CN113528638B - 一种扩增儿童个体化用药基因位点用引物组、检测用引物组及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种扩增儿童个体化用药基因位点用引物组、检测用引物组及其应用，属于基因检测技术领域。扩增儿童个体化用药基因位点用引物组及单碱基延伸引物是针对122种药物、32种药物有效成分的31个用药相关基因的42个SNP位点进行设计得到。扩增用引物组及其与单碱基延伸引物形成的检测用引物组或其制备的试剂盒在检测儿童个体化用药基因位点多态性中的应用。本发明提供的检测用引物组涵盖儿童常用药种类、药品有效成分多，涵盖的基因、SNP位点数量多，基因位点的置信等级高，是针对中国人自己的基因数据库进行基因位点设计和优化，具有检测灵敏度高、效率高、通量高的特点。
Description
技术领域
本发明属于基因检测技术领域，具体涉及一种扩增儿童个体化用药基因位点用引物组、检测用引物组及其应用。
背景技术
国家食品药品监督管理局《2016年儿童用药安全调查报告白皮书》显示，因用药不当，有严重后果。《国家药品不良反应监测年度报告(2016年)》显示，2016年药品不良反应/事件病例报告中，14岁以下儿童患者占比较高。
我国医学界对儿童年龄的定义介于0～14岁，狭义的儿童用药指药品说明书中明确注明仅针对儿童使用的药品，广义的儿童用药指成人和儿童都能使用的药品。
儿童用药不当，不仅仅孩子受到伤害，也给家庭带来了诸多不幸，给社会造成沉重负担。这一突出矛盾的解决思路有两个方面：一方面加速儿童专用药剂的研制，这方面取决于国家政策的倾斜、药厂的研发投入、新药的审批等等；另一方面是从精准医疗层面加强儿童个体化用药指导，目前针对儿童安全用药的药物基因组学研究得到迅猛发展，药物基因组学已成为指导临床个体化用药、评估严重药物不良反应发生风险、指导新药研发和评价新药的重要工具。国家卫计委2015年7月颁布《药物代谢酶和药物作用靶点基因检测技术指南(试行)》，为个体化用药基因检测提供了依据。药物代谢酶和药物作用靶点基因特性的变化可通过影响药物的体内浓度和靶组织对药物的敏感性，导致药物反应性(包括药物的疗效和不良反应发生)个体差异。对药物代谢酶和药物作用靶点基因进行检测可指导临床针对特定的患者选择合适的药物和给药剂量，实现个体化用药，从而提高药物治疗的有效性和安全性，防止严重药物不良反应的发生。药物代谢酶和药物作用靶点基因相关的药物需要结合多方面数据进行筛选。
目前以医院为代表开展儿童安全用药基因检测的机构均采用已获得cFDA批准的药物基因组学临床检测试剂盒，但其局限也十分明显：1)大部分为单个基因，检测结果不够精确和全面；2)变异类型单一，全部是SNP，没有包含indel，CNV等其它变异形式；3)临床上需要多个基因检测时，需要多个试剂盒联用，操作不便，成本太高，难以满足临床要求；4)检测种类少，无法满足希望全面了解自身用药指导信息的人群要求。
另一方面，以体检中心、基因检测公司为代表开展儿童安全用药基因检测的机构还不多，所采用的方法也集中使用的是高通量测序法、核酸质谱法、荧光定量PCR法，存在以下不足：1)包含的用药种类较少。根据儿童用药安全调查报告白皮书中儿童最常患的疾病种类，及国家药品不良反应监测年度报告中患儿用药错误统计情况，儿童用药种类超过15类。市场现有检测多以其中几种用药为主要检测位点。Smith M D等在对美国2002-2012年院外患儿用药错误(medication error，ME)发生情况研究中列出前4位为镇痛药(25.2％)、咳嗽及感冒用药(24.6％)、抗组胺药(15.0％)及抗菌药物(11.8％)。韩国一项研究中ME发生情况排前3位的药物为镇痛药(21.3％)、治疗哮喘药物(11.9％)及免疫制剂(10.5％)。2)位点可信度较低，给儿童安全用药指导带来不安全隐患。世界权威的遗传药理学知识库(PharmGKB)根据项目成熟程度将个体化用药基因检测项目分为4级，并认为其中1级项目(包括1A级和1B级)满足临床应用的最高标准，而4级项目适于临床应用的证据最少。目前市面上的检测套餐内包含的SNP位点置信等级普遍不高，有些SNP位点甚至没有置信等级评级。3)包含大量冗余位点及无效位点。因为基因突变频率存在东西方差异，不同突变类型对酶活性和药物代谢的影响不一，所以同一种药中国人与西方人在用药方面也存在很多不同，如果不能针对中国人自己的基因数据库进行基因位点设计和优化，简单照搬国外文献及数据等，会造成很多针对中国人无效的检测和冗余检测，造成浪费。因此，参照国外权威数据库，设计针对中国人群药物临床研究数据的准确、全面、安全的儿童安全用药基因检测是非常有必要的。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种扩增儿童个体化用药基因位点用引物组、检测用引物组及其应用，所述引物组针对的药物靶点基因及SNP位点数量多，且所检测的SNP位点置信等级高，同时所涉及的儿童常用药种类、药品有效成分多，且是针对中国人自己的基因数据设计得到，具有检测针对性强、效率高的特点。
本发明提供了一种扩增儿童个体化用药基因位点用引物组，包括核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:84所示的引物。
本发明提供了一种检测儿童个体化用药基因位点多态性用引物组，包括所述引物组和核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:85～SEQ ID NO:126所示的单碱基延伸引物。
本发明提供了一种检测儿童个体化用药基因位点多态性用试剂盒，包括所述扩增儿童个体化用药基因位点用引物组或所述检测儿童个体化用药基因位点多态性用引物组。
本发明提供了所述扩增儿童个体化用药基因位点用引物组、所述检测儿童个体化用药基因位点多态性用引物组或所述检测儿童个体化用药基因位点多态性用试剂盒在检测儿童个体化用药基因位点多态性中的应用。
优选的，所述儿童个体化用药包括庆大霉素、链霉素、卡那霉素、妥布霉素、大观霉素、新霉素、巴龙霉素、小诺霉素、核糖霉素、奈替美星、阿司米星、依替米星、异帕米星、阿米卡星、西索米星、布洛芬混悬液、布洛芬缓释胶囊、芬必得、美林、布洛芬颗粒、右旋布洛芳胶囊、同泽安、右旋布洛芬混悬液、优舒芬、清芬、对乙酰氨基酚口服悬液、泰诺、泰诺林、对乙酰氨基翻片、扑热息痛、百服宁、必理通、优卡丹、代尔卡、保达琳、明感静、小儿氢酚黄那敏颗粒、护彤、小儿快克、双氯芬酸钠、双氯芬酸钠栓、扶他林、思孚欣、戴芬、奥尔芬、英太青、芬迪、可待因、联邦止咳露、奥亭、孟鲁司特钠片、顺尔宁、舒喘灵、喘乐宁、平喘灵、伏立康隆片、威凡、匹纳普、丽福康、美大康、依托红霉素、琥乙红霉素、利福平胶囊、异烟肼片、奥司他韦磷酸盐胶囊、利巴韦林口服液、利巴韦林分散片、利巴韦林注射液、二甲双胍片、盐酸二甲双胍缓释片、泰白、捷诺达、格华止、维生素E、咖啡因、卡马西平、卡马西平胶囊、卡马西平片、得理多、氟西汀、帕罗西汀、西酞普兰、氯雷他定口腔崩解片、息斯敏氯雷他定、泼尼松、强的松、去氢皮质素、布地奈德混悬液、普米克、信必可都保、乐冰和/或吉舒。
