CN111304320A - 一种用于儿童安全用药基因检测的引物序列及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于儿童安全用药基因检测的引物序列及试剂盒，属于分子诊断技术领域。试剂盒包括22对扩增引物，能特异地扩增儿童安全用药基因22个常见位点区域；22条单碱基延伸引物，用于检测儿童安全用药基因22个位点基因型；另外包括预处理及检测专用试剂。本发明所述试剂盒可实现1孔检测临床儿童安全用药基因相关常见22个位点的不同基因型，灵敏度高、特异性强、准确性高，并且操作简便、低成本、高通量，检测快速，结果自动判读，易于临床推广应用。本发明可应用于儿童安全用药基因检测，为儿童安全用药提供一种可靠的检测体系及试剂盒，具有重要的临床应用价值和良好的市场应用前景。
Description
技术领域
本发明属于分子诊断技术领域，具体涉及一种基于基质辅助激光解吸电离质谱(MALDI-TOF)平台的用于儿童安全用药基因检测的引物序列及试剂盒。
背景技术
有关数据显示，我国3500多种药品制剂中，儿童专用剂型仅占1.7％；国家食药监局相关数据显示，在药品临床试验注册项目中，国产药品注册信息达到16万多条，其中儿童药品仅有2698条，仅占全部药品的1.63％；临床试验登记的儿童药品仅占2.35％，而欧美发达国家该项数字超过20％。在近日举行的2018中国儿童安全用药大会上，也明确提出了适宜儿童的制剂缺乏，儿童用药说明书信息缺乏，儿科用药指南、标准缺乏，临床用药供应不足等是目前我国医疗机构儿童用药面临的4个大问题。由于缺乏适宜儿童用药的剂型与规格，儿科临床不得不手工分剂量给低龄儿童服用。儿童药匮乏，成人药滥用等，导致儿童安全用药已经成为一个社会问题。
最新调查研究显示，我国每年因药物不良反应住院的病人达到了250万人，致死约20万人，尤其是对于新生儿、儿童的影响更大。目前国内90％的药品无适用于儿童的剂型，部分特殊儿童药品甚至供应短缺。据我国药物不良反应监测中心数据显示，儿科用药不良反应平均发生率为12.9％，约为成人的2倍；新生儿用药不良反应发生率为是24.4％，约为成人4倍。年纪越小，用药不良反应越严重。据中国聋儿康复研究中心统计，我国7岁以下儿童因不合理使用抗生素造成耳聋的数量多达30万，占总体聋哑儿童比例的30％-40％。药物不良反应已经成为人类除了癌症、脑溢血和心血管疾病外的第四大死因。因此，儿童安全用药基因检测对于为孩子提供合理、有效、安全、经济的药物治疗十分重要。
儿童安全用药基因检测使用先进的DNA检测技术对儿童相关用药基因进行多态性位点检测，从而对用药相关位点进行解读，预测个体对药物的代谢情况，给出科学的、安全的用药指导。儿童安全用药基因检测包含儿童最常用的七大类药物：感冒类药物、肠胃不适类药物、疼痛类药物、心血管类药物、糖尿病类药物、精神&神经类药物、病菌感染类药物。精选了中国人群中与这些药物代谢能力相关联的具有代表性的17个药物代谢基因：CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP3A4、CYP3A5、ADRB2、CRHR1、IFNL3/IFNL4、IFNL3、ACE、ABCB1、ADD1、AGTR1、ALDH2、MT-RNR1、TPMT、ADRB1，检测这些药物代谢基因对孩子的药物治疗具有很好的指导意义，最终达到提高药物疗效、降低药物毒副作用、减少盲目的医疗费用支出。
基因的差异影响药物在体内的代谢情况：基因对药物的清除能力强：药物在体内代谢快，可能会降低药效或者无效；基因对药物的清除能力弱：药物在体内滞留时间过长，带来很多副作用，对肾和肝会造成损伤。基因激活能力弱：部分药物被基因激活才会发挥药效，否则药物作用无法发挥，还会滞留体内造成伤害。儿童用药安全基因检测能够帮助爸爸妈妈和医生选择更适合孩子吃的药，调整用药剂量，正确搭配不同药物，规避可能会引起严重副作用的药物，将吃药的伤害降到最低。
目前，用于儿童安全用药基因的方法和产品主要有荧光定量熔解曲线法、反向点杂交法、Sanger测序法、高通量测序法。荧光定量结合溶解曲线法单孔检测通量有限，只能检测少数位点已知突变，每个位点的每种突变基因型均需设计特异引物；覆盖常见位点需要多孔并且每孔进行多重检测，多重探针设计要求高，技术难度大，检测探针成本高昂，结果判读手工操作，易错判；反向点杂交法体系每个位点每一种基因型均需设计探针，成本高昂，分辨率取决于探针有效性，容易有非特异性，且检测流程长，操作复杂，体系开放，样本间极易污染；Sanger测序法是序列金标准，但是流程长，操作复杂，且需要手工判读每一个位点，覆盖常见位点需要多孔检测，成本高，通量低；高通量测序法虽然可一次检测覆盖多个基因位点，但其仪器和检测试剂成本高昂，检测样本数量少的时候会造成浪费，导致成本更高，且体系所需核酸样本量高(50ng以上)，新生儿足跟血样本量少，浓度低，经常需要进行多个项目的筛查检测，因此很难获得足够的核酸模板；高通量测序检测流程长达3-5天，操作复杂，且需要专业的生信分析人员分析数据，结果判读困难，因此无法作为筛查项目在全国各级地方中小医院大规模推广应用。
