CN111607643A - 一种基于实时荧光定量pcr的检测cyp2c19基因分型的方法及其试剂盒 - Google Patents

一种基于实时荧光定量pcr的检测cyp2c19基因分型的方法及其试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种非疾病治疗和诊断目的的基于实时荧光定量PCR的检测CYP2C19基因分型的方法，包括如下步骤：第一步，以待测样品的DNA为模板，进行荧光定量PCR扩增，获得PCR扩增产物；第二步，检测扩增产物的荧光信号；第三步，以检测结果判定样品中是否含有CYP2C19*2基因型；其中，用于PCR扩增的反应体系中含有用于扩增CYP2C19*2基因的特异性引物对和用于检测CYP2C19*2基因的荧光探针。本发明还公开了一种用于检测CYP2C19基因分型的引物对及荧光探针。本发明的方法，具有高度特异性，检测结果精确度高。

Description

一种基于实时荧光定量PCR的检测CYP2C19基因分型的方法及 其试剂盒
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体地说，是关于一种基于实时荧光定量PCR的检测CYP2C19基因分型的方法及其试剂盒。
背景技术
CYP2C19是CYP450酶第二亚家族中重要的成员。位于10号染色体上，由490个氨基酸组成的蛋白，生物体许多组织中都有表达，主要在肝组织中表达，目前在临床应用中，至少10％的药物作用于它。CYP2C19具有很多的SNP位点，目前，在已发现的CYP2C19的25个突变等位基因中至少10个突变造成酶活性的改变，其中慢代谢型以CYP2C19*2，CYP2C19*3为主，快代谢型以CYP2C19*17为主。
亚洲人和太平洋岛居民对于CYP2C19有更高概率的无功能突变，这些突变可能会影响相关药物的治疗，例如治疗冠状动脉粥样硬化性心脏病用的抗血小板药物氯吡咯雷，本身不具备活性，需要生物体吸收转化后发挥抗血小板作用，不同个体间CYP2C19等相关基因的多态性引起功能蛋白水平的差异，从而影响氯吡咯雷的活性代谢水平。因此，准确测定CYP2C19的基因型对于药物的用量和疾病的治疗有着重要的意义。
目前，对CYP2C19基因分型的检测方法有很多种，常规的方法包括：(1)直接测序法，通过抽取人外周静脉血，提取基因组DNA，扩增后进行DNA直接测序，从而判断基因型；该方法能够直接显示已知突变位点的位置和类型。但是，该方法的检测周期长，通量低，成本高。(2)RFLP法(限制性片段长度多态性，restriction fragmentlength polymorphism)，该技术原理是检测DNA在限制性内切酶酶切后形成的特定DNA片段的大小。但是，该方法的SNP位点必须含有酶切位点，受限制性高。(3)PCR-SSCP法，是1989年日本Orita等创建的筛查突变的新技术。它是一种简单、快速、经济的点突变筛查手段。PCR-SSCP技术的基本原理是PCR扩增后的DNA片段经变性成单链DNA，单链DNA在中性聚丙烯酰胺凝胶中电泳时形成不同的立体构象，其构象直接影响泳动速率，相同长度的DNA单链其核苷酸顺序仅有单个碱基的差别，就可以产生立体构象的不同，造成泳动速率的不同，产生不同的泳动带。PCR扩增后的DNA片段经变性成单链后在不含有变性剂的中性胶中电泳，与正常比较出现泳动带的变位即可推测存在碱基置换。其碱基置换的性质必须经过DNA测序才能确定。因此PCR-SSCP检测是测序之前突变筛查的常用手段。但是，该方法的技术要求高，检出率低。(4)HRM法(HighResolution Melt)，即“高分辨率熔解曲线”，是近几年来在国外兴起的最新SNP及突变研究工具，是一种简单、快速、低成本的PCR扩增后检测技术，可用于高通量的突变扫描和基因分型。该技术仅仅只是在标准PCR试剂的基础上再加入双链DNA结合染料即可进行，无需序列特异性探针，在PCR结束后直接运行高分辨率熔解曲线，即可完成对样品基因型的分析。但是该方法的仪器设备比较复杂，使用不方便。(5)SNaPshot基因分型技术是由美国ABI公司开发的一种基于荧光标记单碱基延伸链终止反应原理的分型技术，主要针对中小通量的SNP分型项目。但是该方法的成本高，操作步骤繁琐。
QPCR(Real-time Quantitative PCR Detecting System)，即实时荧光定量核酸扩增检测系统。该技术结合TaqMan探针可以快速检测DNA中某个核酸位点的突变。TaqMan荧光探针是一种寡核苷酸探针，5’端连接荧光基团，3’端连接淬灭集团，能与模板特异性结合，完整的探针荧光信号被淬灭基团吸收，随着PCR扩增进行，Taq酶的外切酶活性将探针酶切水解，释放荧光基团，从而检测到荧光信号。
发明内容
本发明针对CYP2C19的*2，*3的突变位点设计特异性TaqMan探针及引物，配合实时荧光定量PCR技术，能同时测定多个样本，快速精确的进行SNP基因型测定。因此，本发明的第一个目的在于提供一种非疾病治疗和诊断目的的基于实时荧光定量PCR的检测CYP2C19基因分型的方法。本发明的第二个目的在于提供一种用于检测CYP2C19基因分型的引物对及荧光探针。本发明的第三个目的在于提供一种用于检测CYP2C19基因分型的试剂盒。本发明的第四个目的在于提供一种用于检测CYP2C19基因分型的试剂盒在用于非疾病治疗和诊断目的的检测CYP2C19基因分型中的应用。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
作为本发明的第一个方面，一种非疾病治疗和诊断目的的基于实时荧光定量PCR的检测CYP2C19基因分型的方法，包括如下步骤：
第一步，以待测样品的DNA为模板，进行荧光定量PCR扩增，获得PCR扩增产物；
第二步，检测扩增产物的荧光信号；
第三步，以检测结果判定样品中是否含有CYP2C19*2基因型；
其中，用于PCR扩增的反应体系中含有用于扩增CYP2C19*2基因的特异性引物对和用于检测CYP2C19*2基因的荧光探针，
