CN101338337B - 多态性位点基因型预测抑郁症及药效的用途、方法和试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及5—羟色胺转运蛋白(5-HTT)基因13C/T多态性位点基因型用于预测个体抑郁症患病严重程度、抑郁症核心症状患病严重程度、预测抗抑郁药的药效和抗抑郁药对抑郁症核心症状的药效的用途、方法和试剂盒。其中，当5-HTT13C/T多态性位点基因型为13TT纯合型时，预测个体抑郁症严重程度较重，抑郁症核心症状严重程度较重，服用抗抑郁药后抗抑郁药的药效较好，抗抑郁药对抑郁症核心症状的药效较好；当5-HTT13C/T多态性位点基因型为13CC纯合型或13CT杂合型时，预测个体抑郁症患病程度较轻，抑郁症核心症状患病程度较轻，服用抗抑郁药后抗抑郁药的药效较差，抗抑郁药对抑郁症核心症状的药效较差。
Description
技术领域
本发明涉及5羟色胺转运蛋白(5-HTT)基因的多态性位点基因型用于预测抑郁症患病程度、抗抑郁药药效的用途。本发明还涉及一种通过测定5-HTT基因的多态性位点基因型，预测抑郁症患病程度、抗抑郁药药效的方法和试剂盒。本发明属于医药领域。
背景技术
抑郁症(Major depression)是以情绪低落、快感缺乏和兴趣丧失等精神心理症候群为主要表现并伴有其他心理和躯体症状的情感障碍。抑郁症的临床表现差异很大，其主要的临床表现可以分为核心症状和伴随症状(心理症状群和躯体症状群)两大类。抑郁的核心症状包括心境或情绪低落，兴趣缺乏以及乐趣丧失，这是抑郁的关键症状。其中，情绪低落是指病人体验到情绪低、悲伤；兴趣缺乏是指病人对各种以前喜爱的活动缺乏乐趣；乐趣丧失是指病人无法从生活中体验到乐趣，或日快感缺失(anhedonia)。以上三种主征是相互联系的，可以同时出现或只以其中某一、二种突出。
绝大多数抑郁症病人伴随有明显的焦虑症状和睡眠障碍等，有时也能成为患者突出的主诉。焦虑症状表现为主观焦虑和躯体焦虑两种类型。主观的焦虑显示为焦虑情绪、紧张、害怕、恐惧、对未来的莫名的担忧等；躯体焦虑显示为心悸、气短、出汗、口干、尿频等症状。严重焦虑的病人可以表现出激越、易怒、无原因的发火，甚至出现伤人、自伤等行为。焦虑的症状常常与睡眠障碍相关联，主要表现为入睡困难和睡眠感的缺失。抑郁症状和焦虑症状常常合并存在，并与睡眠障碍一起成为构成抑郁症状群的常见症状。
抑郁症的发病机理尚不清楚，目前认为单胺(包括儿茶酚胺和5羟色胺等)类物质在其中发挥重要作用。5-羟色胺(5-HT)水平或功能改变与抑郁症的发生和发展存在密切的关系。位于5-HT神经元的突触前膜上的5-羟色胺转运蛋白(5-hydroxytryptamine transporter，5-HTT)在5-HT系统中起着重要的作用(Meyer JH，Houle S，Sagrati S.et al.Brain serotonin transporter bindingpotential measured with carbon 11-labeled DASB positron emissiontomography：effects of major depressive episodes and severity ofdysfunctional attitudes.Arch Gen Psychiatry.2004；61：1271-9)。5-HTT与突触间隙中的5-HT结合，并将其转运到神经元的轴突末端。神经刺激后5-HTT调节5-HT快速去除和5-HT释放循环。5—HTT位于神经末梢突触前膜，接近中脑、脑干中缝核的5-HT神经元树突及其投射区域，如下丘脑，边缘系统，基底节和大脑皮层，特别是前额叶，有12个疏水跨膜(TM)区域。人类5-HTT基因名称为SCL6A4(溶质载体家族6即神经递质转运蛋白，成员4，solute carrier family6，member4)，位于17q11.1-17q12，跨越37.8kbp，包括14个外显子，编码630个氨基酸的蛋白。5-HTT基因的转录活性由位于转录起始点上游的1.4kb5’区域命名为5-羟色胺T启动子区(5-HTTLPR)进行调节的，由44bp插入和缺失形成l和s两种等位基因。在非翻译区域有三个变异：1位于5-HTTLPR和转录起始位点间的380bp缺失，在体内不稳定，可能涉及5-HTTLPR依赖机制。2VNTR(可变数目串连重复)：位于第2内含子区域的可变数目的串连重复。33’UTR区域的腺苷酸位点G-T的颠换。
抑郁症是多基因遗传疾病，具有很高的生物学异源性。长期以来对于抑郁症的诊治几乎完全凭借医生的临床经验，主观性强、缺乏客观的生物学标志，使抑郁症的诊断治疗水平落后于其他躯体疾病。同时，常规抗抑郁药治疗仅约1/2—2/3的患者有临床疗效，能够达到临床缓解的更低至1/3—1/2，并且抗抑郁药物临床起效慢，通常服药4—6周后才能充分发挥抗抑郁效果(Berman RM，Narasimhan M，Charney DS：Treatment-refractory depression：definitionsand characteristics.Depress Anxiety.1997；5：154-164)，而不同患者使用同一种药物其疗效和副反应上有很大区别。这些问题长期困扰着临床医生。
