリフルオロ酢酸、パラトルエンスルホン酸等の有機酸が例示できる。又反応を促進するために、アニソール、チオアニソール等を添加してもよい。
【００２３】
上記反応工程式で原料として用いられる一般式（２）で表わされる保護合成基質はペプチド合成の分野で通常用いられる方法等、例えば「（社）日本生化学会編、生化学実験講座１、タンパク質の化学ＩＶ、２０７−４００ページ、１９７７年、（株）東京化学同人発行」に記載の方法により製造される。例えば７−アミノ−４−メチルクマリンとＮ^α−ベンジルオキシカルボニルリジン誘導体をイソブチルクロロホルメート等の縮合剤の存在下で縮合させると、７−（Ｎ^α−カルボベンゾキシ−Ｎ^ε−保護（Ｐ_１）リジル）アミノ−４−メチルクマリンが得られる。得られた化合物のＮ^α−保護基を例えば接触還元等で選択的に脱保護し、再び所望のＮ^α−カルボベンゾキシアミノ酸誘導体と縮合、あるいは縮合反応で得られた化合物のＮ^α−保護基を更に選択的に脱保護し、再び所望のＮ^α−カルボベンゾキシアミノ酸誘導体と縮合することにより所望の一般式（２）で表せられる保護合成基質が製造される。
【００２４】
上記方法により得られる本発明化合物（１）及び各化合物は、再結晶、蒸留、各種カラムクロマトグラフィー等の通常の分離手段により単離及び精製して用いることができる。
【００２５】
このようにして得られた本発明のペプチド置換クマリン誘導体（１）又はその塩は口腔内中に存在するポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）が産生する蛋白質分解酵素Ｌｙｓ−ｇｉｎｇｉｐａｉｎにより加水分解されるのでこの酵素の活性を特異的かつ高感度に測定するための蛍光性の合成基質として有用である。
【００２６】
【実施例】
以下に参考例、実施例及び試験例を挙げて本発明を一層詳細に説明する。
【００２７】
参考例１
７−（Ｎ^α−カルボベンゾキシ−Ｎ^ε−ｔ−ブトキシカルボニル−Ｌ−リジル）アミノ−４−メチルクマリンの合成
Ｎ^α−カルボベンゾキシ−Ｎ^ε−ｔ−ブトキシカルボニル−Ｌ−リジン３．２６ｇ（８．６ｍｍｏｌ）とトリエチルアミン１．２ｍｌ（８．６ｍｍｏｌ）のＤＭＦ２０ｍｌ溶液に、−２０℃〜−３０℃でイソブチルクロロホルメート１．１２ｍｌ（８．６ｍｍｏｌ）を加え、１０分間撹拌した後、７−アミノ−４−メチルクマリン１．０ｇ（５．７ｍｍｏｌ）のＤＭＦ１０ｍｌ溶液を加え、氷冷下１．５時間撹拌した。精製水２ｍｌを加え反応を停止させた後、反応液に飽和食塩水を加え酢酸エチル抽出した。酢酸エチル層を１Ｎ塩酸水、飽和食塩水、５％炭酸水素ナトリウム水、飽和食塩水で順次洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒；クロロホルム：アセトン＝１０：１（ｖ／ｖ）で溶出後、クロロホルム：エタノール＝２０：１（ｖ／ｖ）で溶出）により精製した。エーテル−ｎ−ヘキサンより結晶化し、標記化合物を１．０６ｇ（収率３４．４％）得た。物性を下記に示す。
【００２８】
融点：１２７−１２９℃。
【００２９】
^１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３）δ：９．０８（１Ｈ，ｓ），７．６６（１Ｈ，ｓ），７．４８−７．３５（７Ｈ，ｍ），６．１７（１Ｈ，ｓ），５．７３（１Ｈ，ｂｒｓ），５．１３（２Ｈ，ｓ），４．６９（１Ｈ，ｂｒｔ），４．３３（１Ｈ，ｂｒｓ），３．１６−３．０７（２Ｈ，ｍ），２．４０（３Ｈ，ｓ），２．０３−１．９４（１Ｈ，ｍ），１．８０−１．６８（１Ｈ，ｍ），１．５５−１．４２（１３Ｈ，ｍ）。
【００３０】
