KR20010020422A - 보상 결핍 증후군의 대립형질 폴리유전자 진단 및 치료 - Google Patents

보상 결핍 증후군의 대립형질 폴리유전자 진단 및 치료 Download PDF

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케니쓰 블럼, 인코포레이티드
보오드 오브 리젠츠, 더 유니버시티 오브 텍사스 시스템
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Abstract

주의력 프로세싱의 증진은 엔돌피나제 억제제 또는 엔케팔리나제 억제제 및 임의로, 도파민 전구체, 또는 세로토닌 전구체, GABA 전구체, 또는 엔돌핀 또는 엔케팔리나제 방출 물질, 또는 로디올라 로지아(Rhodiola rosea) 추출물(파말린) 및/또는 후퍼진을 포함한 약초성 화합물을 투여하여 수득될 수 있다. 이들 성분은 정상적인 신경전달자 기능의 회복을 촉진시키고 결합된 성분은 중격측좌핵에서 도파민 방출을 증진시키며 비중독성이다. 도파민 전구체 L-페닐알라닌, 또는 L-티로신, 엔케팔리나제 억제제 D-페닐알라닌, 및/또는 세로토닌 전구체인 하이드록시트립토판 및 천연 아세틸콜렌에스테라제 억제제 및 크롬염(예: 피콜리네이트, 니코티네이트 등)의 사용이 특히 바람직하지만, 뇌 페닐알라닌 결핍과 관련된 증상 완화의 일조에만 제한되지는 않는다.

Description

보상 결핍 증후군의 대립형질 폴리유전자 진단 및 치료 {Allelic polygene diagnosis of reward deficiency syndrome and treatment}
발명의 배경
국제 약물 남용 연구 기간의 승인 번호 제1-R01-DA08417 및 담배 관련된 연구 질환 프로그램 승인 번호 제4RT-0110에 따라 정부가 본 발명에 대한 권리를 소유한다.
지난 수십년간, 화학 의존적 생물학적 기반에 관한 연구는 일부 뇌 영역과 신경전달자가 보상에 관련된다는 사실을 확립하게 되었다. 특히, 알콜, 오피트 및 코카인에 대한 의존성은 일련의 공통된 생화학적 기작에 좌우되는 것으로 나타났다[참조: Cloninger, 1983; Blum, 1978; Blum, 1989]. 연계와 관련된 뇌의 심부 뉴우런 회로 및 중격측좌핵 및 담창구로 일컫는 두개의 영역이 약물을 취하는 사람에게서 보상을 나타내는데 결정적인 것으로 보인다[참조: Wise and Bozarth, 1984]. 코카인, 모르핀 및 알콜의 만성적 사용은 연의 도파민 계에 있어 여러 생화학적 적응을 초래하는 것으로 입증되었다[참조: Ortiz et al., 1996].
중연 도파민계는 뇌의 상부 구조, 특히 오르비오프론탈(orbiofrontal) 피질(이마 뒷쪽 전두전엽 영역)을 뇌 중심의 소뇌편도, 및 중격측좌핵과 연결시키는데, 동물 연구에서 이들 부위는 중독 활성의 주요 부위인 것으로 입증되었다. 다중 중독과 관련된 다양한 뇌 경로는 특정 도파민계 수용체(D1, D2, D3, D4, D5)상에 망라되는데, 여기서 D2 부위가 가장 현저한 것으로 보인다. 각각의 남용 물질은 회로의 상이한 부분에 작용하는 것으로 보일지라도, 최종적인 결과는 동일하다: 도파민이 중격측좌핵 및 해마에 방출된다[참조: Koob and Bloom, 1988]. 도파민은 이들 강화 부위에서 보상의 주요 신경전달자인 것으로 보인다.
도파민 대사 이상은 몇몇 행동, 즉, 성적 질환[참조: Gessa and Tagiamonte, 1975], 조병[참조: Goodwin and Jamison, 1990], 분열병질 행동[참조: Carlsson, 1978; Snyder, 1976], ADHD[참조: Shaywitz et al., 1976], 행동성 장해 또는 공격성[참조: Rogeness et al., 1986; Valzelli, 1981; King, 1986], 알콜 남용[참조: Blum et al., 1990] 및 말더듬증과 연루된다. 추가로, DRD2 수용체 길항제인 할로페리돌은 몇몇 말더듬증 치료에 효과적인 것으로 보고되었다[참조: Murray et al., 1977; Prins et al., 1980]. 세로토닌 생성 기작이 강박성 행동에 가장 자주 연관되는 반면, 도파민 이상 또한 고려되었다[참조: Austin et al., 1991; Delgado et al., 1990]. 시상, 뇌신경절 및 전엽을 포함하는 이상 회로가 강박성 질환과 관련되고[참조: Baxter et al., 1992; Rauch et al., 1994; Modell et al., 1989] 도파민은 선조체 및 전엽에서 특히 주요 신경전달자이다.
중추 노르아드레날린 발생 기작의 결함은 빈번히 주의력-결핍 기능항진 질환의 병인과 관련되어 왔다. 읽기 및 기타 인지 불능을 보이는 ADHD 소아는 인지 불능을 나타내지 않는 ADHD 소아에 비해 혈장 노르아드레날린(NA)이 상당히 증가하는 것으로 밝혀졌다[참조: Halperin et al., YEAR]. 이들은 ADHD + 인지 불능이 NA 조절장애와 관련되어 두정/측두골 엽 주의력 중심에 영향을 준다고 제안하였다. 이들 뇌 영역이 청각 및 언어 제어 영역과 인접하여 위치하므로, 이것이 공동이환성의 인지 불능을 설명할 수도 있다. 임상적 견지에서, 클로니딘을 사용한 후 종종 발생되는 증상의 상당한 개선[참조: Hunt et al., 1985; Comings et al., 1990]은 적어도 일부 ADHD에서의 NA의 역할을 시사한다. 클로니딘은 노르아드레날린의 시냅스로의 방출 억제를 초래하는 전시냅스성 a2-노르아드레날린성 수용체 효능제이다[참조: Starke et al., 1974].
NA 및 청반(locus coeruleus, LC)이 주의력의 결정적 양태인 각성 및 불면증에 역할을 한다는 것이 제안되었다[참조: Aston-Jones et al., 1984]. 스트레스 내성 및 작업에 대한 우수한 수행능이 낮은 기초적 또는 지속적 수준의 카테콜라민 및 정신적 스트레스 동안의 보다 높은 급성적 방출과 관련되는 것으로 제안되었다[참조: Dienstbier, 1989]. 반대의 경우 증가된 기저의 지속적인 NA 자극과 스트레스 동안의 카테콜라민의 감소된 방출은 ADHD를 발생시킬 수 있다[참조: Pliszka et al., 1996]. NA 결함이 ADHD와 연루된다는 가설을 시험하기 위해, NA 대사물(3-메톡시-4-하이드록시페닐글리콜, MHPG)의 CSF, 혈장 및 뇨 방출의 다양한 연구가 수행되었다. 일부는 ADHD 피검자가 대조보다 낮은 MHPG 방출율을 나타낸다고 보인 반면[참조: Oades, 1987; Shekim et al., 1983; Shekim, Dekirmenjian, and Chapel, 1997; Yu-cum and Ye-feng, 1984] 다른 일부는 변화가 없거나[참조: Rapoport et al., 1978; Zametkin et al., 1985] NA 턴오버가 증가함을 밝혔다[참조: Khan and Dekirmenjian, 1981]. 에피네프린 농도는 상당히 낮은것으로 보고되거나[참조: Hanna et al., 1996; Klinteberg and Magnusson, 1989; Pliszka et al., 1994], 대조에 비해 ADHD 대상체에서 글루코스 섭취에 대해 무딘 반응을 나타내는 것으로 보고되었다[참조: Girardi et al., 1995]. 노르에피네프린은 PNMT 유전자에 의해 암호화되는 페닐에탄올아민 N-메틸-트랜스페라제에 의해 에피네프린(아드레날린)으로 전환된다.
ADHD의 치료에 보편적으로 사용되는 LC인 d-암페타민 및 데시프라민에서 NA 뉴우런을 지속적으로 억제하는 작용을 하지 못하는 에피네프린을 기초로한 ADHD 모델은 MHPG 방출의 상당한 감소를 초래함이 제안되었다[참조: Mefford and Potter, 1989; Shekim et al., 1979]. 하지만, ADHD 치료에 있어 가장 보편적인 처방약인 메틸페니데이트(리탈린)는 MHPG의 방출을 저하시키지 않고[참조: Zametkin et al., 1985], 펜플루라민[참조: Donnelly et al., 1989]과 같은 MHPG 방출을 감소시키는 기타 약물은 ADHD의 치료에 효과적이지 않다. 이러한 관측은 몇가지 유형의 ADHD가 존재하고 다수의 신경전달자 및 유전자가 관련된다는 사실과 일치한다.
NA 및 아드레날린성 α2-수용체가 두정/측두골 엽의 후방 피질 주의력 시스템[참조: Posner and Peterson, 1990; Pliszka 1996]의 LC에서의 조절 장애를 통해 ADHD의 몇몇 형태에서 역할을 한다는 사실이 제안되었으며, 제2형의 ADHD가 수행성 기능 장애 질환 및 충동과 관련된 전두전엽 주의력 시스템에 주로 영향을 주는 도파민성 결함에 기인한다는 사실이 제안되었다. 몇몇 도파민성 유전자, 즉 도파민 D2수용체(DRD2)[참조: Comings et al., 1991], 도파민 D4수용체(DRD4)[참조: Lahoste et al., 1996] 및 도파민 수송자(DAT1)[참조: Cook et al., 1995; Comings et al., 1996; Gill et al., 1997; Waldmaqn et al., 1996] 유전자가 ADHD와 관련됨이 밝혀졌다.
ADHD 및 읽기 불능을 보이는 소년이 ADHD만을 갖는 소년보다 상당히 높은 혈장 MHPG 농도를 나타내는 것으로 보고되었다[참조: Haperin et al., 1993; Halperin et al., 1997]. 후자의 연구에서, 이들은 또한 혈장 MHPG 농도와 WISC-R 언어적 IQ, 그리고 WRAT-R(광범위한 성취력 시험-개정판)에 의해 평가되는 읽기, 쓰기 및 산수 문제간에 상당한 네가티브적 상호관련이 있음을 입증하였다. 이러한 차이점은, 인지 불능을 보이는 ADHD가 ADHD의 별개의 아유형이라고 시사하는 이전의 연구와 일치한다[참조: August and Garfinkel, 1989; McGee et al., 1989; Pennington et al., 1993]. 또한, 두정엽 결함과 관련된 주의력 결핍의 유형이 선택적인 주의력 결핍 경향을 갖는다는 사실이 시사되었다[참조: Posner and Peterson, 1990; Dykman et al., 1979; Richards et al., 1990].
ADHD + 인지 장애가 아드레날린성 α2 수용체와 연루된 LC의 NA 대사의 조절 장애로 인한 것이고 주로 두정 피질의 후방 주의력 시스템에 영향을 주는 것으로 제안되었다[참조: Halperin et al., YEAR]. 이들 뇌 영역은 청각 및 언어 제어 영역과 인접하여 위치하므로, 이것이 공동 이환성 인지 불능을 설명할 수 있다. ADHD는 폴리유전자 장애이므로[참조: Comings et al., 1996] 이들이 순수한 형태라고 가정하는 것은 착오이며, 대부분의 피검자는 두가지 유형에 대한 선천적 유전자를 갖기 쉽다. 영장류에 대한 연구는 NA 및 아드레날린성 α2-수용체의 결함이 또한 전두전엽 인지 결함에 역할을 한다고 밝히고 있다[참조: Arnsten, 1997].
다양한 연구에 의하면 중독 행동에 있어 도파민 수용체가 연관되어 있음을 지시하고 있다. 코카인 피검자는 뉴우런 활성 수준의 감소를 보이는데, 이는 감소된 도파민 수용능과 일치한다[참조: Volkow et al., 1993]. D2 도파민 수용체를 갖는 뉴우런은 모르핀 중독된 랫트에서 인접 뉴우런으로부터 소량의 도파민을 받는 능력을 많이 상실하고 25% 더 작은 것으로 나타났다[참조: Nestler et al., 1996]. 오피트-의존성 피검자에서 관측되는 D2 수용체의 감소는 이들이 약물 남용을 시작하는 경우에 앞서 낮은 D2 수용체를 가지며, 이러한 저하가 이들이 약물 자가-투여에 대해 보다 손상받기 쉽게 한다는 사실을 나타내는 것으로 시사되었다[참조: Wang et al., 1997].
보상의 생물학에 관련되는 신경전달자의 시스템이 복잡할지라도, 적어도 3가지 기타 신경전달자가 뇌의 몇몇 부위에서 관여하는 것으로 공지되어 있다: 시상하부에서 세로토닌, 복측 피개 영역 및 중격측좌핵에서의 엔케팔린(오피오이드 펩타이드) 및 흑질, 복측 피개 영역 및 중격측좌핵에서의 억제 신경전달자 GABA[참조: Stein and Belluzzi, 1986; Blum and Kozlowski, 1990]. 흥미롭게도, 글루코스 수용체는 시상하부에서 세로토닌계와 오피오이드 펩타이드간의 중요한 연결부이다. 대안적 보상 경로는 청반에서 유래하는 뉴우런 섬유로부터 해마내 노르에피네프린의 방출과 연관된다.
오피오이드성 및 도파민성 계가 해부학적 및 기능상으로 상호연관된다는 증거가 있는데, 이러한 사실은 보상과 관련된 뇌의 도파민성 경로에 대한 에탄올 및 기타 약물의 작용을 중재하는데 있어서 내인성 오피오이드성 계의 역할을 시사하고 있다. 도파민 길항제 및 뇌의 도파민성 경로의 병변은 프리-프로엔케팔린 A 활성에 영향을 끼친다[참조: Morris et al., 1988; Normand et al., 1988]. 행동학적, 약리학적 및 신경화학적 연구는 에탄올 및 기타 약물 남용의 효과를 강화하는데 있어 오피오이드성 및 도파민성 계를 연루시킨다[참조: Blum et al., 1976a,b; Blum et al., 1982a; Blum et al., 1977; Blum et al., 1973; Koob and Bloom, 1988; Weiss et al., 1993]. 동물 연구에 의하면 오피트 수용체 효능제가 에탄올에 대한 선호도를 증가시키는 반면, 이들 수용체에 대한 길항제는 에탄올 소모를 감소시키는 것으로 나타났다[참조: Blum et al., 1975; Le et al., 1993]. 추가로, 동물 및 사람 알콜중독자에 대한 연구는 알콜 소모의 포지티브 강화 효과를 감소시키는 오피트 수용체 길항제의 유효성을 제시하고 있다[참조: O'Malley, 1992; Swift et al., 1994; Blum et al., 1975; Volpicelli et al., 1992]. 더구나, 동물에서 뇌 도파민 농도의 에탄올-유도된 증가는 오피트 수용체 길항제 날록손 및 날트렉손 모두에 의해 차단된다[참조: Widdowson and Holman, 1992; Benjamin et al., 1993]. 지아노우칼리스와 드 와엘에 의한 최근의 연구(1994)는 내인성 오피오이드 및 약물 남용(예, 알콜)의 역할을 지지하고 있다.
정상인에 있어서, 이들 신경전달자는 복합적인 자극과 복합적인 반응 사이의 일련의 여기 또는 억제하에 함께 작용하여, 궁극적인 보상으로서 행복의 감정을 초래하게 된다. 보상의 일련적 이론상으로, 이러한 세포내 상호반응의 혼란은 네가티브 감정을 초래하게 된다. 특정 다형성, 지속된 스트레스 또는 정신활성 약물(글루코스 포함)의 장기 남용을 포함한 유전적 비정상 상태는 동물 및 사람 모두에서 이상 열망의 자활 패턴을 초래하게 된다[참조: Blum, 1991].
약리학적 작용(브로모크립틴, 부프로피온 및 N-프로필노르아포모르핀)은 부분적으로 피검자의 도파민 D2 유전형에 의해 결정된다. DRD2 유전자의 A1 캐리어는 약리학적으로 D2 효능제에 대해 보다 반응적이다. 한 연구에 의해 이미 D2 효능제인 N-프로필노르-아포모르핀을 랫트 중격측좌핵으로 직접 미세주입하여 오피트로부터의 금단후 동물의 증상을 상당히 억제시킬 수 있으며, 도파민 자체는 알콜 금단 증상을 억제한다는 것이 밝혀졌다[참조: Harris and Aston-Jones, 1994; Blum et al., 1976b]. 이와 관련하여, 중격측좌핵 및 뇌의 다른 영역에서 도파민/내인성 오피오이드 펩타이드 상호작용에 대한 증거가 존재하는데, 이는 외인적 오피트에 의해 오피오이드 펩타이드계를 과자극하여 도파민 작용을 저하시킨다는 것이다[참조: Pothos et al., 1991]. 정상의 비-알콜 선호 랫트와 비교할때, 알콜 선호 랫트는 시상하부에서 세로토닌 뉴우런이 거의 존재하지 않으며, 시상하부에서 보다 고농도의 엔케팔린이 존재하며(덜 방출되기 때문이다), 중격측좌핵에 더 많은 GABA 뉴우런이 있으며 연계의 특정 영역에 낮은 밀도의 D2 수용체가 존재한다[참조: McBride et al., 1995; Smith et al., 1997; and McBride et al., 1997].
임상적 시도로, 특정 신경전달자(세로토닌 및 도파민)의 아미노산 전구체 및 효소 절단을 억제함으로써 엔케팔린 활성을 촉진하는 물질인 D-페닐알라닌을 SUD 또는 탄수화물 대식증에 걸린 프로밴드에게 투여하는 경우, 열망을 감소시키고, 스트레스 발생을 감소시키며, 재발을 감소시키고, 또한 회복 징후를 증가시키는 것으로 밝혀졌다.
다수의 연구소에서는 도파민 D2 수용체 대립형질과 다수의 충동-강박-중독 행동과의 결부를 포함하여, 특정 유전자와 다양한 행동 질환간의 관련성을 연구하였다. SPECT 스캐닝 기술에 의해 튜렛 질환 피검자에서 증가된 도파민 수송자 부위를 나타내는 연구를 제외하고는, DAT110/10 대립형질 및 DβHB1대립형질과 연관된 다형성의 수득되는 현상에 대해서는 공지된 것이 거의 없다[참조: Malison et al., 1995, Tiihonen et al., 1995]. ADHD, 튜렛 증후군, 행동 장애, ODD, 실독증, 학습 장애, 연발성흘음, 약물 의존 및 알콜중독 모두 남성에서 우세하게 나타났다. DRD2, DβH, DAT의 분자 유전학 연구[참조: Comings et al., 1996a] 및 임상적 유전자 연구[참조: Comings, 1994b; 1994c; 1995b; Bierderman et al., 1991; Comings and Comings, 1987]는, 이들이 병인적으로 관련된 스펙트럼 장애임을 나타낸다. 신경전달자의 결함은 알콜중독과 관련된다고 주장된 바 있다[참조: Blum, 1991]. 신경경로와 관련된 유전자 연구가 하기에 기술되어 있다.
안드로겐트 수용체 유전자AR 유전자의 특이적 돌연변이는 다양한 유형의 안드로겐 무감각 증후군을 야기시키는 것으로 보고되었다[참조: Gottlieb et al., 1977]. 추가로, 단백질에서 다중 아미노산 트랙트를 생성시키는 두 세트의 다형성 트리뉴클레오타이드 반복 서열인 CAG[참조: Edwards et al., 1992] 및 GGC[참조: Sleddens et al., 1993; Sleddens et al., 1992]가 AR 유전자의 제1 엑손중에 존재한다. 43 내지 65회 정도로 고도로 연장되는 경우, CAG 트리뉴클레오타이드 반복체는 X-연결된 척수성근위축을 야기시키는 것으로 나타났다[참조: La Spada et al., 1991]. 정상 집단에서의 반복체 길이는 11 내지 31회이다[참조: Edwards et al., 1992].
정상 집단에서 존재하는 미세- 및 소형 부수체의 비-고도로 연장된 대립형질은 유전자 조절에 있어 직접적인 역할을 할 수 있다. 이러한 사실은 가장 짧은 탠덤 반복체가 Z-DNA의 형성과 관련되고[참조: Schroth et al., 1992], Z-DNA는 반복적으로 다양한 양태의 유전자 조절에 연루된다는[참조: Rich et al., 1984; Hamada et al., 1982; Wolff et al., 1996] 관측에 근거한다. 형성되는 Z-DNA의 양은 반복체의 길이에 고도로 민감하기 때문에, 반복체 대립형질의 크기는 자체적으로 표현형 효과와 관련될 수 있는 것으로 제안되었다[참조: Comings, 1997].
모든 연구[참조: Bradford and McClean, 1984; Schaal et al., 1998]는 아닐지라도 일부 연구[참조: Olweus et al., 1988; Mattsson et al., 1980; Schiavi et al., 1984; Kreuz and Rose, 1972]에서는 공격 행동과 혈장내 테스토스테론 농도간의 상호관련성을 제안하고 있다. 공격 행동 장애는 종종 TS 및 ADHD를 갖는 대상체에서의 공동 이환상태이고[참조: Comings, 1995; Stewart et al., 1981; Biederman and Sprich, 1991] TS 및 ADHD 사이에는 고도의 공동 이환률이 있다[참조: Comings and Comings, 1984, 1990; Knell and Comings, 1993].
도파민 D 1 수용체 유전자(DRD1) 대조 및 정신분열증, 조울증 질환 및 알콜중독증 피검자에서의 DRD1 유전자의 서열결정은 정신분열증과 TD간의 관련성 연구 및 표현형에 대한 효과를 발생시키는 엑손 돌연변이의 확인에 실패하였다[참조: Jensen, 1993k; Gelertner et al., 1993k]. 전두 피질내 D1수용체는 기억을 담당할 수 있다[참조: Comings et al., 1997k; Williams et al., 1995k]. 랫트에서 코카인 탐색 행동에 대한 D1및 D2수용체 효능제의 반대 작용이 보고되었다[참조: Self et al., 1996]. TD 선발자, 흡연자 및 병적 도박자들은 네가티브 이형시스와 일치하는데, 즉 가장 일치된 차이점은 Dde1 다형성의 11 및 22번 동형접합체의 증가와 12번 이형접합체 빈도수의 상대적인 감소이다[참조: Comings et al., 1996]. 반대로, 포지티브 이형시스가 DRD2 유전자에 존재하는데, 정량적 스코어는 12번 이형접합체에서 최고이고 11번 및 22번 동형접합체에 있어 최저이다. DRD1좌 단독에서 ADHD에 대한 결과는 유의적이지 않은 반면, DRD1 유전자에서 네가티브 이형시스 및/또는 DRD2 유전자에서 포지티브 이형시스의 존재를 관찰하는 상당히 부가적인 효과가 있었다[참조: Comings et al., 1997k].
도파민 D2 수용체 유전자(DRD2)이전의 연구는 ADHD, TS, CD 및 SUD를 갖는 피검자에서 D2A1 대립형질의 상당히 증가된 우세를 나타냈다[참조: Comings et al., 1991]. 이들 질환 각각은 스트레스에 대해 거의 반응하지 않는 것으로 특성화되었고 PTSD의 진단에 대한 많은 범주는 ADHD와 공통된 많은 증상을 가지며 국제 베트남 재향군인 재조정위원회의 연구(The National Vietnam Veterans Readjustment Study)는 PTSD와, ADHD 및 CD에서 일관된 유아기 증상의 병력간의 상당한 상호관계에 대해 보고한 바 있다[참조: Kulka et al., 1990]. 베트남에서의 격렬한 전투 상태를 경험한 바 있었던 중독 치료를 받은 피검자를 외상후 질환(PTSD)에 대해 선별하고, D2A1 대립형질을 갖는 PTSD 피검자의 상호관련성을 보였다[참조: Comings et al., 1996k].
ADHD와 DRD2 유전자의 TaqA1 대립형질간의 관련성을 검출하였다[참조: Comings et al., 1991k]. 자극제 메틸페니데이트는 지역적 혈류를 증가시키는 반면 다른 부위에서는 혈류를 감소시켰다. 전두, 측두골 및 소뇌 대사의 변화는 D2 수용체의 밀도와 연관된다-밀도가 높을수록 혈류가 증가된다. 메틸페니데이트는 뇌저신경절에서 상대적인 대사 활성을 감소시켰다. 이들 결과는 연계 및 전두엽에서 도파민성 상태를 초래하는 도파민 대사에 있어서의 유전적 결함이 뇌저신경절에서 도파민 활성의 보상적 증가를 야기시키고, 메틸페니데이트가, 도파민 수송자의 억제를 통한 도파민계에서의 뇌 도파민 활성 증진[참조: Volkow et al., 1996k]과 뇌저신경절에서 도파민 활성의 2차적인 감소 및 뇌저신경절 혈류의 감소의 혼합을 통해 이들을 역전시킨다는 기술사상과 일치한다. 이들 연구는 또한, CSF에서의 그의 농도가 D2 수용체 밀도와 관련이 있는[참조: Jonsson et al., 1996k] 도파민의 대사산물인 HVA의 CSF 농도 및 메틸페니데이트에 대한 반응과의 포지티브 상호관련성을 보여주는 기타 연구 결과[참조: Castellanos et al., 1996k]와도 일치한다. 메틸페니데이트는 소뇌내의 D2 수용체의 결핍에도 불구하고 소뇌 대사를 일관적으로 향상시킨다[참조: Volkow et al., 1996k; Hall et al., 1994k]. 이러한 사실은 소뇌가 주의력, 학습 및 기억에 중요한 역할을 담당한다는 증가된 증거와 일치하는 것이다[참조: Leiner et al., 1989k]. A1 유전형과 지역적 혈류간의 관련성이 보고되었다. TaqI D2 A1 캐리어는 피각, 중격측좌핵, 전두 및 측두회 및 내부 전두엽, 후두골측두골 및 궤도 피질에서 A22 유전형에 비해 상당히 낮은 상대적 글루코스 대사를 나타내었다[참조: Nobel et al., 1997]. TaqI D2 A1 캐리어는 뇌저신경절에서 상당히 낮은 도파민 D2 수용체 BMAX를 갖는다[참조: Nobel et al., 1991k]. 엔케팔린은 메틸페니데이트와 유사한 영역에서 혈류를 증가시키고 따라서 도파민성 기작에 관련된다[참조: Blum et al., 1985k]. 도파민 D2 수용체 밀도에 있어서 상당한 감소가 이탈감, 사회적 격리감 및 친밀한 우정 결핍된 피검자에서 평가되었다[참조: Farde et al., 1997k].
DRD2 유전자 다형성이 다수의 정신병 질환과 관련될지라도, 감금된 약물 사용자들에서 특정 정신병리사이에는 아무런 관련성도 발견되지 않았다[참조: Smith et al., 1993]. 알콜중독과 DRD2 대립형질 사이의 관련성에 대한 보고는 매우 다양하고, D2A1 대립형질과 다중물질/약물 남용간의 관련성이 밝혀졌다[참조: Smith et al., 1992, Noble, et al., 1993, O'Hara, et al., 1993, Comings, et al., 1994, 미국 특허 제5,210,016호 및 미국 특허 제5,500,343호]. DRD2 A1과 심각한 알콜중독의 첫번째 관련성 이후[참조: Blum et al., 1990], 몇몇 그룹은 관측을 재현할 수 없었다. 두가지 가능한 이유가 제안되었다: 첫번째로, 알콜, 약물 및 담배 남용에 대한 대조 그룹의 부적절한 선별; 두번째로, 질환의 만성 및 중증도에 있어서 알콜중독자의 특성화 측면에 있어서 샘플링 착오[참조: Blum et al., 1997; Bolos et al., 1990; Gelertner et al., 1991; Schwab et al., 1991; Turner et al., 1992; Cook et al., 1992; Goldman et al., 1992; Goldman et al., 1993; Suarez et al., 1994].
도파민은 많은 상이한 행동에 있어 조절인자로서의 역할을 하고[참조: LeMoal and Simon, 1991], 다수의 연구는 DRD2 유전자와 코카인 중독, 다중물질 남용, 흡연, 주의력 결핍 기능항진 질환(ADHD), 튜렛 증후군, 시각-지각 장애, 행동 장애, 외상후 스트레스 장애, 병적 도박, 및 강박성 폭식간의 상당한 관련성을 보고하고 있다[참조: Blum et al., 1995; Blum et al., 1996]. 이러한 관계에도 불구하고, 서열 측정 연구는 이러한 결과를 설명할 수 있는 엑손에서의 어떠한 돌연변이도 발견하지 못하였다. 이러한 발견은 D2A1 대립형질이 DRD2 기능 조절에 역할을 하는 비공지된 비-엑손 돌연변이와 연관된 탈평형상태에 있다면 설명될 수 있다[참조: Comings et al., 1991]. 추가로, 알콜중독의 중증도와 사용된 대조 그룹의 유형은 알콜중독과 관련된 DRD2A1 대립형질의 중요한 결정인자로서 보고되었다[참조: Noble et al., 1994; Geijer et al., 1994; Parsian et al., 1991; Blum et al., 1992; Blum et al., 1990; Lawford et al., 1997].
TaqI "A" RFLP 및 DRD2좌에서 미세부수체 반복 다형성을 이용하여 알콜중독으로 다중 영향받은 가계에서 수행된 Sib 페어 연관성 분석은, 이들 좌와 폭음을 발생시킬 경향간의 상당한 상호관계를 나타냈다. DRD2 유전자에서의 상응하는 돌연변이는 발견되지 않았으며, 이러한 효과는 DRD2 유전자 영역외 밀관된 좌로부터 발생할 수 있다[참조: Cook et al., 1996]. 알콜 의존적 피검자에서 DRD2 유전자의 엑손 8내 단일 점 돌연변이가 밝혀졌으나[참조: Finch et al., 1995], 이외에는 DRD2 유전자의 암호화 영역에서 어떠한 구조적 돌연변이도 보고된 바 없다[참조: Gejman et al., 1993].
DRD2유전자 A1대립형질이 중증의 알콜중독, 다중물질 의존성, 크랙/코카인 중독, 흡연, 병적 도박, 주요 우울 증상 발현의 결핍, 및 탄수화물 대식증을 포함한 다수의 행동과 관련되거나 DSM-IV 물질 사용 장애에 대해 일반화되는 것으로 나타났다[참조: Blum et al., 1996e; Blum et al.,1995b; Comings et al, 1996c]. 기타 Axis II 진단 집단(반사회적, 자기중심주의, 편집증)과 비교하여 MCMI-II 평가된 분열병질/회피 집단은 알콜 남용 규모와 상당히 상호관련되었다[참조: Corbisiero et al., 1991]. 분열병질 및 회피 특성을 나타내는 MCMI-II 상승된 피검자 집단은 잘 치료되지 않고 보다 일찍 재발되는 경향이 있다[참조: Fals-Stewart, 1992]. 높은 스코어의 분열병질/회피 집단은 남성 알콜중독자[참조: Matano et al., 1994] 및 코카인 의존성 피검자[참조: Kranzler and Satel, 1994]와 관련있다. 낮은 지각 수준을 포함한 분열병질/회피 행동은 보다 많은 알콜을 소비하여 높은 수준의 지각을 갖는 피검자에서보다 높은 MAST 스코어를 갖는 것으로 밝혀졌다[참조: Ohannessian and Hesselbrock, 1995]; 회피 성격은 중증의 대식 질환을 갖는 피검자와 상당히 관련있다[참조: Yanovski et al., 1993].
도파민 수용체 유전자에서의 분자 이형시스가 건강한 피검자 및 알콜중독자에서 나타났다. 도파민에 있어서 HVA, 세로토닌에 있어서 5-HIAA 및 노르에피네프린에 있어서 MHPG로 이루어진 모노아민 대사물의 뇌척수액 농도를 DRD2 TaqI A1A2 및 B1B2 유전형에 대해 건강한 지원자에서 비교되었다. 결과는1,1+1,2 동형접합체 대 1,2 동형접합체의 평균에서 통계학상 유의적인 차이를 나타내지만, 1,1+1,2 대 2,2 유전형 및 1 대 2 대립형질을 분석하는 경우에는 그렇지 않은것으로 나타났다. TaqI B1B2 다형성은 실질적으로 동일한 결과를 나타낸다[참조: Jonsson et al., 1996]. 반대로, CSF HVA 농도 및 DRD2 TaqIA1/A2 다형성을 핀란드 및 미국인 알콜중독자에서 검사하였으나 1 대 2 대립형질을 검사하는 경우 및 1,1+1,2 대 2,2 유전형에서도 어떠한 관련성도 나타나지 않았다[참조: Goldman et al., 1992].
DRD2 유전자에서의 이형시스는 HVA의 CSF 농도를 TaqI 다형성을 이용하여 DRD2 유전형과 비교함으로써 나타난다[참조: Jonsson et al., 1996k]. TD 대상체의 부주의력 스코어에 대한 프로파일에 있어서, 12 이형접합체가 가장 낮은 농도의 CSF HVA를 가졌다[참조: Jonsson et al., 1996]. 최고 농도의 HVA는 11 동형접합체에서 나타났으며, 22번 동형접합체는 중간정도를 나타냈다. 일부 연구(전부는 아님)에 의하면, ADHD 및 TD 소아가 상당히 낮은 농도의 CSF HVA를 갖는 것으로 밝혔다[참조: Cohen et al., 1979k]. 상당한 관련성이 전기생화학적 이상 및 DRD2 A1 대립형질 사이에서 발견되었다[참조: Blum et al., 1994k]. 이러한 이상은 ADHD 대상체 및 알콜중독 소아에서도 나타난다[참조: Comings et al., 1991k; Noble et al., 1994k].
주의력 결핍 질환(ADHD) 및 튜렛 질환에 대해 DRD2 유전자의 TaqA1의 포지티브 관련성이 보고된 반면[참조: Comings et al., 1991; Comings et al., 1996a], 이외의 것에서는 ADHD 선발자와 아무런 관련성도 발견하지 못했다[참조: Sunohara et al., 1996]. ADHA 선발자는 D4 유전자의 48bp 변이체와 상당한 관련성을 나타내는 반면, DRD2, DRD3 또는 세로토닌 수송자 유전자와는 그렇지 못하다. DRD4의 7배 반복된 대립형질은 ADHD 소아에서 상당히 빈번히 발생하였다. D4 수용체 유전자의 7회 반복 대립형질과 새로운 것에 대한 탐색(충동, 탐구, 변덕, 흥분, 성급함 및 낭비벽으로 특징지워짐)과의 관련성에 대한 증거가 있다[참조: Epstein et al., 1996; Benjamin et al., 1996]. 코카인 의존성 선발자에서의 DRD2 A1 대립형질은 반대의 경우, 즉, 반성, 완고, 금욕, 느긋함, 기피에 의해 특징지워지는 저하된 새로운 것에 대한 탐색 및 증진된 금욕 우울증과 연관된다[참조: Compton et al., 1996]. 분자 유전학 연구는 D2도파민 수용체(DRD2) A1 대립형질과 알콜중독 및 약물 남용의 관련성을 밝혔다[참조: Blum et al., 1990]. 감소된 중추 도파민성 기능은 A1 대립형질을 갖지 않는 피검자(A1-)에 비해 A1 대립형질을 갖는 피검자(A1+)에서 제시되었다[참조: Nobel et al., 1997]. 현재까지의 많은 연구가 보다 중증의 경우에 있어서 DRD2 유전자의 중요한 역할에 대해 나타내고 있음에도 불구하고 알콜중독의 원인이 되는 유전자는 공지되어 있지 않다[참조: Noble, 1993; Blum et al., 1995].
DRD2 유전자는 강박 행동[참조: Comings and Comings, 1978b] 및 중독, 강박성 폭식, 도박 및 흡연을 포함한 충동 행동[참조: Self et al., 1996; Ogilvie et al., 1996; Blum et al., 1995b; Blum et al., 1996e]과 관련있다. 이들 행동은 이미 TS 그룹과 상이한 대상체에서 DRD2 유전자와 관련되는 것으로 보고된 바 있다[참조: Comings et al., 1993a; Noble et al., 1994d; Blum et al., 1996a; Comings et al., 1996c; Noble et al., 1994c; Noble, 1993; Comings et al., 1996e].
도파민 D2 수용체 유용성은 비알콜중독자에서 보다 알콜중독자에서 상당히 낮으며, 최종 알콜 섭취 이후의 일수와 관련없다[참조: Volkow et al., 1997]. 수송자 유용성에 대한 DRD2 수용체의 비는 알콜중독자 보다 비알콜중독자에서 상당히 높다. 알콜중독자는 비알콜중독자에 비해 D2 수용체(후시냅스 마커)의 상당한 감소를 나타내지만 DA 수송자 유용성(전시냅스 마커)에 있어서는 감소를 보이지 않는다. 선조체에서 D2 수용체가 주로 GABA 세포에 국한되므로, 이들 결과는 알콜중독에서 나타나는 도파민계 이상과 관련된 GABA 생성의 연루 증거를 제공하는 것이다.
도파민 D 3 수용체 유전자(DRD3)DRD3 유전자 결실된 녹아웃 마우스는 정상적인 DRD3 유전자를 갖는 그들의 동산군 새끼에 비해 상당히 보다 활성적이다[참조: Williams et al., 1995k]. 네가티브 이형시스가 DRD3좌에서의 분열증과 관련되는 것으로 보고되었고[참조: Crocq et al., 1992k], 이때 TD[참조: Comings et al., 1993j] 및 병적 도박[참조: Comings et al., 1996]에서 DRD3 MscI 12 이형접합성의 상당한 감소가 관측되었다.
도파민 D 4 수용체 유전자(DRD4)도파민 D4수용체 유전자(DRD4)에서, 구아닌-뉴클레오타이드 단백질과 결합하는데 관련되는 세번째 세포질 루프를 암호화하는 DNA내 48bp 및 16개 아미노산 반복체 다형성이 보고되었다[참조: Van Tol et al., 1992k; Lichter et al., 1993k]. 이러한 DNA 영역은 2내지 11회 반복되고, 가장 공통된 대립형질은 2, 4 및 7 반복체이다. 7번 대립형질은 세포내 아데닐 사이클라제 억제에 대하여 도파민에 대한 무딘 반응을 입증한다[참조: Asghari et al., 1995k]. 정상 대상체에 대한 두가지 독립적인 연구는 7번 대립형질의 존재와 새로운 것에 대한 탐색, 즉 충동과 관련된 특성간의 관련성을 나타냈다[참조: Benjamin et al., 1996k; Ebstein et al., 1996k]. 한 연구는 이러한 관련성을 발견하지 못하였다[참조: Malhotra et al., 1996]. 대조 그룹과 비교하여 ADHD 소아에 대한 연구는 대조 그룹에 비해 ADHD 소아가 적어도 하나 이상의 7번 대립형질을 함유하는 것으로 보고되었다[참조: LaHoste et al., 1996k]. TD에서 DRD4 유전자의 7번 대립형질간의 관련성이 보고되었다[참조: Grice et al., 1996k]. 이 분야의 기타 연구는 다의적이지 않다[참조: Spielman et al., 1993k].
도파민 수송자 유전자(DAT1)소포성 수송자 좌위에서 DAT1 유전자 마커 빈도수는 상이한 유럽 국가로부터 기원한 상이한 백인 미국인에 있어 실질적인 이형성을 나타내지만, 물질 남용과의 관련성은 명백하지 않다[참조: Uhl et al., 1993; Persico et al., 1993]. DAT1 VNTR 대립형질의 분포는 정신자극물질 남용자에 대해 어떠한 물질 사용자 또는 대조 그룹 샘플을 구분하지 않으나[참조: Persico et al., 1996], 일본인 알콜중독자에서는 관련성이 관측되었다[참조: Muramatsu and Higuchi, 1995]. DAT1 유전자 또한 강박 및 중독 장애에 역할을 갖는것으로 내포되어 있다. 코카인 작용 양식중 하나는 도파민 수송자 기능을 억제하는 것이기 때문에[참조: Ritz, et al., 1992; Ritz, et al., 1990], 이는 약물 중독의 생물학 및 파킨슨 질환[참조: Uhl, 1990] 및 튜렛 증후군[참조: Singer, et al., 1991]을 포함하여 기타 장애의 생물학중에 연관되어 왔다.
튜렛 증후군에서 증가된 도파민 수송자 부위는 SPECT 스캐닝 기술[참조: Malison et al., 1995]을 사용하여 밝혀졌고, 도파민 수송자 수용체 부위는 비 폭력적 알콜중독자에 비해 폭력성 알콜중독자에서 상당히 증가하였다[참조: Tiihonen et al., 1995]. TS 대상체의 검시 샘플 연구는 선조체에서 증가된 수의 도파민 흡수 부위를 보고하고 있으며, 이러한 사실은 다량의 DAT1 분자 또는 증가된 수의 도파민 신경 말단을 시사하는 것이다[참조: Singer et al., 1991]. 이곳이 ADHD 치료에 널리 사용되는 화합물인 메틸페니데이트[참조: Volkow et al., 1995k] 및 덱세드린의 작용 부위이다. 이들 자극물질은 수송 과정을 억제하여 시냅스 도파민을 증가시킨다. 대조 그룹에 대해 TD 대상체의 선조체에서 도파민 수송자 단백질의 농도가 상당히 증가하였다고 보고되고 있다[참조: Maison et al., 1995k]. 제한된 공간내에서 매우 기능항진성을 보이는 DAT1 녹아웃 마우스의 연구로, 뇌 도파민 농도의 5배 증가, D2수용체의 하향 조절, D2수용체 기능의 비결합성 및 몸 크기의 57% 감소가 나타났다[참조: Giros et al., 1996k]. 덜 공통적인 DAT1 반복체 대립형질이 DAT1 분자 수의 증가 또는 감소와 관련되는지의 여부는 공지되어 있지 않다.
ADHD/ADD의 경우에서 DAT1 유전자의 10개 대립형질간의 관련성이 보고되었으며[참조: Cook et al., 1995k], 튜렛 질환(TD)에서 행동 변수가 보고되었다[참조: Comings et al., 1996]. 자폐성 대상체에서의 유의적 증가는 TS 및 자폐증이 유전적으로 관련되고 유사한 유전자 세트와 연루된다는 것을 시사하는 연구와 일치한다[참조: Burd et al., 1987; Comings and Comings, 1991b:Sverd, 1991].
93명의 인종적으로 맷치시킨 비-알콜중독자 대조 그룹과 비교하여, 금단 발작 또는 정신착란을 보이는 93명의 알콜중독자에서 DAT1 유전자의 3' 비해독 영역에 있어서 9-반복체 대립형질 VNTR 다형성의 상당히 증가된 우세가 나타난다[참조: Sander et al., 1997]. DAT1에서 5' UTR 40 bp 반복체 다형성을 약물 남용 피검자에서 검사하여 정상인 대조 그룹과 비교하여 3' UTR 반복체 대립형질의 빈도수에 있어서 유의적 차이를 발견하지 못하였다[참조: Persico et al., 1993]. 9/10 유전형이 "병리학적 폭력적" 청년과 관련되는 것으로 나타났고; 9/9 유전형은 금단성 발작 또는 정신착란을 보이는 알콜 의존성에 관련되는 것으로 나타났다. DAT1 유전자의 40bp 반복체의 9 대립형질과 코카인 유도된 편집증의 관련성이 보고되었다[참조: Gelernter et al., 1994a].
도파민-β-하이드록실라제DβH는 도파민 대사에 있어 주요 효소중 하나이고 도파민의 노르에피네프린(NE)으로의 전환을 촉매한다. 동물 연구에 있어서, DβH 활성의 억제는 노르에피네프린 농도를 감소시키는데 이는 티로신 하이드록실라제를 억제하여 도파민을 과도로 생성시키게 된다. 도파민은 기능항진, 공격성, 자기-자극, 및 정형화된 움직임과 관련된다[참조: Randrup and Scheel-Kruger, 1966; Shekin et al., 1983k]. DβH의 혈중 효소 농도에 대한 연구로 지각 탐색[참조: Kuperman et al., 1988k; Comings et al., 1996], ADHD 및 행동 장애에 있어 이들 효소의 역할이 관련됨을 시사하였다[참조: Rogeness et al., 1982k; Rogeness et al., 1989k].
도파민-베타-하이드록실라제(DβH)활성에서의 장해는 이전에는 어린이 CD 및 알콜중독증과 연관되어 있어왔다(참조문헌: Pliszka et al., 1991). CD와 같은 신체화한 질환은 노르아드렌성 기능에서의 감소 및 도파민성 기능에서의 증가, 즉 DβH결핍에 의해 독특하게 야기되는 한 쌍의 질환과 관련되어 있다고 제안되었었다(참조문헌: Quay 1986). 기타로는 낮은 플라즈마 DβH수준을 갖는 감정적으로 장해된 소년에서 CD 진단의 잦은 횟수가 보고되었다. 그러나, 문헌(참조: Bowden et al., 1988)에 의한 외래 피검자 연구에 의하면 CD를 갖지 않은 ADHD 어린이 보다 CD를 가진 ADHD 어린이에서 낮은 DβH수준이 훨씬 많은 것으로 밝혀졌다(참조문헌: Rogeness et al., 1987; Pliszka et al., 1988; Bowden et al., Comings et al., 1996). 이와는 대조적으로, 소년 구치소에 있는 외래피검자 연구에서는 CD와 플라즈마 DβH사이에는 연관성이 없는 것으로 밝혀졌다. 문헌(참조: Umberkomen et al., 1981)에서는 낮은 DβH수준과 감각 추구 행동 사이에는 상관관계가 있음을 보여주고 있다.
주요 우울증, 이극 감동 장해 및 정신분열증을 포함하는 다양한 정신질환을 갖는 피검자에서의 CSH DβH 수준의 조사로 낮은 CSF DβH수준과 이극 감동 장해사이에 상당한 상관관계가 있다는 것만이 밝혀졌다(참조문헌: Lerner et al., 1978). DβH좌와 정신분열증(참조문헌: Aschauer and Meszaros, 1994), 알콜중독증, 우울증, 조울증 및 투렛증후군(참조문헌: Comings, et al., 1986)사이의 연관성 연구는 네가티브로 밝혀졌다. 그러나, 일부 자손 쌍 분석은 ABO 혈액 그룹 및 DβH와, 우울증 및 알콜중독증과 같은 일부 정신병사이에 약한 연관성이 있음을 제시한다(참조문헌: Wilson et al., 1992).
DβH좌와 정신분열증, 알콜중독증, 우울증, 조울증 및 투렛증후군사이의 연관성 연구는 네가티브로 밝혀졌다(참조문헌: Aschauer and Meszaros, 1994; Comings, et al., 1986). DβHTaqIB1 대립형질과 병리학적 SAB사이에는 아무런 상관관계가 없는 것으로 밝혀졌다(참조문헌: Blum et al., 1997). TaqI B1/B2 다형성은 약물, 알콜 및 담배 남용을 배제하도록 스크린된 대조 그룹과 관련이 있는 것으로 보고되었다. 그러나, 도파민-베타-하이드록실라제 유전자의 B1 대립형질은 또한 TD 프로밴드 및 ADHD 프로밴드와 관련되어 있다 (참조문헌: Comings et al., 1996).
칸나비노이드 수용체 (CB1): 칸나비노이드 수용체와 응답 경로와의 연관성이 주로이지만, 도파민 대사상에서 아난다이데와 칸나비노이드의 조절 효과를 통한 효과도 부수적이기 쉽다. 이것은 CB1 수용체와 DRD2 수용체와의 결과 사이의 유사성과도 일치한다. CB1 유전자와 마찬가지로, DRD2 유전자의 유전 변이체의 다물질 남용과의 연관성은 알콜중독증 자체와의 연관성 보다 재연 가능성이 훨씬 높다(참조문헌: O'Hara et al., 1993; Smith et al., 1992; Noble et al., 1993; Comings et al., 1994). 이들 관찰의 해석은 도파민성-칸나비노이드 응답 경로가 알콜에 의해서 보다는 약물, 특히 코카인 및 암페타민에 의해 더욱 활성화된다는 것이다(참조문헌: DiChiara and Imperato, 1988).
중대뇌변연계 도파민 시스템의 활성화는 약물 의존성 동물 모델에서 코카인 추구 행동으로 재발되는 것에 기폭작용을 하는 것으로 알려져 있다. 이러한 기폭효과는 도파민 D2효능제에 의해서는 증가되지만 도파민 D1효능제에 의해서는 억제된다(참조문헌: Self et al., 1996). 이와 관련하여, 선조체에서 D1및 D2수용체의 비율에서의 감소를 야기시키는 아난나미데의 능력(참조문헌: Romero et al., 1995)은 약물 의존에서 CB1 변이체의 역할에 대한 평가와 연결지을 수 있다.
모나민 산화효소: MAO-A cDNA의, 위치 1460에서의 T→C 변이체와 연관된 Fnu4H1 다형성 및 위치 941에서의 T→G 변이체와 연관된 EcoRV 다형성이 조사되었다(참조문헌: Hotamisligil and Breakfield, 1994). 둘다는 코돈의 3번째 염기에서의 치환과 관련되어 있으므로, 이들은 아미노산 치환과는 연관되어 있지 않다. 이들은 공지의 MAO-A 활성의 40 개의 세포주에 대해 조사하였다. Fnu4H1 C 변이체를 갖는 모든 세포주는 또한 EcoRV G 변이체도 가졌다. 샘플을 더 낮은 MAO-A 활성과 더 높은 MAO-A 활성을 기준으로 2개의 그룹으로 나눈 경우, 세포주의 25%에서 존재하는, 공통성이 낮은 Fnu4H1 C 또는 + 대립형질(발명자의 2 대립형질)은 유의적으로(P=0.028) 높은 활성 그룹과 연관되어 있었다. 린(Lin)등은 1994년에 조울증에서 더 낮은 MAO 수준과 연관된(참조문헌: Lin et al., 1994), 공통성이 더 높은 MAOA Fnu4H1 T 또는 + 1 대립형질(참조문헌: Lin et al., 1994)에서의 상당한 증가를 보고한 반면, 문헌(참조: Craddock et al., 1995) 및 문헌(참조: Nothen et al., 1995)에서는 이들을 확인할 수 없었다.
바니유코브(Vanyukov)등은 1993년에 CA 반복 다형성(참조문헌: Black et al., 1991)을 사용하여, 31명의 남성 및 78명의 여성 대조 그룹과 비교하여 23명의 남성 및 34명의 여성 알콜중독자에서의 MAOA 유전자를 조사하였다. 젊은 물질 남용자에서는 더 높은 분자량 대립형질들(＞115 bp)사이의 연관성에 대한 경향이 남성은 (P=0.17)이지만 여성은 (P=0.8)이고, 개시 연령과의 ＞115 bp 대립형질 사이의 최저 연관성은 (P=0.03)였다. 티볼(Tivol) 등은 1996년에 MAO A 효소 활성에서 ＞100-배 변이를 나타내는 40명의 대조 그룹 남성의 엑손을 최근에 서열화 하였다. 암호화 서열의 현저한 보존성이 있었다. 단지 5개의 다형성만이 관찰되었다. 이들중에서, 4개는 아미노산 서열에서 변화가 없는 3번째 코돈 위치와 관련되어 있었다. 나머지 하나는 중성 lys→arg 치환이었다.
니코틴 수용체 유전자: CHRNA4 유전자에 대한 유전자는 크로모좀 20q13.2-13.3 상에 위치하고(참조문헌: Steinlein et al., 1994) 게놈 DNA의 17kb에 걸쳐 6개의 엑손으로 이루어져 있다(참조문헌: Steinlein et al., 1996). CHRNA4 유전자의 트랜스막 도메인 2에서의 Ser248Phe 미스센스 돌연변이는 확대된 호주 사람 혈통에서 상염색체 우세 야행성 전두엽 간질(ADNFLE)과 관련이 있는 것으로 밝혀졌다(참조문헌: Steinlein et al., 1995). M2도메인의 C-말단에 대한 암호화 영역으로의 3개의 뉴클레오타이드(GCT)의 삽입은 상염색체 우세 야행성 전두엽 간질을 갖는 노르웨이 사람 혈통에서 밝혀졌다(참조문헌: Steinlein et al., 1997b). 두가지의 다른 뇌 기능 질환, 즉 양성 가족의 신생아 틱(참조 문헌: Leppert et al., 1989; Malafosse et al., 1992) 및 낮은-전압 EEG(참조문헌: Steinlein et al., 1992)도 CHRNA4 좌의 영역과 연결되어 있다. D20S19, 즉 고도의 다형성 좌는 이들 질환의 3개 모두에 대한 유전자와 매우 밀접하게 연관되어 있다(참조문헌: Steinlein et al., 1996).
CHRNA4 유전자의 첫번째 인트론에 위치하는 고도의 다형성 디뉴클레오타이드 VNTR 다형성이 보고되었다(참조문헌: Weiland and Steinlein, 1996). 단일 염기쌍 다형성도 보고되었다(참조문헌: Steinlein, 1995; Phillips and Mulley, 1997; Guipponi et al., 1997; Steinlein et al., 1997a). 3개의 단일 염기쌍 다형성을 사용한 결과(참조문헌: Steinlein et al., 1997a) CHRNA4 유전자와 공포 장애와는 연관성이 없는 것으로 밝혀졌다. ADNFLE 및 4개의 침묵 다형성과 연관된 Ser248Phe 미스센스 돌연변이를 사용한 결과(참조문헌: Steinlein et al.) Ser248Phe 미스센스 돌연변이는 어린이(.085) 대 대조 그룹(.027)의 공통의 특발성 일반화된 간질에서 CfoI 595 다형성의 T 대립형질의 빈도에서의 적절한 증가로 보고되었다.
마이크로/미니부수체 다형성: 상이한 신경정신병 후보자 유전자에서 마이크로/미니부수체 다형성과 연관된 행동 표현형의 연구로 하기 유전자 MAOA, MAOB, HTR1A, DAT1, DRD4, HRAS, HTT, OB, CNR1, GABRA3, GABRB3, FRAXA 및 NO에서 다양한 정량적 행동 특징 및 미니- 또는 마이크로부수체와 더 짧거나 더 긴 대립형질 사이에 상당한 연관성이 밝혀졌다(참조문헌: Comings et al., 1996k; Comings et al., 1996l; Comings et al., 1996m; Johnson et al., 1997; Comings et al., 1998; Gade et al., 1997). 상당한 표현형 행동은 DAT1(참조문헌: Cook, 1995; Gelernter et al., 1994), DRD4(참조문헌: Benjamin et al., 1996; Ebstein et al., 1996; Grice et al., 1996; Lahoste et al., 1996), HRAS(참조문헌: Herault et al., 1993; Eggers et al., 1995; Thelu et al., 1993), HTT(참조문헌: Ogilvie et al., 1996; Lesch et al., 1996), INS(참조문헌: Bennett et al., 1955; Kennedy et al., 1995; Pugliese et al., 1997; Vafiadis et al., 1997) 및 DBH(참조문헌: Wei et al., 1997)유전자의 동일 다형성의 특정 크기 대립형질에 영향받는다. 이들 연구는 이들 길이의 변이체의 서브세트에서 단일 염기 쌍 변화의 중요한 역할의 존재를 제외하지 않는다(참조문헌: Grice et al.,1996; Lichter et al., 1993; Krontiris et al., 1985).
이것은 취약성-X 증후군, 헌팅톤 질환(Huntington's Disease Collaborative Research Group, 1993), 유전성근경직증, 케네디 질환, 프리드라이히유전성척수성운동실조증(참조문헌: Campuzano et al., 1996), 및 기타(참조문헌: Caskey et al., 1992)를 포함하는 여러가지 신경질환(참조문헌: Caskey et al., 1992)에서 긴 삼중자 반복의 연루의 증거이다. 이들 질환의 적어도 다섯가지는 각각의 유전자 생성물의 아미노산 서열에서 폴리글루타민 트랙을 생성하는 인트론 GAG 반복과 연루되어 있다.
비만 관련 유전자:선행 연구는 수백 비만 피검자에게서 사람 OB 유전자의 변형을 확인하는데 실패하였다(참조: Ezzel, 1995; Hamilton el al., 1995; Considine et al., 1996b). 그러나, 선행 연구(참조: Comings, 1996b; Comings el al., 1996c)는 다유전성 질환에 포함되는 변형은 엑손을 벗어날 수 있고 다양한 디뉴클레오사이드 반복체는 그들자체가 이들이 근접해 있는 유전자의 발현을 조절하는 역할을 할 수 있는 것으로 제안하였다(참조: Krontiris el al,. 1993; Green and Krontiris, 1992; Trepicchio and Krontiris, 1993; Bennett et al., 1995; Kennedy et al., 1995).
어폴리포프로테인 유전자(APOE-D)의 TaqI 다형성은 비만 피검자와 관련되고 APO-D와 급성 인슐린 사이에 관련이 있는 것으로 밝혀졌다. 이러한 연구는 APO-D 다형성은 비만 및 하이퍼인슐린네미아에 대한 유전자 표지일 수 있음을 제안하였다(참조: Vijayaraghavan et al., 1994).
세로토닌 유전자:당해 유전자의 작용성 변형은 각종 질환에서 세로토닌 및 트리토판 둘 다를 동시에 증가시키거나 감소시키는 것으로 판단된다. 사람 TD02 유전자의 4가지 상이한 다형성은 확인되었다. 이러한 연구는 상기 다형성 및 TS, ADHD, and 약물 의존성중의 하나 이상과 상당한 관련이 있음을 나타낸다. 인트론 6G-T 변형은 혈소판 세로토닌 수준과 상당히 관련이 있다(참조: Comings et al. 1996a).
다중 유전자 분석:도파민 D4 수용체 유전자(DRD4), 카나비노이드 수용체 유전자(CNRI) 및 GABAB3 수용체 유전자(GABRB3)의 조합 시험은 사용되는 IV 약물의 다향한 특징의 25%를 설명한다(참조: Saucier et al., 1996; Comings et al., 1997; Johnson et al., 1997). OB 및 DRD2 유전자 둘 다에 대한 시험은 체중 지수의 변화율의 25%를 설명하는데, 이는 단독 시험에 의해 측정되고 보다 작은 %로 보고된 폴리유전자 요인이 체중에 영향을 미치고, 정신 질환과도 관련됨을 나타낸다(참조: Comings et al., 1996b). 3가지 도파민성 유전자에서 개개의 다형성은, 즉 도파민 B-하이드록실라제(DβH)의 도파민 D2 수용체 (DRD2)의 TaqI 및 도파민 수송자(DATI) 유전자의 40bp 반복체의 10/10 유전자형은 TS, ADHD 및 CD와 상당한 관련이 있는 것으로 밝혀졌다(참조: Comings, 1996).
신경전달자 및 아미노산 전구체의 역할:신경 질환에 포함되는 모든 유전자 이외에, 신경전달자 및 약제는 특정한 정신질환 특성을 생성시키거나 상승시키는 이들의 역할에 대해 연구하였다. 사람에서, 메조-전액골 앞의 도파민 활성은 사람 인식에 포함되는 것으로 제안된다(참조: Weinberger et al., 1998). 파킨슨 질환 피검자에서 및 이따금 정신분열증 피검자에서, 인식 타스크(task) 동안 전액골 앞의 활성 및 도파민성 기능의 임상 신호를 나타낸다(참조: Weinberger et al., 1988k). 동물에서 뇌 화학적 전이는 신경전달자 수준에 이어, 전구체 아미노산 하중 또는 조직 및 직접 중추신경계 전달의 변화를 입증한다(참조: Blum et al., 1996a; Blum et al., 1996b). 동물 연구는 연구 및 실험 활성, 심란성, 반응속도, 차별성 및 주위의 스위칭을 포함하는 주위 관련 행동의 넓은 범위에서 NE 및 도파민과 관련된다. 일반적으로, 동물 및 사람 연구에서는 각각 정보의 이르거나 늦은 프로세싱에서 도파민 및 NE의 역할을 나타낸다(참조: Sara et al., 1994k). 뇌 기능시 및 정신신경 조절시 중요한 역할을 하는 다수의 신경전달자, 특히 도파민, 세로토닌, 노레피네프린,GABA, 글루타민 및 오피오이드 펩티드는 이들의 전구체 아미노산 영양분의 수준을 순환시킴으로써 점진적으로 영향을 받을 수 있다(참조: Wurtman, 1981k). 데이타는 아미노산 전구체 및 엔케팔리나제 억제제가 알콜, 코카인 및 혈액 중독으로부터 회복되는데 상당한 효과를 제공하는 것으로 제안하고 있다(참조: Blum et al., 1987a: Blum et al., 1987b; Blum et al., 1987c; Blum et al., 1989b; Blum et al., 1990; (Strandburg et al., 1996).
뇌 외피의 카테콜아민 신경감응의 한가자 중요한 기능은 주위의 조절일 수 있다. 특히 주요한 것은 망상조직 형성, 즉 상부 뇌교(pon)에서 인자좌 심장의 중뇌 및 NE 뉴론의 복부 외피에서의 도파민 뉴론으로부터 뇌 외피에 대한 카테콜아민 투영이다. 아세틸콜린성(ACH) 및 도파민성 시스템(DA)은 정확한 인지력의 유지를 위해 중요한 것으로 밝혀졌다. 방사상의 팔 미로에 의한 인지 기능의 양태를 시험하는 일련의 연구에서 이들 2가지 신경전달자 시스템은 복잡한 형태로 상호작용하는 것으로 밝혀졌다(참조: Levin et al., 1995). 뮤스카린성 또는 니코틴성 ACH 수용체의 폐색에 의해 유도된 정확한 결핍을 선택하라. 스코폴아민을 이용한 뮤스카린성 수용체의 폐색에 의해 유도된 선택된 정확한 결핍은 도파민 수용체 차단제, 할로페리돌에 의해 역전될 수 있다. 특정한 DADI 차단제 SCH23390은 또한 상기 효과를 갖는 반면, 특정한 D2차단제 라클로프리드는 그러치 아니하다. 상기 효과는 D2길항제 라클로프리드를 사용하면 나타나지만, D1길항제 SCH23393을 사용하면 나타나지 않는다. D2수용체는 선택적 D2길항제 LY1771555가 메카밀아민에 의해 유도된 선택적 정확한 결핍을 역전시키는 것으로 밝혀냄으로써 인지력에 대한 니코틴 작용을 나타낸다. 인지력 결핍을 역전시키기 위한 상기 선택성 DA 치료 효능은 활성하에 ACH 때문이다(참조: Levin el al., 1990k).
