CN111118149B - 一种用于指导人癫痫疾病用药的试剂盒及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种用于指导人癫痫疾病用药的试剂盒及其应用，所述试剂盒可同时对33个基因位点进行分型，所述试剂盒包括用于扩增33个基因片段的33对扩增引物，所述33个基因位点如表格所示，所述33对扩增引物的序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.66所示。本发明在对大样本进行研究的基础上，提出一种全新的位点组合，实现从基因和遗传的角度对癫痫疾病的治疗提供准确的指导和及时的反馈；并且基于飞行时间质谱技术进行基因分型，对精心挑选的和癫痫用药最为相关的一些基因和变异位点进行中通量测序，因此可以大大降低检测时间与成本，而且仍然得到高度可靠的检测结果，从而使得本发明在临床上具有实际使用的价值。
Description
技术领域
本发明涉及试剂盒领域，更具体地涉及一种用于指导人癫痫疾病用药的试剂盒及其应用。
背景技术
精神疾病已经成为我国的高发疾病，据统计我国成年人中有超过17％的人深受抑郁症、精神分裂症等精神疾病的困扰。药物治疗是目前精神疾病的主要临床手段，但是仍然处于试误法(Trial and error)的阶段，药物疗效和不良反应也呈现出显著的个体差异。在癫痫症患者中，有30％～40％的患者在足量足疗程的抗癫痫症药物治疗后仍然受到相关症状的困扰。导致药物治疗出现巨大个体差异的原因，除了传统上的病理、生理、性别、年龄、身高、体重、依从性等方面外，遗传因素是影响药物反应差异的重要因素。近年来，药物基因组学得到了飞速发展，通过对药物疗效和不良反应的相关基因检测指导药物的选择和剂量调整，达到个体化治疗的目的。目前精神疾病的主要干预手段是药物治疗，对于临床医生来说如何合理地选择药物、剂量调整、临床监测以及合理地控制不良反应显得尤为重要。
目前，在美国食品药品监督管理局(FDA)批准的药品说明书中，已有超过200种药物被推荐进行药物基因组学生物标记物的检测，占据前3位的分别是抗肿瘤药物、精神类药物和心血管类药物。大量的临床数据也都显示了精神科开展个体化药学的紧要性和必要性，但在中国，精神类药物的药物相关基因检测一直没有在临床得到广泛的应用,随着个体化用药基因学检测的临床模式的建立，药物基因组学在指导临床合理用药中将发挥越来越重要的作用，其临床应用和普及将成为趋势。
癫痫是大脑神经元突发性异常放电，导致短暂的大脑功能障碍的一种慢性疾病。据中国最新流行病学资料显示，国内癫痫的总体患病率为7.0‰，年发病率为28.8/10万，1年内有发作的活动性癫痫患病率为4.6‰。据此估计中国约有900万左右的癫痫患者，其中500～600万是活动性癫痫患者，同时每年新增加癫痫患者约40万，在中国癫痫已经成为神经科仅次于头痛的第二大常见病。有证据显示，γ-氨基丁酸(GABA)、谷氨酸盐、5-羟色胺、多巴胺等神经递质水平的变化，和癫痫的发作有较大的相关性，因此目前市场上主流的抗癫痫药物主要就是针对神经递质及各种离子通道设计的。但不同种类的癫痫具有不同的生物标志物，而且某些基因型的患者对于某种药物(如卡马西平)可能产生严重的不良反应；因此如何合理地选用药物，实现癫痫病的精准治疗，就是一个重要的课题。
癫痫基因检测目前面临的另外一大难题，就是某些基因的连锁位点较难通过少数几个关键SNP而加以“铆定”。其中比较典型的就是一些和人类组织相容性抗原(HLA)相关的基因位点。例如HLA-B*15:02的基因型在癫痫患者基因检测及用药指导套餐中地位非常重要，主要是因为其在东亚人群中阳性突变频率较高，阳性患者使用卡马西平等癫痫药物后出现剥脱性皮炎等副作用的可能性比阴性患者高出193-1300倍，严重的可以导致死亡；让问题更加复杂化的是，此前文献中曾广泛报道的对应于该基因型的两个标签SNP位点，rs2844682和rs3909184，后来有最新的文献证明实际上没有临床意义。在前期大量研发工作的基础上，本技术提供了经实践检测行之有效的引物进行PCR扩增，从而大大提高了检测的准确度。
目前市场上从事基因检测的公司很多，但大多数是针对肿瘤，使用的主流检测技术都是基于高通量的全基因组重测序(即对人基因组的全部约30亿个碱基全部重新测定，并和参考基因组进行比较，以确定变异位点)或全外显子组测序(测定人基因组上所有基因中可以表达为蛋白质的部分，即外显子的序列)技术；近年来使用大、中、小型基因位点组成的panel技术在肿瘤基因检测领域也开始得到一定程度的应用。相比之下，针对精神疾病进行基因检测及用药指导的产品不是很多。全基因组重测序和全外显子组测序技术虽然准确性较高，但检测成本和时间周期还不能满足临床需求：全基因组重测序每个样本的费用在1万元左右，全外显子组测序每个样本也要3000-4000元，因为检测的基因位点多，后续的生物信息分析需要较长时间，因此这两项技术都基本不可能在两个月内拿到结果，而临床精神疾病的基因检测需要反馈及时，医生及病人希望最多一周之内拿到结果。基于荧光定量PCR技术的基因分型技术虽然在时效性上可以满足，但是通量较低，每次检测仅能检测一个样本的一个位点，33个位点需要33个检测反应才能实现，这无疑也增加了检测成本。在样本量较多的情况下，荧光定量PCR技术的检测时间将会被大大延长，因而会丧失检测时效性的优势。
中国专利申请201910212576公开了一种用于抗癫痫药物用药指导的多重基因检测试剂盒及其使用方法。但是该试剂盒的最大缺陷在于检测的位点太少，由于其故意避开了卡马西平、奥卡西平等多个抗癫痫常用药物，因此实际上根本不能满足目前国内医院的需求；而他们这么做的原因，正是因为卡马西平、奥卡西平(也包括拉莫三嗪、苯妥英、苯巴比妥)等芳香烃类抗癫痫药物，都有较大可能出现剥脱性皮炎(Steven-Johnson综合征)等不良反应，有些还特别严重，可能导致死亡，所以美国食品药品监督局(FDA)在卡马西平的使用说明书中，明确用黑框警示了必须检测HLA的一些基因位点，最典型的就是HLA-B*15:02。该对比文件有意回避了这个问题，因此导致其实用性大打折扣。然而，就目前来说如何检测HLA-B*15:02在国际上至今还是个悬而未决的问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于指导人癫痫疾病用药的试剂盒及其应用，从而解决现有技术中全基因组重测序和全外显子组测序技术虽然准确性较高，但检测成本较高，时间周期较长，因此仍然缺乏适当的针对癫痫疾病进行基因检测及用药指导的产品的问题。
为了解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：
根据本发明的第一方面，提供一种用于指导人癫痫疾病用药的试剂盒，所述试剂盒可同时对33个基因位点进行分型，所述试剂盒包括用于扩增33个基因片段的33对扩增引物，所述33个基因位点以及针对这33个特定基因位点设计的33对扩增引物的序列具体如下，全部按5’-3’顺序书写，引物由Life公司合成。
1测序引物对一号(检测ABCB1基因中rs1045642位点)：A--->G(表示野生型为A，突变型为G，下同)
SEQ ID NO.1(上游引物，下同)：ACGTTGGATGTATGGAGACAACAGCCGGGT
SEQ ID NO.2(下游引物，下同)：ACGTTGGATGTAGGCAGTGACTCGATGAAG
2测序引物对二号(检测HLA-B基因中rs9262570位点)：C--->T
SEQ ID NO.3：ACGTTGGATGCCAGGTCAGACAGTTAGTAG
SEQ ID NO.4：ACGTTGGATGGCATGGGTTAAGGGCTTTAG
3测序引物对三号(检测HLA-B基因中rs1265110位点)：C--->T
SEQ ID NO.5：ACGTTGGATGGATATGGTCAGTGCTAAGTG
SEQ ID NO.6：ACGTTGGATGCTCAGGGTGGCTTCACTGG
4测序引物对四号(检测HLA-A基因中rs2860580位点)：G--->C
SEQ ID NO.7：ACGTTGGATGCTTTTCCCTGCTTCATTGTG
SEQ ID NO.8：ACGTTGGATGAGAAGTGGAAGCAAACCCGT
5测序引物对五号(检测CYP2C9基因中rs1057910位点)：C--->A
SEQ ID NO.9：ACGTTGGATGTGTCACAGGTCACTGCATGG
SEQ ID NO.10：ACGTTGGATGATGCAAGACAGGAGCCACAT
6测序引物对六号(检测HLA-A基因中rs9380151位点)：T--->C
SEQ ID NO.11：ACGTTGGATGCAGTTCTGTCCATGTTAGTG
SEQ ID NO.12：ACGTTGGATGAGACAGGGAATCAACCTAAC