优选的，所述儿童个体化用药的有效成分包括氨基糖苷类抗生素、布洛芬、右旋布洛芬、对乙酰氨基酚、双氯芬酸钠、可待因、右美沙芬、孟鲁司特钠、沙丁胺醇、伏立康唑、红霉素、利福平、异烟肼、奥司他韦、利巴韦林、格列本脲、二甲双胍、维生素E、咖啡因、奥美拉唑、兰索拉唑、泮托拉唑、黄连素、卡马西平、苯妥英钠、地西泮、氟西汀、帕罗西汀、西酞普兰、氯雷他定、泼尼松和/或布地奈德。
优选的，所述基因包括MT-RNR1、CYP2C9、CYP2C8、PTGS2、UGT1A、TNFRSF11A、PLA2G4A、CYP2D6、SLCO2B1、ADRB2、CRHR2、COL22A1、CYP2C19、G6PD、ABCC2、NAT1、NAT2、CES1、IFNL3、IFNL4、SLC47A2、CYP4F2、ADORA2A、SCN1A、EPHX1、FKBP5、HTR1A、GRIK4、SLC22A1、CTLA4和/或CRHR1。
优选的，所述基因的SNP位点包括rs267606617、rs267606619、rs1799853、rs1057910、rs11572080、rs20417、rs10929303、rs1805034、rs12746200、rs16947、rs35742686、rs3892097、rs1065852、rs12422149、rs1042713、rs7793837、rs6988229、rs4244285、rs4986893、rs12248560、rs137852327、rs5030869、rs72554665、rs72554664、rs717620、rs1801280、rs1799930、rs200707504、rs12979860、rs8099917、rs2228570、rs12943590、rs2108622、rs2298383、rs3812718、rs1051740、rs4713916、rs6295、rs1954787、rs622342、rs4553808和/或rs1876828。
本发明提供了一种儿童个体化用药基因位点多态性的检测方法，包括以下步骤：
1)提取待检测样品的基因组DNA；
2)以所述基因组DNA为模板，用所述引物进行多重PCR扩增，得到多重PCR扩增产物；
3)将所述多重PCR扩增产物经SAP混液处理，再在所述引物组中单碱基延伸引物作用下进行延伸反应，得到延伸产物；
4)将所述延伸产物进行脱盐处理，得到脱盐的延伸产物；
5)将所述脱盐的延伸产物进行MALDI-TOF MS基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱分析，得到儿童个体化用药基因位点多态性。
优选的，步骤2)中多重PCR扩增的反应体系为5μL，10×PCR Buffer(含20mMMgCl2)0.5μL、25mM MgCl2 0.4μL、5U/μL PCR酶0.2μL、25mM dNTP 0.1μL、1μLPCR扩增引物混合液、1μL 10ng/μL DNA模板、1.8μL超纯水；所述PCR扩增引物混合液包含每种引物浓度为0.5μM的所述引物组；
步骤2)中多重PCR扩增的反应程序为95℃2min；95℃30s，56℃30s，72℃60s，45个循环；72℃5min；
步骤3)中所述多重PCR扩增产物经SAP混液处理的反应体系是向每个反应孔加入2μL SAP混合液；所述SAP混合液中SAP酶0.3U、SAP Buffer 0.17μL，超纯水1.53μL；
步骤3)中所述SAP混液处理的反应程序为37℃40min；85℃5min；
步骤3)中所述延伸反应的反应体系是向每个处理后的反应孔加入2μL iPLEX延伸引物混合液；所述iPLEX延伸引物混合液中每条单碱基延伸引物的浓度为5～14μM；
步骤3)中所述延伸反应的反应程序为如下：
第一步：94℃30s；
第二部：94℃5s；5个内部循环：52℃5s，80℃5s；40个外部循环；
第三步：72℃3min。
本发明提供的扩增儿童个体化用药基因位点用引物组，是根据CIPC(国际临床药物基因组学实施联盟)，FDA(美国食品药品监督管理局)及EMA(欧盟药品管理局)所提供的用药指南为依据，结合HHS(美国卫生语人类服务部)的遗传药理学知识库pharmGKB所收录的药物临床研究数据，依照我国《药物代谢酶和药物作用靶点基因检测技术指南(试行)》，且针对中国人的实验数据设计并优化出一种涵盖儿童常用药种类全面、检测基因位点置信等级高、无冗余及无效位点的全面、可信、低成本的儿童安全用基因扩增引物组。所述引物组能够同时扩增涉及122种基因靶向药物、32种药物有效成分的31个用药相关基因的42个SNP位点的片段，具有较高的特异性。
本发明提供了一种检测儿童个体化用药基因位点多态性用引物组，包括所述引物组和核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:85～SEQ ID NO:126所示的单碱基延伸引物。所述引物组具有以下优点：1)涵盖儿童常用药种类、药品有效成分多，包括122种药物、32种药物有效成分的用药；2)涵盖的基因、SNP位点数量多，包括31个基因、42个SNP位点；3)基因位点的置信等级高，依据遗传药理学知识库(pharmGKB)数据，本检测方法中涉及的42个SNP位点，置信等级1级的由15个，2级的有16个，3级的有10个，4级的有1个；4)针对中国人自己的基因数据库进行基因位点设计和优化；5)该方法灵敏度高，仅需1ng DNA即可实现，广泛适用于血卡、口腔试子等微量DNA样本；6)检测效率高，一次实验可检测384个样本，全部实验流程5小时内完成；7)通量高，通过Agena核酸质谱分析仪，仅需一次可实现42个位点的检测。
附图说明
图1为本发明中一个样本中所有目标SNP位点的检测结果图谱。
具体实施方式
本发明提供了一种扩增儿童个体化用药基因位点用引物组，包括核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:84所示的引物。本发明提供了一种检测儿童个体化用药基因位点多态性用引物组，包括所述引物组和核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:85～SEQ IDNO:126所示的单碱基延伸引物。本发明对所述引物组的来源没有特殊限制，采用本领域所熟知的人工合成的方法即可。在本发明实施例中，所述引物组委托生工生物工程(上海)股份有限公司公司合成。各引物序列与扩增的基因SNP位点对应关系见表1。
表1 SNP位点的PCR扩增引物序列和单碱基延伸引物序列