ＩＲ（ＫＢｒ）ｃｍ^−１：３３２７，２９７７，２９３６，１６９５，１６１９，１５８４，１５２６，１４５５，１４１５，１３９３，１３６８，１３３０，１３０８，１２７０，１２５２，１２２４，１１７３，１０６９。
【００３１】
参考例２
７−（Ｎ^α−カルボベンゾキシ−γ−ｔ−ブチル−Ｌ−グルタミル−Ｎ^ε−ｔ−ブトキシカルボニル−Ｌ−リジル）アミノ−４−メチルクマリンの合成
参考例１で得た縮合体９００ｍｇ（１．６７ｍｍｏｌ）、１０％パラジウムカーボン２００ｍｇ、酢酸３滴、メタノール５０ｍｌの混合物を３．５ｋｇ／ｃｍ^２、３時間接触水素還元した。反応後、不溶物を濾去し、溶媒を留去した。得られた残渣とＮ−メチルモルホリン１８７μｌ（１．７ｍｍｏｌ）のＤＭＦ２ｍｌ溶液をＮ^α−カルボベンゾキシ−γ−ｔ−ブチル−Ｌ−グルタミン酸５４０ｍｇ（１．６ｍｍｏｌ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物２３０ｍｇ（１．７ｍｍｏｌ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩３２６ｍｇ（１．７ｍｍｏｌ）のＤＭＦ８ｍｌ溶液に氷冷下、滴下し、室温で１２時間撹拌した。反応後、反応液に飽和食塩水を加え酢酸エチル抽出した。酢酸エチル層を５％クエン酸水、飽和食塩水、５％炭酸水素ナトリウム水、飽和食塩水で順次洗浄、硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒；クロロホルム：エタノール＝４８：１（ｖ／ｖ）で溶出）により精製した。標記化合物のアモルファスを９１４ｍｇ（収率７５．５％）得た。物性を下記に示す。
【００３２】
融点：７９−８３℃。
【００３３】
^１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３）δ：９．１６（１Ｈ，ｓ），７．７３（１Ｈ，ｓ），７．５４−７．５２（１Ｈ，ｍ），７．４６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ），７．３１−７．３０（５Ｈ，ｍ），６．９８（１Ｈ，ｂｒｓ），６．２３（１Ｈ，ｂｒｓ），６．１６（１Ｈ，ｓ），５．１３（２Ｈ，ｓ），４．７２（１Ｈ，ｂｒｓ），４．５７−４．５２（１Ｈ，ｍ），４．２５−４．２１（１Ｈ，ｍ），３．１０（２Ｈ，ｂｒｓ），２．５０−２．４２（２Ｈ，ｍ），２．３９（３Ｈ，ｓ），２．１９−２．１１（１Ｈ，ｍ），２．０３−１．９９（２Ｈ，ｍ），１．７０−１．６７（１Ｈ，ｍ），１．５０−１．３８（２２Ｈ，ｍ）。
【００３４】
ＩＲ（ＫＢｒ）ｃｍ^−１：３３２２，２９７８，１７０３，１６２０，１５８４，１５２７，１４５５，１４１６，１３９３，１３６８，１３２８，１３０６，１２５３，１２２６，１１５９。
【００３５】
参考例３
７−（Ｎ^α−カルボベンゾキシ−Ｎ^ｉｍ−トリチル−Ｌ−ヒスチジル−γ−ｔ−ブチル−Ｌ−グルタミル−Ｎ^ε−ｔ−ブトキシカルボニル−Ｌ−リジル）アミノ−４−メチルクマリンの合成
参考例２で得た縮合体４５０ｍｇ（０．６２３ｍｍｏｌ）、１０％パラジウムカーボン１６０ｍｇ、酢酸３滴、メタノール４０ｍｌの混合物を３．５ｋｇ／ｃｍ^２、３．５時間接触水素還元した。反応後、不溶物を濾去し、溶媒を留去した。得られた残渣のＤＭＦ２ｍｌ溶液をＮ^α−カルボベンゾキシ−Ｎ^ｉｍ−トリチル−Ｌ−ヒスチジン３９７ｍｇ（０．７５ｍｍｏｌ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物１０１ｍｇ（０．７５ｍｍｏｌ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩１４３ｍｇ（０．７５ｍｍｏｌ）のＤＭＦ４ｍｌ溶液に氷冷下、滴下し、室温で１２時間撹拌した。反応後、反応液に飽和食塩水を加え酢酸エチル抽出した。酢酸エチル層を５％クエン酸水、飽和食塩水、５％炭酸水素ナトリウム水、飽和食塩水で順次洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒；クロロホルム：エタノール＝５５：１（ｖ／ｖ）で溶出）により精製した。標記化合物のアモルファスを４６０ｍｇ（収率６７．１％）を得た。物性を下記に示す。