7测序引物对七号(检测CYP2C19基因中rs4986893位点)：A--->G
SEQ ID NO.13：ACGTTGGATGGACTGTAAGTGGTTTCTCAG
SEQ ID NO.14：ACGTTGGATGAACATCAGGATTGTAAGCAC
8测序引物对八号(检测SH2B1基因中rs3888190位点)：C--->A
SEQ ID NO.15：ACGTTGGATGCCCAGCTGCATTGAATTTCC
SEQ ID NO.16：ACGTTGGATGTGAGGAAAGGGACAGGTGAG
9测序引物对九号(检测HLA-B基因中rs9295863位点)：C--->A
SEQ ID NO.17：ACGTTGGATGTGCTGTAATATCTCCCCCCA
SEQ ID NO.18：ACGTTGGATGAGGGAGACATGGGATCAGAG
10测序引物对十号(检测HLA-B基因中rs144012689位点)：A-->T
SEQ ID NO.19：ACGTTGGATGCAGGTAGAAGTGTTCCCTGC
SEQ ID NO.20：ACGTTGGATGACATGTGCTGCACAAAAGAG
11测序引物对十一号(检测UGT1A4基因中rs2011425位点)：G--->T
SEQ ID NO.21：ACGTTGGATGTGTTGGTGGTGCCCACTGAT
SEQ ID NO.22：ACGTTGGATGATTCACCTCTGGGGTGAGGA
12测序引物对十二号(检测INSR基因中rs2396185位点)：C--->A
SEQ ID NO.23：ACGTTGGATGGGGAACTTGTTGTATCCACG
SEQ ID NO.24：ACGTTGGATGGCCATTACGTTTCAGAGTAG
13测序引物对十三号(检测POLG基因中rs3087374位点)：C--->A
SEQ ID NO.25：ACGTTGGATGAGCAAATACAGAGCCTCCAG
SEQ ID NO.26：ACGTTGGATGTTGAACTCACCAAAGGCTCC
14测序引物对十四号(检测HLA-B基因中rs4711240位点)：T--->C
SEQ ID NO.27：ACGTTGGATGTGAGGCTTAAAGCACCCAAC
SEQ ID NO.28：ACGTTGGATGGTTCCTGGCTTATAATTCCC
15测序引物对十五号(检测HLA-B基因中rs2524160位点)：G--->A
SEQ ID NO.29：ACGTTGGATGCACAGCAGTAGCTAGTAGTT
SEQ ID NO.30：ACGTTGGATGCCATGTGAGTGGTTCAAATC
16测序引物对十六号(检测SCN1A基因中rs2298771位点)：C--->T
SEQ ID NO.31：ACGTTGGATGAGAAAGACAGTTGTATGTCC
SEQ ID NO.32：ACGTTGGATGGCCAGTTCCTATACCACTTG
17测序引物对十七号(检测SCN1A基因中rs3812718位点)：C--->T
SEQ ID NO.33：ACGTTGGATGCTCTTCGCACTTTCAGAGTC
SEQ ID NO.34：ACGTTGGATGGTAGGTACAAAGAGCCTATC
18测序引物对十八号(检测HLA-B基因中rs6928038位点)：G--->A
SEQ ID NO.35：ACGTTGGATGTACGGCAGGATCCGAGAACA
SEQ ID NO.36：ACGTTGGATGTCTGAGCCCATGGCAGAGAC
19测序引物对十九号(检测SCN2A基因中rs17183814位点)：A--->G
SEQ ID NO.37：ACGTTGGATGGCAATGCGTTGTTCAATAGC
SEQ ID NO.38：ACGTTGGATGGCAGGATGAAAAGATGGCAC
20测序引物对二十号(检测HLA-A基因中rs2523756位点)：G--->A
SEQ ID NO.39：ACGTTGGATGAGTCCCACCTCACCTGTAGA
SEQ ID NO.40：ACGTTGGATGGGCAGAACCACAGTGTTTAG
21测序引物对二十一号(检测HLA-A基因中rs396660位点)：T--->C
SEQ ID NO.41：ACGTTGGATGTCCACACTGCAGACAATACC
SEQ ID NO.42：ACGTTGGATGACAGGCAACTGCTATACTAC
22测序引物对二十二号(检测CYP2C19基因中rs12248560位点)：C--->A
SEQ ID NO.43：ACGTTGGATGCGTGGCGCATTATCTCTTAC
SEQ ID NO.44：ACGTTGGATGAACAAAGTTTTAGCAAACG
23测序引物对二十三号(检测ABCB1基因中rs2032582位点)：C--->A
SEQ ID NO.45：ACGTTGGATGTGCAATAGCAGGAGTTGTTG
SEQ ID NO.46：ACGTTGGATGCATATTTAGTTTGACTCACC
24测序引物对二十四号(检测CPS1基因中rs1047891位点)：C--->A
SEQ ID NO.47：ACGTTGGATGCTGGGATTCTGTCCTTCTTG
SEQ ID NO.48：ACGTTGGATGCACATCAGACTGGCTCAACG
25测序引物对二十五号(检测UGT1A7基因中rs2741049位点)：C--->T
SEQ ID NO.49：ACGTTGGATGGTCCAGCCCAATACTAGATT
SEQ ID NO.50：ACGTTGGATGCCCAGAGGAAATGGTCTTAG
26测序引物对二十六号(检测GSK3B基因中rs334558位点)：G--->A
SEQ ID NO.51：ACGTTGGATGTTCCTTTGTCACTTGGCCCG
SEQ ID NO.52：ACGTTGGATGAGACAGCGCTCCTCACACAG
27测序引物对二十七号(检测HLA-A基因中rs2442736位点)：C--->G
SEQ ID NO.53：ACGTTGGATGGCTGAGAGGAACCTGGAGA
SEQ ID NO.54：ACGTTGGATGTCAGTATGTCTCCCCCAGGT
28测序引物对二十八号(检测HLA-B基因中rs2074491位点)：T-->C
SEQ ID NO.55：ACGTTGGATGCCATGACCCGCATCTCGGC
SEQ ID NO.56：ACGTTGGATGTCTAGAGAAGCCAATCAGCG
29测序引物对二十九号(检测HLA-A基因中rs1061235位点)：T-->A
SEQ ID NO.57：ACGTTGGATGTTCCTGCCCTTCCCTTTGTG
SEQ ID NO.58：ACGTTGGATGCCTCCTCACATTATGCCTAC
30测序引物对三十号(检测HLA-A基因中rs3823318位点)：C--->G
SEQ ID NO.59：ACGTTGGATGGCCAAGTACCTGAACATCTG
SEQ ID NO.60：ACGTTGGATGCTCCTGATCTATCGACAGAC
31测序引物对三十一号(检测CYP3A4基因中rs67666821位点)：DEL--->T
SEQ ID NO.61：ACGTTGGATGGTGCCATCCCTTGACTCAAC
SEQ ID NO.62：ACGTTGGATGTTAACTGTTGCAGATCCCCC
32测序引物对三十二号(检测CYP2C19基因中rs4244285位点)：G--->C
SEQ ID NO.63：ACGTTGGATGGCAATAATTTTCCCACTATC
SEQ ID NO.64：ACGTTGGATGTCCATCGATTCTTGGTGTTC
33测序引物对三十三号(检测HLA-B基因中rs10484555位点)：T-->C
SEQ ID NO.65：ACGTTGGATGCACTCCTGAAGTGAAAACTC
SEQ ID NO.66：ACGTTGGATGATCCCAAGATAATCCACGGC
根据本发明，该试剂盒还优选包括用于鉴定这33个基因片段突变的33条延伸引物，针对这33个特定基因位点设计的33条延伸引物的序列具体如下，全部按5’-3’顺序书写，引物由Life公司合称。
SEQ ID NO.67：CTTTGCTGCCCTCAC
SEQ ID NO.68：CTGGGGTCAGACTGC
SEQ ID NO.69：CTGGGCCCTCTAATAC
SEQ ID NO.70：ccACCCGTCCTTCTTCA
SEQ ID NO.71：ACGAGGTCCAGAGATAC
SEQ ID NO.72：CAACCTAACTGTCCATCA