对于复杂性疾病进行单核苷酸多态性(SNP)的研究为了解疾病的发病机理、疾病的诊断及疾病易感性研究提供了重要基础。93％的人类基因都存在SNP，通常为双等位基因，是应用前景最好的遗传标记物。基因组DNA序列的变异，被认为是决定人们的疾病易感性和药物反应的重要因素。为了更早地更全面地防治抑郁症，迫切需要对于抑郁症及其药物治疗进行早期预测，本发明即提供一种新的预测抑郁症患病严重程度及药物治疗的用途、方法以及试剂盒。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是通过研究与抑郁症患病严重程度相关的基因多态性位点基因型，提供5-HTT基因的多态性位点基因型用于预测抑郁症严重程度的用途。
同时，本发明提供5-HTT基因的多态性位点基因型用于预测抑郁症核心症状严重程度的用途。
在本发明中，“抑郁症”是指以情绪低落，快感缺乏和兴趣丧失等精神心理症候群为主要表现并伴有其他心理和躯体症状的情感障碍。抑郁症的临床表现包括核心症状和伴随症状两大类。抑郁的核心症状包括情绪低落(或心境低落)、兴趣缺乏以及乐趣丧失。其中，情绪低落的病人体验到情绪低，悲伤；兴趣缺乏是指病人对各种以前喜爱的活动缺乏乐趣；乐趣丧失是指病人无法从生活中体验到乐趣，或曰快感缺失(anhedonia)。焦虑和睡眠障碍是抑郁症的伴随症状。
本发明另一个要解决的技术问题是提供5-HTT基因的多态性位点基因型预测抗抑郁药物药效的用途。
同时，本发明还提供5-HTT基因的多态性位点基因型用于预测抗抑郁药物对抑郁症核心症状药效的用途。
在本发明中，“抗抑郁药物”是指选自5-羟色胺再摄取抑制剂(selectiveserotonin reuptake inhibitors，SSRI)、选择性5-HT及去甲肾上腺素(NE)再摄取抑制剂(serotonin-norepinephrine reuptake inhibitor，SNRI)、5-HT受体拮抗剂/再摄取抑制剂(serotonin antagonist/reuptake inhibitor，SARI)、NE及特异性5-HT能抗抑郁药(noradrenergic and specificserotonergic antidepressant，NaSSA)。其中，SSRI类药物包括氟西汀(fluoxetine)、帕罗西汀(Paroxetine)、舍曲林(Sertraline)、氟伏沙明(Fluvoxamine)、西肽普兰(Citalopram)和S-西肽普兰(Escitalopram)。SNRI类药物包括文拉法辛(venlafaxine)和度洛西汀(duloxetine)。SARI类药物包括曲唑酮(Trazodone)、奈法唑酮(Nefazodone)。NaSSA类药物包括米氮平(Mirtazapine)。其中，抗抑郁药物优选SSRI类药物，更加优选SSRI类药物中的氟西汀。
在本发明中，5-HTT基因的多态性位点基因型优选“5-HTT的13C/T多态性位点基因型”，5-HTT的13C/T多态性位点基因型”是指5-羟色胺转运体基因(SCL6A417q11.1-17q12)位于13内含子处的多态性位点基因型，在该位点存在C/T的单核苷酸多态性(NCBI SNP ID：rs2054847)，即当两条染色体相应位置均为“C”时，该位点基因型为“5-HTT13CC纯合型”；当两条染色体相应位置分别为“C”和“T”时，该位点基因型为“13CT杂合型”；当两条染色体相应位置均为“T”时，该位点基因型为“13TT纯合型”。
在本发明中，5—HTT的基因型多态性还进一步通过确定13C/T多态性位点附近与之存在连锁不平衡的其它多态性位点的基因型而实现。优选地，所述其它多态性位点包括无义突变位点、错义突变位点以及位于基因内含子部位、基因调节部位的多态性位点。
在本发明的一个实施方案中，当：
(1)5-HTT13C/T(rs2054847)多态性位点基因型为13TT纯合型时，预测个体抑郁症严重程度较重；
(2)5-HTT13C/T(rs2054847)多态性位点基因型为13CC纯合型或13CT杂合型时，预测个体抑郁症严重程度较轻。
在本发明提供的实施方案中，当：
(1)5-HTT13C/T(rs2054847)多态性位点基因型为13TT纯合型时，预测个体抑郁症核心症状严重程度较重；
(2)5-HTT13C/T(rs2054847)多态性位点基因型为13CC纯合型或13CT杂合型时，预测个体抑郁症核心症状严重程度较轻。
在本发明提供的又一个实施方案中，当：
(1)5-HTT13C/T(rs2054847)多态性位点基因型为13TT纯合型时，预测抗抑郁药的药效较好；
(2)5-HTT13C/T(rs2054847)多态性位点基因型为13CC纯合型或13CT杂合型时，预测抗抑郁药的药效较差。
在本发明提供的实施方案中，当：
(1)5-HTT13C/T(rs2054847)多态性位点基因型为13TT纯合型时，预测抗抑郁药针对抑郁症核心症状的药效较好；
(2)5-HTT13C/T(rs2054847)多态性位点基因型为13CC纯合型或13CT杂合型时，预测抗抑郁药针对抑郁症核心症状的药效较差。
本发明还提供了通过测定来自受试者的生物样品中5—HTT基因13C/T多态性位点基因型，预测个体抑郁症患病严重程度、抑郁症核心症状患病严重程度、预测抗抑郁药的药效和抗抑郁药对抑郁症核心症状的药效的方法。其中，当5-HTT13C/T(rs2054847)多态性位点基因型为13TT纯合型时，预测个体抑郁症患病程度较重，抑郁症核心症状患病程度较重，服用抗抑郁药后抗抑郁药的药效较好，抗抑郁药对抑郁症核心症状的药效较好；当5-HTT13C/T(rs2054847)多态性位点基因型为13CC纯合型或13CT杂合型时，预测个体抑郁症患病程度较轻，抑郁症核心症状患病程度较轻，服用抗抑郁药后抗抑郁药的药效较差，抗抑郁药对抑郁症核心症状的药效较差。
