CN110527719A - 一种建立妊娠糖尿病风险评估的早期筛查量表的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种建立妊娠糖尿病风险评估的早期筛查量表的方法，该方法包括如下步骤：通过对国内外权威的科研文献的查阅，确定易感基因SNP选择标准，找到候选基因位点；设计对每个SNP位点进行核酸质谱分析的引物，进行PCR扩增及基因检测；建立复杂疾病的风险评估模型，计算个体的遗传风险值；结合遗传风险值和外因风险因素建立妊娠糖尿病风险评估的早期筛查量表。该方法采用了内外因联合分析，通过该方法建立的妊娠糖尿病风险评估的早期筛查量表对妊娠糖尿病进行早期筛查，大大增加了风险评估的准确性，从而降低了临床上的漏诊率。
Description
技术领域
本发明涉及妊娠糖尿病风险评估技术领域，具体来说，涉及一种建立妊娠糖尿病风险评估的早期筛查量表的方法。
背景技术
妊娠糖尿病早期筛查方法建立的意义如下：(1)妊娠糖尿病患病率高，对孕妇、胎儿、新生儿、产后妇女都有很大危害；(2)临床上在24～28周才会确诊是否患有GDM，错过了最佳的控糖时间；有研究表明单纯使用高危因素筛查，即使一向高危因素都不存在的情况下，仍有34.7％的人在孕中晚期被确诊为妊娠糖尿病，说明早期的筛查方法具有很高的漏诊率，所以说目前临床上没有特别有效的早期筛出方法；(3)中国孕产妇数量庞大，一旦方法建立成功会有很高的经济效益；(4)妊娠糖尿病预防意识弱，普通民众对GDM的认识还停留在仅发生在孕期的血糖异常，需要加强患者教育，提高民众的预防意识；(5)国内外还没有妊娠糖尿病风险筛查产品出现；(6)早期筛查出风险之后，通过早期干预可以降低GDM的患病率，对中国的流行病学研究，对节省医疗开支，降低不良围产结局等有明确的临床意义。
目前对妊娠糖尿病早期筛查的技术手段：妊娠糖尿病是多基因遗传的复杂疾病，即疾病的发生与遗传相关，也与孕妇的生活方式饮食偏好相关，目前临床上对于妊娠糖尿病的早期筛查使用量表的方式，但是有很高的假阴性率，即使一向高危因素都不存在的情况下，仍有34.7％的人在孕中晚期被确诊为妊娠糖尿病，说明早期的筛查方法具有很高的漏诊率，这点就可以通过遗传易感性来解释，所以国内外众多临床科研通过GWAS技术来研究妊娠糖尿病的候选基因，且取得了一定的进展。
国内专利“用于检测妊娠糖尿病患病风险的SNP标志物及试剂盒”(专利申请号：201710827583.9，专利公开号：107723357A)，该发明通过文献报道选取了10个与妊娠糖尿病可能相关的SNP位点，通过核酸质谱对这10个SNP位点进行检测，结果表明通过实验方法可以对10个SNP位点进行分型，但是并未阐明该技术后续如果用于对妊娠糖尿病的风险进行评估，即如何进行临床应用，该发明主要参考的是Zhang C等2013年发表的一篇meta分析的结果，介绍了从1994年到2012年以来国际上对妊娠糖尿病易感基因的研究，并通过统计分析找到结果一致的和妊娠糖尿病发病显著相关的基因。包括TCF7L2，GCK，KCNJ11，CDKAL1，IGF2BP2，MTNR1B，IRS1等。结果阐述出与GDM相关的一些基因及SNP位点。但仍存在不足之处：(1)该文献发表于2013年，距今6年时间有更多的关于GDM的研究出现，该研究所涵盖的SNP位点，不足以对GDM的发病进行全面解释，有很高的假阴性率，6年时间有众多新的GDM相关的易感基因位点被挖掘出来；(2)该文献中大量的分析数据都是应用欧洲人群的队列数据，白种人与黄种人在遗传上的差异会导致所选取的基因在中国人的队列中不能得到一致性的结论。
发明内容
针对相关技术中的上述技术问题，本发明提出一种建立妊娠糖尿病风险评估的早期筛查量表的方法，能够克服现有技术的上述不足。
为实现上述技术目的，本发明的技术方案是这样实现的：
一种建立妊娠糖尿病风险评估的早期筛查量表的方法，该方法包括如下步骤：
(1)通过对国内外权威的科研文献的查阅，首先确定易感基因SNP选择标准，通过易感基因SNP选择标准，找到候选基因位点，所述候选基因位点为28个；
(2)设计对每个SNP位点进行核酸质谱分析的引物，进行PCR扩增及基因检测；
(3)建立复杂疾病的风险评估模型，通过符合要求的文献中病例对照分析的数据，建立每个基因位点在疾病发生中的权重，计算个体的遗传风险值，遗传风险值＜0.87时定义为低风险或正常，0.87≤遗传风险值＜1.33时定义为中风险，遗传风险值≥1.33时定义为高风险；
(4)结合步骤(3)中的遗传风险值和外因风险因素建立妊娠糖尿病风险评估的早期筛查量表。
进一步的，所述易感基因SNP选择标准为：
1)有GWAS在中国人队列研究的病例对照分析，且存在显著差异，同时考虑样本量对数据价值的影响；
2)有GWAS在欧洲人中的病例对照分析，且存在显著差异，在中国队列的研究中得到验证；
3)候选基因法在中国人的多中心研究中病例对照分析，有显著差异，且结果一致；
4)在中国人群的基因功能学研究结果一致，与妊娠糖尿病的发生相关。