SEQ ID NO.73：TATTGTAAGCACCCCCTG
SEQ ID NO.74：CCAGATGGAAGAGGGCTC
SEQ ID NO.75：ATGGGATCAGAGATCAAG
SEQ ID NO.76：TTCTGAGTTAGCCCCTGTG
SEQ ID NO.77：CCCTTCATGGAGCTCCCGCA
SEQ ID NO.78：ACAGCAAAAGTTAGCTGATA
SEQ ID NO.79：GACGTGGAAAAACGAAGCCA
SEQ ID NO.80：GGGACCATTGCCCTTGTTACC
SEQ ID NO.81：TTGTTTCAAATCTCCTCCCCAA
SEQ ID NO.82：GAGAGATCTTTCCCAATTTCTG
SEQ ID NO.83：CCTATCCTTTACTCTAATCACTT
SEQ ID NO.84：AGGATCAGTGCCTGTGATAGAGA
SEQ ID NO.85：ACGAAAGCTTCCGCTTCTTTACCA
SEQ ID NO.86：GGGAAACAGTGTTTAGGGCCTGCC
SEQ ID NO.87：CCCATATACTACAGTAGTCAACCTG
SEQ ID NO.88：TTATGTGTGTCTTCTGTTCTCAAAG
SEQ ID NO.89：CCCTCTAGTTTGACTCACCTTCCCAG
SEQ ID NO.90：GGCTAAACGCCAACAATGTCCCTGCCA
SEQ ID NO.91：GTACTTTAGGTATATACAATATCTAATG
SEQ ID NO.92：CTCACACAGAGCAGC
SEQ ID NO.93：GGACAGGTGGAGGCT
SEQ ID NO.94：CCGCAGTCCCGGTTCT
SEQ ID NO.95：AGAAACAAAGTCAGGGT
SEQ ID NO.96：CATGATGATGCACACAAT
SEQ ID NO.97：GACTTCTTCAACCAGAAAAA
SEQ ID NO.98：AGTAATTTGTTATGGGTTCC
SEQ ID NO.99：GGCTTTATAATATGTCTCTCTAT
根据本发明，优选地，所述试剂盒的PCR扩增的反应体系如下：
根据本发明，优选地，所述试剂盒还包括SAP反应体系，所述SAP反应体系如下：
SAP缓冲液 0.17μL
SAP酶 0.5U
纯水 补齐至2μL。
根据本发明，优选地，所述扩增引物SEQ ID No.1～SEQ ID No.18，SEQ ID No.21～SEQ ID No.30，SEQ ID No.33～SEQ ID No.48，SEQ ID No.51～SEQ ID No.66在反应体系中的摩尔浓度均为0.2～0.6μM，SEQ ID No.19～SEQ ID No.20在反应体系中的摩尔浓度为0.8～1.2μM，SEQ ID No.31～SEQ ID No.32在反应体系中的摩尔浓度为0.4～1.0μM，SEQID No.49～SEQ ID No.50在反应体系中的摩尔浓度为0.9～1.3μM。
应当知晓的是，任何基于MassArray的试剂盒都一定少不了延伸引物，但是延伸引物的重要性又相对不及扩增引物，根据本发明提供的试剂盒，其最主要的发明点还是在于对基因位点的选择以及扩增引物的设计，次要发明点才是对延伸引物的设计，从而最终实现从基因和遗传的角度对癫痫疾病的治疗提供最准确的指导和及时的反馈。
根据本发明，优选地，所述试剂盒采用飞行时间质谱仪进行检测。本发明采用的检测方法为核酸飞行质谱。如图1所示，首先通过多重PCR在一个体系内同时扩增目标序列，然后加入SNP序列特异延伸引物，在SNP位点上，延伸1个碱基。将制备的样品分析物与芯片基质共结晶后在质谱仪的真空管经强激光激发，核酸分子解吸附为单电荷离子，电场中离子飞行时间与离子质量成反比，通过检测核酸分子在真空管中的飞行时间而获得样品分析物的精确分子量，从而检测出SNP位点信息。
根据本发明的第二方面，还提供一种用于指导人癫痫疾病用药的试剂盒在制备用于指导人癫痫疾病用药的试剂中的应用。
根据本发明提供的试剂盒，可用于CYP2C19，CYP2C9，CYP3A4，ABCB1，CPS1，GSK3B，HLA-A，HLA-B，INSR，POLG，SCN1A，SCN2A，SH2B1，UGT1A4，UGT1A7等15个基因共33个突变位点(rs1045642，rs9262570，rs1265110，rs2860580，rs1057910，rs9380151，rs4986893，rs3888190，rs9295863，rs144012689，rs2011425，rs2396185，rs3087374，rs4711240，rs2524160，rs2298771，rs3812718，rs6928038，rs17183814，rs2523756，rs396660，rs12248560，rs2032582，rs1047891，rs2741049，rs334558，rs2442736，rs2074491，rs1061235，rs3823318，rs67666821，rs4244285，rs10484555)的同时定性检测。本品检测结果仅代表上述这33个基因位点的分型结果，为医生临床个体化用药提供参考。
其中，CYP3A4基因和卡马西平、唑尼沙胺的代谢及清除有关联；癫痫患者使用丙戊酸系列抗癫痫药物时，其剂量需要参考CYP2C9的基因型；FDA批准的拉考沙胺使用说明书指出，CYP2C19慢代谢型患者使用该药时，其血浆中该药代谢产物O-去甲拉考沙胺的浓度比广泛代谢型患者降低70％。SCN1A和SCN2A是与癫痫综合征相关的最重要的两个基因，分别编码电压门控钠离子通道α1和α2亚基，这两个基因上的突变位点分别和卡马西平、苯妥英、苯巴比妥、左乙拉西坦等药物的疗效有关。ABCB1基因上的rs2032582位点突变，可能导致患者对苯妥英、丙戊酸等药物没有应答；该基因rs1045642、rs2032582位点突变，可能导致对苯巴比妥形成抗性。CPS1基因变异患者服用丙戊酸后，可能出现尿素循环代谢病，引起严重的高血氨症。GSK3B基因变异可能导致癫痫或双相情感障碍患者对锂盐治疗缺乏应答，SH2B1基因变异可能导致患者服用锂盐后血液中葡萄糖和低密度脂蛋白浓度过低。INSR变异患者服用托吡酯后有可能出现体重异常下降现象。POLG变异患者服用丙戊酸后可能产生肝毒性。UGT1A4和UGT1A7分别与拉莫三嗪、奥卡西平的应答相关。
但癫痫类药物潜在最大的副作用，还是剥脱性皮炎或称Steven-Johnson综合征(SJS/TEN)以及DRESS综合征(伴嗜酸粒细胞增多和系统症状的药疹)。芳香烃类抗癫痫药物(AEDs，也就是说药物化学结构中含有苯环)，包括卡马西平、奥卡西平、拉莫三嗪、苯妥英、苯巴比妥等，发生上述两类严重副作用的可能性很高。而人类组织相容性抗原(HLA)中的一些基因型，如HLA-A*31:01，HLA-A*02:07，HLA-A*11:01，HLA-B*38:01，HLA-B*15:02，HLA-B*51:01，HLA-B*58:01等，都被报道过和AEDs引起的SJS/TEN或者DRESS综合征相关。其中特别是HLA-B*15:02的基因型在癫痫患者基因检测及用药指导中地位非常重要，主要是因为其在东亚人群中阳性突变频率较高，阳性患者使用卡马西平等癫痫药物后出现剥脱性皮炎等副作用的可能性比阴性患者高出193-1300倍，严重的可以导致死亡；让问题更加复杂化的是，此前文献中曾广泛报道的对应于该基因型的两个标签SNP位点，rs2844682和rs3909184，后来有最新的文献证明实际上没有临床意义。在前期大量文献调研及自主研发工作的基础上，我们确定了rs10484555、rs144012689、rs2524160这三个突变位点来代表HLA-B*15:02的基因型，并提供了经实践检测行之有效的引物进行PCR扩增，从而大大提高了检测的准确度。
虽然本发明所选择的位点是目前已有文献公开报道过与癫痫病用药相关的位点，但请注意的是，诸如HLA-B*15:02这种带*号的基因型，是由多个相互连锁的变异位点组合在一起形成的所谓“单倍体型”；以HLA-B*15:02为例来说，它们都属于HLA-B基因的HLA-B*15这种血清学特异等位基因型，所有HLA-B*15:02都编码相同的蛋白(也就是说，HLA-B*15:02和HLA-B*15:01，HLA-B*15:03等虽然基因型相同，但编码不同的蛋白)。HLA-B*15:02的核酸序列最长可以到1089bp，其中包含数十个可能的变异位点，这些变异位点的不同组合可以形成近5000种实际存在的不同的DNA序列。当然实际操作中是很难也没有必要全部检测这些位点的，我们总是希望能够用其中少数位点来代表整段序列。此前文献中曾广泛报道的用于代表该基因型的两个标签SNP位点，rs2844682和rs3909184，后来有最新的文献证明实际上没有临床意义。我们目前提出的新的位点组合是以前任何一篇文献中都没有提到过的，是我们自己通过大量实验摸索获得。