축적되는 증거는 세로토닌이 포유동물 뇌의 많은 부위에서 콜린성 기능을 조절할 수 있고 상기 세로토닌성/콜린성 상호작용은 인지력에 영향을 미치는 것으로 알려준다. 세로토닌성 및 콜린성 시스템의 공존 조작에 의해 유도된 불안은 콜린성 시스템의 세로토닌성 변형에 기여할 수 있는 것으로 추정된다. 유기물의 인지력 결핍은 많은 신경전달자, 예를 들면, 뇌 구조물(예: 히포캄퍼스 또는 코텍스)내의 DA의 상호작용으로부터 발생될 뿐만 아니라, 전통적으로 네직 기능과 관련된 것과는 상이한 대뇌 물질을 포함할 수 있는 다른 통상의 기능의 기억에 대한 영향으로부터도 발생할 수 있다(참조: attention, arousal, sensory accuracy, etc.)(Cassel et al., 1995k).
또한, 히포캄팔 테타의 부대적인 조절은 콜린성 및 GABA-에르긱 중간 격막 투입의 공활성에 좌우되는 것으로 판정되었다. 콜린성 투영은 세포상 히포캄팔 테타에 대한 수입 자극성 유도를 제공하고 세팔 GABA-에르긱 투영은 히포캄팔 GABA-에르긱 내부신경(세포밖의 히포캄팔 테타)을 억제함으로써 전체 억제 수준을 감소시키는 작용을 한다. 두 활성은 히포캄팔 테타 영역 및 세포 활성의 생성을 위해 존재하여야만 한다. 콜린성 시스템과 GABA-에르긱 시스템의 균형은 히포캄팔 신크로니(테타) 또는 어신크로니의 발생 유무를 결정할 수 있다(참조: Smythe et al., 1992).
노르에피네프린(NE)과 같은 다른 신경전달자는 또한 학습 및 기억하는 역할을 할 수 있다. NE의 신경전달 특성은 코에룰레오-코티칼(LC) NE 투영은 주위 및 기억 과정에서 주요한 역할을 수행해야한다고 제시되어 있다. 예를 들면, 표적 감각 시스템에서 방출된 NE의 게이팅 및 조절은 중요한 운동 변화시 관련된 자극에 선택적 주위를 촉진한다(참조: Sara et al., 1994). 다른 연구는 스트레스 또는 정신적 도전 동안 LC 활성의 중요성은 DA 및 NE 둘 다의 방출을 통해 환기를 증가시키거나 유지시킬 수 있다(참조: Page et al., 1994).
래트 및 원숭이의 행동시 NE LC 뉴론의 방출은 주위 상태 또는 경계를 조절하는데 LC 시스템에 대한 역할을 제시하는 것으로 보고되었다(참조: Aston-Jones et al., 1991k). 치상 회전부에서의 NE에 대한 부가적인 연구는 복잡한 감각 입력에 대한 단기간 또는 장기간 반응의 향상을 촉진하는데 LC의 역할을 지지해주고 기억 과정 뿐만 아니라 주의 과정에서 LC의 역할과 일치한다(참조: Harley, 1988k). 외인적으로 적용되거나 내인적으로 방출된 NE는 치상 회전부의 단기간 및 장기간 포텐테이션(LTP)를 개시할 수 있다.
연구는 기억, 강화 및 뇌 대사에 대한 뉴로키닌 물질 P(SP) 및 이의 N- 및 C-말단 단편의 효과에 관한 것이다. SP는 외면으로 적용되는 경우 기억을 촉진시키고 또한 강화시키는 것으로 알려졌다. 그러나, 가장 중요한 발견은 N-말단 SP1-7이 기억을 향상시키는 반면, SP의 C-헵타- 및 헥사펩티드 서열이 SP에 대한 동몰 투여량에서 강화시키기 때문에, 상이한 SP 서열에 의해 엔코드되는 것으로 보인다는 점이다. 이들 상이한 행동 효과는 DA 활성에서 선택적 및 부위-특이적 변화와 필적하는데, 여기서 SP 및 이의 C-말단이지만, N-말단은 제외되고, 핵 측위(Nac)에서는 DA가 증가하지만, 네오-스트리아텀에서는 증가하지 않는다. 이들 결과는 외부 투여된 SP의 강화작용이 이의 C-말단 서열에 의해 조절될 수 있고 당해 효과는 NAC에서 DA 활성과 관련된다(참조: Huston et al., 1991k).
도파민 활성에 대해, 앞선 연구에서는 브로모크립틴, D2도파민 수용체 길항제가 정상의 사람에서 시각적-공간적 동작 기억력에 대해 유리한 효과를 가질 수 있음을 보여준다(참조: Kimberg et al., 1997). 일부 자극이 단시간 간격으로 유지되는 이러한 형태의 기억은 또한 원숭이에 대한 장애 및 단단위 기록 연구에서 및 사람에게서 뉴로-영상 연구에서 전액골 인식기능과 밀접한 것으로 밝혀졌다(참조: Goldman et al., 1987k; Jonidas et al., 1993). 도파민 D2수용체 유전자형의 기능으로서 알콜에서 방출속도를 감소시키는데 브로모크립틴의 선택적인 포지티브 효과가 보고되어 있다(참조: Lawford, et al., 1995). 또한, 기억 시험을 수행하는 원숭이에서 신경의 지연된 활성에 대한 도파민 길항제의 직접적인 효과가 입증되었다(참조: Williams et al., 1995k). 펜터민, 도파민 방출자는 중량손실과 관련된다(참조: Weintramb et al., 1992).
더우기, 뇌 도파민 농도의 약리학적 조작은 사람 및 동물에서 시각적-공간적 작동 기억에 효과적이고, 여기서 후자는 전액골 외피에 대해 국부적으로 효과적이다. 그러나, 사람에 대한 도파민 길항제의 효과는 여전히 불충분한 것으로 판단된다. 브로모크립틴은 뉴로코텍스에 투영된 영역에서 인식 도파민 수용체 및 아-인식 수용체에 대한 이의 효과를 통해 전액골 외피와 관련된 인식 기능에 대해 효과적이다(참조: Kimberg et al., 1997). 이들은 젊은 보통 대상체에 대한 브로모크립틴의 효과는 대상체의 작동 기억용량에 좌우되는 것으로 밝혀졌다. 큰 용량을 가진 대상체는 약물에 대해 보다 불량하게 작용하는 반면, 작은 용량을 가진 대상체는 개선된다. 이들 결과는 사람에게서 도파민 조절된 작동 기억 시스템과 보다 높은 인식 기능사이에 경험적 관련이 있음을 입증한다. DRD2 A1 대립형질은 또한 시각적-공간적 기억 결핍과도 관련되는 것으로 보여진다(참조: Berman et al., 1995k).
이중 혼수상태 연구는 D2길항제 브로모크립틴 또는 플라세보를 A1 대립형ㅈ질(A1/A1 및 A1/A2 유전자형)의 보유자인 알콜중독자에게 투여하거나 브로모크립틴으로 처리한 A1 보유자중에서 욕구 및 불안이 감소된 A1 대립형질(A2/A2)만을 보유하는 알콜중독자에게 투여한다. 감소율은 브로모크립틴으로 처리한 A1 보유자에서 가장 높다. A1 보유자에 대한 브로모크립틴 효과는 처리한지 6주 동안 연구한 결과 훨씬 더 건강하다. 도파민 D2길항제 브로모크립틴은 보다 높은 수준으로 인식 기능을 향상시킬 수 있다.
미세투석 측정을 포함하는, 동물에서 정밀한 기술을 이용하는 연구에서 신경전달자 방출에 이어, 전구체 아미노산 부하의 변화가 입증된다(참조: Hernandez et al., 1988). 또한, 행동 변화는 전구체 아미노산의 계통적 및 직접적 중추신경계 전달에 따른 동물에서 입증된다(참조: Blum et al., 1972). 특정한 L-아미노산은 신경전달자 및 신경조절자 전구체인 반면, 이들의 라세미체, D-아미노산은 또한 생물학적 활성을 가질 수 있다. 특히, D-페닐알라닌, D-루이신, 기타 D-아미노산 뿐만 아니라 특성한 대사체(예: 하이드로신남산)는 감정 및 행동을 조절하는데 중추적인 오피오이드 펩티드의 분해를 감소시킨다(참조: Blum et al., 1977; Della Bella et al., 1980).
일부 과학자들은 페닐알라닌 결핍(PHD)을 기술하고 있다(참조: Lou, 1994k). 이와 관련하여, 페닐알라닌 및 티로신은 NE의 대사 전구체인 도파민의 생합성시 2가지 초기 단계에 기여한다. 외피 페닐알라닌 농도는 감소된 도파민 합성에 의해 PHD중의 뇌 기능에 영향을 준다. EEG는 서서히 감소되고 신경정신적 시험에서 수행 기간을 연장시키는 것으로 나타난다. CNS중의 티로신 농도는 완전한 억제, 예를 들면, 혈액 뇌 차단체를 가로지르기 때문에 카테콜아민 합성을 위한 티로신의 불충분한 물질을 이따금 나타내는, PHD에서 감소된다. 실험적 연구에서, 도파민의 합성 및 방출은 티로신의 이용성 증가에 의해 영향을 줄 수 있다. PHD에서, 티로신을 3가지 투여량(160mg/kg/24h)으로 외부 음식물을 통해 섭취하면 반응시간의 단축을 줄이고 다양성을 감소시키며, 통한 이중 불안 연구에서는 유사한 투여량이 정신적 시험에서 개선을 감소시키고, 반면 적은 투여량은 성공적이지 못한 것으로 보고되었다.
엔케팔리나제 억제 활성을 갖는 전구체 아미노산의 조합은 코카인 의존성 치료에 사용될 수 있다(참조: U.S.Patent No. 5,189,064). 코카인의 실제 사용은 특정한 형태의 뇌 전기생리학적 기능장애를 개선시킬 수 있는 것으로 알려졌다(참조: Maurer et al., 1988k). 만성 코카인 남용은 주위력을 바꾼다(참조: Noldy et al., 1990k). 코카인의 실제 사용은 특정한 양태의 뇌 전기생리학적 기능장애를 개선시킬 수 있는 것으로 알려졌다(참조: Jonsson et al., 1996). 그러나, 역설적으로, 만성 코카인 남용은 주의력을 변화시킨다(참조: Braverman and Blum, 1996). 여전히 논쟁되고 있지만, 주의력은 생유전성 아민 조절에 좌우되는 것으로 보인다(참조: Lyoo et al., 1996).
비만 및 신경학 기능:일반적으로 비만은 이상적인 체중의 20% 이상을 초과하는 것으로서 정의된다. 체중 감소를 위해 저칼로리 균형 음식요법, "지방" 음식요법, 행동 조절법, 약물(예: D-펜플루오르아민, 펜테라아민 등)법, 수술법, 총 단식용법, 자우 라이링법 및 이들 요법의 병용을 포함하는 많은 방법이 시행되었다. 이들 방법의 대부분은 문제에 대한 단기간 처방법이고 일시적으로 효과적일 수 있으며 일부는 심시어 심각한 위험을 안고 있다(참조: Lockwood and Amatruda, 1984). 체중 감소가 단기간에 입증되는 경우 조차, 체중은 통상 체중-감소 통제의 불연속에 따라 회복된다. 미국 국민의 약 28%가 비만인 사실에도 불구하고, 비만치료는 음식물 섭취로서 폭넓게 실시되는데, 이는 건강 측면 보다는 오히려 미용 측면에 따라 강요되는 실정이다(참조: Kral et al., 1989).
일부 비만의 원인 및 이러한 비만 치료의 곤란성은 최근에 연구로부터 이해가 된다. 피마 인디언의 쌍둥이에 대한 연구에서 비만에 대한 강한 유전적 기질이 있음이 확인되었다(참조: Bouchard, 1989; Stunkard et al., 1990). 비만은 유전적 및 환경적 요인을 갖는 불균질적이고 대중적인 질환이다. 각종 음식물과 기질적 물질 사용 질환(SUD)의 거시적 선택사이의 관계는 문헌에 기재되어 있고 신경화학적 연구는 알콜, 니코틴, 코카인 및 카보하이드레이트에 의해 도파민성 시스템을 통해 대중적 강화를 지지한다(참조: Nobel, 1998; DiChiara, 1988). 이에 관해, 비만 및 SUD 둘 다는 식욕 증진의 억제를 고려할 수 있다. 도파민 D2 수용체(DRD2) 및 도파민 전달자(DAT1) 유전자와 같은 일부 유전자는 비만에 위험 요소일 뿐만 아니라(참조: Noble et al., 1994; Comings et al., 1993; Blum et al., 1995a), 통상 SUD 및 기타 정신 질환에 대한 위험 요소(참조: Noble et al., 1994; Smith et al., 1992; Comings, 1994; Blum et al., 1995b; Comings et al., 1996; Cook et al., 1995)일 수 있다. 부가적으로, 마우수 ob 유전자 및 이의 사람 OB 동족체의 무성생식 및 서열화를 통해 상기 유전자의 결핍이 사람의 비만을 야기시키는 상당한 원인으로 작용하고 렙틴, 이의 유전자 생성물은 치료에 유용한 것으로 생각한다(참조: Zhang et al., 1994; Peileymounter et al., 1995). 유전적 효과는 단독으로 작용할 수 있지만, 대부분의 경우에 유전적 프로필은 단지 유전적-환경적 상호작용(예: 음식물 증가와 결합되는 경우 체중이 대폭적으로 증가)에 대한 기회를 정의하는 단계로 설정된다. 이러한 유전적 위험 프로필을 갖는 사람의 경우, 비만은 다른 만성 질환 처럼 장기간 치료를 필요로 하는 만성 질환이다.
알콜, 약물 및 음식물(특히, 카보하이드레이트)에 대한 조절불가능한 섭취 행태의 구체적인 원인은 완전하게 밝혀지지 않고 있다. 그럼에도 불구하고, 상기 식욕을 증진시키는 충동적 행위는 유전적 성질 및 환경적 유해 요인의 산물이다. 많은 연구는 글루코스 이용시 및 카보하이드레이트의 선택적 섭취시 오피네이트, 오피오이드 펩티드, CCK-8, 글리코겐, DA 및 인슐린의 상호작용과 관계된다(참조: Morley and Levine, 1988; Moore et al., 1982; Morley et al., 1985; Riviere and Bueno, 1987). 섭식 행위에 포함되는 주요 신경전달자는 모노아민 도파민(DA), 노레피네프린(Ne), 에피네프린(EPI), 세로토닌(5-HT), 억제 신경전달자 감마-아미노부티릭(GABA), 및 각종 뉴로펩타이드(예: 판크레틱 폴리펩타이드, 오피오이드 펩타이드, 호르몬 방출 인자, 및 각종 장-뇌 펩타이드)를 포함한다(참조: Cooper et al., 1988; Gosnell, 1987; Bouchard, 1994). 메조림빅 보수 시스템에서 일제히 작동하는 통상의 섭식 행위의 조절에 다수의 뇌 모노아민 및 뉴로펩타이드가 역할을 하는 포괄정 증거가 있다(참조: Leibowitz and Hor, 1982). 사람 및 동물 둘 다에서 뇌척수 유액을 분석하면 정상적인 섭식 형태와 관련된 뇌 신경화학적 기능에 특정한 장애를 나타낸다(참조: Kaye et al., 1985; Kaye et al., 1984).
과식자에 대한 연구결과 아미노산 전구체를 함유하는 음식 공급물인 각종 PHENCALTM을 섭취하는 실험 피검자는 대조 그룹에서 손실되는 10lbs에 비해 90일내에 평균 27lbs가 손실됨이 입증된다(참조: Blum, 1990). 알콜중독자, 약물 중독자, 헤로인 중독자 및 코카인 의존성 피검자에 대해 PHENCALTM또는 다른 유사한 신경영양분(참조: Blum, 1990)은 회복을 촉진시키고 추가로 상기 이외의 물질에 대한 중독을 치료하기 위한 통상적인 방법을 나타내는 것으로 밝혀졌다(참조: Blum et al., 1996; Blum et al., 1997).
니코틴의 역할:니코틴은 또한 도파민을 방출하고 니코틴은 래트, 원숭이 및 사람에 대한 각종 시험에서 기억력을 향상시키는 것으로 밝혀졌다(참조: DiChiara et al., 1988). 니코틴은 투여량에 의존하는 형태로 래트에서 식별 행위에 대한 부정확한 반응을 감소시킨다(참조: Geller et al., 1970). 이러한 효과는 클로르디아즈에폭사이드와 유사하지만 자극적인 카페인과는 유사하지 않다(참조: Geller et al., 1970). 검 또는 스킨 패치 형태의 니코틴은 토레트 증후군(TS)을 앓고 있는 일부 피검자에서 틱을 치료하는데 효과적인 것으로 알려졌고, 담배 흡연은 주의력, 각성, 학습 및 기억을 향상시키고(참조: Wesnes and Warburton, 1984; Warburton, 1992; Balfour and Fagerstrom, 1996) ADHD의 증후군을 개선시키는 것으로 보고되었다(참조: Coger et al., 1996; Conners et al., 1996; Levin et al., 1996).
ADHD를 앓고 있는 성인 피검자의 치료시 니코틴을 사용하는 효과를 측정하기 위해 위약-조절된 이중 블라인드 연구가 보고되어 있다(참조: Levime et al., 1996; Conners et al., 1996). 17명의 피검자중, 흡연자는 6명이고 비흡연자는 11명이다. 이들 모두는 성인 ADHD에 대한 DSM-IV 기준을 만족한다. 약물을 피하 패치를 통해 비흡연자에게는 7mg/1일을 투여하고 흡연자에게는 21mg/1일을 투여한다. 활성 및 위약 패치는 별도로 중화-규형된 약 1wk로 주어진다. 니코틴은 클리니칼 글로벌 임프레스(CGI) 등급을 기준으로 전체적으로 개선된다. 이러한 효과는 비흡연자가 고려되는 경우 조차 중요한데, 이는 규칙적인 흡연으로부터 섭취하기가 곤란하기 때문만이 아닌것으로 나타났다. 니코틴은 프로필 오브 무드 스테이트(POMS) 시험에 의해 측정된 바와 같이 활력을 크게 증진시키고 계속적인 성능 시험에서는 반응시간을 전체적으로 크게 감소시킨다. 또한 부주의 지수를 상당히 감소시킨다. 니코틴은 시간 평가의 정확도를 개선시키고 시간-평가 반응 곡선의 다양성을 감소시킨다. 흡연이 ADHD를 갖지 않는 성인 보다 ADHD를 갖는 성인에게서 보다 통상적이기 때문이다(참조: Conners et al., 1996).
니코틴 시스템과 도파민 시스템과의 상호작용은 이러한 효과에 중요할 수 있다. 도파민 시스템과의 니코틴 효능제 및 길항제 상호작용에 대한 일련의 연구는 래디알-암 메이즈(radial-arm maze)에서 윈-시프트 워킹 메모리 태스크(win-shift working memory task)에서 래트를 사용하여 수행되었다(참조문헌: Levin and Rose, 1995k). 니코틴 길항제 메카밀아민에 의해 유발된 작업 기억 결핍은 D1/D2 DA 길항제 할로페리돌 및 특정의 D2 길항제 라클로프리드에 의해 강화된다. 이와는 대조적으로, 메카밀아민-유도된 결핍은 D2/D3 효능제 퀸피롤의 공동-투여에 의해 반전된다. 니코틴은 또한 래디알-암 메이즈에서의 워킹 메모리 수행능 관점에서 도파민 약물과 상당한 상호작용을 갖는다. 도파민 효능제 페르골리드는 자체적으로는 래디알-암 선택 정확도를 개선시키지는 못하였다. 니코틴은 이러한 결핍의 반전에 효과적이다. 니코틴과 함께 주어질 경우, D2/D3 효능제 퀸피롤은 개개 약물 단독에 대해 RAM 선택 정확도를 개선시켰다. 중뇌 도파민 핵에 메카밀아민의 급속한 국부 주입은 래디알-암에서의 워킹 메모리 기능을 효과적으로 손상시킨다(참조문헌: Noble et al., 1998).
크로뮴 염(CrP 및 CrN)의 역할 :3가 크로뮴은 정상적인 인슐린 기능에 필수적인 무기질이다(참조문헌: Jeejeehboy et al., 1977; Schwartz et al., 1959). 모두는 아닌 일부의 이전 연구자들은 크로뮴 보충이 관상 동맥 질환(CAD) 및 비-인슐린 의존성 진성 당뇨병(NIDDM)에 대한 위험 인자를 유리하게 변화시킬 것이라고 제안하였다(참조문헌: Abraham et al., 1992; Anderson et al., 1991; Donaldson et al., 1985; Glinsmann et al., 1966; Kaats et al., 1991; Levine et al., 1968; Page et al., 1991; Press et al., 1990; Roeback et al., 1991). 크로뮴은 인슐린에 대한 이의 강화 효과를 통해 이들 변화를 야기시키는 것으로 사료된다(참조문헌: Offenbacher et al., 1988).
동물 연구는 CrP가 인슐린 내성을 저하시킬 수 있고 체 조성을 개선시킬 수 있다는 주장을 지지하고(참조문헌: Liarn et al., 1993), 하나의 사람 연구 결과 CrP 보충으로 인한 체 조성에서의 포지티브 변화가 밝혀졌고(참조문헌; Hasten et al., 1992), 또 다른 연구는 체 조성에서 포지티브이지만 통계적으로 유의한 변화는 아니라고 보고되었으며(참조문헌: Hallmark et al., 1993), 또 다른 연구는 CrP 보충으로 체 조성에서 포지티브 변화를 밝히는 데 실패했다(참조문헌: Clancey et al., 1994). CrP 보충은 체 조성을 개선시키는 것으로, 특히 과량의 체 지방을 감소시키는 것으로 나타났었다(참조문헌: Page et al., 1992). 그러나, 크로뮴 보충과 운동 훈련을 동시에 관찰하는 이전의 작업은 상충되는 결과로 체중과 조성에 대한 효과가 제한되어 왔다(참조문헌: Clancy et al., 1994; Evans et al., 1989; Evans et al., 1993; Hallmark et al., 1996; Hasten et al., 1992).
일반적으로 체 조성과 체중 손실에 대한 크로뮴 염(피콜리네이트 및 니코티네이트)의 효과에 대해서는 여전히 논쟁이 있지만(참조문헌: Abraham et al., 1992; Anderson, 1995; Hallmark et al., 1993; Clancy et al., 1994; Bulbulian et al., 1996), 일부 보고는 사람의 체 조성에서 포지티브 변화를 지지하는 것으로 보인다(참조문헌: Kaats et al., 1996). 이와는 대조적으로, 사람의 운동 여부와 상관없이 크로뮴 피콜리네이트로 체중이 증가한 것으로 보고된 반면(참조문헌: Grant et al., 1997; Bulbulian et al., 1996), 동일 집단에서 니코티네이트 염에 대해서는 포지티브 효과를 나타낸다(참조문헌: Kaats et al., 1992).
크로뮴 피콜리네이트(CrP)는 가장 많이 사용되고, 연구개발된 크로뮴 화합물이지만, 시험관내 작업은 크로뮴 니코티네이트도 또한 체 조성에서 체중 감소 및 변화의 영역에 실행 가능할 것이라고 제안하고 있다. 이전의 연구는 크로뮴 피콜리네이트 보충이 지방 덩어리를 감소시키고 지방이 없는 덩어리는 증가시키는 것으로 보고하고 있다(참조문헌: Kaats et al., 1991; Page et al., 1991). 운동 훈련의 이전의 연구는 지방이 없는 덩어리도 또한 증가시키는 것으로 보고하고 있다(참조문헌: Stefanick, 1993). 젊은 남성(참조문헌: Evans, 1989) 및 여성(참조문헌: Hasten et al., 1992)에 대한 연구가 운동 훈련과 크로뮴 피콜리네이트 보충의 혼합 사용이 운동 훈련으로 발생되는 체 조성 변화를 증가시키는 것으로 제안하였지만, 이러한 발견은 확인되고 있지 않았다(참조문헌: Clancy et al., 1994; Hallmark et al., 1996). 니코티네이트 염(CrN)이 심지어는 피콜리네이트 염보다 더욱 중요할 것이라고 보고되었었다(참조문헌: Grant et al., 1997).
행동 장애 치료에서의 영양학적 보충물: 신경전달자 작용의 혼란은 다양한 정신병 및 행동 장애의 근간이 될 수 있다(참조문헌: Blum et al., 1996c; Persico and Uhl, 1997; Noble et al., 1991). 특히, 도파민, 세로토닌, 노르에피네프린, 감마아미노부티르산(GABA), 글루타민 및 오피오이드 펩타이드의 파격적 조절은 중독 질환, 특히 알콜 및 코카인 남용을 포함한 중독 질환에 결정적인 역할을 하는 것으로 생각된다(참조문헌: Pohjalainen et al., 1996). 결과적으로, 이들 관찰은 선택된 영양물의 섭취가 사람의 기분에 영향을 줄 수 있고 이에 따라 행동에 영향을 줄 수 있다는 생각에 대한 동기를 부여하였다. 영양학적 전략이 과거에도 사용되었지만(참조문헌: Grandy et al., 1989), 유효성에 대한 설명은 결정적으로 제한되었었다. 알콜, 코카인 및 과식을 포함한 특정의 RDS 행동으로부터의 회복에 대한 아미노산 전구체 및 엔케팔리나제 억제제의 혼합 사용의 실질적인 효과가 보고되었다(참조문헌: Noble et al., 1993; Noble et al., 1994; Blum et al., 1994; Balldin et al., 1993; Duffy et al., 1994; American Psychiatric Association Task Force, 1991, U.S. Patent No. 5,189,064).
정신의학적 및 기타 폴리유전자적 특성에 관련된 유전자의 폴리유전자 분석:
정신의학적 행동은 통상적으로 유전자를 공유하며, 일단 도파민-세로토닌과 기타 신경전달자간의 균형이 뒤집어지면 뇌 기능 장애로 각종 상이한 행동을 유발할 수 있다고 가정한다[참조: Comings, 1990a; Comings and Comings, 1991a; Winokur et al., 1970; Comings, 1994b; Comings, 1996b]. 또 다른 사실은 개개인의 특성이 도파민 전달 뿐만 아니라 기타 신경전달자에서의 유전자적 변이성에 의해 매개되는 특이한 신경화학적 및 유전적 기질을 가질 수 있다는 가설을 지지한다[참조: Cloninger, 1983; Benjamin, et al., 1996, Epstein et al., 1996, Cloninger, 1991]. DRD2, DβH, DAT에 대한 분자상 유전자 연구[참조: Comings et al., 1996a], 및 임상학적 유전자 연구[참조: Comings 1994b; Comings 1994c; Comings 1995b; Biederman et al., 1991; Comings and Comings 1987]는 ADHD, 토렛트(Tourette) 증후군, 행동 장애, ODD, 실독증, 학습 장애, 말더듬, 약물 의존 및 알콜중독증을 병인학상으로 관련된 범주의 질환으로 지시하며, 남성이 우세하다.
지난 이십년간, 이러한 질환에 대한 유전자 중 대부분이 동정, 정위, 클론 및 서열화되었다. 동정된 채 잔존하는 이러한 유전자의 수가 감소함에 따라, 보다 보편적인 폴리유전자 질환에 대한 관심이 증가하게 되었다. 또한 이러한 질환에 관련된 유전자는 동정하기가 훨씬 더 어려울 수 있다고 제의되고 있다. 이러한 난점은 정신의학적 질환에 의해 예증될 수 있다. 양극성 질환을 가능한 한 제외시키면서 조울증, 정신분열증, 토렛트 증후군, 공황 장애, 자폐증 등에 대한 각종 연구[참조: Risch and Botstein, 1996]에도 불구하고, 중복되는 결과는 거의 없다. 복합 질환에서 유전자를 발견하고자 하는 다양한 노력을 통해 단순히 로드 스코어 분석, 결합 분석의 기타 부류계 형태 또는 단일유형-상대적 위험 기술을 사용함으로써 폴리유전자 질환에 대해 단일-유전자 단일-질환 모델을 제공하게끔 시도하였다[참조: Falk and Rubinstein, 1987]. 최근 들어, 복합 질환에서의 유전자를 동정하기 위해 사용되는 가장 인기있는 방법은 영향을 받은 혈통 쌍의 전체 게놈 스크리닝으로 이루어진다. 결합에 대한 비변수적 접근법[참조: Weeks and Lange, 1988]은 복합 유전에 보다 더 적합하다[참조: Greenberg et al., 1996]. 그러나, 제시된 유전자가 변이체의 8% 미만으로 추정되는 경우, 다수의 부모-자녀 셋트 또는 혈통쌍이 시험되어야 한다[참조: Carey and Williamson, 1991].
관련 연구만이 제시된 폴리유전자 특성의 변형률에 대한 약간의 기여로 유전자를 동정할 수 있는 힘을 지닐 수 있다는 인식이 증가하고 있다[참조: Risch and Merikangas, 1996; Collins et al., 1997]. 전체적으로 관련이 없으면서 민족적으로 연결된, 질환에 걸리지 않은 대조 그룹에 대해 악영향을 받은 프로밴드에서의 돌연변이체 대상 유전자의 빈도를 비교하는 관련 연구는 이러한 적은 효과를 입증할 수 있다[참조: Weeks and Lathrop, 1995; Comings, 1996; Owen and McGuffin, 1993]. DRD2, DβH 및 DAT 유전자[참조: Comings et al., 1996j], DRD1 및 DRD2 유전자[참조: Comings et al., 1997a], OB 및 DRD2 유전자[참조: Comings et al., 1996d], 및 TS, ADHD, 행동 장애, 말더듬 및 관련 행동에서의 기타 유전자 조합 유전자의 부가적인 효과가 검사되었다. TS 증후군에서, 3가지 도파민성 유전자(DRD2, DβH 및 DAT1)의 역할에 대한 동정은 비교적 다수의 TS 피검자, 이의 상관물 및 대조 그룹의 검사에 의해 최상으로 측정되며, TS 및 관련 질환이 폴리유전자적으로 내성이며 각각의 유전자가 행동 스코어 변이 중 단지 약간의 %로만 기여한다고 제시한다[참조: Comings et al., 1996a; Comings 1996b; Comings et al., 1996d; Comings 1996c].
대부분의 정신의학적 질환은 폴리유전자성이고[참조: Comings 1996b], 각각의 유전자는 제시된 행동 변수의 변이 중 10% 미만, 일반적으로 5% 미만으로 추정된다. 2가지 연구에서, 관련 정도는 하나 이상의 유전자의 부가적인 효과를 검사함으로써 증가한다. 관련 연구의 광범위한 용도에 대한 주요 장애 중 하나는 클론 및 서열화된 다수의 대상 유전자에서 또는 근방에서의 적합한 다형성의 유용성 결핍이다[참조: Comings, 1994]. 그러나, 이러한 기술 또는 분류상의 결합 기술이 사용되는 경우에도, 일군의 연구로부터의 포지티브 결과는 연속적인 연구에서 종종 중복되지 않는다[참조: Egeland et al., 1987; Kelsoe et al., 1989; Blum et al., 1990; Bolos et al., 1990]. 이러한 기술은 또한 집단 계층화로 인해 그릇된 포지티브를 일으킬 수 있으나, 이는 다수의 피검자[참조: Comings, 1995]와 함께 단일유형 상대적 위험 공정[참조: Falk and Rubinstein, 1987]을 사용하여 최소화될 수 있다. 이러한 시도의 적은 크기, 및 복제에서의 어려움은 폴리유전자 질환에 관련된 유전자를 동정할 수 있는지의 여부에 대한 회의론을 일으킨다[참조: Moldin, 1997].
발명의 요지
미국에서만도, 1천8백만명의 알콜중독자, 2천8백만명의 소아 알콜중독자, 6백만명의 코카인 중독자, 1천4백9십만명의 기타 물질 남용자, 2천5백만명의 니코틴 중독자, 5천4백만명의 20% 이상 비만인, ADHD 또는 토렛트 증후군을 겪는 3백5십만명의 취학 아동 및 3백7십만명의 강박적인 투기꾼들이 있다. 본 발명자들은 사람을 DRD2 유전자 뿐만 아니라 본 발명의 정신 질환에 관련된 기타 유전자의 대립유전형질에 대해 제노타이핑(genotyping)하는 것이 사실상 사회적으로 심각한 문제에 대한 합리적인 대처를 향한 첫걸음이다.
본 발명은 먼저 피검자에서의 보상 결핍 증후군(RDS) 행동의 치료를 위한 조성물을 제공한다. 특정 양상에서, 당해 조성물은 다음의 성분을 하나 이상 포함한다: 뉴로펩티딜 오피트의 효소 파괴를 억제하는, 오피트 파괴 억제량의 하나 이상의 물질(이때, 물질은 아미노산, 펩티드 및 이의 구조상 동족체 또는 유도체이다); 신경전달자 합성-촉진량의 하나 이상의 신경전달자 전구체(이때, 신경전달자 전구체는 L-Tyr, L-Phe 및 L-도파와 같은 도파민 전구체, L-Trp 및 5-하이드록시트립토판과 같은 세로토닌 전구체 또는 L-글루타민, L-글루탐산 및 L-글루타메이트과 같은 감마 아미노 부티르산(GABA) 전구체이다); 트립토판 농도 증진량의 크롬 피콜네이트 또는 크롬 니코티네이트; 엔케팔린을 방출시키는 화합물(이때, 엔케팔린 방출제는 펩티드, 바람직하게는 펩티드를 함유하는 D-아미노산이나, 이에 한정되지 않는다); 또는 델타, 무, 캅파, 시그마 또는 엡실론 수용체에서의 오피트 효과를 차단시키는, 오피트 길항제 양의 하나 이상의 화합물. 상기 구체적으로 기술된 화합물 외에, 엔케팔린 억제제, 신경전달자 전구체, 오피트 파괴-억제 물질, 오피트 길항제 및/또는 크롬 화합물이 본원에 추가로 기술되고 본 발명에 포함된다. 본 발명의 특정의 바람직한 양상에서, 당해 조성물은 피검자의 목적하지 않은 중량을 방지하거나 감소시키는데 사용된다. 본 발명의 또 다른 특정 양상에서, 당해 조성물은 바람직하게는 주의력 결핍 장애, 주의력 진전 또는 기억의 치료에 사용된다. 이러한 양태에서, 주의력 결핍 장애, 주의력 결핍 기능항진 장애(ADHD) 주의력 진전 또는 기억의 치료를 위해, 조성물은 보다 바람직하게는 로딜라 또는 후바진 그룹으로부터 선택된, 신경전달자 합성-촉진량의 하나 이상의 신경전달자 합성 촉진 물질을 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같이, "유도체"란 화학적으로 개질된 화합물을 언급할 수 있고, "동족체"란 비교되는 화합물과 특성 또는 구조가 유사한 상이한 화합물을 언급한다.
본 발명의 특정 양상에서, 당해 조성물은 본원에 기술된 모든 RDS 관련 행동의 치료에 사용될 수 있다. RDS 행동은 평온함과 함께 불안, 분노 또는 물질에 대한 갈망과 같은 피검자의 감정에 관련된 하나 이상의 행동 장애로서 화학적 불균형 명시 자체에 관련되는 행동이다. RDS 행동은 알콜중독, SUD, 흡연, BMI 또는 비만, 병적 도박, 탄수화물 집착, 주축 11 진단, SAB, ADD/ADHD, CD, TS, SUD에 대한 가계 내력 및 비만이 본원에 기술되어 있다.
본 발명은 또한 SUD, 비만, 흡연, 토렛트 증후군, ADHD, 분열병질/회피성 행동, 공격성, 외상후 스트레스 증후군, PMS 또는 담배 사용을 포함하되, 이에 한정되지 않는 RDS 행동에 대한 피검자의 치료방법을 제공한다. 다수 유형의 추가-장애가 이러한 질환에 포함되기 때문에 RDS 행동은 이러한 장애로 구체적으로 한정되지 않는다. 예를 들어, 주의력 결핍 기능항진 장애(ADHD)는 알콜, 약물, 강박 관념적 행동, 학습 장애, 판독 문제, 도박, 조병 증후군, 공포증, 공황 발작, 적대적인 저항 행동, 행동 장애, 초등학교에서의 학원 문제, 흡연, 성적 행동, 정신분열증, 신체화, 울증, 수면 장애, 통상의 불안, 말더듬 및 안면 틱으로서 그 자체를 나타낼 수 있다. 이러한 모든 행동, 및 RDS 행동 또는 RDS에 관련된 신경학상 경로에 포함된 유전자와 관련된 바와 같이 본원에 기술된 또 다른 행동은 본원의 일부로서 RDS 행동으로서 포함된다. 또한, RDS 장애인 다수의 특이적 장애에 대해 본원에서 사용되는 각종 임상학적 용어는 문헌[참조: the Quick Reference to the Diagnostic Criteria From DSM-IVTM, The American Phychiatric Association, Washington, D.C., 1994, 358pages]에서 발견된다. 그 정의가 이러한 문헌에서 발견될 수 있고 DSM-IVTM내의 그 코드 번호가 공황 장애를 포함하는 특정 장애는 광장 공포증이 따르지 않는 공황 장애, 300.01, 광장 공포증이 따르지 않는 공황 장애, 300.21, 공황 장애가 따르지 않는 광장 공포증, 300.22, 특이적 공포증, 300.29, 사회 공포증, 300.23, 강박 관념 장애, 300.3, 외상후 스트레스 장애, 309.81, 급성 스트레스 장애, 308.3, 일반화된 불안 장애, 300.02, 유아기의 과민불안 장애, 300.02, [일반적인 의학적 상태를 나타냄]에 의한 불안 장애, 293.89, 물질 유발 불안 장애, 293.89, 불안 장애 NOS, 300.00; 주의력 결핍/기능항진 장애, 우성 부주의 유형, 314.00, 주의력 결핍/기능항진 장애, 우성 기능항진/자극 유형, 314.01, 주의력 결핍/기능항진 장애 NOS, 314.9, 행동 장애, 312.8, 적대적 저항 장애, 313.81, 파괴적 행동 장애 NOS, 312.9를 포함하는, 주의력 결핍 및 파괴적 행동 장애; 양극성 Ⅰ 장애, 296.0x, 296.40, 296.4x, 296.6x, 296.5x 및 296.7, 양극성 Ⅱ 장애, 296.89, 사이클로티믹 장애, 301.13, 양극성 장애 NOS, 296.80을 포함하는 양극성 장애; 주요 울증, 재발성, 296.3, 정서이상 장애, 300.4, 울증 NOS, 311, 주요 울증, 단일 에피소드, 296.2를 포함하는 울증; 신경성 탐식, 논퍼징 유형, 307.51, 신경성 탐식, 퍼징 유형, 307.51, 신경성 식욕 감퇴, 307.1, 식이 장애 NOS 307.50을 포함하는 식이 장애; 간헐성 폭발 장애, 312.34, 도벽, 312.32, 방화, 312.23, 병적 도박, 312.31, 병적 발모, 312.39, 자극 조절 장애 NOS, 312.30을 포함하는 자극 조절 장애; 반사회적 성격 장애, 301.7, 회피성 성격 장애, 301.82, 강박관념 자극 성격 장애, 301.4, 정신분열 성격 장애, 301.20을 포함하는 성격 장애; 편집증 유형, 295.30, 분열 유형, 295.10, 긴장성 유형, 295.20, 획일성 유형, 295.90, 오차 유형, 295.60, 정서분열증 장애, 295.70, 정신분열형 장애, 295.40을 포함하는 정신분열증; 제1 불면증 307.42, 제1 과수면증 307.44, 기면 발작 347, 24시간 리듬 수면 장애, 307.45, 수면불량 NOS 307.47을 포함하는 수면 불량, 악몽 장애 307.47, 수면 공포 장애 307.46, 몽유병 307.46, 이상 수면 NOS 307.47을 포함하는 이상수면, [주축 Ⅰ 또는 주축 Ⅱ 장애를 가리킴] 307.42 관련 불면증[주축 I 또는 주축 II 장애를 가르킴] 307.44 관련 과잉 수면을 포함하는 기타 정신 질환 관련 수면 장애, [일반적인 의학적 상태를 가리킴] 780.xx, 물질 유발 수면 장애 780.xx에 의한 수면 장애를 포함하는 기타 수면 장애와 같은 제1 수면 장애를 포함하는 수면 장애; 망상, 291.5, 알콜 남용, 305.00, 알콜 중독 303.00, 알콜 금단 291.8, 알콜 중독 정신착란, 291.0, 알콜 금단 정신착란, 291.0, 알콜 유발 지속성 치매, 291.2, 알콜 유발 지속성 건망증 장애, 291.1, 알콜 의존성, 303.90, 환각상태를 지니는 알콜 유발 정신이상 장애, 291.3, 알콜 유발 기분 장애, 291.8, 알콜 유발 불안 장애, 291.8, 알콜 유발 성적 부작용, 291.8, 알콜 유발 수면 장애, 291.8, 알콜 관련 장애 NOS, 291.9, 알콜 중돋, 303.00, 알콜 금단, 291.8과 함께, 알콜 유발 정신이상 장애와 같은 알콜 관련 장애, 니코틴 의존성, 305.10, 니코틴 금단, 292.0, 니코틴 관련 장애 NOS, 292.9을 포함하는 니코틴 관련 장애, 암페타민 의존성, 304.40, 암페타민 남용, 305.70, 암페타민 중독, 292.89, 암페타민 금단, 292.0, 암페타민 중독 정신착란, 292.81, 망상이 따르는 암페타민 유발 정신이상 장애, 292.11, 환각증상이 따르는 암페타민 유발 정신이상 장애, 292.12, 암페타민 유발 기분 장애, 292.84, 암페타민 유발 불안 장애, 292.89, 암페타민 유발 성적 부작용, 292.89, 암페타민 유발 수면 장애, 292.89, 암페타민 관련 NOS 292.9, 암페타민 중독, 292.89, 암페타민 금단, 292.0을 포함하는 암페타민 관련 장애, 대마초 의존성, 304.30, 대마초 남용, 305.20, 대마초 중독, 292.89, 대마초 중독 정신착란, 292.81, 망상이 따르는 대마초 유발 정신이상 장애, 292.11, 환각증상이 따르는 대마초 유발 정신이상 장애, 292.12, 대마초 유발 불안 장애, 292.89, 대마초 관련 장애 NOS, 292.9, 대마초중독, 292.89를 포함하는 대마초 관련 장애, 코카인 의존성, 304.20, 코카인 남용, 305.60, 코카인 중독, 292.89, 코카인 금단, 292.0, 코카인 중독 정신착란, 292.81, 망상이 따르는 코카인 유발 정신이상 장애, 292.11, 환각증상이 따르는 코카인 유발 정신이상 장애, 292.12, 코카인 유발 기분 장애, 292.84, 코카인 유발 불안 장애, 292.89, 코카인유발 성적 부작용, 292.89, 코카인 유발 수면 장애, 292.89, 코카인 관련 장애 NOS, 292.9, 코카인 중독, 292.89, 코카인 금단, 292.0을 포함하는 코카인 관련 장애를 포함하는 물질 사용 장애; 환각제 의존성, 304.50, 환각제 남용, 305.30, 환각제 중독, 292.89, 환각제 금단, 292.0, 환각제 중독 정신착란, 292.81, 망상이 따르는 환각제 유발 정신이상 장애, 292.11, 환각증상이 따르는 환각제 유발 정신이상 장애, 292.12, 환각제 유발 기분 장애, 292.84, 환각제 유발 불안 장애, 292.89, 환각제 유발 성적 부작용, 292.89, 환각제 유발 수면 장애, 292.89, 환각제 관련 장애 NOS, 292.9, 환각제 중독, 292.89, 환각제 지속성 인식 장애(플래시백), 292.89를 포함하는 환각제 사용 장애; 흡입제 의존성, 304.60, 흡입제 남용, 305.90, 흡입제 중독, 292.89, 흡입제 중독 정신착란, 292.81, 망상이 따르는 흡입제 유발 정신이상 장애, 292.11, 환각증상이 따르는 흡입제 유발 정신이상 장애, 292.12, 흡입제 유발 불안 장애, 292.89, 흡입제 관련 장애 NOS, 292.9, 흡입제 중독, 292.89를 포함하는 흡입제 사용 장애; 오피오이드 의존성, 304.00, 오피오이드 남용, 305.50, 오피오이드 중독, 292.89, 오피오이드 중독 정신착란, 292.81, 망상이 따르는 오피오이드 유발 정신이상 장애, 292.11, 환각증상이 따르는 오피오이드 유발 정신이상 장애, 292.12, 오피오이드 유발 불안 장애, 292.89, 오피오이드 관련 장애 NOS, 292.9, 오피오이드 중독, 292.89, 오피오이드 금단, 292.0을 오피오이드 사용 장애; 다중물질 의존성, 304.80을 포함하는 다중물질 관련 장애; 토렛트 장애, 307.23, 만성 모터 또는 성대 안면 틱 장애 307.22, 일시적 안면 틱 307.21, 안면 틱 장애 NOS 307.20을 포함하는 안면 틱 장애, 말더듬 307.0, 자폐증, 299.00 및 신체화 장애 300.81을 포함한다. 또한, 또 다른 RDS 장애는 문헌[참조: Clonigen et al., 1993]에 정의된 신형 추구와 같이, 당해 기술 분야의 숙련인에게 공지된 바와 같이 정의된다. 본원에서 구체적으로 정의되지 않더라도, 기타 장애는 통상의 약칭을 포함하여, 당해 기술 분야의 숙련인에게 통상적으로 공지된 바와 동일하다.
본 발명의 특정 양상에서, 상기 언급된 화합물 각각의 RDS 행동 또는 장애의 치료시 일일 투여량은 약 1, 약 2, 약 4, 약 5, 약 6, 약 7, 약 8, 약 9, 약 10, 약 11, 약 12, 약 13, 약 14, 약 15, 약 16, 약 17, 약 18, 약 19, 약 20, 약 21, 약 22, 약 23, 약 24, 약 25, 약 26, 약 27, 약 28, 약 29, 약 30, 약 31, 약 32, 약 33, 약 34, 약 35, 약 36, 약 37, 약 38, 약 39, 약 40, 약 41, 약 42, 약 43, 약 44, 약 45, 약 46, 약 47, 약 48, 약 49, 약 50, 약 55, 약 60, 약 65, 약 70, 약 80, 약 90, 약 100, 약 110, 약 120, 약 130, 약 140, 약 150, 약 160, 약 170, 약 180, 약 190, 약 200, 약 220, 약 240, 약 260, 약 280, 약 300, 약 325, 약 350, 약 375, 약 400, 약 425, 약 450, 약 475, 약 500, 약 550, 약 600, 약 650, 약 700, 약 725, 약 750, 약 775, 약 800, 약 825, 약 850, 약 875, 약 900, 약 925, 약 950, 약 975, 약 1,000, 약 1,100, 약 1,200, 약 1,300, 약 1,400, 약 1,500, 약 1,600, 약 1,700, 약 1,800, 약 1,900, 약 2,000, 약 2,100, 약 2,200, 약 2,300, 약 2,400, 약 2,500, 약 2,600, 약 2,700, 약 2,800, 약 2,900, 약 3,000, 약 3,250, 약 3,500, 약 3,750, 약 4,000, 약 4,250, 약 4,500, 약 4,750, 약 5,000, 약 5,250, 약 5,500, 약 5,750, 약 6,000, 약 6,250, 약 6,500, 약 6,750, 약 7,000, 약 7,250, 약 7,500, 약 7,750, 약 8,000, 약 8,250, 약 8,500, 약 8,750, 약 9,000, 약 9,250, 약 9,500, 약 9,750, 약 10,000, 약 11,000, 약 12,000, 약 13,000, 약 14,000, 약 15,000, 약 16,000, 약 17,000, 약 18,000, 약 19,000, 약 20,000, 약 21,000, 약 22,000, 약 23,000, 약 24,000, 약 25,000, 약 26,000, 약 27,000, 약 28,000, 약 29,000, 약 30,000㎎ 이상일 수 있다. 또한, 구체적으로 기재되지 않더라도, 상기 신체화된 범위에 속하는 모든 양이 사용될 수 있고 본 발명에 포함될 수 있다. 상기 문단에서 구체적으로 기재되지 않더라도, 예를 들어, 약 4,751, 약 4,752, 약 4,753㎎ 등의 범위가 본 발명에 사용될 수 있다.
RDS 행동이 비만인 본 발명의 특정 양태에서, 바람직한 조성물의 범위 및 성분은 일일 투여되는 DL-페닐알라닌 460㎎, L-트립토판 25㎎, L-글루타민 25㎎ 및 피리독살-5'-포스페이트 5㎎이다. 당해 양태의 또 다른 바람직한 양상에서, 피검자는 본원에 기술되거나 당해 기술 분야의 숙련인에게 공지된 방법을 사용하여 시험되어 피검자가 화학적 의존성의 가계 내력(이때, 가계 내력은 성공적인 치료를 위한 개선된 가능성을 나타낸다)을 지니는지의 여부를 측정한다. 당해 양태의 또 다른 양상에서, 치료는 광적인 식사를 억제한다. 본 발명의 또 다른 양상에서, 치료는 갈망을 억제한다. 바람직한 양상에서, 당해 조성물은 크롬 염을 함유한다.
피검자가 본원에서 기술된 바와 같이, RDS 또는 심리학적 행동과 관련된 대립형질에 대해 분자성 생물학 분석을 사용하여 시험되고, 이러한 치료상의 대립형질의 존재가 치료를 위해 본원에 기술된 조성물에 포지티브적으로 보다 반응하기 용이한 지표 피검자가라는 점이 본 발명의 일부이다. 이러한 양태의 바람직한 양상에서, 피검자는 다음의 하나 이상의 대립형질의 존재에 대해 본원에 기술된 방법을 사용하여, 유전적으로 시험되거나 분자상 생물학 분석에 의해 시험된다: D2TaqⅠA1, B1, C1 또는 OB에 동형성인 엑손6-7단일유형 HTR2A-C 대립형질-1875 디뉴클레오티드 반복 다형성 사람 염색체 2 마이크로세터레이트 다형성의 208 BP 대립형질 미만의 동형도, APO-D-TaqⅠ 2.2 또는 2.7BP, 또는 OB 유전자 D7S1875, 이때 상기 언급된 대립형질의 검출은 치료에 대한 성공적인 반응에 대한 개선된 가능성을 나타낸다. 이러한 양태의 또 다른 바람직한 양상에서, 당해 조성물은 유효량의 크롬 니코티네이트를 포함하고, 피검자는 DED2 A1 대립형질의 존재에 대해 시험되는데, 이때 DRD2 A1 대립형질의 존재는 치료를 사용하는 반응의 개선된 가능성을 나타낸다. 이러한 양태의 또 다른 바람직한 양상에서, 당해 조성물은 유효량의 크롬 피콜리네이트를 포함하고, 피검자는 DED2 A2 대립형질의 존재에 대해 시험되는데, 이때 DED2 A1 대립형질의 존재는 치료를 사용하는 반응의 개선된 가능성을 나타낸다.
RDS 행동이 담배 사용인 본 발명의 한 가지 양태에서, 피검자는 다음의 하나 이상의 대립형질의 존재에 대해 본원에 기술된 방법을 사용하여, 유전적으로 시험되거나 분자상 생물학 분석을 사용하여 시험된다: D1(Dde A1의 동형도) D2(TaqⅠ A1)D4(VNTR 2)D5(이가뉴클레오티드 13대립형질 범위 135 내지 159 BP)DAT1 VNTR(10/10)DβH(TaqⅠ B1 대립형질), 이때 상기 언급된 대립형질의 검출은 치료에 대한 성공적인 반응에 대해 개선된 가능성을 나타낸다.
RDS 행동이 추가로 자폐증, 토렛트 증후군 또는 ADHD를 포함하는 본 발명의 또 다른 양태에서, 피검자는 다음의 하나 이상의 대립형질의 존재에 대해 본원에 기술된 방법을 사용하여, 유전적으로 시험되거나 분자상 생물학 분석을 사용하여 시험된다: D1(Dde A1의 동형도) D2(TaqⅠ A1)D4(VNTR 2)D5(이가뉴클레오티드 13대립형질 범위 135 내지 159 BP)DAT1 VNTR(10/10)DβH(TaqⅠ B1 대립형질)MAOA(X), 이때 상기 언급된 대립형질의 검출은 치료에 대한 성공적인 반응에 대해 개선된 가능성을 나타낸다. 이러한 양태의 특정 바람직한 양상에서, 당해 조성물은 유효량의 로딜라 또는 후바진을 포함한다.
RDS 행동이 병적인 도박인 본 발명의 한 가지 양태에서, 피검자는 다음의 하나 이상의 대립형질의 존재에 대해 본원에 기술된 방법을 사용하여, 유전적으로 시험되거나 분자상 생물학 분석을 사용하여 시험된다: D1(Dde A1의 동형도) D2(TaqⅠ A1, B1, C1), 이때 상기 언급된 대립형질의 검출은 치료에 대한 성공적인 반응에 대해 개선된 가능성을 나타낸다.
RDS 행동이 추가로 병적인 폭력, 정신분열/회피성(SAB), 호전성, 분노, 적의 또는 외상후 스트레스 장애를 포함하는 본 발명의 또 다른 양태에서, 피검자는 다음의 하나 이상의 대립형질의 존재에 대해 본원에 기술된 방법을 사용하여, 유전적으로 시험되거나 분자상 생물학 분석에 의해 시험된다: D2(TaqⅠA1, B1, C1, 엑손6-7)DAT1(VNTR 10/10)mNOSⅠa-201 BP 이하의 동형도, 이때 상기 언급된 대립형질의 검출은 치료에 대한 성공적인 반응에 대한 개선된 가능성을 나타낸다.
RDS 행동이 PMS인 본 발명의 한 가지 양태에서, 피검자는 DAT1 VNTR(10/10)D2TraqⅠ A1, B1, C1, 엑손6-7단일유형으로부터의 대립형질, 또는 DRD1, DRD2, DRD4, HTT, HTRIA, TDO2, DβH, MAO, COMT, GABRAB, GABRB3, PENk, ADRA2A 또는 ADRA2C 유전자로부터의 대립형질 중 하나 이상의 존재에 대해 본원에 기술된 방법을 사용하여, 유전적으로 시험되거나 분자상 생물학 분석을 사용하여 시험되며, 이때 상기 언급된 대립형질의 검출은 치료에 대한 성공적인 반응에 대해 개선된 가능성을 나타낸다.
본 발명은 또한 DRD1, DRD2, DRD3, DRD4, DRD5, DAT1, HTT, HTR1A, TDO2, DBH, ADRA2A, ADRA2C, NET, MAOA, COMT, GABRA3, GABRB3, CNR1, CNRA4, NMDAR1, PENK, AR, CRF, HTR1Dβ, HTR2A, HTR2C, 인터페론-γ, CD8A, 또는 PS1 유전자를 포함하되, 이에 한정되지 않는 그룹으로부터 RDS 행동에 대해 치료적인 하나 이상의 대립형질을 검출함으로써 하나 이상의 RDS 행동에 대한 피검자의 유전적 성향을 측정하는 방법을 제공한다. 본 발명의 한 가지 양태에서, 피검자는 MAOA 유전자 대립형질의 VNTR 다형성인 하나 이상의 존재에 대해 본원에서 기술된 방법을 사용하여 유전적으로 시험되거나 분자상 생물학 분석에 의해 시험되며, 이때 대립형질의 존재는 집착증, OCD, 성적, 수면, 초등학교 행동, 도박, 학습, 부주의, ADHD, ADDR, 강박증, MDE, CD, 기능항진, 공포증, 정신분열 행동, 일반적인 불안, 신체화, 약물, Ⅳ 약물, 난독증, ODD, 안면 틱, 알콜 또는 담배 사용을 포함한 RDS 행동에 대한 유전적 성향과 함께 피검자에 대해 치료학적이다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 피검자는 하나 이상의 DRD2유전자 A1대립형질, DAT1유전자, VNTR 10/10 대립형질, 또는 DβH 유전자 B1대립형질에 대해 본원에 기술된 방법을 사용하여, 유전적으로 시험되거나 분자상 생물학 분석에 의해 시험되며, 이때 대립형질의 존재는 정신분열증 또는 회피증을 포함한 RDS 행동에 대한 유전적 성향과 함께 피검자에 대해 치료학적이다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 피검자는 CNR 1 유전자 중의 증가된 수의 (AAT)n삼중 반복체의 존재에 대해 CNR본원에 기술된 방법을 사용하여, 유전적으로 치료되거나 분자상 생물학 분석을 사용하여 시험되며, 이때 대립형질의 존재는 약물 사용을 포함한 RDS 행동에 대한 유전적 성향과 함께 피검자에 대해 치료학적이다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 피검자는 OB 유전자 중의 증가된 수의 D7S1873, D7S1875, D7S514 또는 D7S680 디뉴클레오티드 반복체의 존재에 대해 본원에 기술된 방법을 사용하여, 유전적으로 시험되거나 분자상 생물학 분석에 의해 시험되며, 이때 대립형질의 존재는 비만, 불안, 울증, 심리분석, 적대감, 편집증 관념, 강박 관념, 총체적 증후군, 일반적인 증후군 지수, 신형 추구, 총체적이고 전체적인 신경증 및 신중함을 포함한 RDS 행동에 대한 유전적 성향과 함께 피검자에 대해 치료학적이다. 이러한 양태에서, 대립형질은 길이에 있어서 225bp 이상인 D7S1875 디뉴클레오티드 반복체이고, 이러한 대립형질은 CNR1 유전자의 2개의 복제물에 존재하는 것이 바람직하다. 이러한 양태에서, 또 다른 검출된 대립형질은 DRD2 유전자의 D2A1 대립형질인 것이 또한 바람직하다. 이러한 양태에서, RDS 행동은 비만인 것이 또한 바람직하다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 피검자는 DRD2 유전자의 D2A1 대립형질의 존재에 대해 본원에 기술된 방법을 사용하여, 유전적으로 시험되거나 분자상 생물학 분석에 의해 시험되며, 이때 대립형질의 존재는 토렛트 증후군, 광적 증후군, 적대적 저항, 성적, ADHD-R, 정신분열, ADHD, 안면 틱, 주요 울증, 행동, 말더듬, 강박 관념, 신체화, 알콜 남용, 학습 및 수면 문제를 포함한 RDS 행동에 대한 유전적 성향과 함께 피검자에 대해 치료학적이다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 피검자는 DβH 유전자의 Taq A1 대립형질의 존재에 대해 본원에 기술된 방법을 사용하여, 유전적으로 시험되거나 분자상 생물학 분석에 의해 시험되며, 이때 대립형질의 존재는 토렛트 증후군, ADHD, 흡연, 학습, 초등학교, ADHD-R, 적대적 저항감, 안면 틱, 조증, 알콜, 난독증, 약물 남용, 수면, 말더듬, 강박 관념, 신체화 및 주요 울증을 포함한 RDS 행동에 대한 유전적 성향과 함께 피검자에 대해 치료학적이다. 이러한 양태에서, 검출된 대립형질은 DβH 유전자의 Taq B1 대립형질 및 Taq A1 대립형질이고 RDS 행동은 토렛트 증후군인 것이 바람직하다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 피검자는 DAT1 유전자의 10 대립형질의 존재에 대해 본원에 기술된 방법을 사용하여, 유전적으로 시험되거나 분자상 생물학 분석에 의해 시험되며, 이때 대립형질의 존재는 토렛트 증후군, 자폐증, 신체화, 알콜, ADHD-R, 주요 울증, 공황, 강박 관념, 일반적인 불안, 조증, 적대적 저항감, 성적, 판독 및 ADHD를 포함한 RDS 행동에 대한 유전적 성향과 함께 피검자에 대해 치료학적이다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 피검자는 DAT1 유전자의 10 대립형질, DβH 유전자의 Taq A1 대립형질 또는 DRD2 유전자의 D2A1 대립형질의 존재에 대해 본원에 기술된 방법을 사용하여, 유전적으로 시험되거나 분자상 생물학 분석에 의해 시험되며, 이때 대립형질의 존재는 ADHD, 말더듬, ADHD-R, 적대적 저항감, 안면 틱, 행동, 강박 관념, 조증, 알콜, 일반적인 불안, 공황 정신분열, 수면, 성적, 약물 및 주요 울증에 대한 유전적 성향과 함께 피검자에 대해 치료학적이다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 피검자는 DRD1 유전자의 DdeⅠ대립형질의 존재에 대해 본원에 기술된 방법을 사용하여, 유전적으로 시험되거나 분자상 생물학 분석에 의해 시험되며, 이때 대립형질의 존재는 알콜, 흡연, 강박적 식사, 안면 틱, 도박, 약물, 판독, 쇼핑, 적대적 저항, 주요 울증 에피소드, 정신분열, ADHD, 행동 장애, 강박 관념 및 조증에 대한 유전적 성향과 함께 피검자에 대해 치료학적이다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 피검자는 DRD2 유전자의 TaqⅠ A1 및 TaqⅠ A2 대립형질의 존재에 대해 본원에 기술된 방법을 사용하여, 유전적으로 시험되거나 분자상 생물학 분석에 의해 시험되며, 이때 대립형질의 존재는 적대적 저항, 행동 장애, 식사, 흡연, 도박, ADHD, 강박 관념, 조증 및 알콜에 대한 유전적 성향과 함께 피검자에 대해 치료학적이다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 피검자는 DRD1 유전자의 D11 또는 22 유전자형의 존재에 대해 본원에 기술된 방법을 사용하여, 유전적으로 시험되거나 분자상 생물학 분석에 의해 시험되며, 이때 대립형질의 존재는 토렛트 증후군, 흡연 및 도박에 대한 유전적 성향과 함께 피검자에 대해 치료학적이다. 이러한 양태에서, 검출된 대립형질은 DRD1 유전자의 Dde1 대립형질의 게놈당 2개의 복제물인 것이 바람직하다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 피검자는 DRD1 유전자의 11개 유전자형의 존재에 대해 본원에 기술된 방법을 사용하여, 유전적으로 시험되거나 분자상 생물학 분석에 의해 시험되며, 이때 대립형질의 존재는 적대적 저항 행동, 행동 장애, 강박적 식사, 흡연, 도박, ADHD 조증, 말더듬, 강박 관념 및 정신분열 행동에 대한 유전적 성향과 함께 피검자에 대해 치료학적이다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 피검자는 DRD1 유전자의 Dde1 대립형질의 존재에 대해 본원에 기술된 방법을 사용하여, 유전적으로 시험되거나 분자상 생물학 분석에 의해 시험되며, 이때 대립형질의 존재는 도박, 흡연, 강박적 식사, 적대적 저항, 주요 울증 에피소드, ADHD, 행동 장애, 정신분열, 강박 관념, 조증 및 알콜에 대한 유전적 성향과 함께 피검자에 대해 치료학적이다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 피검자는 DRD1 유전자의 11 또는 22개 유전자형의 존재에 대해 본원에 기술된 방법을 사용하여, 유전적으로 시험되거나 분자상 생물학 분석에 의해 시험되며, 이때 대립형질의 존재는 알콜, 흡연, 강박적 식사, 안면 틱, 도박, 약물, 난독증, 쇼핑, 도박 및 초등학교 문제에 대한 유전적 성향과 함께 피검자에 대해 치료학적이다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 피검자는 트립토판 2,3 디옥시제나제 유전자의 인트론 6G→A 다형성의 존재에 대해 본원에 기술된 방법을 사용하여, 유전적으로 시험되거나 분자상 생물학 분석에 의해 시험되며, 이때 대립형질의 존재는 토렛트 증후군에 대한 유전적 성향과 함께 피검자에 대해 치료학적이다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 피검자는 트립토판 2,3 디옥시제나제 유전자의 인트론 6G→T 다형성의 존재에 대해 본원에 기술된 방법을 사용하여, 유전적으로 시험되거나 분자상 생물학 분석에 의해 시험되며, 이때 대립형질의 존재는 ADHD, 알콜 의존성, 약물 의존성, 병적 도박에 대한 유전적 성향과 함께 피검자에 대해 치료학적이다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 피검자는 트립토판 2,3 디옥시제나제 유전자의 인트론 6 DGGE 다형성의 존재에 대해 본원에 기술된 방법을 사용하여, 유전적으로 시험되거나 분자상 생물학 분석에 의해 시험되며, 이때 대립형질의 존재는 ADHD, 알콜 의존성, 약물 의존성, 병적 도박 및 울증에 대한 유전적 성향과 함께 피검자에 대해 치료학적이다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 피검자는 ADRA2C 디뉴클레오티드 반복 다형성의 적은 염기쌍 대립형질(≤181bp)의 존재에 대해 본원에 기술된 방법을 사용하여, 유전적으로 시험되거나 분자상 생물학 분석에 의해 시험되며, 이때 대립형질의 존재는 약물 사용에 대한 유전적 성향과 함께 피검자에 대해 치료학적이다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 피검자는 ADRA2C 디뉴클레오티드 반복 다형성의 183bp 이상에 대한 2개의 높은 염기쌍 대립형질의 존재에 대해 본원에 기술된 방법을 사용하여, 유전적으로 시험되거나 분자상 생물학 분석에 의해 시험되며, 이때 대립형질의 존재는 알콜 사용에 대한 유전적 성향과 함께 피검자에 대해 치료학적이다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 피검자는 프레세닐린-1(PS1) 다형성에 대한 2개의 동형성 대립형질의 존재에 대해 본원에 기술된 방법을 사용하여, 유전적으로 시험되거나 분자상 생물학 분석에 의해 시험되며, 이때 대립형질의 존재는 알콜 및 담배 사용에 대한 유전적 성향과 함께 피검자에 대해 치료학적이다. 이러한 양태에서, 검출된 대립형질은 PENK 유전자의 CA 디뉴클레오티드 반복 다형성의 80bp 이상의 2개의 동형성 대립형질인 것이 바람직하다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 피검자는 AR 유전자의 GGC 대립형질의 존재에 대해 본원에 기술된 방법을 사용하여, 유전적으로 시험되거나 분자상 생물학 분석에 의해 시험되며, 이때 대립형질의 존재는 CD, ODD 또는 기능항진에 대한 유전적 성향과 함께 피검자에 대해 치료학적이다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 피검자는 DRD2 대립형질의 존재에 대해 본원에 기술된 방법을 사용하여, 유전적으로 시험되거나 분자상 생물학 분석에 의해 시험되며, 이때 대립형질의 존재는 알콜중독자, 코카인 중독자 또는 RDS 출발인 중의 유형 B 행동에 대한 유전적 성향과 함께 피검자에 대해 치료학적이다.