进一步的，所述候选基因位点为：rs7754840，rs7756992，rs1063192，rs2383208，rs1799884，rs4607517，rs1111875，rs5015480，rs7923837，rs4402960，rs1470579，rs2074196，rs1801278，rs5219，rs2237892，rs1387153，rs10830963，rs10830962，rs7936247，rs1801282，rs2466293，rs3802177，rs13266634，rs391300，rs7903146，rs12255372，rs4506565，rs34872471。
进一步的，每个基因位点在疾病发生中的权重用OR值表示，每个位点有3种基因型分别是aa，ab和bb，三种基因型的OR值分别是ORa，ORab，ORb，每个基因型在亚洲人中的基因型频率分别是Pa，Pab，Pb，那么该疾病的遗传风险值可以用如下公式计算得出：
RI＝(Pa1*ORa1+Pb1*ORb1+Pab1*ORab1)*(Pa2*ORa2+Pb2*ORb2+Pab2*ORab2)*……*(Pa28*ORa28+Pb28*ORb28+Pab1*ORab28)，
该个体的遗传风险值为：
PI＝OR1*OR2*……*OR28/RI。
进一步的，所述外因风险因素包括：一级糖尿病家族病史、寄往妊娠糖尿病病史、血糖异常史、年龄≥35周岁、产次≥3次、BMI≥24或BMI≤18、患有多囊卵巢综合征。
本发明的有益效果：本发明的建立妊娠糖尿病风险评估的早期筛查量表的方法通过参考更新的权威研究结果，选取中国人数据，建立了一种内外因联合分析的早期妊娠糖尿病风险筛查的量表，通过该量表对妊娠糖尿病进行早期筛查，使用内外因联合分析量表大大的增加了风险评估的准确性，与临床上金标准的相关性较好，准确性好，从而降低临床上的漏诊率，进而通过临床应用提高孕妇的营养管理的依从性，降低疾病的患病率，改善不良的围产结局。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
通过对国内外权威的科研文献的查阅，首先确定易感基因SNP选择标准：
1.有GWAS在中国人队列研究的病例对照分析，且存在显著差异的，同时考虑样本量对数据价值的影响；
2.有GWAS在欧洲人中的病例对照分析，且存在显著差异的，且在中国队列的研究中得到验证的；
3.候选基因法在中国人的多中心研究中病例对照分析，有显著差异的，且结果一致的；
4.在中国人群的基因功能学研究结果一致，与妊娠糖尿病的发生相关的。
通过上述4条标准，共找到如表1所示的28个候选基因位点：
表1 候选基因位点
实施例2
设计对每个SNP位点进行核酸质谱分析的引物，进行PCR扩增及基因检测；
对每个SNP位点进行核酸质谱分析的引物设计如表2所示：
表2 对每个SNP位点进行核酸质谱分析的引物
为节约检测费用，将反应体系设置为5μL：
PCR扩增的反应体系(5μL)
反应体系：
模板DNA 1μL，
引物mix 1μL，
10×Buffer 0.5μL，
MgCl2(25mM)0.4μL，
dNTP(25mM)0.1μL，
Hotstar(5U/μL)，
ddH2O 1.8μL；
反应条件：将密封的384孔板置于ABI9700PCR仪上反应：预变性95℃2min，(95℃30s，56℃30s，72℃1min)45个循环，72℃5min，Hold4℃。
实施例3
建立复杂疾病的风险评估模型，先通过符合要求的文献中(需满足：有原始数据，文章质量评级高，中国人队列数据)病例对照分析的数据，建立每个基因位点在疾病发生中的权重，用OR值表示。
每个位点有3种基因型分别是aa，ab和bb。三种基因型的OR值分别是ORa，ORab，ORb。每个基因型在亚洲人中的基因型频率分别是Pa，Pab，Pb。那么该疾病的遗传风险值可以用如下公式计算得出：
RI＝(Pa1*ORa1+Pb1*ORb1+Pab1*ORab1)*(Pa2*ORa2+Pb2*ORb2+Pab2*ORab2)*……*(Pa28*ORa28+Pb28*ORb28+Pab1*ORab28)
该个体的遗传风险值为PI＝OR1*OR2*……*OR28/RI。
PI值就是与群体的患病率相比，该受试者的终身患病风险是群体的水平的倍数。超过群体患病风险一定倍数的，说明该受试者的终身患病风险增加。
通过1000人基因计划中亚洲人的基因型分布频率分析，得到人群的患病分析在0.87～1.33之间，遗传风险值小于0.87时定义为低风险或正常；当遗传风险值在0.87～1.33之间时(包括0.87)定义为中风险，当遗传风险值大于1.33时(包括1.33)定义为遗传高风险。
实施例4
目前已经得到临床证实的妊娠糖尿病的外因风险因素主要包括：1)一级糖尿病家族病史；2)寄往妊娠糖尿病病史；3)血糖异常史；4)年龄≥35周岁；5)产次≥3次；6)BMI≥24或BMI≤18；7)患有多囊卵巢综合征。
结合内外因制作如表3所示的妊娠糖尿病风险评估的早期筛查量表：
表3 妊娠糖尿病风险评估的早期筛查量表
根据该量表可以将遗传易感性与外因风险做联合分析。表3中第一列为存在所述外因风险项目的数量。
实施例5
为了验证该方法的准确性，同时和已有方法进行对比，应用回顾性的临床样本进行验证。北京协和内分泌国家重点实验室赠与的283例样本，其中有27例生活方式数据不齐全，无法进行综合评估，剩余样本中有1例基因检测失败，共得到255例有效数据，其中GDM119例，非GDM116例，检测的成功率为99.6％，多重PCR扩增技术使检测方法简便易操作。