此外，本发明采用Agena Bioscience MassARRAY DNA质谱基因分析系统、ABSciex 5500MD液质串联(LC/MS/MS)三重四极杆质谱系统、ThermoFisher AppliedBiosystems 7500实时荧光定量PCR系统、西门子ADVIA Centaur CP型全自动化学发光免疫分析仪、迪瑞CS-600B全自动生化分析仪，还采用美国最大的精神科精准用药检测机构相同的检测设备——飞行时间质谱仪，确保了检测结果的准确性和灵敏度，简单可行。其优势具体如下：
(1)准确性高，直接检测待测物分子量，准确度超过99.9％；还可以检测PCR实验失败或三等位基因的存在；
(2)灵敏度高，检测窗口内，任何pmol级别的物质都能被检测出来；
(3)通量高，一张芯片上可同时完成384个样品的多重检测，每个反应孔可实现多达30重反应，每次最多能进行数万个基因型分析；
(4)灵活，一张芯片上，样本的数量和位置可以自由选择，同时样本和SNP位点的配对可以自由选择；
(5)质控严格，质谱技术是“一管式操作”，即反应体系在生化学实验过程中始终在一个试管内反应，避免了多次转移造成的人为误差。
(6)操作简单，完全改变传统测序等技术在基因检测中价格昂贵，耗时长，操作繁琐等劣势。
本发明的目的是通过对基因组上特定一组位点的基因型的检测，提供一种指导人癫痫等疾病精准用药的试剂盒，解决现有人癫痫基因检测分型成本高、时间周期长的问题：该试剂盒最高可同时检测379个人的样品，可以通过一个检测同时对一个人的15个基因的33个可变异位点进行分型，并进一步用于11种抗癫痫药或情感稳定剂(卡马西平、拉莫三嗪、奥卡西平、苯妥英、托吡酯、丙戊酸、苯巴比妥、左乙拉西坦、锂盐、唑尼沙胺、拉考沙胺)的个性化用药指导。同传统的基于全基因组重测序或全外显子组测序技术相比，本技术可以在2天之内得到结果，而后者一般需要两个月以上；检测成本也大幅度降低，从全基因组重测序每个样本的1万元左右，全外显子组测序每个样本3000-4000元，使用本发明提供的试剂盒针对每个样本的检测成本将下降到1000元以内。
本发明在通量上是荧光定量PCR的33倍，可以很好的解决在样本量较多时的效率问题。在成本方面据测算，使用荧光定量PCR，33个位点的检测成本约在4000元(包括人工和试剂耗材以及仪器损耗等成本)以上，而使用本技术的检测成本可以控制在1000元以内。本发明基于飞行时间质谱技术进行基因分型，是对精心挑选的和癫痫用药最为相关的一些基因和变异位点进行中通量测序，因此可以大大降低时间周期和检测成本，而且仍然得到高度可靠的检测结果，从而使得该技术在临床上具有实际使用的价值。
截至目前，上海康黎医学检验所已经对国内超过50,000例样本进行了检测，在精神类疾病，包括抑郁症、精神分裂症、焦虑症、癫痫、多动症、镇痛、镇静催眠等领域展开了研究。本发明正是通过对大样本的研究的基础上，建立了基于中国多民族、多地域和多病程的数据库，并在数据多态性的基础上开发出了这样一种效果良好的可用于临床用药指导的试剂盒，在基因和遗传的角度对精神类疾病的治疗提供准确的指导和及时的反馈。
综上所述，本发明在对大样本进行研究的基础上，提出了一种全新的位点组合，实现从基因和遗传的角度对癫痫疾病的治疗提供准确的指导和及时的反馈；本发明基于飞行时间质谱技术进行基因分型，是对精心挑选的和癫痫用药最为相关的一些基因和变异位点进行中通量测序，因此可以大大降低时间周期和检测成本，而且仍然得到高度可靠的检测结果，从而使得该技术在临床上具有实际使用的价值。
附图说明
图1是本发明的工作原理示意图。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明做进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限制本发明的范围。
有关试剂盒的详情说明
1.1主要组成成分
PCR反应混合液，Taq酶，扩增引物混合液，SAP Buffer，SAP Enzyme，单碱基延伸反应混合液，iPlex Enzyme，延伸引物混合液，ddH2O，阳性对照品，脱盐树脂，质谱芯片。
1.2储存条件及有效期
本品保存于-20℃，保质期9个月。
1.3配套仪器
通用PCR仪；DR MassArray。
1.4样本要求
本品适用于从口腔黏膜细胞、口腔脱落细胞、血液、组织和干血片中提取的基因组DNA，要求DNA A260/A280比值应介于1.8到2.0之间。冷冻DNA样本应在-20℃以下，并且避免反复冻融。
1.5检验方法
一、PCR反应
1)在PCRⅠ区，从-20℃冰箱中将各试剂(盒)取出，置于冰上(4℃)融解，再从4℃冰箱取出扩增引物，均涡旋震荡10s后简短离心，备用。
2)按表1依次加入相关试剂组分配置PCR反应混合液，并做好标记、分装至96孔板中，3μL/孔；分装完后从PCRⅠ区通过传递窗传至Ⅱ区。
表1：PCR混合液
| 10X PCR buffer | 0.5μL |
| Mg<sup>2+</sup> | 2μM(终浓度) |
| dNTP | 500μM(终浓度) |
| 扩增引物混合液 | 0.5μL(终浓度0.1μM，各引物之间量比为1) |
| Taq酶 | 1U |
| 水 | 补齐至5μL |
3)在PCRⅡ区，从-20℃冰箱取出DNA模板，冰上(4℃)熔解，涡旋震荡10s后简短离心，吸出一定量DNA稀释至5ng/μL，备用。
4)向96孔板中每孔加入2μL 5ng/μL DNA模板，盖上管盖，涡旋震荡10s后简短离心，从PCRⅡ区通过传递窗传至Ⅲ区，再从PCRⅢ区通过传递窗传至Ⅳ区，每次实验时必须设定空白对照(2μL ddH2O)、阴性对照(2μL DNA提取洗脱液)和阳性对照。
5)将96孔板放入扩增仪，运行程序：pcr，具体程序如下：
4℃保温
二、SAP反应
PCR反应结束后，根据表2在1.5mL EP管中配制SAP混液。表2的数字是以一块96孔板加上38％过剩额计算出来的。该配置过程在PCRⅠ区完成。
表2：SAP反应混合液
| SAP缓冲液 | 0.17μL CutSmart buffer(生产商NEB) |
| SAP酶 | 0.5U(生产商NEB) |
| 水 | 补齐至2μL |
1)将配制好的SAP混液由PCRⅠ区传递至Ⅳ区，加2μL SAP混液到每一个孔里(加混液后总体积：7μL)。
2)把板用膜(用life的或其它公司质量较好的膜)封好，涡旋震荡和离心(4000rpm5秒)。
3)将板放上PCR仪进行以下程序：
37℃40分钟，
85℃5分钟，
4℃保温。
三、延伸反应
1)取出SAP反应板2000rpm离心1min。
2)根据表3在1.5mL管中配制iPLEX延伸混液。表3的数字是以一块96孔板加上38％过剩额计算出来的。请根据实际反应的数量调整数字。该配置过程在PCRⅠ区完成。
表3：iPLEX延伸反应液
| 单碱基延伸反应混合液(由缓冲液+acyNTPs混合) | 0.4μL(产自NEB) |
| iPlex Enzyme | 1U(产自NEB) |
| 延伸引物混合液 | 0.94μL |
| 水 | 补齐至2μL |
3)将iPLEX延伸混液由PCRⅠ区传递至Ⅳ区，每一个孔加入2μL iPLEX延伸混液并混匀(加混液后总体积：9μL)。
4)把板用膜封好，涡旋震荡和离心(4000rpm 5秒)。
5)将96孔板放上PCR仪进行以下热循环：
4℃保温
四、调节(样本脱盐)
以下程序为一块96孔板而设，请根据实际孔的数量调节程序。戴上手套和护眼镜。
1)把洁净树脂(Resin)铺平在96/15mg凹坑板(dimple plate)上，风干最少10分钟。
注意：先用勺子将树脂铺放在板上，然后用刮板刮从左至右或从右至左刮树脂，使96个孔都被树脂填满，当96个孔都被填满后再用刮板轻轻地刮一遍并将表面残留的树脂刮下去，防止干扰下步贴膜。当树脂由深黄变为淡黄色，即表明树脂已经干的差不多了。
2)在样本板的每一个有样本的孔里加入41μL水，封膜(用普通的膜即可)，然后离心。
3)加入15mg洁净树脂(Resin)：轻轻将样本板凌空反转，放在已放树脂的凹坑板上，一定要孔对孔！然后将凹坑板连样本板一起反转(过程中两块板不可水平移动)，让树脂掉到孔里。
4)用膜(用普通的膜即可)把板封好，放在旋转器上颠倒摇匀15分钟。
5)以3200g(标准板离心机的4000rpm)将板离心5分钟。
五、质谱检测
1)打开“板管理系统”软件，编辑实验计划文件，包括样本的位置，样本名称和所用的引物，连接质谱仪与所建立的实验计划文件。
2)点Start All图标，启动软件，并检查各项指示灯是否正常。