본 발명은 또한 DRD1, DRD2, DRD5, DAT1, HTT, HTR1A, TDO2, DBH, ADRA2A, ADRA2C, NET, MAOA, COMT, GABRA3, GABRB3, CNR1, CNRA4, NMDAR1, PENK, AR, CRF, DRD3, DRD4, HTR1Dβ, HTR2A, HTR2C, 인터페론-γ, CD8A 또는 PS1 유전자를 포함하는 그룹으로부터 하나 이상의 관련 대립형질을 검출함을 포함하는 폴리유전적 특성에 대한 유전적 성향을 측정하는 방법을 제공한다. 본 발명의 한 가지 양태에서, 폴리유전적 특성은 ADHD이고, 대립형질은 DRD1, DRD2, DRD5, DAT1, HTT, HTR1A, TDO2, DBH, ADRA2A, ADRA2C, NET, MAOA, COMT, GABRA3, GABRB3, CNR1, CNRA4, NMDAR1, PENK, AR 또는 CRF 유전자에 관련된다. 또 다른 양태에서, 폴리유전적 특성은 ADHD에 대한 감수성의 결핍이고, 대립형질은 DRD3, DRD4, HTR1Dβ, HTR2A, HTR2C, 인터페론-γ, CD8A 또는 PS1 유전자에 관련된다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 폴리유전적 특성은 OOD이고, 대립형질은 DRD1, DRD2, DRD3, DAT1, HTT, HTRIA, HTR2A, HTR2C, DBH, ADRA2A, ADRA2C, MAOA, GABRA3, GABRB3, CNRA, CHRNA4, NMDAR1, PENK, AR 또는 CD8A 유전자에 관련된다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 폴리유전적 특성은 안면 틱이고, 대립형질은 DRD1, DRD5, HTRIA, HTR1Dβ, HTR2C, TDO2, DBH, ADR2C, COMT, GABRA3, CNR1 또는 CHRNA4 유전자에 관련된다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 폴리유전적 특성은 LD이고, 대립형질은 DRD1, HTR2C, TDO2, DBH, ADR2A, ADR2C, MAOA, CNR1 또는 CNRA4 유전자에 관련된다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 폴리유전적 특성은 LDL이고, 대립형질은 HTT, OXYR, DRD2 또는 PS1 유전자에 관련된다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 폴리유전적 특성은 장수이고, 대립형질은 PS1, OXYR 또는 APOE 유전자에 관련된다.
본 발명은 또한 연구하고자 하는 특성을 확인하고, 연구하고자 하는 특성의 중증도를 측정하는 범주를 생성하고, 특성에 기여할 수 있는 하나 이상의 대상 유전자를 선택하고, 대상 유전자에 관련된 하나 이상의 다형성을 확인하고, 다형성의 대립형질적 형태를 범주와 상호관련시키고 대상 유전자의 상호관련에 대한 대립형질적 형태의 관계를 특성과 비교함으로써 치료학적 폴리유전학상 분석을 개발시키는 방법을 제공한다. 특성과 포지티브적으로 관련된 대립형질적 형태는 함께 가해져 폴리유전적 특성을 포함하는 피검자의 민감성에 대해 치료학적인 폴리유전적 분석을 형성한다. 특성과 네가티브적으로 관련된 대립형질적 형태가 가해져 폴리유전적 특성을 포함하는 피검자의 감수성 결핍에 대해 치료학적인 폴리유전적 분석을 형성하는 것 또한 본 발명의 일부이다.
본 발명의 한 가지 양태에서, 피검자 유전자는 DRD1, DRD2, DRD5, DAT1, HTT, HTR1A, TDO2, DBH, ADRA2A, ADRA2C, NET, MAOA, COMT, GABRA3, GABRB3, CNR1, CNRA4, NMDAR1, PENK, AR, CRF, DRD3, DRD4, HTR1Dβ, HTR2A, HTR2C, 인터페론-γ, CD8A 또는 PS1 유전자를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 한 가지 양태에서, 폴리유전적 특성은 ADHD, ADHD의 결핍, ODD, CD, LD, 안면 틱, 약물 남용/의존, 흡연, 관절염, 콜레스테롤 증가 수치, LDL 증가 수치 또는 장수를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 한 가지 양태에서, ADHD에 대한 폴리유전적 분석은 DRD1, DRD2, DRD5, DAT1, HTT, HTR1A, TDO2, DBH, ADRA2A, ADRA2C, NET, MAOA, COMT, GABRA3, GABRB3, CNR1, CNRA4, NMDAR1, PENK, AR 또는 CRF 유전자에 관련된 하나 이상의 대립형질의 검출이다.
본 발명의 또 다른 양태에서, ADHD에 대한 감소된 감수성에 대한 폴리유전적 분석은 DRD3, DRD4, HTR1Dβ, HTR2A, HTR2C, 인터페론-γ, CD8A 또는 PS1 유전자에 관련된 하나 이상의 대립형질의 검출을 포함한다.
본 발명의 한 가지 양태에서, OOD에 대한 폴리유전적 분석은 DRD1, DRD2, DRD3, DAT1, HTT, HTR1A, HTR2A, HTR2C, DBH, ADRA2A, ADRA2C, MAOA, GABRA3, GABRB3, CNR1, CHRNA4, NMDAR1, PENK, AR 또는 CD8A 유전자에 관련된 하나 이상의 대립형질의 검출을 포함한다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 안면 틱에 대한 폴리유전적 분석은 DRD1, DRD5, HTR1A, HTR1Dβ, HTR2C, TDO2, DBH, ADR2C, COMT, GABRA3, CNR1 또는 CHRNA4 유전자에 관련된 하나 이상의 대립형질의 검출을 포함한다.
본 발명의 한 가지 양태에서, LD에 대한 폴리유전적 분석은 DRD1, HTR2C, TDO2, DBH, ADR2A, ADR2C, MAOA, CNR1 또는 CNRA4 유전자에 관련된 하나 이상의 대립형질의 검출을 포함한다.
본 발명의 또 다른 양태에서, LDL 상승 수치에 대한 폴리유전적 분석은 HTT, OXYR, DRD2 또는 PS1 유전자에 관련된 하나 이상의 대립형질의 검출을 포함한다.
본 발명의 한 가지 양태에서, 장수에 대한 폴리유전적분석은 PS1, OXYR 또는 APOE 유전자에 관련된 하나 이상의 대립형질의 검출을 포함한다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 관절염에 대한 폴리유전적 분석은 또한 COL2A1, COL2A1, OL2A1, COL9A1, COL9A1, AGC1, IGF1, IGF1, IGF1R, IGF1R, IGF2, IGF2R, TGFB1, TGFB2, IL1A, IL1B, IL1R1, IL1RN, MMP9, TIMP1 또는 비타민 D3 유전자에 관련된 하나 이상의 대립형질의 검출을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 단어 "하나의" 또는 "그~"는 하나보다는 하나 이상을 의미할 수 있음을 이해할 수 있다.
도면의 간단한 설명
다음의 도면은 본원의 일부를 형성하고 본 발명의 특정 양상을 추가로 입증하기 위해 포함된다. 본 발명은 본원에 제시된 특정 양태의 상세한 설명과 병용하여 하나 이상의 이러한 도면을 참조하여 보다 충분히 이해될 수 있다.
도 1은 "초강력 대조 그룹(정상)" 및 열악한 "RDS" 출발물 중의 DRD2 유전자이다. 언급된 그룹 전반에 걸쳐 비교하기 위한 선형 경향 분석은 p＜0.000001이다. 컴퓨터는 다음의 그룹을 선택한다:
그룹 Ⅰ(C1): 알콜중독, 물질 사용 장애, 다중물질 의존, 화학적 의존의 가계 내력 및 25 초과의 비만 니코틴 의존(흡연) BMI, 탄수화물 열중, 자폐증, 토렛트, ADⅡD, 주축 Ⅱ, 병적 도박 및 외상후 스트레스 장애에 대해 조심스럽게 평가한다. 본 발명자들은 DSMIV 기준을 사용하여 물질 사용 장애를 평가한다.(N=11)
그룹 Ⅱ(C2): 주축 Ⅱ를 제외한 그룹 Ⅰ의 동일한 배제 기준을 포함시킨다.(N=6)
그룹 Ⅲ(C3): 물질 사용 장애 및 비만의 포지티브 가계 내력을 제외한 그룹 Ⅰ 및 Ⅲ의 동일한 배제 기준을 포함시킨다.(N=20)
그룹 Ⅳ(C4): 흡연 행동(니코틴 의존)을 제외한 그룹 Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ의 동일한 배제 기준을 포함시킨다.(N=21)
그룹 Ⅴ(C5): 벤조디아제핀 남용/의존을 제외한 그룹 Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ, Ⅳ의 동일한 배제 기준을 포함시킨다.(N=31)
그룹 Ⅵ(C6): 물질 사용 장애(즉, 알콜 및 코카인)를 제외한 그룹 Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ, Ⅳ, Ⅴ의 동일한 배제 기준을 포함시킨다.(N=74)
그룹 Ⅶ(C7): 25 초과의 BMI를 제외한 그룹 Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ, Ⅳ, Ⅴ, Ⅵ의 동일한 배제 기준을 포함시킨다.(N=140)
그룹 Ⅷ(C8): 코모비드 물질 사용 장애와 함께 25 초과의 BMI를 제외한 그룹 Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ, Ⅳ, Ⅴ, Ⅵ, Ⅶ의 동일한 배제 기준을 포함시킨다.(N=31)
그룹 Ⅸ(C9): 코모비드 다중물질 의존(즉, 알콜 및 코카인)과 함께 25 초과의 BMI를 제외한 그룹 Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ, Ⅳ, Ⅴ, Ⅵ, Ⅶ, Ⅷ의 동일한 배제 기준을 포함시킨다.(N=11)
또한, 본 발명자들은 또한 통계학상 비교에 대해 문헌[참조: Blum et al., 1990, Blum et al., 1991, Noble et al., 1993, Parsian et al., 1991, Comings et al., 1991, Smith et al., 1992, Amedeo et al., 1993]으로부터 미리 제노타이핑시킨 총 286명(N=286)의 건강한 백인 남자 및 여자(단지 알콜 및 약물 남용, 그리고 일부 경우에 니코틴 남용에 대해 차단시킴)(L1)를 18.5%의 빈도로 포함한다. 또한, 본 발명자들은 총 714명(N=714)의 피검자(L2)를 단지 알콜중독 또는 다중물질 의존에 대해서만 차단된 문헌[참조: Blum et al., 1990, Parsian et al., 1991, Comings et al., 1993, Noble et al., 1994, Amedeo et al., 1993, Comings et al., 1994, Nobel 1993, Schwab et al., 1991, Uhl et al., 1992, O'Hara et al., 1993, Uhl et al., 1992]으로부터 유도된 25.9의 D2A1 빈도로 포함한다. 또한 본 발명자들은 총 980명(N=980)의 피검자(L3)를 문헌[참조: Bolos et al., 1990, Grandy et al., 1989, Gelernter et al., Uhl 1992, Goldman et al., Finns 1994, Nothen et al., Noble et al., 1994, Jonsson et al., 1993, Hedebrand et al., 1993, O'Hara et al., 1993]으로부터 유도된 32.9의 D2A1 빈도(알려지지 않은 상태에 대한 대조 그룹)로 또한 포함한다.
도 2는 중량 감소에 대한 펜칼(Phencal)TM의 효과이다. 이 도면은 2년 후의 펜칼TM과 비-펜칼TM그룹 둘 다에 있어서의 비교 중량을 나타낸다. 2년간의 연구 종말부에, 펜칼TM처리한 피검자(n=130)은 펜칼TM처리를 하지 않은 대조 그룹 그룹(n=117)에 대한 52.8%와 비교시 평균 23.5%의 과잉중량이다(p＜0.0001).
도 3은 MAOA VNTR 다형성의 대립형질의 분포이다(총 대립형질 수=768).
도 4는 ADHD 스코어에 대한 증가수의 변이 부가물 유전자의 부가적인 효과이다. 이는 단지 4 또는 5개의 변이 유전자를 사용한 것에 대한 1.0에서, 15개의 변이 유전자를 사용한 것에 대한 25.0까지 점진적인 증가 경향을 나타낸다. ADHD 스코어에서의 점진적인 증가의 선형 카이 스퀘어 시험에 대한 p값은 10-8미만이다.
도 5는 ADHD 스코어에 대한 29개의 모든 유전자의 가감 효과, 및 단지 부가적인 유전자만의 부가적인 효과이다. 저부의 개방된 스퀘어는 관찰된 스코어의 횟수를 맞추는 랜덤 스코어 확인된 각각의 유전자에 대한 r2값을 나타낸다. r2값의 점진적으로 부가적인 효과는 텅빈 스퀘어로 보여지고 포지티브 상관계수만을 사용한 부가적인 효과는 x를 함유하는 스퀘어로 보여진다. 점이 "x"에 의해 표시되는 선은 보가적인 유전자이고, 점이 채워진 점에 의해 표시되는 선은 가감 유전자이다. 가감 유전자를 둘 다 사용하는 최종 r2는 0.0001이다. 부가적인 랜덤 유전자만을 사용하는 최종 r2는 0.0004이다. 어느 것도 명확하지 않다. 또한, 가환성 r2가 랜덤 PENK 유전자에서 0.008만큼 높음에도 불구하고, 이는 최후의 랜덤 부가적인 유전자(CD8A)가 가해지는 경우에 0.0004로 줄어든다.
도 6은 샘플 중의 쪼개진 반쪽(n=166)의 29개의 모든 유전자의 가감 효과이다. 일부 유전자는 셋트 둘 다에 있어서 가감적이고, 일부는 하나에 있어서는 부가적이고, 나머지 하나에 있어서는 감수적이다. 채워진 점은 그룹 1 데이타를 나타내고, 채워진 스퀘어는 그룹 2개의 Ⅱ 데이타를 나타낸다.
도 7은 DSM-IV ADHD 증후군이 없는 대상장 대한 변이 유전자 대 ADHD에 대한 DSM-IV 기준을 충족시키는 수의 분포이다.
도 8은 콜레스테롤 및 LDL 혈액 수치에 대한 HTT, OXYR, DRD2 및 PS1의 4개의 유전자의 부가적인 효과이다. 이는 154개의 피검자의 연구시 병용시 p=2.0×10-4로 명확한 결과를 제공하는, MAA 기술로 4개의 유전자를 확인함을 보여준다. 채워진 원은 콜레스테롤 데이타이고, 개방된 원은 저밀도 리포단백질 데이타이다.
예시적인 양태의 설명
RDS 및 기타 폴리유전적 특성의 진단을 위한 폴리유전자
본 발명자들은 각종 정신 질환이 특정 행동을 보상하는 방법에 흥미를 제공하는 뇌내 "경질-열광" 시스템인 통상적인 생물학적 기질과 관련된다고 믿고 있다. 본 발명자들은 본 발명에서 신경 즉위 또는 기타 변연계 보상 영역 중의 세포간 신호계를 변경시키는 선천적 화학적 불균형이 피검자의 평온한 감정을 불안, 분노 또는 부정적인 감정을 완화시킬 수 있는 물질(즉, 알콜)에 대한 갈망으로 대체시킬 수 있다고 제의한다. 이러한 화학적 불균형은 "보상 결핍 증후군"이라는 용어를 창출해낸 하나 이상의 행동 장애로서 그 자체를 나타낸다[참조: Blum et al., 1996a].
보상 결핍 증후군 또는 RDS에서, 보상 경로에서의 유전적 결함은 폴리유전적 장애로서 가장 잘 이해되고, 유전적 시험은 다중 유전자의 시험을 요구할 수 있다. 본 발명은 RDS에 대한 성향과 도파민성 유전자 DRD1, DRD2, DRD3, DRD4, DRD5, 도파민 전송 유전자(DAT1); 세로토닌 유전자 HTT, HTRA, HTRDb, HTRA, HTRC, 트립토판 2,3-하이드록살라제(TD02); 노르에피네프린 유전자, DβH, ADRAA, ADRAC, NT; 카테콜라민 신진대사작용 유전자, MAOA, COMT; GAGA 유전자, GABRAA, GABRAB; 카나비노이드 수용체 유전자, CNR; 니코틴성 콜린성, CHRNA; NMDA 수용체 유전자, NMDAR; 엔케팔린 유전자, PENK; 안드로겐 수용체 유전자, AR; 인터페론 감마 유전자, INFG; CDA; 프레세닐린-, PS-; CRF 유전자, CRF, 비만 유전자(OB), 렙틴 수용체 유전자; 세로토닌 HTR1A 수용체 유전자, 세로토닌 수용체(5HT2R) 유전자, 카파콜-0 메틸-트랜스페라제(COMT) 유전자, 신경 니트릭 옥사이드 합성효소 유전자(nNOS1a), 아포리포 단백질-D(APO-D) 및, 비커플링 단백질(UCP1 및 UCP2)를 포함하나 이에 한정되지 않는 각종 유전자의 대립형질간의 상관관계를 확인한다.
매우 복잡한 RDS 및 관련 행동의 특성 및 각종 환경적 요인의 중요성은 하나의 유전자 또는 환경적 요인이 사실상 결정자로서 100% 기여하다는 가능성을 부정한다. 일반적으로 "보상 캐스케이드 모델"이 손상되는 경우에 RDS 행동을 일으킨다고 여겨지는 동시에, 본 발명자들은 하나 이상의 유전자가 하나의 RDS 추가 특성 중의 총체적인 변형률에 관여할 수 있는 동시에 또 다른 관련 RDS 행동에 거의 또는 전혀 상관이 없을 수 있다는 점을 조심스럽게 지적한다.
개선된 제노타이핑 기술은 통상의 사람 질환의 병인론에 관련된 지도 유전자로의 유전적 접근을 사용하는 것을 상업적으로 가능하게 한다. 각종 질환 유전자는 랜덤 마커 로커스를 갖는 질환 특성 계통으로의 안착에 대해 시험하는 연결 분석 접근법을 통해 확인된다. 이중 대부분은 간단한 유전 형태를 갖는 단일유전자 멘델형 질환에 포함되는 유전자이다[참조: Weeks and Lathrop, 1995]. 본 발명에 이르러, 사람 유전학자들은 고혈압, 당뇨병, 심장 질환, 다중 경화증, 천식 및 RDS 행동, 예를 들어, 비만과 같은 다중요인성 질환의 유전학을 연구하기 시작하였다. 다중요인성 질환은 서로 상호작용하고 환경적 요인과 상호작용하여 질환에 대한 유전적 감수성의 변화도를 일으키는 다중 유전자에 의해 유발된다. 우성의 정도 및 유형, 또는 이러한 유전자간의 상호작용은 결합 분석 연구를 통한 유전자 검출 기회에 강하게 영향을 미친다. 심지어는 우성이 존재하지 않는 경우에도, 성공 기회는 유전자상 이종도가 유지되는 경우에 감소할 수 있는데, 이때 몇몇의 특정 위치는 독립적으로 특성을 일으킨다. RDS와 같은 복합 질환에 대해, 전형적인 LOD 스코어 분석은 매우 강력할 가능성이 희박한데, 이는 유전적 변이의 대부분에 대해 추정되는 단일 주요 질환 로커스의 존재(특정 유전 모델과 함께)가 추측되고 현재 RDS 및 이러한 관련 연구가 보다 더 힘있고 바람직하다는 것은 사실이 아니기 때문이다.
예를 들어, 알콜중독 그 자체 또는 RDS 행동, 예를 들어, TS 및 ADHD에 대한 유전자를 발견하고자 시도하는데 있어 종전 기술 중의 한 가지 중요한 갭은 본 발명자들을 포함한 작업자 중 대부분이 단일 유전자 접근법에 촛점을 맞추고 있고 이로써 단지 DRD2 대질형질과 함께 총체적인 변이에 대한 약간의 기여를 확인할 수 있다는 점이다. 게놈의 사실상 100%의 "배제"라는 접근법이 비생산적임에도 불구하고, 예를 들어, TS와 함께 대부분의 작업자는 또한 감소치 및 현재까지의 비관련성과 함께 자가상염색체 우성 유전의 모델을 사용하는 연결 분석을 포함한다. 본 발명자들은 RDS가 양친에 의해 부여받은 유전자를 지니는 폴리유전적 스펙트럼 질환이라는 점을 보여준다. 로드 스코어 연결 연구가 실제적으로 폴리유전형인 질환에서 시도되는 경우, 표현형의 정의에 실제적으로 관련되는 유전자를 사용해서도 네가티브 로드 스코어가 수득될 수 있는, 라벨링에서의 다소 많은 실수가 생긴다. 또한, 질환이 폴리유전학상 유전되는 경우, 연결 분석에 의한 특이적 유전자의 역할이 배제되었다는 논의는 DRD2 유전자의 경우에서와 같이 더 이상 타당성을 갖지 못 한다[참조: Devor et al., 1994; Gelernter et al., 1990].
본 발명에서, 일부 경우에 폴리유전자로서의 폴리유전자상 셋트의 단일 유전자를 참조할 수 있다. 지난 수십년간, 본 발명자들은 수십개의 유전자의 행동학상 및 신경학상 표현형의 범위에서의 잠재적 역할을 연구하였다. 상관계수의 산출을 기본으로 하여, 본 발명자들은 중요도와 상관없이 제시된 다형성에 의해 산출되는 QTV에 대한 변형률이 0.5 내지 2.5%에 달한다는 점을 밝혀냈다. 특성에 대한 제시된 대립형질의 낮은 정도의 효과로 인해, 관련 연구는 단지 폴리유전자의 효과를 확인하는 존립 가능한 방법뿐일 수 있다. 폴리유전자에 대해 산출된 포현형의 비가 감소함에 따라, 효과를 입증하는 어려움이 증가하게 되었고 연구해야 하는 대상의 수도 증가하게 되었다. 관련 연구에 대한 비판 중 하나는 대조 그룹이 상이한 종족 또는 민족 그룹으로부터 수집되는 경우, 이러한 그룹 중의 유전자 빈도에서의 존재 및 차이점이 그릇된 결과를 가져올 수 있다는 점이다. 이 점은 한 가지 대립형질의 빈도가 0.1 내지 0.2 범위에 속하고 연구하고자 하는 유전자가 변이의 20% 미만으로 추저오디는 경우의 악성 마커에 대해 단일유형 상대 위험 기술을 사용함으로써 이론적으로 제거될 수 있는 반면, 이러한 기술의 힘은 심각하게 제한된다. 최종적으로, 관련 접근법의 옹호론자들의 특히 DED2 연구에 대한 반대 의견 중 하나는 대조 그룹을 조심스럽게 차단하여 다수의 이미 관련된 RDS 행동(그 중, SUD, TS, ADHD, CD, SAB)을 배제시키는 것에 있어서의 실패일 뿐만 아니라, 시험하고자 하는 조건이 관련이 없다는 그릇된 추측을 가져올 수 있다는 점이다[참조: Blum et al., 1995; Blum et al., 1997].
그러나, 유용한 데이타 중 일부 메타-분석은 이러한 관련사항이 확고하다는 점을 입증한다[참조: Cloninger, 1991; Gorwood et al., 1994; Noble and Blum K, 1993; Pato et al., 1993; Cook and Gurling, 1994; Uhl et al., 1993; Blum et al., 1995; Blum et al., 1997]. 알콜중독(이는 또한 기타 RDS 행동을 포함한다)과 DRD2A1 대립형질과의 관련성 연구에서의 중요한 요인은 사용되는 비교 대조 그룹이다. 이미 사용된 대조 그룹의 조합된 분석은 알콜중독 및 기타 관련 요인에 대해 평가된 것들보다 평가되지 않은 대조 그룹에서 두드러지게 높은 A1 대립형질의 보급을 보여준다[참조: Uhl et al., 1993; Nobel et al., 1994a]. 이러한 결과는 "슈퍼-정상" 대조 그룹을 사용함으로써 A1 대립형질과 알콜중독과의 관련성을 밝혀낸 최근의 연구에서 돋보인다[참조: Neiswanger et al., 1995 and Hill and Nyswander, 1997]. 이 그룹은 이러한 평가를 받은 대조 그룹 그룹의 사용이 샘플링 에러 또는 집단화 계층화 보다 이미 관찰된 상이한 결과에 대한 아마 보다 더 중요한 설명이라고 단정내린다.
슈퍼-대조 그룹.
본 발명자들은 뉴저지주 프린스톤 소재의 신경정신학 및 의약 임상연구소에서 184개 프로밴드를 평가하였으며, 이때, 이들은 조심스럽게 대조 그룹에접근하여, 결과적으로 각각의 피검자는 다수의 RDS 행동(알콜 중독, SUD, 흡연, BMI 또는 비만, 병적인 도박, 탄수화물 폭식, 액시스 II(Axis II) 진단, SAB, ADD/ADHD, CD, TS, SUD의 가족 병력, 및 비만을 포함)에 대해 배제되며, 따라서 TaqID2A1에 대해 제노타이핑되며, 32.9%가 DRD2A1 대립형질을 갖는 선별되지 않은 백인 집단과는 달리, 포함 기준에 부합하는 30피검자 중 단지 하나의 피검자만이 S2A1 대립형질을 가지며 이는 3.3%인 것으로 확인된다(도 1 참조). 사실, 모든 그룹을 비교해 볼 때, A1+ 대립형질 우세에서 점진적인 퍼센트(%) 증가가 매우 잘 접근한 대조 그룹과 비교해서 공병적인(comorbid) 다물질 의존 그룹(엄격한)에서 현저하게 높아지는 것을 확인하였다(X2=78.8, df=1, p＜0.000001).
본원의 한 가지 중요한 양태는 진단하는 RDS 행동에 대한 그들의 개별적인 기여에 기초하여, 단독으로 또는 혼합하여 다수의 유전자 변이를 검출하는 방법에 관한 것이다. 본 발명자들은, 유전자들을 혼합하여 사용하고 상기 특정 다형성 또는 실질적인 돌연변이를 검출함으로써, 도파민 D2 수용체 유전자의 DNA 기초 검출로 제시되는 최초 유래된 피검자에서와 같이 단 하나의 유전자가 검출되는 경우 보다 더욱 정확성이 달성될 수 있는 방식으로 위험성이 있는 피검자를 확인할 수 있 수 있을 것으로 생각한다. 이러한 잠재성의 정도에 대한 보다 명확한 개요를 제공하기 위해서, 유전자들 중 일부가 보상 경로(reward pathway)에 관여하는 것으로 사료된다. 이것은 보상 경로에 관여하는 신경전달자, 보고된 다형성을 갖는 관련된 유전자 및 물질 남용 및 기타 충동적, 약물 중독성 행위에서 유전자 결함이 갖는 추정 효과를 예증하는 반면, 본 발명자들은 이들 및 가능한 많은 미확인된 기타 유전자들이 RDS의 완전한 이종형태학적 지도에 기여할 것이라고 생각한다. 이는 시간을 두고 생각하고, 기타 신경전달자에 영향을 미치는 유전자가 폴리유전자 세트에 부가될 것인지, 및 기타 정신 질환(특히 본 발명에 있어서 "보상" 및 스펙트럼 행동들)이 또한 폴리유전자이며 본 기술을 사용하여 해독할 수 있을지를 좀 더 연구하기 위한 기초로서 기여한다. 사실, 다수의 염색체 좌위 및 특정 마커 또는 유전자들이 가까운 미래에 발견될 것이라는 가능성이 있지만, 기타 폴리유전자 특성뿐만 아니라 보상 결함 증후군(Reward Deficiency Syndrom)을 포함하여 본 발명자들이 특성화한 충동적-강압적-약물 중독성 행동에 이미 연관된 다수의 유전자들을 검출하기 위한 멀티플렉스 제네스칸(MULTIPLEX GENESCANTM)을 개발하는 것이 목적이다. 부가적으로, RDS를 포함하는 폴리유전자 특성을 진단하는 방법(멀티플 애디티브 어쏘시에이션스(Multiple Additive Associations, MAA) 기술로 불림)이 본 발명자들에 의해 개발되었다.
멀티플 애디티브 어쏘시에이션스(MAA) 기술을 향한 단계들.특정 양태들은 RDS 관련 질환들에 대한 진단 검정법을 작제하기 위한 MAA 기술의 용도를 예증한다. 그러나, 본 발명자들은 정신 질환과 별개이며 MAA 기술이 모든 폴리유전자 질환 및 모든 폴리유전자 특성에 보편화될 수 있음을 예증하는 다수의 실시예를 제공한다. 따라서, 본 발명자들은 MAA 기술이 모든 폴리유전자 질환을 위한 방법임을 의미한다. 폴리유전자 질환은 각각의 유전자 개별적으로는 표현형의 단지 작은 퍼센트의 변형에 기여하는 유전자 다수의 부가 효과에 기인하는 것으로서 특성화된다. 이들은 모든 피검자에 다양한 정도로 존재한다. 폴리유전자 질환은 집단의 1 내지 20퍼센트에 영향을 미치며, 단일 유전자 질환보다 훨씬 더 일반적이다. 일부 예로는 고혈압, 비만, 대부분의 정신 질환, 다발성 경화증, 낭창성 홍반, 골다공증, 관상동맥질환, 류마티스성 관절염, 골관절염, 체중, 키, 혈압, 연령(수명), 정신학적 특성 및 하나 이상의 유전자 또는 대립형질에 의해 부분적으로 결정되는 모든 특성이 있다. 하기는 MAA 기술을 수행하는 방법을 교시한다.
본 MAA 기술은 하기 독특하게 부가된 특성을 갖는다. 첫째, 본 기술은 조사할 수 있는 유전자 수를 수천개까지 극적으로 확장시킨다. 이는 그 특성 자체를 대신하여 상관 계수(r) 및 변이 퍼센트(r2)를 사용함으로써 동일한 규모로 모든 정량적이거나 이분류적인 특성을 사용한다. 이는 개개의 유전자들이 부가될 때 부가(r 및 r2의 증가)되거나 감소(r 및 r2의 감소)될 수 있다는 개념을 도입한다. 이는 이러한 증가 또는 감소를 사용하여 질병 또는 특성에서 역할을 수행하는 유전자(이들은 부가적이기 때문이다)를 질병 또는 특성에서 역할을 수행하지 않는 유전자(이들은 감소적이기 때문이다)로부터 식별할 수 있다. 확인된 부가 유전자에 의해 설명되는, 전체 변이 퍼센트 즉, r2를 평가하는 것은 부가적인 유전자를 사용한 재-분석을 위해 제공된다. 한번에 하나의 유전자를 시험하기 보다는 다수의 유전자의 부가 효과를 시험함으로써, MAA 기술은 로드 스코어(lod score), 시브 페어(sib pair), 반수체 상관 위험[Falk and Rubinstein,1987], 및 전송 불균형 시험(transmission disequilibrium test)[Spielman and Ewens, 1996]같은 방법에 비해 폴리유전자 질환에 관련된 유전자를 확인하는 보다 더 강력한 힘을 갖는다. MAA 기술은, 한번에 하나의 유전자를 시험하는 연관성 연구에서 p 값은 어떤 유전자가 폴리유전자 질환 또는 특성에 관련되는지에 대해 거의 아무런 관련성이 없음을 나타낸다. MAA 기술은 하기 단계들을 가지며, 일부 단계들은 본 기술에 유일한 것으로서 기술될 수 있다.
단계 1.제1 단계는 연구하고자 하는 폴리유전자 질환 또는 특성, 즉 주의 결핍 기능항진 질환(ADHD), 우울증, 콜레스테롤 수치, 체중, 비만, 수명, 혈압, 다발성 경화증, 또는 폴리유전자성이거나 폴리유전자성으로 의심되는 기타 모든 질환을 확인하는 것이다. 구체적으로 언급되지 않는 한, DIS(진단성 인터뷰 스케줄, Diagnostic Interview Schedule)[Robins et al., 1981] 또는 SCID[Williams et al., 1992] 같은 체계화된 진단 인터뷰를 사용하여 DSM 기준을 공지된 정신병 특성을 갖거나 폴리유전자성으로 의심되는 피검자에 대해 정신병 진단을 하는데 적용한다. 본 발명자들은, 보다 구 버젼을 또한 사용할 수 있지만, 출판중인 가장 최근의 DSM 버젼을 사용하여 상기 진단을 수행할 수 있음을 의미한다.
단계 2.제2단계는 폴리유전자 질환의 심각도를 측정하는 기준을 설정하는 것이다. 이는 정량적 특성 또는 이분류적 변수(QT 또는 DV)일 수 있다. 예를 들어, 혈압이 연구되는 경우, 정량적 기준은 심장 이완 혈압일 수 있고, 키가 연구되는 경우, 인치 또는 센티미터 단위의 키가 사용될 수 있고, 비만이 연구되는 경우, 기준은 체중 또는 BMI일 수 있고, 우울증이 연구되는 경우, 기준은 우울증 등을 위한 포지티브 DSM-IV의 수일 수 있다. 이분류적 특성이 또한 사용될 수 있다. 예를 들어, 200개 대조 그룹 및 다발성 경화증에 걸린 200개 피험체를 연구하는 경우, 대조 그룹은 0점으로서 득점될 수 있으며 다발성 경화증에 걸림 피험체는 1점으로 득점될 수 있다. 특성, 표현형 또는 QTV에 대한 득점은 상기 특성의 수량을 나타낸다. 예를 들어, 피검자의 체중이 200lb이면 그의 체중 득점은 200일 것이다. 피검자가 250의 콜레스테롤 수치를 가지면, 그의 콜레스테롤 득점은 250일 수 있다 등이다. 유전자에 대한 득점은 유전자형이 최소, 중간 또는 최대 표현형 효과과 연관되는가에 따라서 유전자형에 대해 0, 1, 또는 2의 '득점'이 할당된다.
단계 3.제3 단계는 시험하고자 하는 후보 유전자를 확인하는 것이다. 예로서, 본원은, ADHD, 반항 질환(oppositional defiant disorder), 행동 질환, 학습 질환, 알콜에 대해 선택된 29개 후보 유전자들이 도파민, 세로토닌, 노르에피네프린, GABA, 및 기타를 포함하는 신경전달자의 조절에서 역할을 수행하는 유전자임을 보여준다. 당해 분야의 통상적인 숙련자는 모든 유전자가 폴리유전자 특성에 잠정적으로 기여할 수 있음을 인식할 것이다. MAA 기술에 사용되는 후보 유전자 또는 유전자 세트의 선택은 조사하고자 하는 특성에 일부 대사적으로 또는 생리학적으로 관련성을 갖는 유전자를 선택함으로써 촉진될 것이다. 대중 도서관, 또는 생명공학 정보를 위한 국립 센터(National Center for Biotechnology Information, NCBI)로부터 입수 가능한 겐뱅크(Genbank)와 같은 컴퓨터화된 데이터베이스에서 유용한 과학 문헌에 기술되거나 포함된 모든 유전자 또는 유전자 대립형질이 MAA 기술에서 사용하여 특정 특성에 대한 진단적 또는 예후적 검정법을 만들기 위한 후보 유전자로서 포함된다. 당해 분야의 통상적인 숙련자는 대부분의 폴리유전자 특성에 대한 후보 유전자를 확인하기 위해 사용될 수 있는 개인적인 지식, 또는 출판되거나 대중적으로 유용하지 않은 지식을 포함하는 기타 유전자 정보 공급원이 있으며, 상기 공급원은 MAA 방법의 수행에 사용될 수 있음을 인식할 것이다.
키, 또는 골다공증 막수성 같은 폴리유전자 특성에 관련되는 후보 유전자의 예는 골 및/또는 결합 조직 정보, 성장, 및/또는 조절에 관계하는 유전자이다. ㄹ평가할 수 있는 또 다른 특성은 비만이며, 후보 유전자는 이들 유전자를 포함하며, OB 유전자, OB 수용체 유전자, 뉴로펩타이드 Y 유전자 및 뉴로펩타이드 Y 수용체 유전자가 후보 유전자일 수 있다. 혈압 같은 특성에 있어서, 합리적인 후보 유전자는 노르에피네프린, 에피네프린, 스테로이드 및 레닌 대사에 관계하는 유전자들이다.
본 발명의 실시예에서, 폴리유전자 특성에 기여하는 것으로 의심되는 다양한 유전자들이 선택된다. 물론 관심은 RDS 행동에 기여하는 것으로 의심되는 유전자들이다. 유전자 선택을 위한 기준은 하나 이상의 RDS 행동 또는 관심있는 기타 폴리유전자 특성에서, 문헌으로부터의, 이의 관련성에 대한 지표 및/또는 하기 기술되는 본 발명자들에 의한 실험적 데이터를 포함한다. 본 발명자들은 주어진 특성과 유전자 또는 다형성과의 관련성이 상기 특성에 대한 진단적 검정법에서 사용될 수 있으며, 또한 관심있는 폴리유전자 특성에 대한 MAA 진단적 검정법에 포함되는 유전자 및/또는 이의 특정 다형성에 대한 교시를 제공함을 의미한다. 특성은 유전자 또는 다형성에 있어서 RDS과 연관성이 있어야만 하는 것은 아니다.
DRD1 유전자.본 연구자들에 의한 예비 연구에서 본 특정 유전자는 대조 그룹과 비교하여 심각한 알콜성 프로밴드와 관련이 없으며, 따라서, 보다 더 큰 샘플을 사용한 이러한 부가적인 발견은 놀라운 것이다. 상기 연구는 DRD1 및 DRD2 도파민 수용체 유전자 모두에 대한 시험이 유전자 단독에 비해 행동 범위에 있어서 보다 큰 변이율을 설명하는 것으로 나타난다[참조: Comings et al., 1997]. D1 수용체 유전자 다형성은 심각한 알콜 중독보다는 오히려 다물질 중독자와 보다 더 관련이 있을 수 있다.
도파민성 유전자, 폭력 및 정신분열성/회피성 행동.기타 발견들은 "병적 폭력" 및 정신분열성/회피성 행동(SAB) 같은 복합 인격 질환에서 폴리유전자 유전 개념을 뒷받침한다. 본 발명자들은 젊은이의 프로밴드에서 DRD2 A1 대립형질 및 "병적 폭력"사이의 강한 연관성을 발견하였으며 또한 도파민 수송인자 유전자(DAT1)의 10개 대립형질에 대해 유사한 연관성을 발견하였다. 하지만, 강한 연관성은 SAB를 갖는 DRD2A1 대립형질에서도 발견되지만, DβH 유전자에 대해서는 어떠한 연관성도 발견되지 않지만, SAB를 갖는 DAT1 유전자에 있어서는 보다 약한 연관성이 발견된다[참조: Blum et al., 1997].
　DβH 대립형질 시험은 사람 행동 질환에서 DβH의 잠정적인 역할을 시험하는 가장 정확한 접근 방법일 수 있다. 이는 SAB를 갖는 DRD2TaqIA1 대립형질 및 PV사이의 강력한 연관성을 뒷받침하는 첫 번째 연구이다. 이러한 복합 특성들은 유전의 단순한 멘델 형식을 나타내지 않기 때문에, 누구도 단일한 유전자에 의해 야기되는 단순한 유전적 답변을 기대할 수 없다. 도파민 유전자의 병적 폭력과의 관계는 추가로 특정 실시예 17에서 기술된다.
도파민 D2 수용체 유전자.다형성 마커와 결합 불균형을 유지하는 유전자의 3' 및 5' 비암호화 영역에 위치하는 잠정적인 돌연변이는, 하기에 기초하여 DRD2 전자 및/또는 mRNA 안정성에 영향을 미칠 수 있으며 DRD2 수용체 수에 영향을 미칠 수 있다; 외부 점 돌연변이 보다 플랭킹 영역에 위치한 마커를 사용하여 확인된 강력한 연관성; "A1-표지된" DRD2 대립형질의 엑손(엑손 8 제외)에서 돌연변이의 보고된 결핍; 및 Kd 변화의 부재하에서 A1 마커의 존재와 함께 보고된 감소된 DRD2 Bmax[참조: Noble et al., 1991]. 이는 하나의 다형성, 즉 TaqID2와 연관성 부족을 설명하는 것을 도울 수 있다. TaqI D2와의 연관성 부족은, TaqI A 및 TaqI B는 서로 강력한 결합 불균형속에 존재하며, A1 3' 플랭킹 마커는 TaqI D와 보다 덜 불균형을 보이며, 따라서, TaqI D의 정신자극제 선택과의 약한 연관성이 기대될 수 있음을 입증하는 집단 유전자 분석과 일치한다[참조: Suarez et al., 1994].
추가로, 문제를 복잡하게 하는 것은, 일부 연구에서 실패에 대한 설명이 Comings(공동-연구자)가 분자적 잡종 강세(molecular geterosis)라고 인용한 것에 기인할 수 있다는 것이다. 이는 유전자 다형성에 있어서 이형 접합성인 피험체가 대립형질에 대해 동형 접합성인 피험체에 비해 변이할 수 있는 정량적인 특성에 있어서 보다 현저하게 더 높은(포지티브 잡종 강세) 또는 보다 더 낮은(네가티브 잡종 강세) 평균을 나타내지 경우 발생한다.
양전자 방출 단층 X선 사진촬영법(PET) 연구는 중독성을 없앤 알콜 및 코카인 중독자의 뇌 영역에서 감소된 글루코오스 대사를 나타낸다. 본 발명의 연구에서,18F-데옥시글루코오스를 사용하여, A1+또는 A1-대립형질을 갖는 알콜/약물-비중독된 건강한 피검자에서 결정한다. 평균적인 상태적 글루코오스 대사율(GMR)은 피각, 측중격핵, 전두 및 관자놀 회전부 및 중앙 전액골, 후두-관자놀 및 안와 피질을 포함하는 많은 뇌 영역에서 A1-보다는 A1+에서 현저ㅎ게 더 낮아진다. 그러나, 일부 뇌 영역은 A1+그룹에서 상대적으로 증가된 GMR을 나타낸다.
스트레스 질환의 병인에서 도파민 대사에서의 결함에 대한 역할을 제시하는 몇가지 증거가 있다. 뇌에서 A1 대립형질 캐리어의 도파민 D2 수용체의 극소수만이 복귀에 관련된 뇌의 일부에서 도파민 활성을 보다 낮은 수준으로 바꿀 수 있다. A1 캐리어는 A2 캐리어가 만족할만한 자극에 의해서도 충분히 복귀될 수 없다. 이는 A1 캐리어의 지속적인 욕구 또는 자극-추구성 행동으로 나타날 수 있다. 도파민은 스트레스 또는 욕구를 감소시키는 것으로 공지되어 있기 때문에, A1 캐리어는 일시적인 경감을 얻기 위한 시도로 부가적인 양의 도파민을 방출하게 하는 기타 물질 또는 활성으로 변할 수 있다. 알콜, 코카인, 카나비스, 니코틴 및 탄수화물(예: 초콜렛) 모두는 뇌에서 도파민 방출을 야기하며 욕구의 일시적인 경감을 가져올 수 있다. 이러한 물질들은 단독으로, 혼합하여 또는 상호변환 가능한 정도로 사용될 수 있다. 마찬가지로, DRD2 유전자는 본 발명자들[참조: Comings et al., 1996b] 및 기타 연구자들[참조: Noble et al., 1994; Lerman et al., 1997]의 연구에서 흡연과 관련이 있는 것으로 입증되었다.
도파민-β-하이드록실라제.DβH가 교감신경계 말단에 위치하고 있고 노르에피네프린을 방출하는 동한 순환계내로 방출되기 때문에, 이의 조절에 관여하는 유전자들은 DβH 유전자 그 자신이기 보다는 기타 유전자 좌위에 존재할 수 있다. 따라서, DβH 좌위에 있는 유전자 마커 및 ADHD, CD, 알콜 중독 뿐만 아니라 기타 RDS 관련된 행동사이의 연관성 연구는 부정적일 수 있다. 한편, DβH의 혈중 수치는 환경 인자들의 범위에 의해 공-발견되는 경우, DβH의 유전자 마커를 사용한 연관성 연구는 혈액 수치보다 이러한 질병에서 DβH 유전자의 역할에 대한 보다 정확한 평가를 제공할 것이다.
이러한 발견 및 함께 수득된 기타 발견들은 DβH 유전자의 다형성은 특정 RDS 행동에서만 역할을 수행할 수도 있으며, DβH의 혈액 수치 또는 이의 생성물의 활성과 관련된 과거의 문헌들로부터 유전자 결과를 예견하는 것은 어려울 것이라는 것을 나타낸다.
약물 남용에서 도파민-베타-하이드록실라제 유전자 및 기타 특성들.DβH 활성의 억제는 활동항진, 공격성, 자체 자극 및 상동증 이동과 관련된 도파민의 과도한 생성을 초래한다[참조: Randrup and Scheel-Kruger, 1996]. 이는 사람에서 공격성, ADHD, 및 행동 질환(CD)에서 DβH의 가능한 역할을 제시한다. 낮은 혈중 DβH 수치를 가는 감정적으로 파괴된 소년들에서 CD에 대한 증가된 빈도의 진단이 보고되었다[참조: O'Connell et al., 1992; Rogeness et al., 1984; Rogeness et al., 1986; Rogeness et al., 1988; Rogeness et al., 1987]. 일부 연구는 낮은 DβH 수치와 입셍크 퍼서날리티 퀘스쳐나이레(Eysnenck Personality Questionnaire)에서 외전 득점(extroversion score)[참조: Roy and Brockington, 1987] 및 감흥 추구[참조: Ballenger et al., 1983; Umberkoman-Wita et al., 1981]와 같은 특정 인격 특성사이의 상호관련성을 나타내는 반면, 다른 연구는 혈장 DβH 및 감흥 추구 득점사이에 긍정적인 연관성이 있음을 나타낸다[참조: Folstein and Rutter, 1977].
본 발명의 또 다른 양태는 도파민-베타 하이드록실라제 유전자와의 연관성 연구와 관련되며 DβH 디뉴클레오타이드 반복 다형성 및 약물 남용 형태사이에서 제1 연관성을 보여준다[참조: Comings et al., 1996a].
DβH에 있어서 디뉴클레오타이드 반복 다형성은 약 175bp 이하 또는 이상에서 이중 모델 대립형질 분포를 갖는 것으로 확인된다. 피검자들은 낮은(≤174bp) 또는 높은(≤176bp) 동형 접합성, 또는 이형 접합성으로서 유전자형이 분류된다. 일반적으로, 높은 bp의 동형 접합성을 갖는 피검자는 보다 많은 횟수의 이전 약물 처리, 보다 긴 코카인 사용 병력, 보다 빈번한 암페타민의 IV 주사, 보다 빈번한 IV 약물 사용을 갖는 ASI상에서 확인된다. 이러한 피검자들은 보다 빈번한 부계 알콜 중독 및 어린시절 성추행의 경력이 있는 것으로 보고된다. 높은 bp를 갖는 피검자에 있어서, 유전자형은 자기-수용(self-acceptance), 개발된 제2 천성(enlighted second nature), 및 자가-지배(self-directiveness)에서 낮은 득점과 관련된다.
DRD2 A1 대립형질과 마찬가지로, DβH B1 대립형질은 대부분 다양한 ADHD, 강박성-충동성, 조병(manic), 반항성 결함, 및 수면과 관련된다. 차이점은 DRD2 A1 대립형질과 정신분열, 성욕, 행동 및 중얼거림과 보다 더 많은 관련성을 갖는 반면, DβH B1 대립형질은 보다 더 강력하게 학습, 읽기 및 교육 문제와 관련된다는 것이다. DβH 연구에서 일기, 학습 및 학년 진급 같은 학교 수행과 관련된 변수에서 높게 등급이 오르는 경향은 바닥에서 등급이 매겨지는 경향이 있는 DRD2 연구에 대조적으로 특히 인상적이다. 이는 기억에서 DβH의 역할과 관련될 수 있다.
투렛증후군(Tourette's syndrom, TS)은 RDS의 가장 복잡한 인식할 수 있는 형태 중 하나일 수 있다. DβH 활성의 억제와 관련된 행동 모두는 투렛증후군 피검자에서 일반적이기 때문에[참조: Comings and Comings, 1984; Comings and Comings, 1987b; knell and Comings, 1993; Comings, 1990], DβH Taq B 다형성[참조: d'Amato et al., 1989] 및 TS, 행동 질환, 주위 결핍 활동항진 질환(ADHD), 자폐성 또는 관련된 행동 사이의 연관성이 존재할 수 있다.
병적 비만에서 DAT1 유전자의 배제.DRD2 A1 대립형질의 존재는 비만에 대해서 뿐만 아니라 기타 관련된 중독성 행동에 대해서도 증가된 위험을 나타내며, 25 이상의 BMI 그 자체(거대선택(macroselection)[탄수화물 폭식] 또는 공병적인 SUD의 특성 없이)는 DRD2 A1 대립형질과의 연관성에서 충분한 기준이 되지 못한다는 것을 나타낸다[참조: Blum et al., 1996].
DRD2 A1 및 DAT1 유전자 모두를 평가하는 병적 비만의 영역에서의 연구는 남성에서 28% 이상의 체지방 뿐만 아니라 여성에서 34% 이상의 체지방에서 단지 DRD2 A1 대립형질(p＜0.0001)의 연관성을 나타내지만 DAT1 유전자에서는 연관성이 나타나지 않는다. 최고의 체중은 DRD2 A1/A1-DAT1-10/10 반수체를 갖는 피검자에서 나타나며, 이는 병적 비만에서 두 유전자가 기여하며, 훨씬 더 많은 기여는 D2 수용체 유전자임을 제시한다.
카나비노이드 수용체 유전자.정맥 약물(IV) 약제 사용의 가능성은 유전적 및 환경적 인자 모두에 의해 영향을 받을 수 있다. 이러한 유전자-배양 병인 인자를 개발하기 위해서, 77명의 비-히스패닉계 백인 약물 남용자 및 70명의 인종적으로 부합되는 대조 그룹을 시험한다. 피검자들에게 중독 심각도 지수(Addiction Severity Index)를 부여하고; 모든 프로밴드는 가족 환경 척도 및 어린시절-경험 설문 조사를 실시하며, 도파민성, 카나비노이드성 및 GABA성 유전자에 대해 유전자형을 분류한다. 본 발명자들은 단지 높은 분자량의 CB1(카나비노이드)의 대립형질 수용체 유전자 및 낮은 분자량의 GABRB3 유전자의 대립형질을 포함하는 피검자들 사이에서 보다 높은 우세의 IV 약제 사용을 확인하였다. CB1 유전자는 9개 대립형질 이상의 3개 뉴클레오타이드 반복체이며, 본 발명자들은 표현형에서의 이의 효과는 대립형질의 상대적 중량으로부터 비례적으로 예견하 수 없으며, IV 약제 사용과 이의 상호관계에서 오히려 보다 더 복잡하다는 증거를 확인하였다. 가족 환경 척도를 포함하는 몇몇 환경적 변수가 유전자 변수와 관련된 변화를 제거한 후 IV 약물 사용에 대한 병적 소인에 대한 경향과 관련이 있으며, 이러한 환경적 변수 그들 자체도 여전히 미확인된 유전자들의 영향하에 있을 것이다.
전기생리학적 이상 및 물질 사용 질환(SUD): 도파민 D2 수용체 및 카나비노이드 수용체 유전자에 대한 상관관계."수퍼 대조 그룹" 및 다수의 문헌 대조 그룹에 비해서 심각한 물질 사용 질환(SUD) 및 DRD2 A1 대립형질사이의 현저한 연관성이 관찰된다[참조: Blum et al., 1997; Hill et al., 1997]. 유발된 관련된 전위(ERP)의 P300 파장의 감소된 진폭과 잠복기는 오랫동안 알콜 및 약물 의존성과 연관되어져 왔다[참조: Braverman, R. et al., 1990]. 현저한 P300 잠복기의 연장은 3개의 위험인자들 (1) 부계 SUD; (2) 화학약품 의존성(즉, 코카인 의존성); 및 (3) 탄수화물 폭식과 상호관련이 있다. 감소된 P300 진폭은 알콜 중독 및 SUD의 가족 병력과 상호 관련이 있지만, DRD2 A1 대립형질과 상호 관련성은 없다.
본원에서, 본 발명자들은 감소된 전두엽 P300 진폭 및 카나비노이드 수용체 유전자(CB1)의 ≥5 반복 대립형질에 대한 동형 접합성 사이의 현저한 연관성에 대한 증거를 제시한다. 동일한 유전자형이 알콜 또는 약물 의존성과 연관되어 있는지를 결정하기 위해서, ATU로부터의 98명의 피검자 및 69명의 대조 그룹에 대해 CB1 반복 대립형질에 대하여 유전자형을 분류한다. 모든 피검자들이 비-히스패닉계 백인들이다. ATU 피검자들은 중독 심각도 지수, 진단 인터뷰 스케줄, 및 MAST-R을 사용하여 평가된다. 약물 및 알콜 남용/의존성은 단지 MAST-R을 사용하여 대조 그룹으로부터 배제된다. 결과는 5 반복 대립형질에 대한 동형 접합성과 다수의 상이한 유형의 약물 의존성(코카인, 암페타민, 카나비스)의 현저한 연관성, 다년간의 환각제, 흡입제, 헤로인, 아편제, 암페타민, 코카인, 및 바르비투레이트 사용과의 현저한 연관성, IV 약물 사용 및 약물 과용과의 현저한 연관성, 및 약물 남용(약물 혐의, 약물 자각, 운전 폭력, 및 무기, 폭행, 및 예술 문화적 파괴 혐의)와 관련된 법적 문제와의 현저한 연관성을 나타낸다. 반대로, 알콜 의존성과 관련된 변수와의 현저한 연관성은 나타내지 않는다. 이는 특히 완전한 RDS 표현형에 있어서는 근접된 대조 그룹 및/또는 심각한 알콜 중독의 평가에 기인할 수 있다. 그러나, 이러한 결과는 카나비노이드 수용체가 복귀 경로에서 역할을 수행하며 도파민 대사를 조절한다는 것을 나타내는 연구와 일치한다.
본 발명은 뇌 전기적 활성 맵핑(BEAM) 이상, 및 DRD2 유전자형과의 연관성 사이에 현저한 관련성을 확인한다. 본 발명자들은 이는 RDS 행동에 대한 유전적으로 유도된 경향을 진단하기위한 중요한 확인 시험으로써 상업적 가치가 있는 것으로 생각한다. 상기 방법은 상기 사람 도파민 수용체 유전자 A1 대립형질 및 카바비노이드 수용체 유전자(CNR1)을 검출하여 표준 뇌 지도(즉, NicolettTM)를 달성하는 것과 관련된다.
추가로, 가중된 선형 경향은 DRD2A2 유전자형과 공병적인 SUD(p＜0.0001)에 비교하여 DRD2A1의 존재하에 사건-관련된 잠재력의 현저하게 악화하는 효과를 밝혀준다. 던컨의 레인지 시험은 DRD2A1 대립형질을 갖는 또는 갖지 않는 SUD가 DRD2A2 대조 그룹과 비교하여 EP'S를 현저하게 악화시킨다는 것을 나타낸다. 이러한 결과는 뇌 기능 및 잠재적인 중독 경향과 관련되는 비-행동적 병리생리학적 표현형에서 DRD2A1 대립형질에 대한 역할을 제시한다.
세로토닌 유전자들.세로토닌 대사 결함, 및 혈중 세로토닌 및 트립토판 수치 모두에서의 이상은 많은 정신 질환에서 보고되어져 왔다. 트립토판 2,3-디옥시게나제(TD02)는 트립토판의 N-포르밀 케뉴레닌으로의 분해에서 율속 효소이다. 본 발명자들은 세로토닌 HTR1A 유전자에서 유전자 변이가 TS의 표현형 발현 또는 이와연관된 공병적인 행동 중 하나와 연관성이 있는지를 결정하고자 하였다. 보다 낮은 공통점(보다 짧은 및 보다 긴 대립형질들)과 ADHD, CD, 및 반항 질환(ODD), 틱, 성욕 및 기타 행동에 대한 득점 사이에 현저한 연관성이 있다. 이러한 득점에 대한 기여도는 작은 편으로, 변이의 단지 2 내지 4% 정로를 설명할 뿐이다. HTR1A 및 DRD2 유전자의 효과는 부가적이며 함께 ADHD, CD 및 ODD 득점의 변이의 5.1 내지 5.4%를 설명한다. 이러한 결과는 이들이, 환경적 인자들 뿐만 아니라 세로토니 및 도파민 대사에 영향을 미치는 변이 유전자들의 기회 수렴현상에 부분적으로 기인하는, 폴리유전자 질환이라는 제안과 일치한다. 반복 서열 그 자체가 폴리유전자 유전에서 중요한 기능적 대립형질형성 변이를 생성하는데 역할을 할 수도 있다.
5HT-2 수용체 유전자에서 T/C 다형성은 또한 액시스 II 인격 질환 구조 인터뷰 및 중독 심각도 지수(ASI) 및 부스-더키 적개심 척도(BHDS)를 사용하여 가능한 연관성을 시험한다. 피검자 샘플에서, 22개 유전자형이 변방 인격 질환(p＜0.05) 및 우울증(p＜0.05)의 진단과 연관성이 있었다. ASI에서, 상기 마커는 약물에 소비된 금전적 양(p＜0.05), 및 성추행 경력(p＜0.005) 및 도둑질/파괴행위(p＜0.05)와 연관성이 있다. BHDS에서, 남성 대조 그룹중에서, 22개 유전자형이 폭행(p＜0.01) 및 간접적인 적개심(p＜0.05) 서브 척도에서 증가된 득점과 연관성이 있다. 여성 대조 그룹 중에서, 5HT-2R 유전자는 전체 적개심 득점(p＜0.01) 뿐만 아니라 간접적인 적개심(p＜0.05), 거절증(p＜0.05), 언어적 적개심(p＜0.005), 및 죄책감(p＜0.05)과 연관성이 있지만, 상기 연관성의 양극성은 가역적이다(예를 들어, 11개 유전자형은 모든 득점에서 보다 높은 값과 연관된다). 유전자형 연관성의 성-반전은, 이것이 성 스테로이드와 상호작용할 수도 있는 복합 유전자임을 제시한다.
에스트로겐 수용체, 아로마타제 좌위, 및 아르기닌 바소프레신 유전자 및 행동 질환.에스트로겐 수용체 넉아웃 마우스는 공격적인 행동을 보이기 때문에[참조: Ogawa et al., 1996], 상기 유전자에서 디뉴클레오타이드 반복체 연구[차조: del Senno et al., 1992]가 또한 행동 질환과 관련성이 있을 수 있다. 두개의 기타 관련 유전자들이 아로마타제(CYP19) 좌위[참조: Polymeropoulos et al., 1991] 및 아르기닌 바소프레신(AVP) 유전자[참조: Summer, 1992]에 있을 것이다.
니코틴 수용체 유전자들.전액골 피질에서 니코틴 수용체는 지연된 반응에 관여하는 반면, 뮤스카린 수용체는 일반적인 활동 기억에 보다 더 관여한다[참조: Granon et al., 1995]. 많은 연구들은 니코틴 및 도파민사이의 긴밀한 상호작용을 나타낸다. 기타 중독성 약물과 마찬가지로 니코틴은 중번연계 및 측중격핵 뉴론에서 도파민의 방출[참조: DiChiara and Imperato, 1988; Corrigall et al., 1994; Ponitiefi et al., 1996] 및 격렬한 자가 투여[참조: Corrigall and Coen, 1989; Corrigall and Coen, 1991]를 증가시킨다. 그러나, 반복적인 투여로 인해 내성이 급격하게 나타난다[참조: Lapin et al., 1989]. 니코틴이 대부분의 도파민 흡수 억제제와 달리 도파민 흡수를 억제하는 반면, 이는 단지 50% 정도 억제한다[참조: Irenwasser et al., 1991]. 도파민 흡수 억제제 및 니코틴 수용체 효능제 및 길항제에 대한 연구들은 도파민 흡수에 대한 상기 효과는 니코틴 아세틸콜린 수용체에 의해 매개됨을 제시한다[참조: Irenwasser et al., 1991].
