CN113322315A - 癫痫用药相关snp位点的检测产品及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了癫痫用药相关SNP位点的检测方法，包括以下步骤：S1、提取样本基因组DNA；S2、引物配置；S3、PCR扩增引物Mix的配制；S4、单碱基延伸引物Mix的配制；S5、PCR扩增反应；S6、SAP消化反应；S7、单碱基延伸反应；S8、结果分析。本发明还提出了癫痫用药相关SNP位点的检测产品，包括引物与检测试剂，所述引物包括位于40个SNP位点的PCR扩增引物以及位于40个SNP位点的单碱基延伸引物。本发明通过多引物延伸技术和Mass ARRAY技术结合使用，可以在一个反应体系中同时检测多个突变位点，大大减轻了工作量，提高了检测通量，并降低了检测费用。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术相关领域，尤其涉及癫痫用药相关SNP位点的检测产品及方法。
背景技术
在癫痫用药前进行基因检测，能够为医生提供十分有针对性的实验依据，提高对临床用药的指导，利于患者痊愈。
目前癫痫用药基因检测技术中，部分采用以PCR为基础的检测手段，如RT-PCR、ARMS-PCR、一代测序等，这种检测方式一次仅能检测少量的基因的少量位点，对临床用药难以提供有针对性的实验依据；还有部分高通量基因检测的技术，如二代测序等，这种检测方式的成本高、周期长，且对实验操作及数据分析的要求较高，只能作为实验手段使用，在实际临床操作时难以普及推广。据此，本申请文件提出癫痫用药相关SNP位点的检测产品及方法。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺点，而提出的癫痫用药相关SNP位点的检测产品及方法。
为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
癫痫用药相关SNP位点的检测方法，包括以下步骤：
S1、提取样本基因组DNA，通过采取血液、口腔拭子、干血片等方式提取基因组DNA样品，并用Nanodrop测定浓度，之后用Nuclease-Free Water稀释至终浓度为10-20ng/ul；
S2、引物配置，将引物干粉导入离心机内并以12000rpm转速离心处理2min，加入Nuclease-Free Water后将所有PCR引物稀释至100uM，同时将单碱基延伸引物稀释至400uM；
S3、PCR扩增引物Mix的配制，将每条100uM的引物稀释200倍，使PCR引物Mix的最终浓度为0.5uM，配制完成后震荡混匀离心，并在-20℃环境下保存；
S4、单碱基延伸引物Mix的配制，使每条UEP引物的贮藏浓度保持在400uM，配制完成后震荡混匀离心，-20℃环境下保存；
S5、PCR扩增反应，在一定反应条件下完成PCR扩增反应体系；
S6、SAP消化反应，在一定反应条件下完成SAP消化反应体系；
S7、单碱基延伸反应，在一定反应条件下完成单碱基延伸反应体系；
S8、结果分析，采用质谱仪对实验结果进行分析。
优选地，所述步骤S1中，稀释后的样本需在-20℃环境下保存，并在使用前利用离心机以2000rpm转速离心处理2-5min，以对样本解冻。
优选地，所述步骤S2中，稀释完成后先充分震荡混匀，并在室温下放置15-30min，再次震荡混匀离心后，可在-20℃环境下保存。
优选地，所述步骤S4中，配置单碱基延伸引物Mix时，按单碱基延伸引物稀释表计算。
优选地，所述步骤S8中，质谱仪检测结果时，采用软件Mass ARRAY Typer4.0查看实验检测数据并进行数据分析。
本发明还提出了癫痫用药相关SNP位点的检测产品，包括引物与检测试剂，所述引物包括位于40个SNP位点的PCR扩增引物以及位于40个SNP位点的单碱基延伸引物，所述检测试剂包括PCR Reagent Set，
Gold Reagent Set，无水乙醇。
本发明具有以下有益效果：
通过多引物延伸技术和Mass ARRAY技术结合使用，可以在一个反应体系中同时检测多个突变位点，大大减轻了工作量，提高了检测通量，并降低了检测费用。
附图说明
图1为本发明提出的癫痫用药相关SNP位点的检测方法流程框图；
图2为本发明检测样本中W1 SNP位点rs1061235的质谱分析图；
图3为本发明检测样本中W1 SNP位点rs1386494的质谱分析图；
图4为本发明检测样本中W1 SNP位点rs16944的质谱分析图；
图5为本发明检测样本中W1 SNP位点rs2298383的质谱分析图；
图6为本发明检测样本中W1 SNP位点rs2517754的质谱分析图；
图7为本发明检测样本中W1 SNP位点rs3789243的质谱分析图；
图8为本发明检测样本中W2 SNP位点rs1137101的质谱分析图；
图9为本发明检测样本中W2 SNP位点rs17183814的质谱分析图；
图10为本发明检测样本中W2 SNP位点rs1778929的质谱分析图；
图11为本发明检测样本中W2 SNP位点rs3812718的质谱分析图；
图12为本发明检测样本中W2 SNP位点rs4828696的质谱分析图；
图13为本发明检测样本中W2 SNP位点rs511310的质谱分析图；