具体步骤如下：
(1)唾液DNA提取
利用康为世纪口腔拭子基因组DNA提取试剂盒，在GW1和GW2试剂中加入一定量的无水乙醇。从采样管中取500μL唾液样本，加入300μL GR、20μL Proteinase K和300μL GL，震荡混匀，56℃震荡孵育15min，加入300μL无水乙醇，震荡混匀；将750μL该溶液加入到收集管的吸附柱中，12000rpm离心1min，弃液；向吸附柱中加入400μL GW1，12000rpm离心1min，弃液；向吸附柱中加入400μL GW2，12000rpm离心1min，弃液；12000rpm离心2min，静置晾干；将吸附柱置于新的1.5mL离心管中，悬空加入40μL GE，静置5min，12000rpm离心1min，收集DNA溶液，质检，4℃保存。
(2)血卡DNA提取
基于协和医科大学基础研究所，使用打孔器在干血卡上血斑较厚区域打孔，取2片1mm大小的血片于1.5mL离心管中；加入200μL ddH2O，室温震荡10min，弃液；加入50μL B2,95℃孵育15min，弃液；加入40μL B3，室温震荡10min，质检，4℃保存。
(3)PCR扩增
将步骤1或2提取的待测样本的DNA分别加入到384孔板中，进行多重PCR扩增。按照多重PCR扩增的反应体系(5μL)加入到每个反应孔中，反应体系：模板DNA 1μL，引物mix 1μL，10×Buffer 0.5μL，MgCl2(25mM)0.4μL，dNTP(25mM)0.1μL，Hotstar(5U/μL)，ddH2O 1.8μL；反应体系配制好后使用PCR封口膜封紧，防止样品蒸发，震荡混匀，离心；将密封的384孔板置于ABI9700PCR仪上反应：预变性95℃2min，(95℃30s，56℃30s，72℃1min)45个循环，72℃5min，Hold 4℃；得到PCR扩增产物，离心备用。
(4)SAP消化反应
利用Sequenom平台配套试剂和操作步骤，完成待测样本SNP位点分型结果。将步骤3中得到的PCR扩增产物，按照SAP消化的反应体系(2μL)加入到每个反应孔中，反应体系：SAP×Buffer 0.17μL，SAP Enzyme(1U/μL)0.3μL，ddH2O 1.53μL；反应体系配制好后使用PCR封口膜封紧，防止样品蒸发，震荡混匀，离心；将密封的384孔板置于ABI9700PCR仪上反应：37℃40min，85℃5min，Hold 4℃；得到碱性磷酸化酶处理后的PCR产物，离心备用。
(5)单碱基延伸反应
利用Sequenom平台配套试剂和操作步骤，完成待测样本SNP位点分型结果。将步骤4中得到的碱性磷酸化酶处理后的PCR产物，按照单碱基延伸反应体系(2μL)加入到对应的每个反应孔中，反应体系：延伸引物mix 0.94μL，Gold×Buffer 0.2μL，Extension mix 0.2μL，Iplex Enzyme 0.041μL，ddH2O 0.619μL；反应体系配制好后使用PCR封口膜封紧，防止样品蒸发，震荡混匀，离心；将密封的384孔板置于ABI9700PCR仪上反应：94℃30s，(94℃5s，(52℃5s，80℃5s)5个内部循环)40个外部循环，72℃3min，Hold 4℃；得到单碱基延伸产物，离心备用。
(6)树脂纯化
利用Sequenom平台配套试剂和操作步骤，完成待测样本SNP位点分型结果。将步骤5的单碱基延伸产物的384孔板，轻轻撕下封口膜后，每孔加入16μL ddH2O；取干净的A4纸将6MG 384板置于其上，用小勺取适量纯化树脂；用塑料板反复左右推平纯化树脂，压实，使每孔树脂含量均匀；将384板倒置压在6MG 384板上，两板对调，6MG板在上，敲打6MG板背面，使树脂落入装有单碱基延伸产物的384孔板中；封口膜封好后，15rpm上下颠倒混匀30min，充分纯化。
(7)芯片点样
将步骤6中的384孔板离心，启动MassARRAY Nanodispenser RS1000点样仪，将树脂纯化后的延伸产物移至384孔SpectroCHIP芯片上；点样后的芯片使用MALDI-TOF分析，检测结果使用TYPER4.0软件分型并输出结果。
(8)检测完成后算出每个样本的遗传风险等级，使用内外因联合评估量表进行综合分析。
如表4所示，遗传检测、外因分析、联合分析三者检测的准确性分别为：63％，30％，71％，充分说明采用本发明的取得了较好的效果。
表4 遗传检测、外因分析、联合分析检测的准确性对比
综上所述，由于妊娠糖尿病是多基因遗传的，与之发病相关的候选基因远远不止10个，每个基因在疾病发病中起到的作用微效的，所以检测的基因越多，越能够提高产品的准确性，通过对国内外权威的科研文献的查阅，精准的找到与妊娠糖尿病相关的候选基因。更多的SNP位点的分型，对技术要求的难度更高，要考虑不同位点之间的相互干扰，考虑检验人员操作的便利性，考虑分型的准确性等等问题，设计一套30个位点左右的多重PCR反应体系是对技术的挑战。在基因检测结束之后，还不能根据基因测序结果直接阐明结果与疾病的相关性，需要建立复杂疾病的分析算法，通过算法评估受试者的患病风险。需要大量的中国人的病例对照研究数据，建立该种算法，同时，需要在一定样本中验证该算法。由于妊娠糖尿病的发病机制，与遗传和生活方式都相关，所以单纯使用外因量表或单纯使用遗传易感性筛查，都不足以保证筛查的准确性，只有通过遗传加生活方式的联合评估才能得到更有益的效果。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 北京天平永达生物科技发展有限公司
