CN109825574A

CN109825574A - 一种用于抗癫痫药物用药指导的多重基因检测试剂盒及其使用方法

Info

Publication number: CN109825574A
Application number: CN201910212576.7A
Authority: CN
Inventors: 吕军英; 王凡; 吴勇; 余丁
Original assignee: NINGBO HEALTH GENE TECHNOLOGIES Co Ltd
Current assignee: NINGBO HEALTH GENE TECHNOLOGIES Co Ltd
Priority date: 2019-03-20
Filing date: 2019-03-20
Publication date: 2019-05-31

Abstract

本发明公开了一种用于抗癫痫药物用药指导的多重基因检测试剂盒及其使用方法。本发明采用多重PCR结合片段长短/质量分析方法，同步快速定性检测与抗癫痫药物代谢、转运、靶点作用相关的CYP2C9、CYP2C19、POLG和UGT1A4等4个基因上8个单核苷酸多态性(SNP)位点。检测步骤：(1)采集口腔脱落细胞保存于细胞采集卡，或采集血液样本并提取核酸；(2)采用步骤1所述细胞采集卡或核酸为模板进行多重PCR扩增；(3)按PCR产物片段长短/质量同步分离8个SNP位点、3个人基因组DNA内参(huDNA)基因及1个PCR反应内参的PCR产物；(4)结果分析判读。本发明的优势是快速、灵敏度高、重复性好、特异性强、通量高、成本低。

Description

一种用于抗癫痫药物用药指导的多重基因检测试剂盒及其使用方法

技术领域

本发明涉及一种多重基因检测试剂盒，具体涉及一种用于抗癫痫药物用药指导的多重基因检测试剂盒及其使用方法。

背景技术

癫痫(epilepsy)是一种反复发作、病程迁延、突发性大脑功能失调的慢性疾病，临床表现为运动、感觉、意识和植物神经功能紊乱。癫痫作为神经内科仅次于脑血管病的第二大疾病，严重威胁着人类的健康。据世界卫生组织(WHO)统计的数据显示，目前全球共有约5000万人正遭受癫痫的侵袭，其中80％的患者在发展中国家，其中约有四分之三的患者得不到所需治疗。我国的癫痫患病率为7‰，与WHO报告的发展中国家7.2‰的发病率接近。

服用抗癫痫药物是治疗癫痫症的主要手段。目前临床上常用的药物有丙戊酸钠、苯妥英、拉莫三嗪和苯巴比妥等。根据作用机制，抗癫痫药物可分为膜稳定剂、减少神经递质释放的药物、γ-氨基丁酸调节剂和其他药物。大部分抗癫痫药物都会引发不良反应，如中枢神经系统抑制反应、行为障碍、血液系统紊乱、和皮肤病变。除了引发严重不良反应，抗癫痫药物治疗的疗效存在显著的个体差异。研究表明，抗癫痫药物疗效个体差异和不良反应与患者基因多态性有关。

人类基因组80％以上基因多态性都是单核苷酸多态性(Single Nucleotidepolymorphism，SNP)。SNP指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性，包括碱基转换、颠换、缺失和插入。与药物相关的基因SNP位点发生突变可使对应的酶活性发生变化，从而影响药物代谢、转运或靶点结合，导致药物疗效不佳，甚至发生严重毒副反应。例如：相关研究报道，苯妥英由CYP2C9基因编码的酶代谢。CYP2C9的*2或*3位点发生突变会使酶活性降低，从而使患者对苯妥英的代谢速率减慢，导致行为障碍和共济失调等不良反应。随着药物基因组学的发展，越来越多与抗癫痫药物用药相关的基因被报道。因此，通过对抗癫痫用药相关的SNP位点进行检测，为患者量身定制一套用药方案，可提高治疗效率，减轻患者医疗负担和痛苦，节省大量医院及社会资源(见表1)。