基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(Matrix Assisted Laser DesorptionIonization Time-of-flight Mass Spectrometry，MALDI-TOF MS)的基本原理是将分析物分散在基质分子中并形成晶体，当用激光照射晶体时，由于基质分子经辐射所吸收的能量，导致能量蓄积并迅速产热，从而使基质晶体升华，致使基质和分析物膨胀并进入气相。MALDAI所产生的质谱图多为单电荷离子，因而质谱图中的离子与多肽和蛋白质的质量有对应关系，并以质/荷比计算分子量。MALDI产生的离子常用飞行时间(Time-of-Flight,TOF)检测器来检测，最后根据到达检测器的飞行时间不同而被检测，即通过离子的质量电荷之比(M/Z)与离子的飞行时间成正比来分析离子，并测得样品分子的分子量。MALDI-TOF质谱很适合用于对蛋白质、多肽和多糖、核酸等生物大分子的研究。因其具有测定质量范围宽、灵敏度高、速度快、精确度高及对盐的耐受性较好等优点，已广泛应用于蛋白质及多肽的分子量和序列测定。
发明内容
本发明要解决的技术问题是，提供一种针对儿童安全用药基因的检测方案，首先，儿童用药基因位点尽可能全，至少覆盖所有最新数据库、指南或专家共识中汇总统计而得的中国人群高发的致病性突变类型；其次，结果要准确可靠、灵敏度高、特异性强，所需模板量尽可能少，满足儿童或新生儿少量足跟血、干血片的筛查检测；另外，操作需简便快捷、结果判读简单客观，不易出错，且通量高、成本低廉，对样本个数要求低，可随到随检，适宜全国不同地区各级医院大规模推广。这样各级地方医院可以及时方便地开展儿童安全用药基因检测，尽可能多的覆盖儿童或新生儿人群进行筛查诊断，从而可以指导临床给出合理的建议，避可能会引起严重副作用的药物，将吃药的伤害降到最低。
为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：一组用于儿童安全用药基因检测的引物序列，包括如下表所示引物：
本发明还提供第二种技术方案：一组用于儿童安全用药基因检测的单碱基延伸检测的引物序列，包括如下表所示引物：
| 引物名称 | 引物序列(5'-3') | 检测位点 |
| SEQ ID NO：46 | CTCTCTCCCTCCCTG | c.668+111C>T |
| SEQ ID NO：47 | CGCAGCAGAGCAGTC | c.1165G>C |
| SEQ ID NO：48 | tcGCTTCCATTCTGCC | c.1378G>T |
| SEQ ID NO：49 | cTGTAAGCACCCCCTG | c.636G>A |
| SEQ ID NO：50 | TCCTTTCTGTGAGCAAT | g.39743165T>G |
| SEQ ID NO：51 | AGAGGAGCATTGAGGAC | c.430C＞T |
| SEQ ID NO：52 | cacaTCACAGTTTTCACTT | c.1510G＞A |
| SEQ ID NO：53 | ccTACCATGTTACGACTTG | m.1555A>G |
| SEQ ID NO：54 | gggggCcGCGCATGGCTTC | c.46G>A |
| SEQ ID NO：55 | AGTAATTTGTTATGGGTTCC | c.681G>A |
| SEQ ID NO：56 | ATCTATTAAATCGCCTCTCTC | c.-392G>A |
| SEQ ID NO：57 | ccatTTTGACTCACCTTCCCAG | c.2677T>A/G |
| SEQ ID NO：58 | gaataAGCTCTTTTGTCTTTCA | c.806-4288C>T |
| SEQ ID NO：59 | TTCAATTCTGAAAAGTAGCTAA | c.1166A>C |
| SEQ ID NO：60 | tgggGCACGAGGTCCAGAGATAC | c.1075A＞C |
| SEQ ID NO：61 | cccGAGCTCCCCGAAGGCG | c.151-152G>A |
| SEQ ID NO：62 | aattgtgGTCTTCTGTTCTCAAAG | c.-806C>T |
| SEQ ID NO：63 | atgtctcatttacttttctgtaagtaga | c.719A>G |
| SEQ ID NO：64 | aagcgcccgCGCTGGGCTGCACGCTAC | c.100C>T |
| SEQ ID NO：65 | CCGGGTGGTGTCACAGGAAGAGAT | c.3435T>C |
| SEQ ID NO：66 | AAGCGCGTACACACCGCCCGTCAC | m.1494C>T |
| SEQ ID NO：67 | cagtcGCTGCCTATACAGTCACTTTT | I/D |
上述核酸序列在一次1孔检测中使用。
本发明提供第三种技术方案：一种用于检测儿童安全用药基因的试剂盒，该试剂盒包括如下试剂：
(1)飞行时间质谱检测系统核酸样本预处理试剂：包括如下主要组分
(2)扩增反应引物预混合液：所述权利要求1中的SEQ ID NO：1～45所示的核苷酸序列的混合液，各引物浓度为0.3～3μM；
(3)单碱基延伸反应引物预混合液：所述权利要求2中的SEQ ID NO：46～67所示的核苷酸序列的混合液，各引物浓度介于3～30μM；
(4)除盐树脂：包括去除延伸反应液盐离子的阳离子交换树脂粉末；