本发明提供了一种检测儿童个体化用药基因位点多态性用试剂盒，包括所述扩增儿童个体化用药基因位点用引物组或所述检测儿童个体化用药基因位点多态性用引物组。所述试剂盒优选还包括PCR扩增缓冲液、SAP混液、单碱基延伸反应液。在本发明中，所述PCR扩增缓冲液、SAP混液、单碱基延伸反应液均可来自Complete iPLEX Gold GenotypingReagent Set 10*384(Agena，10148-2)试剂盒。
本发明提供了所述扩增儿童个体化用药基因位点用引物组、所述检测儿童个体化用药基因位点多态性用引物组或所述检测儿童个体化用药基因位点多态性用试剂盒在检测儿童个体化用药基因位点多态性中的应用。
在本发明中，儿童用药相关基因与SNP位点对应关系见表2。
表2儿童用药相关基因与SNP位点对应关系
本发明提供了一种儿童个体化用药基因位点多态性的检测方法，包括以下步骤：
1)提取待检测样品的基因组DNA；
2)以所述基因组DNA为模板，用所述引物组进行多重PCR扩增，得到多重PCR扩增产物；
3)将所述多重PCR扩增产物经SAP混液处理，再在所述引物组中单碱基延伸引物作用下进行延伸反应，得到延伸产物；
4)将所述延伸产物进行脱盐处理，得到脱盐的延伸产物；
5)将所述脱盐的延伸产物进行MALDI-TOF MS基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱分析，得到儿童个体化用药基因位点多态性。
本发明提取待检测样品的基因组DNA。
本发明对提取样品DNA的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的DNA提取方法即可，例如试剂盒法。本发明对所述待测样品的形式没有特殊限制，采用本领域所熟知的待测样品形式即可，例如唾液/咽拭子。
得到样本基因组DNA后，本发明以所述基因组DNA为模板，用所述引物组进行多重PCR扩增，得到多重PCR扩增产物。
在本发明中，多重PCR扩增的反应体系优选为5μL，10×PCR Buffer(含20mMMgCl2)0.5μL、25mM MgCl2 0.4μL、5U/μL PCR酶0.2μL、25mM dNTP 0.1μL、1μLPCR扩增引物混合液、1μL 10ng/μL DNA模板、1.8μL超纯水；所述PCR扩增引物混合液包含每种引物浓度优选为0.5μM的所述引物组。所述多重PCR扩增的反应程序为95℃2min；95℃30s，56℃30s，72℃60s，45个循环；72℃5min。本发明对所述多重PCR扩增所用的仪器不做特殊限制，采用本领域常规的PCR仪即可。
得到多重PCR扩增产物，本发明将所述多重PCR扩增产物经SAP混液处理，再在所述引物组中单碱基延伸引物作用下进行延伸反应，得到延伸产物。
在本发明中，所述多重PCR扩增结束后，向每个反应孔中加2μL SAP混液。所述处理优选采用液体处理器完成。所述处理的条件为37℃40min；85℃5min。用SAP混液处理的作用是去除反应体系中多余的引物以及dNTPs。
在本发明中，所述延伸反应的反应体系是向每个处理后的反应孔加入2μL iPLEX延伸引物混合液；所述iPLEX延伸引物混合液中每条单碱基延伸引物的浓度为5～14μM。所述延伸反应的反应程序为94℃30s，{94℃5s，(52℃5s，80℃5s)5个内部循环}40个外部循环，72℃3min。
得到延伸产物后，本发明将所述延伸产物进行脱盐处理，得到脱盐的延伸产物。
本发明对所述脱盐处理的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的脱盐处理方法即可，例如采用树脂进行脱盐。
得到脱盐的延伸产物后，本发明将所述脱盐的延伸产物进行MALDI-TOF MS基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱分析，得到儿童个体化用药基因位点多态性。
在本发明中，将所述脱盐的延伸产物预先点样至SpectroCHIP芯片上。本发明对所述点样的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的点样方法即可，例如采用MassARRAYTMNanodispenser RS 1000/Fusio(RS1000/Fusio点样仪)或自备点样仪将样本点到SpectroCHIP(芯片)上。将点样后的SpectroCHIP芯片置于MassARRAY TyperWorkstation MA4或Compact上进行质谱分析。在质谱分析中，FlexControl和SpectroAcquire的参数要设定为iPLEXGold(iPLEX.par)。采用上述质谱分析，得到每个SNP位点的基因型的结果峰高比例清晰，彼此分离，互相无相交，表明本发明的引物特异性和重复性良好。为了验证本发明质谱分析结果各基因SNP位点基因型的正确性，本发明还同时进行Sanger测序法进行测序，比对两种测序得到的基因型结果，结果表明，10例随机样本检测结果与Sanger测序法结果完全一致，显示本发明所述的检测体系结果准确性为100％。
在本发明中，通过检测122种药物、32种药物有效成分的31个用药相关基因的42个SNP位点的基因型，准确得到各SNP位点基因类型，为后续进一步指导儿童用药提供了基础。
下面结合实施例对本发明提供的一种扩增儿童个体化用药基因位点用引物组、检测用引物组及其应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
1.唾液/咽拭子等DNA提取
用百泰克口腔拭子基因组DNA提取试剂盒进行10个唾液/咽拭样本的DNA提取，具体步骤如下：在GW1和GW2试剂中按照说明书指导加入一定量的无水乙醇。从采样管中取500μL唾液样本，加入300μL GR、20μL Proteinase K和300μL GL，震荡混匀，56℃震荡孵育15min，加入300μL无水乙醇，震荡混匀；将750μL上述制备的混合溶液加入到收集管的吸附柱中，12000rpm离心1min，弃液；向吸附柱中加入400μL GW1，12000rpm离心1min，弃液；向吸附柱中加入400μL GW2，12000rpm离心1min，弃液；12000rpm离心2min，静置晾干；将吸附柱置于新的1.5mL离心管中，悬空加入40μL GE，静置5min，12000rpm离心1min，收集DNA溶液，质检，4℃保存。
2.目标片段的PCR扩增及延伸反应
2.1配制0.5μM(每条引物)多重PCR扩增引物混合液，里面包含扩增用引物组中每个SNP位点的正向(F)和反向(R)引物。配制多重PCR扩增反应体系：10×PCR Buffer(含20mMMgCl2)0.5μL、25mM MgCl2 0.4μL、5U/μL PCR酶0.2μL、25mM dNTP 0.1μL、1μL PCR扩增引物混合液、1μL 10ng/μL DNA模板、1.8μL超纯水。
