JP7218878B2 - 判別方法、蛍光測定装置および検査薬 - Google Patents
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Description
はじめに、本発明の一実施形態に係る判別方法および検査薬について、図を参照しながら説明する。
図1に示すように、本実施形態に係る判別方法は、酵素反応工程S10と、蛍光測定工程S20と、遺伝子型判別工程S30と、を含む。
図2A~図2Dには、Pg菌の細胞懸濁液を遠心分離して沈殿物を採取し、この菌体を含む沈殿物を加えた液体試料を各pH条件に調整し、37.5℃で酵素反応させた後に、蛍光測定装置を使用して蛍光強度を測定した結果を示している。図2Eには、ジンジパインと性質が類似しているトリプシンを加えた液体試料の温度を23~45℃の範囲で変えたときの蛍光強度を測定した結果を示している。
図3Aには、fimA遺伝子の遺伝子型がII型であるPg菌の細胞懸濁液を遠心分離して沈殿物を採取し、この菌体を含む沈殿物を加えた液体試料を各pH条件に調整し、37.5℃で酵素反応させた後に、蛍光測定装置を使用して蛍光強度を測定した結果を示している。
図3Bには、菌株の種類が異なる各Pg菌の細胞懸濁液を遠心分離して沈殿物を採取し、この菌体を含む沈殿物を加えた液体試料を所定のpH条件に調整し、37.5℃で酵素反応させた後に、蛍光測定装置を使用して蛍光強度を測定した結果を示している。
図4A~図4Dには、Pg菌の細胞懸濁液を遠心分離して上清を採取し、この菌体抽出物である上清を加えた液体試料を各pH条件に調整し、37.5℃で酵素反応させた後に、蛍光測定装置を使用して蛍光強度を測定した結果を示している。
図5には、fimA遺伝子の遺伝子型がI型であるPg菌の細胞懸濁液を遠心分離して上清を採取し、この菌体抽出物である上清を加えた液体試料を各pH条件に調整し、37.5℃で酵素反応させた後に、蛍光測定装置を使用して蛍光強度を測定した結果を示している。
図6A~図6Eには、各遺伝子型のPg菌の細胞懸濁液を遠心分離して沈殿物を採取し、この菌体を含む沈殿物を加えた液体試料を各pH条件に調整し、各温度条件で酵素反応させた後に、蛍光測定装置を使用して蛍光強度を測定した結果を示している。
図7A~図7Eには、各遺伝子型のPg菌の細胞懸濁液を遠心分離して上清を採取し、この菌体抽出物である上清を加えた液体試料を各pH条件に調整し、各温度条件で酵素反応させた後に、蛍光測定装置を使用して蛍光強度を測定した結果を示している。
図8の横軸は、酵素反応の開始時から起算される時間、縦軸は、蛍光強度を示す。図中の一点鎖線は、遺伝子型が未知である歯周病の原因菌の菌体(供試物)を含む液体試料の蛍光強度の具体例を示している。
図9の横軸は、酵素反応の開始時から起算される時間、縦軸は、蛍光強度を示す。図中の一点鎖線は、遺伝子型が未知である歯周病の原因菌から抽出された菌体抽出物(供試物)を含む液体試料の蛍光強度の具体例を示している。
次に、本発明の一実施形態に係る蛍光測定装置について、図を参照しながら説明する。
図10に示すように、本実施形態に係る蛍光測定装置100は、光源(照射手段)1と、試料ホルダ2と、光学レンズ3a,3bと、フィルタ4と、検出素子(検出手段)5と、増幅器6と、アナログ処理器7と、A/D変換器8と、制御装置(判別手段)9と、試料容器10と、入力手段11と、表示手段12と、pH測定手段13と、温度測定手段14と、温調装置15と、を備えている。
図11に示すように、蛍光測定装置100が備える制御装置9は、測定結果データ取得部90と、測定結果データ処理部91と、測定結果データ比較部92と、測定条件データ取得部93と、制御部94と、記憶部95と、表示制御部96と、温度制御部97と、を備えている。