表1抗癫痫药物用药指导相关基因

目前市场上，SNP分型检测技术主要有三种：测序法、荧光定量PCR法、基因芯片法：

(1)荧光定量PCR法

荧光定量PCR采用荧光淬灭及双末端标记技术，针对SNP位点设计特异性的探针，具有灵敏度高、准确性高和特异性高等优势。但荧光定量PCR通量低，若要同时检测多个个SNP位点，需要分管检测，操作复杂，样品用量大，难以适应临床需求。此外，荧光定量PCR难以设置内参质控，无法避免假阳性和假阴性。

(2)基因芯片法

基因芯片是通过微加工技术，将数以万计的特定序列的DNA片段(基因探针)，有规律地排列固定于硅片、玻片等支持物上，构成的一个二维DNA探针阵列，利用这类芯片与标记的生物样品进行杂交，可对样品的基因表达谱生物信息进行快速定性和定量分析。其优点是通量高、操作简便；缺点是检测成本昂贵、重复性差、灵敏度较低。芯片的种类较多，难以制定一个统一的质量控制标准也限制了基因芯片技术的普及。

(3)测序法

Sanger测序法是SNP分型金标准，不仅能检测已知SNP，也能发现未知SNP。但Sanger测序法操作复杂，成本较高。当测序位点较多时需要逐个位点测序，耗时长，累计价格相对昂贵。二代测序技术实现了边合成边测序，具有高通量、高效率的优势，然而二代测序平台价格昂贵、普及度低，作为SNP检测技术在临床上的应用还不够成熟。

由于与抗癫痫药物用药相关的基因SNP数量较多，以上技术均具有明显局限性，因此很难应用于抗癫痫药物用药指导多重基因检测。

目前，国内尚无有关以多重PCR和CE分离技术为基础的抗癫痫药物用药指导多重基因检测方案的报道。

发明内容

本发明提供了一种快速、灵敏度高、重复性好、准确性高、特异性强、通量高、成本低的抗癫痫药物用药指导多重基因检测试剂盒及其使用方法。其特征在于，使用多重PCR结合片段长短/质量分析方法，在一个反应管中同步快速定性检测与抗癫痫药物用药相关的8个单核苷酸多态性(SNP)位点。本试剂盒在检测上述8个SNP位点的PCR反应系统中加入了3个人基因组DNA(huDNA)内参和1个PCR反应内参(如表2所示)，同步进行PCR扩增，用于监测核酸提取及PCR反应过程，可避免假阴性和假阳性。

表2抗癫痫药物用药指导多重基因检测试剂盒检测位点和引物列表

本试剂盒包括以下组分：引物组合物EPi Primer Mix、PCR反应液和阳性对照品、超纯水。阳性对照品包含上述8个SNP位点和内参基因所对应的质粒混合物，用于SNP检测系统测试及每次引物订购后的质量控制。PCR反应液包括以下组分：超纯水、2×PCR缓冲液、DNA聚合酶、dNTP。

使用本试剂盒检测步骤如下：

(1)采集口腔脱落细胞保存于细胞采集卡，或采集血液样本并提取核酸。其中，保存于细胞采集卡上的口腔脱落细胞，可不需进行核酸提取，直接用于PCR扩增，节省了核酸提取的时间；

(2以细胞采集卡或提取的核酸为模板进行多重PCR扩增。PCR反应条件为：95℃5min；94℃10s，61℃1min；70℃30s，循环29次；60℃，15min；4℃直至收取PCR产物；

(3)按PCR产物片段长短/质量同步分离8个SNP位点及4个内参。本发明采用毛细电泳分离PCR产物：在96孔样品板中配制电泳样品，取高纯甲酰胺8.7μL，标准品SIZE-5000.3μL，PCR产物1μL，混匀离心。将配制好的电泳样品置于3500基因分析仪中，按操作说明进行毛细电泳；