2.2多重PCR扩增引物混合液配制完成后，向每个反应孔中添加5μL的反应体系，用膜把板封好，涡旋震荡和离心。
2.3将384孔板放上PCR仪进行以下热循环：
1)95℃，2分钟；
2)45个循环：
95℃，30秒；
56℃，30秒；
72℃，60秒；
3)72℃，5分钟；
4)4℃保温。
3.SAP反应
3.1每一个反应孔加入2μl SAP混液，然后在37℃40min；85℃5min。完成后，用膜把板封好，涡旋震荡和离心。
3.2将384孔板放上PCR仪，根据下表3配制终浓度为5～14μM iPLEX延伸引物混合物。
表3 iPLEX延伸引物混合物各单碱基延伸引物的浓度
3.6根据计算达到工作浓度所需的超纯水的体积，配制iPLEX延伸混液。
3.7每一个反应孔中加入2μl iPLEX延伸混液并混好。完成后，用膜把板封好，涡旋震荡和离心。
3.8进行延伸反应，反应程序为94℃30s，{94℃5s，(52℃5s，80℃5s)5个内部循环}40个外部循环，72℃3min。
4脱盐处理
4.1把洁净树脂铺平在384/6mg dimple plate上，风干最少10分钟。
4.2在延伸反应后的样本板每个反应孔里加入16μL水。完成后，用膜把板封好，涡旋震荡和离心。
4.3加入6mg洁净树脂：轻轻将样本板凌空反转，放在步骤4.1中已放树脂的dimpleplate上，然后将所述dimple plate连样本板一起反转(过程中两快板不可水平移动)，让树脂掉到孔里。用膜把板封好，放在旋转器上颠倒摇匀15分钟。以3200g(标准板离心机的2000rpm)的离心力将样本板离心5分钟。
5.点样
用点样仪将延伸产物点到SpectroCHIP(芯片)上。
6MALDI-TOF MS基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱
将点样后的芯片放到MassARRAY Typer Workstation MA4里打质谱，FlexControl和SpectroAcquire的参数要设定为iPLEXGold(iPLEX.par)，得到各样本的质谱图。
本发明将相同样本送至Sanger测序，本发明10个检测样本的测序方法与Sanger测序的比对结果见表3。
表3儿童用药相关基因SNP分型比对结果
/>
表3(续)儿童用药相关基因SNP分型比对结果
/>
由表3结果显示，10例随机样本检测结果与Sanger测序法结果完全一致，显示本发明所述的检测体系结果准确性为100％。图1为一个样本中一个样本中所有目标SNP位点的检测结果图谱。图1中显示，每个基因型的结果峰高比例清晰，彼此分离，互相无相交，表明本发明的引物特异性和重复性良好。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 北京市理化分析测试中心
<120> 一种扩增儿童个体化用药基因位点用引物组、检测用引物组及其应用
<160> 126
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
acgttggatg cctggtgaca ggaaaactca 30
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
acgttggatg aacccaggct ctgtgaccat 30
<210> 3
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
acgttggatg cagtgagctt cctcttgaac 30
<210> 4
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
acgttggatg tttctccctc acaaccttgc 30
<210> 5
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
acgttggatg gactgtaagt ggtttctcag 30
<210> 6
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
acgttggatg aacatcagga ttgtaagcac 30
<210> 7
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
acgttggatg gactggcgat tgtctagagc 30
<210> 8
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
acgttggatg agcagcatac ccctagggac 30
<210> 9
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
acgttggatg tttctctctc cggatgtgtg 30
<210> 10
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
acgttggatg aagcgcccag gagtcaaaac 30
<210> 11
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
acgttggatg gacccagcat cgacaatgta 30
<210> 12
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
acgttggatg caaatacagc actggcatgg 30
<210> 13
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
acgttggatg ttgactggaa gaagcaggtg 30
<210> 14
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
acgttggatg ctggcgtttt gcaaacatac 30
<210> 15
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
acgttggatg agagtagaac atcatgggac 30
<210> 16
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
acgttggatg tggttttcta gctggcagag 30
<210> 17
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