図12に示すように、蛍光測定装置100では、遺伝子型が未知である歯周病の原因菌、または、その菌体抽出物(供試物)を含む液体試料Saを測定対象として蛍光測定を行い、その測定データに基づいて解析された遺伝子型の判別の結果を、ユーザに対して表示させることができる。
図13に示すように、遺伝子型が未知である歯周病の原因菌や菌体抽出物の遺伝子型を判別する処理(ステップS340)は、蛍光強度値または蛍光強度の時間的変化量のデータである蛍光強度データを、測定結果データ比較部92において、記憶部95に記憶されている閾値と比較することによって行う。
2 試料ホルダ
3a 光学レンズ
3b 光学レンズ
4 フィルタ
5 検出素子(検出手段)
6 増幅器
7 アナログ処理器
8 A/D変換器
9 制御装置(判別手段)
10 試料容器
11 入力手段
12 表示手段
13 pH測定手段
14 温度測定手段
15 温調装置
90 測定結果データ取得部
91 測定結果データ処理部
92 測定結果データ比較部
93 測定条件データ取得部
94 制御部
95 記憶部
96 表示制御部
97 温度制御部
100 蛍光測定装置
Claims (30)
- 歯周病の原因菌の遺伝子型を判別する判別方法であって、
前記原因菌は、ポルフィロモナス・ジンジバリスであり、
前記遺伝子型は、線毛タンパクをコードするfimA遺伝子の多型であり、
歯周病の原因菌の菌体または菌体抽出物と、前記原因菌による酵素反応の基質が蛍光標識された試薬として、N末端が保護基によって保護されたポリペプチドである保護基-グリシル-グリシル-L-アルギニル-4-メチルクマリル-7-アミドと、を含み、pH7.0以上pH8.5以下に調整して酵素反応させた液体試料に励起光を照射し、
前記液体試料から放出された蛍光の強度に基づいて前記遺伝子型を判別する判別方法。 - 請求項1に記載の判別方法であって、
前記液体試料は、
遺伝子型が未知である前記原因菌の菌体または菌体抽出物を含む試験区の液体試料と、
遺伝子型が既知である前記原因菌の菌体または菌体抽出物を含み、前記試験区の液体試料と同じpHに調整されている対照区の液体試料と、であり、
前記遺伝子型の判別において、前記試験区について測定された蛍光強度値または蛍光強度の時間的変化量と、前記対照区について測定された蛍光強度値または蛍光強度の時間的変化量とが、互いに同一であるか、または、近似しているとき、前記試験区中の当該液体試料の前記原因菌のfimA遺伝子が、遺伝子型が既知である前記原因菌のfimA遺伝子と同じ遺伝子型であると判定する判別方法。 - 請求項1に記載の判別方法であって、
前記液体試料は、
遺伝子型が未知である前記原因菌の菌体を含む判別対象の液体試料と、
遺伝子型が既知である前記原因菌の菌体または遺伝子型が未知である前記原因菌の菌体を含み、前記判別対象の液体試料と同じpHに調整されている複数の液体試料と、であり、
前記遺伝子型の判別において、前記判別対象の液体試料について測定された蛍光強度値または蛍光強度の時間的変化量が、前記複数の液体試料について測定された蛍光強度値または蛍光強度の時間的変化量の測定値群のうち、上位一番目の測定値群に分類されるとき、当該液体試料の前記原因菌のfimA遺伝子がII型であると判定する判別方法。 - 請求項1に記載の判別方法であって、
前記液体試料は、
遺伝子型が未知である前記原因菌の菌体を含む判別対象の液体試料と、
遺伝子型が既知である前記原因菌の菌体または遺伝子型が未知である前記原因菌の菌体を含み、前記判別対象の液体試料と同じpHに調整されている複数の液体試料と、であり、
前記遺伝子型の判別において、前記判別対象の液体試料について測定された蛍光強度値または蛍光強度の時間的変化量が、前記複数の液体試料について測定された蛍光強度値または蛍光強度の時間的変化量の測定値群のうち、上位二番目の測定値群に分類されるとき、当該液体試料の前記原因菌のfimA遺伝子がIV型であると判定する判別方法。 - 請求項1に記載の判別方法であって、