图14为w1中点rs1128503多个样本的基因分型聚类图；
图15为w1中点rs1128503基因型为AA的样本质谱分析图；
图16为w1中点rs1128503基因型为GA的样本质谱分析图；
图17为w1中点rs1128503基因型为GG的样本质谱分析图；
图18为w1中点rs10789038多个样本的基因分型聚类图；
图19为w1中点rs10789038基因型为AA的样本质谱分析图；
图20为w1中点rs10789038基因型为GA的样本质谱分析图；
图21为w1中点rs10789038基因型为GG的样本质谱分析图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
癫痫用药相关SNP位点的检测方法，包括以下步骤：
S1、提取样本基因组DNA，通过采取血液、口腔拭子、干血片等方式提取基因组DNA样品，并用Nanodrop测定浓度，之后用Nuclease-Free Water稀释至终浓度为10-20ng/ul；需要说明的是，若不及时进行下一步检测处理，则稀释后的样本需在-20℃环境下保存，并在使用前利用离心机以2000rpm转速离心处理2-5min，以对样本解冻，此外应注意尽量减少反复冻融。
S2、引物配置，将引物干粉导入离心机内并以12000rpm转速离心处理2min，加入Nuclease-Free Water后将所有PCR引物稀释至100uM，同时将单碱基延伸引物稀释至400uM；稀释完成后先充分震荡混匀，并在室温下放置15-30min，再次震荡混匀离心后，可在-20℃环境下保存。
S3、PCR扩增引物Mix的配制，将每条100uM的引物稀释200倍，使PCR引物Mix的最终浓度为0.5uM，配制完成后震荡混匀离心，并在-20℃环境下保存；配置单碱基延伸引物Mix时，按单碱基延伸引物稀释表计算。
S4、单碱基延伸引物Mix的配制，使每条UEP引物的贮藏浓度保持在400uM，配制完成后震荡混匀离心，-20℃环境下保存；
S5、PCR扩增反应，在一定反应条件下完成PCR扩增反应体系；具体的，PCR扩增条件是：先95℃，2min。再95℃，30s。之后依次56℃，30s；72℃，60s；72℃，5min，共45个循环。最后4℃保温。PCR扩增反应体系如下表所示：
| 试剂 | 反应体积(uL) |
| Nuclease-Free Water | 1.8 |
| 10×PCR Buffer | 0.5 |
| MgCl2 | 0.4 |
| dNTP Mix | 0.1 |
| PCR扩增引物Mix | 1 |
| 基因组DNA(10-20ng/ul) | 1 |
| PCR Enzyme | 0.2 |
表1 PCR扩增反应体系
S6、SAP消化反应，在一定反应条件下完成SAP消化反应体系；具体的，SAP消化反应条件为：先37℃，40min。再85℃，5min。最后4℃保温。SAP消化反应体系如下表所示：
| 试剂 | 反应体积(uL) |
| Nuclease-Free Water | 1.53 |
| SAP Buffer | 0.17 |
| Shrimp Alkaline Phosphatase Enzyme | 0.3 |
| 总量 | 2 |
表2 SAP消化反应体系
S7、单碱基延伸反应，在一定反应条件下完成单碱基延伸反应体系；具体的，单碱基延伸反应条件为：先94℃，30s。再依次94℃，5s；52℃，5s；80℃，5s；52℃，5s；80℃，5s；52℃，5s；80℃，5s；52℃，5s；80℃，5s；52℃，5s；80℃，5s，共40个循环。之后72℃，3min。最后4℃保温。单碱基延伸反应体系如下表所示：
| 试剂 | 反应体积(uL) |
| Nuclease-Free Water | 0.619 |
| iPLEX Buffer Plus | 0.2 |
| iPLEX Termination mix | 0.2 |
| 单碱基延伸引物Mix | 0.94 |
| iPLEX Enzyme | 0.041 |
| 总量 | 2 |
表3 单碱基延伸反应体系
S8、结果分析，采用质谱仪对实验结果进行分析，质谱仪检测结果时，可采用软件Mass ARRAY Typer4.0查看实验检测数据并进行数据分析。具体的，质谱仪检测手段如下：对单碱基延伸产物进行树脂纯化脱盐反应、离心，使树脂沉积在384孔板底部。然后，将384孔板放置在自动点样仪上，芯片放置在相应的位置。每孔取60uL的calibrate加到芯片相应位置，用于检测该次实验所用的芯片及点样的质量。
将384孔中样本加到芯片的相应位置，然后将加样后的芯片放置在质谱仪中，编辑需要检测的孔，点击START，直到全部完成。
打开软件Mass ARRAY Typer4.0，对实验检测数据进行分析，数据分结果见图2-21。其中图2-7显示为实例样本的w1中六个SNP位点的质谱分析图；图8-13显示为实例样本的w2中六个SNP位点的质谱分析图；图14显示w1中点rs1128503多个样本的基因分型聚类图；图15显示w1中点rs1128503基因型为AA的样本质谱分析图；图16显示w1中点rs1128503基因型为GA的样本质谱分析图；图17显示w1中点rs1128503基因型为GG的样本质谱分析图；图18显示w1中点rs10789038多个样本的基因分型聚类图；图19显示w1中点rs10789038基因型为AA的样本质谱分析图；图20显示w1中点rs10789038基因型为GA的样本质谱分析图；图21显示w1中点rs10789038基因型为GG的样本质谱分析图。