3)点击“芯片托盘进入/退出”按钮，把芯片放在托盘上，再放到芯片甲板上，记录芯片的位置(左边记为1，右边记为2)。手不要触及芯片表面；将96板放到标有MTP1/2的位置，按A1在左下角的方向放，固定好；芯片第一次使用时，在校准品加样槽内加入75μL的校正标准品，芯片非第一次使用时不需添加校正标准品。然后再点击“芯片托盘进入/退出”按钮，关闭夹板。
4)点击“添加/维持树脂”按钮，打开树脂槽，添加树脂或者补充高压灭菌纯化水(A.仪器第一次开机时需加28g树脂进入树脂槽内并加16mL灭菌纯化水混匀。B.第一次使用时把9g树脂全部倒入树脂槽内，并加入5.2ml高压灭菌纯化水，用枪头混匀。C.非第一次使用时，需观察液面，若水的液面低于树脂面，则应补充适量的高压灭菌纯化水，使得水的液面高于树脂面。C.树脂溶液加入树脂槽后，需尽快使用，且不能放置超过30天。)
5)程序设置参数如下：
6)打完质谱后，点击“从分析仪上移走旧芯片”按钮，把芯片退回芯片甲板上，然后点击“芯片托盘进入/退出”按钮，取出96孔板，封膜后于-20±5℃保存；将芯片装回包装盒内并置于除湿器内保存(芯片开启后需尽快使用，保存时间不要超过30天)，回收校正标准样品于-20±5℃保存，然后击“芯片托盘进入/退出”按钮，关闭夹板。
1.6检验结果的解释
1.有效性判定：标准品可以检测对应基因型，空白对照品(ddH2O)无信号检出，弱阳性对照可以检出对应阳性信号时，此次检测结果有效，否则此次检测结果无效。
1.7检验方法的局限性
1)本方法可能受到检测样本DNA质量的影响，如果检测样本DNA质量较差，可能出现假阴性结果。
2)本检测结果仅供临床用药参考，用于指导个体化用药，不能作为临床用药的唯一依据。
3)当本品检出对应位点的基因型为野生型时，不能排除该基因还有其它位点的突变。
1.8产品性能指标
本产品最低可以检出A260/A280纯度在1.70-1.90之间的1ng人类基因组DNA。
实验例子：
案例一：患者王某某，男，汉族，24岁。患者12年前无明显诱因突然出现意识丧失，四肢抽搐，头偏向左侧，双眼上翻，牙关紧闭，持续不足3分钟自行缓解，诉乏力、头痛，约30分钟后可恢复正常。发作时大小便失禁，无舌咬伤，无发热等。后无规律发作，最长为2天1次，最频繁时一天2-3次。6年前曾发现血压偏高(120/90)，未治疗。否认脑炎，无颅外伤、昏迷史，否认糖尿病、冠心病等慢性病史，无急慢性传染病史，否认手术、输血史。否认癫痫遗传病史及其它家族遗传病史。2019年10月22日进入西安某医院就诊，主诉“发作性意识丧失伴抽搐12年，再发15天”；检查发现体温36℃、脉搏72次/分钟、血压140/110mmHg。患者意识清醒，双侧瞳孔等大等圆，对光反射灵敏，复视(-)，眼震(-)。双侧额纹对称，伸舌不偏，悬雍垂居中，四肢肌力V级，肌张力正常，深浅感觉未见异常，生理反射存在。经血尿便、肝肾、葡萄糖、电解质、凝血、血脂、HCY、心电图、腹部B超、脑电图、经络分析、血清药物浓度等辅助检查，诊断为癫痫及短暂性脑缺血发作。2007年初次就诊时医生处方为丙戊酸+左乙拉西坦，但患者表示仍存在“意识不清，动作停止，烦躁未晕”等临床症状。
采用本发明提供的试剂盒检测得到如下结果：
1.卡马西平
| 序号 | 检测基因 | 检测位点 | 检测结果 |
| 1 | SCN1A | C>T | CT |
| 2 | CYP3A4 | *20 | 广泛代谢型 |
| 3 | HLA-B | *15:11 | 阴性 |
| 4 | HLA-A | *31:01 | 阴性 |
| 5 | HLA-B | *15:02 | 阴性 |
2.拉莫三嗪
| 序号 | 检测基因 | 检测位点 | 检测结果 |
| 1 | UGT1A4 | T>G | TT |
| 2 | HLA-B | *38:01 | 阴性 |
| 3 | HLA-B | *15:02 | 阴性 |
| 4 | HLA-B | *58:01 | 阴性 |
3.奥卡西平
| 序号 | 检测基因 | 检测位点 | 检测结果 |
| 1 | UGT1A7 | T>C | TT |
| 2 | HLA-B | *15:02 | 阴性 |
| 3 | CYP2C19 | *2,*3,*17 | 广泛代谢型 |
4.苯妥英
| 序号 | 检测基因 | 检测位点 | 检测结果 |
| 1 | SCN1A | C>T | CT |
| 2 | CYP2C9 | *3 | 广泛代谢型 |
| 3 | ABCB1 | C>T/A | AC |
| 4 | HLA-B | *15:02 | 阴性 |
5.托吡酯
| 序号 | 检测基因 | 检测位点 | 检测结果 |
| 1 | INSR | A>C | AA |
6.丙戊酸
| 序号 | 检测基因 | 检测位点 | 检测结果 |
| 1 | CYP2C9 | *3 | 广泛代谢型 |
| 2 | ABCB1 | C>T/A | AC |
| 3 | CPS1 | C>A | AC |
| 4 | POLG | C>A | CC |
7.苯巴比妥
| 序号 | 检测基因 | 检测位点 | 检测结果 |
| 1 | ABCB1 | A>G | GG |
| 2 | SCN2A | G>A | AG |
| 3 | HLA-B | *51:01 | 阳性 |
| 4 | CYP2C19 | *2,*3,*17 | 广泛代谢型 |
8.左乙拉西坦
| 序号 | 检测基因 | 检测位点 | 检测结果 |
| 1 | HLA-A | *11:01 | 阳性 |
| 2 | SCN1A | T>C | TT |
9.锂盐
| 序号 | 检测基因 | 检测位点 | 检测结果 |
| 1 | SH2B1 | C>A | AC |
| 2 | GSK3B | A>G | GG |
10.唑尼沙胺
| 序号 | 检测基因 | 检测位点 | 检测结果 |
| 1 | CYP3A4 | *20 | 广泛代谢型 |
| 2 | HLA-A | *02:07 | 阴性 |
11.拉考沙胺
| 序号 | 检测基因 | 检测位点 | 检测结果 |
| 1 | CYP2C19 | *2,*3,*17 | 广泛代谢型 |
根据上面的结果，我们做出如下判读：
注1：○基因型与药物有相互作用，但患者的基因型表现正常
注2：●基因型与药物有相互作用，且患者的基因型表现发生改变
注3：[代谢基因]1:CYP3A4；2:CYP2C19；3:CYP2C9
[应答基因]4:SCN1A-I；5:UGT1A4；6:UGT1A7；7:ABCB1-I；8:INSR；9:ABCB1-II；10:SCN2A；11:SCN1A-II；12:GSK3B
[毒性基因]13:HLA-A*31:01；14:HLA-B*15:02；15:HLA-B*15:11；16:HLA-B*38:01；17:HLA-B*58:01；18:CPS1；19:POLG；20:HLA-B*51:01；21:HLA-A*11:01；22:SH2B1；23:HLA-A*02:07
因此，我们可以对下列药物的使用情况进行推荐，如下表所示：
注释：
1.(广泛代谢型)药物代谢属正常，血药浓度在治疗窗口内。
2.(超快代谢型)药物代谢加快，血药浓度可能低于有效治疗浓度，导致治疗效果不佳。
3.(中间代谢型)药物代谢减慢，血药浓度可能高于安全治疗浓度(或缺少明确数据支持)。
4.(慢代谢型)药物代谢显著减慢，血药浓度可能高于安全治疗浓度，导致不良反应风险增加。
5.药物应答是最佳。
6.药物应答不是最佳。
7.不良反应风险较低。
8.不良反应风险较高。
药物调整方案：卡马西平(早1g，晚0.5g)。
结果：发作次数减少。
医生建议：3个月后复查
案例二：患者马xx，女，23岁，回族。患者21年前“高烧”后出现意识丧失、愣神、目光呆滞，持续时间约3秒钟后缓解，发作时无牙关紧闭，无四肢抽搐，无口吐白沫，无舌咬伤，无大小便失禁等症状。发作后无特殊不适，就诊于西安儿童医院，诊断为“失神性癫痫”。既往无颅外伤、脑炎、昏迷史，否认糖尿病、心脏病、高血压等慢性病史，否认急慢性传染病史，否认手术及输血史。否认药物、食物过敏史。预防接种史不详。否认家族癫痫病史及其它家族遗传病史。因再次发作，于2019年11月来医院就诊。经检查体温36.3℃、脉搏76次/分钟、呼吸20次/分钟、血压112/64mmHg。患者意识清醒，双侧瞳孔等大等圆，对光反射灵敏。双侧额纹对称，伸舌不偏，悬雍垂居中，四肢肌力V级，肌张力正常，深浅感觉未见异常，生理反射存在，病理反射未引出。经MRI、凝血、血脂、HCY、心电图、腹部B超、脑电图等辅助检查，诊断为“晕厥、癫痫、短暂性脑缺血发作”。既往曾使用奥卡西平、托吡酯、开浦兰(左乙拉西坦片)等相关药物，未完全控制发作。
试剂盒检测得到如下结果：
1.卡马西平
| 序号 | 检测基因 | 检测位点 | 检测结果 |
| 1 | SCN1A | C>T | TT |
| 2 | CYP3A4 | *20 | 广泛代谢型 |