(5)检测芯片：包括含384个已预点基质的检测点的硅基芯片；
(6)纯突变对照：包含22个位点突变阳性的人儿童安全用药基因对应片段质粒水溶液，浓度大于500拷贝/μL；
(7)杂合对照：包含22个位点突变阳性的人儿童安全用药基因基因对应片段质粒、包含22个位点野生型的人儿童安全用药基因对应片段的混合水溶液，突变型质粒和野生型拷贝浓度相等，浓度大于500拷贝/μL；
(8)纯野生对照：包含22个位点野生型的人儿童安全用药基因对应片段质粒水溶液，浓度大于500拷贝/μL。
作为优选，所述扩增反应引物预混合液具体为，所述权利要求1中的SEQ ID NO：1～45所示的引物的混合液，各引物等比例混合，最终摩尔浓度浓度均为0.5μM或者SEQ IDNO：1～44所示引物浓度0.5μM，SEQ ID NO：45所示引物浓度1.5μM；
进一步地，所述单碱基延伸反应引物预混合液具体为，各延伸引物摩尔浓度比值如下：
优选地，各延伸引物摩尔浓度比值如下：
| 引物名称 | 检测位点 | 摩尔浓度比值 |
| SEQ ID NO：46 | c.668+111C>T | 5.67 |
| SEQ ID NO：47 | c.1165G>C | 6.11 |
| SEQ ID NO：48 | c.1378G>T | 6.48 |
| SEQ ID NO：49 | c.636G>A | 6.57 |
| SEQ ID NO：50 | g.39743165T>G | 10.27 |
| SEQ ID NO：51 | c.430C＞T | 7.57 |
| SEQ ID NO：52 | c.1510G＞A | 10.28 |
| SEQ ID NO：53 | m.1555A>G | 8.35 |
| SEQ ID NO：54 | c.46G>A | 8.56 |
| SEQ ID NO：55 | c.681G>A | 9.05 |
| SEQ ID NO：56 | c.-392G>A | 9.27 |
| SEQ ID NO：57 | c.2677T>A/G | 9.72 |
| SEQ ID NO：58 | c.806-4288C>T | 12.88 |
| SEQ ID NO：59 | c.1166A>C | 9.96 |
| SEQ ID NO：60 | c.1075A＞C | 10.53 |
| SEQ ID NO：61 | c.151-152G>A | 8.39 |
| SEQ ID NO：62 | c.-806C>T | 10.82 |
| SEQ ID NO：63 | c.719A>G | 12.35 |
| SEQ ID NO：64 | c.100C>T | 11.98 |
| SEQ ID NO：65 | c.3435T>C | 11.00 |
| SEQ ID NO：66 | m.1494C>T | 7.06 |
| SEQ ID NO：67 | I/D | 16.51 |
本发明还提供一种集成一体化的核酸质谱检测技术平台：飞行时间质谱检测系统(DP-TOF型，迪谱诊断)，扩增、消化、延伸后的预处理产物通过该仪器，实现自动除盐、芯片点样、质谱检测和结果分析。
与现有技术相比，本发明的有益效果：
(1)本发明提供了一种针对儿童安全用药基因检测的试剂盒，优化的体系和试剂灵敏度高，特异性强，可检测低至0.01ng/μL的人gDNA核酸样本(约5-6个拷贝)，可节约珍贵的儿童或新生儿血样；准确性达100％；配套一体化检测平台，操作简便快速，结果分析容易，通量高，成本低，具有比现有基于QPCR、反向点杂交或NGS方法学的相关产品更优异的性能，实用性也非常突出，尤其适宜在全国范围的各级医院推广应用，方便地开展儿童用药基因突变检测，尽可能多的覆盖儿童或新生儿人群进行筛查诊断，从而可以指导临床给出合理的建议，避可能会引起严重副作用的药物，将吃药的伤害降到最低。
(2)本发明参考全球共享的SNP数据库NCBI dbSNP(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/)、OMIM数据库(http://www.omim.org/)、国际千人基因组SNP数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/variation/tools/1000genomes/)以及中国国内相关指南，选取具有明确致病临床意义和中国儿童最常用的七大类药物基因突变位点，经过多次筛选和优化扩增引物和单碱基延伸引物组合后，22个位点可实现1孔检测；经过多次优化完善的预处理试剂，多种组分实现预混配制，并已获得国家医疗器械备案，大大简化了临床应用时操作人员进行体系配制和后续检测的难度，显著提升了微量体系配制和检测的稳定性和重复性，易于操作，有效降低使用门槛和上手难度；一体化仪器自动检测和分析结果，输出文件可直接导入lims报告系统，结果分析和发布简单客观，不易出错；全流程6-7h内完成384个样本检测，检测通量高，易于大规模推广应用。