前記液体試料は、
遺伝子型が未知である前記原因菌の菌体を含む判別対象の液体試料と、
遺伝子型が既知である前記原因菌の菌体または遺伝子型が未知である前記原因菌の菌体を含み、前記判別対象の液体試料と同じpHに調整されている複数の液体試料と、であり、
前記遺伝子型の判別において、前記判別対象の液体試料について測定された蛍光強度値または蛍光強度の時間的変化量が、前記複数の液体試料について測定された蛍光強度値または蛍光強度の時間的変化量の測定値群のうち、下位一番目の測定値群に分類されるとき、当該液体試料の前記原因菌のfimA遺伝子がI型であると判定する判別方法。 - 請求項1に記載の判別方法であって、
前記液体試料は、
遺伝子型が未知である前記原因菌の菌体抽出物を含む判別対象の液体試料と、
遺伝子型が既知である前記原因菌の菌体抽出物または遺伝子型が未知である前記原因菌の菌体抽出物を含み、前記判別対象の液体試料と同じpHに調整されている複数の液体試料と、であり、
前記遺伝子型の判別において、前記判別対象の液体試料について測定された蛍光強度値または蛍光強度の時間的変化量が、前記複数の液体試料について測定された蛍光強度値または蛍光強度の時間的変化量の測定値群のうち、上位一番目の測定値群に分類されるとき、当該液体試料の前記原因菌のfimA遺伝子がI型であると判定する判別方法。 - 請求項1に記載の判別方法であって、
前記液体試料は、
遺伝子型が未知である前記原因菌の菌体抽出物を含む判別対象の液体試料と、
遺伝子型が既知である前記原因菌の菌体抽出物または遺伝子型が未知である前記原因菌の菌体抽出物を含み、前記判別対象の液体試料と同じpHに調整されている複数の液体試料と、であり、
前記遺伝子型の判別において、前記判別対象の液体試料について測定された蛍光強度値または蛍光強度の時間的変化量が、前記複数の液体試料について測定された蛍光強度値または蛍光強度の時間的変化量の測定値群のうち、上位二番目の測定値群に分類されるとき、当該液体試料の前記原因菌のfimA遺伝子がIV型であると判定する判別方法。 - 請求項1に記載の判別方法であって、
前記液体試料は、
遺伝子型が未知である前記原因菌の菌体抽出物を含む判別対象の液体試料と、
遺伝子型が既知である前記原因菌の菌体抽出物または遺伝子型が未知である前記原因菌の菌体抽出物を含み、前記判別対象の液体試料と同じpHに調整されている複数の液体試料と、であり、
前記遺伝子型の判別において、前記判別対象の液体試料について測定された蛍光強度値または蛍光強度の時間的変化量が、前記複数の液体試料について測定された蛍光強度値または蛍光強度の時間的変化量の測定値群のうち、下位一番目の測定値群に分類されるとき、当該液体試料の前記原因菌のfimA遺伝子がII型であると判定する判別方法。 - 請求項1から請求項8のいずれか一項に記載の判別方法であって、
前記試薬は、イソブチルオキシカルボニル-グリシル-グリシル-L-アルギニル-4-メチルクマリル-7-アミド(iBoc-Gly-Gly-Arg-MCA)である判別方法。 - 請求項1から請求項8のいずれか一項に記載の判別方法であって、
前記励起光の波長は、355nm以上375nm以下である判別方法。 - 請求項1から請求項8のいずれか一項に記載の判別方法であって、
前記蛍光の波長は、430nm以上455nm以下である判別方法。 - 請求項1から請求項8のいずれか一項に記載の判別方法であって、
前記液体試料は、pH緩衝液であり、
前記pH緩衝液は、トリスヒドロキシメチルアミノメタン(Tris)を主成分とする判別方法。 - 請求項1から請求項8のいずれか一項に記載の判別方法であって、