| 3 | HLA-B | *15:11 | 阴性 |
| 4 | HLA-A | *31:01 | 阴性 |
| 5 | HLA-B | *15:02 | 阴性 |
2.拉莫三嗪
| 序号 | 检测基因 | 检测位点 | 检测结果 |
| 1 | UGT1A4 | T>G | TT |
| 2 | HLA-B | *38:01 | 阴性 |
| 3 | HLA-B | *15:02 | 阴性 |
| 4 | HLA-B | *58:01 | 阴性 |
3.奥卡西平
| 序号 | 检测基因 | 检测位点 | 检测结果 |
| 1 | UGT1A7 | T>C | CC |
| 2 | HLA-B | *15:02 | 阴性 |
| 3 | CYP2C19 | *2,*3,*17 | 广泛代谢型 |
4.苯妥英
| 序号 | 检测基因 | 检测位点 | 检测结果 |
| 1 | SCN1A | C>T | TT |
| 2 | CYP2C9 | *3 | 广泛代谢型 |
| 3 | ABCB1 | C>T/A | CC |
| 4 | HLA-B | *15:02 | 阴性 |
5.托吡酯
| 序号 | 检测基因 | 检测位点 | 检测结果 |
| 1 | INSR | A>C | AA |
6.丙戊酸
7.苯巴比妥
| 序号 | 检测基因 | 检测位点 | 检测结果 |
| 1 | ABCB1 | A>G | GG |
| 2 | SCN2A | G>A | GG |
| 3 | HLA-B | *51:01 | 阴性 |
| 4 | CYP2C19 | *2,*3,*17 | 广泛代谢型 |
8.左乙拉西坦
| 序号 | 检测基因 | 检测位点 | 检测结果 |
| 1 | HLA-A | *11:01 | 阳性 |
| 2 | SCN1A | T>C | TT |
9.锂盐
| 序号 | 检测基因 | 检测位点 | 检测结果 |
| 1 | SH2B1 | C>A | CC |
| 2 | GSK3B | A >G | GG |
10.唑尼沙胺
| 序号 | 检测基因 | 检测位点 | 检测结果 |
| 1 | CYP3A4 | *20 | 广泛代谢型 |
| 2 | HLA-A | *02:07 | 阳性 |
11拉考沙胺
| 序号 | 检测基因 | 检测位点 | 检测结果 |
| 1 | CYP2C19 | *2,*3,*17 | 广泛代谢型 |
根据上面的结果，我们做出如下判读：
注1：○基因型与药物有相互作用，但患者的基因型表现正常
注2：●基因型与药物有相互作用，且患者的基因型表现发生改变
注3：[代谢基因]1:CYP3A4；2:CYP2C19；3:CYP2C9
[应答基因]4:SCN1A-I；5:UGT1A4；6:UGT1A7；7:ABCB1-I；8:INSR；9:ABCB1-II；10:SCN2A；11:SCN1A-II；12:GSK3B
[毒性基因]13:HLA-A*31:01；14:HLA-B*15:02；15:HLA-B*15:11；16:HLA-B*38:01；17:HLA-B*58:01；18:CPS1；19:POLG；20:HLA-B*51:01；21:HLA-A*11:01；22:SH2B1；23:HLA-A*02:07
因此，我们可以对下列药物的使用情况进行推荐，如下表所示：
注释：
1.(广泛代谢型)药物代谢属正常，血药浓度在治疗窗口内。
2.(超快代谢型)药物代谢加快，血药浓度可能低于有效治疗浓度，导致治疗效果不佳。
3.(中间代谢型)药物代谢减慢，血药浓度可能高于安全治疗浓度(或缺少明确数据支持)。
4.(慢代谢型)药物代谢显著减慢，血药浓度可能高于安全治疗浓度，导致不良反应风险增加。
5.药物应答是最佳。
6.药物应答不是最佳。
7.不良反应风险较低。
8.不良反应风险较高。
调整治疗方案：奥卡西平早0.6g，晚0.75g；卡马西平0.1g，2次/日；丙戊酸镁早0.5g，晚0.75g。结果：患者症状有一定减轻。
案例三：患者孙某某，男，35岁，汉族。患者自述15年前被石头砸伤头顶部，当时给予清创处理。否认昏迷、脑炎、否认急慢性传染病史，否认手术、输血史，过敏原检测对蒿类植物过敏。7年前晨起无明显诱因出现意识丧失，四肢抽搐，牙关紧闭，持续约10分钟左右自行停止，其它症状不详，意识恢复后自觉疲乏无力，头昏，随后入睡，醒后正常。发作时有舌咬伤，无大小便失禁，发热等。第一天出现全身肌肉酸痛，2-3天症状消失。家族无类似疾病，无家族遗传倾向疾病。因病情再次发作14天后，于11月下旬来医院就诊。体温36.2℃、脉搏70次/分钟、血压120/80mmHg。患者意识清醒；步入病房，双侧瞳孔等大等圆，对光反射灵敏，复视(-)，眼震(-)。双侧额纹对称，伸舌不偏，悬雍垂居中，四肢肌力V级，肌张力正常。经辅助诊断措施后，结论为“晕厥、短暂性脑缺血发作”。患者以前曾服用卡马西平、丙戊酸镁缓释片及拉莫三嗪片，均有意识丧失、四肢强直抽搐、牙关紧闭等状况。
采用本发明提供的试剂盒检测得到如下结果：
1.卡马西平
| 序号 | 检测基因 | 检测位点 | 检测结果 |
| 1 | SCN1A | C>T | CT |
| 2 | CYP3A4 | *20 | 广泛代谢型 |
| 3 | HLA-B | *15:11 | 阴性 |
| 4 | HLA-A | *31:01 | 阴性 |
| 5 | HLA-B | *15:02 | 阳性 |
2.拉莫三嗪
| 序号 | 检测基因 | 检测位点 | 检测结果 |
| 1 | UGT1A4 | T>G | TT |
| 2 | HLA-B | *38:01 | 阴性 |
| 3 | HLA-B | *15:02 | 阳性 |
| 4 | HLA-B | *58:01 | 阴性 |
3.奥卡西平
| 序号 | 检测基因 | 检测位点 | 检测结果 |
| 1 | UGT1A7 | T>C | CT |
| 2 | HLA-B | *15:02 | 阳性 |
| 3 | CYP2C19 | *2,*3,*17 | 中间代谢型 |
4.苯妥英
| 序号 | 检测基因 | 检测位点 | 检测结果 |
| 1 | SCN1A | C>T | CT |
| 2 | CYP2C9 | *3 | 广泛代谢型 |
| 3 | ABCB1 | C>T/A | AC |
| 4 | HLA-B | *15:02 | 阳性 |
5.托吡酯
| 序号 | 检测基因 | 检测位点 | 检测结果 |
| 1 | INSR | A>C | AC |
6.丙戊酸
7.苯巴比妥
| 序号 | 检测基因 | 检测位点 | 检测结果 |
| 1 | ABCB1 | A>G | AG |
| 2 | SCN2A | G>A | GG |
| 3 | HLA-B | *51:01 | 阴性 |
| 4 | CYP2C19 | *2,*3,*17 | 中间代谢型 |
8.左乙拉西坦
| 序号 | 检测基因 | 检测位点 | 检测结果 |
| 1 | HLA-A | *11:01 | 阴性 |
| 2 | SCN1A | T>C | TT |
9.锂盐
| 序号 | 检测基因 | 检测位点 | 检测结果 |
| 1 | SH2B1 | C>A | CC |
| 2 | GSK3B | A>G | AG |
10.唑尼沙胺
| 序号 | 检测基因 | 检测位点 | 检测结果 |
| 1 | CYP3A4 | *20 | 广泛代谢型 |
| 2 | HLA-A | *02:07 | 阴性 |
11.拉考沙胺
| 序号 | 检测基因 | 检测位点 | 检测结果 |
| 1 | CYP2C19 | *2,*3,*17 | 中间代谢型 |
根据上面的结果，我们做出如下判读：
注1：○基因型与药物有相互作用，但患者的基因型表现正常
注2：●基因型与药物有相互作用，且患者的基因型表现发生改变
注3：[代谢基因]1:CYP3A4；2:CYP2C19；3:CYP2C9
[应答基因]4:SCN1A-I；5:UGT1A4；6:UGT1A7；7:ABCB1-I；8:INSR；9:ABCB1-II；10:SCN2A；11:SCN1A-II；12:GSK3B
[毒性基因]13:HLA-A*31:01；14:HLA-B*15:02；15:HLA-B*15:11；16:HLA-B*38:01；17:HLA-B*58:01；18:CPS1；19:POLG；20:HLA-B*51:01；21:HLA-A*11:01；22:SH2B1；23:HLA-A*02:07
因此，我们可以对下列药物的使用情况进行推荐，如下表所示：
注释：
1.(广泛代谢型)药物代谢属正常，血药浓度在治疗窗口内。
2.(超快代谢型)药物代谢加快，血药浓度可能低于有效治疗浓度，导致治疗效果不佳。
3.(中间代谢型)药物代谢减慢，血药浓度可能高于安全治疗浓度(或缺少明确数据支持)。