(4)根据所设计的每个检测位点的片段长度进行结果分析。

根据检测峰图，可获得每个SNP位点的基因型，结合各个基因对应的临床参考信息(表3.1～3.4)，指导抗癫痫药物的个性化使用。

表3.1 CYP2C9基因所对应的临床参考信息

表3.2 POLG基因对应的临床参考信息

表3.3 UGT1A4基因对应的临床参考信息

表3.4 CYP2C19基因对应的临床参考信息

与现有技术相比，本发明具有以下优势：

本发明基于3500基因分析仪创立了一种用同步检测与抗癫痫药物用药相关的4个基因上8个SNP位点的检测方案；特异性和准确度可达到qPCR水平；可在短时间内(2.5小时)同时完成多个样品8个SNP位点的检测；DNA内参和反应内参的使用可监测DNA提取及PCR反应的效率，避免了假阴性和假阳性。

综上所述，本发明提供了一种同步检测与抗癫痫药物用药相关的4个基因上8个SNP位点的检测方案，具有快速、灵敏度高、重复性好、特异性强、通量高、成本低等优势。

附图说明

图1为一个癫痫患者的口腔脱落细胞采集卡样本(未经核酸提取，直接进行PCR)检测结果；

图2为一个癫痫患者的全血样本检测结果。

具体实施方式

为了更好地理解本发明的内容，下面结合具体实施例和附图作进一步说明。应理解，这些实施例仅用于对本发明进一步说明，而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明的内容后，该领域的技术人员对本发明作出一些非本质的改动或调整，仍属于本发明的保护范围。

实施例1和2所述引物组合物Epi Primer Mix为表2所述用于扩增8个SNP位点的各3条引物和4个内参基因的各2条引物：SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.32。

实施例1和2所述PCR反应液包括以下组分：超纯水、2×PCR缓冲液、DNA聚合酶和dNTP。

实施例1和2所述阳性对照品Epi POS为表2所述内含8个SNP位点和4个内参基因所对应的质粒混合物。

实施例1

本实施例采集一个癫痫患者的口腔脱落细胞，以细胞采集卡为模板直接进行多重PCR反应，最终用毛细电泳方法分离样品，具体步骤如下：

1.生产用于抗癫痫药用药指导的多重基因检测试剂盒，包括以下组分：

1)引物组合物Epi Primer Mix；

2)PCR反应液；

3)阳性对照品Epi POS；

4)超纯水。

2.采集样本

使用口腔拭子采集人类的口腔脱落细胞，保存于细胞采集卡上。

3.以细胞采集卡为模板进行PCR反应

1)按表4在96孔样品板/PCR八联管中加入试剂和样品。

表4 PCR反应体系

试剂	量(μL)/孔
		PCR反应液	14
引物组合物	2
		细胞采集卡	0
水	4
		Total	20

2)将配制好的PCR体系混匀离心，按表5的程序进行PCR反应：

表5 PCR扩增程序

步骤	程序	时间
			1	95℃	5min
2	94℃	10s
			3	61℃	1min
4	70℃	30s
			5	N/A	重复2-4步骤29次
6	60℃	15min
			7	4℃	持续直至收取PCR产物

4.毛细电泳分离样品

1)制备电泳样品

按表6在96孔样品板中配制电泳样品。

2)毛细电泳分离样品

将样品板置于3500DX基因分析仪中，选择“fragment”电泳方法，进行电泳，详见ABI3500操作说明书。

表6电泳样品配制

5.结果分析

根据各特征峰出现的位置和数量，确定基因型，结合各基因对应的临床参考信息，判断患者对各种抗癫痫药物的反应，给出用药指导。图1为一个癫痫患者的口腔脱落细胞采集卡样本检测峰图。表7为该患者的基因型结果，表8为该患者的用药指导。

如图1所示，横坐标为PCR片段大小，纵坐标为荧光信号强度，根据特征峰的位置即可获得各位点的基因型。该患者CYP2C19*3位点的基因型为GA；POLG基因A467T位点的基因型为CC；CYP2C19*2位点的基因型为GA；POLG基因W748S位点的基因型为GG；UGT1A4基因rs2011425位点的基因型为TG；CYP2C19*17位点的基因型为CC；CYP2C9*2位点的基因型为CC；CYP2C9*3位点的基因型为TT。其中3个位点的基因型不同于野生型：CYP2C19*2位点、CYP2C19*3位点和UGT1A4基因rs2011425位点，影响到治疗效果，需调整治疗方案。其它位点为野生型，可按照推荐剂量服药(详见表7和表8)。