在本发明所述的方法，可以使用包括选自以下的差异核酸分析技术：聚合酶链反应(PCR)、聚合酶链反应—限制性片段长度多态性、PCR-等位基因特异性寡核苷酸探针法、PCR-序列特异寡核苷酸法、序列测定、PCR-序列特异性引物法、PCR-荧光法、PCR指纹图法、寡核苷酸连接分析、荧光能量共振转移的检测法、生物芯片、核酸芯片、质谱技术、基因扫描、单链构象多态性、变性梯度凝胶电泳、酶或化学错配切割法、Taqman生物检测方法、纳米技术。
PCR、PCR-RFLP、生物芯片、序列测定、基因扫描基因型检测方法是本领域技术人员常规使用的方法。Taqman技术是一种运用荧光技术进行实时定量PCR的方法。生物芯片是指采用广岛原位合成或微量点样等方法，将大量生物大分子比如核酸片段、多肽分子甚至组织切片、细胞等生物样品有序地固化于支持物(如玻片、硅片、聚丙烯酰胺凝胶、尼龙膜等载体)的表面，组成密集二维分子排列，然后与已标记的待测生物样品中靶分子杂交，通过特定的仪器如激光共聚焦扫描仪或电荷偶联摄影相机(CCD)对杂交信号的强度进行快速、并行、高效地检测分析，从而判断样品中靶分子的数量或质量。纳米技术利用功能化的金纳米颗粒，颗粒直径范围在10—40nm。特异性的寡核苷酸序列附着于金纳米颗粒表面，通过特异性的分子杂交、特异性的荧光信号系统或者其他显色系统使信号得到富及放大，从而得到基因型的信息。其中优选的检测方法为PCR、PCR-RFLP、Taqman技术、生物芯片、核酸芯片或者纳米技术。本发明对于多态性位点基因型的检测方法的说明并非是对于检测方法的限定，任何本领域技术人员采用常规的生物技术方法通过检测本发明的多态性位点基因型来预测个体抑郁症患病程度、抗抑郁药药效的方法均属于本发明内容，还可以进一步包括采用常规的生物技术方法通过检测本发明的多态性位点功能型基因型的转录产物和/或者表达产物的差异间接反映相关联的多态性位点来预测生物样品中个体抑郁症患病程度、抗抑郁药药效的方法。
在本发明中，所述的生物样品选自：血液样品、体液样品、组织样品和培养细胞，优选的，所述样品为血液样品。其中血液样品包括外周血细胞、白细胞、血清等，体液样品包括尿液、唾液、组织液、脑脊液、体腔渗出液等，组织样品包括口腔粘膜试子、毛发、皮肤、活检组织、组织样分泌物、排泄物样本等。
本发明还提供了用于预测个体抑郁症患病严重程度、抑郁症核心症状患病严重程度、预测抗抑郁药的药效和抗抑郁药对抑郁症核心症状的药效的试剂盒。在本发明提供的试剂盒中，当5-HTT13C/T(rs2054847)多态性位点基因型为13TT纯合型时，预测个体抑郁症患病程度较重，抑郁症核心症状患病程度较重，服用抗抑郁药后抗抑郁药的药效较好，抗抑郁药对抑郁症核心症状的药效较好；当5-HTT13C/T(rs2054847)多态性位点基因型为13CC纯合型或13CT杂合型时，预测个体抑郁症患病程度较轻，抑郁症核心症状患病程度较轻，服用抗抑郁药后抗抑郁药的药效较差，抗抑郁药对抑郁症核心症状的药效较差。
在本发明提供的试剂盒中，可以包括用于检测生物样品中5—HTT基因的13C/T多态性位点基因型的多态性分型寡核苷酸探针和进行检测的反应体系。其中，寡核苷酸探针能特异地与含有所述5—HTT基因的13C/T多态性位点的核酸杂交。寡核苷酸探针优选包含SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示的探针。
等位基因特异性探针的序列为：
VIC-5’TCAGGCACGACATTT3’-NFQ(SEQ ID No.3)
FAM-5’TCAGGCACAACATTT3’-NFQ(SEQ ID No.4)
在本发明提供的试剂盒中，可以包括用于扩增含5—HTT基因的13C/T多态性位点的5—HTT基因片段的特异性引物、能够特异性识别并切断所述位点处特异性核酸序列的限制性内切酶及其缓冲液。其中，限制性内切酶优选为AvaII。在上述试剂盒中，还可以进一步包括核酸提取试剂、PCR反应试剂和阳性对照模板。其中，PCR反应试剂含有四种脱氧单核苷酸、耐热DNA聚合酶及其反应缓冲液；阳性对照模板包括含有5-HTT基因的13C/T多态性位点的纯合型、杂合型和/或纯合型序列的PCR产物、克隆核酸、克隆质粒、直接合成的核酸序列或基因组DNA。
引物序列为：
正向引物：5’GTAATAAAATATTATTTATTTTGATTTTGGCTCCTGCTG3’(SEQ IDNo.1)
反向引物：5’AGAAACTCAATGACTGTGCATCAAGA3’(SEQ ID No.2)
本发明又提供了一种基因芯片，其中包含用于测定5-HTT的多态性位点基因型的多态性分型寡核苷酸探针；其中所述基因芯片优选为DNA芯片。
应当指出，本发明的所有技术方案不受限于任何理论，本发明对于位点基因型的检测方法的说明也并非是对于检测方法的限定，任何本领域技术人员采用常规的生物技术方法通过检测本发明的多态性位点基因型来预测以抑郁症患病程度、抗抑郁药物药效为核心的其他发明均属于本发明内容，还可以进一步包括采用常规的生物技术方法通过检测本发明的多态性位点基因型的转录产物和/或者表达产物的差异间接反映相关联的多态性位点来预测抑郁症患病程度、抗抑郁药物药效的事例。