acgttggatg cactttccag tacacttacc 30
<210> 18
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
acgttggatg accctcctca agtatacttc 30
<210> 19
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
acgttggatg gtcagtctcc caattattgc 30
<210> 20
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
acgttggatg cgagaacgga ggtagctttt 30
<210> 21
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
acgttggatg actgtataca gcatggttcc 30
<210> 22
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
acgttggatg caatttgtca ctgttcctcc 30
<210> 23
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
acgttggatg tgtcacaggt cactgcatgg 30
<210> 24
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
acgttggatg atgcaagaca ggagccacat 30
<210> 25
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
acgttggatg aagatgttgg agacgtctgc 30
<210> 26
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
acgttggatg cctgccaaag aagaaacacc 30
<210> 27
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
acgttggatg tgctcctggt ggacctgatg 30
<210> 28
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
acgttggatg tggaagtcca catgcagcag 30
<210> 29
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
acgttggatg aagaagtgga ctggtttgag 30
<210> 30
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
acgttggatg atcgtgcctt cacccaattc 30
<210> 31
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
acgttggatg acaacctaat gggcacttcc 30
<210> 32
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
acgttggatg ctgtgtgttc ctcttgaggg 30
<210> 33
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
acgttggatg tctccagctc aatctggtgc 30
<210> 34
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
acgttggatg tcagcgacga gctccgtga 29
<210> 35
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
acgttggatg tccatcgatt cttggtgttc 30
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<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
acgttggatg gcaataattt tcccactatc 30
<210> 37
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
acgttggatg agactcgcta gtcagtaaag 30
<210> 38
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
acgttggatg aaatggcaca tgtcatcctg 30
<210> 39
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
acgttggatg atgagagaca tgacgatgcc 30
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
acgttggatg gaacggcagc gccttcttg 29
<210> 41
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
acgttggatg ttctgtcccg agtatgctct 30
<210> 42
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
acgttggatg agagaacagg tcagccacca 30
<210> 43
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
acgttggatg ttctcacagg tatgtacatc 30
<210> 44
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 44
acgttggatg ttcttttcag tgtccactgc 30
<210> 45
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
acgttggatg gtaggtacaa agagcctatc 30
<210> 46
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 46