(3)本发明采用一种基于MALDI-TOF MS技术的核酸质谱分析系统，属于高精度DNA定性分析平台。该技术平台是目前全球唯一可以准确检测核酸的质谱技术平台，完美整合了PCR技术的高灵敏度、芯片技术的高通量、质谱技术的高精确度和计算机智能分析的强大功能，为市场提供了一个具有显著成本优势，简易工作流程和高通量的全自动解决方案。准确性≥99.7％，FDA认可为用于SNP基因分型和突变检测的金标准；除盐、点样、检测一体化整合，自动化程度高，操作简便快速，结果判读简单；一次检测384个样本，检测样本通量高，也可一次检测单个样本，检测通量灵活，可随到随检；位点通量中高，单孔最多可检测超过40个位点，可降低用量珍贵样本，成本低至数十元，节约筛查成本，降低国家医疗支出，适宜全国不同经济水平地区全面推广。
附图说明
图1为纯突变对照品检测结果图。DP-TOF核酸质谱仪检测软件界面，软件依据各孔的22位点延伸后产物峰出峰情况，自动判读各位点基因型，结果框(中下)所示22位点均为纯突变型。
图2为杂合突变对照品检测结果图。DP-TOF核酸质谱仪检测软件界面，软件依据各孔的22位点延伸后产物峰出峰情况，自动判读各位点基因型，结果框(中下)所示22位点均为杂合型。
图3为纯野生型对照品检测结果图。DP-TOF核酸质谱仪检测软件界面，软件依据各孔的22位点延伸后产物峰出峰情况，自动判读各位点基因型，结果框(中下)所示22位点均为野生型。
图4为1例临床样本(1号)检测结果图。DP-TOF核酸质谱仪检测软件界面，软件依据各孔的22位点延伸后产物峰出峰情况，自动判读各位点基因型，结果框(中下)所示。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制本发明。
实施例1：检测儿童安全用药基因的引物由上海百力格生物技术有限公司合成，序列如下：
扩增引物：
单碱基延伸引物：
实施例2：检测儿童安全用药基因各位点的突变型质粒由上海生工生物工程有限公司合成。
实施例3：儿童安全用药基因检测试剂盒的制备。
(1)飞行时间质谱检测系统核酸样本预处理试剂(迪谱诊断，货号：20020100)，包括如下主要组分：
(2)扩增反应引物预混合液：所述权利要求1中的SEQ ID NO：1～45所示的核苷酸序列的混合液；优选方案为，SEQ ID NO：1～44所示引物浓度0.5μM，SEQ ID NO：45所示引物浓度1.5μM；
(3)单碱基延伸反应引物预混合液：所述权利要求2中的SEQ ID NO：46～67所示的核苷酸序列的混合液，各延伸引物摩尔浓度优选方案如下：
(4)除盐树脂：包括去除延伸反应液盐离子的阳离子交换树脂粉末；
(5)检测芯片：包括含384个已预点基质的检测点的硅基芯片。
(6)纯突变对照品：包含经酶切片段化、数字PCR绝对定量后稀释的包含22个位点突变型人儿童用药基因对应片段质粒水溶液，浓度大于500拷贝/μL。
(7)杂合对照品：包含经酶切片段化、数字PCR绝对定量后稀释的包含22个位点突变型人儿童用药基因对应片段质粒、包含22个位点野生型的人儿童安全用药基因对应片段质粒的混合水溶液，突变型质粒和野生型质粒拷贝浓度相等，浓度大于500拷贝/μL。
(8)纯野生对照品：包含经酶切片段化、数字PCR绝对定量后稀释的包含22个位点野生型的人儿童安全用药基因对应片段质粒水溶液，浓度大于500拷贝/μL
实施例3：儿童安全用药基因检测方法。
仪器：Qubit 2.0荧光计(美国，ThermoFisher公司)，Mastercycler X50h 384孔快速定性PCR仪(德国，Eppendorf公司)，Mastercycler ProS 96孔快速定性PCR仪(德国，Eppendorf公司)，BECKMAN
22R台式微量冷冻离心机，WH-866型涡旋振荡器(太仓华利达)，低速板式离心机(安徽中佳)、恒温振荡器(杭州奥盛)。
1.人gDNA核酸模板的制备：成人外周血样本采用全血DNA抽提试剂盒(迪谱诊断，货号20020100)，新生儿足跟血干血片样本采用微量DNA提取试剂盒(新景生物，货号：3102050)，按照试剂盒说明书操作。抽提完成后用Qubit 2.0荧光计测定核酸浓度，立即检测或-20℃保存备用。
2.利用1组优化的扩增引物和1组优化的单碱基延伸引物进行儿童安全用药基因常见位点的检测，具体包括如下步骤；
(1)PCR试剂配制(试剂准备区)：
从试剂盒中取出T-PCR反应混合液和PCR酶混合液，分别在室温下融化并振荡混匀后，2000rpm离心10sec。计算需准备反应试剂人份数。
每个测试反应体系配制如下：
| 试剂 | T-PCR反应混合液 | PCR酶混合液 | PCR扩增引物预混合液 |
| 用量 | 1.67μL | 0.33μL | 1μL |
计算上述各试剂的使用量，充分混匀后，按3μL量分装到PCR反应管或384孔PCR板中，转移至样本处理区。
(2)上样(样本处理区)：
分别加入2μL样品DNA溶液，盖紧反应管或384孔PCR板，转移至检测区。
(3)PCR扩增(核酸扩增区)：
将各反应管按一定顺序放入PCR仪上，按以下程序进行PCR扩增：
*注：PCR产物暂时不进行下一步实验操作，可4℃保存过夜。
(4)SAP试剂配制(试剂准备区)：
从试剂盒中取出SAP反应混合液和SAP酶混合液，分别在室温下融化并振荡混匀后，2000rpm离心10sec。计算需准备反应试剂人份数。
每个测试反应体系配制如下：
| 试剂 | SAP反应混合液 | SAP酶混合液 |
| 用量 | 1.70μL | 0.30μL |
(5)加样(核酸扩增区)：
向3的PCR产物中分别加入2μL的上述SAP反应液，盖紧反应管或384孔PCR板。
将各反应管按一定顺序放入PCR仪上,按以下程序进行SAP消化：