如下实施例对本发明进行了进一步的说明，但本领域技术人员应当明白所有实施例只是为了更好地理解本发明，其在任何意义上均不是为了限制本发明的内容。
具体实施方式
实施例1测定5—HTT基因13C/T多态性位点基因型预测抑郁症严重程度的效果
一.研究对象
1患者来源：
全国12家精神专科医院和综合医院精神科或心理科门诊患者。
2纳入标准：
年龄≥18岁的男女病人；根据美国精神障碍诊断和统计手册第四版(Diagnosis and statistic manual for mental disorder-IV，DSM-IV)确诊为重性抑郁症(major depressive disorder)，既往无躁狂或轻躁狂发作史。单纯的心境恶劣障碍(dysthymia)不在纳入之列；HAMD17项总分≥16分；根据研究者的观点，病人必须能够配合所有的研究步骤。
3排除标准：
●既往精神病史：1)不能除外其他器质性或药物引起的继发性抑郁症或双向情感障碍；2)有严重自杀倾向、木僵状态、强迫症、暴食症或其他严重精神障碍病史；3)有酒或其他物质依赖或滥用证据者。
●其他病史：1)手术后一年康复期；2)1年内有过胃溃疡、慢性腹泻等胃肠道疾病、肝胆疾病(慢性肝炎、肝硬化、胆道结石等)、原发性慢性肾病、肾功能不全等影响氟西汀正常吸收、代谢、分布和排泄功能的患者；3)有严重脑外伤史；或有其他严重合并症，如脑卒中、心脏病、糖尿病、心功能不全等慢性进行性或恶化的器质性疾病等；4)实验室或体格检查发现明确躯体或神经系统严重疾病者。
●药物治疗史：1)最近六个月接受过电抽搐治疗(ECT)，或长期使用长效的抗精神病药物或氟西汀；2)最近三个月内曾经接受系统(治疗剂量4周以上)的抗抑郁药物治疗；3)最近四周内服用过任何抗精神病药物或抗抑郁药物，不管剂量多大或疗程多长；4)最近两周内使用过单胺氧化酶抑制剂；5)必须长期合并使用具有中枢神经系统作用的药物或可能影响情绪的药物者；
6)对氟西汀过敏
生育史：妊娠或哺乳期妇女。目前未采取医学上认可的有效避孕措施因而有可能怀孕者
二研究方法
1评定工具和方法：
(1)诊断标准：美国精神障碍诊断和统计手册第四版(American PsychiatricAssociation.Diagnostic and Statistical Manual Disorder(DSM-IV).4th，Washington：psychiatric Association，1994.320-327)重性抑郁的诊断标准。
(2)诊断量表：遗传学研究用诊断检查(Nurnberger J.J.，Blehar，M.，Kaufmann，C.，et al.Diadgnostic interview for genetic studies；Rationale，uniquefeatures and training；NIMH Genetics Initiative，Arch.Gen.Psychiatry.1994)第三版
(3)严重程度评定量表(张明园主编精神科量表评定手册，湖南科学技术出版社，1998)：Hamilton抑郁量表(HAMD)17项版本
HAMD量表将症状群相应的分为5类因子(Cleary M，Guy W.Factoranalysis of the Hamilton depressionscale.Drugs Exp Clin Res1975；1：115-20.)，包括迟滞因子(HAMD条目1，7，8，14)；睡眠症状因子(HAMD条目4，5，6)；Maier症状因子(HAMD条目1，2，7，8，9，10)；焦虑/躯体化因子(HAMD条目10，11，12，13，15，17)；核心因子(HAMD条目1，2，3，7，8)；校验因子＝HAMD总分-焦虑因子分-睡眠因子分(HAMD条目1，2，3，7，8，9，14，16)。。
临床总体疗效评定量表CGI(Clinical Global Impression)：是美国NIMH修订的1976年版本。疾病严重程度SI(severity of illness)，采用0—7分的8级记分方法，根据具体病人的病情与同一研究的其他同类病人比较，做出评定。
(4)流行病学问卷：
所有参加者在第1天回答流行病学问卷，内容包括：疾病史、3个月内或者3个月至1年内有无负性生活事件；职业史：包括就业经历、工作性质、日常职业活动和职业暴露等；生活习惯：体育锻炼、生活节奏、睡眠情况、吸烟与被动吸烟情况、饮酒及饮茶情况等；日常膳食情况：饮食习惯，每日蔬菜、水果、肉类、副食品摄入情况等。
2研究过程：
(1)经过筛选合格的患者第1天完成Hamilton抑郁量表和临床总体印象(CGI)评定，完成治疗中出现的副作用量表的基线评定，遗传学研究用诊断检查(DIGS)及流行病学问卷等
(2)符合标准的病人进入药物治疗期。给与氟西汀分散片口服，每日20毫克，早晨或上午口服。治疗观察期6周。治疗前一天，治疗第一、二、四、六周末各进行一次临床随访。
(3)血样采取和基因型测定：采集患者静脉EDTA抗凝全血10ML，采血后充分混匀，分装，放于—20°C冻存，于3个月内完成DNA提取及基因型分析。
三实验室部分
1提取宿主细胞的基因组DNA：
(1)血中加入30ml红细胞裂解液，缓慢摇匀，室温静置10分钟，期间，摇动数次，彻底裂解红细胞；
(2)于4℃、2000转离心/分，10分钟，去上清，将沉淀之白细胞在旋转震荡器上打散，加蛋白酶40ul、RNA酶50ul，摇匀，加白细胞裂解液置15ml，混匀37℃水浴20分钟后取出，置冷水中；