뉴론성 산화질소 신타제(NOS) 유전자.산화질소 신타제 유전자는 최근에 마우스에서 공격적인 행동에서 연관되어져 왔다. ob/ob 마우스에 대한 연구는 비-ob/ob인 한배의 마우스와 비교할 때 산화질소 신타제(NOS)의 증가된 수치를 나타낸다. NOS 넉아웃 마우스에 대한 연구는 공격적 및 성적 행동에서 산화질소의 중요한 역할을 강조해 준다. ob/ob 마우스는 또한 측실핵 및 시상하부 측부에서 노르에피네프린의 현저하게 증가된 수치를 나타내며 활-누두(aracuate-infundibulum)에서 도파민의 현저하게 감소된 수치를 나타낸다[참조: Oltman, 1983].
뉴론성 산화질소 신타제(nNOS1a) 유전자의 디뉴클레오타이드 반복 다형성의 관련성이 조사된다. 적개심, 진단 특성 및 인격 특성을 67명의 비-히스패닉계 백인 물질 남용자 및 68명의 나이든 인종적으로 부합되는 대조 그룹에서 측정하여 평가한다. 피검자 샘플을 액시스 II 인격 질환 조직화된 인터뷰, 중독 심각도 지수(ASI), 및 클로니거 기질 및 특성 목록(TCI)를 사용하여 평가한다. 피검자 및 대조 그룹의 대립형질 분포는 근소하게 상이하며(p＜0.056), 피검자들은 고분자량 대립형질에 대해서 동형 접합성을 갖는다. 액시스-II 인터뷰에서, 고분자량 대립형질(≥201)에 대해 동형 접합성인 피검자들은 정신병적(p＜0.05) 및 변방(p＜0.05) 인격 질환에 대해 보다 빈번하게 진단적 기준에 부합된다. ASI에서 이러한 유전자형은 다음에서 증가된 득점과 연관된다: 지난 30일 동안 표현된 폭력적 행동(p＜0.005), 위조 경력(p＜0.05), 강도 경력(p＜0.005), 지난 30일동안 알콜 사용(p＜0.005), 흡입제 사용의 년수((p＜0.0075), 약물 해독 수(p＜0.05), 및 지난 한달 동안 알콜(p＜0.005) 및 약물(p＜0.005)과 관련된 문제를 경험한 일수. 상기 유전자형은 또한 보다 적은 친구(p＜0.04), 이들의 친구와의 보다 적은 우정(p＜0.0005), 및 보다 자주 결혼하는 것과 연관된다. TCI에서 상기 유전자형은 증가된 충동(p＜0,01), 및 애정(p＜0.05), 의존성(p＜0.02), 복귀 의존성(p＜0.05), 과단성(p＜0.01), 자가-지배(p＜0.05), 감정 이입(p＜0.05), 도움주기(p＜0.02), 순수한 양심(p＜0.02), 및 협력성(p＜0.05)에서의 감소된 득점과 연관된다.
모노아민 옥시다제 유전자(MAO).MAO는 뇌의 시냅스에서 신경전달자의 분해에 관여하는 주요 효소 중 하나이다. MAO 활성을 억제하는 약제를 투여함으로써 분위기 및 기타 행동에서 현저한 개선이 나타날 수 있다. 많은 연구들은 낮은 MAO 수치 및 알콜 중독[참조: Wiberg et al., 1977; Gottfries et al., 1975; Devor et al., 1994; 09], 정신분열증[참조: Wyatt et al., 1979]; 우울증[참조: Sherif et al., 1991; Pandey et al., 1992]; 조울성 질환[참조: Pandey et al., 1980]; 자살[참조: Gottfries et al., 1975; Sherif et al., 1991; Buchsbaum et al., 1976; Buchsbaum et al., 1977; Meltzer and Arora 1986]; ADHD, 또는 ADDH로 공지됨[참조: Skekim et al, 1982]; 및 위험-추구, 감흥 추구 또는 외향성 인격 특성[참조: Vonknorring et al., 1991; BuchsBaum et al., 1976; Schooler et al., 1978; Shekim et al., 1989; Vonknorring et al., 1984] 사이에서 상호관련성을 제시해 왔다. 그러나 기타 연구들은 이러한 특성들 하나 이상과의 연관성을 발견하는데는 실패하였다[참조: Mann and Stanley 1084; Propping et al., 1981; Tabakoff et al., 1988]. 두개의 효소 수치[참조: Wiberg et al., 1977; Gottfries et al., 1975; Devor et al., 1994; Vonknorring et al., 1991] 및 유전자 변이[참조: Vanyukov et al., 1993]을 사용한 선행 연구들은 물질 남용에서 MAOA 유전자의 역할을 나타낸다.
도파민계 및 카나비노이드 수용체에 부가하여, 모노아민 옥시다제(MAO)는 RDS에서 중요한 역할을 수행하는 것으로 또한 생각된다. 본 발명은 또한 투렛 증후군에서 모노아민 옥시다제 유전자 변이체의 제1 연관성을 제공한다. X-결합된 MAOA 또는 MAOB 유전자에서 유전자 결함은 ADHD, TS 및 관련된 질환에서 남성의 우세를 설명할 수 있다. 351 Ts 피검자, 친척 및 대조 그룹에서 3개의 단복체 다형성, 두개의 MAOA 및 한개의 MAOB 유전자의 대립형질을 시험한다. 각각의 피험체에 대해 행동적, 학습적 학교 문제와 관련된 23개의 상이한 정량적 특성의 평가를 가능하게 하는 조직화된 설문을 완료한다. MAO VNTR 및 MAOB 다형성의 보다 긴 염기쌍 대립형질 및 MAO CA-1 다형성의 보다 짧은 염기쌍 대립형질이 ADHD, 말더듬기, 조병, 우울증, 행동 및 학습 문제에 대한 보다 높은 득점과 연관되는 현저한 경향이 있다. 가장 중요한 결과는 ADHD(p＜0.005), 주요 우울증(p=0.005), 및 말더듬기(p=0.007)에 대한 MAOA 유전자의 CA-1 반복체를 사용한 결과이다. 행동 중 7개에 대한 복귀 계수는 ＜0.01에서 현저한 반면, 성-관련된 MAOA 유전자에서 R2또는 변이 퍼센트는 행동의 범위에 기여하며, 관련성 정도는 TS, ADHD, 또는 CD에 대한 남성 우세의 정도를 설명하는데는 불충분하다. 상기 결과는 TS 스펙트럼 질환의 유전의 폴리유전자 메카니즘 및 소부수체 그 자체가 유전자 조절에 역할을 수행할 수도 있다는 가설과 일치한다.
비만에서 OB, 사람 염색체 2번, 분리성 단백질-2 및 APO-D 유전자.결연 관계 연구는 남성에서 보다 여성에서 비만에 대한 보다 높은 정도의 유전자 부가를 난타내며, 유전적 인자가 비만 발생이 집단의 많은 퍼센트에서 증가하며 보다 정착된 생활 형식과 같은 후천적 인자들이 보다 중요할 수 있는 50세 이상의 사람에서보다 젊은이에서 보다 더 비만에 관여할 가능성이 있다는 가능성을 보여준다[참조: Stunkard et al., 1986].
비만과 관련된 중요한 단백질 생성물은 혈청 단백지 렙틴이다. 이의 합성은 OB 유전자에 의해 조절되며 체지방의 조절에서 역할을 하는 것으로 사료된다[참조: Maffei et al., 1995]. 사람에서 렙틴의 수치는 피검자의 전체 지방증과 매우 상관관계가 있는 것으로 확인되었다[참조: Considine et al., 1996]. 소부수체 다형성, D2S1788이 염색체 22p21에서 맵핑되었으며 이는 혈청 렙틴 수치와 로드 득점에 의한 연관의 강력한 증거임이 확인된다[참조: Comuzzie et al., 1997]. 이러한 좌위는 혈청 렙틴 수치에서 변이의 47%를 설명해 주며, 글루코키나제 조절 단백질(GCKR) 및 프로-오피오멜라코르틴(POMC)를 포함하는 비만에 대한 수개의 잠정적인 후보 유전자를 함유한다[참조: Comzzie, 1997]. POMC 유전자와 관련된 잠정적인 메카니즘은, 이것이 에드레노코르티코트로픽 호르몬(ACTH)에 대한 전구체이며, ACTH는 글루코코르티코이드의 생성을 초래하는 부신선의 피질에서 작용한다는 것이다. 그러나, POMC 유전자가 또한 아편제 펩타이드에 대한 전구체로서 작용한다는 것을 암시하는 것도 가능하다.
분리성 단백질(UCP1)으로 불리는 미토콘드리아 단백질은 발열 및 칼로리 연소를 생성시키는데 중요한 역할을 수행한다[참조: Nicholls and Locke, 1984]. 이러한 경로는 체온 조절, 체조성 및 글루코오스 대사의 조절에 포함되어져 왔다[참조: Himms-Hagen, 1990]. 그러나, UCP1-함유 갈색 지방 조직은 온대 환경에서 생활하는 사람에서 체중 조절에 관여하지 않는 것으로 보인다. UCP-1과 59% 아미노산 동일성을 갖는 UCP-2는 당뇨병 및 비만에서 역할에서 일치하는 특성을 갖는다[참조: Fleury et al., 참조]. CUP-2는 효모에서 발현될 때 미토콘드리아 막 전위에서 UCP-1보다 큰 효과를 갖는다. UCP-2는 대식세포가 풍부한 조직을 포함하여 성인 조직에서 광범위하게 발현되며, 지방 공급에 대한 반응에서 백색 지방을 상승조절한다.
본 발명은 이들 모든 비만 유전자들의 폴리유전자성 분석을 연계시키며, 이들 유전자는 다수의 상이한 생리학적 메카니즘을 갖는다. 이러한 차이점은 보다 정확한 DNA 기초한 예비 진단 시험을 이끄는 상승효과 보다는 부가적인 효과를 가능하게 할 수 있다. DRD2, ON, 염색체 2, UCP-2 및 APO-D 유전자를 한 샘플에서 혼합하는 것이 하나의 유전자 단독 보다 바람직한 양태이다. 부가적으로, 본 발명은 BMI(이는 최선의 비만 결정인자가 아니다)에 의해서가 아니라 체지방 퍼센트(여성 34% 및 남성 28%)에 의해 측정된 바와 같이 병적으로 비만인 프로밴드를 결정한다.
SUD에서 폴리유전자 접근방법.하나의 동일한 피험체 세트에서 다수의 상이한 유전자의 대립형질을 시험하는 독특한 장점 중 하나는 각각의 유전자의 상대적 효과가 상이한 정량적 변수에 대해 비교될 수 있다는 것이다. 부가적으로, 유전자형의 확인은 환경적 효과에 대한 분석에 보다 큰 세련미와 정교함을 부가하여 유전자에 대한 효과를 환경적 원인으로부터 분리할 수 있게 된다.
무스 가족 환경적 척도(FES)의 10개의 척도에서의 득점은 어린시절 및 청년기의 피검자의 가족 환경의 지표로서 사용된다. 상기 데이터는 SPSS(제조원: SPSS, Inc)의 상관관계 및 부분적인 상관관계 소프트웨어(Correlations and Partial Correlations software)를 사용하여 분석한다.
각각의 약물 변수에 대한 분석은 예시자로서 7개 유전자 좌위에서 마커 유전자형을 사용하여 단계적인 복귀로 시작한다. 0.05 보다 낮은 p 값은 연장 방정식에서 변수를 도입하기 위해서 요구된다. 각각의 복귀 후, 최저 예시적 유전자와 연관된 변수를 제거한다. 상이한 유전자 및 환경적 인자에 대한 각각의 상관 계수를 나타내는 결과를 표 1에서 나타낸다.
단계 4.제4 단계는 각각의 유전자와 관련된 하나 이상의 다형성을 확인하는 것이다. 이는 다양한 직렬 반복체 또는 유전자 좌위의 임의의 기타 마커뿐만 아니라 단일 염기쌍 제한 단편 길이 다형성(RFLP), 또는 디뉴클레오타이드, 트리뉴클레오타이드, 또는 기타 반복체 다형성일 수 있다. 상기 다형성 및 검출 방법은 본원에 기술된 다형성에 부가하여, 후보 유전자를 확인하기 위해서 상기 기술한 바와 같이, 이미 출판되었거나 출판되지 않은 연구 실적에서 용이하게 활용할 수 있다. 대안적으로, 유전자가 관심있는 폴리유전자 특성에 기여하는 것으로 의심되지만, 문헌 및 유전자 데이터베이스를 검토한 후 MAA 기술에서 현재 사용 가능한 다형성이 없는 경우, MAA 기술에서 사용될 수 있는 유전자 중 다형성을 결정하기 위해서 유전자 검정법을 수행할 수 있다. 본원에 기술된 기술에 부가하여, 상기 검정법은 흔히 사용되며 문헌에 기술되어 있다. 게놈성 DNA, cDNA 또는 RNA 샘플에서 정확하게 돌연변이를 검출하기 위해 유전자를 스크리닝하는 방법이 특정 상황에 따라 사용될 수 있다.
본 발명은 MAA 기술을 사용한 RDS 질환의 검출, 진단, 예상 및 치료, 및 폴리유전자 특성의 검출, 진단 및 예상에 관한 것이다. 피검자로부터 분리된 핵산 서열의 형태로 폴리유전자 특성에 부가적으로 감소적으로 기여하는 대립형질의 마커들, 및 MAA 검정법에서 사용되는 신규한 마커를 확인하고 검출하는 방법이 기술된다. 이러한 마커들은 검정하고자 하는 폴리유전자 특성의 지표이며 특정 특성을 나타내는 피검자에 있어서 잠재력을 진단한다.
당해 분야의 숙련자는 생명공학 정보를 위한 국립 센터(NCBI) 또는 출판된 과학 문헌에서 발견되는 바와 같은 대중적인 데이터베이스를 통해 이용 가능한 것 뿐만 아니라 본원에 기술된 핵산 서열이 MAA 기술에서 사용될 수 있음을 인식할 것이며 따라서, RDS 또는 기타 폴리유전자 특성의 검출, 진단, 예상 및 치료에의 다양한 적용에서의 용도를 확인할 것이다. 본 발명의 범위내에서 상기 적용의 예는 특정 프라이머를 사용한 폴리유전자 특성의 하나 이상의 마커의 증폭, 올리고뉴클레오타이드 또는 핵산 프로브를 사용한 하이브리드화에 의한 폴리유전자 특성의 마커의 검출, 분리된 핵산의 벡터내로의 삽입, 및 벡터로부터의 RNA의 발현을 포함한다.
행동 질환 및 기타 폴리유전자 특성에서 다중 유전자를 시험하고자 하는 필요성은 실현가능한 것이며 신규한 기술을 필요로 하는 것은 아니다. 다형성 및 관련된 변이체는 두가지 유형 즉, 1) 제한 단편 길이 다형성(RFLP)을 생성시키는 단일 염기쌍 변화, 및 2) 짧은 직렬 반복체 다형성(STR)[특히 디- 및 트리-뉴클레오타이드 반복체]로 분류된다. 이들을 대규모 시험하는 방법은 각각의 유형에 있어서 상이하다.
RFLP.퍼킨-엘머 코포레이션의 지사인 어플라이드 바이오시스템스사는 PCRTM기초한 단일 염기쌍 RFLP 유형 유전자 다형성에 대한 신속한 시험을 가능하게 하는 신규한 기술 및 장비를 개발하였다. 이러한 장비, 어플라이드 바이오시스템스 프리즘 7200 서열 검출 시스템(TaqMan)은 다중 유전자 시험을 가능하게 한다. 이러한 방법은 제한 엔도뉴클레아제 다형성부위를 함유하는 DNA의 일부분을 전기영동하는데 표준 프라이머를 사용한다. 본 기술의 독특한 양태는 두개의 짧은 올리고머를 디자인하며, 이때 하나는 대립형질 중 하나에 정확하게 일치하며 다른 하나는 다른 대립형질에 일치하게 하는 것이다. 형광 염료를 각각의 한쪽 말단에 부착시키고, 소광(quenching) 염료를 다른 쪽 말단에 부착시킨다. 일치가 완전한 경우, DNA 폴리머라제가 하이브리드화된 올리고머에 도달하는 경우, 폴리머라제가 통과함에 따라서 뉴클레오타이드로 분해시킨다. 이러한 방출물들, 소광물 및 염료는 이때 최대치로 형광을 발한다. 그러나, 올리고머가 일치하지 않는 경우, 뉴클레아제 절단 대신에, 올리고머는 그 위치를 밀어내어 소광이 지속된다. 플레이트의 이중 파장 판독으로 11, 12, 22 유전자형 사이의 구별을 가능하게 한다. 96개 샘플상에서 결과를 판독하는 전체 방법은 15분 미만의 시간이 소요되며 그 결과는 분석 및 저장을 위해서 컴퓨터내로 입력된다. 이러한 기술은 PCRTM반응을 설정하기위해서 컴퓨터화된 워크스테이션에 의해 보조되어 하루에 상이한 RFLP 수백개를 시험하는 것을 가능하게 만든다.
STR.상기 사용된 동일한 컴퓨터화된 워크스테이션을 사용하여 STR을 위한 PCRTM반응을 설정한다. 차이점은 STR에 있어서는 프라이머 그 자체가 상이한 형광염료로 표지된다는 것이다. 단지 두개의 염기쌍에 의해서 차이가 생기는 대립형질을 확인하기 위해 필요한 정확성은 염료를 제2 염료로 표지되게 하는 어플라이드 바이오시스템스 373 DNA 서열분석기로부터 수득된다. 각각은 상이한 파장에서 레이저 스캐닝에 의해 검출된다. 예를 들어, 하나의 PCRTM프라이머는 형광 HEX 아미다이트(어플라이드 바이오시스템스, 캐나다, 포스터 시티)로 또는 다른 형광 염료로 표지된다. 10배 희석된 PCRTM생성물 2㎕를 탈이온화된 포름아미드 2.5㎕ 및 ROX 500 표준 0.5㎕에 부가하고 92℃에서 2분 동안 변성시키고 AB 373 DNA 서열 분석기 중 6% 변성 폴리아크릴아미드 겔상에 로딩한다. 겔을 일정한 25W에서 5시간 동안 전기영동시킨다. 겔을 레이저 스캐닝하고 각각의 레인에 존재하는 내부 ROX 500 표준을 사용하여 분석한다. 피크를 염기쌍 길이에 의해 크기별로 배열된 착색 단편에 기초하여 제노타이퍼(Genotyper)(버젼 I.1)에 의해 인식된다.
역사적으로, 다수의 상이한 방법들이 점 돌연변이를 검출하는데 사용되어져 왔으며, 변성 구배 겔 전기영동("DGGE"), 제한 효소 다형성 분석, 화학적 및 효소적 절단 방법, 및 기타 등이 포함된다. 최근에 사용되는 보다 일반적인 방법들은 PCRTM(하기 참조)에 의해 증폭된 표적 영역의 직접적인 서열 분석 및 단일-쇄 확인 다형성 분석("SSCP")을 포함한다.
점 돌연변이에 대한 또 다른 스크리닝 방법은 RNA/DNA 및 RNA/RNA 이형이합체에서 염기쌍 불일치에 대한 RNase 절단에 기초한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "불일치(mismatch)"는 이중쇄 RNA/RNA, RNA/DNA, 또는 DNA/DNA 분자에서 쌍을 이루지 않거나 불일치하는 뉴클레오타이드의 영역으로써 정의된다. 따라서, 이러한 정의는 단일 및 다수 염기 점 돌연변이 뿐만 아니라 삽입/결실 돌연변이에 기인하는 불일치를 포함한다.
미국 특허 제4,946,773호는 단일쇄 DNA 또는 RNA 시험 샘플을 RNA 프로브에 어닐링시키고 후속적으로 RNase A로 상기 핵산 이합체를 처리하는 것과 관련된 RNase A 불일치 절단 검정법을 기술하고 있다. RNase 절단 반응 후, RNase를 단백질분해적 절단 및 유기 추출에 의해 불활성화시키고, 절단 생성물을 가열하여 변성시키고 변성 폴리아크릴아미드 겔 상에서 전기영동으로 분석한다. 불일치의 검출을 위해서, 크기별로 전기영동적으로 분리시킨 RNase A 처리의 단일쇄 생성물을 유사하게 처리된 대조 그룹 이합체와 비교해 본다. 대조 그룹에서 관찰되지 않는 보다 짧은 단편(절단 생성물)을 함유하는 샘플은 포지티브로서 득점을 부여한다.
미국 특허 제4,946,773호에서 수행된 방법을 포함하여, 최근 이용할 수 있는 RNase 불일치 절단 검정법은 방사선 표지된 RNA 프로브의 사용을 요구한다. 미국 특허 제4,946,773호에서 마이어스 및 마니아티스(Myers and Maniatis)는 RNase A를 사용한 염기쌍 불일치의 검출을 기술하고 있다. 기타 연구자들은 불일치 검정법에서 이. 콜라이 효소인 RNase I의 사용을 기술해 왔다. RNase A에 비해 보다 광범위한 절단 특이성을 갖고 있기 때문에, 성분들이 비-특이적인 절단의 정도를 감소시키고 불일치의 절단 빈도를 증가시키는 경우 RNase I는 염기쌍 불일치의 검출에 사용하기에 바람직한 효소일 것이다. 불일치 검출에 있어서 RNase I의 사용은 프로메가 바이오테크사로부터의 문헌에서 기술되어 있다. 프로메가사는 효소 수준이 충분히 높지는 않지만, 이들의 문헌에서 4개 중 3개의 공지된 불일치를 절단하는 것으로 나타나는 RNase I를 함유하는 키트를 시판하고 있다.
RNase 보호 검정법은 처음에는 용액 중 특정 mRNA 표적의 말단을 검출하고 맵핑하기 위해서 사용되었다. 상기 검정법은 시험관내 전사에 의해 관심있는 mRNA에 상보적인 고 특이적인 활성 방사선 표지된 RNA 프로브를 용이하게 생성시키는 능력에 의존한다. 최초에, 시험관내 전사를 위한 주형들은 박테리오파아지 프로모터를 함유하는 재조합 플라스미드였다. 프로브는 전체 세포성 RNA 샘플과 혼합되어 이의 상보적 표적에 하이브리드화되고, 이후 상기 혼합물을 RNase로 처리하여 과량의 비하이브리드화된 프로브를 분해시켰다. 또한, 최초에 의도된 바와 같이, 사용되는 RNase는 단일쇄 RNA에 특이적이며, 결과적으로 하이브리드화된 이중쇄 프로브는 분해로부터 보호되었다. RNase의 불활성 및 제거 후, 보호된 프로브(이는 존재하는 표적 mRNA의 양에 양적 비율로 존재한다)를 회수하고 폴리아크릴아미드 겔상에서 분석한다.
RNase 보호 검정법은 단일 염기 돌연변이의 검출을 위해서 채택되었다. RNase A 불일치 절단 검정법의 상기 유형에서, 야생형 서열로부터 시험관내 전사된 방사선 표지된 RNA 프로브는 시험 샘플로부터 유도된 상보적 표적 영역에 하이브리드화된다. 시험 표적은 일반적으로 DNA(게놈성 DNA 또는 플라스미드내에 클로닝에 의해 또는 PCRTM에 의해 증폭된 DNA)을 포함하며, RNA 표적(내인성 mRNA)가 경우에 따라 사용되기도 한다. 단일 뉴클레오타이드(또는 보다 큰) 서열 상이점이 하이브리드화된 프로브 및 표적사이에 유발되는 경우, 그 위치("불일치")에서 결합되는 와트슨-크리크 수소 결합의 결과적인 분리는 인식될 것이고 단일쇄 특이적인 상기 리보뉴클레아제에 의해 일부의 경우에 절단되게 된다. 현재까지, RNase A는 단일-염기 불일치의 절단용으로 압도적으로 가장 많이 사용되고 있으며, RNase I는 최근에 불일치 절단용으로 또한 유용한 것으로 보인다. 단일-염기 불일치의 검출용으로 MutS 단백질 및 기타 DNA-수선 효소를 사용하는 것에 대한 최근의 기술들이 있다. 핵산의 검출을 위한 부가적인 방법 및 돌연변이가 본원에서 기술된다.
핵산.본원에서 기술되는 바와 같이, 본원의 양태는 ADHD, 반항 질환, 행동 질환, 학습 질환, 알콜, 콜레스테롤, 및 LDL 같은 폴리유전자 특성에 대한 마커들을 포함하여, 대립형질 다형성이 폴리유전자 특성의 마커인 이전에 공지된 29개 유전자이다.
한가지 양태에서, 본원에 기술된 핵산 서열은 하이브리드화 프로브 또는 증폭 프라이머로서 용도를 밝힌다. 이러한 핵산은 예를 들어, 조직 샘플의 진단 평가에서 사용되거나 완전한 길이의 cDNA 또는 이에 상응하는 게놈성 클론을 클로닝하는데 사용될 수 있다. 특정 양태에서, 이러한 프로브 및 프라이머는 올리고뉴클레오타이드 단편으로 이루어진다. 상기 단편들은 RNA 또는 DNA 조직 샘플에 대한 특정 하이브리드화를 제공하도록 충분히 길어야 한다. 서열들은 전형적으로 10 내지 20 뉴클레오타이드이지만, 보다 더 긴 것일 수도 있다. 보다 긴 서열, 예를 들어, 40, 50, 100, 500 및 심지어 완전한 길이의 서열도 특정 양태에서 바람직하다.
본 원에서 기술된 진단 또는 치료 방법에서 사용될 수 있는 어떠한 유전자로부터 선택된 서열로부터 약 10, 15, 17, 20, 30, 40, 50, 60, 75, 100, 또는 500개의 뉴클레오타이드의 인접 스트레치를 갖는 핵산 분자가 예상된다. 상기 언급한 서열에 상보적이고 매우 척박한 조건하에서 이러한 서열에 결합하는 분자가 또한 예상된다. 이러한 프로브는 서던 및 노던 블랏팅과 같은 다양한 하이브리드화 양태에서 유용할 것이다. 일부 경우에, 프로브는 폴리유전자(polygenic) 특성을 효과적으로 진단하면서 다중 목적 서열에 하이브리드화하는데 사용될 수 있다고 사료된다.
본원에서 상술된 유전자 또는 본원에서 기술된 29 세트의 유전가 첨가된 후자의 유전자가 존재하는 경우, 다양한 프로브 및 프라이머는 상술된 뉴클레오타이드 서열 또는 마커로서 유용한 폴리모르피즘을 둘러싼 서열 주위에서 고안될 수 있다. 기타 유전자는 상이한 폴리유전자 특성을 검사하기 위한 새로운 세트의 유전자를 형성하는데 사용될 수 있고 어떠한 기타 유전자의 용도, 또는 바람직하게는 MMA 기술에서 유전자 폴리모르피즘의 용도가 본 발명의 일부로서 포함된다고 사료된다. 프라이머는 어떠한 길이로도 존재할 수 있으나, 통상적으로 10 내지 20개의 염기의 길이로 존재한다. 예를 들면 제1 잔기는 1이고, 제2 잔기는 2이고 등등과 같이 서열에 대한 수적 값을 할당함으로써, 모든 프라이머를 정의하는 알고리즘은 하기와 같이 제안될 수 있다.
n 내지 n+y
여기서, n은 1 내지 서열의 마지막 수의 정수이고,
y는 프라이머-1(9 내지 19)의 길이이고,
n+y는 서열의 마지막 수를 초과하지 않는다.
따라서, 10-머에서, 프로브는 염기 1 내지 10, 2 내지 11, 3 내지 12....등에 상응한다. 15-머에서, 프로브는 염기 1 내지 15, 2 내지 16, 3 내지 17...등에 상응한다. 20-머에서, 프로브는 1 내지 20, 2 내지 21, 3 내지 22....등에 상응한다.
특정 양태에서, 다수의 프로브는 단일 샘플에 하이브리드화 하기 위해 사용될 수 있다고 사료된다. 14 내지 100 뉴클레오타이드 길이의 프로브를 하이브리드화하는데 사용하여 안정하면서 선택적인 이중 분자가 형성될 수 있다. 하이브리드의 안정성과 선택성을 증가시키기 위해 20 염기 길이 이상의 스트레치에 대한 상보적 서열을 갖는 분자가 일반적으로 바람직하고, 이에 의해 수득한 특정 하이브리드 분자의 질과 순도가 개선될 수 있다. 20 내지 30개 뉴클레오타이드의 스트레치 또는 바람직한 경우 더 긴 스트레치를 갖는 핵산 분자를 고안하는 것이 일반적으로 바람직할 것이다. 이러한 단편은, 예를 들면 화학적 수단에 의해 단편을 직접 합성하거나 선택된 서열을 재조합 형성을 위해 재조합 벡터로 도입시킴으로써 미리 제조될 수 있다.
따라서, 본 발명의 뉴클레오타이드 서열은 유전자 또는 RNA의 상보적 스트레치로 이중 분자를 선택적으로 형성하거나 조직으로부터의 DNA 또는 RNA의 증폭을 위해 프라이머를 제공하는데 사용될 수 있다. 계획된 용도에 따라, 목적 서열에 대한 프로브의 다양한 선택성을 성취하기 위해 다양한 하이브리드화 조건을 사용하는 것이 바람직하다.
고 선택성이 필요한 용도에서, 하이브리드를 형성하기에 비교적 척박한 조건을 사용하는 것이 통상적으로 바람직하고, 예를 들면 약 50℃ 내지 약 70℃의 온도에서 NaCl 약 0.02M 내지 약 0.10M가 제공되는 것과 같은 비교적 낮은 염 및/또는 높은 온도 조건이 선택될 것이다. 프로브 및 주형 또는 목적 스트랜드 사이에 잘못 대응되는 경우에는 이러한 매우 척박한 조건에서 거의 내성이 없으므로 특정 유전자를 분리하거나 특정 mRNA 전사를 검출하는데 특히 적합하다. 조건은 포름아미드를 증가하는 양으로 첨가함으로써 더욱 척박하게될 수 있다고 일반적으로 공지되어 있다.
특정 용도, 예를 들면 부위-직접적 돌연변이 유발에 의해 아미노산의 치환의 경우, 더 낮은 척박한 조건이 필요하다고 공지되어 있다. 이러한 조건하에서, 하이브리드화는 프로브 및 목적 스트랜드의 서열이 완전히 상보적이지 않을지라도 발생할 수 있으나, 이들은 서로의 위치가 잘못 대응된다. 조건은 염 농도를 증가시키고 온도를 낮춤으로써 덜 척박해질 수 있다. 예를 들면, 중간 정도의 척박한 조건은 약 37℃ 내지 약 55℃의 온도에서 약 0.1 내지 0.25M NaCl에 의해 제공될 수 있고, 반면 낮은 척박한 조건은 약 20℃ 내지 약 55℃ 범위의 온도에서 약 0.15M 내지 약 0.9M의 염에 의해 제공될 수 있다. 따라서, 하이브리드화 조건은 미리 조작될 수 있고 따라서, 일반적으로 목적하는 결과에 따라 방법을 선택할 수 있다.
기타 양태에서, 하이브리드화는, 예를 들면, 약 20℃ 내지 약 37℃의 온도에서 50mM 트리스-HCl(pH 8.3), 75mM KCl, 3mM MgCl2, 10mM 디티오트레이톨의 조건하에서 성취될 수 있다. 사용된 기타 하이브리드화 조건은 약 40℃ 내지 약 72℃ 범위의 온도에서 10mM 트리스-HCl(pH 8.3), 50mM KCl, 1.5μM MgCl2를 포함할 수 있다.
특정 양태에서, 본 발명의 핵산 서열을 하이브리드화를 측정하기 위한 표지와 같은 적합한 수단과 함께 사용하는 것이 유리할 것이다. 광범위한 다양한 적합한 지시제 수단은 검출될 수 있는 형광, 방사성, 효소적 또는 기타 리간드(예: 아비딘/바이오틴)을 포함하여 당해 기술분야에서 공지되어 있다. 바람직한 양태에서, 방사성 또는 기타 환경적으로 바람직하지 않은 시약 대신, 우레아제, 알카리성 포스파타제 또는 퍼옥시다제와 같은 형광 표지 또는 효소 태그를 사용하는 것이 바람직할 것이다. 효소 태그의 경우, 색상측정 지시제 기질은 사람 눈에 또는 분광 광도계로 가시적인 검출 수단을 제공하고, 상보적 핵산-함유 샘플과의 특이적 하이브리드화를 분리하는데 사용될 수 있다고 공지되어 있다.
일반적으로, 본원에서 기술된 하이브리드화 프로브는 상응하는 유전자의 발현을 검출하기 위해 고체 상에서 사용하는 양태에서 뿐만 아니라, 용액 하이브리드화에서의 시약으로서, PCR™에서의 시약으로서 둘다에서 유용할 것이라고 생각된다. 고체 상을 포함하는 양태에서, 시험 DNA (또는 RNA)는 흡수되거나, 달리 말해 선택된 매트릭스 또는 표면에 고착된다. 이어서, 이러한 고정된 단일-스트랜드 핵산은 목적하는 조건하에서 선택된 프로브와 하이브리드화를 수행한다. 선택된 조건은 필요한 특정 기준(예를 들면, G+C 함량, 목적 핵산의 유형, 핵산의 원천, 하이브리드화 프로브의 크기 등에 따라 좌우된다)을 기초로 하는 특정 환경에 따라 좌우될 것이다. 비특이적 결합 프로브 분자를 제거하기 위한 하이브리드화 표면을 세척한 다음, 표지를 사용하여 하이브리드화를 검출하거나 측량하기도 한다.
PCT™의 증폭. 증폭용 주형으로서 사용된 핵산은 표준 방법론[참조: Sambrook et al., 1989]에 따라, 생물학적 샘플에서 함유된 세포로부터 분리한다. 핵산은 게놈성 DNA 또는 단편 또는 전체 세포 RNA일 수 있다. RNA가 사용되는 경우, RNA를 상보적 DNA로 전화시키는 것이 바람직할 수 있다. 하나의 양태에서, RNA는 전체 세포 RNA이고, 증폭용 주형으로서 직접 사용된다.
폴리유전자 특성의 유전자에 상응하는 핵산에 선택적으로 하이브리드화 하는 한쌍의 프라이머는 선택적 하이브리드화를 허용하는 조건하에서 분리된 핵산과 접촉시킨다. 본원에서 정의된 "프라이머"란 용어는 주형-의존적 방법에서 초기의 핵산의 합성을 프라이밍할 수 있는 어떠한 핵산도 포함함을 의미한다. 통상적으로 프라이머는 염기쌍 길이가 10 내지 20 또는 30인 올리고뉴클레오타이드이나, 더 긴 서열이 사용될 수 있다. 프라이머는 단일-스트랜드화 형태가 바람직하지만, 이중 스트랜드화 또는 단일 스드랜드화 형태로 제공될 수 있다.
일단 하이브리드화되면, 핵산:프라이머 복합체는 주형-의존적 핵산 합성을 유용하게 하는 하나 이상의 효소와 접촉시킨다. "사이클"로 칭하는 증폭의 다중 반복은 충분한 양의 증폭 생성물이 형성될 때까지 수행한다.
이어서, 증폭 생성물을 검출한다. 특적 용도에서, 검출은 가시적 수단에 의해 수행될 수 있다. 또는, 검출은 화학루미네센스, 혼입된 방사선 표지 또는 형광 표지의 방사능 신티그래피를 통한 또는 전자 또는 열적 임펄스 신호[아피맥스(Affymax) 기법]를 사용하는 시스템을 통한 생성물의 간접 확인을 포함할 수 있다.
일부 주형 의존적 방법은 상기 주형 샘플에 존재하는 마커 서열을 증폭시키는데 유용하다. 매우 공지된 하나의 증폭 방법은 본원 전체에서 각각 참조로 인용된 미국 특허 제4,683,195호, 제4,683,202호 및 제4,800,159호에 상세하게 기술된 폴리머라제 연쇄 반응(PCR™로서 칭함)이다.
요약하면, PCR™에서, 마커 서열의 상보적 스트랜드에 대한 마주보는 영역에 상보적인 두개의 프라이머 서열이 제조된다. 과량의 디옥시뉴클레오사이드 트리포스페이트가 DNA 폴리머라제, 예를 들면, Taq 폴리머라제와 함께 반응 혼합물에 첨가된다. 마커 서열이 샘플에 존재하는 경우, 프라이머는 마커에 결합할 것이고 폴리머라제는 뉴클레오타이드에 첨가됨으로써 프라이머를 마커 서열을 따라 연장시킬 수 있다. 반응 온도를 상승시키고 하강시킴으로써 연장된 프라이머는 마커로부터 분해되어 반응 생성물을 형성하고 과량의 프라이머는 마커 및 반응 생성물에 결합될 것이고 이 방법은 반복된다.
역 트랜스크립타제 PCR™ 증폭 방법은 증폭된 mRNA의 양을 정량하기 위해 수행될 수 있디. RNA에서 cDNA로의 역 전사 방법은 매우 공지되어 있고 문헌[참조: Sambrook et al., 1989]에 기술되어 있다. 역 전사의 또 다른 방법은 열안정적, RNA 의존적 DNA 폴리머라제를 사용하는 것이다. 이러한 방법은 본 원에서 참조로 인용된 1990년 12월 21일 공개된 WO 90/07641에 기술되어 있다. 폴리머라제 연쇄 반응 방법론은 당해 기술분야에서 공지되어 있다.
증폭을 위한 또 다른 방법은 본원에서 참조로 인용된 EPA 제320308호에서 상술된 리가제 연쇄 반응("LCR")이다. LCR에서, 두개의 상보적 프로브 쌍이 제조되고, 목적 서열의 존재하에 각 쌍은 이들이 인점하도록 목적물의 마주보는 상보적 스트랜드에 결합할 것이다. 리가제의 존재하에, 두개의 프로브 쌍은 결합하여 단일 유니트를 형성한다. PCR™과 마찬가지로 온도를 사이클링함으로써 인접한 결합 유니트가 목적물로부터 분해되고 이어서 과량의 프로브 쌍의 결합에 대해 "목적 서열"로서 작용한다. 미국 특허 제4,883,750호는 프로브 쌍의 목적 서열로의 결합에 대한 LCR과 유사한 방법이 기술되어 있다.
본원에서 침조로 인용된 PCT 출원 제 PCT/US87/00880에서 기술된 Q 베타 리플리카제는 또한 본 발명에서의 또 다른 증폭 방법으로서 사용될 수 있다. 이 방법에서, 목적 복제 서열에 대해 상보적인 영역을 갖는 RNA 복제 서열을 RNA 폴리머라제의 존재하에 샘플에 첨가한다. 폴리머라제는 복제 서열을 복사할 것이고 이어서 검출될 수 있다.
제한 엔도뉴클레아제와 리가제가 제한 부위의 한 스트랜드에 5'-[알파-티오]-트리포스페이트를 함유하는 목적 분자의 증폭을 달성하기 위해 사용된 등온 증폭 방법은 또한 본 발명의 핵산의 증폭에 유용할 수 있다.
스트랜드 치환 증폭(SDA)은 스트랜드 치환 및 합성(즉, 닉 번역)의 다중 반복을 포함하는 핵산의 등온 증폭을 수행하는 또 다른 방법이다. 복구 연속 반응(Repair Chain Reaction, RCR)라고 칭하는 유사한 방법은 증폭에 대해 목적하는 영역을 통해 수개의 프로브를 어닐링하고 이어서 복구 반응을 수행함을 포함하고 4개의 염기 중의 두개만이 존재한다. 다른 두개의 염기는 용이한 검출을 위한 바이오틴화된 유도체로서 첨가될 수 있다. 유사한 접근 방법이 SDA에서도 사용된다. 목적하는 특이적 서열은 또한 사이클릭 프로브 반응(CPR)을 사용하여 검출될 수 있다. CPR에서, 비 특이적 DNA의 3' 및 5'서열과 특이적 RNA 중간 서열을 갖는 프로브는 샘플에 존재하는 DNA에 하이브리드화 된다. 하이브리드화되면, 반응은 RNase H로 처리되고, 특징적 생성물로서 확인된 프로브의 생성물이 분해 후 방출된다. 원 주형은 또 다른 사이클링 프로브에 어닐링되고 반응은 반복된다.
각각 전체가 본원에서 참조로 인용된 영국 출원 제2 202 328호 및 PCT 출원 제PCT/US89/01025호에서 기술된 또 다른 증폭 방법은 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 전자 출원에서, "개질된" 프라이머는 PCR™-유사 주형 및 효소-의존적 합성에서 사용된다. 프라이머는 포획 부위(예: 바이오틴) 및/또는 검출 부위(예: 효소)로 표지화시킴으로써 개질될 수 있다. 후자의 출원에서, 과량의 표지된 프로브는 샘플에 첨가된다. 목적 서열의 존재하에, 프로브는 결합되고 촉매적으로 분해된다. 분해 후, 목적 서열은 그대로 방출되어 과량의 프로브에 의해 결합된다. 표지된 프로브의 분해는 목적 서열의 존재를 나타낸다.
다른 핵산 증폭 방법은 핵산 서열 기본의 증폭(NASBA) 및 3SR[본원에서 참조로 인용된 진저라스 등(Gingeras et al.)의 PCT 출원 WO 88/10315]을 포함하는 전사-기본의 증폭 시스템(TAS)를 포함한다. NASBA에서, 핵산은 표준 페놀/클로로포름 추출, 임상적 샘플의 가열 변성, 용해(lysis) 완충액으로의 처리 및 DNA 및 RNA의 분리 또는 RNA의 구아니딘 클로라이드 추출을 위한 소형스핀 컬럼에 의한 증폭에서 사용될 수 있다. 이러한 증폭 기법은 목적하는 특이적 서열을 갖는 프라이머를 어닐링함을 포함한다. 이어서 중합반응하고 DNA/RNA 하이브리드는 RNase H로 분해시키고 반면, 이중 스트랜드 DNA 분자는 다시 가열 변성된다. 다른 경우에, 단일 스트랜드 DNA는 제2 목적하는 특이적 프라이머를 첨가한 후 중합시킴으로써 완전히 이중 스트랜드화된다. 이어서, 이중 스트랜드 DNA 분자는 T7 또는 SP6와 같은 RNA 폴리머라제에 의해 반복 전사된다. 등온 사이클 반응에서, RNA's는 단일 스트랜드 DNA로 역 전사되고 이어서 이중 스트랜드 DNA로 전환된 후, T7 및 SP6과 같은 RNA 폴리머라제로 일단 다시 전사된다. 일부가 생략되거나 또는 완전한 수득한 생성물은 목적하는 특이적 서열을 나타낸다.
다베이 등(Davey et al.)의 EPA 제329 822호(본원에서 참조로 인용됨)에서는 본 발명에 따라서 사용될 수 있는 주기적으로 합성하는 단일 스트랜드 RNA("ssRNA"), ssDNA 및 이중 스트랜드 DNA(dsDNA)를 포함하는 핵산 증폭 방법이 상술되어 있다. ssRNA는 역 트랜그크립타제(RNA-의존적 DNA 폴리머라제)에 의해 연장되는 제1 프라이머 올리고뉴클레오타이드에 대한 주형이다. 이어서 RNA는 리보뉴클레아제 H(RNase H, DNA 또는 RNA와의 이중나선에서 RNA에 대해 특이적인 RNase)의 작용에 의해 수득한 DNA:RNA 이중나선으로부터 제거된다. 수득한 ssDNA는 또한 5'에서 주형에 대한 상동성 부위의 RNA 폴리머라제 프로모터(T7 RNA 폴리머라제에 의해 증폭)의 서역을 포함하는 제2 프라이머에 대한 주형이다. 이어서, 이 프라이머는 DNA 폴리머라제[이. 콜리 DNA 폴리머라제 Ⅰ의 거대 "클레오우(Klenow)"에 의해 증폭)에 의해 연장되어 프라이머들 사이에서 원 RNA 서열과 동일한 서열을 갖고, 추가로 한쪽 끝에서 프로모터 서열을 갖는 이중 스트랜드 DNA("dsDNA") 분자를 수득한다. 이 프로모터 서열은 DNA의 다수의 RNA 복제물을 제조하는 적합한 RNA 폴리머라제에 의해 사용될 수 있다. 이어서 이러한 복제물은 매우 신속한 증폭을 유도하는 사이클에 다시 도입될 수 있다. 효소의 적합한 선택에 따라서, 이러한 증폭은 각 사이클에서 효소를 첨가하지 않고 등온적으로 수행될 수 있다. 이러한 방법의 사이클적 특성때문에, 출발 서열은 DNA 또는 RNA 형태로 존재하도록 선택될 수 있다.
밀러 등의(Miller et al.) PCT 출원 WO 89/06700(본원에서 참조로 인용함)에서는 목적하는 단일-스트랜드 DNA("ssDNA")에 대한 프로모터/프라이머 서열의 하이브리드화 후, 다수의 RNA 복제 서열의 전사를 기초로 하는 핵산 서열 증폭 방법을 상술하고 있다. 이러한 방법은 주기적이지 않고, 즉 새로운 주형이 수득한 RNA 전사물로부터 형성되지 않는다. 다른 증폭 방법은 "RACE" 및 "한 면 PCR™"을 포함한다(본원에서 참조로 인용됨, Frohman, 1990).
수득한 "디-올리고뉴클레오타이드"의 서열을 갖는 핵산의 존재하에 두 개(또는 그 이상)의 폴리고뉴클레오타이드의 결합하고 이에 의해 디-올리고뉴클레오타이드의 증폭을 기초로 하는 방법은 또한 본 발명의 증폭 단계에서도 사용될 수 있다.
하기의 어떠한 증폭에서도, 주형으로부터의 증폭 생성물과 특이적 증폭이 발생하는지에 대한 측정을 목적으로 하는 과량의 프라이머를 분리하는 것이 바람직할 수 있다. 하나의 양태에서, 증폭 생성물은 표준 방법을 사용하여 아가로즈, 아가로즈-아크릴아미드 또는 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 분리된다[참조: Sambrook et al., 1989].
또는, 크로마토그래피 기법은 분리를 수행하는데 사용될 수 있다. 본 발명에서 사용될 수 있는 각종 크로마토그래피: 흡착, 분배, 이온-교환 및 분자 채, 및 컬럼, 종이, 박층 및 기체 크로마토그래피를 포함하여 이러한 원리를 사용하는 다수의 특이적 기법이 존재한다.
증폭 생성물은 마커 서열의 증폭을 확인하기 위해 가시화되여야 한다. 하나의 전형적 가시화 방법은 에티듐 브로마이드를 사용한 겔의 염색 및 UV 광하에서의 가시화를 포함한다. 도는, 증폭 생성물이 방사선- 또는 형광분석적으로-표지된 뉴클레오타이드로 통합적으로 표지된 경우, 이어서 증폭 생성물은 x-레이 필름에 노출되거나 적합한 촉징 스펙트럼하에서 가시화되어 분리될 수 있다.
하나의 양태에서, 가시화는 간접적으로 달성된다. 하기 증폭 생성물, 표지된 핵산 프로브의 분리는 증폭된 마커 서열과 접촉시킨다. 프로브는 바람직하게는 발색단에 결합되나 방사선 표지될 수 있다. 또 다른 양태에서, 프로브는 결합 파트너, 예를 들면 항체 또는 바이오틴에 결합되고 결합 쌍의 다른 구성원이 겸출성 부위를 수반한다.
하나의 양태에서, 서던 블랏팅과 표지된 프로브와의 하이브리드화에 의해 검출된다. 서던 블랏팅에서 포함된 기법은 당해 기술분야의 숙련인에게 널리 공지되어 있고 분자 프로토콜의 다수의 표준 서적에서 발견될 수 있다[참조: Sambook et al., 1989]. 요약하면, 증폭 생성물은 겔 전기영동에 의해 분리된다. 이어서 겔은 나트로셀루로즈와 같은 막과 접촉되어 핵산 및 비-공유결합의 전달이 가능하다. 이어서, 막은 목적하는 증폭 생성물과 하이브리드화될 수 있는 발색단-결합된 프로브와 배양한다. x-레이 필름 또는 이온 방출 검출 장치에 막을 노출시킴으로써 검츨된다.
하기의 일예는 본원에서 참조로 인용된 미국 특허 제5,279,721호에 기술되어 있고, 여기에는 자동 전기영동과 핵산 전송을 위한 장치 및 방법에 대해 상술하고 있다. 장치로는 겔 조작하지 않고 전기영동과 블랏팅이 가능하고 본 발명에 따른 방법을 수행하는데 이상적으로 적합하다.
생물학적 샘플에서 하나 이상의 폴리유전자 특성의 유전자 마커를 검출하기 위해 요구되는 실질적 물질 및 시약은 키트에 함께 조립될 수 있다. 이는 일반적으로 특정 마커에 대한 미리선택된 프라이머를 포함할 수 있다. 또한, 증폭을 위해 필요한 반응 혼합물을 제공하는 다양한 폴리머라제(RT, Taq 등), 디옥시뉴클레오타이드 및 완충액을 포함하여, 핵산을 증폭시키는데 적합한 효소도 포함될 수 있다.
이러한 키트는 일반적으로, 적합한 방법에서, 각 시약 및 효소 뿐만 아니라 각각의 마커 프라이머 쌍에 대한 별개의 용기를 포함할 것이다. 핵산 증폭을 위한 바람직한 프라이머 쌍은 서열 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33 및 34에서 특이적인 서열을 증폭시키기 위해 선택된다.
또 다른 양태에서, 이러한 키트는 서열 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33 및 34에서 특이적인 서열에 따라서 폴리유전자 특성에 함유된 유전자에 대해 특이적인 하이브리드화 프로브를 포함할 것이다. 본 발명자들은 본 원에서 상술된 방법, 특히 MAA 기법에서 진단될 것으로 예상되는 폴리모르피즘성 대립형질에 하이브리드화하기에 효과적이라고 공지된 어떠한 프라이머도 이러한 키트에서 사용될 수 있다고 생각한다. 이러하 키트는 일반적으로, 적합한 방법에서, 각 개별 시약 및 효소 뿐만 아니라 각 마커 하이브리드화 프로브에 대한 별개의 용기를 포함할 것이다.
특정 유전자를 코드화하는 DNA 단편은 재조합 호스트 세포로 도입되어 특이적 구조 단백질 또는 조절 단백질을 발현시키는데 사용될 수 있다. 또는, 유전 공학 기법의 적용을 통해, 선택된 유전자의 일부 또는 유도체가 사용될 수 있다. 프로모터 영역과 같은 조절 단백질을 함유하는 업스트립 영역이 분리되고 이어서 선택된 유전자의 발현에 사용될 수 있다.
본 발명은 본원에서 상술된 특정 프로브에 제한되지 않지만, 특히 상술된 서열에 하이브리드화될 수 있거나 이러한 서열의 기능적 서열 동족체인 핵산 서열을 적어도 포함한다고 사료된다. 예를 들면, 부분 서열은 구조적으로 관련된 유전자 또는 건체 길이의 게놈 또는 이로부터 유도된 cDNA만을 확인하는데 사용될 수 있다. 당해 기술분야의 숙련인들에게는 상기 프로브에 대한 목적으로서 사용될 수 있는 cDNA 및 게놈성 라이브러리를 생성시키는 방법은 공지되어 있다[참조: Smbrook et al., 1989].
본 발명의 핵산 서열을 플라스미드, 코스미드 또는 바이러스와 같은 벡터로 혼입시키는 방법에 있어서, 이러한 단편은 이들의 전체 길이가 상당히 변화될 수 있도록 프로모터, 폴리아데닐화 시그날, 제한 효소 부위, 다중 클로닝 부위, 기타 코드화 단편 등과 같은 다른 DNA 서열과 배합될 수 있다. 총 길이는 바람직하게는 용이한 제제 및 목적하는 재조합 DNA 프로토콜에 의해 제한됨에 따라, 거의 모든 길이의 핵산 단편이 사용될 수 있다고 사료된다.
하나의 DNA 샘플에서 동의 유전자를 검출하는 신규한 방법론: 다수의 유전자 및 이들의 폴리모르피즘성 유전자 위치(loci)가 RDS 및 관련된 행동을 진단할 필요가 있기때문에, 본 발명자들은 동의 유전자 스크린(GENESCREEN™)을 제안한다. 여기서는 아피매트릭스(Affymetrix)에 의해 개발된 진 칩(Gene Chip)과 같은 신규한 DNA 기법을 사용할 수 있다. 요약하면, 유리 칩은 광 감성 화학적 화합물로 피복된다. 이러한 화학물질은 DNA 염기의 칩에 및 서로에의 결합을 방지하는 광-감성 보호 그룹을 함유한다. 광이 화학물질에 비춰질 경우, 그러나 보호 그룹은 불활성화 되고 화학 커플링 반응이 발생할 수 있다. 광이 나머지를 제외한 칩의 특정 영역을 비추도록 하는 "마스크"의 사용을 통해, DNA 염기는 칩의 선택된 영역에 결합될 수 있다. 첨가된 각각의 신규한 염기는 방법이 하나의 염기가 다른 염기와의 결합을 반복할 수 있도록 첨부된 보호 그룹을 갖는다. 이러한 방법에서, 상이한 서열의 다수의 DNA 프로브는 단일 1/2-in 칩에서 동시에 합성될 수 있다.
20 DNA 염기 길이 이하인 400,000 프로브 이하의 세트를 구성하기 위해서 단 80 화학 단계가 소요된다. 통상의 DNA 합성 기쳬를 사용하여 합리적 시간 프레임 내에 상이한 DNA 서열만큼 많은 프로브를 제조할 수는 없다. 이러한 기계는 아피매트릭스에 의해 사용된 양적으로 대등한 방법 보다는 오히려 연속적 방법으로 프로브를 제조한다. 이러한 신속한 DNA 분석에서, 샘플 DNA는 먼저 형광 태그로 표지되고 이어서 칩에 배열된 프로브에 첨가된다. 샘플이 칩에서 상보적인 프보프를 발견하는 경우, 결합할 것이고, 상보적인 스트랜드를 발견하지 못한 경우, 칩을 세척할 것이다(상보적 염기를 갖는 DNA 단편은 DNA 단편 자신이 상보적이 된다): 단편 ATTTGCGC(서열 1)이, 예를 들면, 서열 TAAACGCG(서열 2)를 갖는 상보적 단편에 결합할 것이다. 서열 및 각 프로브의 위치는 공지되어 있으므로, 스캐너는 샘플이 어떤 프로브에 결합할 것인가를 측정할 수 있다. 칩상의 프로브의 서열이 공지되어 있기 때문에, 이의 서열은 상보적이기 때문에 샘플 DNA의 서열 또한 공지되어 있다. 유전자 칩을 사용하면 메신저 RNA의 cDNA로의 복제가 불필요하고 1 메신저 rNAs 및 cDNAs를 정량적으로 검출할 수 있다.
그러나, 이러한 본 발명에서 제안된 분석에서, DNA 기계에 의해 좌우되는 다른 방법은 상업화하기에는 매우 적합할 수 있다. 예를 들면, 질량 분광법에 의한 유전자형이 이에 해당된다. 동시에 많은 유전자를 유전자형에 대해 DNA 칩 기법을 사용하는 대안으로서, 세퀘놈(Sequenom, San Diego, CA)이 단일-염기쌍의 질량 유전자형 및 짧은 탠덤 반복 폴리모르피즘에 대한 매트릭스-보조된 레이저 탈착/이온화-시간의 섬광 질량 분광법(MALDI-TOF)에 적용된다[참조: Little et al., 1997; Braun, Little, Koster, 1997; Braun et al., 1997]. 이는 하기 단계에 의해 수행된다. 제1 단계에서, 프라이머 중의 하나에 부착된 바이오틴을 갖는 폴리모르피즘 영역의 PCR™ 증폭이 수행된다[참조: Jurinke et al., 1997]. 제2 단계에서, 증폭된 DNA를 스테파미딘 비드에 고정화시킨다(참조: Jurinke et al., 1997). 제3 단계에서, 폴리모르피즘 부위에 인접한 프라이머의 하이브리드화가 완료된다[참조: Braun, Little, Koster, 1997]. 제4 단계에서, 데옥시형태에 존재하지 않는 dNTPs 및 ddNTPs의 존재하에 폴리모르피즘 부위를 통과하는, DNA 폴리머라제를 사용한 연장이 완료된다. 서열에 따라 적합하게 고안된 경우, 그 결과 소량의 부가 염기를 첨가한다[참조: Braun, Little, Koster, 1997]. 제5 단계에서, 이어서 DNA는 사용되지 않은 뉴클레오타이드와 염을 제조하도록 처리한다. 제6 단계에서, 단 프라이머 + 폴리모르피즘성 부위는 변성에 의해 제거되고 피에조전기 피펫을 사용하여 실리콘 웨이퍼로 전송된다[참조: O'Donnell et al., 1997]. 제7 단계에서, 이어서 프라이머 + 폴리모르피증성 부위의 질량은 지연된 추출 MALDI-TOF 질량 분광법에 의해 측정된다[참조: Li et al., 1996; Tang et al., 1995]. 서열에서 단일 염기 쌍 및 탠덤 반복 변종은 이들의 질량에 의해 용이하게 측정된다. 이러한 최종 단계는 매우 신속하고 검정당 단 5초가 필요하다. 이러한 모든 단계는 로보트적으로 자동화되어 있다. 이러한 기법은 1일 당 20,000 이하의 유전자형을 수행하는 잠재력을 갖는다.
이러한 기법은 신속하고 매우 정확하며 어떠한 폴리모르피즘에 대해서 적용가능하다. 이러합 기법은 훨씬 정확하고 단일 염기 쌍과 짧은 탠덤 반복 폴리모르피즘 둘 다를 확인할 수 있고, 시험될 폴리모르피즘의 첨가 또는 제거가 적은 비용으로 수 초에 완료될 수 있다는 점에서 칩 기법 이상의 중요한 장점을 갖는다.
폴리진 키트-진스크린(GeneScreen) 시험 키트: 본 원에서 제안된 다양한 유전자의 관점에서, 하기 표 2는 GENECHIP™ 개념을 기본으로 하는 잠재적 유전자-질환 키트를 상술한다.
RDS 행동에 대한 매우 위험한 사람들을 안전하게 확인하기 위해서 모든 이러한 유전자가 시험되어야 한다는 것이 본 발명자들의 제안이다. 다른 유전자가 발견됨에 따라, 이들 또한 시험될 것으로 기대된다. 시험을 위한 초기 계획은 단 수소수의 유전자가 시험 패널로 이루어지기 때문에 PCR™ 기법을 포함한다. 이러한 다른 유전자가 발견됨에 따라, 이들은 또한 GENECHIP™에 첨가될 것이라고 기대된다(참조: Affirmatrix, santa Clara, CA).
단계 5. 제5 단계는 유전자형이 최고 함량 스코어와 관련되고 최저 스코어와 관련된다고 나타내는 독립적인 연구를 기초로 하여 유전자형에 대한 스코어를 할당할 것이다. 유전자의 스코어링은 각 폴리모르피즘의 각각의 유전자형에 대한 평균 켈그렌(Kellgren) 스코어의 대소를 검사하기 위해 ANOVA의 사용을 기본으로 한다. 이러한 연구는 MAA에 대해 사용된 연구와 독립적인 한 세트의 대상에서 수행된다. 예를 들면, 도파민 D2수용체 유전자의 TaqⅠ A1/A2 폴리모르피즘, DRD2에서, 모든 연구에서는 1 대립형질이 충동적, 강박적, 부가적 행동의 범위와 관련이 있다고 나타나고, 일부 연구에서는 이형성 합성 유전자형, 12는 최고 스코어와 관련있고 11 및 22 유전자형은 최저 스코어와 관련있다고 나타낸다. 따라서, TaqⅠ A1/A2 폴리모르피즘을 사용하는 DRD2 유전자는 유전자형 22 또는 11 = 0으로서 및 유전자형 12=2로서 스코어된다. 독립적 연구가 22 유전자형이 정량적 특성에서 최저 스코어와, 12가 정량적 특성에서 중간 스코어와, 11이 최고 스코어와 관련되는 경우, 스코어링은 22=0, 12=1 및 11=2가 될 것이다.
많은 대립형질이 존재하는 경우까지도 디뉴클레오타이드 또는 트리뉴클리오타이드 폴리모르피즘이 사용되는 경우, 대립형질은 짧은 대립형질 대 긴 대립형질로 분해될 수 있다. 긴 대립형질이 최대 표현형 효과와 관련되는 경우, 스코어링은 SS=0, SL=1 및 LL=2일 것이고, S는 짧은 대립형질이고, L은 긴 대립형질이다.
단계 6. 각 유전자의 스코어를 진보적으로 첨가함으로써 더미 폴리유전자 또는 PG 변수를 정한다. 예를 들면, 경우 1에서, 검사된 제1 유전자에 대한 스코어가 2이고 제2 유전자에 대한 스코어가 1인 경우, PG 스코어 변수는 3일 것이다. 정량적 특성 변수 스코에에 대한 1 내지 n 경우에서, 상관 계수, r은 회긔 분석, 바람직하게는 어떠한 오프-더-셀프 통계 프로그램을 사용하여 측정된다. 분산의 %는 r2이다. 이어서, 경우 1 내지 n에서, 제3 유전자에 대한 유전자 스코어가 첨가되고 방법은 반복된다. 최종 결과를 플라팅한다.
단계 7. PG 대 QT 또는 DV의 비가변성 회귀 분석을 수행한다. 하기는 어떠한 정량적 특성 또는 이분성 변수에 대해서도 일반화된 하나의 예이다. 분석을 시작하기 전, 유전자 스코어(PG)에 대한 더미 변수는 0으로 고정한다. 이어서 각각의 추가의 유전자 스코어를 첨가하고 회귀 분석을 수행하고, 제2 유전자 스코어를 첨가하고 뢰귀 분석을 반복한다. 이는 시험된 모든 유전자가 첨가될 때까지 계속한다. 유전자 1 스코어가 1인 경우, PG 값은 2로 조정되거나 PG=PG+2로 조정된다. QT 또는 DV에 대한 PG의 회귀 분석을 수행한다. 유전자 2 스코어가 1인 경우, 이어서 PG 값은 대신 2로 조정되거나 PG=PG+2로 조정된다. 유전자 2 스코어가 첨가되는 경우, QT 또는 DV에 대한 PG의 회귀 분석을 다시 수행한다.