前記液体試料の温度は、4℃以上45℃以下である判別方法。 - 歯周病の原因菌の遺伝子型を判別する蛍光測定装置であって、
前記原因菌は、ポルフィロモナス・ジンジバリスであり、
前記遺伝子型は、線毛タンパクをコードするfimA遺伝子の多型であり、
歯周病の原因菌の菌体または菌体抽出物と、前記原因菌による酵素反応の基質が蛍光標識された試薬として、N末端が保護基によって保護されたポリペプチドである保護基-グリシル-グリシル-L-アルギニル-4-メチルクマリル-7-アミドと、を含み、pH7.0以上pH8.5以下に調整して酵素反応させた液体試料に励起光を照射する照射手段と、
前記液体試料から放出される蛍光を検出する検出手段と、
検出された蛍光の強度に基づいて前記遺伝子型を判別する判別手段と、を備える蛍光測定装置。 - 請求項14に記載の蛍光測定装置であって、
前記液体試料は、
遺伝子型が未知である前記原因菌の菌体または菌体抽出物を含む試験区の液体試料と、
遺伝子型が既知である前記原因菌の菌体または菌体抽出物を含み、前記試験区の液体試料と同じpHに調整されている対照区の液体試料と、であり、
前記判別手段は、
前記対照区について測定された蛍光強度値または蛍光強度の時間的変化量を記憶した記憶部と、
前記試験区について測定された蛍光強度値または蛍光強度の時間的変化量と、前記対照区について測定された蛍光強度値または蛍光強度の時間的変化量とが、互いに同一であるか、または、近似しているとき、前記試験区中の当該液体試料の前記原因菌のfimA遺伝子が、遺伝子型が既知である前記原因菌のfimA遺伝子と同じ遺伝子型であると判定するデータ比較部と、を備える蛍光測定装置。 - 請求項14に記載の蛍光測定装置であって、
前記液体試料は、
遺伝子型が未知である前記原因菌の菌体を含む判別対象の液体試料と、
遺伝子型が既知である前記原因菌の菌体を含み、前記判別対象の液体試料と同じpHに調整されている複数の液体試料と、であり、
前記判別手段は、
第1閾値を記憶した記憶部と、
前記判別対象の液体試料について測定された蛍光強度値または蛍光強度の時間的変化量と、予め設定された第1閾値とを比較し、前記判別対象の液体試料について測定された蛍光強度値または蛍光強度の時間的変化量が、前記第1閾値以下であるとき、当該液体試料の前記原因菌のfimA遺伝子がI型であると判定するデータ比較部と、を備え、
前記第1閾値は、fimA遺伝子の遺伝子型がI型である前記原因菌の菌体を含む前記液体試料について測定された蛍光強度値または蛍光強度の時間的変化量、および、fimA遺伝子の遺伝子型がIV型である前記原因菌の菌体を含む前記液体試料について測定された蛍光強度値または蛍光強度の時間的変化量のうち、少なくとも一方に基づいて設定された値である蛍光測定装置。 - 請求項14に記載の蛍光測定装置であって、
前記液体試料は、
遺伝子型が未知である前記原因菌の菌体を含む判別対象の液体試料と、
遺伝子型が既知である前記原因菌の菌体を含み、前記判別対象の液体試料と同じpHに調整されている複数の液体試料と、であり、
前記判別手段は、
第1閾値および第2閾値を記憶した記憶部と、
前記判別対象の液体試料について測定された蛍光強度値または蛍光強度の時間的変化量と、予め設定された第1閾値および第2閾値とを比較し、前記判別対象の液体試料について測定された蛍光強度値または蛍光強度の時間的変化量が、前記第1閾値を超え、前記第2閾値以下であるとき、当該液体試料の前記原因菌のfimA遺伝子がIV型であると判定するデータ比較部と、を備え、
前記第1閾値は、fimA遺伝子の遺伝子型がI型である前記原因菌の菌体を含む前記液体試料について測定された蛍光強度値または蛍光強度の時間的変化量、および、fimA遺伝子の遺伝子型がIV型である前記原因菌の菌体を含む前記液体試料について測定された蛍光強度値または蛍光強度の時間的変化量のうち、少なくとも一方に基づいて設定された値であり、