(3)加冷的蛋白沉淀液4ml，混匀后放在-20℃冰箱5分钟，取出于4℃、3000转/分离心10分钟。将上清液倒入己加好15ml异丙醇的50ml离心管中缓慢摇动数次，至DNA絮状物析出；
(4)将析出的DNA絮状物移至另一1.5ml已装入75％乙醇的滤纸上，使液体挥发干；
(5)加DNA水化液1.5ml，置摇床，摇动过夜，备用；
(6)DNA浓度的测定采用紫外分光光度法，分别测定260nm及280nm两个波长下的OD值，以OD260nm×50所得值为DNA浓度。并以OD260nm/OD280nm比值估计DNA纯度。
2使用Taqman方法检测5-HTT基因的13C/T多态性位点基因型
(1)用PCR仪扩增5-HTT功能基因多态位点及其侧翼序列，在5ul PCR反应体系中含有基因组DNA10ng，2.5ul的Taqman2X Universal PCR Master MixNo AmpErase UNG(组成成份包括：AmpliTaq Gold DNA Polymerase，dNTPs withDutp，Passive Reference，以优化的缓冲液)，及0.72uM的正向引物，0.72uM的反向引物及两段带荧光报告基团的等位基因特异性探针各0.16uM.
引物序列为
正向引物：5’GTAATAAAATATTATTTATTTTGATTTTGGCTCCTGCTG3’(SEQ ID No.1)
反向引物：5’AGAAACTCAATGACTGTGCATCAAGA3’(SEQ ID No.2)
等位基因特异性探针的序列为：
VIC-5’TCAGGCACGACATTT3’-NFQ(SEQ ID No.3)
FAM-5’TCAGGCACAACATTT3’-NFQ(SEQ ID No.4)
PCR反应条件：预循环95°C10分钟；92°C15s，60°C1分钟循环50次。
(2)在7900型荧光定量PCR仪上检测荧光信息，进行基因型结果判定：
将完成PCR反应的PCR板放入7900型荧光定量PCR仪上，选用“AllelicDiscrimination”程序，进行扫描与结果的判断：
发出FAM荧光者的基因型为T/T纯合子；
发出VIC荧光者的基因型为C/C纯合子；
发出两种荧光者的基因型为C/T杂合子。
四统计学处理
使用SPSS11.5统计软件包进行分析。采用卡方分析基因型频率是否符合Hardy-Weinberg平衡定律。描述性统计：对连续变量做是否符合正态分布的分析，不符合首先采用数据转换，使之符合正态分布。推断性统计：P值：统计学计算时，给出具体P值。P<0.05表示有统计学意义。计量资料：t检验，单因素方差分析和多元回归分析。计数资料：采用卡方法、校正卡方检验。
结果
1 5-HTT等位基因和基因型分布情况
基线期761例患者入选研究，其中425例(56％)的血样进行了DNA检测基因型。5-HTT等位基因和基因型分布情况参见表1。其中CC基因型患者的比例低，将CC和CT基因型患者合并为含有C等位基因的一组患者，简称C+，TT基因型的患者不含C等位基因，简称为C-。进行Hardy-Weinberg平衡检验：χ2＝0.839，P＝0.36，符合Hardy-Weinberg平衡，说明样本来自遗传平衡的群体。
表1 5-HTT基因型和等位基因频率(N＝425)
2 5-HTT基因型分析中遗传模型的选择
三个基因型的患者在基线期HAMD总分的均值分别是TT型(n＝278)：23.19±5.23，CT型(n＝135)：21.98±4.62和CC型(n＝12)：20.83±4.06。TT型与CT型患者HAMD总分比较，差异有显著性(校正性别，年龄，本次病程，单次/复发和1年内有无生活事件等因素之后，P＝0.043)，CT型与CC型患者HAMD总分比较，差异无显著性(校正因素同上，P＝0.425)，因此采用显性遗传模型将CT型和CC型患者合并为一组(C+型)和TT型(C一型)患者进行比较。
3 基线期资料和5-HTT基因型比较：
计数资料采用卡方检验，计量资料采用独立样本t检验(使用均数±标准差表示)，其中本次病程、发作次数和CGI—SI采用非参数检验，使用中位数(最小值～最大值)表示。基线期测得5-HTT基因型的患者425例。患者性别，此次发病年龄，首次发病年龄，发作次数，民族，婚姻状况，受教育年限、单次或复发，本次病程，发病前3个月内有无负性生活事件等在5-HTT基因型之间无差异；而TT基因型在发病前1年内出现负性生活事件的频率、CGI-SI分数、HAMD总分高于含C+型患者，有统计学意义。其中TT基因型患者1年内有负性生活事件比例是C+基因型有负性生活事件比例的1.86倍(95％CI：1.23-2.83)。见表2。
表2 基线期资料和基因型
“—”表示非参数检验
4 基线期HAMD总分与基因型的关系
比较不同基因型抑郁症患者抑郁严重程度之间的差异。由于使用回归分析和t检验分析方法结果一致，同时使用回归分析便于我们与校正变量后的数据进行比较，所以在表格中显示的是回归分析采用校正前后的2组数据。校正因素同前。不同基因型患者的HAMD总分的差异有统计学意义。TT基因型患者的HAMD总分显著的高于C+基因型的患者。见表3。
该结果说明，该基因位点多态性与抑郁症的严重程度有关，TT基因型病人抑郁症更为严重。
5 基线期因子分与基因型的关系