데이터를 분석하는 하나의 바람직한 방법은 오든 데이터를 SPSS와 같은 통계 팩키지에 도입시키는 것이다. 상기 단꼐 5에서 기술된 DRD2 유전자에 대한 값을 사용하여 SPSS 프로그램에 대한 신택스 파일을 개시하고 하기 샘플 알고리즘을 정한다.
컴퓨터 PG = 0
PG(DRD1이 1인) 경우 = PG+2
PG(DRD2가 2인) 경우 = PG+2
PG(DRD3이 2인) 경우 = PG+2
PG(DRD4가 2인) 경우 = PG+2
PG(DRD5가 1인) 경우 = PG+1
PG(DRD5가 2인) 경우 = PG+2
PG(DAT1이 1인) 경우 = PG+1
PG(DAT1이 2인) 경우 = PG+2
회귀 변수 = ADHD PG
/의존적 = ADHD
/방법 = PG에 입력
PG 변수는 0으로 정한다. DRD1, DRD2, DRD3 및 DRD4 유전자가 0 또는 2로서 스코어되기 때문에 피검자가 DRD1 DdeI 11 유전자형 및/또는 DRD2 TaqⅠ 12 유전자형 및/또는 DRD3 MscⅠ 11 또는 22 유전자형 및/또는 DRD4 46, 47 또는 77 유전자형을 수반하는 경우, 이들은 PG를 2로 증가시키는 단일 라인만을 필요로한다. 이에 비해 DRD5 및 DAT1 유전자가 1 또는 2로 스코어되는 경우 2라인의 코드를 필요로한다. 각 유전자가 첨가됨에 따라, 회귀 분석이 QTV(ADHD 스코어)데 대한 PG 스코어 대해 수행한다.
단계 8. 결과를 플라팅한다. 결과는 ADHD에 대한 첨가 및 감소 유전자를 나타내는 도 5의 라인에서 나타낸 바와 같이 X축에 점진적으로 첨가된 유전자를, Y축에 r2를 플라팅한다.
단계 9. 첨가 유전자만을 사용하여 방법을 반복한다. 이는 첨가 유전자를 나타내는 도 6의 라인에서 나타낸다.
RDS 관련된 행동의 치료
내인성 및 또는 외인성 신경펩타이드 및 핵 대위체에서 도파민 방출과 같은 신경전달자의 유효성을 증진시킴으로써 강장제에 대한 욕구를 감소시키는 특정 갈망-억제 물질은 이에 제한되지 않지만, 알콜, 코카인, 오피트, 니코틴, 글루코즈 또느 기타 당을 포함하는 강장제 물질에 대한 성적, 갬블링, 호전성 및 폭력성과 같은 작용뿐만 아니라 "RDS"라고 칭하는 탈선적 갈망 행동을 매우 감소시킨다. RDS 행동은 메소-변연계에서 신경전달자의 충분한 공급을 기본으로 하여, 일반적 유전적 기초를 갖는다. 보상의 최종 경로는 수용체 부위(D1, D2, D3, D4, D5 및 아유형)에서 도파민성 활성을 포함하고 이러한 수용체의 밀도는 도파민, 합성, 저장, 방출 및 대사에 대한 유전자 뿐만 아니라 이들 각각의 유전자에 의해 측정된다.
본 발명은 엔도케팔리나제 억제를 통한 시냅스성 도파민 방출의 증진의 용도와 키오토르핀(kyotorphin, Tyr-Arg) 또는 이의 안정한 동족체, TyrD-Arg과 같은 엔케팔린 방출제를 결합하고, D2 수용체 증식 또는 업-조절에 대해 유효한 D2 수용체의 만성 점유를 촉진하는 것을 제안한다(참조: Fitz et al., 1994).
본 발명은 부분적으로 폴리유전자 유전성의 개념을 포함하므로, RDS에 대한 높은 위험을 확인하기 위한 측정물로서 다중 유전자 위치의 개념을 촉진시킨다. 정량적 특성 유전자 위치를 포함하는 작업은 하나의 단일 유전자 매카니즘 원링에 대해 음성적으로 판명된 유전적으로 구별된 마우스 스트레인에서 연구한다. 15마리의 마우스는 알콜, 모르핀 및 메탐페타민에 대한 반응에 대해 시험한다. 이러한 마우스는 상이한 유전자가 상이한 중독 물질에 대한 감수성을 측정한다고 제안하는, 이러한 3종의 물질에 대한 상이하게 반응한다고 밝혀진다. 발견의 패턴은 알콜에 대해 유전적으로 영향받은 감수성은 단일 현상이 아니라고 추가로 제안된다. 오히려, 특정 반응 변수에 대해 특이적이라고 연구되었다(참조: Crabbe et al., 1994).
그러므로, 본 발명의 하나의 양태는 상기 특이적 유전자의 특정 유전자형이고, 하프로타입 프로필을 수득하기 위해, RDS 행동 또는 기타 다인성 특성에 기여할 것 같은 다른 유전자는 RDS, 관련된 행동 또는 다른 폴리유전자 특성의 목적하는 치료의 중요한 양태이다. 특이적 유전적 변종이 행동 장애와 관련된다고 확인되는 경우, 본 발명자들은 약리유전적으로 목적화된 치료에서 임상의들을 돕기위해 이러한 지식을 사용할 수 있다. 본 발명은 유전자형 및 전구체 아미노산 포딩, 엔도케팔리나제 억제, 엔케팔린-유도된 방출, 마취성 길항제의 용도와 갈망-억제 조성물로서 핵 대위에서 도파민의 차별적 증진을 위한 크롬 피콜리네이트 또는 니코티네이트를 연결시키는 것이다.
본 발명에서, 본 발명자들은 보상 케스케이드의(100개 이상 정도로 많을 수 있다) 분자의 발현에서 포함된 어떠한 유전자에서의 변질도 개인이 RDS 및 ADHD 및 폭력까지도 포함하는 관련된 행동으로 빠지기 쉽다고 제안한다. 상기가 사실일 수 있으나, 여기서 이것이 MAA 기법에 관한 것이라고 본 발명에서 상술할때까지는 특정 유전자가 함유된다고 예견하는 것은 매우 어렵다. 그러나, 적어도 D2 도파민 수용체 유전자의 역할에 대한 증거는 중요하고 본 발명자들은 D2 도파민 수용체 유전자가 RDS 및 관련된 행동에서 중요한 주된 "보상 유전자"를 나타낸다고 믿는다. 본 발명의 바람직한 양태는 TaqA1 DRD2 대립형질(A1, B1, C1, 엑손 6 내지 7 사이의 하플로타입 폴리모르피즘)과 목적 치료 결과(즉, 주의력 과정, 체중 회복 방지, 금연, 탄수화물 과다증의 감소, AMA 비율의 감소, 다물질 의존성의 경과 방지 및 폭력 행동의 감소 등)를 연결하는 것이다. 본 발명자들은 또한 특정 약물 부류에 최고로 반응해야 하는 상기 나열된 특이적 유전자를 기초로 하여 다수의 유사한 유전형의 예를 제공할 것이다.
신결전달자 보상-케스케이드 모형에서, 시상하부성 세로토닌 작동성 뉴런이 차례로, γ-아미도부티르산(GABA) 뉴런을 억제하고 이어서 복부의 테그멘텀의 DA 뉴런을 활성화시키는 메트-엔도케팔린작동성 뉴런을 자극하고 활성화시킨다. 이어서 이러한 DA 뉴런은 신경 전달자 DA가 제1 보상 기질로서 작용하는 해마상 융기의 클러스터 세포에서 Acb로 및 클러스터(Cluster) A1(CA1)로 투영된다(참조: Stein and Beluzzi, 1978).
이 복합 순환에서 핵 대위 및 에케팔린은 중요하다(참조: Heidreder et al., 1988). 선조체에서 DA 방출은 델타 수용체 촉지에 의해 조절되는 엔케팔리나제 억제제의 부분 적용 후 유도된다(참조: Chesselet et al., 1981). 사실, 케라토판(keratophan)은 또한 뇌 펨티아제에 의한 가능한 폴리사이스테르키닌-8(CCK-8) 분해에 대해 보호할 수 있다. 이러한 중요한 포만 신경펩타이드는 핵 대위에서의 DA와 공동 위치하고 CCK-8, DA 및 내인성 오피오이드 펩타이드 사이의 밀접한 상호작용이 있다(참조: Koob, 1992).
신경전달자 세로토닌(5-HT), DA, 노르에피네프린(NE) 및 에ㅌ케팔린은 단 음식물의 흡수를 억제한다고 알려져 있다. 따라서 본 발명의 조성물은 엔도케팔리나제 억제제 d-페닐알라닌 뿐만 아니라 1-트립토판(5-HT 전구체), 1-페닐알라닌(DA 및 NE 전구체)을 포함하는 전구체 아미노산의 로딩을 통해 특히 이러한 음식 억제 신경전달자를 증진시키도록 고안된다(참조: Blum et al., 1986).
본 발명자들은 현재 이러한 물질 카테고리의 효과를 확립하는 루위스 래트에 대한 연구를 수행하고 있다. 루위스 래트는 다물질 중독에 대한 성향을 갖는것 같고, RDS 행동에 대한 중요한 동물 모형로서 작용한다. 이에 관해, 사양한 용량 양생법 및 3종의 물질(D-페닐알라니[DPA], 날트렉손[NTX], Ty-d-Arg[TA])은 알콜, 코카인, 니코틴,대마초 또는 당의 자가 선택에 대해 사용된다. 3종의 물질을 함께 배합하면 다른 2종의 물질의 각각의 배합에 비해 가장 효과적이다(참조: 표 3).
RDS 치료용 조성물. 다양한 질환이 RDS에 포함된다고 분류되고 도파민성 시스템에 영향을 주지만, RDS 유사 질환을 겪고 있는 모든 개인을 치료할 수는 없다. 다수의 다른 시스템이 영향을 받을 수 있고 달성될 모든 성공을 위해 동시 치료를 필료로한다. 특히, 약물 또는 물질 남용을 포함하는 질환은 개별적으로 치료되어야 한다. 따라서, 전체적 치료는 피검자에세 유효량의 엔도케팔리나제 억제제, 엔케팔린 방출제 및 도파민성 시스템에 대한 아미노산 전구체을 제공함을 포함하지만, 추가의 성분은 치료의 전체적 효과를 증진시키는데 사용된다.
특정 치료제는 "유전자-D2 수용체 결핍 이론"에 의해 바람직하다. DRD2A1 단체는 낮은 수준의 DRD2 수용체를 갖는다고 널리 공지되어 있다. 스트레스 피검자가 현재의 사회에 적응하기 위해 이러한 수용체의 완전한 보충이 필요하다. 본 발명의 중요한 양태는 사실상 특히, D2A1 담체에서 D2 증식을 유도하기 위해 도파민을 자연적 방출시키기 위한, 특정 전구체 아미노산, 크롬 피콜리네이트 및/또는 크롬 니코티네이트와 같은 미량 금속, 엔케팔리나제 억제제, 마취성 길항제 및 에케팔린 방출제의 치료학적 양(단독 또는 배합으로)을 제공하는 것이다. 이의 일반적 개면은 이미 코카인 중독에서 시험되었다. 본 발명자에 의해 개발된 트로파민(TROPAMINE™)이라 칭하는 제형은 피검자에게서 연구되고 사용된다. 트로파민을 다른 약물과 비교하면 탈독성화 및 금단 유지 둘다의 관점에서 주로 잇점을 나타낸다(참조: Halikas et al., 1993). 표 4 참조.
본 발명의 양태의 성분은 피검자 유전자형을 우선으로하며, 이어서 그/그녀의 유전자형을 근거로 하여 적합한 혼합물을 수득한다. D2 기형에 의해, 발명자는 상기 적합한 혼합물을 개발하였다. 표 5는 개선된 특이한 유전자형으로서 본 발명의 조성물의 용도를 요약한다. 표 6 내지 16은 다양한 장애의 치료에 유용한 이들 조성물의 바람직한 성분을 나타낸다. 또한, 표 17 내지 19는 흥분제(코카인 등), 마취제, 진정-최면제에 의해 유도된 특이 성분의 작용 효과의 도식적인 개요를 나타낸다.
1제법은 표 6 내지 17에 나타나 있다.
2상호간의 조성물은 다음에 따라 제한된다: 6x일의 캡슐당 D-페닐알라닌 500mg; 6x일의 캡슐당 Tye-D-Arg 1mg; 1 내지 3일간의 캡슐당 날트렉손 50mg
*GABRB3 - 185 염기쌍 이상의 디뉴클레오티드 반복 동형접합
HTR1A - TC 다형성
HTR2A - C 대립형질(동형접합)
약어:
ADHD = 과활동성 장애 결핍 주의
DBPC = 이중맹, 위약-조절
PMS = 월경전기 증후군
POME = 프로피오멜란코르틴
OT = 공개 실험
주의 : 교차 증후군으로 일반화되어진 기본적인 작용 결핍 증후군 행동에 대하여, 발명자는 1일당 3회(식전에)의 "코어" 중성약리학적인 투여를 제시한다. 피검자가 중독적/충동적/강박적인 행동을 지속적인 형태를 갖는 경우, 발명자는 "코어" 중성약리학적 투여에 매일 적합한 횟수의 적합한 부가의 중성약리학적 패킷의 투여를 제시한다.
비만인 피검자에 대해, "코어" 중성약리학적인 투여를 위하여 그/그녀에게 지시된 백색 캡슐을 투여해야 한다. 피검자는 식전에는 오렌지색 캡슐이 주어진다.
니코틴 의존성 피검자에게는 취침시에 청색 캡슐이 주어진다.
* 수면 시간.
처리 방법
본 발명에서 D-페닐알라닌, D-루이신 및 하이드로시남산(참조: 표 6 내지 16)을 포함하는 모든 D-아미노산은 치료 제형을 포함한다. 추가로, 엔케팔리나제 억제제는 제형은 바시트라신, 베스타틴 및 푸로마이신과 같은 특정한 단백질 합성 억제제; D-형태의 기본적인 아미노산의 D-형태, 디- 및 트리펩티드의 단량 유리 형태 아미노산과 같은 펩티드 아미노산; 티올 벤질 아미노 산(2-[메르캅토-3-페닐-프로판오일]-L-루이신); 카복시알킬 메틸 에스테르(N-[(R,S)-2-카베톡시-3-페닐 프로판올]-L-루이신); 및 세코바르비톨, 피로포스페이트, O-페난트롤린, 포스파미돈, Z-루이신-NHOH 및 Z-글리신-NHOH와 같은 기타 많은 수의 구조적으로 연관되지 않은 화합물을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
추가로, 발명자는 엔케팔린 유리촉진제를 공급하는 것이 치료받는 피검자의 반응을 상당히 개선시킬 수 있다는 것을 깨달았다. 따라서, 엔케팔린 유리촉진제 Tyr-Arg 및 Tyr-D-Arg도 치료 제형에 포함된다.
수많은 유전적 대립형질과 다양한 충동성, 강박성 및 중독성 질환의 연관성은 정신자극제 뿐만 아니라 비-정신자극제 모두에의해 영향을 받아 도파민(DA)을 내측 핵 어컴벤스(Acb)로 우선적으로 방출시키는 공통된 기작이 있다는 것을 제안한다. 상기 기작의 유전적인 근거는 도파민성 유전자 및 조절 효소(D1-D5, DAT1, DβH, MAOA, COMT)의 하나 이상의 다형성을 포함한다: 따라서, 보상 캐스케이드(reward cascade)의 신경전달을 변환시키는 조성물(세로토닌, 엔케팔린, GABA 및 DA를 포함)이 물질 및 행동성 질환에 대해 유리한 효과를 가져야만 한다. 남용된 물질 및 행동성 질환은 알코올, 코가인, 니코틴, 글루코스, 캐나비스, 오피트 및 오피트 유도체, 도박, 성적 강박, 과활성, 만성 폭력행위 및 스트레스 질환 및 월경전 증상과 관련된 증상(PMS)을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
핵 어컴벤스에서의 도파민 방출을 유도하기 위해서는 궁극적으로 아편 중독활성이 관여한다. 따라서, 엔케팔린의 분해를 예방하는 엔켈팔리나제 억제제 및 엔케팔린의 방출제를 함께 배합함으로써 아편 중독 활성의 최대 증가를 제공할 것으로 예상된다.
상기 양태의 중요한 구성요소는 첫번째로 피검자를 유전형질을 분류하고 이의 유전형질을 근거로 적당한 칵테일을 제공하는 것이다. D2 아노말리에 관하여 본발명가는 본원에 기술된 적절한 칵테일을 개발하였다.
합성 효능제는 바람직한 치료제가 아니다. 주어진 효능제는 단지 자극시키고자 목적하는 특정 수용체 또는 세포가 아닌 다양한 수용체 또는 상이한 세포의 유사한 수용체에 작용할 수 있다. 약제에 대한 내성이 발생(다수의 수용체 및 약제에 대한 이의 친화성을 변화시킴으로써)할 수 있기 때문에 마찬가지로 효능제에 대한 내성이 발생할 수 있다. 특정 문제점, 예를 들어, 브로모크립틴 또는 메탐페타민 그 자체가 약물 의존성을 창출할 수 있다는 것이다. 브로모크립틴 모두가 레서스 몽키에 의해 자가 투여된 다는 것은 공지되어 있다[문헌참조: Woolverton, et al., 1984].
반대로, D-페닐알라닌(DPA)에서는 어떠한 내성이 관찰되지 않는다. 내성 및 의존성은 마우스에서 상기 물질을 에스.에렌프레이스(The Chicago Medical School)에 따라 하루 500mg/kg의 투여량으로 장기 투여시 나타나지 않는다.
또한 본원에서 제한된 배합물에 대한 추가의 이론은 방출제가 단지 이들이 방출할 무엇인가를 갖는 경우에만 효과적이라는 이해를 포함한다. 이들은 도파민 고갈의 상태를 치료하지 못한다. 실제로, 본 발명가는 도파민 방출제 스스로가 도파민의 만성 고갈을 악화시킬 것을 우려한다. 이러한 관점에서, 전구체는 천연적으로 조절되는 경로를 사용한다. 전구체는 단지 필요한 경우에만 신경 전달물질로서 전환되고 따라서 필요한 경우 신체는 산물을 분해한다.
선행 기술분야는 알콜중독 및 코카인 의존성의 치료에 있어서 욕구 억제 성분으로서 DPA의 사용을 포함한다. l-트립토판, l-글루타민 및 피리독살-5'와 배합된 DPA의 용도를 지적하는 블룸 그룹의 데이터가 존재하고 이것은 체충감량에 대한 90일 개방 시험을 기술하고 있다. 상기 연구에서, 보충 그룹은 대조구에서는 단지 10파운드인데 비해 평균 26파운드가 감량된다. 더욱이, 대조구의 81.8%와 비교하여 연구 그룹의 18.2% 만이 90일 동안 15파운드 이하로 감량한다. 이들 결과는 과체중인 개인이 산물의 혜택없이 피검자보다 2.7배의 체중이 감량된다는 것을 보여준다.
본 발명가는 2년 동안의 낮은 칼로리의 단식 프로그램에서 247명의 피검자의 한 그룹에서 DPA 및 또 다른 아미노산 및 미량 금속을 포함한 보충물을 취한 그룹이 센트럼 비타민 그룹(유일)과 비교하여 다음과 같은 사실을 보여준다: 1) 남성 및 여성 모두에 대한 과체중 %의 2배 감소; 2) 여성에 있어서 욕구의 70% 감소 및 남성에 있어서 63%의 감소; 3) 여성에 대한 과식에서 66% 감소 및 남성에 있어서는 41% 감소; 4) 연구그룹은 단식기간동안 감량된 체중의 14.7% 만을 회복한 반면에 대조구 그룹은 이의 체중 감량의 41.7%만이 회복됨; 및 5) 기호 역행 모델링은 보충물 치료, 여성 성, 질환성 비만 및 비만의 가계가 2년 후 체중 증가에 대한 유의적인 지침인 것을 밝힘.
상기 데이터는 DPA 단독 또는 또 다른 아미노산 전구체 및 크로뮴 피코티네이트 또는 니코티네이트와 같은 미량 금속과 배합된 DPA가 특히 체중 증가의 억제 또는 2년 동안 체중 감량의 회복을 소멸시키기 위한 능력에 대해 급진적인 효과를 나타낸다는 것을 보여준다. 과거에 시장에 판매되는 제품이 없었다는 것을 본 발명가가 인지한다는 것은 레덕스(Interneuron, Cambridge, MassR) 또는 패스틴(Smith/Kline Beacham, Philadelphia, PAR)과 관련된 관찰을 포함하는 상기 중요한 발견을 자랑할수 있다.
더욱이, 또 다른 연구는 비만인의 체중 감량을 어렵게하고 체중 감량 섭생을 중단한 후의 감량된 체중을 유지하기 힘들게 하는 기작의 이해에 기여하였다. 이들 연구는 신체가 주어진 체중을 방어하는 방법을 입증하였고 이것은 흔히 "셋- 포인트"로서 언급된다: 체중 감량 프로그램동안에 감소된 에너지 소비에 직면하여 산소 이용은 감소하고 위장 시스템이 음식물을 흡수하는데 보다 효과적이게 되고 타이로이드 호르몬 생산이 감소한다[문헌참조: Keesey, 1989]. 더욱이, 체중이 임의의 간섭의 영향을 상실함으로써 위생 또는 약제치료중 하나가 감소하여 많은 식이요법자가 기술하는 안정한 체중 또는 플라토를 유발하게되고 심지어 제중을 회복하게된다. 이러한 보충물과 관련하여 이것은 체중의 회복을 억제할 뿐만 아니라 플라토 효과를 극복한 것처럼 보인다.
단독으로 및 펜터민 대 펜칼TM과 배합된 펜플루라민에 대한 비교 연구.
d-펜플루라민과의 연구는 애드 리비튬 음식물이 정상 농도로 회복됨에도 불구하고 체중을 지속적으로 억합한다는 것을 밝혔다. 사람 및 동물 모두에서의 병력에 관한 연구는 약물 투여후 대사 활동의 증가를 입증하는데 실패하였다. 대신에 펜플루라민은 에너지 소비의 증강가 일어날때마다 에너지 소비를 강화시키는 것으로 나타났다. 이러한 약제는 사람 및 동물 모두에서 음식물의 열량 효과를 강화한다. 내성은 에너지 소비를 강화시키는 이의 능력을 발생시키는 것으로 나타나지 않지만 이것은 식욕부진으로서 작용하는 이의 능력에 대해서는 사실이 아니다[문헌참조: Levitsky and Troiano, 1992].
신규한 체중 산물을 고려하여 가장 중요한 치료 효과는 체중 감량의 회복 억제와 관련이 있어야한다. 사실 터너(Turner)는 지속적인 체중 감량은 체중 감량 전략의 목표이고 상기 작용과 관련된 현재의 증거를 근거로하여 d-펜플루라민이 내성의 발생없이, 상기 질환의 치료에 사용되는 또 다른 약리학적 제제의 장기간 사용을 제한하는 문제없이 12개월 이하의 기간동안 체중 감량 효과를 발휘한다고 제안하였다. 세로토닌성 시스템을 통한 d-펜플루라민 작용이 또 다른 체중 감량 전략에 만족할만하게 반응하지 못하는 피검자의 체중감량을 용이하게 하는 반면에 이에 따른 d-펜플루라민에 대해 보고된 오랜 기간의 연구는 계속적인 치료가 체중 감량을 유지하는 경우 심각한 과체중 피검자에게 요구된다. 체중 감량 회복의 억제에 대하여 d-펜플루라민이 또한 13 내지 25%의 다양한 1일 에너지 섭취의 감소를 통해 작용하는 것으로 나타났다. D-펜플루라민은 또한 유지방 음식물에 대한 욕구를 감소시킴으로써 작용한다. 여기에서 주목할 것은 d-암페타민 및 또 다른 자극제가 승인된 이후 처음에 FDA에서 일반적으로 승인한것 보다 심지어 펜칼 방식을 갖는 약제가 체중 감량에 대해 승인되었다. 본 발명가는 아미노산 전구체 로딩 및 엔켈팔리나제 억제를 사용하는 것에 대한 결과가 체중 증가의 억제에 가장 진일보한것이라고 믿고있다.
치료의 바람직한 양태.
RDS 행위자를 위한 기본적인 치료 섭생은 단독의 또는 배합된 하기의 물질중 하나 이상을 포함한다(표 20). 상기 목록은 약제 또는 "신경치료"(특정 방식에 대해 표 6 내지 16 참조)에 대한 관점에서 치료의 주요 구성 성분을 포함한다.
또 다른 엔케팔리나제 억제제가 치료방법에 유용한 것으로 사료되고 있다[문헌참조: 미국 특허 제5,189,064호, 미국 특허 제4,761,429호 및 캐나다 특허 제1,321,146호; 이들은 본원에 참조로서 인용되었다.
탄수화물 과식 또는 비만 억제 화합물.
이와 관련하여, 앞서 기술한 바와 같이 아미노산 로딩 및 엔케팔리나제 억제는 많은 유의적인 연관된 체중 문제에 영향을 미치고 가장 중요한 것은 2년 기간 후 회복되는 체중의 억제이다.
항-SUD 세부 프로토콜: 유전형질의 함수로서 알코트롤TM및 코코트롤TM.
최초 특허이후 개선된 방식을 사용하는 알콜 및 코카인 의존성 프로밴드 모두의 재발를 억제하는데 있어서 아미노산 전구체 로딩 및 엔케팔리나제 억제의 효과를 결정하기 위해 개방 시험 평가를 수행한다. 연구는 2년 동안 관찰되는 전체 280명의 피검자를 포함한다. 재발에 대한 기준은 자격있는 중독 전문가에 의해 평가된 바와 같이 프로밴드가 알콜 또는 코카인 중의 하나를 정규적으로 다시 사용하게 되는가의 여부이다. 피검자는 2개의 그룹으로 분류한다: 그룹 A = 유일한 원-A-데이(one-A-day) 비타민; 그룹 B = 알콜중독에 대해서 알코트롤TM의 변형체 및 코가인 중독에 대해서는 코코트롤TM의 변형체(방식을 위해 표 8 및 표 9 참조).
2년 후에 대조구 그룹에 전체 78명의 피검자들이 86% 재발율인 연구에서 2년 후에 재발한다는 것을 결정한다. 아미노산과 함께 전체 189명의 피검자 중에 어떠한 피검자도 재발하지 않거나 재발율이 0%이다. 그 결과는 SUD 피검자의 재발을 억제하는데 매우 양성적인 효과를 지적한다. 근본적으로 상기 효과는 통상적으로 회복하는데 12단계 방법을 포함한 전형적인 치료 설비에 참여한 피검자에게서 나타나는 결과를 증가시킨다.
알콜 및 코카인 남용자의 타이포그래피: 유전형질 A형 및 B형 프로밴드.
연구가는 알콜중독을 A형 및 B형으로 분류하거나 아유형화하는 개념을 테스트하였고 현재 코카인 남용을 연구하는데 유용한 개념을 밝혀냈다. 아유형화는 하나 이상의 공통된 특징을 갖는 개개인을 분류하고 연구하기 위한 시스템이다. 알콜중독을 아분류함으로써 알콜중독으로 발전할 수 있는 유전적, 개성, 및 환경적 위험 요소 뿐만 아니라 이들 위험 요소에 대항하는 회복력 간의 상호작용을 보다 이해할 수 있도록 한다.
알콜 남용은 A형 보다 B형 알콜중독자가 보다 심각하다. B형 안료중독이 몇몇 특성을 갖는다: 이것은 A형 보다 유전적인 요소와 보다 연관되어 있다; 이것은 남성들중에서 발생할 소지가 보다 가능성이 있다; B형은 보다 충동성이고 알콜 남용의 보다 강한 가계를 갖는 경향이 있다; 이들은 보다 어린시절 행동 질환 문제 및 보다 심각한 알콜 의존성, 다중약물 남용 및 정신적 질환, 특히 반사회적 개성을 갖는다.
코카인 남용자에 관하여, 알콜 또는 약물 남용의 가계와 같은 특정 취약성 요소는 코카인 사용자를 코카인 의존성 B형의 보다 독성 형태로 되게하는 경향이 있는 것처럼 보인다. 따라서, 이들 특징(A형)을 갖지 않는 또 다른 코카인 남용자는 유전적, 감수성 또는 정신적 영향과 관계되는 사회적 또는 환경적 영향으로 부터 이의 코카인 의존성이 보다 강하게 나타날 수 있다.
주요 3개의 특징, 예를 들어, 질환전 위험 요소(물질 남용에 대한 가계, 어린시절 행동 질환 및 ADHD, 감성 추구 시도 및 약물 남용을 시작하는 연령); 물질 남용 변수(코카인 사용 횟수, 과도한 코카인 사용 년수, 코카인 의존성 증상, 알콜 의존성 증상, 다중약물 용도 및 의학적 및 사회적 결과]; 및 정신적 문제[우울증 및 반사회성 질환 및 이들 정신적 문제의 중증도]의 중요한 특징들이 B형 코카인 남용자에게서 발견되었다[문헌참조: Ball et al, 1995].
더욱이, B형은 감성 추구, 공격성, 범죄, 폭력 및 사회 적응 손상의 평가에서 A형 보다 높게 기록된다. 또한, 전자 유형은 A형 코카인 남용자보다 보다 빈번하고 오랫동안 보다 과량의 코카인을 사용한다. 또한, B형은 이의 약물 사용으로부터 보다 큰 역효과[예: 무의식 및 폭력(우선적으로)]를 직면하게 되고, 이들은 금단 증상을 경감시키기 위해 보다 강도가 높은 추가의 약물 남용을 사용한다. B형 남용자는 소년기에 코카인에 연루된다: 처음으로 사용하고 과식하게 되며 정규적으로 사용하다가 매일 사용하게 되고 처음으로 중독증상을 나타냄.
코카인의 최초 사용 및 의존성간의 시간 간격에 대해 2개의 아유형간에는 어떠한 차이가 없다; 사용 경로(예: 흡입, 흡연 또는 주사); 시도 억제 용도로 사용되는 전략수; 및 불법의 역물 또는 알콜을 절제한 이전 기간. 흥미롭게도, 참가자의 절반 이상이 A형으로서 분류되었느나 이들 중에 입원 치료에 있어서는 A형 및 B형이 수가 거의 동등하다. 퇴원한 피검자 및 치료 받지 않은 참가자들 중에서는 75%가 A형이다.
본 발명의 한 측면에서, 알콜 및 코가인 남용자 둘 다에 대해서 이전에 확인된 B형 행동 마커와 함께 분자 유전학적 진단을 사용하는 새로운 연구를 보다 정확한 타이포그래프에 결부시키는 것이다. 새로운 유전학적 발견은 놀랍게도 B형과 연관된 변수와 일치한다[참조문헌: Ball et al., 1995]. DRD2 유전자와의 하기 연합은 그자체가 문헌[참조문헌: Ball et al., 1995]에서 제안된 B형 계수 모두와 친밀하게 연관된다. 제공된 증거는 도파민 D2 수용체 유전자의 다형성과 함께 비-히스파닉 코카시안을 유전 형질 분류하는 것과 관련된 다수의 연구로부터 나온다(표 20-A 참조).
ADHD와 함께 프로밴드의 주요 문제점은 이들이 포커싱과의 문제를 갖는다는 것이다. 본 발명가의 최근 연구는 칸트롤이라 불리우는 이의 방식중 하나는 전자생리학적 결과에 영향을 미친다는 것을 보여준다(표 6 참조).
이것은 사람에게 있어서 수행능력과 연관된 인식 사건-관련된 잠재력(ERP)에 대한 특정 아미노산 혼합물의 매일 주입 효과가 본 발명가에게 공지된 첫번째 보고이다. 인식 ERP는 정상적인 청년 지원자(여기서, 각각의 대상은 테스트전 및 아미노산 주입 28일 내지 30일후에 자신의 의지대로 통제될 수 있다)에 있어서 2개의 컴퓨터화된 가시적인 주의 태스크(visual attention task), 스패티얼 오리엔테이션 태스크(SOT) 및 컨틴전트 컨틴니우어스 퍼퍼먼스 태스크(Contingent Continuous Performance Task)(CCPT)에 의해 생성된다. ERP의 P300 성분의 통계학적으로 중요한 증폭 증가가 2개의 태스크(p ＜0.009)에 대한 조성물후 뿐만 아니라 인식 처리 속도(p ＜0.015)에 대한 개선을 보여준다. 정상적인 통제하에 상기 연구에서 관찰되는 신경학적 기능의 증가는 아미노산 보충물의 주입에 따른 RDS(예: 물 사용 질환, 주의 결핍 질환, 탄수화물 과식)를 사용한 개인의 회복 용이성과 일치한다.
상기 연구는 ADHD 프로밴드에서 성취되지 않는다. 그러나, 분석은 감소된 과대활동성에 관한 다수의 ADHD 케이스 보고 양성 결과로서 매우 강하고 아미노산 배합과 함께 학교 수업을 개선시킨다. 본 발명가는 DRD2 A1 대립형질이 또한 본 발명에서 이전에 지적된 바와 같이 P300 및 AER 및 VER에서의 비정상과 관련된다는 데이터를 갖는다. 또한 p300 파장에 대한 캐나비스에 대한 컴밍 연구를 참조한다. 이와 함께 특정 방식(하이퍼겐TM, 표 12 참조) 또는 하나 이상의 엔케팔리나제 억제제(dl-페닐알라닌)로 치료할 경우가 절실하다. 상기 분석을 사용하여 본 발명가는 또한 DRD2A 대립형질과 TOVA(이것은 현재 분석되고 있다)라 불리우는 표준 컴퓨터화된 ADHD 테스트간의 관계에 대한 데이터를 갖는다.
주의 처리 질환.
본 발명의 한 측면은 주의 처리 질환 및 또 다른 RDS 관련 증상을 치료하는 것이다. 본 발명가는 주의 처리가 신경전달물질 기능에 의해 지배된다는 사실과 임의의 특이적인 신경전달물질이 정상적인 뇌 인식 기능에 관여한다는 사실을 바탕으로 치료하고 이때 이것은 특정 전구체 아미노산에 의해 조절될 수 있다. 뇌의 전기생리학적 기능은 주의 처리에 관여하는 것으로 공지된 화학 매개물질의 생물유전학적 측면에서 이해한다.
최근 관심이 되는 한 분야가 알콜중독의 어린이(P300 파장으로 측정됨) 및 ADD/ADHD로 진단된 피검자의 불량한 포커싱 피검자에서 관찰된는 손상된 인식이다. 이와 관련하여 증거는 많은 파괴적인 유년기 및 청년기 행동성 질환(ADHD, 투렛 질환, 학습 불능, 물질 남용, 반대 성형 질호나 및 품행 질환을 포함)이 강한 유전적 성분을 갖는 상호 관련된 행동 스펙트럼중 일부이고 폴리-유전학적으로 유전되고 도파민, 세로토닌 및 또 다른 유전물질에 영향을 주는 공통된 다수의 유전자를 공유하며 부모 모두로부터 전달된다는 개념을 지지한다. 주의 결핍/과대활동성 질환에 대해 통찰하는 경우 ADHD는 자가 조절 또는 수행 기능 질환으로서 최선의 행동적으로 특징화된다는 개념을 지지한다. 해부학상의 신경 이미지 연구는 적절한 조절성 회로가 전두엽 피질 및 기본 신경절을 포함하고 이것은 중뇌로부터 도파민성 신경지배 및 효능제 활성 또는 도파민 방출에 의한 도파민성 수용체를 활성화시키는 자극 변형물에 의해 조절된다.
본 발명은 시냅스 도파민에 의한 점령을 통해 도파민 D2수용체의 증가를 촉진시킬 뿐만 아니라 PHD를 극복시키는 천연 도파민 방출을 유발할 수 있는 신경전달 물질 조절을 촉진하는 물질의 조성물(페닐알라닌의 사용 포함)을 제공한다.
세로토닌에 대한 전구체
세로토닌(5-하이드록시트립타민, 5HTP)은 CNS 신경전달 물질이다. 또한, 이것은 또한 장의 엔테로크로마핀 시스템 및 혈소판내에서 발견된다. 이러한 신경 화학물질은 처음에 L-트립토판을 하이드록실화하여 5-하이드록시트립토판을 수득한 다음, 이를 탈카복실화하여 세로토닌을 수득함으로써 생합성된다. 하이드록실화(율속 단계)는 효소 트립토판 하이드록실아제를 사용하여 수행되는 반면에 탈카복실화는 산재해 있는 효소 L-아로마틱산 데카복실라제를 사용하여 성취된다. 상기 효소는 조인자로서 피리독살 포스페이트를 필요로한다.
세로토닌은 모노아민 옥시다제에 의해 5-하이드록시인돌-아세트산으로 대사된다. 상기 대사물질은 뇨로 분비된다. 중추 뇌 세로토닌 기작은 기분 및 행위, 모터 활성, 급식의 억제 및 공복의 억제, 체온조절, 수면, 특정 환각 상태 및 시상하부 내에서 가능한 몇몇 신경엔도크린 억제에 있어 중요할 수 있다.
만성적인 코카인의 사용은 세로토닌 및 이의 대사물질의 농도를 감소시킨다. 코카인은 명백하게 세로토닌 전구체 트립토판의 섭취를 감소시킴으로써 세로토닌의 합성을 감소시킨다. 또한, 코카인은 트립토판 하이드록실라제 활성을 감소시킨다. 따라서 코카인은 세로토닌성 작용을 감소시킨다[참조: Reith et al., 1985].
세로토닌을 고갈시키는 약물(펜플루라민, PCPA 또는 5-7-DHT)을 사용한 랫트의 치료는 시상하부의 엔케팔린 및 엔돌핀의 함량을 증가시키지만 뇌 부위에서는 증가시키지 않는다. mRNA 또는 전구체-프로-엔케팔린(PE) 또는 프로피오멜라노코르틴 중 하나의 함량에 변화가 없기 때문에 세로토닌 작용성 전달은 합성에 영향없이 아편성 펩타이드 사용을 조절하는 것으로 제안된다[문헌참조: Schwartz et al., 1985].
이러한 발견은 엔케팔린의 감소된 방출이 도파민 활성을 감소시켜 우울증로서 나타난다는 가설을 지지한다. 심한 운동을 하고 나서 특정의 행동 결핍은 통증, 우울증 및 수면 질환으로 나타난다. L-트립토판과 함께 세로토닌성 전달의 회복은 적극적인 기분의 회복을 돕는다. 식이에 트립토판을 제공하는 것, 예를 들면, 전구체 로딩은 세포토닌 및 관련 화합물의 뇌 대사에 명확한 효과를 갖는다고 밝혀졌다[참조: Moir and Eccleston, 1968]. 뇌 세로토닌 함량은 플라즈마 트립토판 양에 좌우될 수 있다[참조: Fernstorom and wurtman, 1971]. 트립토판이 부족한 식이를 주입받은 랫트는 뇌에 낮은 세로토닌 농도를 갖고 L-트립토판은 상기 결핍을 회복시킨다. 트립토핀이 혈액으로 주입되는 경우 뇌의 트립토판 및 세로토닌의 농도는 각각 9배 및 2배로 상승한다. 우울증 및 불면증을 앓는 신경성 피검자에게 트립토판의 투입은 피질의 트립토판 농도를 6배 상승시킨다[참조: Gillman et al., 1981]
8명의 건강한 남성에 대한 이중맹 교차 연구에서 트립토판(50mg/kg) 및 티로신(100mg/kg) 또는 위약을 비교한다[참조: Lieberman et al., 1983]. 티로신이 아닌 트립토판은 유의적으로 통증 분별력을 감소시킨다. 또 다른 연구는 트립토판이 임상적인 통증[참조: Seltzer et al., 1983)을 감소시키고 편두통[참조: Poloni et al., 1974]을 억제하며 무통증 내성[참조: Hosobuchi et al., 1980]을 역전시킨다. 이것은 세로토닌성 활성을 통해 트립토판이 엔돌핀성 방출을 증가시켜 무통증을 증가시키는 것으로 나타났다.
티로신 하이드록실라제와 같지 않게 정상적인 생리학적 조건하에서 트립토판 하이드록실아제는 포화되지 않고, 예를 들어 효소는 완전히 작용하지 않아 트립토판 하이드록실라제 활성이 L-트립토판에 의해 영향을 받는다. 유용한 유리 L-트립토판의 양은 뇌 및 시냅스전의 말단에서 이의 취득율에서 혈장내 L-트립토판을 순환시키는 농도를 포함한 다양한 인자에 의존한다. 본 발명가는 코카인에 의해 파괴된 세로토닌 시스템을 회복하기 위해 L-트립토판 또는 5-HTP의 사용을 고려하고 있다.
5HTP는 치료제로서 유용하지 않다. L-트립토판의 뇌로의 진입 속도는 혈장내 유리 결합된 트립토판의 비율에 의존하고 이러한 비율은 천연 아미노산, 인슐린 및 약제의 혈액 농도에 영향을 받으며 이들은 혈장 단백질 결합 부위 뿐만 아니라 트립토판-취득 부위에 대해 서로 경쟁한다. 또한, 5HTP는 5HT 뉴런 이외의 뉴런에 의해 취득되고 다라서 5HT 합성의 증가는 선택적으로 세로토닌 뉴런에 국한된다.
5HT 합성에 관여하는 효소의 억제제는 비가역적인 트립토판 하이드록실라제 억제제(DL-파라클로로페닐알라닌, 6-플루로트립토판 및 L-프로필도라세트아미드) 및 5HTP 데카복실라제(카르비도파 및 1-메틸-5HTP)의 억제제를 포함한다. 세로토닌은 활성 전위 및 약물에 응답하는 배출작용의 과정에 의해 시냅스 간극으로 방출될 수 있다. 용이한 5HT의 방출은 코카인, (+)암페타민, 메탐페타민, 펜플루라민, 파라클로람페타민, 클로리미프라민(클로미프라민) 및 아미트리프틸린을 사용하여 성취될 수 있다.
3개 유형의 5HT 수용체(5HT-1, -2 및 -3)가 제안되었다. 5HT 수용체 효능제는 LSD, 퀴파진, N,N-디메틸-트립타민(DMT)을 포함한다. 5HT 수용체 길항제는 사이프로헵타딘, 메티세르기데, LSD, 2-브로모-CSD(BOL), 케탄세린, 크실아미딘, 시난세린 및 1-(-)-코카인을 포함한다. 5HT의 불활성화는 시넵스 간극으로부터 시냅스전 뉴런으로 이동하는 5HT를 제거하기 위해 존재하는 고친화성 에너지 의존성 활성-수송 기작이 관여한다.
5HT의 뉴런성 취득의 억제제는 트리사이클릭 항우울증제(이미프라민, 데시미프라민, 아미트리프틸린, 클로리미프라민, 플루복사민); 펜플루라민(식욕감퇴제) 및 코카인을 포함한다. 저장중에 결합되지 않은 임의의 5HT는 MAO에 의해 대사물질로 전환될 것이다. 그러나, MAO가 억제되는 경우, 세로토닌은 O-메틸-트랜스퍼라제(COMT)에 의해 N-메틸 또는 N-N-디메틸로 대사된다.
아편성 펩타이드의 증진제/방출제
본 발명의 한 측면은 뉴로펩티딜 오피트의 파괴를 억제하는 물질의 사용이다. 이들 오피트는 도파민의 합성 및 방출을 촉진한다. 오피트형 물질의 동물로의 투여는 선조체의 DA 생합성 및 대사 속도를 증가시키고 이러한 효과는 흑질선조체 도파민성 말단상에 위치한 특정 오피트 수용체에 의해 매개된다[참조: Clouet et al., 1970; Biggio et al., 1978; Regiawi 1980]. B-엔돌핀 또는 엔케팔린의 만성적인 투여시 도파민성 내성이 나타난다[참조: Iwatsubo et al., 1975; Arden, 1972]. 시냅스전 DA 수용체는 내성 동물에서 매우 민감하다[참조: Schwartz et al., 1978].
코카인은 또한 아편성 작용에 영향을 미친다. 코카인의 랫트에 대한 만성적인 노출과 함께, 날록손 결합의 투여량-의존 변화가 관찰된다. 오피트 수용체 밀도는 유의적으로 몇몇 뇌 구조에서 감소되는 반면에 후측 시상하부에서는 증가한다. 오피트 결합은 특이적으로 "회귀 센터"에 영향을 주지만 다른 영역에는 영향을 주지 못한다[참조: Hammer et al., 1987]. 추가로 또 다른 연구에서 날록손은 뇌의 회귀 센터에 코카인의 임계 저하 작용을 효과적으로 차단시킨다[참조: Bain and Korwetsky, 1987]. 더욱이, 코카인은 특정 오피트의 무통각 작용에 영향을 주는 것으로 나타난다[참조: Misra et al., 1987]. 본 발명가는 코카인의 보강 작용을 만성 코카인 노출에 의해 변환되는 뇌 회귀 센터에서 오피트 시스템에 의해 부분적으로 매개될 수 있는 것으로 믿는다.
중독성 약물은 다양한 "오피트 수용체"에서 작용하는 것으로 밝혀졌다. 뇌 및 따른 신경 조직은 내인성 아편제(EO)를 소유한 것으로 밝혀졌다. 관련된 펜타펩타이드, 메티오닌 및 루이신-엔케팔린은 뇌에서 동정된다[참조: Hughes et al., 1975]. 엔케팔린은 델타 및 뮤 수용체 모두를 활성화시키는 반면에 베타 엔톨핀은 입실론 수용체를 활성화시킨다. 내분비학자는 뇌하수체 호르몬으로서 인지된 B-리포트로핀(B-LPH)이 5개의 아미노산의 Met-엔케팔린 서열을 함유하고 B-LPH가 할성 아편제, B-엔돌핀으로 가수분해된다는 것을 보여줄 수 있다[참조: Li et al., 1976].
현재, 모든 펩타이드가 N-말단에 서열 Tyr-Gly-Gly-Phe-X를 포함한다 할지라도 본 발명가는 상이한 기원 및 상이한 기능을 갖는 EO의 3개 이상의 화학적 계열에 대해서 알고있다. 엔돌핀 계열은 큰 전구체, 프로-오피오코르틴, B-LPH 및 B-엔돌핀을 포함한다. 2번째 계열의 EO는 엔케팔린 계열이다. [Met]엔케팔린 및 [Leu]-엔케팔린은 2개의 서열을 포함하는 큰 펩타이드 전구체로부터 유도된다. 엔케팔린의 카복실 말단에 부착된 하나 또는 2개의 염기성 아미노산을 갖는 헥사- 및 헵타- 펩타이드 및 헵타 펩타이드; [Met]엔케팔린-Arg-Phe는 천연적으로 존재하는 중간체인 것처럼 보인다[참조: Hexum et al., 1980]. 세번째 계열은 카파 효능제, 예를 들어, 디노르핀 1-13 및 1-17이다. 이들 CNS 성분은 모르핀 작용을 길항한다, 디노르핀은 N-말단을 형성하는 Leu-엔케팔린의 전구체로서 작용할 수 있다; 서브엔돌핀 형태(E5)로의 전환은 수용체(카파 내지 델타) 친화력을 변화시키고 이것은 효소 조절 리간드 발현을 위해 가능한 신규 조절 역할을 설명한다.
각각의 계열의 펩타이드는 신경전달물질 및 신경호르몬으로서 작용하는 것 처럼 보인다. 펜타펩타이드 엔케팔린은 신경 말단에 위치하고 자극시 뉴런으로부터 방출된다. Leu- 및 Met-엔케팔린은 아드레날 메듈러로부터 혈액으로 방출되고 신경호르몬으로서 작용한다. 베타 엔돌핀은 뇌하수체 선으로부터 혈액으로 방출되고 이것은 뇌의 뚜렷한 영역에서 신경 전달물질로서 작용할 수 있다[참조: Bloom et al., 1978]. 엔돌핀 및 엔케팔린 모두는 EO가 사람 또는 동물에게 투여되는 경우 중독성 무통각 약물에 의해 제조되는 것과 유사하게 내성, 의존성 및 절제를 포함하는 생화학적 및 약리학적 반응을 일으킨다. 중독성 약물과 같은 내인성 오피트는 아편제 부류의 구성원이다. 엔케팔린(E5)를 분해하는 효소는 일반적으로 "엔케팔린아제"로 불리운다.
조직이 펜타펩티디딜 엔케팔린(E5)를 대사시키는 다양한 펩타이드를 포함한다는 것은 잘 확립되어 있다. 엔케팔린아제와 같은 효소는 가용성 및 특정 결합 아미노펩티다제[참조: Hersh, 1981] 및 펩티딜 디펩티다제 또는 메탈로엔도펩티다제[참조: Benuck et al., 1982; Schwartz et al., 1980]와 같은 Gly3-Phe4 부위에서 작용하는 것들을 포함한다. 메탈로효소 카복시펩티다제 A는 엔케팔린의 Tyr-Gly-Gly-C 및 말단 디펩타이드 Met-Phe 또는 Leu-Phe를 절단한다. 메탈로엔도펩티다제가 주요 엔케팔린아제인 것으로 밝혀졌다 할지라도 생물성 아민과 같지 않게 단일 효소는 표적 부위를 불활성화시키고 엔케팔린의 분해에는 다중 효소가 관여한다. 하기의 도식은 E5 분해와 연과된 효소의 작용 부위를 설명한다.
분해를 취급하기 위한 한가지 전략은 E5 대용품을 제공하는 것이다. 엔케팔린에 대해 몇몇 화학적 변형은 조직 효소에 의한 분해를 차단시키는데 요구된다. 이들은 a) 메티오닌 엔케팔린아제의 티로신 변형된 동족체가 분해에 내성을 갖는 것과 같은 N-말단-Tyr의 변형체[참조: Coy and Kastin, 1980]; b) 아미노 펩티다제의 효과를 차단시키기위한 2번 위치에 D-아미노산의 존재 및/또는 c) 펩티딜 디펩티다제 또는 Gly3-Phe4 결합에서 작용하는 효소의 작용을 차단하기 위한 3 내지 5번 위치에서의 D-아미노산의 변형 또는 존재를 포함한다. 또 다른 동족체는 뮤 효능제로서 D-Ala-엔케팔라미드 또는 FK 33-824; 델타 효능제로서 엔켈팔린-Arg-Phe 및 카파 효능제인 디노르핀 1-13 또는 1-17를 포함한다[참조: Wisler et al., 1981].
현재에 추천된 E5 효능제인 이들 제제가 강력한 중독성, 내성 및 이의 임상학적 용도와 관련된 또 다른 독성학적 문제를 갖고 있는지의 여부는 알려지지 않았다. 추정된 많은 이들 변형된 중독성 특성, 효소 내성 대용품은 유의적으로 이의 임상적인 용도를 저하시킨다.
생체내에서의 엔케팔린 또는 엔도르핀 작용을 증진시키는 또 다른 바람직한 전략은 특정 효소 억제제를 사용하는 것이다. 특정 엔케팔린 단편(Gly-Gly-Phe-Met 또는 Gly-Gly-Phe-Leu, Phe-Met, Phe-Leu)은 엔케팔린의 억제제로서 작용할 수 있고 보다 큰 엔케팔린계 형태 또한 억제 특성을 갖는다.
본 발명에 있어서, 용어 "엔케팔리나제 억제제"는 비제한적으로 D-페닐알라닌(DPA), DL-페닐알라닌(DLPA), 하이드로신남산 및 D-아미노산(예: D-루이신)을 포함한다. 특정 단백질 합성 억제제(바시트라신, 베스타틴 및 푸로마이신), 펩타이드 아미노산(유리 D-형 모노아미노산, D-형태의 필수 아미노산의 디- 및 트리펩타이드, 티올 벤질 아미노산(예: 2-[머캅토-3-페닐프로파노일]-L-루이신), 카복실 알킬 메틸 에스테르, N-[(R,S)-2-카브에톡시-3-[페닐 프로판올]-L 루이신), 벤조모르판-엔카팔린 등, 세코바르비탈, 피로포스페이트, o-페난트롤린, 포스파미돈, Z-루이신-NHOH 및 Z-글리신-NHOH와 같은 구조적으로 관련되지 않은 화합물로 이루어진 그룹으로부터 선택된 기타 엔케팔리나제 억제제들이 있다. 디펩타이드 D-Phe-D-Leu 및 D-Phe-D-Met, 및 폴리펩타이드 L-Tyr-Gly-Gly-D-Phe-D-Leu 및 L-Tyr-Gly-Gly-D-Phe-D-Met, D-Phe, D-Leu 및 하이드로신남산이 특히 중요하다.
D-페닐알라닌은 카복시펩티디제 A를 억제하는 것으로 공지되어 있고[참조: Hartruck and Lipscomb, 1971], 보다 최근에는 항우울 작용[참조: Beckmann et al., 1977] 뿐만 아니라 진통 특성을 갖는 것으로 밝혀졌다[참조: Ehrenpreis et al., 1978; Della Bella et al., 1979].
D-페닐알라닌의 엔케팔리나제 억제제로서의 능력을 평가하기 위해서, 당해 화합물이 래트의 장내 점막에서 올리고펩타이드(D-Ala2-D-Leu5) 엔케팔린(DAPLE) 및 Tyr-D-Ala-Gly-Phe(TAAGP)의 분해를 실질적으로 상당히 감소시키는 것으로 제시되었다[참조: Gail et al., 1983]. 그러나, D-페닐알라닌은 송아지 뇌로부터 수득한 엔케팔리나제 A 및 엔케팔리나제 B 활성 둘 다에 대한 억제 활성에 대한 생체내 연구에 있어서 훨씬 덜 효과적이다[참조: Amsterdam et al., 1983]. 흥미롭게도, 디펩타이드 D-Phe-Tyr을 형성시키기 위해 하나의 아미노산을 첨가하는 경우에도, 억제 능력이 현저하게 증진된다.
D-페닐알라닌은 엔케팔린과 B-엔도르핀 둘 다의 분해를 억제하는 것으로 밝혀졌다. 이는 B-엔도르핀을 조절하는 효소에 비해 엔케팔린 분해를 조절하는 효소에 대해 더 잘 작용한다. 이의 활성은 또한 조직 특이성인데, 시상하부에서는, 엔케팔리나제가 80% 억제되고, 엔도르피나제가 5% 억제되고, 피질에서는 엔케팔리나제는 60% 억제되지만 엔도르피나제는 18%만 억제되며, 선조체에서는 엔케팔리나제는 78% 억제되고 엔도르피나제는 10% 억제되며, 척수에서는 엔케팔리나제는 84% 억제되고 엔도르피나제는 40% 억제된다[참조: Ehrenpreis et al., 1981]. 다른 연구는 DPA 주입 후 90분 이내에 트리플링된 [Met]-엔케팔린의 실제 CNS가 증가하고 6일 후에도 높게 유지됨을 보여준다[참조: Balagot et al., 1983]. 마우스의 뇌에서의 다른 [Met]-엔케팔린의 증가는 D-페닐알라닌의 공지된 대사물질인 하이드로신남산과 유사한 것으로 밝혀졌다.
본 발명의 또 다른 양태는 엔케팔리나제 억제제와 엔케팔린 방출제를 합하는 것이다. 이에 대한 근본원리는 이렇게 함으로써 발명자가 엔케팔린의 이의 각각의 오피트 수용체 부위(예: δ 및 μ)에 대한 효과를 상당히 증진시킬 수 있다는 것이다. 이러한 목적을 수행하기 위해서, 래트 뇌의 선조체 절단시 시냅토솜에서의 세포내 칼슘을 증진시키고 진통제인 것으로 밝혀진 펩타이드 Tyr-Arg(키오토르핀) 또는 이의 안정한 동족체 Tyr-D-Arg를 사용하는 것이 유리하다. 이들 물질은 공지된 메카니즘에 의해 작용하는 추정상의 메티오닌-엔케팔린 방출제이다[참조: Ueda et al., 1986].
엔케팔리나제를 억제하고 신경 엔케팔린 방출을 증진시키기 위해서, 키오토르핀(Tyr-Arg)으로서 공지된 물질을 1일 투여량 15㎍ 내지 15mg으로 사용할 수 있다[Takagi et al., 1979]. 1일 투여량 15㎍ 내지 15mg의 보다 안정한 동족체 Tyr-D-Arg는 엔케팔린 방출제로서 치환될 수 있다[참조: Tajima et al., 1980; Ueda et al., 1985]. 따라서, 엔케팔린 방출제는 엔케팔리나제 억제제와 합해져서 시냅스에서의 높은 엔케팔린 활성을 달성하여 류로날 도파민의 방출을 추가로 증가시킬 수 있다. 이는 "대체 치료"의 형태로 작용하고 코카인에 대한 "갈망"을 감소시킬 것이며, 다른 RDS 행동이 본 명세서에 기재되어 있다. 이러한 치료는 코카인 독성 제거 후 12개월 동안 가장 유용하다.
γ-부티르산에 대한 전구체(GABA).
GABA는 도파민의 방출을 조절하는 억제 신경전달자이다[참조: Gessa et al., 1985]. 이는 알콜 음용중지 동안 발작 활성을 감소시키는 것 같다. γ-아미노부티르산(GABA)에 대한 주요 합성 경로는 글루탐산 데카복실라제(GAD)에 의한 L-글루탐산의 데카복실화를 통해서이다. 다른 아미노산 데카복실라제와 같이, 이 효소도 조인자로서 비타민 B6(피리독살 포스페이트)을 필요로 한다. GAD는 주로 시냅스 GABA 신경 말단의 세포질에서 발견된다. GABA 합성의 기본 조절은 GABA 합성시 속도 제한 단계인 것 같은 GAD이다. GABA는 최종 생성물 억제에 의해 FAD 활성에 영향을 미칠 수 있다. 포화 농도의 L-글루탐산이 스냅스전 뉴런에 존재한다; 따라서, 증가된 기질 농도는 정상적으로 GABA 합성 속도에 영향을 미치지 않는다. 그러므로, L-글루탐산을 외부로부터 투여하는 것은, L-글루탐산 농도가 비정상적으로 낮지 않다면, 신경전달자 GABA를 현저하게 증가시킬 수 없다. 그러나, 상이한 알콜 자극을 갖는 성장한 알비노 래트에게 물과 함께 글루타민(1일 500ng/kg)을 10일간 투여함으로써 뇌 속의 글루타메이트, GABA 및 타우린 함량을 상당히 증가시켰다[참조: Blum et al., 1991]. 글루타민은 뇌로부터 암모니아를 전달하는 데 있어서 활성 중간체이므로, 신경 조직에서 상이한 아미노산의 이화작용에 대단한 영향을 미칠 수 있다[참조: Ostrovsky, 1984]. 탈아민화 후, 글루타민은 글루타메이트의 전구체가 될 수 있고, 이에 따라 GABA의 전구체도 될 수 있다[참조: Thawki et al., 1983].
2가지 형태 이상의 GABA 수용체가 존재한다: 비쿠쿨린 및 피크로톡신 또는 피크로톡시닌의 경쟁 차단 활성에 민감한 GABA-A 수용체. 이들 수용체들은 시냅스후 구조물 상에 존재하고 GABA의 전형적인 억제 활성을 매개하고; GABA-B 수용체는 시냅스전 말단에 위치하고 비쿠쿨린의 차단제 활성에 민감하지 않다. GABA-B 수용체는 CNS에서의 GABA의 방출을 조절할 뿐만 아니라, 교감신경 시스템에서 특정 부위로부터의 NE의 방출을 조절할 수 있다.
몇몇 임상 기능 부전이 운동 질환, 헌팅턴 무도병, 간질 및 알콜 중독과 같은 GABA 시스템과 관련될 수 있는 것으로 제안되었다. GABA 수용체의 GABA에 대한 친화도의 변화, 벤조디아제핀에 대한 벤조디아제핀 결합 부위 및/또는 바르비투레이트에 대한 바르비투레이트 결합 부위가 단백질 "GABA-모둘린"에 의해 조절된다. GABA-모둘린은 아데닐레이트 사이클라제에 결합된 수용체과 연관된 GTP 조절자 단백질과 유사하다. GABA-모둘린의 활성은 포스포릴화에 의해 결정된다.
GABA는 통상적으로 시상 하부, 해마, 뇌의 기본 신경절, 척수의 등 각의 아교질 및 망막의 짧은 억제 뉴런과 연관되어 있다. CNS 속에서의 몇몇 긴 축삭 돌기 경로는 GABA 활성과 연관된 것으로 확인되었다.
GABA 작용물질은 이미다졸 아세트산, 3-아미노프로판 설폰산 및 THIP(4,5,6,7-테트라하이드로-이소야졸로-[415-C]-피리딘-3-올), 및 무유방 무스카리아(amanita muscaria)에서 발견된 무스시몰(muscimol)(3-하이드록시-5-아미노-메틸이속사졸)을 포함한다. GABA 길항제는 비쿠쿨린, 피크로톡신, 피트로톡시닌 및 벤질페니실린을 포함한다.
방출된 GABA를 세포외 공간으로부터 이를 제거함으로써 불활성화하는 신경교 원소 및 시냅스전 GABA 신경 말단에 존재하는 고친화도 나트륨 의존성 흡수 시스템이 있다. GABA 흡수 억제제는 신경 흡수형으로 디아미노부티르산 및 cis-2,3-아미노사이클로헥산, 카복실산을 포함하고 신경교 흡수형으로 B-알라닌을 포함하고, 이종혼합 흡수형으로 니페코트산, 벤조디아제핀, 뉴롤렙틱스 및 트리사이클릭 항우울제를 포함한다.
방출 및 수용체 상호작용 후에 시냅스전 뉴런으로 회수된 GABA는 잠재적으로 재사용가능한 전달자로서 재순환된다. GABA는 신경 말단 및 신경교 조직 둘 다에서 효소에 의해 대사되어 A-옥소글루탐산의 존재하에 미토콘드리아 효소 GABA 아미노트랜스퍼라제(GABA-T)에 의해 숙신산 세미알데히드로 전환된다. 형성된 숙신산은 트리카복실산(크렙스) 사이클로 도입된다. GABA-T는 조인자로서 피리독살 포스페이트를 필요로 한다. 숙신산 세미알데히드는 조인자로서 NAD와 NADH를 또한 포함하는 효소 숙신산 세미알데히드 데하이드로게나제에 의해 숙신산으로 신속하게 산화된다. RDS에 대한 발명자의 공식은 이러한 사실을 피리독살-5-포스페이트를 산화-환원 경로의 촉진제로서 가함으로써 고려한다.
이와 관련하여, GABA 농도는 사람을 포함하는 동물에게 다음 GABA-T 억제제를 투여함으로써 증가된다: 에탄올로아민-P-설페이트, γ-아세틸렌성 GABA, γ-비닐 GABA, 가브쿠쿨린, 하이다지노프로피온산, 나트륨 디-N-프로필아세테이트(나트륨 발프로에이트) 및 아미노옥시아세트산(비타민 B6 억제제), L-글루타민[참조: Bloom, 1985].