*注：SAP产物应立即进行下一步操作，不建议放置4℃过夜。
(6)延伸试剂配制(试剂准备区)：
从试剂盒中取出T-延伸反应混合液和延伸酶混合液，在室温下融化并振荡混匀后，2000rpm离心10sec。计算需准备反应试剂人份数。
每个测试反应体系配制如下：
| 试剂 | T-延伸反应混合液 | 延伸酶混合液 | 单碱基延伸引物预混合液 |
| 用量 | 0.72μL | 0.34μL | 0.94 |
(7)加样(核酸扩增区)：
按一定顺序向6的SAP产物中分别加入2μL的上述延伸反应液，盖紧反应管或384孔PCR板。
将各反应管按一定顺序放入PCR仪上,按以下程序进行延伸扩增：
*注：延伸产物暂不进行下一步实验操作，可4℃保存过夜。
(8)使用DP-TOF飞行时间质谱检测系统进行质谱检测(扩增分析区)：
按照DP-TOF核酸质谱仪操作说明书进行标准操作，选择所需检测样本对应芯片及孔号，仪器自动进行样本延伸产物除盐、芯片点样和检测，并自动对结果进行分析。
(9)将质谱仪分析完的结果文件导入样本结果报告系统，发布样本结果报告。
实施例4：用本发明所述试剂盒进行儿童安全用药基因检测准确性测试
(1)随机抽取12例临床体检人血样，进行全血gDNA抽提，测定浓度；
(2)取试剂盒中的3个对照品(纯突变型对照品、杂合对照品、纯野生型对照品)；
(3)根据实施例3进行3个对照品和12例未知结果体检人样本的儿童安全用药基因检测；
(4)采用序列金标准的Sanger测序法验证本发明所述的试剂盒检测儿童安全用药基因位点的准确性，结果与质谱检测结果比对。比对结果如下：
结果显示，三个对照品检测结果与预期结果完全一致，准确性100％；12例体检样本检测结果与Sanger测序法结果完全一致，显示本发明所述的试剂盒及检测体系结果准确性为100％。
实施例5：用本发明所述试剂盒进行儿童安全用药基因检测灵敏度测试
根据实施例3进行儿童安全用药基因检测灵敏度测试。
采用实施例4中1-3号样本核酸模板进行稀释后，用本发明所述的试剂盒和体系进行儿童安全用药基因检测，考察灵敏度。检测结果如下表：
结果显示，本发明所述引物组和试剂盒和检测体系能检测低至0.01ng/μL(即3拷贝/μL)的核酸模板，再低一个梯度浓度则部分位点无法检出，显示本发明所述试剂盒具有极高的灵敏度。
综上所述，本发明提供了一种优化的检测儿童安全用药基因的引物组合和检测试剂盒，优化的体系和试剂和灵敏度高，特异性强，可检测低至0.01ng/μL的人gDNA核酸样本(约5-6个基因拷贝/反应)，可节约珍贵的儿童及新生儿血样；22个位点可实现1孔检测，准确性达100％；经过多次优化完善的预处理试剂，多种组分实现预混配制，大大简化了临床应用时检测人员体系配制和操作难度，易于操作，有效降低使用门槛和上手难度；配套一体化检测平台，操作简便快速，自动检测和分析结果，结果文件可直接导入lims报告系统，结果分析和发布简单客观，不易出错；通量高，成本低廉，实用性非常突出，临床应用前景广阔，尤其适宜在全国范围大规模推广应用，满足不同经济水平的各级医院方便地开展儿童用药基因突变检测，尽可能多的覆盖儿童或新生儿人群进行筛查诊断，从而可以指导临床给出合理的建议，避可能会引起严重副作用的药物，将吃药的伤害降到最低。
序列表
<110> 浙江迪谱诊断技术有限公司
<120> 一种用于儿童安全用药基因检测的引物序列及试剂盒
<160> 67
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
acgttggatg cgattgtcta gagccttctc 30
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
acgttggatg agcagcatac ccctagggac 30
<210> 3
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
acgttggatg aaccccatca tctactgccg 30
<210> 4
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
acgttggatg ggtctccgtg ggtcgcgtg 29
<210> 5
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
acgttggatg acaagatggc tgaactctgg 30
<210> 6
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
acgttggatg caccttagtc ttcgacttgg 30
<210> 7
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
acgttggatg aacatcagga ttgtaagcac 30
<210> 8
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
acgttggatg gactgtaagt ggtttctcag 30
<210> 9
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
acgttggatg caatttgtca ctgttcctcc 30