表7一个癫痫患者口腔脱落细胞采集卡样本基因型检测结果

表8一个癫痫患者的抗癫痫药物用药指导

实施例2

本实施例采集一个癫痫患者全血样本并提取核酸，以提取的核酸为模板进行多重PCR反应，最终用毛细电泳方法分离样品，具体步骤如下：

1.生产用于抗癫痫药用药指导的多重基因检测试剂盒，试剂盒组分如实施例1所述。

2.采集样本

采集一个癫痫患者的全血样本并提取核酸。

3.以提取的核酸为模板进行PCR反应

1)按表9在96孔样品板/PCR八联管上加入试剂和样品。

表9 PCR反应体系

2)将配制好的PCR体系混匀离心，进行PCR反应，PCR程序如实施例1所述。

3)毛细电泳分离样品，操作步骤如实施例1所述。

4.结果分析

根据各特征峰出现的位置和数量，确定基因型，从而判断患者对各种抗癫痫的反应，给出用药指导。图2为一个癫痫患者的全血样本检测峰图。表10为该患者的基因型结果，表11为该患者的用药指导。

如图2所示，横坐标为PCR片段大小，纵坐标为荧光信号强度，根据特征峰的位置即可获得各位点的基因型。该患者CYP2C19*3位点的基因型为GG；POLG基因A467T位点的基因型为CC；CYP2C19*2位点的基因型为GA；POLG基因W748S位点的基因型为GG；UGT1A4基因rs2011425位点的基因型为TG；CYP2C19*17位点的基因型为CC；CYP2C9*2位点的基因型为CC；CYP2C9*3位点的基因型为TG。其中3个位点的基因型不同于野生型：CYP2C9*3位点、CYP2C19*2位点和UGT1A4基因rs2011425位点，影响到治疗效果，需调整治疗方案。其它位点为野生型，可按照推荐剂量服药(详见表10和表11)。

表10一个癫痫患者的全血样本基因型检测结果

表11一个癫痫患者的抗癫痫药物用药指导

本发明采用的SNP检测方法基于多重PCR和毛细管电泳(CE)分离技术。在同一个反应管中同时加入多对特异性基因扩增引物及内参引物，获得大小不一的基因扩增片段，使用毛细管电泳进行分离，进而分析SNP基因型。本发明所采用的检测方法和试剂盒能快速有效地检测多个SNP位点，克服了传统方法存在的缺陷，具有以下优势：

1、高通量：能实现同步检测多达8个SNP位点。

2、准确性高：采用CE技术对PCR产物进行分离，可将非特异性扩增产物、引物二聚体和特异性扩增产物分离，最大程度降低假阳性。

3、灵敏度高：本系统能检测含量低至1ng/反应的DNA样品，具有超高灵敏度。

4、方法简便，使用经济：本发明提供试剂、多重PCR引物设计、结果分析等全套实验方案；检测成本低，利于大规模推广。

上述说明并非对发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在发明的实质范围内，做出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。