acgttggatg ctcttcgcac tttcagagtc 30
<210> 47
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 47
acgttggatg atgatgtgcc tttcttgatg 30
<210> 48
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 48
acgttggatg ggaggggtta atagagagag 30
<210> 49
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 49
acgttggatg cctaacgaga tagtgaggag 30
<210> 50
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 50
acgttggatg tatctggcaa ccctaacctc 30
<210> 51
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 51
acgttggatg agttgaacag ggccctgaag 30
<210> 52
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 52
acgttggatg ccatgttacg acttgtctcc 30
<210> 53
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 53
acgttggatg ctaggagcct tggaatggac 30
<210> 54
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 54
acgttggatg tgcctcatca gtgttttcgg 30
<210> 55
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 55
acgttggatg ctcatcccac aagttgccat 30
<210> 56
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 56
acgttggatg cagcctggct gatgagtaag 30
<210> 57
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 57
acgttggatg acaaagcggg aactgggaag 30
<210> 58
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 58
acgttggatg acggctttgt ccaagagacc 30
<210> 59
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 59
acgttggatg caaagggtac ctggacgac 29
<210> 60
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 60
acgttggatg cattctccac atagaggacg 30
<210> 61
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 61
acgttggatg tgacatggag ggagcttacc 30
<210> 62
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 62
acgttggatg tgcccaagga aaaacgtgag 30
<210> 63
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 63
acgttggatg tcgtgcctgt cgtgtactga 30
<210> 64
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 64
acgttggatg agcgcggagt gcaattcaac 30
<210> 65
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 65
acgttggatg gagggatagg aaattgccag 30
<210> 66
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 66
acgttggatg agagtgacag gaaggtcaga 30
<210> 67
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 67
acgttggatg ttgagttcca gccccaaaac 30
<210> 68
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 68
acgttggatg aacaggccct gtgtaagaac 30
<210> 69
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 69
acgttggatg agcatgattc ctggactgcg 30
<210> 70
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 70
acgttggatg cctgttccac tttctttgat g 31
<210> 71
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 71
acgttggatg acgttccggt caaagtctcc 30
<210> 72
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 72
acgttggatg tggcctgctt gctgttctta 30
<210> 73
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 73
acgttggatg tctcaccttc tccatctctg 30
<210> 74
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 74
acgttggatg agctggatga gctgctaact 30
<210> 75