比较不同基因型抑郁症患者各个症状群严重程度之间的差异。分析方法同前，不同基因型患者的迟滞因子、核心因子、Maier因子分数有统计学意义。我们根据结果设立校验因子，校验因子分数＝HAMD总分—(焦虑因子分数+睡眠因子分数)，并比较基因型的差异，分析方法同上。TT基因型患者在迟滞因子、核心因子、Maier因子和校验因子分数显著的高于C+基因型的患者。见表3。
6 基线期HAMD各条目分数与基因型的关系：
对于符合正态分布的数据采用独立样本t检验，对于经过转换后仍不符合正态分布的数据采用非参数检验分析。结果显示TT基因型患者的HAMD量表条目1抑郁心境，条目2罪恶感和条目7工作兴趣丧失这3项条目评分高于C+型的患者。见表4。
我们的研究显示TT基因型和C+基因型的患者相比，在发病年龄，性别等方面无统计学的差异；然而TT基因型患者报告的1年内负性生活事件多，HAMD总分和CGI-SI分数高，表明抑郁症状评定严重；TT基因型患者迟滞因子，核心因子和Maier因子的分数高，表明对单个症状的严重程度的评定上抑郁心境、罪恶感和工作兴趣丧失明显。
在研究中使用的5个因子中某些条目有重叠，例如迟滞因子和核心因子共同拥有条目1，7，8，Maier因子中包含了焦虑方面条目的评定，因此对因子分析的结果需要结合校验因子的分析进行综合评定。本研究显示TT基因型主要影响的是抑郁患者的核心症状，而对睡眠和焦虑方面的影响相对较小。
5-HTT 13 C/T(rs2054847)基因多态性能够修饰抑郁症病人对负性生活事件的感知，修饰抑郁症的严重程度，并且主要是修饰抑郁症的核心症状，即主观抑郁、兴趣丧失等症状的严重程度而与焦虑、睡眠等症状关系不大。TT纯合子抑郁症病人倾向于罹患更为严重，而且更为典型的抑郁症。
表3 基线期HAMD总分、因子分与基因型多元回归分析
*校正因素：性别，年龄，本次病程，1年内有无生活事件，单次/复发等
表4 基线期HAMD条目分数与基因型关系t检验和*非参数检验
实施例2 氟西汀药物疗效与5羟色胺转运体基因多态性的关系
一研究对象
1患者来源：见实施例1。
2研究药物：氟西汀(Fluoxetine)，美国礼来公司生产，商品名百优解。批号：A022974，A042635，A057046，A060206，A077246)，(每日1次，每次1片，每片20mg，共43天)，固定剂量。
3 临床研究过程：
(1)研究过程：经过筛选合格的患者第1天完成Hamilton抑郁量表和临床总体印象(CGI)评定，完成治疗中出现的副作用(TESS)量表的基线评定，遗传学研究用诊断检查(DIGS)及流行病学问卷等；医生指导患者口服氟西汀一片(20mg)，向病人介绍药物治疗的特点和常见的副反应。预约随访，指导填写随访日记，发放一周药物和随访日记本。
第2～42天患者每日在晨间口服氟西汀一粒，并填好服药日记。患者于开始服药后第8、15、29、43日到医院复查(其间可以有前后2天的允许范围)，由医生进行HAMD、CGI、TESS等检查。医生复核病人的服药情况，并发放下周服用的药物。同时，药物治疗期间每周电话随访2次，督促病人按时服药，填写随访记录，监测副反应和症状转归的处置。复诊前一天，由协调员电话提醒患者次日复诊及复诊时携带服药日记和未服完的药品以及已服用的药物的包装盒，用于核对病人的服药情况。
(2)合并使用药物：在氟西汀药物治疗期间不得合并使用其它抗抑郁药物，尽量不合并使用各种主要作用于中枢神经系统的药物，包括抗精神病药物、抗抑郁药物、抗躁狂药物、抗癫痫药物等。对于治疗中出现明显睡眠障碍的病人，可以短期(不超过2周)合并使用罗拉西泮(<6mg)、氯硝西泮(<6mg)、硝基西泮(<15mg)或艾司唑仑(<3mg)其中一种。在治疗的最后两周内尽量不合并应用此类药物，以免影响最终结果的评定。
(3)随访期间特殊情况的处理：研究过程中医生应注意观察患者的病情转归，一旦发现严重的并发症、病情恶化、或严重的副反应、或患者任何时候提出退出观察，都应及时终止研究。研究中尤其在治疗的前两周，医生应注意观察患者有无自杀倾向及其他严重情绪异常。应向患者家属详细交待病人病情和本次研究的目的，尤其是病人的自杀意念和行为。服用药物本身可能引起的胃肠道不适、焦虑、激惹、失眠、性功能障碍或皮疹等反应。由医生视严重程度及时处理，并在病例报告表(CRF)上做好记录。如果患者存在漏服药物，或未经医生允许服用其他药物等情况，需认真记录用量、服用时间和药物名称等，连续漏服3天以上(不含3天)、或累积漏服8天以上(不含8天)，要退出研究。服药量在方案规定剂量的80～120％之间的病人为依从性良好者。医生对病人的服药情况应进行严格的追踪观察。包括在每次随访时向病人详细介绍用药方法以及药物常见的副反应，让病人将服药后剩下的空药盒和泡板回收并查验，督促病人记随访日记等。
二 数据录入与统计学处理
使用SPSS11.5统计软件包进行分析。描述性统计：对连续变量做是否符合正态分布的分析，不符合首先采用数据转换，使之符合正态分布。推断性统计：P值：统计学计算时，给出具体P值。P≤0.05表示有统计学意义。计量资料：单因素方差分析和多元回归分析。计数资料：采用卡方法、校正卡方检验、Logistic回归分析等。
基线期761例患者中602例(79.1％)完成了43天治疗随访评估。
三 基因型和疗效关系
1疗效评估标准：
(1)随访时条目分数，因子分数和HAMD总分。
(2)减分和减分率：基线分数减去随访时分数的得分作为减分。减分率是(减分/基线分数)×100％。