4.(慢代谢型)药物代谢显著减慢，血药浓度可能高于安全治疗浓度，导致不良反应风险增加。
5.药物应答是最佳。
6.药物应答不是最佳。
7.不良反应风险较低。
8.不良反应风险较高。
调整治疗方案：左乙拉西坦片早晚各0.5g，丙戊酸钠缓释片早晚各0.4g，碳酸锂每晚睡前1次0.2g。
结果：调整一周之后患者症状明显改善
以上所述的，仅为本发明的较佳实施例，并非用以限定本发明的范围，本发明的上述实施例还可以做出各种变化。凡是依据本发明申请的权利要求书及说明书内容所作的简单、等效变化与修饰，皆落入本发明专利的权利要求保护范围。本发明未详尽描述的均为常规技术内容。
SEQUENCE LISTING
<110> 上海康黎医学检验所有限公司
<120> 一种用于指导人癫痫疾病用药的试剂盒及其应用
<160> 99
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
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<400> 1
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<213> 人工合成
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acgttggatg ggcagaacca cagtgtttag 30
<210> 41
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 41
acgttggatg tccacactgc agacaatacc 30
<210> 42
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 42
acgttggatg acaggcaact gctatactac 30
<210> 43
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 43
acgttggatg cgtggcgcat tatctcttac 30
<210> 44
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 44
acgttggatg aacaaagttt tagcaaacg 29
<210> 45
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 45
acgttggatg tgcaatagca ggagttgttg 30
<210> 46
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 46
acgttggatg catatttagt ttgactcacc 30
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<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 47
acgttggatg ctgggattct gtccttcttg 30
<210> 48
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 48
acgttggatg cacatcagac tggctcaacg 30
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<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 49
acgttggatg gtccagccca atactagatt 30
<210> 50
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 50
acgttggatg cccagaggaa atggtcttag 30
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<213> 人工合成
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acgttggatg ttcctttgtc acttggcccg 30
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acgttggatg agacagcgct cctcacacag 30
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<213> 人工合成
<400> 53
acgttggatg gctgagagga acctggaga 29
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<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 54
acgttggatg tcagtatgtc tcccccaggt 30
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<213> 人工合成
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<212> DNA
<213> 人工合成
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acgttggatg cctcctcaca ttatgcctac 30
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<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 59
acgttggatg gccaagtacc tgaacatctg 30
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acgttggatg ctcctgatct atcgacagac 30
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<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 61
acgttggatg gtgccatccc ttgactcaac 30
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<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 62
acgttggatg ttaactgttg cagatccccc 30
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<212> DNA
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<400> 63
acgttggatg gcaataattt tcccactatc 30
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<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 64
acgttggatg tccatcgatt cttggtgttc 30
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<212> DNA
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acgttggatg cactcctgaa gtgaaaactc 30
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<212> DNA
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<400> 66
acgttggatg atcccaagat aatccacggc 30
<210> 67
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 67
ctttgctgcc ctcac 15
<210> 68
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 68