<210> 10
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
acgttggatg actgtataca gcatggttcc 30
<210> 11
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
acgttggatg catgacgctg cggaattttg 30
<210> 12
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
acgttggatg tatggagtag ggtcacccac 30
<210> 13
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
acgttggatg ttggtggcta caagatgtcg 30
<210> 14
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
acgttggatg aggtcccaca ctcacagttt 30
<210> 15
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
acgttggatg accctcctca agtatacttc 30
<210> 16
<211> 30
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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acgttggatg cactttccag tacacttacc 30
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acgttggatg tccatcgatt cttggtgttc 30
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acgttggatg atgaggacag ccatagagac 30
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<211> 30
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acgttggatg agtaagcagt agggagtaac 30
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<211> 30
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acgttggatg gtctggacaa gcactgaaag 30
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<211> 30
<212> DNA
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acgttggatg gtaatgtggt ccaaacaggg 30
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acgttggatg atgtaccacc cagcttaacg 30
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acgttggatg attcctctgc agcacttcac 30
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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acgttggatg gaaaagtcgg ttcagtccac 30
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<211> 30
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<400> 29
acgttggatg atgcaagaca ggagccacat 30
<210> 30
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
acgttggatg tgtcacaggt cactgcatgg 30
<210> 31
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
acgttggatg tgcacagtct gggattcctg gacgt 35
<210> 32
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
acgttggatg gggtcaatca cagaagggag ccctg 35
<210> 33
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
acgttggatg caaatttgtg tcttctgttc 30