【００３６】
融点：１０５−１０８℃。
【００３７】
^１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３）δ：９．０４（１Ｈ，ｂｒｄ），８．８４（１Ｈ，ｓ），８．４１（１Ｈ，ｓ），７．８６（１Ｈ，ｓ），７．６２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ），７．３５−７．１９（１６Ｈ，ｍ），６．９１−６．８９（６Ｈ，ｍ），６．５８（１Ｈ，ｓ），６．１５（１Ｈ，ｓ），６．００（１Ｈ，ｂｒｓ），５．１１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１２．４Ｈｚ），５．０４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１２．４Ｈｚ），４．７１−４．５９（２Ｈ，ｍ），４．４０（１Ｈ，ｍ），４．２９−４．２６（１Ｈ，ｍ），３．１２−３．０４（４Ｈ，ｍ），２．５３−２．４６（２Ｈ，ｍ），２．２８（３Ｈ，ｓ），２．２８−２．１２（３Ｈ，ｍ），１．６４−１．３７（２３Ｈ，ｍ）。
【００３８】
ＩＲ（ＫＢｒ）ｃｍ^−１：３３２７，１７１１，１６１９，１５７９，１５２２，１４４８，１４１３，１３９２，１３６８，１３２８，１２５１，１１５６，７５１，７０２。
【００３９】
実施例１
７−（Ｎ^α−カルボベンゾキシ−Ｌ−グルタミル−Ｌ−リジル）アミノ−４−メチルクマリン塩酸塩の合成
参考例２で得た縮合体３１４ｍｇ（０．４３ｍｍｏｌ）、アニソール０．３ｍｌ、トリフルオロ酢酸５ｍｌの混合物を氷冷下１５分、室温１．５時間撹拌した。反応後、反応混合物を減圧下濃縮した。残渣にジエチルエーテルを加え、析出した結晶を瀘取した。得られた結晶を０．５Ｎ塩酸に溶解し、ＭＣＩゲル（三菱化学社製、ＣＨＰ−２０（７５〜１５０μ））を担体としたカラムクロマトグラフィー（展開溶媒；４０％アセトニトリルで溶出）により精製した。得られた画分を減圧下濃縮し、更に０．５Ｎ塩酸を加え凍結乾燥し、標記化合物２２０ｍｇ（収率８４．０％）を得た。物性を下記に示す。
【００４０】
融点：１５２−１５６℃（分解）。
【００４１】
比旋光度：［α］^２５ _Ｄ＝−４４．３６°（ｃ＝０．５２３，ＭｅＯＨ）。
【００４２】
^１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ_３ＯＤ）δ：７．８５（１Ｈ，ｓ），７．６５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８Ｈｚ），７．５６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８Ｈｚ），７．３５−７．２４（５Ｈ，ｍ），６．２１（１Ｈ，ｓ），５．１３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１２．４Ｈｚ），５．０８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１２．４Ｈｚ），４．５５−４．５１（１Ｈ，ｍ），４．１６−４．１２（１Ｈ，ｍ），２．９５−２．９１（２Ｈ，ｍ），２．４３（３Ｈ，ｓ），２．３５−２．２９（２Ｈ，ｍ），２．１１−１．９８（３Ｈ，ｍ），１．８６−１．７９（１Ｈ，ｍ），１．７６−１．６２（２Ｈ，ｍ），１．５９−１．４５（２Ｈ，ｍ）。