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 75
acgttggatg caaatttgtg tcttctgttc 30
<210> 76
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 76
acgttggatg ggatttgagc tgaggtcttc 30
<210> 77
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 77
acgttggatg tgcatacctg tgggctatgg 30
<210> 78
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 78
acgttggatg agcagtgggg tgaaaatacg 30
<210> 79
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 79
acgttggatg attgttggcc tgcacctctg 30
<210> 80
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 80
acgttggatg caactcaaca cccaaggagc 30
<210> 81
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 81
acgttggatg acagggtaac tgcttaggac 30
<210> 82
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 82
acgttggatg actgttctcc gtaccttcac 30
<210> 83
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 83
acgttggatg tatggagtag ggtcacccac 30
<210> 84
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 84
acgttggatg catgacgctg cggaattttg 30
<210> 85
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 85
tctcctcccg ctgac 15
<210> 86
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 86
acggtcctca atgctc 16
<210> 87
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 87
ctggccttac ctggat 16
<210> 88
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 88
gactctctcc ctccctg 17
<210> 89
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 89
ggcaccctgt tgtggat 17
<210> 90
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 90
acgtaattcc tgccgtca 18
<210> 91
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 91
gtggagattc tcaacaga 18
<210> 92
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 92
ggacagagaa atccgatg 18
<210> 93
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 93
cttaccatgt tacgacttg 19
<210> 94
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 94
ccccgaccga gtgtgtcttc 20
<210> 95
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 95
catggttcca atttgggtga 20
<210> 96
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 96
gcttgtgggg agaaggtcaa 20
<210> 97
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 97
gactcaaaat cttcaattgt t 21
<210> 98
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 98
ccccagctgg gctgcacgct ac 22
<210> 99
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 99
aacgcaattg gagactggtt at 22
<210> 100
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 100
agaatgggca acagaggttt tt 22
<210> 101
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 101
gggaggcagt ggggtgaaaa ta 22
<210> 102
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 102
gttaagtaat ttgttatggg ttcc 24
<210> 103
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 103
attttaatat gtatcgtgcc ccctc 25
<210> 104
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 104
cctccgtggt ccggcgcatg gcttc 25
<210> 105
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 105
ggggagcttc aatgatgaga acctg 25