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<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
acgttggatg ggatttgagc tgaggtcttc 30
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
acgttggatg agaacgacat aaaagttggg 30
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
acgttggatg cctcaaaaac atgtcagtgt g 31
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<211> 31
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
acgttggatg ccatttggta gtgaggcagg t 31
<210> 38
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
acgttggatg gccatgtata aatgcccttc tc 32
<210> 39
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
acgttggatg ttcagtggct ccgagcacac ct 32
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<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
acgttggatg aaactatagg ccagagaggc tgcc 34
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
acgttggatg tgaacagggc cctgaagcg 29
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acgttggatg agtgtaagtt gggtgctttg 30
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acgttggact ggagaccact cccatccttt 30
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acgttgatgt ggccatcaca ttcgtcagat 30
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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acgttgattg agaccatccc ggctaaaacg 30
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<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 46
ctctctccct ccctg 15
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cgcagcagag cagtc 15
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<400> 48
tcgcttccat tctgcc 16
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<211> 16
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ctgtaagcac cccctg 16
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<400> 50
tcctttctgt gagcaat 17
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agaggagcat tgaggac 17
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cacatcacag ttttcactt 19
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cctaccatgt tacgacttg 19
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<400> 54
gggggccgcg catggcttc 19
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<211> 20
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agtaatttgt tatgggttcc 20
<210> 56
<211> 21