所述用于扩增CYP2C19*2基因的特异性引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO：1和SEQID NO：2所示；用于检测CYP2C19*2基因的荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：3和SEQ IDNO：4所示。
根据本发明，所述PCR扩增的条件如下：
反应体系为20μL：2×HieffTM qPCR TaqMan Probe Master Mix，10μL；引物各10μM，0.4μL；探针10μM，0.2μL；人基因组10ng；余量为无菌超纯水；
PCR反应条件：预变性，95℃，1min，1个循环；变性，95℃，10s；退火、延伸60℃，30s；40个循环。
作为本发明的第二个方面，一种用于检测CYP2C19基因分型的引物对及荧光探针，包括用于扩增CYP2C19*2基因的特异性引物对和用于检测CYP2C19*2基因的荧光探针，
所述用于扩增CYP2C19*2基因的特异性引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO：1和SEQID NO：2所示；用于检测CYP2C19*2基因的荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：3和SEQ IDNO：4所示。
作为本发明的第三个方面，一种用于检测CYP2C19基因分型的试剂盒，所述试剂盒包括上述所述的用于检测CYP2C19基因分型的引物对及荧光探针。
作为本发明的第四个方面，一种用于检测CYP2C19基因分型的试剂盒在用于非疾病治疗和诊断目的的检测CYP2C19基因分型中的应用。
本发明的有益效果是：
1、本发明运用TaqMan qPCR法能一次进行中等密度的检测，时间短，操作简单。
2、本发明设计的探针及引物，具有高度特异性，检测结果精确度高。
3、相比于其他方法，其成本较低。
附图说明
图1为96个样本CYP2C19*2位点SNP分型结果。
图2为48个样本CYP2C19*3位点SNP分型结果。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或厂商提供的条件进行。
实施例1引物对和探针的设计
1、CYP2C19 SNP位点序列的查找
本实施例是在dbSNP数据库上查找CYP2C19的SNP位点，选择其中的*2，*3位点，进行引物和探针设计。本实施例的dbSNP数据库的网址为：http：//www.bioinfo.org.cn/relative/dbSNP％20Home％20Page.htm。
2、据引物探针设计原则设计引物对和探针，如表1所示。
表1引物对和探针
Figure BDA0002448834910000041
其中，CYP2C19*2扩增长度为244bp；CYP2C19*3扩增长度235bp。
3、qPCR扩增体系
将上述每个SNP位点合成的探针混合成10uM的TaqMan Probe mix，每个位点按表2的配方配置成20μL体系进行反应。
表2 qPCR扩增体系
Figure BDA0002448834910000042
Figure BDA0002448834910000051
4、qPCR扩增程序
qPCR反应扩增程序如表3所示。
表3 qPCR反应扩增程序
Figure BDA0002448834910000052
实施例2实际验证
(1)分别对96份经一代测序确定的50例GG型、36例GA型、8例AA型的样本进行分型测试，阴性对照组为水，2组。测试结果如图1所示。
结果显示：这些样本中CYP2C19*2位点有50例GG纯合型，8例AA纯合型，36例GA杂合型，与一代测序结果完全对应。
(2)分别对48份已知分型结果的样本(即，分别为26例GG型、16例GA型、4例AA型，阴性对照组为水，2组)进行分型测试，测试结果如图2所示。
结果显示：这些样本中CYP2C19*3位点有26例GG纯合型，4例AA纯合型，16例GA杂合型，与理论结果一致。
结论：
采用实施例1的引物对和探针进行基因分型，其准确性为100％；对其他非CYP2C19*2和CYP2C19*3核酸样本，其检测结果为阴性，实施例2质检出两个位点，因此其特异性好。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。
序列表
<110> 武汉翌圣生物科技有限公司
<120> 一种基于实时荧光定量PCR的检测CYP2C19基因分型的方法及其试剂盒
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tcttagatat gcaataattt tcccac 26
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ctagtcaatg aatcacaaat acgc 24
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
attatttccc gggaacccat 20
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
attatttccc ggaacccat 19
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gctgtgctcc ctgcaatg 18
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
agtattcaaa aatgtacttc 20
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gtaagcaccc cctggatcca ggt 23
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gtaagcaccc cctgaatcca ggt 23