前記第2閾値は、fimA遺伝子の遺伝子型がIV型である前記原因菌の菌体を含む前記液体試料について測定された蛍光強度値または蛍光強度の時間的変化量、および、fimA遺伝子の遺伝子型がII型である前記原因菌の菌体を含む前記液体試料について測定された蛍光強度値または蛍光強度の時間的変化量のうち、少なくとも一方に基づいて設定された値である蛍光測定装置。 - 請求項14に記載の蛍光測定装置であって、
前記液体試料は、
遺伝子型が未知である前記原因菌の菌体を含む判別対象の液体試料と、
遺伝子型が既知である前記原因菌の菌体を含み、前記判別対象の液体試料と同じpHに調整されている複数の液体試料と、であり、
前記判別手段は、
第2閾値を記憶した記憶部と、
前記判別対象の液体試料について測定された蛍光強度値または蛍光強度の時間的変化量と、予め設定された第2閾値とを比較し、前記判別対象の液体試料について測定された蛍光強度値または蛍光強度の時間的変化量が、前記第2閾値を超えるとき、当該液体試料の前記原因菌のfimA遺伝子がII型であると判定するデータ比較部と、を備え、
前記第2閾値は、fimA遺伝子の遺伝子型がIV型である前記原因菌の菌体を含む前記液体試料について測定された蛍光強度値または蛍光強度の時間的変化量、および、fimA遺伝子の遺伝子型がII型である前記原因菌の菌体を含む前記液体試料について測定された蛍光強度値または蛍光強度の時間的変化量のうち、少なくとも一方に基づいて設定された値である蛍光測定装置。 - 請求項14に記載の蛍光測定装置であって、
前記液体試料は、
遺伝子型が未知である前記原因菌の菌体抽出物を含む判別対象の液体試料と、
遺伝子型が既知である前記原因菌の菌体菌体抽出物を含み、前記判別対象の液体試料と同じpHに調整されている複数の液体試料と、であり、
前記判別手段は、
第1閾値を記憶した記憶部と、
前記判別対象の液体試料について測定された蛍光強度値または蛍光強度の時間的変化量と、予め設定された第1閾値とを比較し、前記判別対象の液体試料について測定された蛍光強度値または蛍光強度の時間的変化量が、前記第1閾値以下であるとき、当該液体試料の前記原因菌のfimA遺伝子がII型であると判定するデータ比較部と、を備え、
前記第1閾値は、fimA遺伝子の遺伝子型がII型である前記原因菌の菌体抽出物を含む前記液体試料について測定された蛍光強度値または蛍光強度の時間的変化量、および、fimA遺伝子の遺伝子型がIV型である前記原因菌の菌体抽出物を含む前記液体試料について測定された蛍光強度値または蛍光強度の時間的変化量のうち、少なくとも一方に基づいて設定された値である蛍光測定装置。 - 請求項14に記載の蛍光測定装置であって、
前記液体試料は、
遺伝子型が未知である前記原因菌の菌体抽出物を含む判別対象の液体試料と、
遺伝子型が既知である前記原因菌の菌体抽出物を含み、前記判別対象の液体試料と同じpHに調整されている複数の液体試料と、であり、
前記判別手段は、
第1閾値および第2閾値を記憶した記憶部と、
前記判別対象の液体試料について測定された蛍光強度値または蛍光強度の時間的変化量と、予め設定された第1閾値および第2閾値とを比較し、前記判別対象の液体試料について測定された蛍光強度値または蛍光強度の時間的変化量が、前記第1閾値を超え、前記第2閾値以下であるとき、当該液体試料の前記原因菌のfimA遺伝子がIV型であると判定するデータ比較部と、を備え、
前記第1閾値は、fimA遺伝子の遺伝子型がII型である前記原因菌の菌体抽出物を含む前記液体試料について測定された蛍光強度値または蛍光強度の時間的変化量、および、fimA遺伝子の遺伝子型がIV型である前記原因菌の菌体抽出物を含む前記液体試料について測定された蛍光強度値または蛍光強度の時間的変化量のうち、少なくとも一方に基づいて設定された値であり、