카테콜아민(도파민, 노르에피네프린)에 대한 전구체.
카테콜아민 도파민(DA), 노르에피네프린(NE) 및 에피네프린(E)은 모두 신결전달자이다. 카테콜아민은 벤젠 환 위에 2개의 인접하는 하이드록실(OH) 그룹을 갖는 화합물이다. 인체에서, 이러한 물질은 효소 티로신 하이드록실라제에 의해 L-3,4-디하이드록시페닐알라닌(L-도파)으로 하이드록실화된 방향족 아미노산 L-티로신으로부터 합성된다. L-티로신은 노르아드레날린 신경 말단으로 활성적으로 흡수된다. L-페닐알라닌은 L-티로신의 전구체이다[참조: Blum and Kozlowski, 1990; Schwartz et al., 1992].
티로신 하이드록실라제는 노르아드레날린성 뉴런의 세포질 속에 위치하고 NE 합성시의 속도 제한 효소이다. 광범위한 조사로 감소된 프페리딘 조인자, 분자 산소 및 철 이온이 모두 활성을 위해서 필요한 것으로 드러났다. 세포질에서, L-도파는 L-방향족 아미노산 데카복실라제에 의해 DA로 데카복실화되는데, 이 효소는 조인자로서 피리독살 포스페이트(비타민 B6)를 필요로 한다. 도파민(DA)은 DA가 효소 도파민-B 하이드록실라제에 의해 하이드록실화되어 노르에피네프린(NE)을 형성시키는 입상 저장 낭으로 활성적으로 흡수된다. 이 효소는 구리, 분자 산소 및 아스코르브산을 조인자로서 필요로 한다. CNS 속의 몇몇 뉴런들에서, NE는 효소 페닐에탄올아민-N-메틸트랜스퍼라제에 의해 에피네프린(E)으로 추가로 전환된다.
티로신 하이드록실라제 활성은 다음에 의해 영향을 받는다: L-티로신의 L-도파로의 전환속도를 감소시키는 신경 말단에서의 증가된 농도의 NE에 의해 유발되는 "최종 생성물" 억제; NE의 합성을 증가시키는 CNS로부터의 증가된 교감 활성; 매개된 안지오텐신 II에 의한 NE 합성 속도 증가; 시냅스전 말단에 위치하는 아드레날린 수용체를 포함하는 메카니즘에 의한 NE 방출 속도를 변화시키는 아드레노-수용체의 작용물질(예: 클로니딘) 및 차단제(예: 펜톨아민).
NE 합성 효소의 억제제는 메틸-p-티로신(이는 티로신 하이드록실라제를 억제한다), 카르비도파(이는 CNS 외부 조직에서 방향족 아미노산 데카복실라제를 억제한다), 디에틸디티오카보네이트, FAI63 및 디설피람(이는 도파민-B-하이드록실라제의 억제제이다)을 포함한다.
NE는 신경 말단 속에 다중 저장 복합체로 하나 이상의 해부 위치에 저장되어 있다. NE 저장 유형의 한가지 형태는 노르아드레날린 신경 말단 속의 소포에서 발견된 입상 복합체이다. 입상 복합체는 ATP에 결합된 NE, 집합적으로 크로모그라닌이라고 하는 몇개의 단백질로 이루어지고, 도파민-B-하이드록실라제 및 Mg++, Zn++및 Cu++를 포함한다.
저장 소포로의 DA와 NE의 흡수는 에너지 공급원으로서의 ATP와 Mg++의존성인 ATP아제 효소를 활성화하는 Mg++를 필요로 하는 활성 수송 과정이다. 이러한 저장 소포로의 NE와 DA의 Mg++의존성 흡수 과정은 독립적이고 Na.sup.+ /K.sup.+ -ATP아제 의존성인 신경 세포막을 가로지르는 NE에 대한 신경 흡수 과정과 상이한 과정이다.
NE-ATP-단백질-이온 저장 복합체의 안정성은 Mg++의 킬레이터로서 작용하는 몇몇 화합물에 의해 저해될 수 있다. 이는 때때로 만성 코카인 남용자에게서 발견되는 메카니즘 부족과 연결될 수 있다. 이에 대하여, 만성 코카인 투여는 NE 전환을 증가시킨다.
신경 말단으로부터의 NE의 방출은 칼슘 의존성인 세포외유출 과정에 의해 일어나는데, 이에 의해 플라즈마 막과 NE, ATP, 도파민-B 하이드록실라제 및 크로모그라닌으로 이루어진 소포 함유물과 소포막과의 융합물은 시냅스 열로 방출된다. 시냅스후 수용체에 대한 NE의 유용성을 조절하는 것으로 공지되어 있는 하나의 메카니즘은 NE가 방출되는 말단에 위치하는 시냅스전 수용체를 통해 작동된다. 시냅스 열에서의 NE의 작용은 시냅스전 신경 말단에서 발견되는 흡수 시스템에 의한 시냅스 열로부터의 제거로 종결된다. NE-흡수 I 및 흡수 II의 2가지 유형의 신경 흡수가 있다.
흡수 I은 나트륨 의존성 ATP아제에 의해 분해되는 ATP를 필요로 하는 에너지 의존성이다. 이는 고친화도 과정인데, 이는 시냅스 열로부터 낮은 농도의 NE를 제거시 효과적임을 의미한다. 신경 흡수 시스템은 NE를 신경 말단으로 전달한다. 신경 말단 내부에서, 대부분의 NE는 저장 낭으로 흡수된다. 이 과정의 억제제는 코카인, 트리사이클릭 항우울제, 암페타민 및 티라민을 포함한다.
흡수 II는 비신경 조직에 의한 NE의 축적을 수반한다. 부신 수질의 자극으로 또는 카테콜아민의 정맥내 주사로 유도된 고 플라즈마 농도의 NE는 간, 근육 및 결합조직과 같은 비신경 조직으로의 흡수에 의해 제거될 것이다. NE 또는 기타 카테콜아민은 순환으로 역확산되거나, 보다 통상적으로는 효소들 모노아민 옥시다제(MAO)와 카테콜-O-메틸트랜스퍼라제(COMT)에 의해 세포내에서 파괴된다.
MAO는 미토콘드리아를 함유하는 모든 조직에서 발견되고 이들의 외부 막에 결합되어 있다. MAO는 간, 뇌, 신경, 근육 및 모든 활성적으로 대사하는 조직에 존재한다. 이는 NE를 c, 4-디하이드록시만델산으로 산화적으로 탈아민화한 후, O-메틸화에 의해(COMT에 의해) 3-메톡시-4-하이드록시-만델산을 형성시킬 수 있다. MAO는 실제로 조직 분포, 기질 특이성, 억제제 특이성 및 물리적 특성이 상이한 동위효소 그룹을 나타낸다. 예를 들면, MAO A는 NE와 5HT에 대한 기질 호의성을 갖고, 클로르길린(clorgyline)에 의해 선택적으로 억제된다. MAO B는 올로파민과 페닐에틸아민에 대한 기질 호의성을 갖고 데프레닐(셀레길린)에 의해 선택적으로 억제된다. 익히 공지된 다른 MAO 억제제로는 이프로니아지드, 니알라미드, 파르길린, 트란클라프로민 및 페넬진이 있다.
COMT는 간 세포에서 대량으로 발견된다. CNS에서, COMT는 신경 재흡수에 의해 불활성화되지 않은 E 및 NE에 대해 작용한다. 파이로갈롤(pyrogallol) 억제제는 S-아데노실-L-메티오닌으로부터의 메틸 그룹의 NE, E 및 DA의 카테콜 환의 3' 위치의 하이드록실 그룹으로의 COMT 의존성 전달을 차단함으로써 작용한다. 도파민은 NE와 E의 전구체이며 CNS와 자율신경계의 몇몇 신경절에서 중요한 역할을 한다.
신경 내의 대량의 DA는 최종 생성물 억제에 의해 티로신 하이드록실라제를 억제하고, 이에 의해 DA 합성 속도는 감소된다. 또한, DA 합성시 속도 제한 단계는 티로신 하이드록실라제에 의한 티로신의 L-도파로의 전환 단계이다. 정상 상태하에 티로신 하이드록실라제는 L-티로신으로 완전히 포화됨으로써 순환성 티로신의 양을 증가시켜 DA 합성 속도를 증가시키지 않는다. 그러나, 이러한 사실은 DA 양이 부족한 경우와 티로신 하이드록실라제가 코카인의 영양하에서와 같이 보충되는 경우에 변한다.
L-도파는 CNS에서 DA 뉴런으로 활성적으로 흡수되고, CNS서, DA로 전환된다. L-도파 처리후, 합성되고 저장된 DA의 양이 상당히 증가한다. 도파민 작용성 시스템과 비교해 보면, L-도파 치료후 NE의 합성이 비교적 거의 증가하지 않았다.
도파민은 저장 과립으로 저장되는데, 이 경우에 카테콜아민은 크로모그라닌, 2가 금속 이온 및 ATP와 착체화된다. DA는 세포외 유출에 의해 시냅스 열로 방출되는 것으로 믿어진다. NE와 같이, 이는 칼슘 의존성 과정이고, 신경 말단에 도달하는 작용 포텐셜 및 약물에 대한 반응으로 발생한다. 다음 물질은 DA 방출을 증가시킬 수 있다: 코카인, (+)-암페타민, 메틸암페타민, 티라민, 아만타딘, m-펜페트라진, 펜터민 및 노미펜신. DA 방출을 일으키는 이외에 이들 화합물은 DA의 신경 재흡수를 상이한 정도로 억제할 수 있다.
DA가 시냅스 열로 방출된 후, 이의 작용은 고친화성인 에너지 의존성 활성 전달 과정인 신경 재흡수 시스템에 의해 종결된다. 이 시스템은 NE에 대해 이미 기술한 시스템과 유사하다. MAO와 COMT 둘 다는 DA의 3,4-디하이드록시페닐아세트산(DOPAC)과 동형바닐산(HVA, 3-메톡시-4-하이드록시-페닐아세트산)으로의 변형의 원인이 된다. 코카인은 DA의 시냅스전 신경 말단으로의 재흡수를 차단함으로써 DA를 시냅스 열로 방출시키는 작용을 연장시킨다.
뇌에서의 티로신의 양 증가는 뇌에서의 L-DOPA의 합성을 증가시킨다. L-DOPA는 또한 도파민으로 대사된다. 도파민의 합성 및 방출은 티로신 투여후 증가된다. 카테콜라민의 양을 증가시키지 않으면서 식이 티로신은 도파민과 노르에피네프린의 회전 및 방출을 증가시킨다. 스트레스, 감기 및 몇몇 약물은 신경 점화의 증가를 유발하여 신경 말단에서의 카테콜아민의 양을 낮춘다.
L-페닐알라닌은 신경전달자인 도파민과 노르에피네프린의 합성을 위한 전구체인 필수 아미노산이다. 이들 신경전달자들은, 이의 대사물질, HVA, DOPAC 및 MHPH에 의해 측정된 바와 같이, 격렬한 운동 기간 및 물리적 항속 기간 동안 상당히 변형된다. L-페닐알라닌은 L-티로신 또는 L-도파 대신에 또는 이들과 배합되어 사용되어 코카인 남용에 의해 소모된 후 도파민 보존량을 회복한다.
이들 전구체의 사용은 도파민작용성 방출제, 차단제, 작용물질 또는 길항제 또는 도파민, 노르에피네프린 또는 에피네프린의 재흡수 또는 분해에 영향을 미치는 제제로 치료하는 적합한 단계에 보충될 수 있다. 그러나, 보다 중요하게는, 합성 및 방출을 포함하는 도파민 활성의 전 범위는 몇몇 오피오이드 펩타이드(예: 엔케팔린 및 엔도르핀)에 의해 어느 정도 조절된다. 중점적으로 투여된 오피오이드 펩타이드(예: 엔케팔린 및 엔도르핀)는 동물 및 사람의 혈액 플라즈마 속에서의 카테콜아민의 양을 증가시킨다[참조: Clouet, 1982]. 사실, 시냅스전 도파민 수용체를 차단함으로써 B-엔도르핀 방출을 증진시킬 수 있는데, 이는 독특한 상호 관계를 보여준다. 전구체로서 사용될 수 있는 화합물은 L-티로신, L-페닐알라닌, 파르말린이다.
로디올라 로시 추출물(Phodiola Rhosea extract; 파르말린).
로디올라 로시 또는 골든 루트(Golden Root)는 북극과 고산 지역에서 생장하는 오르핀(크라설라시에)족 다년생 초본 식물이다. 동시베리아 디엔 스데인의 알타이 산맥과 극동에서 로디올라 로시는 성공적으로 재배된다. 씨앗으로부터 그리고 영양 방법으로 이를 재생산할 수 있다[참조: Polozhy et al., 1985; Saratikov and Krasnov, 1987]. 근경은 페놀 화합물들을 함유하는데, 그중에서도 로디올라 제제의 생물학적 활성을 결정하는 p-옥시페닐에탄올(티라졸) 및 이의 글리코사이드 살리드로사이드가 가장 중요하다[참조: Saratikav et al., 1968]. 로디올라는 자극적인 적응 특성을 갖는다. 이 화합물은 물리적 작용을 수행하고 피로를 감소시키고 연장된 근육 노동 후 회복 기간의 단축 및 심근 활성을 정상화하는 능력을 향상시킨다. 격렬한 근육 노동 시간 동안, 로디올라는 산화 포스포릴화, 지질의 근육 활성 안정화, 골격 근육에서의 대사 지시자의 향상(아미나실-t-RNA-합성효소의 활성), RNA 함량의 증가 및 근육, 특히 뇌로의 혈액 공급 증가 과정을 최적화함으로써 뇌와 근육에서의 현미해부 포스페이트의 손실을 방지한다[참조: Saratikov et al., 1968; Saratikov, 1974]. 로디올라는 어텐션 스팬(attention span), 기억력을 증가시키고, 정신 작업을 향상시키고 수행된 작업을 증진시킬 수 있다. 이러한 활성과 관련된 뇌 영역은 시상피질과 후 시상하부이다[참조: Marina et al., 1973]. 로디올라에 대한 여러가지 다른 작용이 주지되어 있는데, 고형당증 및 저혈당증, 백혈구 증가 및 백혈구 감소, 용혈 및 적혈구감소증, 산소압저하의 발달을 방지하고, 스트레스를 감소시키고 심장 보호 작용을 갖는다. 로디올라의 스트레스 조절 효과는 하이포피소-아드레날 및 오피오드작용성 시스템에 대한 효과를 정상화하는 것을 수반한다. 또한, 로디올라는 기관의 항종양 저항을 증가시키는 것으로 밝혀졌다. 이는 실험용 종양의 성장을 상당히 억제하고 이의 신진대사의 빈도를 감소시키고, 상습적인 종양을 갖는 동물의 생존 가능성을 연장시키고 자발적인 종양의 성과를 감소시킨다[참조: Dementyeva and Yaremenko, 1983]. 로디올라가 또한 신경증을 감소시키고 극도의 피로와 싸우는 몇가지 증거가 있다[Saratikov, 1977].
살리드로시드(salidrosid)(로디올라의 추출물).
30mg/kg의 살리드로시드(SAL)는 동물 뇌에서의 NE의 디설피람 유발된 질환을 예방한다. SAL은 COMT와 MAO의 활성을 억제하는 능력을 통해 뇌의 NE에 영향을 준다. SAL은 카테콜아민과 세로토닌의 전구체에 대한 블러드 브레인 배리어(Blood Brain Barrier; BBB)의 침투성을 감소시키고, 이러한 특성은 SAL을 특히 주의력 프로세싱 질환의 치료에 대한 양태에 있어서 조성물에 유용하도록 한다. 0.2mg/kg의 로도신(이는 SAL, 아글리콘 p-티로졸 및 로사빈을 함유한다)의 투여는 신피질에서의 DOPA, 도파민(DA) 및 5-HT의 뇌 농도를 증가시키고 온전한 마우스의 뇌 속의 꼬리가 있는 핵 속의 NE의 농도 감소를 증가시키고, 피하 주사한 지 30분 후 SAL은 에피네프린(EPI)과 DOPA의 양을 변화시키지 않았고; 30mg/kg의 투여량에서는 NE의 함량을 26% 감소시키고 5-HT는 15% 감소시켰으며; 100mg/kg의 투여량에서는 NE, DA 및 5-HT의 농도를 각각 20%, 28% 및 23% 감소시켰다. 마우스에 대한 L-도파(50mg/kg) 및 50 HTP(100mg/kg) 투여를 수반하는 연구에서, 실리드로시드(30mg/kg)는 살린-도파-5HT 대조 그룹에 비해 동물의 외부로부터의 DOPA 및 세로토닌을 각각 26% 및 13% 증가시키는 것으로 나타났다. 이러한 데이타는 당해 제제가 카테콜아민 전구체에 대한 블러드 브레인 차단벽의 침투성을 증가시킴을 나타낸다. 또한, 페트코프(Petkov; 1981) 연구에 따르면, SAL은 MOA 활성을 감소시키고 COMT 활성을 억제함으로써 O-메틸화 및 산화적 탈아민화에 의한 카테콜아민의 불활성을 늦춘다. 또한, 연구들은 SAL이 5-HTP 데카복실라제의 활성을 변화시키지 않음을 보여준다. 결과적으로, 이는 5-HTP로부터의 세로토닌의 합성에 영향을 주지 않지만, MAO를 약간 억제함으로써 아민의 생체변형을 늦출 수 있다. 명백하게, 5-HTP와 SAL의 조합 투여를 수반하는 연구에서 뇌 속에서의 세로토닌의 성장의 증가는 5-HTP에 대한 블러드 브레인 차단벽의 침투성을 증가시키는 SAL의 능력에 의해 지배된다.
문헌에는, 로디올라와 신경전달자 역학과의 다수의 상호작용을 드러내고 있다. 요컨데, n.아쿰벤스에서의 도파민의 감소; 시상하부에서의 5-HT의 증가; 해마에서의 NE의 증가; 및 콜린 수용체의 작용물질 활성이 보고되어 있다. 몇몇 메카니즘은 인지면에서 각종 신경전달자의 특수 역할에 관련된 신경학에 수용된다. 콜린작용성 메카니즘은 기억력 트레이스의 고정의 기초가 된다. 뇌의 노르아드레날린성 시스템은 양성 강화를 증진시킨다. 세로토닌작용성 메카니즘은 기억 강화 과정과 보다 많이 관련된다.
래트에서의 로디올라의 효과는 음성 및 양성 강화를 갖는 몇가지 활성 회피 방법을 사용하여 연구된다. 음성(형벌) 강화를 갖는 미로 방법을 사용하여 래트당 0.10ml의 단일 투여량의 로디올라 추출물이 인식을 향상시키고 24시간 후까지 보유시키는 것으로 밝혀졌다. 장기간 기억력의 상당한 향상은 동일 투여량의 추출물로 치료한 지 10일 후에 행한 기억력 시험으로 확립된다. 래트당 0.10ml의 투여량의 로디올라 추출물은 양성(음식) 강화를 사용한 "계단(staircase)" 방법을 사용하는 훈련 과정에 대한 유리한 효과를 갖는다. 대조적으로, 로디올라 추출물이 래트당 0.01ml의 투여량으로 사용되는 기타 방법의 경우에 인식 및 기억력에 대한 실질적인 효과를 갖지 못하고 이러한 알콜-수성 추출물의 불일치를 나타낸다.
알비노 래트를 사용하여 발작성 전기 쇼크의 기억력 손상 작용에 대한 메클로페녹세이트 및 로디올라의 효과를 연구한다[Lazarova et al., 1986]. 한편, 5일 동안 체중 kg당 100mg의 투여량으로 경구적으로 투여된 메클로페녹세이트는 훈련 기간의 종결 후 3시간 및 24시간 후 기억력 시험시 발작성 전기쇼크 후에 관찰되는 퇴행성 기억상실증을 예방한다. 대조적으로, 10일 동안 래트당 0.10ml의 투여량으로 경구적으로 투여된 로디올라 추출물은, 다른 실험적 접근시 인식 및 기억력은 향상시키지만, 이 경우에는 비효과적인 것으로 나타났다.
후페르진(Huperzine). 후페르진은 아세틸콜리네스테라제로서 공지된 부류에 속하는 화합물이다. 이는 중요한 신경전달자인 아세틸콜린 또는 인식 및 기억력에 중요한 것으로 믿어지는 뇌 화학물질의 분해의 원인이 되는 효소를 억제하는 것으로 나타났다. 후페르진은 원래 석송 후페르진 세라타로부터 분리된 천연 화합물이다. 이는 중국의 민간 요법에 사용되고, 보다 최근에는 노인성 기억력 질환의 치료와 같이 중국에서 수행되는 제한된 임상 시험에서 사용된다. 특정 피검자들에게서 인식 및 기억력을 향상시킨다는 결과가 제안되었다. 그러나, 이들 제안된 결과들은 임상 시험에 의해 입증되지 않았다. 이 천연 물질은 주의 과정에 영향을 미치는 본 특허에서 청구된 물질의 조성물과 함께 사용하기 위해 주시된다. 사람에 있어서, 기억을 증진시키기 위해서 권장되는 투여량은 1일 150㎍이다(치료제의 범위는 1일 1.50 내지 1,500meg이다).
소코폴라민에 의해 유발된 기억력 손상에 대한 후페르진 A의 효과는 방사상 미로 임무(radial maze task)를 사용하여 평가하고 생체내에서의 콜리네스테라제의 억제율을 E2020 및 타크린의 효과와 비교한다. 스코폴아민(0.2mg/kg)은 래트에 있어서 공간 기억력을 상당히 손상시킨다. 후페르진 A(0.1 내지 0.4mg/kg, 경구 투여), E2020(0.5 내지 1.0mg/kg, 경구 투여) 및 타크린(1.0 내지 2.0mg/kg, 경구 투여)은 이들 스코폴아민 유발된 기억력 결함을 역전시킬 수 있다. 비색 정량분석 방법으로 측정된 부티릴콜리네스테라제에 대한 후페라진 A, E2020 및 카트린 대 아세틸콜리네스테라제의 비는 각각 884.57, 489.05 및 0.80이다. 이러한 결과는 후페르진 A가 가장 선택적인 아세틸콜린테라제 억제제이고, 스코폴아민에 의해 유발된 진행중인 기억력 결함을 E2020 또는 타크린보다 상당히 향상시킴을 입증하고, 이는 후페르진 A가 알쯔하이머병을 앓는 피검자에 있어서의 인식 손상의 임상 치료를 위한 유망한 제제일 수 있음을 의미한다[Cheng et al., 1996].
신규하고 강력하고 가역적이며 선택적인 아세틸콜리네스테라제(AChE) 억제제인 후페르진 A는 알쯔하이머병을 앓고 있는 피검자에 있어서의 기억력 결함의 치료를 위한 다른 AChE 억제제보다 우수할 것으로 예상된다. AF64A 처리된 래트의 방사상 미로에서의 수행에 대한 후페르진 A의 효과를 평가한다[Zhi et al., 1995]. AF64A(측면당 1nmol, i.c.v.)는 래트의 공간적인 작업상 기억 임무를 수행하는 능력에 상당한 손상을 유발한다. 이러한 행동 손상은 해마 속의 콜린아세틸트랜스퍼라제(ChAT)의 활성을 상당히 감소시키는 것과 관련된다. 후페르진 A(0.4 내지 0.5mg/kg, 복강내 투여)는 AF64A 유발된 기억력 결함을 상당히 경감시킨다. 이러한 결과는 AF64A가 해마의 콜린성 작용을 변화시킴으로써 작업상 기억 과정을 붕괴시키는 데 유용한 제제이고 이러한 손상은 후페르진 A에 의해 효과적으로 경감됨을 제안한다[Zhi et al., 1995].
후페라존(HuperazoneTM)의 주요 성분은 알쯔하이머병을 치료하는 데 사용되는, 석송의 독점 추출물인 후페르지아 세라타(Huperzia serrata)이다. 중국에서 수행된 연구는 이 추출물 속의 활성 물질인 후페르진 A가 알쯔하이머병에 대한 유망한 신규 치료제임을 보여준다. 다른 연구들은 후페르진 A가 CNS로의 침투성이 우수하고 생체내 반감기가 현저한 우수한 아세틸콜리네스테라제(ACheE) 억제제임을 보여준다. 중국에서 수행된 2회의 이중맹검 시행은 후페르진 A가 알쯔하이머병의 장기간 치료에 안전하고 효과적임을 입증했다. AChE 억제제로서의 이의 활성 이외에 후페르진 A는 다른 신경보호 작용을 갖는 사실이 최근 발견되었고, 후페르진 A는 래트 신생아 해마와 소뇌 뉴런의 배양액에서 글루타메이트 유발된 세포독성을 억제하며, 후페르진 A는 신경 배양액의 수지상결정 성장을 촉진시킨다.
알쯔하이머병은 정상 활성 및 생존 능력을 위해 아세틸콜린 및 아세틸콜린 에스테라제에 의존하는 뉴런의 기형 및 퇴화를 특징으로 한다. 기본 전뇌에 위치하는 이들 세포들은 파키슨병과 같은 다른 신경 질환에 관련된다. 후페르진 A는 코그넥스(CognexR)에 대한 활성이 우수한 아세틸콜린 에스테라제의 강력한 억제제인데, 이는 알쯔하이머병에 대해 미국에서 처음으로 허가된 약물이며 E2020은 에이사이 파마슈티칼(Eisai Pharmaceutical)에 의해 허가되었다. 또한, 후페르진 A는 엑사이토아미노산 글루타메이트에 의해 초래된 사망자로부터의 배양액 속에서 신경 세포를 보호하는 것으로 밝혀졌다. 후페르진 A의 이중 약리학적 작용으로 인해 후페르존은 주의력 부족 및 노인성 기억력 감퇴의 치료에 대해 독특하고 중요한 활성을 제공한다. 후페르진 A의 독물학 및 효능 연구는 사람 치료 투여량의 50 내지 100배로 투여하는 경우에도 비독성을 나타낸다. 추출물은 2㎍/kg의 투여량에서 현저한 부작용없이 6시간 동안 활성이다.
알쯔하이머병에 있어서, 160명의 피검자에 대한 이중맹검 조절된 연구에서 1일 2회의 단지 150㎍의 투여량(3 내지 5㎍/kg)으로 웨슐러 스케일 결과에 의해 측정된 바에 따르면 상당한 향상을 나타낸다. 후페르진 A를 플라시보(placebo)와 비교하는 간병인에 의한 피검자의 평가에 있어서, 플라시보를 투여한 11인의 피검자는 후페르진 A를 투여한 26인의 피검자에 비해 분명한 상기(headedness)에 있어서 향상된 것으로 보고되었고, 플라시보를 투여한 8인의 피검자는 후페르진 A를 투여한 16인의 피검자에 비해 기억력이 향상된 것으로 입증되었으며 1인의 피검자는 후페르진 A를 투여한 8인의 피검자에 비해 언어기능이 향상된 것으로 입증되었다.
후페르진 A를 투여한 피검자와 피라세탐(piracetam)을 투여한 피검자간의 기억력 향상 비교시, 피라세탐을 투여한 피검자 50%가 후페르진 A를 투여한 피검자 85%에 비해 기억력이 향상된 것으로 입증되었고, 피라세탐을 투여한 피검자 30%는 후페르진 A를 투여한 피검자 70%에 비해 기억력이 현저하게 향상된 것으로 입증되었으며, 피라세탐을 투여한 피검자 50%는 기억력이 향상되지 않은 것으로 입증된 반면, 후페르진을 투여한 피검자는 15%만이 기억력이 향상되지 않은 것으로 입증되었다.
후페르진 A의 2개의 중요한 특성이 이를 코그넥스 및 E2020 뿐만 아니라 개발되고 있는 다른 실험 화합물과 구별짓는다. 후페르진 A는 인체의 다른 곳에서 발견되는 AChE에 비해 뇌의 아세틸콜린 에스테라제(AChE)에 대해 매우 특이성을 나타낸다. 이러한 선택성은 추출물의 비교적 낮은 독성의 원인이 되는 것으로 믿어진다. 또한, 알쯔하이머병을 위한 약물로 허가된 2개의 약물, 즉 코그넥스 및 E2020과는 달리, 후페르진 A는 무스카린 수용체 M1과 M2와 같이 부작용을 일으킬 수 있는 CNS 속의 수용체에 대한 결합성이 부족한 것으로 밝혀졌다.
3시간의 후페르진 A의 작용 지속시간은 코그넥스(2시간)와 파이소스티그민(30분)보다 우수하다. 동물에 대한 인식 및 기억력 증진에 대한 행동 연구에서, 기억력 및 인식에 효과적인 추출물의 양과 비독성효과 투여량(독성 연구로부터)간의 차는 30 내지 100배이다. 이들 데이타는 후페르진 A가 최소의 부작용으로 알쯔하이머병을 치료하는 데 유용할 수 있음을 강력하게 제안한다.
크롬 염(예: 피콜리네이트, 니코티네이트 등). 식이 크롬은 사람의 영양 섭취에 있어서 가치가 결정적으로 보고된 필수 영양분이다. 크롬에 대한 관심은, 크롬이 필수적인 트레이스 무기염류가고 인슐린에 대한 조인자이기 때문에, 이는 인슐린 작용에 대한 이의 강한 효과에 의해 글루코즈, 지질 및 아미노산 대사에서 작용을 할 수 있다. 이러한 논거를 지지하는 것은 크롬 결핍은 글루코즈 내성을 손상시키고, 인슐린 내성을 손상시키고, 혈액내 글루코즈 양을 증가시키고, 유형 11 당뇨병의 증상에 대한 관찰사항이며; 또한 생리학적 활성 형태의 크롬의 적합한 양은 사람의 인슐린 필요량을 감소시킬 수 있다[Kaats et al., 1996].
국가 과학 협회는 크롬을 필수 트레이스 무기염류로서 분류하고 50 내지 200㎍의 1일 섭취량을 권장한다. 그러나, 가장 신뢰할 만한 연구는 미국인들에 대한 섭취량(이는 다른 국가와도 유사하다)은 최적량 이하인데, 여자에 대해서는 최소 40%이고 남자에 대해서는 최소 60%인 것으로 보고되었다. 글루코즈, 인슐린 및 지질 양의 향상되고, 글루코즈 내성이 손상된 집에서 생활하는 피검자, 콜레스테롤 수준이 증가된 성인, 인슐린 및 저혈당 피검자에 대한 크롬 보충시 유리한 효과를 보고하는 25인의 연구가 있다[Mertz, 1992].
크롬의 생체이용가능성을 증가시키기 위해서 몇몇 연구는 트립토판의 천연 대사 유도체인 피콜리네이트산을 사용할 것을 제안하였다. 피콜리네이트 산은 장과 혈액 속에서 트레이스 금속 이온과 결합하여 필수 트레이스 금속의 수집 및 사용을 용이하게 하는 것으로 보인다[Evans and Bowman, 1992].
인체 지방의 부착이 인슐린에 의해 부분적으로 조절되는 것으로 보이기 때문에, 인슐린 사용이 증가되면 지방 부착이 감소되어야 한다. 인슐린의 효과를 증진시키는 것은, 인슐린이 아미노산을 근육 세포로 향하게 하기 때문에 근육 조직에 대한 긍정적인 효과를 가질 수 있고; 일단 아미노산이 근육 세포로 도입되면, 이들은 세포의 유전 물질, 즉 DNA 및 RNA에 대한 인슐린의 효과를 통해 단백질로 모인다. 크롬의 이러한 효과는, 이렇게 함으로써 발린 또는 루이신과 같은 아미노산의 경쟁을 감소시켜 아미노산 트립토판의 양을 증가시킬 수 있기 때문에 본 발명에 있어서 중요하다[Wurtman, 1982]. 인슐린은 또한 구성 조직에 유용한 단백질을 증가시키는 순수한 효과를 갖는 생체 단백질의 분해 또는 이화작용을 늦춘다. 크롬은 지방 부재 물질(FFM)의 유지 또는 첨가를 매우 용이하게 할 수 있다. CrP가 인슐린 내성을 낮출 수 있는 경우, 인슐린 내성 또는 결핍으로 글루코즈와 아미노산의 근육 세포로의 도입이 손상되고 근육 단백질의 이화작용이 증가할 뿐만 아니라 인슐린 부족으로 인한 촉진제의 지질 부착 가능성을 유발하기 때문에 생체 조성물을 향상시킬 수 있다[Kaates et al., 1996]. 다른 참고문헌에는 인슐린 내성이, 비만 수준이지만 추가의 체중 증가를 방지하는 "세트 포인트(set point)"와 같이 작용하면서 비만 피검자의 인체 지방을 안정화시키는 것을 도울 수 있다고 기재되어 있다[Eckel, 1992]. 일반적으로 동물 연구는 이러한 주장을 지지하지만[참조: Liarn, 1993], 한 연구는 CrP 보충으로 생체 조성물에 있어서 긍정적인 변화를 발견했고[Hasten etal., 1992], 또 다른 연구는 생체 조성물에 있어서 통계학적으로 중요한 변화는 아니지만 긍정적임을 보고했고[Hallmark et al., 1993], 또 다른 연구는 CrP 보충으로 생체 조성물에 있어서의 긍정적인 변화를 발견하지 못했다[Clancey et al., 1994]. 문헌에서 논쟁의 여지가 있는 성질은 대부분의 연구자들이 소수의 피검자를 이용했고 피검자들은 종종 운동을 했거나 이들 연구에서 제공된 양보다 많은 양의 크롬에 대한 필요성을 증가시킬 수 있는 조건화된 프로그램을 따랐다.
크롬을 보충하는 동시에 운동을 하는 것을 관찰하는 이전 작업은 결과들이 불일치하면서 체중 및 조성물에 대한 효과에 대해 제한되었다[Clancy et al., 1994; Evans et al., 1989; Evans et al., 1993; Hallmark et al., 1996; Hasten et al., 1992].
크롬 피콜리네이트는 가장 대량으로 사용하고, 연구하며, 촉진된 크롬 화합물이지만, 시험관내에서의 작업은 크롬 니코티네이트가 체중 손실 영역에서 생존 가능하고 신체 조성물이 변할 수도 있다는 것을 암시한다. 이러한 점에 있어서, 본 발명자들에 의한 매우 최근의 작업은 니코티네이트 염이 피콜리네이트 염보다 훨씬 보다 중요할 수 있음을 암시한다[그랜트(Grant) 등, 1997]. 이러한 자료는 본 특허 출원의 실시양태에서 명시되는 물질의 기본 조성물에 대한 첨가와 같은 크롬 니코티네이트의 유용성의 예로서 본 명세서에 제시되어 있다.
약제학적 조성물. 본 발명의 액상 조성물은 비만, ADHD, 튜렛 증후군, PMS, 흡연 및 본 명세서에 기재되어 있는 기타 관련 행동을 포함하여, RDS 관련 질환을 치료하는 것으로 공지되어 있고, 약제학적으로 허용되는 담체 또는 수성 매질 속에 용해되거나 분산되어 있는 유효량의 각종 화합물을 포함한다. "약제학적으로 또는 약리학적으로 허용되는"이라는 구절은 동물 또는 적절한 바와 같이 사람에게 투여하는 경우, 불리한, 알레르기의 또는 기타 바람직하지 목산 반응을 생성시키지 않는 분자 존재물과 조성물이라 한다.
본 명세서에서 사용하는 바와 같이, "약제학적으로 허용되는 담체"는 모든 용매, 분산 매질, 피복물, 항세균제, 항진균제, 등장 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 이러한 약제학적 활성 물질용 매질과 제제의 용도는 당해 분야에서 익히 공지되어 있다. 통상적인 매질 또는 제제가 활성 성분과 혼화성이 있는 경우를 제외하고는, 치료학적 조성물에서의 이의 사용은 예상되고 있다. 또한, 부가적인 활성 성분은 조성물 속으로 혼입할 수도 있다. 사람 투여에 있어서, 제조는 생물학적 표준의 FDA 사무국에 의해 요구되는 바와 같은 불임, 발열, 일반적 안전 및 정제 표준과 일치해야만 한다.
생물학적 물질은 바람직하지 않은 소분자량 분자를 제거하기 위해 광범위하게 투석해야만 하고/하거나, 적절한 경우, 바람직한 비히클 속으로 보다 능숙한 제형에 대해 동결 건조되어야만 한다. 활성 화합물은 일반적으로 비경구 투여(예: 정맥내, 근육내, 피하, 손상내 또는 심지어는 복막내 경로에 대해 제형화될 것이다. 활성 성분 또는 요소를 함유하는 수성 조성물의 제조는 본 발명의 명세서의 견지에서 당해 분야의 숙련가에게 공지되어 있을 것이다. 전형적으로, 이러한 조성물은 주사 가능한 액상 욕액 또는 현탁액으로서, 제조할 수 있고, 주사하기 전에 액체를 첨가할 때 용액 또는 현탁액을 제조하는 데 사용하기에 적합한 고체 형태는 또한 제조할 수도 있으며, 제조방법은 유화시킬 수도 있다.
주사 가능한 사용에 적합한 약제학적 형태는 멸균 수용액 또는 분산액, 참기름, 땅콩유 또는 수성 프로필렌 글리콜을 포함하는 제형 및 멸균 주사 가능한 용액 또는 분산액의 임시 제조용 멸균 분말을 포함한다. 모든 경우에 있어서, 형태는 멸균되어야만 하며 용이한 주사 적성이 존재하는정도로 유출되어야만 한다. 제조 조건과 저장하에 안정해야만 하며 미생물(예: 세균과 진균)의 오염 작용에 대해 억제되어야만 한다.
유리 염기 또는 약리학적으로 허용되는 염으로서 활성 화합물의 용액은 계면활성제(예: 하이드록시프로필셀룰로즈)와 함께 적절하게 혼합된 물 속에서 제조할 수 있다. 또한, 분산액은 글리세롤, 액체 폴리에틸렌 글리콜 및 이들의 혼합물 속에서 그리고 오일 속에서 제조할 수 도 있다. 보관과 사용의 일반적인 조건하에서, 이러한 제제는 미생물의 성장을 억제하기 위한 방부제를 함유한다.
본 발명의 RDS 관련 질환의 치료용 화합물은 중성 또는 염 형태로 조성물 속으로 제형화될 수 있다. 약제학적으로 허용되는 염은 (단백질의 유리 아미노 그룹으로 형성된) 산 첨가 염을 포함하먀, 이는 무기 산(예: 염산 또는 인산) 또는 유기산(예: 아세트산, 옥살산, 타르타르산, 만델산) 등으로 형성된다. 또한, 유리 카복실 그룹으로 형성된 염은 무기 염기(예: 수산화나트륨, 수산화칼륨, 수산화암모늄, 수산화칼슘 또는 수산화철)와 유기 염기(예: 이소프로필아민, 트리메틸아민, 히스티딘, 프로카인 등)으로부터 유도될 수 있다. 활성 성분으로서 펩티드 치료제를 사용하는 데 있어서, 본 명세서에 참조로 인용되어 있는 문헌[참조: 미국 특허 제4,608,251호, 미국 특허 제4,601,903호, 미국 특허 제4,599,231호, 미국 특허 제4,599,230호, 미국 특허 제4,596,792호 및 미국 특허 제4,578,770호]의 기술을 사용할 수 있다.
또한, 담체는, 예를 들면, 물, 에탄올, 폴리올(예: 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 이들의 적합한 혼합물, 및 식물성유를 함유하는 용매 또는 분산액 매질일 수 있다. 적합한 유동성은, 예를 들면, 피복물(예: 레시틴)을 사용함으로써, 분산액의 경우에 필수적인 입자 크기를 유지함으로써 및 계면활성제를 사용함으로써 유지될 수 있다. 미생물의 작용의 억제는 각종 항세균제와 항진균제(예: 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 티머로살 등)에 의해 일어난다. 대부분의 경우, 등장제(예: 설탕 또는 염화나트륨)를 포함하는 것이 바람직할 것이다. 주사 가능한 조성물의 연장된 흡수는 흡수 지연제(예: 알루미늄 모노스테아레이트와 젤라틴)의 조성물에서 사용함으로써 야기될 수 있다.
주사 가능한 멸균 용액은 활성 화합물을 적절한 용매 속에 필수적인 양으로 위에서 열거한 필수적인 각종 기타 성분과 혼합하고, 여과 멸균시켜 제조한다. 일반적으로, 분산액은 각종 멸균된 활성 성분을 이에서 열거한 성분으로부터 염기성 분산 매질과 기타 필수 성분을 함유하는 멸균 비히클 속으로 혼입시켜 제조한다. 주사 가능한 멸균 용액의 제조용 멸균 분말의 경우, 바람직한 제조방법은 진공 건조법과 냉동 건조법이으로서, 이는, 이들의 이전의 멸균 용액으로부터 활성 성분과 추가의 바람직한 성분의 분말을 수득한다. 또한, 직접 주사용의 보다 많이 또는 보다 고도의 진한 용액의 제조가 예상되는데, 용매로서의 DMSO의 사용은 매우 신속하게 투과되고 작은 면적에 대한 활성제의 농도가 높아질 것으로 예상된다.
제형화에 있어서, 용액은 복용량 제형과 적합한 방식으로 치료학적으로 유효한 양으로투여할 것이다. 제형은 각종 복용 형태(예: 위에서 언급한 주사 가능한 용액의 형태)로 용이하게 투여할 수 있으나, 약제 완화 캡슐제 등도 사용할 수 있다.
수성 용액 속에서의 비경구 투여에 있어서, 예를 들면, 필요한 경우, 용액은 적합하게 완충되어야만 하고, 액체 희석제는 먼저 충분한 염수 또는 글루코즈로 등장성이 된다. 이러한 특별한 수용액은 정맥내, 근육내, 피하 및 복막내 투여에 특히 적합하다. 이 때, 사용할 수 있는 멸균 수성 매질은 본 발명의 명세서의 견지에서 당해 분야의 숙련가에게 공지될 것이다. 예를 들면, 1회 복용량은 등장성 염화나트륨 용액 1㎖ 속에 용해될 수 있고 하이포더모클리시스(hypodermoclysis) 유액 1,000㎖에 첨가하거나 주입액의 소정의 부위에서 주사된다[예: "Remington's Pharmaceutical Sciences" 15th Edition, pages 1035-1038 및 1570-1580]. 복용량의 상당향의 변화는 치료하고자 하는 피검자의 질환에 따라 필수적으로 발생할 것이다. 투여하기에 적합한 사람은, 결국 각각의 피검자에 대해 적합한 용량을 결정할 것이다.
본 명세서에 기재되어 있는 활성제는 용량당 약 0.0001 내지 1.0mg, 약 0.001 내지 0.1mg, 약 0.1 내지 1.0mg 또는 약 10mg 등을 포함하여 치료학적 혼합물 내에서 제형화될 수 있다. 또한, 수회의 복용량을 투여할 수도 있다.
비경구 투여(예: 정맥내 주사 또는 근육내 주사)를 위해 제형화된 화합물 이외에, 기타 약제학적으로 허용되는 형태는, 예를 들면, 정제 또는 기타 경구 투여용 고형제, 리포솜 제형, 서방 캡슐제 및 크림제를 포함하여 현재 사용되는 기타 형태를 포함한다.
또한, 비장 용액은 일반적으로 비장 통로에 한 방울씩 또는 분무하여 투여되는 수용액이다. 비장 용액은 비장 분비액과 대부분의 점에서 유사하도록 제조하여, 일반적인 섬모 작용이 유지된다. 따라서, 수성 비장 용액은 일반적으로 등장성이고 pH 5.5 내지 6.5를 유지하도록 약간 완충물이 된다. 또한, 항세균성 약제 안정화제는, 필요한 경우, 제형물 속에 포함될 수 있다. 또한, 안과 제제에서 사용하는 방부제와 유사한 항균성 방부제와, 필요한 경우, 적절한 약제 안정화제는 제형 속에 포함될 수 있다. 각종 시판되는 비장 제제는 공지되어 있고, 예를 들면, 항생제와 항히스타민를 포함하며 천신 예방에 사용한다.
기타 투여법에 적합한 추가의 제형은 질 좌제와 페서리를 포함한다. 또한, 직장 페서리 또는 좌제를 사용할 수도 있다. 좌제는 직장, 질 또는 요도로 삽입하기 위해 일반적으로 약물을 섞은 각종 체중과 형태의 고형 복용 형태이다. 상입한 후, 좌제는 공동 유액 속에서 연화, 용융 또는 용해된다. 일반적으로, 좌제에 있어서, 통상적인 결합제와 담체는, 예를 들면, 폴리알킬렌 글리콜 또는 트리글리세라이드를 포함할 수 있는데, 이러한 좌제는 활성 성분 범위가 0.5 내지 10%, 바람직하게는 1 내지 2%를 함유하는 혼합물로부터 형성될 수 있다.
경구 투여는 이러한 일반적으로 사용하는 부형제(예: 약제학적 등급의 만니톨, 락토즈, 전분, 스테아르산마그네슘, 나트륨 삭카린, 셀룰로즈, 탄산마그네슘 등)를 포함한다. 이러한 조성물은 용액, 형탁제, 정제, 환제, 캡슐제, 지속 방출 제형 또는 산제의 형태일 수 있다. 특정한 정의한 실시양태에서, 경구 약제학적 조성물은 불활성 희석제 또는 동화 가능한 식용 담체를 포함하며, 이들은 경질 또는 연질 쉘 젤라틴 캡슐제 속에 동입될 수 있거나, 이들은 정제 속으로 압착될 수 있거나, 다이어트 음식으로 직접 혼입될 수 있다. 경구 치료학적 투여에 있어서, 활성 성분은 부형제와 함께 혼합될 수 있고 섭취 가능한 정제, 구강 정제, 트로키제, 캡슐제, 엘리서제, 현탁제, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 사용할 수 있다. 이러한 조성물과 제제는 활성 성분을 0.1% 이상 함유해야만 한다. 조성물과 제제의 비율은, 물론, 변할 수 있고 단위가 약 2 내지 약 75체중%, 바람직하게는 25 내지 60%가 편리할 수 있다. 이러한 치료학적으로 유용한 조성물에서의 활성 성분의 양은 적합한 용량을 수득하도록 하는 양이다.
또한, 정제, 트로키제, 환제, 캡슐제 등은 다음을 함유할 수 있다: 트라가칸트, 아카시아, 옥수수전분 또는 젤라틴으로서의 결합제, 부형제(예: 인산이칼슘), 분해제(예: 옥수수 전분, 감자 전분, 알긴산 등), 윤활제(예: 스테아르산마그네슘) 및 감미제(예: 슈크로즈, 락토즈 또는 삭카린)를 첨가할 수 있고 또는 향미제(예: 페퍼민트, 노루발풀 오일 또는 체리 향)을 첨가할 수 있다. 용량 단위 형태가 캡슐제인 경우, 위의 형태의 물질 이외에, 액체 담체를 함유할 수 있다.
기타 각종 물질은 피복물로서 존재할 수 있거나 용량 단위의 물리적 형태를 개질시킬 수도 있다. 예를 들면, 정제, 환제 또는 캡슐제는 셸랙, 당 또는 둘 다로 피복시킬 수도 있다. 엘릭서제의 시럽은 방부제로서의 감미제(메틸 및 프로필파라벤), 염료 및 향미제(예; 체리 또는 오렌지 향) 등의 활성 화합물 슈크로즈를 함유할 수 있다.
Kits. 본 발명의 치료학적 키트는 RDS와 관련 행동의 치료에 본 명세서에서 언급한 하나 이상의 제제 또는 화합물을 포함하는 키트이다. 이러한 키트는 일반적으로 적합한 용기 수단 속에 약제학적으로 허용되는 제형 속에 앞에서 언급한 약제학적으로 허용되는 제형을 함유한다. 키트는 단일한 용기 수단을 가지거나 각각의 화합물에 별개의 용기 수단을 가질 수 있다.
키트 성분이 하나 이상의 액체 용액 속에 공급되어 있는 경우, 액체 용액은 수용액으로서, 멸균 수용액이 특히 바람직하다. 또한, RDS 관련 질환의 치료용 화합물은 주사 가능한 조성물 속으로 제형화될 수도 있다. 이러한 경우, 용기 수단은 시린지, 피펫 또는 기타 유사 장치일 수 있으며, 이로부터 제형이 신체의 면적으로 적용될 수 있거나, 동물 속으로 주사되거나, 키트의 기타 성분과 함께 적용되어 혼합될 수 있다.
그러나, 키트 성분은 무수 분말로서 공급될 수 있다. 시약 또는 성분이 무수 분말로서 공급되는 경우, 분말은 적합한 용매를 첨가하여 다시 구성될 수 있다. 또는, 용매는 또 다른 용기 수단 속에 공급될 수 있다.
다음 실시예는 본 발명의 바람직한 실시양태를 입증하기 위해 포함되어 있다. 당해 분야의 숙련가는, 다음 실시예에서 공지되어 있는 기술이 본 발명을 실시하는 데 잘 작용하도록 발명자가 발견한 기술을 나타내는 것으로 인식해야만 하며, 따라서 실제로 바람직한 양식을 구성할 것으로 생각된다. 그러나, 당해 분야의 숙련가는, 본 발명의 명세서의 견지에서, 많은 변화가 공지되어 있는 특별한 실시양태 속에 있을 수 있고 본 발명의 취지와 범주로부터 이탈되지 않고 비슷하거나 유사한 결과를 여전히 수득한다.
실시예 1
최종 조작에서 아미노산 충전과 엔케팔리나제 억제
도입
본 발명자는 RDS가 하나 이상의 신경전달자 결손에 대한 응답이라고 생각한다. 약제 수용체 활성화를 통하여 이러한 신경전달자 불균형을 완화시키려는 시도는 보상의 부족용의 유일한 대용품일 것이며 행복의 일시적인 감정만을 얻을 것이다. 이 때, 발명자는 조절 불가능한 섭취 행동(즉, SUD)의 특정한 형태로부터의 회수가 전구체 아미노산과 엔케팔리나제 억제제 둘 다의 투여를 통하여 뇌 화학 결손을 부활시키기 위해 고안된 신경영양제의 사용으로 상당히 촉진된다[참조: Blum et al., 1988a, blum et al., 1988, Brown et al., 1990]. 본 발명자들은 아미노산 전구체 충전과 엔케팔리나제 억제가 2년에 걸쳐서 외래 피검자 셋팅에소 체중 손실의 유지도를 증진시키는 문제를 평가하는 것으로 결정했다.
방법
피검자 선택과 프로그램. 이러한 연구의 주제는 문헌[참조: Behavioral Medicine Group Clinic in Sacramento, California]에서 매우 낮은 칼로리의 부가적인 단식 프로그램에서 외래 피검자 247명이다. 피검자는 이들의 목표 체중 15% 이내일 때까지 또는 피검자가 단식을 계속하기를 선택하지 않을 때까지, 선택된 영양학적인 단식 생성물로서 옵티페스트(Optifast)TM를 사용한다. 발명자들은 내과 의사의 관리하에 소정의 기타 다이어트 대부분은 옵티페스트TM대신에 작업한다. 표준 메트로폴리탄 생명 보험회사 키/체중 표는 실제 체중을 결정하기 위해 사용한다. 모든 피검자는 전체 연구 도중에 센트롬 비타민을 복용한다. 피검자는 통지한 동의서를 받고 조서는 비만 연구의 조서하에 당국[참조: Behavioral Medicine Medical Group Clinic Industrial Rview Committe and the University of Texas Heath Science Center at San Antonio Institutional REview Board]에 의해 승인되었다.
피검자가 PHENICALTM을 복용하거나 복용하지 않을 지의 결정은 단식 말기에 한다. 특정한 탄수화물형 단맛(달콤한 치아), 빵, 시트러스 과일, 파스타 등을 방해하여 고도의 파티 점수와 가장 힘든 시간에 대해 불평하고 체중을 느슨하게 하는 데 어렵거나 이들의 목표 체중을 달성하는 데 어려운 피검자는 치료하기가 보다 어렵다고 생각된다. 가장 불평하는 피검자나 이들의 섭취를 조절하지 못하는 피검자는 펜칼(PHENICAL)TM(조사 그룹; N=30)을 복용하는 것으로 선택되었다. 유지가 수고 없이 나타나는 경우, 피검자는 펜칼TM(조절 그룹; N=17)을 제공받지 못한다. 선택된 피검자에 대해, 펜칼TM치료는 단식 말기에 시작되고 2년의 연구 말기까지 유지 기간 도중에 께속된다. 펜칼TM은 아미노산과 비타민 부가물이고, 고안하고 개발하며 1899년 리미티드 라이어빌러티 코포레이션(산 안토니오, 텍사스)[Limited Liability Corporation(San Antonio, Texas)]가 제조한 펜칼TM의 전조이며, 바이더 뉴트리션 그룹(솔트 레이크 시티, 유타)[Weider Nutrition Liability Corporation(San Antonio, Texas)]이 시판한다. 선택된 피검자는 1일당 펜칼TM6개의 캡슐을 복용하고, 이는 DL-페닐알라닌 460mg, L-트립토판 25mg, L-글루타민 25mg 및 피리독살-5'-포스페이트 5mg, 크롬 피콜리네이트 33㎍ 및 L-카니틴 10mg이라고 생각된다.
피검자는 교육 클라스를 참석하기 전에 또는 이후에 매주 칭량한다. 교육 클라스는 프로ㅡ램의 의학적 지도자와 비만 질환, 사회의 유행, 전위 억제, 사람 건강과 행복, 이의 치료, 가족의 역할, 유전 질환의 전위, 영양물 부가의 유용성, 섭취에서의 보다 적절한 영양의 역할, 다이어트에서 고단백질, 저지방 및 매우 낮거나 탄수화물 부재의 의미, 운동의 역할에 대한 이의 영향에 대한 정보를 포함하여 구성된 등록된 영양사가 가르친다. 또한, 이들의 심리학적 상태와 의학적 질환은 매주 단위로 모니터한다. 심리학적 상태는 음식물 갈망, 기분 및 과도하게 열중하는 음식에 대한 평가 규모에서 점수로서 모니터한다. 갈망과 과도한 열중은 1 내지 5의 규모로 기록된다. 갈망 규모에 대한 점수 5는 전적으로 조절 감각과 섭취 전 불안을 나타낸다. 점수 1은, 사람이 그/그녀가 만족되었다는 것을 알고 심리학적으로 갈망하지 않아야만 하지만 성가신 열망을 나타낸다. 기분은 5가 매우 우울하고 1이 최소로 우울한 유사한 규모로 평가한다. 과도한 열중은 완전하게 되는 포인트 전에 섭취 1wk당 다수의 에피소드로서 기록한다. 혈액의 실험실용 분석은 모든 기타 wk를 바꾸지만, 소변 검사는 의학적 질환에 대한 정보를 제공한다. 화학 패널과 SMAC-CBC는 혈액에 대해 수행하지만, 소변은 주로 케톤 및/또는 글루코즈에 대해 분석한다. 교육 클라스는 wk당 1시간이다. 체중 손실과 장기간 유지를 지탱하기 위해, 영양의 원리, 운동, 행동 변화 및 스트레스 유지가 강조되었다.
피검자 집단의 특성. 피검자 247, 84%는 여성이다. 모든 피검자는 코카시안이고 평균 연령은 40세이다. 평균 피검자는 프로그램에 가입할 때 74% 과체중이다.
펜칼TM이라고 하는 130명의 연구 피검자는 117명의 대조 그룹 피검자와는 연령, 이상 체중, 출방 체중, 비율 과체중, 갈망, 기분 스윙, 과도한 열중 섭취 또는 비만의 가족 내력이 상당히 다르지 않다(표 20-B 참조). 그러나, 이들은 화학 의존도(CD+)의 가족 내력이 다르다. 연구 그룹의 피검자 중에서, 65%는 화학 의존도(CD+)의 가족 내력이 있지만, 대조 그룹 피검자의 39%는 CD+(p ＜0.005)이다. 피검자는 연구 그룹에서 있기로 선택한 후, 이들이 보다 많이 불평하거나 체중 유지 도중에 조절을 실패를 하는 경우, 이러한 자료는 CD+ 피검자가 보다 많이 불평하고 ㅈ체중 유지 기간 도중에 보다 힘든 시간을 갖는 것으로 나타난다.
피검자 특성. 수는 평균 값으로 나타낸다. 과체중(%)은 [출발 체중-이상 체중]/이상 체중; OB(%)=비만 가족 내력을 보고한 그룹의 비율, CD(%)는 화학 의존도의 가족 내력을 보고한 그룹의 비율이다. 펜칼TM은 1899년 리미티드 라이브러리 코포레이션, 산 안토니오, 텍사스와 바이더 뉴트리션 인코포에이션, 솔트 레이크 시티, 유타의 제품이다.
성별 차이. 연구에서 여성 208명은 출발시에 과체중 76%이지만, 남성 39명은 과체중 66%이다. 스텐다드 메트로폴리탄 생명보험회사 키/체중 표는 이상 체중을 결정하는 데 사용한다. 남성의 약 절반(49%)에 비해, 여성의 거의 ¾은 병적인 비만(즉, 과체중 50% 이상)이다. 여성은 이러한 프로그램에서 남성의 수의 5배 이상이다. 가입 인터뷰 도중에 여성의 90% 이상이 갈망 음식물을 보고했지만, 남성의 갈망 음식물은 80% 보다 약간 미만이다. 또한, 과다한 섭취는 남성과 여성 사이에는 상당히 상이하다. 여성의 80%는 과도한 열중 섭취를 보고했고, 남성은 64%만이다.
피검자의 가족 측면. 프로그램에 가입할 때, 피검자는 각각 비만의 가족 내력과 화학 의존도의 가족 내력에 대해 질문을 받는다. 여성의 70% 약간 이상과 남성의 56%는 비만의 가족 내력을 보고했다. 이들 중에서, 비만의 가족 내력에 대해, 다수의 피검자의 2배는 비만 아버지(38%)에 비해 비만 어머니(73%)가 있는 것으로 보고했다. 비만 가족 내력을 갖는 이들 중의 7%는 양친 모두 비만임을 보고했다. 여성과 남성의 거의 절반은 화학 의존도의 가족 내력을 보고했다. 그러나, 이 경우, 특성을 지니는 것은 아버지이다. 화학 의존도의 가족 내력을 갖는 피검자 중에서, 전체 86%는 어머니의 겨우 31%에 비해 아버지가 화학 의존도를 갖는 것으로 보고했다. 병적인 비만 피검자의 약 ⅔(63%)(과체중 50% 이상)는 비만이 있는 어머니를 가지며 60%는 화학 의존도의 상당한 형태를 갖는 아버지가 있는 것으로 보고했다. 남성이 전체 집단의 16% 뿐이므로, 가족 내력 서브그룹에 대한 진술은 가장 예비적이다.
결과
체중 손실의 유지. 피검자 247명은 평균 단식 20.0wk에 걸쳐서 평균 68.4lbs를 손실했다. 연구 그룹은 단식의 말기에 그리고 펜칼TM을 시작하기 전에 대조 그룹과 다르지만, 이러한 차이는 중요하지 않다. 연구 그룹은 대조 그룹에 대한 과체중 32%에 비해 단식 말기에 과체중 22%이다. 이러한 차이가 있지만, 통계적인 분석은 단식 말기에 체중이 2년 동안 감소한 체중에 영향을 미치지 않는 것으로 입증했다. 2년의 연구 말기에, 펜칼TM을 복용한 피검자는 펜칼TM(p ＜0.0001)을 복용하지 않은 대조 그룹 52.8%보다 평균 과체중 23.5%이다[참조 도 2]. 2년 후, 연구 그룹의 피검자는 손실한 체중(p ＜0.0001)을 회복한 대조 그룹 피검자의 41.7%보다 손실 체중의 14.7%만이 회복했다.
유전적 영향. 가족 내력에 의해 연구 피검자와 대조 피검자 사이의 비교(OB+/ CD+, OB+/CD-, OB-/CD+ 및 OB-/CD- 그룹)에서, 펜칼TM을 복용한 모든 그룹은 2년 후 대조 서브 그룹(P ＜0.0001)보다 상당히 체중 손실이 있다. 이러한 실시예에서, OB는 비만의 가족 내력이 있는 유전자가 아니다. OB+의 내력을 갖는 모든 그룹은 2년 후에 비교되는 OB- 그룹(p ＜0.05)보다 보다 과체중이다. 화학 의존도의 가족 내력을 갖는 통계적으로 중요한 피검자가 펜칼TM에 잘 반응하지 않는다.
유전학과 성별. 전체적으로, 모든 가족 내력 남성 그룹은 여성의 비교 그룹(p ＜0.0001)보다 극적으로 체중 손실을 회복한다. 2년 말기에 (OB-/CD+)의 최대의 경우에, 여성은 실제로 단식 도중에 체중 손실량 중에서 하나도 회복하지 않는다. 여성이 여구 그룹에서 남성의 5배 이상이며, 여성이 여러 특성에서 남성과 다르므로, 발명자들은 여성을 특징화하기로 추기로 결정했다. 여성의 70%는 OB+의 가족 내력을 보고한 반면, 54%는 CD+의 가족 내력을 보고했다. 단지 12%만이 CD- 또는 OB-의 가족 내력을 보고하지 않았다. OB+와 CD+인 여성은 OB-/CD- 여성보다 평균 58% 무겁다. 또한, OB+/Cd+ 여성은 가장 과체중이며, OB+/CD+, OB-/CD+이고, OB-/CD- 여성이 최소 과체중이다. 유사한 경과는 음식물 갈망, 과도한 열중, 솝취 및 우울증 점수와 가장 갈망, 과도한 열중 및 우울증을 보고하는 OB+/CD+ 여성에 대해 나타난다.
음식물 갈망과 과도한 열중의 섭취. 양친의 심리학적 상태와 의학적 질환을 모니터한다. 심리학적 상태는 음식물 갈망, 우울증 및 과도한 섭취에 대해 임상적 평가 규모에 대해 정량적으로 모니터한다. 5 포인트 규모는 음식물 갈망에 대해 사용한다. 갈망 규모에서 점수 5는 전적으로 대조의 감각과 섭취 전 불안을 나타내고, 점수 1은 성가신 열망을 나타내지만, 사람은 그 또는 그녀가 만족하고 있고 갈망하지 않아야만 한다는 것을 발견한다. 우울증은 간단한 규모에 관련되는데, 5가 심리적으로 매우 우울하고 1이 최소한으로 우울하다. 과도한 열중은 포인트가 완전해지기 전 섭취 1wk당 다수의 에피소드로서 기록한다. 실험적인 섭생에의 불평은 질문함으로써 평가한다.