【００４３】
ＩＲ（ＫＢｒ）ｃｍ^−１：３４２７，３３０６，３０６９，２９４８，１７０１，１６６５，１６１９，１５８１，１５２９，１４５４，１３９４，１３７１，１３２９，１３０９，１２６６，１２３３。
【００４４】
実施例２
７−（Ｎ^α−カルボベンゾキシ−Ｌ−ヒスチジル−Ｌ−グルタミル−Ｌ−リジル）アミノ−４−メチルクマリン塩酸塩の合成
参考例３で得た縮合体３１０ｍｇ（０．２８ｍｍｏｌ）、アニソール０．３２ｍｌ、トリフルオロ酢酸６ｍｌの混合物を氷冷下１５分、室温２時間撹拌した。反応後、反応混合物を減圧下濃縮した。残渣にジエチルエーテルを加え、析出した結晶を瀘取した。得られた結晶を０．５Ｎ塩酸に溶解し、ＭＣＩゲル（三菱化学社製、ＣＨＰ−２０（７５〜１５０μ））を担体としたカラムクロマトグラフィー（展開溶媒；２５％アセトニトリルで溶出）により精製した。得られた画分を減圧下濃縮し、更に０．５Ｎ塩酸を加え凍結乾燥し、標記化合物１７７ｍｇ（収率８１．０％）を得た。物性を下記に示す。
【００４５】
融点：１６６−１６９℃（分解）。
【００４６】
比旋光度：［α］^２５ _Ｄ＝−４９．６０°（ｃ＝１．００４，ＭｅＯＨ）。
【００４７】
^１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ_３ＯＤ）δ：７．９３（１Ｈ，ｓ），７．６５−７．５８（３Ｈ，ｍ），７．３０−７．２５（５Ｈ，ｍ），６．９１（１Ｈ，ｓ），６．２１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．２Ｈｚ），５．０８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１２．４Ｈｚ），５．０４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１２．４Ｈｚ），４．５２−４．４８（１Ｈ，ｍ），４．３５−４．２６（２Ｈ，ｍ），３．１５−３．０１（１Ｈ，ｍ），２．９４−２．９０（２Ｈ，ｍ），２．４３（３Ｈ，ｓ），２．３８−２．２６（２Ｈ，ｍ），２．１４−２．０２（３Ｈ，ｍ），１．８９−１．８１（１Ｈ，ｍ），１．７４−１．４６（４Ｈ，ｍ）。
【００４８】
ＩＲ（ＫＢｒ）ｃｍ^−１：３４０１，３２８５，３０８９，２９５８，１７００，１６５９，１６１９，１５７７，１５５８，１５３０，１４５４，１４４０，１３９４，１３７１，１３２８，１３０９，１２６８，１２３３。
【００４９】
試験例
次に本発明化合物が蛋白質分解酵素リジル−ジンジパインの特異的かつ高感度の蛍光性の合成基質となることを示す。
【００５０】
試験例１リジル−ジンジパインに対する本発明化合物の活性の測定
リジル−ジンジパインは岡本、山本らの方法［Ｋ．Ｏｋａｍｏｔｏ，Ｋ．Ｙａｍａｍｏｔｏ，ｅｔａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１２０，３９８−４０６（１９９６）］によりＰｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ３８１の培養瀘液の上清より調製されたものを使用した。所定の酵素溶液をｐＨ７．５に調整された５ｍＭシステインを含んだ２０ｍＭリン酸ナトリウムバッファーの各所定の濃度の合成基質溶液に添加し、４０℃で反応させた。反応は経時的に１０ｍＭのヨード酢酸を含んだ酢酸ナトリウム緩衝液でｐＨ５に調整し、反応を停止させ、遊離した７−アミノ−４−メチルクマリンを蛍光分光光度計を用い、波長３８０ｎｍで励起した４６０ｎｍの蛍光波長の蛍光強度を測定した。得られた蛍光強度から予め作成した検量線を用いて反応速度ｖを算出した。各基質濃度［Ｓ］_０とｖから［Ｓ］_０／２０〜［Ｓ］_０プロットを行い、Ｋ_ｍ値を算出した。