ctggggtcag actgc 15
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<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 69
ctgggccctc taatac 16
<210> 70
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 70
ccacccgtcc ttcttca 17
<210> 71
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 71
acgaggtcca gagatac 17
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 72
caacctaact gtccatca 18
<210> 73
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 73
tattgtaagc accccctg 18
<210> 74
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 74
ccagatggaa gagggctc 18
<210> 75
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 75
atgggatcag agatcaag 18
<210> 76
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 76
ttctgagtta gcccctgtg 19
<210> 77
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 77
cccttcatgg agctcccgca 20
<210> 78
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 78
acagcaaaag ttagctgata 20
<210> 79
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 79
gacgtggaaa aacgaagcca 20
<210> 80
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 80
gggaccattg cccttgttac c 21
<210> 81
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 81
ttgtttcaaa tctcctcccc aa 22
<210> 82
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 82
gagagatctt tcccaatttc tg 22
<210> 83
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 83
cctatccttt actctaatca ctt 23
<210> 84
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 84
aggatcagtg cctgtgatag aga 23
<210> 85
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 85
acgaaagctt ccgcttcttt acca 24
<210> 86
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 86
gggaaacagt gtttagggcc tgcc 24
<210> 87
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 87
cccatatact acagtagtca acctg 25
<210> 88
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 88
ttatgtgtgt cttctgttct caaag 25
<210> 89
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 89
ccctctagtt tgactcacct tcccag 26
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 90
ggctaaacgc caacaatgtc cctgcca 27
<210> 91
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 91
gtactttagg tatatacaat atctaatg 28
<210> 92
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 92
ctcacacaga gcagc 15
<210> 93
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 93
ggacaggtgg aggct 15
<210> 94
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 94
ccgcagtccc ggttct 16
<210> 95
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 95
agaaacaaag tcagggt 17
<210> 96
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 96
catgatgatg cacacaat 18
<210> 97
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 97
gacttcttca accagaaaaa 20
<210> 98
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 98
agtaatttgt tatgggttcc 20
<210> 99
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 99
ggctttataa tatgtctctc tat 23
Claims (6)
1.一种用于指导人癫痫疾病用药的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒可同时对33个基因位点进行分型，所述试剂盒包括用于扩增33个基因片段的33对扩增引物，所述33个基因位点以及33对扩增引物的序列具体如下所示：
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括用于依次鉴定这33个基因片段突变的33条延伸引物，所述延伸引物的序列如SEQ ID NO.67～SEQ ID NO.99所示。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的PCR扩增的反应体系如下：
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括SAP反应体系，所述SAP反应体系如下：
SAP缓冲液 0.17μL
SAP酶 0.5U
纯水 补齐至2μL。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述扩增引物SEQ ID No.1～SEQ IDNo.18，SEQ ID No.21～SEQ ID No.30，SEQ ID No.33～SEQ ID No.48，SEQ ID No.51～SEQID No.66在反应体系中的摩尔浓度均为0.2～0.6μM，SEQ ID No.19～SEQ ID No.20在反应体系中的摩尔浓度为0.8～1.2μM，SEQ ID No.31～SEQ ID No.32在反应体系中的摩尔浓度为0.4～1.0μM，SEQ ID No.49～SEQ ID No.50在反应体系中的摩尔浓度为0.9～1.3μM。
6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒采用飞行时间质谱仪进行检测。
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