<212> DNA
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atctattaaa tcgcctctct c 21
<210> 57
<211> 22
<212> DNA
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ccattttgac tcaccttccc ag 22
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<211> 22
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<400> 58
gaataagctc ttttgtcttt ca 22
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ttcaattctg aaaagtagct aa 22
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tggggcacga ggtccagaga tac 23
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<400> 61
cccgagctcc ccgaaggcg 19
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 62
aattgtggtc ttctgttctc aaag 24
<210> 63
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 63
atgtctcatt tacttttctg taagtaga 28
<210> 64
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 64
aagcgcccgc gctgggctgc acgctac 27
<210> 65
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 65
ccgggtggtg tcacaggaag agat 24
<210> 66
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 66
aagcgcgtac acaccgcccg tcac 24
<210> 67
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 67
cagtcgctgc ctatacagtc actttt 26
Claims (6)
1.一组用于儿童安全用药基因检测的引物序列，其特征在于，包括如下表所示引物：
2.一组用于儿童安全用药基因检测的单碱基延伸检测的引物序列，其特征在于，包括如下表所示引物：
上述核酸序列在一次1孔检测中使用。
3.一种用于检测儿童安全用药基因的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括如下试剂：
(1)飞行时间质谱检测系统核酸样本预处理试剂：包括如下主要组分
(2)扩增反应引物预混合液：所述权利要求1中的SEQ ID NO：1～45所示的核苷酸序列的混合液，各引物浓度为0.3～3μM；
(3)单碱基延伸反应引物预混合液：所述权利要求2中的SEQ ID NO：46～67所示的核苷酸序列的混合液，各引物浓度介于3～30μM；
(4)除盐树脂：包括去除延伸反应液盐离子的阳离子交换树脂粉末；
(5)检测芯片：包括含384个已预点基质的检测点的硅基芯片；
(6)纯突变对照：包含22个位点突变阳性的人儿童安全用药基因对应片段质粒水溶液，浓度大于500拷贝/μL；
(7)杂合对照：包含22个位点突变阳性的人儿童安全用药基因基因对应片段质粒、包含22个位点野生型的人儿童安全用药基因对应片段的混合水溶液，突变型质粒和野生型拷贝浓度相等，浓度大于500拷贝/μL；
(8)纯野生对照：包含22个位点野生型的人儿童安全用药基因对应片段质粒水溶液，浓度大于500拷贝/μL。
4.根据权利要求3所述的用于儿童安全用药基因检测的试剂盒，其特征在于，所述扩增反应引物预混合液具体为：所述权利要求1中的SEQ ID NO：1～45所示的引物的混合液，各引物等比例混合，最终摩尔浓度浓度均为0.5μM或者SEQ ID NO：1～44所示引物浓度0.5μM，SEQ ID NO：45所示引物浓度1.5μM。
5.根据权利要求3所述的用于儿童安全用药基因常见致病性突变检测的试剂盒，其特征在于，所述单碱基延伸反应引物预混合液具体为，各延伸引物摩尔浓度比值如下：
6.根据权利要求3所述的用于儿童安全用药基因常见致病性突变检测的试剂盒，其特征在于，所述单碱基延伸反应引物预混合液具体为，各延伸引物摩尔浓度比值如下：
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| PB01 | Publication | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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