연구 말기에 갈망은 대조 그룹(p ＜0.0001 이상)에 비해 펜칼TM을 복용한 피검자에게서 3배 감소되고, 갈망은 대조에서 전부 감소하지 않는다. 과도하게 열중하는 섭취 에피소드 수는 펜칼TM을 복용하지 않은 대조 그룹에 비해, 펜칼TM을 복용한 피검자에게서 상당히 감소한다. 연구를 참가할 때, 피검자는 1wk당 10.9회의 과도한 열중 에피소드를 보고했다. 연구 말기에, 환자는 과도한 열중 행동이 단지 29시간/wk임을 보고했다. 반대로, 연구를 참가할 때, 비펜칼TM대조 그룹은 1wk당 8.3회의 에피소드를 보고했다. 연구의 말기에 대조 그룹은 상당한 변화가 없는 1wk당 8.3회의 과도한 열중 에피소드를 보고했다. 2년 후, 음식물에 대한 갈망과 과도한 열중 섭취는 대조 그룹에 비해 펜칼TM을 복용한 그룹에서 3배 감소했다.
다수의 복귀와 변화의 분석. 단계적인 다수의 복귀는 치료 프로그램을 출발한 지 2년 후, 다시 복귀한 체중(%)의 상당수의 예보자를 시험하는 데 사용한다. 예보자는 부재(0) 또는 존재(1)로서 카테고리화하며 피검자가 우울성 비만, 과도한 열중, 칼망인지를 지시하고, 화학 의존도의 가족 내력을 가지며, 비만, 여성 성별의 가족 내력을 가지며, 펜칼TM을 투여한다. 단계적인 선택 과정(SPSS Version 6.13)(SPSS, Inc., Chicago, IL)은 펜칼TM치료, 여성 성별, 우울성 비만 및 2년 후에 얻은 체중의 중요한 예보자로서의 비만의 가족 내력을 선택한다. 과도한 열중 행동, 갈망 행동 및 화학 의존도의 가족 내력은 예보자로서 만족스럽게 현저하지는 않다. 선택된 예보자의 전체 모델은 예보자에 의해 설명한 체중 증가가 2년 내에 39.8%로 현저하다. 설정한 예보자 중에서 가장 영향력 있는 예보자는 펜칼TM이고, 우울증 비만, 여성 성별 및 비만의 가족 내력(표 20-C 참조)이다. 제2 분석은 펜칼TM그룹과 대조 센트럼 그룹 사이의 2년 전에 그리고 이후에 과도한 열중 점수를 비교한다. 펜칼TM치료용의 그룹 인자 사이의 두 가지 인자 변화의 분석과 과도한 열중의 2년 이전과 이후에 반복 측정 인자는 상당한 상호 작용(p ＜0.001)을 갖는다. 한 쌍의 t-시험은 펜칼TM그룹과 대조 그룹에 대해 별도로 과도한 점수에서의 변화를 위해 시험하는 데 사용한다. 만족스럽게도, 대조 그룹은 검사 가능한 변화가 없으나, 과도한 열중에서의 변화는 펜칼TM그룹에 대해 극적으로 감소한다.
토의
자료는 2년 내에 제출되며, 개방 실험 연구는, 손실 체중의 복귀를 억제하는 공지된 탄수화물 과도한 열중에서 이상 섭취-행동을 억제하는 신경영양학적 펜칼TM을 제안한다. 발명자들은 뚜렷한 이익의 영향인 펜칼TM이 메솔리브 보상 회로에서 작용하는 전구체 아미노산과 엔케팔리나제 억제 둘 다의 작용에 의해 설명할 수 있을 것으로 생각한다. 발명자들은 이러한 신경영양학적 혼합물에 대한 정확한 작용 메카니즘을 제공할 수 없을 뿐만 아니라, 발명자들은 성분 또는 성분 혼합물이 발명자들의 연구에서 개시하는 탄수화물을 최대로 억제하는 것을 정확하게 나타낼 수도 없다.
신경전달자 5-HT, DA, NE 및 엔케팔린은 달콤한 음식물의 도입을 감소시키는 것으로 나타난다(Leibowtz, 1985, Leibowitz et al., 1982, kaye et al., 1984, Riviere et al., 1987, Blum et al., 1990). 따라서, 펜칼TM은, 1-트립토판(5-HT 전구체), 1-페닐알라닌(DA와 NE 전구체)와 엔케팔리나제 억제제 d-페닐알라닌을 포함하여, 특히 전구체 아미노산 충전을 통하여 음식물 내력 신겨언달자를 증진시키켜 엔케팔린을 상승시키는 것으로 생각된다. 당해 연구에서 펜칼TM의 관찰된 효과에 대한 통과 가능한 포지티브 메카니즘은 부족한 모노아민(예: 5-HT, NE, EPI)의 회복과 뉴로펩티드 met-엔케팔린과 CCK-8을 포함한다. 이들 모두는 글루코즈 또는 유전자에 의해 영향을 받은 (탄수화물) 물질을 섭취할 것으로 생각된다(Frohman, 1983, Fullorton et al., 195, Matsumura et al., 1984).
펜칼TM이 동일한 가족 내력을 갖는 남성에 비해, OB+와 CD+를 갖는 여성에게 가장 큰 영향이 유도되었다는 것은 주목할 만하다. 이러한 차이는, 바디 메스 지수(BMI)의 변화의 22.8% 이하에 대해 측정한 사람 비만(OB)와 사람 도파민 D2(DRD2) 유전자의 두 가지의 유전자 변수 단독으로 여성의 대해 관찰한 코밍(Comings) 등의 최근의 발견(1996b)에 관련될 수 있다. 비만에서 OB와 DRD2 유전자 사이의 상호 작용의 면에서, 렙틴과 OB 수용체와의 결합이 수반될 수 있다. 이러한 결합은 행동과 식욕과 대사에 작용하는 중간체 신경전달자 또는 뉴로펩티드를 활성화한다. 본 명세서에서, Ob/ob 생쥐는 아치형 인펀디벌럼(archate-infundibullum)(Oltmans, 1983)에서 도파민의 상당한 수준 저하를 나타낸다. 이러한 작용을 근거로, 본 발명자들은 글루코즈 결합이 이전에 제안한 바와 같이, 기타 화학 의존도(즉, 알콜, 코카인, 헤로인)와 유사하다고 생각된다.
2년 내에, 비펜칼TM/센트럼 비타민 그룹에 비하여, 펜칼TM의 아미노산 섭취 그룹은 다음에 기재된다: 1) 남성과 여성 모두에게 과체중(%)의 2배 감소, 2) 여성에게 갈망의 70% 감소와 남성에게 63% 감소, 3) 여성에게 과도한 열망 섭취의 66% 감소와 남성에게는 41% 감소.
실시예 2
VNTR 대립형질와 튜렛 증후군 및 약제 남용과의 상관 관계
TS는 알콜 및 약제 남용, 우울병 및 강제적인 강박관념, 의지력 부족 과활성, 행동, 수면, 학습, 성 및 불안 장애를 포함하여, 만성 모터 및 보컬 안면 틱과 광범위한 연합 행동을 특징으로 하는 복잡한 신경정신의학적 장애이다(Comings 및 Comings, 1987c, comings, 1990, Comings 및 Comings, 1993, Comings, 1995d). TS는 일반적으로 오토소말 우성 형질로서 유전되는 것으로 추정되는 반면, 결합 연구는 Gts 유전자를 발견하지 않고 전체 게놈을 실질적으로 차단된다(Fog, 1985, Tsui, 1994). 그러나, 행동에의 고도의 상당한 증가와 Gts와 ADHD 유전자에 대해 증가하는 유전학적 충전을 갖는 반대의 반항적인 장애는 최근에 입증되었다(Comings, 1995a). 장애의 수명 위험이 1,000명당 12명 미만인 튜렛 증후군의 유전의 족보 연구는 이러한 장애가 다원 유전성이라는 것을 의미한다(Comings et al., 1984). 취학 연령 소년들의 TS는 90명 중의 전체 TS와 40명 중의 가능한 TS 1의 빈도를 나타낸다(Comimings et al., 1990). 유사한 결과는 기타 연구(Kurlan et al., 1994)에서 확인되며, 이스라엘 군인들의 TS의 빈도 또는 만성 안면 틱이 2.6%로 결정된다(Zohar et al., 1992). 보다 최근의 족보 연구에 있어서, TS 관련 행동의 전체 스펙트럼(Comings, 1990, Comings, 1995d)이 포함되는 경우, 다수의 가계는 유전자가 부모 모두로부터 유전된다는 증거를 나타내고, 이는 TS가 다유전성 장애라는 것을 주장한다(Comings, 1990, Comings 및 Comings, 1992, Comings, 1994b, Comings, 1995b, Kurlan et al., 1994).
관련 장애의 넓은 스펙트럼과 Gts 유전자가 부모 모두로버 유전된다는 증거(Kurlan et al., 1994, Comings, 1990) 때문에, TS가 다유전성 장애이고 이러한 유전자(MAOACX, DBH, DRD2, DATI, 등)은 도파민, 세로토닌, 노르에피네프린 및 기타 신경전달자의 대사를 수반하며, 유전자 각각은 변이의 1 내지 10%만을 구성한다는 것을 암시한다(Comings, 1996b, Comings, 1995a, Comings, 1995b, Comings, 1996a).
방법
그룹 Ⅰ: TS 그룹. 피검자는 57명의 대조 그룹, 229명의 TS 시조를 포함하며, 이들의 대부분은 많은 관련 행동적 장애(Comings 1990)에 심각하게 감염되었고, 90명은 TS 시조의 감염되고 감염되지 않은 친척이다. 모든 피검자는 비히스판성 백인이다. 평균 연령, 진단 형태(TS 대 만성 모터 안면 틱) 및 피검자의 기타 측면은 다른 문헌에 기재되어 있다(Comings et al., 1996a)
행동적 점수. TS 제어와 TS 시조 또는 친척은 각각 다이아그노스틱 인터뷰 스케쥴(Diagnostic Interview Schedule)(Robins et al., 1981) 또는 DSM-Ⅲ-R(1987)을 기준으로 하는 질문 사항을 채우는 것이 필수적이다. 이는 정신의학적 증상의 넓은 범위의 구조적 재조사를 제공한다. 이러한 증상은 ADHD, 물질 남용, 기분, 불안, 취학 성능, 말더듬, 안면 틱 등을 포함하여, 27명의 다른 행동으로 분류한다. 이러한 행동적 점수에 사용하는 질문은 다른 문헌에 상세하게 기재되어 있다. [참고: Comings 1995a; Comings 1994a; Comings 1994b; Comings 1995b; Comings et al.. 1996a; Robins et al., 1981; Comings 1995c]. 2가지 행동의 스코어를 사용하여 ADHD를 평가한다. ADHD라고 불리는 첫번째 행동의 스코어는 DSM-III 및 DSM-III-R 항목으로부터의 22개의 ADHD 변종의 절반 이상이 존재하는 가를 기준으로 한다. ADHD-R로 불리는 두번째 행동의 스코어는 DSM-III-R 진단항목을 기준으로 한다. 이전에 사용되지 않은 3가지 QTV는 부주의, 충동 및 기능항진이다. 이들은 ADHD 점수를 누적 생성시키는 3가지 서브스코어이다. QTV 약어는 행동이상에 대한 CD, 적대적 반항 이상에 대한 ODD(참고: Comings 1995a) 및 주요 우울즉 에피소드(참고: Comings 1995c) 증상들에 대한 MDE를 포함한다.
합병적 행동을 검사하기 위한 원리는 특정 유전자가 자체 진단법보다 TS 중에 존재하는 특정한 합병적 거동과 더 강하게 연관될 수 있다는 초기 관찰이다(Comings et al., 1996a). 이러한 질문서는 DSM-III-R 또는 DSM-IV 진단법을 제공하기 위한 것이라기 보다는 상이한 행동 영역에 대해 QTV를 생성하는 고도로 구조화된 방법을 제공하기 위한 것이다. 연속적인 특성의 이점은 이들이 이분법의 진단법보다 광범위한 증상들을 제공한다는 점이다. 증상 평가에 대한 질문서를 토대로 한 접근법의 정확성, 유용성 및 민감성은 이러한 장치의 사용을 동일한 구조의 장치의 인터뷰자 교육과 대조함으로써 다른 사람들에 의해 설명되어 왔다[참고: Gadow and Sprafkin 1994; Grayson and Carlson 1991). 수백 가지의 주제를 갖는 질문서의 검토 결과, 이들은 개인 인터뷰에 의해 수득된 정보를 정확하게 반영하는 것으로 드러났다.
그룹 II : 물질 남용 그룹
피검자는 라틴아메리카계가 아닌 120명의 백인 남성이다.
평가
모든 주제를 미시간 알콜 중독증 시험(Davis et al., 1987), 약물 남용을 포함하도록 수정된 24개 항목의 자가 진단 질문서(MAST-R), 임상적으로 수행되는 진단성 인터뷰 스케쥴(DSM-III-R 버젼)(Robins et al., 1981)로 평가하여 물질 의존 이상의 여부를 진단하고, 임상적으로 수행되는 중독증 인덱스 5판(Hodgins and Guebaly 1992)(ASI)로 알콜 및 약물 사용 변수의 범위를 평가한다.
발명자들은 약물/알콜 용법 및 ASI의 법적 지위 부문을 이용한다. 특정 물질의 용도를 평가하기 위해, 중독성 알콜, 헤로인, 기타 오피트/진통제, 바르비튜레이트, 기타 진정제/최면제/안정제, 코카인, 암페타민, 대마초, 환각제 및 흡입제의 사용기간(년수)에 대해 질문하였다. 상기한 바의 각각에 대해, 관련된 경우, 피검자들에게 투여경로에 대해 질문하였다. 경구, 경비, 흡연 및 정맥내 주사 등이 채택되었다. 연속 변수인 사용되는 #IV 약물은 정맥주사된(IV) 상이한 약물의 총수를 합산함으로써 계산된다. IV 약물 사용 변수는 IV 약물을 사용하지 않은 경우를 0으로 하고 하나 이상의 IV 약물을 사용하는 경우 ≤1으로 나타내는 이분법적 변수이다. 약물 문제에 관한 질문은 다음과 같은 것들을 포함한다: "당신은 알콜 중독에 의한 중풍성 섬망증을 얼마나 오래 동안 앓아 왔습니까?, 약물에 대한 과다복용은요?", "당신이 과거 30년 동안 알콜로 인한 문제를 겪은 날수는 얼마나 될까요?, 약물문제는요?", "당신이 과거 30년 동안 알콜에 대해 얼마나 많이 소비했나요?, 약물에 대해서는요?". 약물 및 알콜 남용의 다양한 법적 양태에 대한 질문들은 다음과 같은 것들을 포함한다: "당신의 평생 동안 취한 상태로 운전하여 기소된 적은 몇번이나 있었나요?", "당신의 평생 동안 약물 소지로 체포되거나 기소된 적은 몇번이나 있었나요?", "이러한 기소로 인해 유죄판결을 받을 적은 몇번이나 있었나요?". 응답이 0 내지 임의의 수인 경우, 이들을 0에 대해서는 "0"으로 스코어를 매기고, 기타 다른 회수에 대해서는 "1"로 스코어를 매긴다. 알콜 사용에 관한 이러한 질문들은 전체 알코 스코어에 합산되며, 약물 사용에 관련된 질문들은 약물 스코어에 합산된다. 알콜 및/또는 약물 남용에 대한 치료를 요하는 인터뷰를 토대로 한 증상 평가는 0(치료할 필요 없음) 내지 9(생명에 위협적인 상황으로 중재를 요하는 치료)의 범위이다.
물질 남용 대조 그룹
물질 남용 그룹에 대한 대조 그룹은 TS 피검자에 대한 대조 그룹과 무관하다. 이들은 2개의 세트로 이루어진다. 첫번째 세트는 산 베르나르디노 소재의 캘리포니아주립 대학에 재학중인 라틴아메리카계가 아닌 백인 성인 남성 45명(평균 연령 30.1세)이다. 물질 남용으로 인한 심각한 문제들을 갖고 있는 사람들은 MAST-R 시험을 토대로 배제하였다. 두번째 세트는 미네소타 쌍둥이 가족 연구회로부터의 쌍둥이의 아버지들로 이루어진다. 이들은 11세 또는 17세의 쌍둥이를 갖는다는 사실만을 토대로 모든 주(state) 전역으로부터 확정되었으므로, 이들은 대학생들에 비해 사회경제적 및 교육적으로 보다 무작위한 그룹의 세트를 나타낸다. 모든 대조 그룹이 물질 남용 변수에 대해 네거티브로 스코어가 매겨지지만, 약물 남용 평가의 결과가 쌍둥이 대조 그룹에 대해서는 아직 입수되지 않았기 때문에, 일부는 포지티브일 수 있다. 그러나, 이는 전원적인 주가 압도적인 무작위 단면이므로, 본 발명자들은 이 그룹에서 네거티브 가수가 적다고 추정한다.
PCRTM다형체
MAOA VNTR 다형체(Hinds et al., 1992)가 사용된다. 이러한복합 다형체는 불완전 복제 신형 23-bp VNTR 모핏에 바로 인접한 GT 소형위성으로 이루어지며, 대립형질은 디누클레오티드 반복 단위수와 VNTR 반복단위수가 모두 상이하다. DNA는 표준과정에 의해 혈액 전체로부터 추출된다. 표적 DNA는 PCRTM(Mullis et al., 1986)에 의해 확대된다. PCRTM생성물을 라벨링하기 위해, 형광성 HEX 또는 FAM 아미다이트로 라벨링된 각각의 하도제 0.1μM(참고: Applied Biosystems, Foster City, CA)를 반응에 사용한다(참고: 표 20d). 10배 희석한 PCRTM생성물 2μl를 탈이온화된 포름아미드 2.5μl와 ROX 500 표준물질(참고: Applied Biosystems, Foster City, CA) 0.5μl에 가하고, 90℃에서 2분 동안 변성시킨 다음, 어플라이드 바이오시스템 3373 DNA 서열분석기 속에 6% 폴리아크릴아미드 겔에 장전한다. 상기 겔을 1100volt와 일정한 30+W에서 5시간 동안 전기영동시킨다. 겔을 레이저로 스캐닝하여 내부 ROX 500 표준 물질을 사용하여 분석한다. 피크는 기저 쌍 길이에 의해 파악한 착색 파편을 토대로 제노타이퍼(버젼 1.1)(Applied Biosystems)에 의해 인식한다. 각각의 샘플에 대한 완전한 정보는 모든 겔 파일로부터 인쇄하고, 수집된 데이타를 분석을 위해 제출한다.
대립형질 그룹
MAOA 대립형질의 길이가 표현 효과와 상관될 수 있다는 가정을 조사하기 위해, 대립형질을 4개의 그룹으로 나눈다(결과 참조). 이들을 최단 그룹으로부터 최장 그룹에 따라 1 내지 4로 라벨링하여 MAOA 유전자형 변수를 형성한다. 여성은 TS 그룹에서만 채용된다. 소정의 대립형질 그룹에 대해 동형 접합성인 것들만이 분석에 포함된다.
통계적 분석
토우렛(Tourette) 증상의 그룹을 위해, ANOVA를 사용하여 4개의 상이한 대립형질 그룹에 대한 각각의 QTV의 상대적 크기를 검사한다. 선형 ANOVA를 사용하여 4개의 대립형질 그룹 전체 평균의 유의적 진행 증가에 대해 시험한다. SPSS(SPSS, Inc, Chicago, IL) 통개적 팩키지를 사용한다. 선형 ANOVA에 대해, 부지배 다항식이 1로 설정된다. MANOVA는 모든 변수가 동시에 검사되는 경우 QTV 중의 어느 하나가 유의한 경우를 측정하기 위해 사용한다. 다변수 선형 회귀 분석법은 모든 변수가 동시에 검사되는 경우 QTV 중의 어느 하나가 유의한 경우를 측정하기 위한 제2의 접근법으로서 사용한다. MAOA 유전자는 의존 변수로서 설정되며, 27개의 QTV가 독립 변수로서 단계적으로 도입된다.
Chi 스퀘어
상기 연구는 최장 대립형질이 QTV의 대부분에 대해 최고 평균을 가짐을 나타낸다. ≤335 bp 대립형질의 잠정적 진행성 빈도 감소를 진행적으로 더 적은 TS 증상들을 갖는 4개의 그룹 전체와 비교한다: ADHD를 갖는 TS 프로밴드, ADHD가 없는 TS 프로밴드, TS가 있는 관계조 및 TS가 없는 관계조.
MANOVA
물질 남용 그룹에 대해, MANOVA를 사용하여 4개의 MAOA 대립형질 그룹과 2개의 요약 변수, 알콜 및 약물 스코어 사이에 유의한 관계가 있는지를 측정한다. ANOVA를 사용하여 4개의 대립형질 그룹에 대한 알콜과 약물 스코어의 평균을 검사한다.
선형 χ 스퀘어
≤335 bp 그룹의 잠정적 진행성 빈도 증가를 3개의 그룹 전체에 대해 검사한다: 대조 그룹, 행동이 없는 물질 남용자(ATU 위드아웃), 및 행동이 수반되는 물질 남용자(ATU 위드). ATU 위드아웃 그룹은 상이한 행동에 대한 합병증으로 인해 물질 남용자에서의 빈도가 증가될 가능성을 배제하도록 포함된다. 이를 배제시키기 위해, 대립형질 그룹의 빈도는 행동이 없는 경우에 비해 행동이 있는 물질 남용자에서 20% 이상 더 높다. 이들 대립형질의 빈도가 3개 그룹 전체에서 진행적으로 증가한다는 가설에 따라, 선형 χ 스퀘어 통계학이 사용된다.
회귀 분석
MAOA 유전자에 의해 계산되는 약물 관련 변수의 최대%를 측정하기 위해, 회귀 분석을 수행하여 ≤335 bp 대립형질을 수반하는 대상을 1로서 스코어를 매기고 ≤335 대립형질을 수반하는 대상을 2로서 스코어를 매긴다. 이는, MAOA 유전자와 가장 많이 관련된 χ 스퀘어 변수이기 때문에, 약물 의존 변수에 대해 수행된다(대조용 = 1, ATU 위드아웃 = 2, ATU 위드 = 3).
결과
대립형질 그룹
두 그룹에 대한 대립형질 분포가 도 3에 도시되어 있다. 이는 복합 VNTR이므로, 대립형질이 기저 쌍의 짝수 또는 홀수의 명확한 절단 패턴으로 떨어지지 않는다. 그 결과는 이들이 제노타이핑 프로그램에 의해 생성됨에 따라 정확하게 도시된다. bp 316과 323bp 사이에는 어떠한 대립형질도 없으므로 ＜320과 ＞320bp의 2개의 명확한 주요 그룹이 생성된다. 그러나, 표현 효과가 크기와 연관이 있을지도 모른다는 가설을 조사하기 위해, 보다 큰 323-339bp 그룹의 대립형질을 주요 피크 320-333bp보다 짧은 대립형질, 주요 피크 334bp보다 짧은 대립형질, 및 주요 피크 ≤335bp보다 긴 대립형질로 이루어진 3개의 서브그룹으로 분류한다. TS 그룹에서 총 375개의 피검자 중에서 남성의 것은 219개이고 여성의 것은 156개이다. 여성의 것 중에는 88개가 이형 접합자이다. 이들을 제거하면 287개의 대상이 남으며, 이의 연구 중 36개가 대조 그룹이다. 이와 같은 최종 그룹에서, 남성 유전자 대 여성 유전자에서 4개의 대립형질 그룹의 빈도 분포에 있어서 유의한 차이는 없다.
TS 그룹
QTV 대 4개의 대립형질 그룹 각각에 대한 ANOVA 결과를 표 20d에 제시하였다. 정규 ANOVA에 대한 결과는 F-비 및 p값으로 제시하였다. 선형 ANOVA에 대한 F-비는 F2컬럼하에 제시하였으며, 상첨자 1은 ＜0.05에서 유의한 것들을 나타낸다. QTV는 F2컬럼에서 F-비의 감소 크기에 의해 규칙적으로 된다. ≤0.05에서 α로 설정된 터키(Tukey) 시험에 의해 측정되는 바와 같이, 평균이 ≤335bp 그룹보다 유의적으로 적은 이들 대립형질 그룹은 별표로 나타내었다. 말더듬증, 쇼핑 및 공포(이는 최저 F-비를 나타낸다)을 배제하고, 나머지 24개의 OTV에 대해 ≤335를 수반하는 대상들의 평균이 가장 높다.
통계적 분석
모두 27개의 QTV에 대한 MANOVA의 결과는 성적인 문제(p = 0.012), 학습 문제(p = 0.023), 도박 문제(p = 0.025) 및 매니아(p = 0.025)에 대해 유의하다. 모두 27개의 QTV가 단계적 다중변량 회귀 분석으로 동시에 검사되는 경우, 가변적 학교성적 문제(p = 0.012) 및 도박 문제(p = 0.038)가 유의하다. r2값을 기준으로 하여, MAOA 유전자가 단지 3.9% 또는 이들 QTV의 편차로 산정된다. Chi 스퀘어 분석을 사용하여, ≤335 대립형질을 수반하는 피검자의 %가 유의하게 진행성 감소하며, ADHD(24%, n =129)를 갖는 TS 프로밴드로부터 ADHD(20.0%, n = 50)가 없는 TS 프로밴드, TS를 갖는 관계조(12.5%, n = 16) 및 비 TS 관계조(5.6%, n = 56)(p = 0.003)까지 진행한다.
물질 남용 그룹. 대조 그룹 대 ATU 피검자
160개의 합한 대조 그룹에 대해, 4개의 대립형질 그룹의 분포는 다음과 같다: ＜320-34.4%, 320-333-38.1%, 334-335-21.3%, ≤335 6.3%. 120개의 ATU 피검자에 대해, 빈도는 다음과 같다: ＜320-39.2%, 320-333-18.3%, 334-20.8%, ≤335-21.7%. 이들은 유의적으로 상이하다. χ2 = 22.17, p =0.00006. ≤335 bp 그룹의 빈도는 2개의 대조 그룹에 필적하며, 산 베르나르디노 그룹에 대해 8.9%이고, 쌍둥이의 부모에 대해 5.2%이다(χ2 = 0.744, p = 0.38).
MANOVA
알콜 및 약물 스코어에 대한 MANOVA는, 이들이 둘 다 MAOA 유전자 VNTN 대립형질와 유의한 연관이 있는 것을 나타내는 반면, 이는 알코 스코어(p = 0.012)에 대해서보다는 약물 스코어(p = 0.001)에 더 유의함을 나타낸다(표 21). 합한 MANOVA 결과 또한 유의하다(p = 0.007). 257의 N은 총 160 대조 그룹 + 120 ATU, 또는 280보다 적은데, 그 이유는 단지 97 ATU 피검자만이 ASI를 종결지었기 때문이다. 반대로, 모두 120개가 알콜 및/또는 약물 의존도의 DSM 진단의 변형에 대한 DIS를 종결지었다.
ANOVA
각각의 대립형질 그룹을 나타내는 2가지 스코어에 대한 ANOVA는 표 22에 나타내었다. TS 그룹에 대해, 최고 평균은 ≤335 bp 대립형질 그룹에 존재한다. 약물 스커어에 대해 3개의 기타 대립형질 그룹은 터키 시험에 의해 ≤335 bp 그룹보다 유의하게 낮다.
Chi 스퀘어
MAO 유전자가 물질 남용의 특정 양태와 우선적인 연관이 있는 지를 측정하기 위해, 사용되는 물질의 유형과 관련된 변수의 14개를 검사한다. 대조 그룹에서 ≤335 bp 대립형질 대 행동이 없는 ATU 대상(ATU 위드아웃) 대 행동이 있는 ATU 대상(ATU 위드)의 빈도가 표 23에 제시되어 있다. 물질 사용 변수의 14가지 형태가 검사되므로, p가 0.0036(0.05/14) 미만인 것만이 본페로니(Bonferroni) 보정으로 유의한 것으로 간주된다. p가 ＜0.01인 것들만이 제시된다. 예외는 알콜 의존성뿐이다. 이는 약물 의존성 또는 알콜 및 약물 의존성인 이들에 비해 알콜 의존성인 대상에서 ≤335 bp 대립형질의 빈도가 거의 증가하지 않는다는 사실을 설명하기 위해 제시한 것이다. 반대로, 단지 가변적인 약물 의존성은 최고치를 나타낸다(χ2 = 17.4, p = 0.00003).
회귀 분석
대립형질 그룹의 회귀 분석(＜335 대 ≤335) 대 약물 의존성의 진단법의 결과는 다음 결과를 제공한다: r = 0.25, r2= 0.0625, T = 4.305, 및 p ≤ 0.0001.
물질 남용
효소 농도(참고: Wiberg et al., 1977; Gottfries et al., 1994; Vonknorring et al., 1991)와 유전자 변종(참고: Vanyukov et al., 1993)을 모두 사용하는 선행 연구에서 물질 남용에 있어서의 MAOA 유전자의 역할을 제안한 바 있다. 본 발명의 결과는 이러한 결론과 일치하며, 특히 약물 의존성에 있어서 그러하다. MANOVA는 MAOA 대립형질들과 알콜 및 약물의 두 스코어 사이의 유의한 상관관계를 제시하면서, 물질 남용의 이들 두 형태의 다수의 합병증이 있다. 표 23에 제시한 바와 같이, 약물 의존성과 알콜 의존성이 별도로 검사되는 경우, 이러한 상관관계는 알콜 의존성보다는 약물 의존성이 더 크다.
남성 우세
ADHD, 토우렛 신드롬, 행동 이상, ODD, 난독증, 학습 이상, 말더듬기, 약물 의존성 및 알콜중독 모두가 남성 우세를 나타낸다. 남성 우세는 부분적으로는 호르몬 및 환경적 인자에 기인하는 반면, X-결합된 유전자 또한 그러한 인자를 가질수 있다. TS 그룹의 경우, 회귀 계수를 사용하는 r2의 측정 결과, 상이한 QTV에 대해 MAOA 유전자는 모든 QTV의 편차의 최대 2.5% 미만으로 산정되어, X-결합된 MAOA 유전자는 TS, ADHD 또는 관련 이상의 남성 우세를 설명하지 못한다는 사실을 제안한다. 반대로, ≤335 bp 대립형질의 부재 또는 존재 대 약물 의존성의 진단법에 대한 r2는 6.2% 이하의 편차가 MAOA 유전자에 기인함을 제안한다. 이는 약물 의존성의 남성 우세에서 중도의 역할을 담당할 수 있다.
보다 긴 소형 위성 대립형질와 토우렛 신드롬 그룹에서 특정한 QTV와의 상관관계가 표 21에 제시한 바와 같이 중간 정도인 반면, QTV 전체에 걸쳐서 균일화도가 탁월하다. 이는 우연한 무작위 상관관계일 수 있으므로, 발명자들은 이러한 결과가 대상 및 대조 그룹의 완전 별개 그룹에서 재생될 수 있는 지의 여부를 결정해야 한다. 이러한 그룹(물질 남용 그룹)은 MAOA VNTR의 더 긴 대립형질, 특히 ≤335 bp 대립형질 사이의 상관관계가 TS 그룹에서 관찰되는 것보다 훨씬 강하다는 사실을 나타낸다. 2개의 그룹에 대한 패턴은 ≤335 bp 대립형질에 대한 최고 스코어, 최소 크기 대립형질(＜320)에 대한 조금 높은 스코어 및 334-335 bp 대립형질와 매우 유사하다. 반복 대립형질의 크기와의 이러한 상관관계는 위성 자체가 MAO 유전자의 정규화에 일익을 담당하는 가능성과 일치한다.
1＜0.05에서 유의함. F2 = 선형 ANOVA에 대한 F-비
* 터키 시험에 의한 a = 0.05에서 유의적으로 ≥ 335 미만임.
(소정의 평균 및 표준 편차)
(n = 287)
* 터키 시험에 의해 α = 0.05에서 ≥335에 대한 평균치보다 유의하게 낮음.
* OSH = 기타 오피트(헤로인 또는 메타돈 이외), 진정제 및 최면제
실시예 3
정신분열증세/도피성 행동과 연관된 도파민 D2 수용체의 다형체
대상 선정 및 시험 투여
백인 자원자를 모집한다. 남성 58명과 여성 71명이고 평균 연령은 각각 40.9 ± 1.8세와 47.3±1.5세(평균±표준 편차)이다. 밀론 클리니칼 멀리액시얼 인벤토리(MCMI-II) 컴퓨터화 시험 2판을 수행하기 전에, 자원자들은 정맥천자에 의해 혈액 15cc를 헌혈한다. 인종적 및 윤리적 계층화에 대한 우려로 인해, 라티아메리카가 아닌 북부 및 서부 유럽의 백인으로부터 채취하며, 이때 대조 그룹에 대한 가장 광범위한 데이타가 이 그룹으로부터 나오기 때문에 일부 예외는 있다. 본 연구를 위해, 총 129명의 약물 또는 알콜 남용의 합병증이 있거나 없는 정신병 피검자가 제노타이핑 및 밀론 클리니컬 멀티액시얼 인벤토리(MCMI-II)를 사용한 평가를 위해 선정된다. 이 그룹은 다음과 같은 구성으로 이루어진다: 정서 이상(22.1%), 일반화된 불안 이상(8.4%), 극단성(24.5%), 양극성(12.9%), 정신분열증세(5.2%), 주의 산만 이상(21.9%) 및 약물 사용 이상(18.1%).
밀론 클리니컬 멀티액시얼 인벤토리를 사용하여 각 대상의 정신분열증세/도피성 클러스터를 포함하는 11개의 공지된 인격 이상을 평가하는데 사용된다. 이 시험은 175가지 항목을 포함하며, 대부분의 사람이 20 내지 30분 내에 이를 끝마친다. 이의 22가지 임상적 척도의 각각은 인격 및 정신병 이론으로부터 유도된 증세의 작용 척도로서 조직된다. 임상적으로 세워진 스케일을 공식 진단 시스템 및 이의 증상 분류(DSM-IV)와 직접 조화시킨다. 별도의 스케일을 DSM-IV 모델과 일직선으로 배치하여 급성 임상 이상(Axis I)으로부터 피검자의 보다 지속적인 인격(Axis II)과 구분한다. 표준 스코어 변형을 분석하기 보다는 실제적인 기본 비율 데이타를 사용하여 스케일 측정을 계산하고 정량화한다. 기본율 60은 이상을 지시한다. 75 내지 83의 기본율은 만성 또는 다소 심각한 이상을 나타내며 84 이상은 제어될 수 없는 병리학적 이상을 나타낸다. 이러한 연구에서, 발명자들은 특정 클러스터에 대해 85 이상의 % 등급을 달성한 대상 행동의 밀론의 정신분열증세 도피성 클러스터를 사용하여 연구 그룹을 동정한다. 발명자들은 피검자들을 이들의 MCMI-II 스코어에 따라 분류하여 다음 구분에 따라 4가지 상이한 기본율로 프로밴드를 그룹화한다: (1) 60 미만의 스코어; (2) 60 내지 73의 스코어; (3) 74 내지 83의 스코어; (4) 84 내지 100. 대상 인구의 통계학이 표 24에 기재되어 있다.
MCMI-II 시험 스코어는 104명의 피검자를 미네소타 다중 인격 인벤토리(MMPI) 인격 이상 척도와 비교함으로써 상이한 피검자 군집에 대해 유효하다. 기존의 유의성 수준을 사용하여 유효 결론을 보장한다. 정신분열증세, 도피성, 의존성, 신파성 및 자아도취 척도는 유의적으로 상관관계가 있으며, 수동적-공격적, 정신분열증세 및 경계례 척도는 상응하는 MCMI-II 척도와 상관관계가 없으므로, 이러한 시험의 사용을 유효화하여 정신분열증세 및 도피성 행동의 비정상적인 인격 특성(Shuler et al., 1994; Zimmerman et al., 1994)을 신뢰성 있게 측정한다.
이러한 연구를 위해, 30명의 "슈퍼" 대조 그룹 피검자들을 선별하여 알콜 중독, 다수 물질 의존성, 흡연 행동, 탄수화물 과다섭취, BMI ＞25, 물질 사용 이상의 가족 병력, ADHD, 병리학적 도박 및 아식스 II 진단법(SAB 포함)을 포함하는 보상 결핍 행동의 수를 배제하고 DRD2A1및 A2대립형질에 대해 제노타이핑한다. 추가의 대조 그룹은 다음과 같은 3가지 지원자 공급원으로부터 취한다: A) 토우렛 이상 피검자의 양부모, 수양부모 또는 계부 및 계모; B) 갑상선암 또는 비인슐린 의존성 당뇨병을 앓는 내분비 클리닉으로부터의 대상; 및 C) 전문가, 기술자 및 상주 근로자를 포함하는 병원 직원. 총 142명의 대조 그룹으로부터 ADHD, 알콜중독 및 담배 남용을 선별하여 배제시킨다. 발명자들은 DAT1 9 및 10 대립형질에 대한 이들 91개의 대조 그룹과 DβH B1및 B2대립형질에 대해 10개의 대립형질와 51개의 대조 그룹을 제노타이핑한다. 본 발명자들은 합병적 RDS 행동(즉, 이 군집 중의 18.1%가 물질 사용 이상)을 갖는 피검자들과 가능한 통계학적 혼동을 인식하는 한편, SAB를 갖고 참석한 피검자에서 모든 RDS 행동을 배제하기가 매우 어렵다는 사실을 똑 같이 인식한다. 따라서, 본 발명자들은 장래에 추가의 연구를 기다리면서 이러한 이슈를 상세하게 제기해야 한다.
제노타이핑
본 연구에서 하나 이상의 도파민 유전자에 대해 제노타이핑된 대상의 총 수는 271이다. 모든 대상은 천연 동정 수를 토대로 제노타이핑되며 유형화된 개인을 지식 없이 판독한다.
DRD2 다형체
D2A1및 D2A2제노타이핑은 기술된 바와 같이 남쪽 얼룩의 혼성화에 의해 수행된다(참고: Blum et al. 1990a ; Comings et al., 1995). 샘플의 수 또한 PCRTM기술에 의해 제노타이핑된다(참고: Noble et al. 1994d).
DβH 다형체
다마토 앤드 어소세이츠(d'Amato et al., 1989)는 A와 B로 명명된 2개의 Taq DβH 다형체의 존재를 보고한다. 사용되는 DβH cDNA 클론 AII(Lamouroux et al., 1987; Lamouroux et al., 1993)은 EcoRI 사이트에서의 2.7Kb 삽입물로 이루어진다. 벡터의 라벨링을 개선시키는 것은 BamHI 및 Sa/I로 분해하여 5개의 밴드를 생성시킨다. 3.5Kb 분획을 라벨링하여 β 다형체를 시험한다. Taql 제한 엔도뉴클레아제를 사용한 분해, 한천에서의 전기영동, 나일론 필터로의 남부 전이, 32P 라벨링된 탐침을 사용한 혼성화 및 방사선사진술은 2.8Kb(B) 및 1.4Kb(B)의 분획을 증명한다.
DAT1반복 다형체
3'UTR에서의 대립형질은 올리고머를 사용하여 PCRTM에 의해 측정하며, PCRTM조건은 반덴베르그(Vandenberg) 등에 의해 보고되어 있다(1992b). PCRTM확대에 이어서, 생성물을 가시화를 위한 크기 결정 세트를 사용하여 아크릴아미드 겔 8%에서 전기영동시킨다.
통계학
비율을 피어슨(Pearson)의 Chi 스퀘어와 피셔(Fisher)의 정확한 시험을 이용하여 2 × 2 표에 대해 분석한다. 2 × 3 표와 같은 보다 큰 표는 피어슨의 Chi-스퀘어와 선형 트렌드에 대한 만텔 헨젤 시험을 이용하여 분석한다. 평균차는 스튜던트의 t-시험을 사용하여 시험한다. 다중 논리학적 회귀를 사용하여 정신분열증세/도피성 스코어가 높은 확률을 예견하는 하나 이상의 변수의 기여도를 분석한다. 논리학적 모델은 보정 시험의 홋머-레메쇼 양호도, 수용자 작동 특징(ROC) 곡선하의 면적을 나타내는 c 통계학, r-스퀘어 또는 SAS 컴퓨터 프로그램 Proc 논리학에 의해 계산되는 편차의 존재를 사용하여 평가한다. 홀수비는 임의의 논리학적 회귀 모델에서의 예측 변수에 대해 컴퓨터로 계산한다(Dunn and Clark, 1995).
결과
정신분열증세/도피성 데이타 세트에 대한 분석은 도파민 대립형질의 84 이상인 MCMI-II 정신분열증세 및 MCMI-II 도피성 스코어에 대한 χ 스퀘어 접근 제한 잠정적 연관관계를 이용하여 수행하여 제안된 표현형의 정도를 보장한다. DRD2A1대립형질은 정신분열증세 50%(11/22)와 도피성 44%(12/27) 피검자들에게서 발견되며, DAT1480 bp(VNTR 10/10 대립형질)는 정신분열증세 72%(13/18)와 도피성 62%(13/21) 피검자들에게서 발견되며, DβH B1대립형질은 정신분열증세 81.3%(13/16)와 도피성 82.4%(14/17) 피검자들에게서 발견되는 것으로 밝혀졌다. χ 스퀘어를 사용하여, DRD2A1대립형질은 DRD2A2대립형질(χ2= 7.6, df = 1, p ＜0.006)에 비해 정신분열증세/도피성 클러스터(MCMI-II 스코어 ≥ 84)를 갖는 피검자와 유의적인 연관이 있다. DRD2A1대립형질의 동형접합체는 SAB 클러스터의 멤버쉽을 갖는 피검자들의 최고 %를 나타낸다(≥ 84). 이형접합체는 동형접합체 그룹에서의 SAB 피검자들의 %의 대략 절반이다. 반면, 단지 DRD2A2표시만을 갖는 그룹은 SAB의 최저%를 나타낸다(선형 트렌드 분석: p ＜0.005, A1/A1= 83%, A1/A2= 41%, 및 A2/A2= 23%).
DRD2A1대립인자 데이타와는 달리, χ 스퀘어 분석은 분열병질/회피 행동을 사용하여 DβH B1대립인자와 DAT110/10 대립인자의 관계를 밝힐 수 없다. DRD2대립인자, 연령 및 성별의 유의적 관계에 대한 기호논리적 회귀 시험을 사용한 이분된 SAB 스코어의 다중 다양한 관계를 사용하면 DRD2A1대립인자와 성별은 둘 다 SAB 중증도의 유의적인 예언인자들이다. 본 발명자들은 DRD2A1대립인자를 사용하여 우열비가 2.79(p=0.018)이고, 성별로는 3.6(p=0.0031)이며, 호스머-레메쇼우(Hosmer-Lemeshow) 우성은 p=0.78일 때 적합함을 발견했다. 30명의 선별된 수퍼 대조 그룹(알콜 중독자, 다물질 의존자, 신체 충실 지수 25 미만자, 흡연자, 가족 병력자, 병적 도박자, ADHD, 분열병질/회피 행동자 제외)에서, DRD2A1대립인자의 이환율은 1명/30명 또는 3.3%이다. 91명의 선별된 대조 그룹의 경우, DAT110/10 대립인자의 이환율은 34명/91명 또는 37.4%이고 51명의 선별된 대조 그룹의 경우, DβH B1대립인자의 이환율은 27명/51명 또는 53%이다.
DRD2A1대립인자(18명/37명 또는 48.6%)에 대해, 문헌의 대조 그룹 185명/714명 또는 26%(χ2=9.2, df=1, p=0.0024; OR=2.71)와 수퍼 대조 그룹(χ2=16.8, df=1, p=0.00004; OR=27.5)을 SAB≥84과 비교하여 유의적으로 관련이 있음을 밝혀냈다. 또한, 선별된 대조 그룹(χ2=6.3, df=1, p=0.0012; OR=3.0)과 비교하면, SAB(18명/28명 또는 64.3%)로 진단된 개인들에서의 DAT1480 bp(VNTR 10/10 대립인자) 사이에 유의적인 관련이 있음을 밝혀냈다. 또한, 선별된 대조 그룹(χ2=2.89, df=1, p=0.09; OR=2.52)과 비교하면, SAB(17명/23명 또는 73.9%)를 갖는 것으로 평가된 DβH B1대립인자의 캐리어도 유사한 경향이 있는 것으로 밝혀졌다. 기호논리적 회귀 분석이라 불리는 통계적 기술을 사용하여 MCMI-II 스코어가 84 미만인 모든 경우와 MCMI-II 스코어가 84(중증도 스코어)를 초과하는 모든 경우를 비교하면, DRD2A1대립인자는 분산이 8.3%로서 통계적으로 유의하다(χ2=7.5, df=1, p=0.0059; OR=2.52). 대조적으로, DAT1(10/10 대립인자)은 분산이 1.6%이고, DβH B1대립인자는 분산이 0.0025%이며 분산에 대한 기여치는 아니다.
성별을 기호논리적 회귀 모델에서 단일변수로서 검정하는 경우, 성별만의 전체 분산에 대한 기여치는 9.9%(χ2=9.4, df=1, p=0.0022)이다. 84를 초과하는 높은 분열병질/회피 MCMI-II 스코어를 예견하는 기호논리적 회귀 모델에서, DRD2A1대립인자와 성별을 예언인자로서 사용하면, 이러한 예언인자의 우열비는 DRD2유전자의 경우는 2.79이고 남성에 대해서는 3.55이다. 호스머-레메쇼우(Hosmer-Lemeshow) 우성은 p=0.778일 때 적합하고, C 통계치(ROC 곡선 밑의 영역)는 0.714이며 분산에 대한 조합된 기여치는 17.9%이다. 또한, 유전자형이 DRD2A1및 A2대립인자인 67명의 피검자를 대상으로 하고 위의 방법을 사용한 파일럿 연구에서, 본 발명자들은 MCMI-II 시험에 의해 평가된 다른 10명의 개인적 특성과 관련되지 않음을 밝혀냈다.
결론적으로, 본 발명자들은 분열병질/회피 집단으로서 지칭되는 비정상의 개인적 특성에 대한 3개의 도파민성 유전자 다형성의 기여도를 알아보기 위해 MCMI-II 자기 보고 자동화 시험을 사용한 관련 연구를 수행하였다. 관련도는, 피검자의 민족성, 성별 및 연령은 독립적이기 때문에 인구 성층화에 의해서는 나타나지 않는 것으로 밝혀졌다. 또한, 일반 인구를 기초로 한 분열병질/회피 행동의 빈도는 1 내지 4%이다. DAT1(10/10 반복 대립인자)과 DβH B1대립인자의 전체 분산에 대한 유의적 기여치의 부족은 샘플 크기로 인해 아직 통제될 수 없다. 사실, 샘플 크기가 단지 44명(소실값으로 인한)일 때의 이러한 3개의 유전자 다형성은 다중변수 회귀 분석과 조합하면, 유전 분산이 약 7.6%이고, 이는 다중 유전자와 성별과 같은 다른 인자가 이러한 복잡한 행동 장애에 포함되는 경우 예상할 수 있다.
실시예 4
생체내 약물 사용과 관련된 캐나비노이드 수용체 유전자
방법
대상
혼합 인자로서의 민족 수를 최소화하기 위해, 모든 피검자를 비스페인계 백인 92명으로 제한한다. 대조 그룹은 62명의 성인 학생(SB 대조 그룹)과 52명의 피검자(LL 대조 그룹)로 구성한다. 후자는 40%를 회사직원으로, 43%를 비서와 사무원으로, 17%를 의학박사와 철학박사로 구성한다. 두 그룹 모두 총 114명이다.
평가
약물 또는 알콜의 남용자/의존자를 개인 면담을 통해 LL 대조 그룹에서 제외시킨다. 모든 대조 그룹을 약물 남용을 포함하는 24개 항목의 자기 관리 질문서를 사용하는 미시간 알콜중독 중증도 시험(MAST-R)으로 평가한다. MAST-R 스코어가 4보다 큰 모든 SB 대조 그룹은 제외시킨다. 또한, 모든 ATU 피검자를 임상관리 진단 인터뷰 스케쥴(DSM-III-R 버전)로 평가하여 물질 의존성 질환의 존재를 진단하고 임상관리 중독 중증도(제5판)로써 실시예 4에 기재한 바와 같은 알콜 및 약물 사용 변수 범위를 평가한다.
유전자형
전혈로부터 표준 방법을 사용하여 DNA를 추출한다. DNA 샘플을 도슨(Dawson)이 기술한 프라이머, 즉 5'-GCTGCTTCTGTTAACCCTGC-3'(서열 확인 번호: 3) 및 5'-TACATCTCCGTGTGATGTTCC-3'(서열 확인 번호: 4)를 사용하여 확대한다. 이는 (AAT)n삼중 반복 대랍형질로서 확인된다. PCTTM생성물을 표지화하기 위해, 각각의 프라이머 0/1μM을 형광성 HEX 아미다이트[미국 캘리포니아주 포스터 시티소재의 어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems) 제품] 프라이머로 표지화한다. 10배로 희석된 PCTTM생성물 2㎕를 6% 폴리아크릴아미드 겔에 부하하고 실시예 2에서 VNTR 다형성의 PCTTM다형성 분석에 대해 기재한 바와 같이 분석한다.
대립인자 및 유전자형 빈도의 통계학적 분석
대조 그룹에서의 상이한 대립인자의 빈도 대 ATU 피검자에서의 상이한 대립인자의 빈도는 캐나다 오타와주 챨톤 대학 죠지 카모디에 의한 RxC 프로그램을 사용하여 유의적 차이[참조: Roff and Bentzen, 1989]에 대한 회귀 몬테 카를로 시험(recursive Monte Carlo test)을 사용하여 검정한다. 이러한 컴퓨터를 사용한 접근 방법의 이점은 평가된 표준 오차를 사용한 χ 스퀘어 시뮬레이션이 세포의 붕괴없이 소수의 관찰 횟수(특히 제로)로도 완결될 수 잇다는 것이다. 상이한 유전자형의 빈도는 χ 스퀘어 분석을 사용하여 비교한다.
인자 분석
다수의 변수 분석의 통계적 문제를 해결하기 위해, 2가지 인자만이 생성되도록 제한하면서 예비 인자 분석을 실시한다. 인자 1은 약물 의존성과 관련된 변수와 조합하는 경향이 있고 인자 2는 알콜 의존성과 관련된 변수와 조합하는 경향이 있다.
대립인자 그룹 및 유전자형
본 발명자들은 1개, 및 3 내지 10개의 반복단위로 이루어진 상이한 9개의 대립인자를 관찰하였지만, 당해 연구에서 대조 그룹이나 ATU 피검자 어느 누구도 2개의 대립인자를 갖지 않는다. 대조 그룹과 ATU 피검자에서의 9개의 대립인자의 분포는 가장 통상의 대립인자가 4개임을 나타낸다. 이는 대조 그룹에서 36.4%가 존재하고 ATU 피검자에서는 31.7%가 존재하며 정맥내 약물을 사용하는 ATU 피검자에서는 20.2%가 존재한다. 본 발명자의 연구 가설[참조: Comings, 1996b; Comings, 1996a]은 미세위성(microsatellite)은 주로 Z-DNA의 형성을 통해[참조: Hamada et al., 1982; Schroth et al., 1992] 유전자 통제에 직접적인 역할을 하고 효과의 크기는 반복단위의 길이에 좌우된다는 것이었다. 주요 대립인자 그룹은 4개의 반복단위이고 1개 또는 3개의 대립인자는 거의 없기 때문에, 9개의 대립인자가 짧은 대립인자(＜5)와 긴 대립인자(≤5)로 이루어진 2개의 그룹으로 자연스럽게 분리된다. 이로써 유전자형 ＜5/＜5, 이종접합체 및 ≤5/≤5가 생긴다. 통계적 복잡성을 제거하기 위해, 기타 대립인자, 유전자형 또는 대립인자들의 조합물은 검정하지 않는다.
ANOVA
다수의 변수에 관한 통계적 복잡성을 제거하기 위해, 초기 시험으로 ANOVA로써 위의 3가지 유전자형에 대해 인자 1과 2를 검정한다. 이는 후속 시험이 주요 열성 모델(＜5/＜5 대 이종접합체 + ≤5/≤, 또는 ≤5/≤5 대 이종접합체 + ＜5/＜5)을 제안할지, 아니면 우성 모델(≤5/≤5 + 이종접합체 대 ≤5/≤5, 또는 ≤5/≤5 + 이종접합체 대 ≤5/≤5) 또는 이형시스(이종접합체 대 ≤5/≤ + ≤5/≤5)을 제안할지를 측정하는데 사용한다. 결과는 ≤5/≤5 대 이종접합체 + ＜5/＜5의 열성 모델을 제안한다. 그리고, 통계적 복잡성을 제거하기 위해, 기타 모델은 검정하지 않는다. 인자 1 또는 인자 2가 유의한 결과를 생성시키면, 인자 분석에 의해 제안된 서브스코어의 몇몇은 열성 모델을 사용한 ANOVA로 연구한다.
χ 스퀘어 분석
유의 인자에 의해 강조된 개개의 변수를 2× 3 χ 스퀘어 시험을 사용하여 추가로 평가한다. ×2 디멘션은 2개의 유전자형 그룹, 즉 ≤5/≤5 반복 대립인자에 대한 동종접합성 대 다른 유전자형으로 이루어진다. ×3 디멘션은 대조 그룹(1), 제시된 변수에 대한 스코어가 0인 ATU 피검자(ATU 네가티브)(2) 및 제시된 변수에 대한 스코어가 1 이상인 ATU 피검자(ATU 포지티브)(3)로 이루어진다. ATU 네가티브 그룹은, ATU 피검자의 ≥5/≥5 유전자형 빈도의 증가가 실제로 코모비드 장애 또는 검정되지 않은 변수에 의할 수 있다는 가능성을 통제하기 위해 첨가할 필요가 있다. 본 발명자들은 3가지 패턴을 예상했다:
A. 유의적 직선: ≥5/≥5 유전자형이 제시된 변수와 관련되어 있을 경우, 본 발명자들은 대조 그룹에서 ATU 네가티브로 진행하는 ≥5/≥5 그룹은 그 변수에 대해 네가티브이고 ATU 포지티브로 진행하는 그룹은 그 변수에 대해 포지티브인 경우의 증가율(%)이 유의적 직선형임을 예상했다. 이러한 진행성 증가의 유의성은 직선 χ 스퀘어 시험을 사용하여 시험한다[참조: Mantel-Haenzel χ square of the SPSS Statistical Package, SPSS, Inc., Chicago, IL]. ≥5/≥5 유전자형이 하나 이상의 물질 또는 변수와 관련될 수 있기 때문에, 본 발명자들은 또한 ≥5/≥5 캐리어의 %가 ATU 네가티브 그룹에서보다 ATU 포지티브 그룹에서 20% 이상 더 높아야할 것을 요구했다.
B. 유의적 비직선: ≥5/≥5 유전자형의 이동률(%)이 ATU 포지티브 그룹에서보다 ATU 네가티브 그룹에서 높을 경우, p 값이 유의하더라도 ≥5/≥5 유전자형은 제시된 물질과 연관이 없는 것으로 여겨진다.
C. 비유의적 비직선: p 값이 ＞0.05인 경우, ≥5/≥5 유전자형은 또한 제시된 물질과 연관이 없는 것으로 여겨진다.
결과
피검자 특성
ATU 피검자의 평균 연령인 39.7세(표준 편차 7.0, 23 내지 52세)를 대조 그룹의 평균 연령 38.4세(표준 편차 12.6, 21 내지 71세)와 비교한다. 이들은 유의적으로 현저히 상이하지 않다(F 비=0.76, p=0.38). 모든 ATU 피검자는 남성이고 대조 그룹은 45명(39.5%)이 남성이고 69명(60.5%)이 여성이다.
대립인자 빈도
정맥내로 약물을 투여한 ATU 피검자는, 임상 경험상 이러한 경우 가장 심각한 약물 의존성 문제가 있는 피검자를 나타내는 것이기 때문에 골라낸다. 모든 대립인자의 빈도를 대조 그룹 대 ATU 그룹에서 몬테 카를로 시험을 10,000회 반복 실시하여 비교하면, 유의적으로 상이하지 않음을 나타낸다(χ2=7.09, p=0.54). 대조 그룹을 정맥내 사용자와 비교하면, 차이는 경계선이다(χ2=14.49, p=0.065).
대조 그룹의 경우, 41명 또는 36.0%가 ≥5/≥5 이종접합체인 반면, ATU 피검자는 43명 또는 46.7%가 ≥5/≥5 동종접합체(p=NS)이다. 정맥내 약물 사용자 32명중 20명 또는 62.5%가 ≥5/≥5 동종접합체(χ2=7.23, p=0.007)이다.
대조 그룹에 여성이 있지만, 대조 그룹 남성(37.8%, n-45) 대 여성(34.8%, n=69)의 ≥5/≥5 유전자형의 이환율에는 차이가 없다(χ2=0.106, p=0.74).
인자 분석
인자 분석은 2가지의 인자를 생성시키기 위한 것이다. 인자 1은 약물 남용과 관련된 변수로 이루어진다. 이는 약물의 정맥내 사용과 관련된 변종, 약물 복용량, 다양한 약물의 사용 기간(년), 약물 스코어 및 약물 의존성 형태의 DSM 진단으로 이루어진다. 인자 2는 DUI 수, 알콜에 대한 금전적 지출량, 알콜 중증도 스코어, 알콜 해독 횟수, 알콜 스코어 및 알콜 의존성의 DSM 진단으로 이루어진다.
인자 1 및 2의 ANOVA 분석 결과를 표 25에 나타낸다. 평균 인자 1 스코어는 ＜5/＜5 대립인자(-0.085)에 대한 이종접합체(-0.51) 또는 동종접합체인 피검자보다 ≥5/≥5 대립인자(0.198)에 대한 동종접합체인 피검자에서 가장 높다(F 비=2.85, p=0.060). 이는 ≥5 반복 대립인자에 대한 동종접합체 대 ≥5 반복 대립인자(기타)에 대한 이종 접합체 + 동종접합체의 열등 모델을 제안한다. 이 모델을 ANOVA로 검정하면, 인자 1의 평균은 기타 유전자형(p=0.019)을 갖는 피검자보다 ≥5/≥5 유전자형을 갖는 피검자가 유의적으로 더 크다. 대조적으로, 3가지 유전자형 또는 열등 모델을 사용하여도 인자 2의 평균은 유의적인 차이가 없다.
이러한 초기 결과는 약물 의존성에는 관련되지만 알콜 의존성에는 관련이 없는 CNRI 유전자의 대립인자에 대해서도 일치한다. 이를 추가로 검정하기 위해, 본 발명자들은 알콜 스코어, 약물 스코어 및 정맥내에 사용된 약물의 수에 대한 평균에 대해서 열등 모델을 시험한다(표 26). ≥5/≥5 유전자형을 갖는 피검자에 대한 평균 약물 스코어가 기타 유전자형(p=0.038)을 갖는 피검자에서보다 현저히 크다. 정맥내에 사용된 약물의 평균수(#정맥내)는 또한 ≥5/≥5 동종접합체의 경우가 기타 유전자형(p=0.005)의 경우보다 현저히 크다. 이는 본페로니(Bonferroni) 보정된 α가 0.5/3 또는 0.016으로서 여전히 유의하다.
대조적으로, ≥5 동종접합체의 평균 알콜 스코어는 기타 유전자형과 비교하였을 때 실제로 차이가 없다. 연령이 결과를 설명해 주는 숨겨진 공변수일 수 있기 때문에 연령을 공변수로서 사용한다. 연령에 대한 p 값은 0.404이고 CNRI 주요 효과에 대해서는 0.004인데, 이는 연령에서의 분산이 결과를 설명하지 않음을 나타낸다.
평균 약물 스코어와의 관련성은 본 발명자들이 CNRI 유전자가 특정한 특이 약물과의 보다 큰 관련성을 나타낼 수 있을지의 여부에 대한 의문을 제기한다. 4가지 유형의 약물 의존성은 방법에 설명한 2×3χ 스퀘어 분석을 사용하여 시험한다(표 27). 3가지 유형의 약물 의존성은 3가지 그룹, 즉 코카인, 암페타민 및 마리화나 의존성에 걸친 ≥5/≥5 유전자형의 빈도가 현저히 증가됨을 나타낸다. 아편양제제 의존성과의 연관은 유의적이지 않다. 이들은 모두 본페로니 보정된 α가 0.05/4 또는 0.0125으로서 유의적이지 않다.
비교용으로 알콜 의존성만을 시험한다. 알콜 의존성이 없는 ATU 피검자가 알콜 의존성이 있는 ATU 피검자보다 더 많이(50.7%) ≥5/≥5 유전자형을 갖는다.
코카인, 암페타민 및 헤로인 투여 경로
표 28은 이들 약물의 투여 경로에 대한 결과이다. 코카인의 경우, ≥5/≥5 유전자형의 이환율이 ATU 피검자 및 코카인을 사용하지 않는 대조 그룹의 경우 36.2%에서, 코카인을 흡입하는 경우 32.3%로, 코카인을 흡연하는 경우 55.6%로, 코카인을 주사로 맞을 경우 68.4%(p=0.006)로 변한다. 유사한 결과가 암페타민의 투여 경로에 대해 수득되는데, ≥5/≥5 유전자형을 갖고 코카인을 사용하지 않는 피검자의 경우는 35.7%, 암페타민을 정맥내로 주입한 경우는 65.2%(p=0.007)이다. ≥5/≥5 유전자형의 동등한 높은 빈도가 헤로인을 정맥내 사용하는 피검자에게서 관찰된다.
회귀 분석
CNRI 유전자에 기여하는 3가지의 정량적 스코어의 분산(%)을 평가하기 위해, 본 발명자들은 회귀 분석을 실시하여 유전자형을, ≥5/≥5 유전자형의 경우는 2로, 기타 유전자형의 경우는 1로 스코어링한다(표 29). CNRI 유전자는 알콜 스코어에 대해서는 실제로 아무 것도 나타내지 않고, 총 약물 스코어의 경우는 2.1%, 정맥내 약물 스코어의 경우는 3.8%를 나타낸다(p=0.005).
결과는 CNRI 유전자가 상이한 유형의 약물(코카인, 암페타민 및 마리화나) 의존성의 수 및 정맥내 약물 사용, 특히 심각한 형태의 약물 의존성과 유의적으로 연관된 것을 나타낸다. 당해 결과는 제일 먼저 기재된 특이 유전자와 정맥내 약물 사용과의 연관성을 제공한다. 대조적으로, 알콜 남용/의존성과 관련된 변수와는 유의적 연관성이 없다.
당해 결과에 잠재해 있는 다른 가능한 설명은 ATU 피검자와 대조 그룹을 비스페인계 백인으로 제한하여도 결과는 이 두 그룹의 숨겨진 민족적 성층화로 설명된다. 이는 연관성 연구에서 항상 관심이 되지만, ATU 약물 남용 피검자에 대한 인구통계성이 유사하고 알콜에 비해 대부분의 약물에 의한 도파민성 응답 경로의 동요가 더 크며 도파민성 대사와 카나빈성 대사 사이에 친밀한 상호반응이 있더라도, 알콜 의존성 변수와는 연관성이 없지만 ≥5/≥5 유전자형과 약물 의존성 변수와의 연관성은 일관되어서 결과를 민족적 성층화로 설명할 수 없게 한다. 연령 또한 복잡한 변수로서 제외된다.