(3)缓解(remission)：抗抑郁药治疗6周结束时HAMD评分<＝7分作为临床缓解标准(Keller MB.Remission versus response：The new gold standard of antidepressant care.J Clin Psychiatry2004；65：53-59)。
(4)有效(respond)：抗抑郁药治疗6周结束时HAMD治疗前后减分率下降>＝50％作为有效(Stassen HH，Angst J，Delili-Stula A.Severity at baseline and onset ofimprovement in depression：meta-analysis of imipramine and moclobemide versusplacebo Eur Psychiatry1994；9：129-136)。
2 研究结束时总分减分与基因型的关系：
校正性别、年龄、本次病程、单发/复发、基线HAMD分数、生活事件等因素，进行回归分析。校正前回归分析显示在治疗第29d和结束时(43d)TT基因型患者HAMD减分(10.18±5.74，13.91±6.20)高于C+基因型HAMD减分(8.81±5.65，12.41±5.68)，在校正上述变量后这种趋势仍然存在。见表5。
3 探讨研究结束时有效率和基因型的关系：
校正性别、年龄、次病程、单发/复发、生活事件等，进行Logistic回归分析。在研究结束时(43d)，TT基因型患者有效率是74.7％(162/217)，C+基因型有效率是69.6％(78/112)，有效率TT型呈现高于C+型患者的趋势。
4 探讨研究结束时缓解率和基因型的关系：
进行Logistic回归分析、校正变量为性别、年龄、本次病程、单发/复发，1年内生活事件、基线HAMD分数等。在研究结束时(第43天)，TT基因型患者缓解率(48.3％，44/112)是C+型患者的缓解率(39.3％，105/217)的1.68倍(R2＝0.096，P＝0.036)。
5 分析因子减分与基因型的关系：
在研究结束时(43d)，TT基因型患者的核心、迟滞和Maier因子减分高于C+型患者，有统计学意义；其中核心因子和Maier因子减分的差异是从治疗的第15d开始出现的，说明涉及抑郁症的核心症状群的因素的减分在TT基因型上出现的早。见表6、7。
6 校验因子与基因型的关系：
在第一部分研究中我们设立的校验因子(HAMD总分减去睡眠和焦虑因子的分值)，计算其随访时的减分值。在研究结束时校验因子减分：TT型是7.75，C+型是6.47，研究基因型对因子减分的影响，校正变量同上，显示TT型校验因子减分显著的高于C+型患者(t＝-2.413，P＝0.016)，证明了TT型患者除睡眠和焦虑以外的抑郁的核心因子减分显著。
抑郁症患者使用氟西汀治疗后，TT基因型患者的总分减分多于C+基因型患者，且有效率和缓解率显著高于C+基因型患者，说明TT基因型患者服用氟西汀后症状改善强于服用同样药物的C+基因型患者。在43天时，服用氟西汀的TT基因型患者的核心因子减分、迟滞因子减分和Maier因子减分高于C+型患者，有统计学意义，说明TT基因型患者服用氟西汀后症状的改善主要表现在核心症状改善，对于睡眠、焦虑等躯体性症状的改善与服用氟西汀后的C+基因型患者的治疗效果区别不明显。TT基因型患者与C+基因型患者相比，随访期间核心因子减分和Maier因子减分的改善差异是从治疗的第15天开始出现的，说明涉及抑郁症的核心症状群的因素的减分在TT基因型患者上出现的早，表明TT基因型患者使用SSRI类抗抑郁药物在治疗早期就能明显改善抑郁症核心症状。说明SSRI类抗抑郁药氟西汀治疗抑郁症的疗效受到5-HTT13C/T(rs2054847)多态性的修饰。TT基因型病人治疗后总体疗效显著提高，而且主要反映在抑郁症核心症状好转显著加快，最终疗效显著提高。
表7 随访期间HAMD总分减分与基因型
校正变量：性别，年龄，本次病程，单次/复发，1年内生活事件，基线期HAMD总分
表8随访期间因子减分和基因型
正变量：性别，年龄，本次病程，单发/复发，1年内生活事件，基线分数TT基因型与C+基因型相比，*P<0.05
表9 TT基因型与C+基因型随访43d时因子减分的多元回归分析
校正因素：性别，年龄，本次病程，基线分数，1年内生活事件等
实施例3：试剂盒及其实施方法
本实施例例证性地提供一种预测抑郁症发生风险的试剂盒，由以下组分组成：
(1)红细胞裂解液：含有NH4Cl，KHCO3，EDTA；
(2)白细胞裂解液：含有蛋白酶K(Sigma)、RNase A(Promega)、NaCl、5×Tris、EDTA、SDS；
(3)蛋白沉淀液：7.5M乙酸胺(pH7.4)
(4)核酸储存液：1M三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl，pH8.0)；
(5)PCR反应混合液：1.0ml[100mM Tris-HCl，100mM KCl，pH8.3(20°C)]；5.0μM MgCl2(Applied Biosystem)；各0.4mM dATP，dCTP，dGTP，dTTP，无菌双蒸10水配制，pH7.0(BioBasic Inc.)；PRCP基因的多态性位点基因型检测引物(上海生工生物工程有限公司)；
(6)Taq DNA聚合酶(Applied Biosystems)(5U/μl)：保存缓冲液：20mMTris-HCl(pH8.0)，100mM KCl，0.1mM EDTA，1mM DTT，0.5％NP40，0.5％(v/v)Tween20，50％甘油；