<120> 一种建立妊娠糖尿病风险评估的早期筛查量表的方法
<160> 84
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
acgttggatg aatgcagaag tccaggttcc 30
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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acgttggatg agatgtgcag gccaacattc 30
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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caaaccaaac cca 13
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acgttggatg cagatgatgg gagctgtcac 30
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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acgttggatg gtgtaaggca tctggtggag 30
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ggactttgcc acc 13
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cggtacctgg gct 13
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ggaatcgctt tctg 14
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acgttggatg gggcatgttt gcaaacacaa 30
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gtggacagta gatt 14
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acgttggatg tcgagatggg cagactggg 29
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tgccctgcac ctccc 15
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acgttggatg tcccaggcag ttactggttc 30
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gaattcacac catct 15
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cgaatgttga ttata 15
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acgttggatg taacagagac atcactgtcc 30
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catctatcaa gtcaac 16
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<212> DNA
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gtcctggcgg gctcca 16
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acgttggatg cagaggcctg agtaattatc 30
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atatccaggc aagaat 16
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gtgtcgaccg aagtgat 17
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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acaatcaagt catttcctct 20
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acgttggatg agcagacaga cacaaaagcc 30
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cacatagatt ttatgatacc 20
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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acgttggatg gacaattaat attcccccct g 31
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gcaccaaagg aagaaattca t 21
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acgttggatg ttgtgatgtg tcagtgctgg 30
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acgttggatg aaagcaagac ctgccttctg 30
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gagtggactg aatccaagtt g 21
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 82
acgttggatg aactaagggt gcctcatacg 30
<210> 83
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 83
acgttggatg tgcctcaaaa cctagcacag 30
<210> 84
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 84
cctacggcaa ttaaattata ta 22
Claims (5)
1.一种建立妊娠糖尿病风险评估的早期筛查量表的方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）通过对国内外科研文献的查阅，首先确定易感基因SNP选择标准，通过易感基因SNP选择标准，找到候选基因位点，所述候选基因位点为28个；
（2）设计对每个SNP位点进行核酸质谱分析的引物，进行PCR扩增及基因检测；
（3）建立复杂疾病的风险评估模型，通过符合要求的文献中病例对照分析的数据，建立每个基因位点在疾病发生中的权重，计算个体的遗传风险值，遗传风险值＜0.87时定义为低风险或正常，0.87≤遗传风险值＜1.33时定义为中风险，遗传风险值≥1.33时定义为高风险；
（4）结合步骤（3）中的遗传风险值和外因风险因素建立妊娠糖尿病风险评估的早期筛查量表。
2.根据权利要求1所述的建立妊娠糖尿病风险评估的早期筛查量表的方法，其特征在于，所述易感基因SNP选择标准为：
1）有GWAS在中国人队列研究的病例对照分析，且存在显著差异，同时考虑样本量对数据价值的影响；
2）有GWAS在欧洲人中的病例对照分析，且存在显著差异，在中国队列的研究中得到验证；
3）候选基因法在中国人的多中心研究中病例对照分析，有显著差异，且结果一致；
4）在中国人群的基因功能学研究结果一致，与妊娠糖尿病的发生相关。
3.根据权利要求1所述的建立妊娠糖尿病风险评估的早期筛查量表的方法，其特征在于，所述候选基因位点为：rs7754840，rs7756992，rs1063192，rs2383208，rs1799884，rs4607517，rs1111875，rs5015480，rs7923837，rs4402960，rs1470579，rs2074196，rs1801278，rs5219，rs2237892，rs1387153，rs10830963，rs10830962，rs7936247，rs1801282，rs2466293，rs3802177，rs13266634，rs391300，rs7903146，rs12255372，rs4506565，rs34872471。
4.根据权利要求1所述的建立妊娠糖尿病风险评估的早期筛查量表的方法，其特征在于，每个基因位点在疾病发生中的权重用OR值表示，每个位点有3种基因型分别是aa，ab和bb，三种基因型的OR值分别是ORa，ORab，ORb，每个基因型在亚洲人中的基因型频率分别是Pa，Pab，Pb，那么该疾病的遗传风险值可以用如下公式计算得出：
RI=（Pa1*ORa1+Pb1*ORb1+Pab1*ORab1）*（Pa2*ORa2+Pb2*ORb2+ Pab2*ORab2）*……*（Pa28*ORa28+Pb28*ORb28+Pab1*ORab28），
该个体的遗传风险值为：
PI=OR1*OR2*……*OR28/RI。
5.根据权利要求1所述的建立妊娠糖尿病风险评估的早期筛查量表的方法，其特征在于，所述外因风险因素包括：一级糖尿病家族病史、寄往妊娠糖尿病病史、血糖异常史、年龄≥35周岁、产次≥3次、BMI≥24或BMI≤18、患有多囊卵巢综合征。
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