【００５１】
Ｋ_ｍは最大速度Ｖの半分の速度が得られる基質濃度であり、それによりＶを算出した。
【００５２】
Ｋ_ｃａｔはターンオーバー数であり、酵素の活性部位１個について単位時間に転化される基質分子の最大数を示しており、Ｋ_ｃａｔはＶ／［Ｅ］_０で表される。ここで［Ｅ］_０は酵素濃度を示す。また、Ｋ_ｃａｔ／Ｋ_ｍは遊離の酵素と遊離の基質との反応に関連した速度定数であり、その値の極限は酵素−基質複合体の生成初期速度定数と考えられ、特異性定数とも呼ばれている。算出した各化合物の反応速度定数を表１に示す。
【００５３】
【表１】

【００５４】
表１における記号は、次のものを示す。Ｂｏｃ：ｔ−ブトキシカルボニル基、Ｖａｌ：バリン、Ｌｅｕ：ロイシン、Ｌｙｓ：リジン、Ｇｌｕ：グルタミン酸、Ｈｉｓ：ヒスチジン、ＭＣＡ：７−アミノ−４−メチルクマリン、Ｚ：カルボベンゾキシ基。
【００５５】
上記表１より、本発明合成基質である化合物１及び化合物２は、公知化合物であるＢｏｃ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−ＭＣＡに比べ、リジル−ジンジパインに対し１０〜１００倍大きい反応速度定数を有しており、従ってリジル−ジンジパインの活性を特異的かつ高感度で測定できることが明らかである。
【００５６】
また、門脇、山本等の方法（ＴｈｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，２６９，２１３７１−２１３７８（１９９４））に従って測定した本発明化合物である合成基質のポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）の産生する他の主要なトリプシン様システインプロテアーゼ（アルグージンジパイン（Ａｒｇ−ｇｉｎｇｉｐａｉｎ））による分解活性は認められなかった。
【００５７】
また、Ａ．Ｊ．Ｂａｒｒｅｔｔらの方法（ＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＪｏｕｒｎａｌ、２０１、１８９−１９８（１９８２））に従って測定した本発明化合物である合成基質のカテプシンＢ及びＬに対する酵素分解活性は弱いものであり、本発明化合物である合成基質はリジル−ジンジパインに対する酵素分解活性を特異的に測定できることが示唆された。
【００５８】
【発明の効果】
本発明化合物である合成基質によれば、口腔内中に存在しているポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）が産生し、歯周病に関与する蛋白質分解酵素であるリジル−ジンジパインの活性を特異的かつ高感度で測定することができる。

Claims

一般式

（式中、Ｒはカルボベンゾキシ基又はＮ^α−カルボベンゾキシ−ヒスチジル基を示す。）で表されるペプチド置換クマリン誘導体又はその塩。
Ｒが、Ｎ^α−カルボベンゾキシ−ヒスチジル基である請求項１に記載の化合物又はその塩。
一般式

（式中、Ｒはカルボベンゾキシ基又はＮ^α−カルボベンゾキシ−ヒスチジル基を示す。）で表されるペプチド置換クマリン誘導体又はその塩を含有するリジル−ジンジパイン（Ｌｙｓ−ｇｉｎｇｉｐａｉｎ）の活性を測定する試薬。
Ｒが、Ｎ^α−カルボベンゾキシ−ヒスチジル基である請求項３に記載の試薬。