(7)阳性质粒：含有5—HTT基因的多态性位点杂合基因型个体全血标本，或者含有5—HTT基因的多态性位点杂合基因型的质粒；
(8)阴性对照：经DNAase I(Promega)处理的双蒸水；
(9)内切酶缓冲体系(10×)；
(10)限制性内切酶；
(11)PCR用水；
(12)10×电泳上样缓冲液：0.25％溴酚兰(Sigma)，40％(w/v)蔗糖水溶液。上述试剂盒可例如用于测定5—HTT基因的13C/T多态性位点基因型：
1提取宿主细胞的基因组DNA：
(1)血中加入30ml红细胞裂解液，缓慢摇匀，室温静置10分钟，期间，摇动数次，彻底裂解红细胞；
(2)于4℃、2000转离心/分，10分钟，去上清，将沉淀之白细胞在旋转震荡器上打散，加蛋白酶40u1、RNA酶50ul，摇匀，加白细胞裂解液置15ml，混匀37℃水浴20分钟后取出，置冷水中；
(3)加冷的蛋白沉淀液4ml，混匀后放在-20℃冰箱5分钟，取出于4℃、3000转/分离心10分钟。将上清液倒入己加好15ml异丙醇的50ml离心管中缓慢摇动数次，至DNA絮状物析出；
(4)将析出的DNA絮状物移至另一1.5ml已装入75％乙醇的滤纸上，使液体挥发干；
(5)加DNA水化液1.5ml，置摇床，摇动过夜，备用；
(6)DNA浓度的测定采用紫外分光光度法，分别测定260nm及280nm两个波长下的OD值，以OD260nm×50所得值为DNA浓度。并以OD260nm/OD280nm比值估计DNA纯度。
2使用Taqman方法检测5—HTT(5羟色胺转运体)基因的C/T多态性位点基因型
(1)用PCR仪扩增5—HTT功能基因多态位点及其侧翼序列，在5ul PCR反应体系中含有基因组DNA10ng，2.5ul的Taqman2X Universal PCR Master Mix No AmpErase UNG(组成成份包括：AmpliTaq Gold DNA Polymerase，dNTPs with Dutp，Passive Reference，以优化的缓冲液)，及0.72uM的正向引物，0.72uM的反向引物及两段带荧光报告基团的等位基因特异性探针各0.16uM.
引物序列为
正向引物：5’GTAATAAAATATTATTTATTTTGATTTTGGCTCCTGCTG3’(SEQ ID No.1)
反向引物：5’AGAAACTCAATGACTGTGCATCAAGA3’(SEQ ID No.2)
等位基因特异性探针的序列为：
VIC-5’TCAGGCACGACATTT3’-NFQ(SEQ ID No.3)
FAM-5’TCAGGCACAACATTT3’-NFQ(SEQ ID No.4)
PCR反应条件：预循环95°C10分钟；92°C15s，60°C1分钟循环50次。
(2)在7900型荧光定量PCR仪上检测荧光信息
将完成PCR反应的PCR板放入7900型荧光定量PCR仪上，选用“AllelicDiscrimination”程序，进行扫描与结果的判断：
发出FAM荧光者的基因型为T/T纯合子；
发出VIC荧光者的基因型为C/C纯合子；
发出两种荧光者的基因型为C/T杂合子。
根据基因型测定结果预测抑郁症发生风险如实施例1所述。
序列表
<110>北京华安佛医药研究中心有限公司
<120>多态性位点基因型预测抑郁症发生及预后的用途、方法和试剂盒
<130>122212223
<160>4
<170>PatentIn version3.3
<210>1
<211>39
<212>DNA
<213>人工合成
<400>1
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<211>26
<212>DNA
<213>GTAATAAAATATTATTTATTTTGATTTTGGCTCCTGCTG
<400>2
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<212>DNA
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<400>3
<210>4
<211>15
<212>DNA
<213>人工合成
<400>4
Claims (1)
1.用于预测抑郁症患病程度或氟西汀药效的试剂盒，该试剂盒包括用于检测生物样品中5-HTT基因的13C/T多态性位点基因型的寡核苷酸探针，其探针序列如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示，以及进行检测的反应体系，该反应体系还含有用于扩增含5-HTT多态性位点的5-HTT基因片段的特异性引物，该引物序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；其中所述5-HTT基因的13C/T多态性位点为rs2054847，当检测的5-HTT 13 C/T多态性位点基因型为13TT纯合型时，预测个体抑郁症患病程度较重、服用氟西汀后氟西汀的药效较好；当5-HTT 13 C/T多态性位点基因型为13CC纯合型或13CT杂合型时，预测个体抑郁症患病程度较轻、服用氟西汀后氟西汀的药效较差。
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