前記第2閾値は、fimA遺伝子の遺伝子型がIV型である前記原因菌の菌体抽出物を含む前記液体試料について測定された蛍光強度値または蛍光強度の時間的変化量、および、fimA遺伝子の遺伝子型がI型である前記原因菌の菌体抽出物を含む前記液体試料について測定された蛍光強度値または蛍光強度の時間的変化量のうち、少なくとも一方に基づいて設定された値である蛍光測定装置。 - 請求項14に記載の蛍光測定装置であって、
前記液体試料は、
遺伝子型が未知である前記原因菌の菌体抽出物を含む判別対象の液体試料と、
遺伝子型が既知である前記原因菌の菌体抽出物を含み、前記判別対象の液体試料と同じpHに調整されている複数の液体試料と、であり、
前記判別手段は、
第2閾値を記憶した記憶部と、
前記判別対象の液体試料について測定された蛍光強度値または蛍光強度の時間的変化量と、予め設定された第2閾値とを比較し、前記判別対象の液体試料について測定された蛍光強度値または蛍光強度の時間的変化量が、前記第2閾値を超えるとき、当該液体試料の前記原因菌のfimA遺伝子がI型であると判定するデータ比較部と、を備え、
前記第2閾値は、fimA遺伝子の遺伝子型がIV型である前記原因菌の菌体抽出物を含む前記液体試料について測定された蛍光強度値または蛍光強度の時間的変化量、および、fimA遺伝子の遺伝子型がI型である前記原因菌の菌体抽出物を含む前記液体試料について測定された蛍光強度値または蛍光強度の時間的変化量のうち、少なくとも一方に基づいて設定された値である蛍光測定装置。 - 請求項14から請求項21のいずれか一項に記載の蛍光測定装置であって、
前記遺伝子型の判別の結果を表示する表示手段を備える蛍光測定装置。 - 請求項14から請求項21のいずれか一項に記載の蛍光測定装置であって、
前記液体試料のpHを測定するpH測定手段を備える蛍光測定装置。 - 請求項14から請求項21のいずれか一項に記載の蛍光測定装置であって、
前記液体試料の温度を調節する温度制御手段を備える蛍光測定装置。 - 請求項14から請求項21のいずれか一項に記載の蛍光測定装置であって、
前記試薬は、イソブチルオキシカルボニル-グリシル-グリシル-L-アルギニル-4-メチルクマリル-7-アミド(iBoc-Gly-Gly-Arg-MCA)である蛍光測定装置。 - 請求項14から請求項21のいずれか一項に記載の蛍光測定装置であって、
前記励起光の波長は、355nm以上375nm以下である蛍光測定装置。 - 請求項14から請求項21のいずれか一項に記載の蛍光測定装置であって、
前記蛍光の波長は、430nm以上455nm以下である蛍光測定装置。 - 請求項14から請求項21のいずれか一項に記載の蛍光測定装置であって、
前記液体試料は、pH緩衝液であり、
前記pH緩衝液は、トリスヒドロキシメチルアミノメタン(Tris)を主成分とする蛍光測定装置。 - 請求項14から請求項21のいずれか一項に記載の蛍光測定装置であって、
前記液体試料の温度は、4℃以上45℃以下である蛍光測定装置。 - 歯周病の原因菌の遺伝子型を判別する検査薬であって、
前記原因菌は、ポルフィロモナス・ジンジバリスであり、
前記遺伝子型は、線毛タンパクをコードするfimA遺伝子の多型であり、
前記原因菌による酵素反応の基質が蛍光標識された試薬と、前記試薬を溶解したpH緩衝液と、を含み、
前記試薬は、N末端が保護基によって保護されたポリペプチドである保護基-グリシル-グリシル-L-アルギニル-4-メチルクマリル-7-アミドであり、
前記pH緩衝液は、pH7.0以上pH8.5以下である検査薬。
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