Claims (5)

1.一种非疾病治疗和诊断目的的基于实时荧光定量PCR的检测CYP2C19基因分型的方法，其特征在于，包括如下步骤：
第一步，以待测样品的DNA为模板，进行荧光定量PCR扩增，获得PCR扩增产物；
第二步，检测扩增产物的荧光信号；
第三步，以检测结果判定样品中是否含有CYP2C19*2基因型；
其中，用于PCR扩增的反应体系中含有用于扩增CYP2C19*2基因的特异性引物对和用于检测CYP2C19*2基因的荧光探针，
所述用于扩增CYP2C19*2基因的特异性引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO：1和SEQ IDNO：2所示；用于检测CYP2C19*2基因的荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示。
2.如权利要求1所述的非疾病治疗和诊断目的的基于实时荧光定量PCR的检测CYP2C19基因分型的方法，其特征在于，所述PCR扩增的条件如下：
反应体系为20μL：2×HieffTM qPCR TaqMan Probe Master Mix，10μL；引物各10μM，0.4μL；探针10μM，0.2μL；人基因组10ng；余量为无菌超纯水；
PCR反应条件：预变性，95℃，1min，1个循环；变性，95℃，10s；退火、延伸60℃，30s；40个循环。
3.一种用于检测CYP2C19基因分型的引物对及荧光探针，其特征在于，包括用于扩增CYP2C19*2基因的特异性引物对和用于检测CYP2C19*2基因的荧光探针，
所述用于扩增CYP2C19*2基因的特异性引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO：1和SEQ IDNO：2所示；用于检测CYP2C19*2基因的荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示。
4.一种用于检测CYP2C19基因分型的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求3所述的用于检测CYP2C19基因分型的引物对及荧光探针。
5.一种权利要求4所述的用于检测CYP2C19基因分型的试剂盒在用于非疾病治疗和诊断目的的检测CYP2C19基因分型中的应用。
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Application publication date: 20200901

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