序列表

<110> 宁波海尔施基因科技有限公司

<120> 一种用于抗癫痫药物用药指导的多重基因检测试剂盒及其使用方法

<130> 2019-02-19

<160> 32

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 1

gggaagagga gcattgagga ac 22

<210> 2

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 2

gtatggggaa gaggagcatt gaggtct 27

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 3

agcttcaaac ccccgcttca catg 24

<210> 4

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 4

gtaatcaggc tggtggggag aaggtcagt 29

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 5

gtggctggtg gggagaaggt cgag 24

<210> 6

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 6

tgatgtttgg ataccttcat gattcata 28

<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 7

gtgcagctgg caggcatcat tcgt 24

<210> 8

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 8

gtagagtgca gctggcaggc atcattgac 29

<210> 9

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 9

actacctgcc tgtcaaccag aac 23

<210> 10

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 10

gtcgtggaca tccctggctg atg 23

<210> 11

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 11

gtaacgtcgt ggacatccct ggctgcac 28

<210> 12

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 12

tgtcccacta ctagtcattc ccac 24

<210> 13

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 13

gtggctcagc atgcgggagg tct 23

<210> 14

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 14

gttcactggc tcagcatgcg ggaggctg 28

<210> 15

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 15

tcttgagtgt agcccagcgt aac 23

<210> 16

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 16

ggtttttaag taatttgtta tgggttcac 29

<210> 17

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 17

gccaaggttt ttaagtaatt tgttatgggt tact 34

<210> 18

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 18

agagcttggc atattgtatc tataccatta 30

<210> 19

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 19

caggattgta agcaccccct ag 22

<210> 20

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 20

gacattagga ttgtaagcac ctcctga 27

<210> 21

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 21

ttggtcaata tagaattttg gatttccc 28

<210> 22

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 22

gaaatttgtg tcttctgttc tcaaatc 27

<210> 23

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 23

gtcttcaaat ttgtgtcttc tgttctcaac gt 32

<210> 24

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 24

acacgtgaag gcaggaattg t 21

<210> 25

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 25

actaggatcc tgcttcctgg ta 22

<210> 26

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 26

gttgaaggtc atcacagagc catg 24

<210> 27

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 27

aggcgcagta ggggttactt 20

<210> 28

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 28

gggtggtgct tacggtcatc t 21

<210> 29

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 29

aactttgctc ctgcccttgg 20

<210> 30

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 30

gctgttcccc acccacagtt c 21

<210> 31

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 31

gccagatata cgcgttgaca 20

<210> 32

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 32

gggcgtactt ggcatatgat 20

Claims

1.一种用于抗癫痫药物用药指导的多重基因检测试剂盒，其特征在于，包括如下表所示的同步快速定性检测与抗癫痫药物用药相关的8个SNP位点和4个内参基因的引物组合物：SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.32、PCR反应液、阳性对照品和超纯水；所述8个SNP位点为：CYP2C19基因的*2、*3和*17位点，CYP2C9基因的*2和*3位点，UGT1A4基因的rs2011425位点，POLG基因的A467T和W748S位点；

2.如权利要求1所述的一种用于抗癫痫药物用药指导的多重基因检测试剂盒，其特征在于，针对每一个SNP位点设计了3条引物，其中2条引物分别与野生型基因和突变型基因互补结合，1条共用的引物分别与野生型和突变型引物形成引物对扩增出片段长短有2～10个碱基差异的PCR产物。

3.如权利要求1所述的一种用于抗癫痫药物用药指导的多重基因检测试剂盒，其特征在于，在多重PCR反应中加入3个人基因组DNA内参和一个PCR反应内参。

4.如权利要求1所述的一种用于抗癫痫药物用药指导的多重基因检测试剂盒，其特征在于，所述阳性对照品包括所述8个SNP位点和所述4个内参基因所对应的质粒混合物。

5.如权利要求1所述的一种用于抗癫痫药物用药指导的多重基因检测试剂盒，其特征在于，所述PCR反应液包括以下组分：超纯水、2×PCR缓冲液、DNA聚合酶和dNTP。

6.一种用于抗癫痫药物用药指导的多重基因检测试剂盒的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)采集口腔脱落细胞保存于细胞采集卡，或采集血液样本并提取核酸；(2)采用步骤1所述细胞采集卡或核酸为模板进行多重PCR扩增；(3)按PCR产物片段长短/质量同步分离8个SNP位点及4个内参；(4)结果分析判读。

7.如权利要求6所述一种用于抗癫痫药物用药指导的多重基因检测试剂盒的使用方法，其特征在于，所述口腔脱落细胞保存于细胞采集卡上，可不需要核酸提取，直接用于PCR扩增。

8.如权利要求6所述一种用于抗癫痫药物用药指导的多重基因检测试剂盒的使用方法，其特征在于，所述PCR反应条件为：95℃5min；94℃10s，61℃1min；70℃30s，循环29次；60℃15min；4℃直至收取PCR产物。