本发明以基质辅助激光解吸附/电离飞行时间质谱技术检测基因组DNA，通过扩增40个癫痫用药相关的SNP位点，再进行单碱基延伸，使在SNP位点上延伸1个碱基。由于离子的质量不同，则再根据在真空小管中飞行的时间长短也不同，借以来判断离子质量的大小，从而判断位点的基因型。可以在一个反应体系中同时检测多个突变位点，提高检测准确性、提高通量、降低检测成本、提高检测效率，从而能够便于临床普及使用。
本发明可特异性的检测基因组DNA中的SNPs位点，再针对每一组特异性染色体SNPs位点进行多重PCR扩增的引物序列，然后针对每一组特异性染色体SNPs位点进行多重PCR延伸的引物序列，最后以基质辅助激光解吸附/电离飞行时间质谱方法检测一组特异性染色体SNPs位点。
具体实施过程中可简述为：先合成引物序列，即合成个性化用药基因特异性染色体SNPs位点的PCR扩增的引物及单碱基延伸引物序列；再多重PCR扩增SNPs位点基因片段，即通过多重扩增体系一次扩增覆盖特异性SNPs位点的个性化用药基因片段(多重PCR是指：一个混合多种成分在单个孔内的扩增反应体系；来源于对样本提取的基因组DNA作为模板)；之后单碱基延伸SNPs位点，通过多重延伸体系一次延伸个性化用药基因的SNPs位点；最终上机检测基因型，通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱方法，检测数据并分析各突变位点的基因型。
本发明还提出了癫痫用药相关SNP位点的检测产品，包括引物与检测试剂，引物包括位于40个SNP位点的PCR扩增引物以及位于40个SNP位点的单碱基延伸引物，检测试剂包括PCR Reagent Set，
Gold Reagent Set，无水乙醇。具体的为：PCR Reagent Set,Large(Agena bioscience)、
Gold Reagent Set,Large(Agena bioscience)。
需要说明的是，40个SNP位点的PCR扩增引物，每条引物1OD，引物序列如下表所示：
表4 40个SNP位点的PCR扩增引物
需要说明的是，40个SNP位点的单碱基延伸引物，每条引物1OD引物序列如下表所示：
表5 40个SNP位点的单碱基延伸引物
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种癫痫用药相关SNP位点的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、提取样本基因组DNA，通过采取血液、口腔拭子、干血片等方式提取基因组DNA样品，并用Nanodrop测定浓度，之后用Nuclease-Free Water稀释至终浓度为10-20ng/ul；
S2、引物配置，将引物干粉导入离心机内并以12000rpm转速离心处理2min，加入Nuclease-Free Water后将所有PCR引物稀释至100uM，同时将单碱基延伸引物稀释至400uM；
S3、PCR扩增引物Mix的配制，将每条100uM的引物稀释200倍，使PCR引物Mix的最终浓度为0.5uM，配制完成后震荡混匀离心，并在-20℃环境下保存；
S4、单碱基延伸引物Mix的配制，使每条UEP引物的贮藏浓度保持在400uM，配制完成后震荡混匀离心，-20℃环境下保存；
S5、PCR扩增反应，在一定反应条件下完成PCR扩增反应体系；
S6、SAP消化反应，在一定反应条件下完成SAP消化反应体系；
S7、单碱基延伸反应，在一定反应条件下完成单碱基延伸反应体系；
S8、结果分析，采用质谱仪对实验结果进行分析。
2.根据权利要求1所述的癫痫用药相关SNP位点的检测方法，其特征在于，所述步骤S1中，稀释后的样本需在-20℃环境下保存，并在使用前利用离心机以2000rpm转速离心处理2-5min，以对样本解冻。
3.根据权利要求1所述的癫痫用药相关SNP位点的检测方法，其特征在于，所述步骤S2中，稀释完成后先充分震荡混匀，并在室温下放置15-30min，再次震荡混匀离心后，可在-20℃环境下保存。
4.根据权利要求1所述的癫痫用药相关SNP位点的检测方法，其特征在于，所述步骤S4中，配置单碱基延伸引物Mix时，按单碱基延伸引物稀释表计算。
5.根据权利要求1所述的癫痫用药相关SNP位点的检测方法，其特征在于，所述步骤S8中，质谱仪检测结果时，采用软件Mass ARRAY Typer4.0查看实验检测数据并进行数据分析。
6.一种癫痫用药相关SNP位点的检测产品，包括引物与检测试剂，其特征在于，所述引物包括位于40个SNP位点的PCR扩增引物以及位于40个SNP位点的单碱基延伸引物，所述检测试剂包括PCR Reagent Set，
Gold Reagent Set，无水乙醇。
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Patent Citations (8)
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