<210> 106
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 106
ctaattggtt ttgaactctg cgttag 26
<210> 107
<211> 27
<212> DNA
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<400> 107
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gtattgagat tgttagatct atgtatt 27
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gaggggtgag gagttattgg accaaga 27
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<400> 110
cacaccgccc gtcac 15
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agttgccatg gtagc 15
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aacatctccc accccca 17
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cccgcgggtc caccacc 17
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gagctccccg aaggcg 16
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gattgccccg ccccctccc 19
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cattaggaga atttaccttt ccc 23
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 126
gaagagggct tcctcttgaa cac 23
Claims (8)
1.一种扩增儿童个体化用药基因位点用引物组，其特征在于，包括核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1~SEQ ID NO:84所示的引物。
2.一种检测儿童个体化用药基因位点多态性用引物组，其特征在于，包括权利要求1所述引物组和核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:85~SEQ ID NO:126所示的单碱基延伸引物。
3.一种检测儿童个体化用药基因位点多态性用试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述扩增儿童个体化用药基因位点用引物组或权利要求2所述检测儿童个体化用药基因位点多态性用引物组。
4.权利要求1所述扩增儿童个体化用药基因位点用引物组、权利要求2所述检测儿童个体化用药基因位点多态性用引物组在制备检测儿童个体化用药基因位点多态性的产品中的应用。
5.根据权利要求4所述应用，其特征在于，所述儿童个体化用药包括庆大霉素、链霉素、卡那霉素、妥布霉素、大观霉素、新霉素、巴龙霉素、小诺霉素、核糖霉素、奈替美星、阿司米星、依替米星、异帕米星、阿米卡星、西索米星、布洛芬混悬液、布洛芬缓释胶囊、芬必得、美林、布洛芬颗粒、右旋布洛芳胶囊、同泽安、右旋布洛芬混悬液、优舒芬、清芬、对乙酰氨基酚口服悬液、泰诺、泰诺林、对乙酰氨基翻片、扑热息痛、百服宁、必理通、优卡丹、代尔卡、保达琳、明感静、小儿氢酚黄那敏颗粒、护彤、小儿快克、双氯芬酸钠、双氯芬酸钠栓、扶他林、思孚欣、戴芬、奥尔芬、英太青、芬迪、可待因、联邦止咳露、奥亭、孟鲁司特钠片、顺尔宁、舒喘灵、喘乐宁、平喘灵、伏立康隆片、威凡、匹纳普、丽福康、美大康、依托红霉素、琥乙红霉素、利福平胶囊、异烟肼片、奥司他韦磷酸盐胶囊、利巴韦林口服液、利巴韦林分散片、利巴韦林注射液、二甲双胍片、盐酸二甲双胍缓释片、泰白、捷诺达、格华止、维生素E、咖啡因、卡马西平、卡马西平胶囊、卡马西平片、得理多、氟西汀、帕罗西汀、西酞普兰、氯雷他定口腔崩解片、息斯敏氯雷他定、泼尼松、强的松、去氢皮质素、布地奈德混悬液、普米克、信必可都保、乐冰和/或吉舒。
6.根据权利要求4所述应用，其特征在于，所述儿童个体化用药的有效成分包括氨基糖苷类抗生素、布洛芬、右旋布洛芬、对乙酰氨基酚、双氯芬酸钠、可待因、右美沙芬、孟鲁司特钠、沙丁胺醇、伏立康唑、红霉素、利福平、异烟肼、奥司他韦、利巴韦林、格列本脲、二甲双胍、维生素E、咖啡因、奥美拉唑、兰索拉唑、泮托拉唑、黄连素、卡马西平、苯妥英钠、地西泮、氟西汀、帕罗西汀、西酞普兰、氯雷他定、泼尼松和/或布地奈德。
7.根据权利要求4所述应用，其特征在于，所述基因包括MT-RNR1、CYP2C9、CYP2C8、PTGS2、UGT1A、TNFRSF11A、PLA2G4A、CYP2D6、SLCO2B1、ADRB2、CRHR2、COL22A1、CYP2C19、G6PD、ABCC2、NAT1、NAT2、CES1、IFNL3、IFNL4、SLC47A2、CYP4F2、ADORA2A、SCN1A、EPHX1、FKBP5、HTR1A、GRIK4、SLC22A1、CTLA4和/或CRHR1。
8.根据权利要求4~7任意一项所述应用，其特征在于，所述基因的SNP位点包括rs267606617、rs267606619、rs1799853、rs1057910、rs11572080、rs20417、rs10929303、rs1805034、rs12746200、rs16947、rs35742686、rs3892097、rs1065852、rs12422149、rs1042713、rs7793837、rs6988229、rs4244285、rs4986893、rs12248560、rs137852327、rs5030869、rs72554665、rs72554664、rs717620、rs1801280、rs1799930、rs200707504、rs12979860、rs8099917、rs2228570、rs12943590、rs2108622、rs2298383、rs3812718、rs1051740、rs4713916、rs6295、rs1954787、rs622342、rs4553808和/或rs1876828。
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