* 만텔-핸젤 직선 χ 스퀘어
1 36.0%가 ≥5/≥5 동종접합체인 대조 그룹 114명과 37.5%가 ≥5/≥5 동종접합체인 ATU 피검자 24명으로 구성됨.
2 36.0%가 ≥5/≥5 동종접합체인 대조 그룹 114명과 33.3%가 ≥5/≥5 동종접합체인 ATU 피검자 15명으로 구성됨.
3 36.0%가 ≥5/≥5 동종접합체인 대조 그룹 114명과 40.6%가 ≥5/≥5 동종접합체인 ATU 피검자 64명으로 구성됨.
실시예 5
체중, 정신의학적 증후 및 도파민 D2 수용체 유전자(DRD2)와 연관된 사람 비만(OB) 유전자의 유전적 변종
방법 및 재료
건강 증진 그룹을 위한 센터(CHP)
CHP 연구를 위한 피검자를 비스페인계 백인 211명으로 구성한다. 행동 변수와 유전적 다형성의 연관성에 관한 기타 연구의 파워 분석을 기초로 하여, 본 발명자들은 피검자의 샘플 크기를 200 내지 225명으로 한다. 이들의 연령은 29 내지 75세로 평균 54세이고 표준 편차는 10.2세이다. 이들 중 98명이 남성이고 113명이 여성이다. 피검자 개개인에 대해 연령, 성별, 체중, 신장 및 허리-힙 비율을 측정한다. 물 속에서 체중을 측정하여 총 체지방을 구한다. 피검자 개개인에게 16세 부터 현재까지 상이한 연령 간격으로 최대 체중에 대한 데이타를 공급해줄 것을 부탁한다. 혈중 포도당, 콜레스테롤 및 인슐린의 측정을 위해 공복시 혈액 샘플을 수득한다. 코드화한 혈액 샘플을 분석하고 CHP 데이타에 대해 블라인드화한다.
피검자 개개인에게 NEO 5-인자 인성 목록(Costa and McCrae, 1992)과 증후 체크 리스트-90(SCL-90)을 완성하게 한다. 피검자에게 또한 다음의 질문에 답하게 한다: 배가 고파서 먹습니까?, 밤참을 먹습니까?, 식사 사이에 스낵을 먹습니까?, 무료해서 먹습니까?, 스트레스로 인해 먹습니까?, 아침식사를 합니까?, 저녁에 과식합니까?, 단것을 매우 좋아합니까?, 채소를 좋아합니까?, 지방질 음식이나 튀김을 선호합니까?. 대답은 다음과 같이 하게 한다: 1 전혀 그렇지 않다, 2 가끔 그렇다, 3 자주 그렇다, 4 매우 자주 그렇다, 5 항상 그렇다,
유전적 연구
본 발명자들은 이미 기재한 바와 같이[참조: Green et al., 1995] 사람 OB 유전자를 함유하는 YAC 콘티그(contig)에 존재하는 D7S1873, D7S1875, D7S514 및 D7S680 디뉴클레오타이드 반복단위를 PCRTM확대했다. 물론, D7S1875가 OB 유전자에 가장 근접하게 있다. 본 발명자들은 이를 OB1875로서 지칭한다. DRD2 유전자 Taq A1 대립인자를, 이미 기재한[참조: Noble et al., 1994b] 프라이머를 사용하여 검정한다.
OB 1875 유전자형의 통계적 분석
앞의 가설은 D7S1875 디뉴클레오타이드 반복단위의 보다 짧거나 긴 대립인자가 BMI 또는 기타 변수와 연관성이 있을 경우, 짧은(또는 긴) 대립인자에 대한 각각의 동종접합성이 최고 스코어를 가질 수 있고 이종접합이 중간 스코어를, 긴(또는 짧은) 대립인자에 대한 동종접합성이 최저 스코어를 가질 수 있다. 따라서, 행동 스코어의 평균을 진행성 직선 관계에 대해 시험하기 위해 1로 셋팅된 서브커맨드 "폴리노미얼"을 사용한 SPSS(일리노이주 시카고 소재의 SPSS, Inc.)로부터의 ANOVA 통계적 프로그램을 사용한 상이한 대립인자 그룹의 피검자와 비교한다. 3개 이상의 그룹인 경우, α=0.05인 그룹 사이의 각각의 유의적 차이에 대해 투키(Tukey) 분석을 한다. 공분산의 분석(ANACOVA)은 공변수로서 BMI, 허리-힙 비율, 연령 및 성별을 사용한 SCL-90 불안증 스코어에 대한 OB1875유전자형의 효과를 검정하는 데 사용한다. 또한, χ 스퀘어 분석은 이분 분리시점에 따른 변수에 대해 3개의 OB1875유전자형으로 수행한다. 선행 가설은 3개의 OB1875유전자형에 걸쳐 진행형 직선 증가 또는 감소가 있을 수 있기 때문에 이들은 직선 χ 스퀘어 시험(SPSS에서의 만텔-핸젤)으로 검정한다는 것이다. 최종적으로, 회귀 분석은 OB와 DRD2 유전자형 또는 대립인자사이의 싱호관계(r)를 측정하는 데 사용한다. r2는 관련된 유전자 또는 이들의 조합물로 설명되는 분산의 분수를 제공한다.
결과
BMI는 17.7 내지 57.6으로 평균이 27.9이고, 표준 편차가 7.2이다. 초기 연구에서, 모든 4개의 다형성의 대립인자를 더 긴 그룹과 더 짧은 그룹으로 나누어 검정한다. 피검자를 짧은 대립인자에 대한 동종접합성으로, 긴 대립인자에 대한 동종접합성으로, 짧은 대립인자와 긴 대립인자에 대한 이종접합성으로 유전자형화한다. 3가지 유전자형 그룹의 BMI를 검정하여 D7S1875 다형성이 최고의 F 비를 제공함을 알 수 있다. 따라서, 기타 변수를 사용한 모든 후속적인 연구를 당해 다형성을 사용하여 수행한다.
OB 1875 대립인자 분포
CHP 피검자에 대한 OB1875다형성의 상이한 대립인자는 크기 범위가 길이로써 199 내지 225bp이다. 정신의학적 장애에서의 뉴클레오타이드 반복단위의 검정에 대한 본 발명자들의 선행 접근 방법[참조: Comings et al., 1996c]은 먼저 원래 2정(bimodal) 분포인 경우, 대립인자를 대략 동등하게 이분하는 것이다. 이는 OB1875다형성에 관한 경우이고 208bp를 절단한다. 생성된 유전자형은 ＜208bp/＜208bp, ＜208bp/≥208bp 및 ≥208bp/≥208bp이다.
비만 변수
그룹 전체의 여성과 남성에 대해, 3가지의 유전자형 그룹에 걸쳐 진행형 감소를 나타내는 체중과 유의적 연관성이 있다(＜208/＜208 n=47, 183.83㎏, 표준 편차 45.39; 이종접합체 n=95, 177.56kb, 표준 편차 44.00; ≥208/≥208 n=39, 161.29㎏, 표준 편차 45.17, F 비=5.22, p=0.023). BMI의 경우, 진행형이지만, 현저하지는 않고 BMI가 ＜208/＜208 동종접합체의 경우 28.92에서 이종접합체의 경우 27.96으로 감소되고 ≥208/≥208 동종접합체의 경우 26.62이다. 혈장 인슐린, 공복시 혈당, 콜레스테롤 및 지방 비율에 대한 평균값에서의 유전자에 의한 차이는 유의수준이 아니다. 개개인의 성별을 검정할 경우, 남성의 경우는 추세가 동일하다. BMI는 유의수준(p=0.053)에 접근하고 중량은 현저히 상이하다(p=0.038). 추세가 다시 동일해지는 동안 변수 중 어느 것도 여성에 대해서만 유의수준이지 않다.
연령에 의한 BMI
표 30은 참가한 남성 및 여성 모두의 상이한 연령에서의 평균 BMI의 ANOVA 에 의한 비교이다. 유전자형에 의한 차이는 피검자가 26 내지 30세일 경우 유의수준이고, 16 내지 20세일 경우는 대부분 유의수준이다. 여성만을 검정하면, 26 내지 30세 그룹이 유의적 결과(p=0.028)를 제공한다. 남성만을 검정하면, 어떠한 연령 그룹도 유의수준이 아니다. 피검자가 26 내지 30세일 때의 BMI는 ＜25, 25 내지 34 및 ≥35의 세 그룹으로 나뉜다. OB1875＜208/＜208 유전자형의 빈도는 24 내지 33%에서 56%로 세 가지의 BMI 그룹에 걸쳐 진행적으로 증가한다(직선 χ 스퀘어=4.46, df=1, p=0.034).
SCL-90
SCL-90 결과를 표 31에 나타낸다. ＜208/＜208 동종접합체에 대한 스코어는 불안증, 우울증, 정신 이상, 적대 행위, 편집증, 강박반응, 전증후, 일반 증후 지수 및 전체에 대해 현저히 높다. 스코어 7의 경우 p는 ＜0.025이다.
공분산의 분석
정신의학적 변수가 단순히 체중 문제 또는 비만 유형(허리-힙 비율)에 의한 이차적인 것인지를 검정하기 위해, 주요 효과로서 OB1875유전자형을 사용하고 공변수로서 BMI, 허리-힙 비율, 연령 및 성별을 사용하여 SCL-90 불안증 스코어를 검정한다(표 32). 이는 5가지의 변수 중에서 오직 OB1875유전자형만이 불안증 스코어와 현저한 연관성이 있음을 나타낸다. 이와 동일하게 우울증, 포지티브 전증후 및 전증후의 경우는 SCL-90이 연관성이 있다.
DRD2 및 BMI 연령 그룹
D2A1 대립인자의 존재 또는 부재에 대해 ANOVA를 수행하여 DRD2 유전자가 연령 특이적 BMI에 영향을 미치는지 측정한다. 평균 BMI는 피검자가 31 내지 40세인 경우 BMI에 대한 A1 대립인자를 갖는 개인에 대해 현저히 크다(D2A1+ n=54, 28.78, 표준 편차 8.56; D2A1- n=70, 25.67, 표준 편차 5.21, F 비=6.04, p=0.015). OB 유전자로 인해, F 비는 샘플 크기가 유사하여도 연령이 더 높은 그룹의 경우가 더 낮다.
OB 1875 ＜208/＜208 동종접합체와 D 2 A1 대립인자와의 조합
OB의 효과와 DRD2 유전자의 효과가 부가적인지를 측정하기 위해, 피검자를 OB1875＜208/＜208 대립인자에 대한 동종접합성인 피검자 및/또는 D2A1 대립인자를 갖는 피검자로 나누어 BMI를 검정한다(표 33). 결과는 아주 유의하다. OB1875＜208 대립인자에 대 동종접합성이고/이거나 D2A1 대립인자를 갖는 피검자는 16 내지 20세, 21 내지 25세, 26 내지 30세, 31 내지 40세 및 41 내지 50세일 때 평균 BMI가 현저히 높다. 이들 두 유전자의 효과를 합하고 전체 비만 변수를 검정하면, 허리/힙 비율(p=0.033), 체중(0.013) 및 인슐린량(0.042)에 대해 차이가 현저하다.
회귀 분석
단일변수 회귀 분석으로 OB 유전자 또는 OB+DRD2 유전자에 의해 설명되는 연령-특이적 BMI에 대한 분산(r2)의 %를 검정한다. 남성 및 여성 모두에서 OB 유전자에 대해서만 r 및 r2가 16 내지 20세 및 26 내지 30세에서의 BMI에 대해서만 유의하다. 여기서 OB 유전자는 두 BMI의 분산의 약 3%가 된다. 그러나, OB 유전자와 DRD2 유전자의 효과를 합하면, 16 내지 20세, 21 내지 25세, 26 내지 30세 및 31 내지 40세에서의 BMI에 대한 분산의 8.5 내지 9.9%가 된다. OB 유전자에 대해서만여성만을 검정하면, 31 내지 40세 그룹과만 상호관계가 유의적이다(p=0.029). OB 유전자와 DRD2 유전자의 효과를 합하면, 피검자가 16 내지 20세, 21 내지 25세, 26 내지 30세, 31 내지 40세 및 41 내지 50세일 때 상호관계가 유의적이다. 가장 유의적인 상호관계는 26 내지 30세(p=0.0004) 그룹과 31 내지 40세(p=0.0005) 그룹에 대해서이다. 여기서, 두 유전자는 BMI의 뷴산의 22.8%이다.
N.E.O.
유쾌함, 성실함, 외향성, 중립성 및 솔직함의 5가지 N.E.O. 인자 중에서 중립성이 증가됨이 현저하다. 세가지 OB1875유전자형에 대한 스코어는 21.16, 17.82 및 14.86이고, F-비율=7.29, p=0.008이다. 감소된 인지도는 경계에서 유의적이다(32.97, 34.67 및 35.65, F-비율=3.71, p=0.056).
먹는 이유
먹는 이유에 대한 질문 중에서 스트레스 때문에 먹는다는 것과 아침을 먹는다는 두 가지 이유만이 OB1875유전자형과 유의적으로 관련되어 있다. '스트레스 때문에 먹는다'의 경우, 세 가지 유전자형에 대한 스코어는 2.33, 2.32, 1.85이고, F-비율=4.54, p=0.034이다. '아침을 먹는다'의 경우, 세 가지 유전자형에 대한 스코어는 3.50, 4.15, 4.14이고, F-비율=4.889 p=0.028이다.
피검자의 현재 체중을 기본으로 하는 BMI를 사용하는 경우, OB1875유전자형의 표현 효과는 거의 입증되지 않는다. ＜208/＜208 동형 접합체가 가장 높은 BMI를 갖는 경향이 있는 반면, 이형 접합체는 중간 수준의 BMI를 갖고 대립형질에 대한 동형 접합성은 가장 낮은 값을 갖는 경향이 잇다. 허리-엉덩이 비율, 지방 백분율, 혈장 인슐린 및 혈당의 차이는 유의적이지 않지만, 체중 차이는 유의적이다(p=0.2).
피검자의 연령이 16 내지 30살인 경우, 이들의 BMI는 OB1875＜208/＜208 이형 접합성과 유의적 또는 거의 유의적으로 관련되는 경향이 있지만, 이들이 41 내지 70살인 경우, BMI에 대한 관련성이 거의 없거나 전혀 없다. 이러한 경향은 또한 여성들에게 적용되는 반면, 남성들의 경우에는 비유의적인 경향이 나타난다(표 30), 이러한 결과에 의하면, 나이든 여성이 아니라 젊은 여성에게 있어서 OB 유전자의 변형과 BMI 사이에 관련성이 있으며, 남성의 경우에는 연령에 상관없이 모두 관련성이 없다. 26 내지 30살의 남성과 여성의 BMi를 25 미만, 25 내지 34 및 35 이하 그룹으로 분류하는 경우, ＜208 대립형질에 대한 피검자의 동형 접합성 백분율이 24%에서 56%로 유의적으로 상당히 증가한다.
SCL-90을 기준으로 한 정신 의학적 변수와의 관련성은 더욱 극적이다. 비만과 가장 빈번하게 관련된 두 가지 행동인 불안증과 우울증은 OB1875＜208 대립형질에 대한 동형 접합성과 유의적으로 관련되어 있다(p=0.003 내지 0.0005). 우울증의 경우, ＜208 대립형질에 대해 동형 접합성인 피검자 36명에 대한 평균 스코어(0.85)는 이형 접합체(0.277) 또는 ≥208/≥208 동형 접합체(0.203)의 경우에 대한 평균 스코어의 2배 이상이다. OB1875＜208 대립형질와 불안증 및 우울증과의 관련성에 대한 적합한 설명은 이들 대립형질이 비만을 일으키고 불안증과 우울증이 비만에 대해 2차적으로 중요하다는 것일 수 있다. 이를 연구하기 위해 본 발명자들은 공분산자(covariate)로서의 BMI, 허리-엉덩이 비율, 연령 및 성별과 주 효과로서의 OB1875대립형질와의 공분산(covariance)을 분석하였다. 이 분석은, 불안증의 경우, SCL 90 불안증 스코어와 유의적으로 관련된 유일한 변수는 OB1875≥208 대립형질의 존재(표 32)이고 OB 유전자가 정신병 증상에 주된 영향을 미침을 보여주고 비만과 관련된 우울증과 불안증에서 직접적이고 우발적인 역할을 할 수 있음을 제안한다.
CHP 피검자에서 DRD2 유전자의 역할을 조사하기 위해 ANOVA를 사용하여 D2A1 대립형질을 가진 피검자의 각각의 연령에서의 BMI 대 A1 대립형질을 갖지 않는 피검자를 비교한다. OB1875대립형질의 경우에서와 마찬가지로, 보다 적은 연령 그룹, 즉 31 내지 40살의 경우, BMI와 유의적으로 관련되어 있으며, p=0.015이다.
두 가지 이상의 유전자의 첨가 효과를 연구하기 위해, 본 발명자들은 OB1875＜208 bp 대립형질에 대해 동형 접합성이거나/이고 상이한 연령의 특이적 BMI 그룹에 대해 D2A1 대립형질을 가진 피검자에 대하여 ANOVA를 수행한다. 남성과 여성이 같이 포함된 경우, OB1875＜208/＜208 또는 D2A1 대립형질의 존재와 연령 16 내지 50살의 모든 그룹에 대한 보다 높은 BMI 사이에 유의적인 관련성이 있다.(표 34). 연령 16 내지 40살의 4개의 모든 그룹에 대한 p값은 0.005 미만이다. 여성만을 조사하는 경우, 피검자의 수가 적음에도 불구하고, 결과는 훨씬 더 유의적이다. 여기서, 연령 16 내지 40살 그룹에 대한 p값은 0.0017 내지 0.0004이다. 허리-엉덩이 비율, 체중 및 혈장 인슐린 함량에 대해 표현형 또는 대립형질 또는 이들 둘다를 갖고 있는 피검자의 경우 유의적인 관련성이 있다.
선행 연구[참고: Comings et al., 1996f; Comings et al., 1996b; Comings et al., 1997b]에서와 같이, 당해 표현형과 소정의 스코어 사이의 회귀 계수(r)을 측정하여, r2또는 연구중인 유전자에 매겨진 스코어의 편차율을 측정한다. 연령 특이적 BMI 값에 대한 결과는 표 34에 나타내었다. 남성과 여성이 포함된 경우, OB 유전자 단독으로 각각 연령 16 내지 20살 및 26 내지 30살에서의 BMI 편차가 3.2%와 3.0%이다. 여성만인 경우, 이들 값은 6.2%와 4.1%로 증가한다. OB 유전자와 DRD2 유전자의 효과를 조합하면, 남성과 여성이 포함된 경우에 피검자가 16 내지 40살일 때 BMI의 편차는 8.5%와 9.9%이다. 여성만을 조사한 경우, 이들 두 가지 유전자는 피검자가 16 내지 40살일 때 BMI의 편차가 19.1%와 22.8%이다(p=0.0017 sowl 0.0004).
실시예 6
세가지 도파민 유전자와 관련된 첨가 효과
본 연구에서도파민 작용성 뉴론에 영향을 미치는 이들 세가지 주요 유전자의 첨가 효과를 세가지 모든 유전자의 특이적 마커(marker)를 유전받은 피검자가 세가지 미만의 유전자의 특이적 마커를 유전받은 피검자보다 더 높은(더 불량한) 행동 스코어를 받는 경향이 있는지를 측정함으로써 연구한다. 제거 효과, 즉 첨가 효과의 역수를 이들 마커를 유전받지 못한 피검자들이 더 낮은(더 양호한) 행동 스코어를 갖는 경향이 있는지를 측정함으로써 검사한다. 두 가지 모든 효과를 세가지 마커 중 한가지 또는 두가지 마커를 유전받은 피검자들이 중간 스코어를 갖는 경향이 있는지를 측정함으로써 조사한다. 이것은 폴리유전자 유전의 중요성-표현형에 임상학적으로 중요한 영향을 미치는 몇가지 유전자의 첨가 효과에 대한 필요 조건에 대한 시험이다.
방법
피검자
피검자는 TS에 대해 치료받은 화가 또는 화가의 친척이다. TS, 만성 운동성 틱증( motor tic disorder) 또는 만성 발성 틱증(vocal tic disorder)의 치료는 DSM-III-R 기준을 근거로 한다[참고: American Psychiatric Association, 1987]. TS 프로밴드는 당해 임상에서 의학적 치료를 요구하는 개인으로서 정의한다. 프로밴드(n=225) 중 82%는 TS를 가지고 있는 반면, 나머지 18%는 만성 운동성 틱증 또는 만성 발성 틱증을 가지고 있다. 비-프로밴드 TS 친척(n=60) 중에서, 54%는 TS를 가지고 있고, 31%는 만성 운동성 틱증을, 15%는 만성 발성 틱증을 가지고 있다. 비-TS 친척(N=132)은 아무도 만성 운동성 틱증이나 만성 발성 틱증을 가지고 있지 않다. 모든 프로밴드들은 개인적으로 인터뷰하고 조사한다. 친척 중 80% 이상도 개인적으로 인터뷰한다. 프로밴드와 이들의 친척에게 각각 4명의 조부모에 대한 인종 및 민족적 배경에 대해 질문한다. DRD2 연구의 경우, 북유럽과 서유럽 배경을 가진 비-스페인계 백인 프로밴드, 친척 및 대조 그룹만을 포함시킨다. 모든 피검자는 6살 이상이다.
민종적 계층
민족적 계층은 본 연구에서 배제시킨다. 모든 피검자는 북유럽 또는 서유럽 계통의 비-스페인계 백인으로 제한한다. 각 피검자의 민족적 배경을 모든 4명의 조부모에 대해 조사한다. 상이한 조상 그룹의 수는 1 내지 12이고, 대부분의 피검자는 4 내지 6개의 상이한 조상 그룹을 갖는다. D2A1 대립형질의 경우, 총 13가지 상이한 연구에 의해, 알콜 중독증과 약물 증독증에 걸리지 않은 714명으로 이루어진 대조 그룹을 선별하도록 조사한다. 이들 연구에서 D2A1 대립형질의 점유율은 평균 25.9%로 12.5 내지 34.8%이고, 모두 432 TS 경우에서의 40.7%보다 낮다[참고: 본원에서 앞서 기술한 Super control Study]. D2A1 보유자 대 비보유자의 평균 행동 스코어를 조사하는 경우, 몇가지 평균 행동 스코어는 대조 그룹을 분석하지 않는 경우에도 유의적이다. 이것은 세가지 모든 도파민 유전자의 조합된 조사의 경우에도 적용된다. 상이한 피검자는 상이한 행동 스코어에 대해 높은 스코어를 갖는 경향이 있다. 그럼에도 불구하고, 비증상 대조 그룹, 증례(case) 부재 및 증례 존재의 세 가지 그룹을 조사하는 경우에도 많은 중요한 결과가 나타난다. 이들 모든 결과는 조사하는 변수의 존재 또는 부재에 의한 계층의 결과라기 보다는 실제로는 숨겨진 민족적 계층의 결과라는 가정은 거리가 먼 것 같다. 동일한 폴리유전자 세트의 대조 그룹과 피검자를 이용하여, 세가지 도파민 유전자 모두를 조사하는 경우에 포지티브 결과가 얻어진다. 숨겨진 민족적 계층이 세가지 도파민 유전자 모두와 관련되어 있을 가능성도 거리가 먼 것 같다. 이들 포지티브 결과는 단순히 다중 행동 변수를 조사했다는 사실로부터 얻어진 것이 아니므로, 몇가지는 우연히 유의적이다. 본 발명자들은 시험한 기타 몇가시 유전자에 대한 모든 행동 변수에 대해 완전히 비유의적인 결과를 수득하였다.
대조 그룹
대조 그룹(n=67)은 a) TS 피검자의 양부모 또는 계모, 계부, b) 갑상선암 또는 비-인슐린 의존성 당뇨증을 가진 내분비 임상실로부터의 피검자 및 c) 전문가, 기술자 및 정비사를 포함한 병원 직원의 세 부류로부터 뽑는다. 갑상성 피검자는 두 가지 상태 모두 높은 치료율로 이미 치료가능하고 넓은 연령대이며 매일의 생활이 최소한 중단되기 때문에 대조 그룹으로서 선택하고, 또한 피검자 기준은 TS 피검자의 기준과 동일하다. 모든 대조 그룹은 ADHD, 알콜, 약물 및 담배 중독증에 걸리지 않도록 선별한다.
체계적인 앙케이트
1987년 이후에 모든 부모와 제1세대 친척에게 문헌[참고: Diagnostic Interview Schedule(DIS)(Robins et al., 1991)]에 따라 모델링한 상세한 31쪽 분량의 행동 앙케이트를 작성하도록 요구하였다. 완성된 앙케이트는 모든 곳에서 얻을 수 있다[참고: Comings, 1990a]. DIS 질문 이외에, 인구학적 변수, ADHD 진단에 필요한 모든 DSM-III와 DSM III-R 변수에 관한 질문과 운동성 틱증 및 발성 틱증의 유형, 위치, 지속성 및 중증도에 관한 질문이 많이 있다[참고, American Psychiatric Association, 1980, Ameriacan Psychiatric Association, 1987]. 이들 질문에 대한 답을 이어서 SPSS 데이타 베이스에 도입시킨다. 이러한 도구의 사용과 증상 집단의 사용의 다양한 관점은 다른 문헌에도 제시되어 있다[참고: Comings, 1995c; Comings, 1994c; Comings, 1994a; Comings, 1995a].
혈액 샘플
임상 실험에 참여한 모든 TS 프로밴드 또는 친척에 대해 혈액 샘플을 채취하지는 않는 반면, 아래의 고려 사항의 범위내에서 필수적으로 무작위적으로 선택한다. 먼저, 혈액 샘플 공급은 전적으로 자발적이고, 다수의 피검자, 특히 보다 나이가 어린 피검자는 혈액을 채취하지 않도록 선택한다. 두번째로, 인종 및 민족적 계층에 대한 관심때문에, 대조구에 대한 가장 광범위한 데이타가 비-스페인계 북유럽계 및 서유럽계 백인으로부터 나오기 때문에 이 그룹으로부터 혈액을 채취하는 경향이 있다. 세번째로, 양 부모가 생존하는 경우, 이들 가족들로부터 혈액을 채취하는 것이 부모 중 한 사람이 생존하지 않는 경우보다 바람직하다.
유전자형
모든 피검자들의 유전자형을 중성 확인 수(neutral identification number)를 기준으로 조사하는 개인을 밝히지 않고 조사한다. D2A1 유전자형은 앞에서 언급한 서던 블롯의 혼성화에 의해 조사한다[참고: Comings et al., 1991]. 또한, 일부는 앞에 기재한 PCRTM기술로 유전자형을 조사한다[참고: Dawson, 1986]. DβH 유전자형 조사는 실시예 3에서와 같이 수행한다. DATI 반복 다형성은 실시예 3에 기재한 바와 같이 유전자형을 조사한다.
코모비드(Comorbid) 조건에 대한 기준
체계적인 앙케이트로 다수 그룹의 관련 증상을 조사할 수 있다. 이들 각각에 대한 기준은 선행 연구에서 측정되었으며, 예를 들면 다음과 같다. 알콜 중독증[참고: Comings, 1994b], 약물 중독증[참고: Comings, 1994c], 비만-강박 행동[참고: Comings, 1994a], (major depressive episode)[참고: Comings, 1995c], 조병[참고: Comings, 1995b], 신체 질병[참고: Comings, 1995b], 공포 발작[참고: Comings, 1995b], 공포증[참고: Comings, 1995b], 행동 질병[참고: Comings, 1995a], 적대적 반항 질병(ODD)[참고: Comings, 1995a], 성병[참고: Comings, 1994ca], 학습 질병[참고: Comings, 1995b] 및 틱 중증도[참고: Comings, 1995a]. ADHA 스코어는 없음=0, 때때로=1 및 종종=2인 앙케트이트에 사용된 22개 모든 ADHA 변수의 합계를 나타낸다. 선행 연구[참고: Knell and Comings, 1993]를 근거로, 스코어가 21 이상인 경우 ADHA를 갖고 있는 것으로 생각된다. ADHA에 대한 본 발명자들의 특별한 관심 때문에, 본 발명자들은 또한 위의 22개 변수 중 8개 이상이 요구되는 DSM-III-R 진단을 엄격히 근거로 한 또 다른 일련의 기준을 사용하여 이를 조사하였다[참고: American Psychiatric Association, 1987].
증상 평가에 대해 앙케이트를 근거로 하는 방법의 정확도, 유용성 및 민감도는 다른 연구자들[Karp, 1994; Grossman et al., 1994]이 이러한 도구의 사용을 동일한 피검자에게 적용하는 인터뷰자 관리용 체계적인 도구[예: Kiddie Schedule for Affective Disorders and Schizophrenia]의 사용과 비교함으로써 입증하였다.
다음은 본 명세서 작성시에 공개되지 않거나 분류를 필요로 하는 일부 증상 또는 스코어에 대한 기준이다. 학교에서의 일반적인 수행(학교 성적 증상, Grade School symptom)을 평가하기 위해 본 발명자들은 아래와 같이 질문하였다: 등급 1 내지 6에 대하여 당신의 학업 수행은 전반적으로 다음 항목에서 평균 미만, 평균 또는 평균 이상이다: a) 수학, b) 읽기 및 c) 작문. 가능한 답은 평균 미만(2), 평균(1), 평균 이상(0). 결과는 가장 불량한 스코어는 6, 가장 양호한 스코어는 0으로 하여 세가지 과목에 대해 합산한다. 양분된 변수에 대하여 4 이상의 스코어는 학교 성적 증상에 대해 포지티브한 것으로 간주한다. 개인들은 교육적, 학업적으로 장애가 있는 학업 질병 또는 재원 수업반에 있어야 하는 경우 학업 불능 문제를 가지고 있는 것으로 생각한다(학업 불능 증상, Learning disabilities symptom). 피검자들에게 DIS에서의 16가지 모든 공포증(공포증 증상)의 존재 여부에 대해 질문하고 3가지 이상과 관련하여 어려움이 경우에 문제가 있는 것으로 간주한다. 공포증 스코어는 소정의 피검자에 대한 DIS에 기재된 공포증의 총 갯수이다. 공포 발작(공포 발작 증상)은 개인들이 DIS 질문 "대부분의 사람들이 두려워하지 않는 상황에서 당신은 갑자기 놀라거나 두렵거나 매우 불안한 경우에 에 '예'라고 대합하는 경우에 (신체적 질병으로 인하지 않은) 발작 또는 발병을 경험한 적이 있습니까"에 대해 "예"라고 대답하는 경우, 특정 경우에 존재하는 것으로 간주한다. 공포증 스코어는 소정의 피검자에 대한 DIS 공포 발작의 전체 수를 나타낸다. 읽기 문제(읽기 문제 증상)를 평가하기 위해 개인들에게 "당신은 읽기 수업에서 당신의 경쟁자들에게 뒤쳐진다고 느낀 적이 있다면, 그 가장 큰 연수는 몇년입니까?. 예를 들면, 당신이 6학년이고 4학년 수준에서 읽기만 한다면, 당신은 2년 뒤쳐지는 것입니다."라는 질문을 한다. 2년 이상이라고 답한 사람은 읽기 문제가 있는 것으로 간주한다. 말더듬기(말더듬 증상)은 "당신은 말더듬과 관련하여 문제를 경험한 적이 있습니까?"라는 질문으로 평가한다. 일반 불안증(일반 불안 증상)에 대해 포지티브 스코어를 부여하기 위해, 개인들은 다음의 두 가지 DIS 질문 "당신은 평생동안 다양한 것들에 대해 과도한 불안 또는 걱정을 해 본 시기가 있습니까?"와 "만일 그렇다면, 이러한 느낌이 없는 경우보다 있을 때에 이러한 느낌이 6개월 이상 동안의 기간 동안 지속되었습니까?"에 모두 "예"라고 답해야 한다. 신체화와 관련된 문제(신체화 증상)은 신체화와 관련된 DIS 질문 중 3개 이상의 질문에 "예"라고 대답하는 경우, 존재하는 것으로 간주한다. 신체화 스코어는 특정 피검자에 대한 DIS 신체화 증상의 총수를 나타낸다. 다음 증상들 중의 어느 하나라도 매일 또는 거의 매일 나타날 경우에는 수면 문제(수면 질환)가 있는 것으로 간주한다: 밤에 수면을 취하기가 어려움, 몽유병, 야경증, 일찍 깨서 다시 잠들기 어려움, 잠꼬대 또는 가위눌림. 수면 스코어는 매일 또는 거의 매일 일어나는 상기 수면 스코어 증상의 총수를 나타낸다. 성 질환(성적 증상)을 갖는 개인들을, 만일 이들이 다음의 증상들 중의 어느 하나라도 나타내면 포지티브로 스코어링한다(Comings, 1994a): 1. 빈번한 대중 노출, 2. 평균치보다 훨씬 큰 성적 충동, 3. 동성 또는 양성을 선호, 4. 성적인 것에 대한 조기 관심, 5. 어린아이로서 같은 연배의 다른 아이들에 비해 훨씬 더 많이 음란화를 그림, 6. 자신들이 부도덕한 성행위에 의해 출생했다고 강력히 믿음, 7. 할로윈 또는 가면 무도회가 아닌 경우인데도 반대되는 성의 옷을 입음, 8 - 11. 대상, 어린이, 피학대음란 몽상병자 또는 가학애 몽상병자에 의해 성적 행동이 6개월 이상 지속되는 경우. 성적 행동 스코어는 특정 피검자에 대한 상기한 바와 같은 성적 행동 질환의 총수를 나타낸다. 분열증 행동(분열증 행동 증상)을 나타내는 피검자들을, 만일 이들이 정신분열 증상에 대한 하나 이상의 DIS 질문에 대해 그렇다고 대답하면 포지티브로 스코어링한다. 분열증 스코어는 특정 피검자에 대한 DIS 분열 증상의 총수를 나타낸다. 피검자들을 8가지의 상이한 운동성 틱 및 9가지의 상이한 음성적 틱의 존재 여부 및 이들 현상이 처음으로 발생한 연령에 대한 질의에 의해 틱(틱 증상)에 대해 시험한다. 이러한 틱의 수를 더하여 틱 스코어를 구한다. 따라서, 복수의 상이한 틱의 존재가 소수의 틱보다 높게 스코어링된다. 상기한 것들은 χ 스퀘어 분석에 대한 이분류법 결과, 및 D2A1 대립형질 보균자 대 비보균자에서의 평균치를 비교한 스코어를 제공한다.
케이스의 분류.상기한 정보는 피검자들을 상이한 두개의 그룹으로 나눌 수 있게 한다. 제1 그룹은 만성 운동성 및/또는 음성적 틱의 존재 또는 부재에 근거한다. 이들 그룹은 TS 프로밴드, TS 또는 만성 틱을 나타내는 TS 프로밴드 친척 및 틱을 나타내지 않는 대조 그룹이다. 제2 그룹은 a) 약물, 알콜, 담배를 남용하지 않고 문제가 되는 행동 상태를 나타내지 않는(대조 그룹은 나타내지 않음) 대조 그룹, b) 문제가 되는 행동 상태를 나타내지 않는(경우에 따라 나타내지 않음) TS 프로밴드 또는 이의 친척 및 c) 문제가 되는 행동 상태를 나타내는(경우에 따라 나타냄) TS 프로밴드 또는 이의 친척. 따라서, 예를 들면, 대조 그룹 및 피검자들이 구조화 설문지를 완성하기 때문에, 강박 행동에 대한 비교를 약물 남용이 없고 강박 행동이 없는 대조 그룹 대 강박 행동이 없는 TS 프로밴드 및 TS 프로밴드 친척 대 강박 행동이 있는 TS 프로밴드 및 TS 프로밴드 친척에 대해 수행한다. 폴리유전자성 세트에서 TS 프로밴드들 중 단지 3%만이 경미하고, 74%가 중증이며, 32%가 심각하다.
통계.개인 행동, 예를 들면, 행동 x를 조사한 경우, 행동 x가 있는 TS 프로밴드 대 행동 x가 없는 대조 그룹에서의 표지의 우세가 의미있게 증가하는 데 대한 2가지의 가능성 있는 이유가 다음과 같다: a) 표지된 유전자가 행동 x에서 어떤 역할을 수행할 수 있거나, b) 표지된 유전자가 자체적으로 행동 x와 연관되어 있는 행동 y와 관련되어 있기 때문에 표지된 유전자가 빈번하게 증가할 수 있다. a)와 b)를 구분하기 위해, 본 발명자들은 (행동 x가 없고 행동 y가 거의 없는) 대조 그룹, (행동 x는 없지만 행동y는 종종 없는) 경우 및 (행동 x가 있고 행동y도 종종 있는) 경우의 모든 세가지 경우를 통과하는 표지의 우세에 있어서의 유의적인 점진적인 선형 증가가 있어야 한다고 주장한다. SPSS(시카고 일리노이 소재의 SPSS, Inc.) 통계 패키지를 사용했다. (행동 x가 없고 행동 y가 거의 없는) 대조 그룹 대 (행동 x는 없지만 행동y는 종종 없는) 경우 대 (행동 x가 있고 행동y도 종종 있는) 경우의 점진적 시리즈에 대한 이분법 변수를 비교하는 경우, 점진적 선형 경향을 위한 SPSS 만텔-하엔첼 χ 스퀘어 통계를 사용했다. D2Al 대립형질(D2A1A1 또는 D2A1A2)를 갖는 피검자 대 Al 대립형질(D2A2A2)를 갖지 않는 피검자에서의 특정 행동 스코어의 평균치를 비교하기 위해 스튜던츠 t-테스트를 사용했다.
연구된 유전자들 각각에 대한 균일성을 위해, 본 발명자들은 상이한 3가지 그룹에 대한 동일한 피검자 그룹을 유전자형화했다. 이 그룹을 폴리유전자성 세트라고 명명한다. 피검자들을 DβH 또는 DAT1 대립형질들에 대해 유전자형화하기 전에 폴리유전자성 세트에 소속시킨다. 폴리유전자성 세트에 대한 선택 기준은 피검자들이 라틴아메리카계 백인이어야 하고, 구조화 설문지를 완성해야하며, 채혈에 동의해야 하며, 3종의 유전자 모두를 유전자형화하기에 충분한 양의 DNA를 생성해야 하며, 대조 그룹, TS 프로밴드 또는 프로밴드 친척 중의 어느 하나이어야 한다. 동일한 피검자들을 시험하기 때문에, 상이한 유전자들과 비교하기 위한 행동 스코어에 대한 평균치를 제공한다.
폴리유전자성 세트에는 319명의 피검자들이 있다. 또한, 상당수의 피검자들이 3가지 유전자 모두에 대해서가 아니라 이들 유전자들 중의 하나에 대해 유전자형화된다. 각각의 유전자를 토탈 세트라고 명명하며 상이한 유전자들에 대해 크기별로 분류한다. 모든 경우에 있어서, 토탈 세트는 폴리유전자성 세트와 추가의 비폴리유전자성 세트 케이스들을 포함한다. 각각의 행동에 대한 데이타 또는 파워를 상실하는 것을 피하기 위해, 토탈 세트도 검사한다. 그러나, 공간 절약을 위해, 고유 표의 최종 컬럼에 토탈 세트에 대한 p값을 기재한다. t-시험 분석으로 대립형질 또는 표지를 갖지 않는 피검자에 대한 시험된 대립형질 또는 표지를 갖는 피검자의 다양한 상이한 행동들에 대한 평균치를 비교한다. 또한, 경우에 따라, 토탈 세트에 대한 p값을 각 표의 최종 컬럼에 기재한다.
상이한 행동 스코어에 대한 평균치에 대한 정량적 시험을 위해, 본 발명자들은 2종의 다소 반대되는 방법들을 계획했다. 첫번째 방법은 시험하는 피검자들이 많으면 많을수록 유형 II 에러에 대한 가능성이 더 적다는 가정하에, 가능한한 많은 수의 피검자들을 시험하는 것이다. 이러한 방법 조정을 위해, 프로밴드 친척 및 TS 프로밴드들을 시험한다. 두번째 방법은 돌연변이성 유전자를 최대로 나타내는 개인들과 최소로 나타내는 개인들을 비교한다는 가정하에 극단적인 그룹들, 즉 대조 그룹 대 TS프로밴드의 비교만을 실시하는 것이다. 결과는 첫번째 방법에 대해서만 나타내며, 두번째 방법의 결과는, 이의 결과가 보다 큰 세트를 시험하는 것보다 보다 많은 정보를 준다면 거론될 수 있을 것이다. 본페로니(Bonferroni) 조절된 α값들을 고유 표에, 즉 상호 배타적 분류 그룹에 속하는 피검자들에 대한 복수 비교에 대해 나타낸다.
3개 중 3개, 3개 중 2개, 3개 중 1개 및 3개 중 0개의 표지가 나타나는 4개의 그룹들을 망라하는 연속적 행동들의 수의 평균치에서의 상당한 선형 감소가 존재하는지를 알아보기 위하여, 리니어 콘트라스트(Dunn and Clark, 1995)를 사용하여 아노바(ANOVA) 분석을 수행한다. 각각의 그룹 스코어들 중의 어느 것들이 α=0.05에서 서로 상당한 차이를 나타내는지를 알아보기 위해, 시험에 터키 테스트(Tukey test)를 삽입한다. 3개의 도파민 작용성 유전자에 기인한 변화율(%)을 평가하기 위해, 3개의 유전자 모두에 대해 동시에 상이한 행동 스코어에 대해 표지의 존재를 1로 하고, 표지의 부재를 0으로 하여 복수 선형 회귀 분석을 수행한다. R2는 각 유전자에 기인한 변화율을 나타내고 r2는 3개의 유전자 모두에 대한 합을 나타낸다. 이는 각각의 특히 행동에 대한 3개의 유전자 모두에 의한 변화율의 총합을 제공한다.
결과
토탈 세트에 대한 4개의 피검자 그룹에서 피검자의 수, 평균 연령 및 성 분포를 표 35에 나타낸다. TS 프로밴드의 평균 연령은 다른 그룹들에 비해 낮을 것으로 예상되었는데, 사실이 그러했다. TS 프로밴드와 TS 프로밴드 친척의 M:F 성비는 비TS 프로밴드 그룹에서보다 높을 것으로 예상되었는데, 사실이 그러했다. 그러나, 시험된 유전자들이 모두 보통 염색체를 가졌기 때문에, 성비 자체가 팩터가 되는 것을 기대할 수는 없었다. 이를 연구하기 위해, 본 발명자들은 성에 대한 상이한 표지들의 존재 또는 부재에 대한 χ 스퀘어 분석을 실시했다. 이에 대한 결과는 유의적이지 않았다.
DRD2 유전자의 Taq A1 대립형질. 만성 틱을 나타내지 않는 대조 그룹 대 만성 틱을 나타내지 않는 케이스 대 만성 틱을 나타내는 케이스.
폴리유전자성 세트 및 토탈 세트에 대한, TS 프로밴드, 만성 틱을 나타내는 TS 프로밴드 친척, 만성 틱을 나타내지 않는 TS 프로밴드 친척 및 대조 그룹에서의 D2A1 대립형질의 우세를 표 36에 나타낸다. 상기 두 케이스에서, 대조 그룹(23.5 및 26.9%)으로부터 TS 프로밴드(41.5 및 41.7%)까지 A1 대립형질의 우세에 있어서, 만텔-하엔첼 리니어 χ 스퀘어에 의한 상당히 점진적인 증가가 관찰되었다.
폴리유전자성 세트에 대한, 만성 틱을 나타내지 않는 대조 그룹 대 만성 틱을 나타내지 않는 케이스 대 만성 틱을 나타내는 케이스에서의 D2A1 대립형질의 우세를 관찰한 결과 및 토탈 세트에 대한 유의적 관련성에 대한 p값을 표 37에 기재한다. 가장 유의적인 관련성은 조증에 대한 것인데, 조증을 전혀 나타내지 않던 대조 그룹의 21.2%가 D2A1 대립형질을 갖고 있었고, 조증을 나타내지 않던 케이스의 경우는 28.7%였고, 조증을 나타내던 케이스의 경우에는 52.2%(p=0.00024)였다. 다른 유의적인 변수들을 순서대로 나타내면, 대립적 반항, 성, ADHD-R, 분열병질, ADHD, 틱, 장기간의 우울증 및 행동이다. 토탈 세트에 대한 가장 유의적인 관련성은 성(p=0.0007), 말더듬증(p=0.0008), 분열병질(p=0.0016) 및 조증(p=0.0017)에 의한 것이다.
D 2 A1 보유자 대 D 2 A2A2 보유자에 대한 평균치에 대한 T-통계.대부분의 행동 평가가 연속 스코어를 포함하기 때문에, 피검자들이 D2A1 대립형질을 갖고 있느(D2A1A1 D2A1A2)냐 아니냐(D2A2A2)에 근거하여 모든 피검자들에 대한 이들 스코어의 평균치를 구하는 것도 유리하다. 폴리유전자성 세트에서의 피검자들에 대한 결과를 t-테스트 값의 감소를 나타낸 표 38A에 기재했다. 토탈 세트에서의 유의적인 행동에 대한 p값은 마지막 컬럼에 기재했다. 유의적인 변수들을 순서대로 나타내면, ADHD, 조증, ADHD-R, 행동, 틱, 대립적 반항, 분열병질 및 성이다. 토탈 세트에 대해서는, 3개의 추가의 변수들,즉 말더듬증, 강박증 및 신체화 증상도 유의적이다. 이들 대부분은 대조 그룹이 제외되는 경우에도 여전히 유의적이다(표 38-B). 3개의 도파민 작용성 유전자 모두에 대해 사용된 결과와 비교하기 위해, 폴리유전자성 세트에서의 대조 그룹 및 TS 프로밴드에 대한 유의적인 결과를 표 38-C에 기재한다. 여기서, 행동이 가장 순위가 높고, 그 다음으로는 조증, ADHD, 틱, 분열병질, 강박증 및 대립적 반항의 순서이다. D2A1 대립형질에 대한 동형 접합(D2A1/D2A1)이 이형 접합(D2A1/D2A2)보다 높은 평균 행동 스코어를 제공하는 지를 알아내기 위해, 이들 두 그룹에 대한 행동 스코어의 평균치를 구한다. 틱 스코어를 제외한 모든 변수에 있어서, 동형 접합체가 이형 접합체보다 낮은 평균치를 나타낸다. 이는 단지 3개의 변수, 즉 술, 초등학교 및 독서에 있어서만 유의적이다.
DβH 유전자의 Taq B1 대립형질. 각종 정신 질환에서의 Taq B1 대립형질.
시험된 비라틴아메리카계 백인 148명 중 60.8%가 DβH B1 대립형질을 보유한다. 술, 약물 및 담배 남용 또는 의존자를 배제하도록 선별된 피검자들 중에서 52.9%가 B1 대립형질을 보유한다(표 39). 0.05의 α값을 사용하면, 352명의 TS 프로밴드들 중 70.5%(p=0.012)에 달하는 B1 대립형질 우세의 현저한 증가가 나타난다. TS가 과도하게 어떤 역할을 수행하는지를 알아보기 위하여, TS 프로밴드들을 글로발 레이팅에 의해 미약함(TS 스펙트럼의 어떤 면의 치료를 요하는 정도가 미약함), 중간 정도임(어떤 면에서 치료를 요함) 및 심함(TS 스펙트럼의 어떤 면이 TS 프로밴드들의 삶의 상당한 파괴를 초래함, Comings and Comings, 1985)으로 나눈다. 미약한 경우의 54.3%로부터, 중간 정도의 경우 72.1%까지, 심한 경우 72.7%까지 B1 대립형질 우세의 증가가 나타난다. 중간 정도의 경우에 대한 B1 대립형질 우세는 p=0.0071에서 유의하다.
B1 대립형질 우세는 ADHD를 나타내는 피검자 78명의 경우 73.1%(p=0.019)이고 흡연자 104명의 경우 73.1%(0.012)이다. 다른 그룹에서의 B1 대립형질 우세는 대조 그룹에서의 수치보다 상당히 증가하는 것은 아니다. B1 대립형질의 TS 및 흡연과의 관련성은 본페로니 보정을 행하지 않는 경우에만 유의적이지만, 이러한 보정이 유형 II 에러를 부적절하게 증가시킨다(Rothman, 1990)는 점을 다소 고려해야한다. 3가지 등급의 TS에서 B1/B1 동형 접합 대 B1/B2 이형 접합에 대한 포스트 혹(post hoc) 분석에서, 미약한 TS 경우의 37.1%, 중간 정도의 TS 경우의 49% 및 심한 정도의 TS 경우의 62%가 B1/B2 이형 접합을 나타내는 것으로 밝혀졌다(만텔-하엔첼 리니어 χ 스퀘어=6.25, p=0.012).
ADHD를 나타내지 않는 대조 그룹, ADHD를 나타내지 않는 케이스, ADHD를 나타내는 케이스.폴리유전자성 세트의 피검자 319명에 대한 DβH Taq B1 대립형질 우세에 대한 결과를 표 40에 나타낸다. ADHD는, 약물 남용 또는 ADHD를 나타내지 않는 대조 그룹의 경우 47.1% B1 대립형질에 대해 가장 유의적이고, ADHD를 나타내지 않는 케이스의 경우 70.6% B1 대립형질에 대해 가장 유의적이고, ADHD를 나타내는 케이스의 경우 81.9% B1 대립형질에 대해 가장 유의적이다(p=0.0001). 다른 유의한 행동 변수들을 순서대로 언급하면, 학습, 초등 학교, ADHD-R, 대립적인 반항, 틱, 조증, 술, 독서, 약물 남용, 수면, 말더듬증 및 강박증이다. 토탈 세트에 대한 결과는 ADHD에 대해 유사하며, 가장 유의적이다. 토탈 세트에서 남성만을 시험하는 경우, 수면이 가장 유의적이(p=0.00005)고, 다음이 ODD(p=0.002) 및 ADHD(p=0.005)이다.
B1 보유자 대 B2B2 보유자에 대한 평균치에 대한 T-통계.표 41-A는 폴리유전자성 세트를 대조 그룹 및 TS 프로밴드로만 한정한 경우의 결과를 나타낸다. 역시 ADHD가 리스트의 탑을 차지하며, p=0.020에서 유의적이다. 단 하나의 다른 유의적인 행동은 p=0.029인 초등 학교이다. 토탈 세트에 대한 유의적인 결과는 표 41-B에 기재되어 있다. 대립적인 반항 행동, 수면, ADHD 및 독서는 α=0.05에서 유의적이다. B1 대립형질에 대한 동형 접합(B1/B1)이 이형 접합(B1/B2)에 비해 더 높은 평균 행동 스코어를 제공하는 지를 알아보기 위해, 이들 두 그룹에 대한 모든 행동 스코어의 평균치를 구한다. 동형 접합체 대 이형 접합체의 어떠한 행동 변수에 대해서도 유의적인 편차가 나타나지 않았다.
DAT1 유전자의 10/10 유전자형.시험된 피검자들의 전체 세트에 대한 상이한 DAT1 대립형질들의 빈도수를 표 42에 기재했다. 분석을 단순화하기 위해, 토렛 증후군(Tourette's syndrome) 및 자폐증, 및 행동 질환의 상이한 부류에 대해 10/10 유전자형의 우세를 10/x 또는 x/x 유전자형의 우세와 비교한다. 91명의 대조 그룹 중 37.4%가 10/10 유전자형을 보유한다. 이는 241명의 TS 프로밴드들에 있어 52.3%까지 증가한다(p=0.015). 미약한 TS 피검자, 중간 정도의 TS 피검자 및 심한 TS 피검자들에 있어서 유의적인 편차는 없다. 자폐증을 갖는 36명의 피검자들 중 58.3%가 10/10 유전자형을 보유한다(p=0.031). TS 프로밴드 및 TS 프로밴드 친척에 대한 결과는 본페로니 보정 후에도 여전히 유의적이다. 10 대립형질의 빈도수에 대한 관찰은 대적할 만한 결과를 제공한다(표 42의 마지막 2개의 컬럼).
신체화 질환을 갖지 않는 대조 그룹, 신체화 질환을 갖지 않는 케이스, 신체화 질환을 갖는 케이스.319명의 피검자로 구성되는 폴리유전자성 세트에 대한 결과를 표 43에 나타낸다. 가장 큰 χ 스퀘어 값을 갖는 변수는 10/10 유전자형을 보유하는 신체화 질환을 갖지 않는 대조 그룹중 21.1% 대 신체화 질환을 갖지 않는 TS 프로밴드 또는 TS 프로밴드 친척들 중 46.8% 대 신체화 질환을 갖는 TS 프로밴드 또는 TS 프로밴드 친척들 중 60.3%에 의해 신체화된다(p=0.002). 다른 유의적인 변수들을 χ 스퀘어 값 순서대로 언급하면, 술, ADHD-R, 장기간의 우울증, 공황, 강박증, 포괄적 불안증 및 조증이다. 357명의 피검자들로 구성되는 적절하게 더 큰 토탈 세트에 대한 유의적인 결과를 표 43의 마지막 컬럼에 나타낸다. 중요한 차이는 대립적인 반항, 성, 독서 및 ADHD를 유의적인 변수로서 포함시킨 것이다.
10/10 유전자형 대 비 10/10 유전자형에 대한 평균치에 대한 T-테스트.토탈 세트를 시험하는 경우, 변수 신체화 및 장기간의 우울증이 10/10 유전자형을 갖는 피검자들의 경우에 상당히 큰 평균치를 나타낸다(표 44-A). 어떠한 변수도 폴리유전자성 세트의 모든 피검자들에 대해 유의적이지 않다. 단지 폴리유전자성 세트의 경우에만, 대조 그룹 및 TS 프로밴드에 대한 결과를 표 44-B에 나타낸다. 이는 3가지의 추가의 효과에 대한 시험에 사용되는 세트이다. 여기서 다음의 변수들이, 기재되는 순서대로 유의적이다: 포괄적 불안증 , 장기간의 우울증, ADHD-R 및 술.
3개의 도파민 작용성 유전자 모두에 대한 비교.3가지 유전자 모두에 걸쳐 시험된 행동 스코어 각각에 대한 결과는 표 45에 나타낸다. 시험 그룹들은 3가지 표지 모두를 물려 받은 자(그룹 1), 3가지 중의 2가지를 물려받은 자(그룹 2), 3가지 중의 1가지를 물려받은 자(그룹 3) 및 3가지 중의 어느 것도 물려받지 않은 자(그룹 4)들로 구성된다. 상기 4가지의 유전자 그룹에 대해 가장 유의적인 선형 관련성을 나타내는 콤오비드 행동(comorbid behavior)은 ADHD(p=0.0002)이다. 예를 들면, 3가지 표지 모두를 물려 받은 자에 대한 ADHD 스코어는 30.04이고, 3가지 중의 2가지를 물려받은 자에 대한 ADHD 스코어는 24.74이고, 3가지 중의 1가지를 물려받은 자에 대한 ADHD 스코어는 20.42이고, 3가지 중의 어느 것도 물려받지 않은 자에 대한 ADHD 스코어는 14.07이다. 그룹 4(3가지 중의 어느 것도 물려받지 않은 자)에 대한 평균치는 그룹 1 및 2에 대한 평균치보다 상당히 작고, 그룹 3에 대한 평균치는 그룹 1에 대한 평균치보다 상당히 작다. 다음으로 가장 유의적인 것은 말더듬증에 대한 스코어로서 각각 1.17, 1.06, 0.94 및 0.46(p=0.0002)이다. 그룹 1 내지 4에 대한 대립적인 반항 행동에 대한 각각의 스코어는 5.04, 3.91, 3.38 및 1.93(p=0.0023)이다. 행동 질환에 대한 각각의 스코어는 4.08, 3.05, 2.87 및 1.93(p=0.0023)이다. 다른 유의적인 변수는 틱, 강박증, 조증, 술 및 포괄적 불안증이다. 다른 행동들은 유의적이지 않은 반면, 20 중의 16은 유전자 보유량이 적어지는 것에 비례하여 점진적 선형 감소를 나타낸다. 전체적인 폴리유전자성 세트를 사용하는 경우에 결과는 유사하지만 다소 덜 유의적이다.
이들 관계를 보다 자세히 살펴보기 위해, 가장 유의적인 행동 스코어인 ADHD를 3가지 유전자들의 표지의 모든 가능한 조합을 나타내는 8개의 그룹으로 나눈다(표 46). 이는 증가 추세 및 감소 추세를 확인시켜준다. 틱 스코어의 유사한 감소가 나타난다. 이들결과는 4가지 유전자 카테고리에 대한 결과들과 유사하며 동일한 변수들에 대해 유의적이다.
결과가 대조 그룹의 확인되지 않은 면에 의해 어느 정도 유도될 수 있는 가능성을 알아보기 위해, TS(프로밴드 및 친척)를 갖는 피검자들에 대해서만 분석을 반복한다. 스코어의 좁은 범위에도 불구하고, 나타난 보다 높은 p값, ADHD, ADHD-R, 신체화 및 장기간의 우울증은 p ＜0.05에서 유의적이고, 행동, 대립적인 반항 및 조증은 p ＜0.07에서 약간 유의적이다. 예를 들면, 그룹 1 내지 4에 대한 ADHD 스코어 값은 각각 29.9, 26.1, 23.0 및 22.9(p=0.01)이고, 행동 스코어 값은 각각 5.1, 4.0, 3.8 및 3.2이며, 대립적인 반항 스코어는 각각 3.8, 3.3, 2.9 및 2.7이다. 보다 유의적인 행동 변수에 대한 변동비에 대한 평가 결과를 표 47에 나타낸다. 일반적으로, DRD2 유전자가 변동비에 대한 기여도가 가장 크다. TS와 관련된 대부분의 행동에 있어서, 변동비 중 3.0 및 7.6%가 3가지의 도파민 유전자에 기인한다.
이 시험에서, 인종적 배경에 기인할 수 있는 유전자 변형 및 기타 유사한 질환들을 제거하기 위한 시도가 있었다. 이는 다음과 같다. 1. 모든 피검자들은 비라틴아메리카계 백인이었다. 2. 대조 그룹에는 ADHD, 약물, 술 및 담배 남용/의존성 피검자들이 포함되지 않도록 하였을 뿐만아니라, 이들을 TS 프로밴드 및 TS 프로밴드 친척에 대해 사용된 것과 동일한 구조의 장치로 시험했다. 이는 시험하고자 하는 행동들을 하는 대조 그룹을 제외시키도록 한 것이다. 이것이 갖는 급진적인 효과는 토탈 세트의 경우, 대조 그룹에서 D2A1 대립형질의 우세의 변화율이 35.0% 내지 23.8%이고, 상이한 행동들에 대한 적합한 자격을 갖는 대조 그룹의 인원수의 변화가 67명 내지 40명이라는 사실로부터 설명될 수 있다. 3. 다수의 피검자들에 대해 타입 II 에러가 발생하지 않도록 시험했다. 따라서, 토탈 세트의 경우 DRD2 유전자좌를 갖는 484명의 피검자에 대해 시험했으며, 폴리유전자성 세트에 대해서는 319명에 대해 시험했다. 4. 모든 피검자들에게 DIS에 기초한, 동일한 정신질환의 구조화된 검토를 실시하였다. TS는 컴플렉스 스펙트럼 질환(Comings, 1995d, Comings, 1990)이며, D2A1 대립형질이 몇몇 행동들과 강한 관련성을 가질 수 있으나, 다른 것들은 오히려 단일의 이분법 진단체(TS 또는 비TS)에 의존할 수 있는 가능성을 알아보기 위해 다수의 상이한 행동들을 시험할 수 있게 한다. 5. TS 프로밴드, TS를 갖거나 갖지 않는 TS 친척, 및 대조 그룹의 포함은 시험하고자 하는 행동 스코어를 훨씬 넓은 범위로 할 수 있는 기회를 부여한다. 6. 대조 그룹의 부적절한 선택에 대한 걱정을 제거하기 위해, 결과를 대조 그룹을 포함시키지 않고 분석했다. 7. 개개인들이 보다 큰 유전자 보유도를 가질 수 있기 때문에, 코모비드 상태를 갖는 프로밴드를 고의로 배제시키지 않고 포함시켰다. 8. 비프로밴드 피검자가 종종 보다 미약하게 영향을 받을 수 있는 경우에, 관련 시험에 사용되는 유형의 보다 큰 패밀리에 촛점을 맞추기 보다는 다수의 보다 심하게 영향을 받는 프로밴드를 선택했다. 9. 표현형에 대한 2가지 이상의 유전자 조합, 즉 DRD2 유전자의 Taq Al 대립형질, DβH 유전자의 Taq Bl 대립형질 및 DAT1 유전자의 10/10 유전자형의 영향을 시험했다. 이를 완수하기 위해, 3가지 유전자 모두를 동일한 피검자 세트에 대해 시험했다.
도파민 D 2 수용체 유전자. TS 프로밴드 대 다른 그룹에서의 D2A1 대립형질.표 36에 나타낸 바와 같이, 토탈 세트에 대하여, TS 프로밴드의 41.7%가 D2Al 대립형질을 함유하고, TS를 갖는 친척(relative)의 경우에는 35.0%이고, TS를 갖지 않는 친척의 경우에는 28.8%이고, 물질 남용 질환을 갖지 않은 대조 그룹의 경우에는 26.9%이다. 이러한 진행은 p=0.0038에서 유의적이다. 발명자들의 대조 그룹에 대한 결과(26.9%)는 알콜 및 약물 남용/의존을 배제하고 선별된 총 714명의 비라틴아메리카계 백인 대조그룹에서 25.9%의 D2Al 대립형질 보급율로부터 구별할 수 없다(Comings et al., 1996e). 발명자의 TS 프로밴드 보급율(41.7%) 또한 40.7%인 발명자 및 다른 사람들에 의해 유전자형화된 총 432명의 TS 대상의 보급율로부터 거의 구별할 수 없다. 이들 결과는 TS 속의 DRD2 유전자의 역할과 일치하지만, 이들은 행동 스펙트럼의 어떤 부분이 주로 영향을 받는지를 한정하지 못한다. 이를 결정하기 위해서, 본 발명자들은 3개의 그룹, 즉 문제의 행동을 갖지 않는 대조 그룹, 문제의 행동을 갖지 않는 경우 및 문제의 행동을 갖는 경우에서 D2Al의 보급율을 조사하였다.
충동, 강제, 습관, 감정, 불안, 수면 및 학습 행동과 관련된 20개의 개별 증상을 조사한다(표 37 및 38). (ADHD의 이중 평가를 포함하여 21개). D2Al 대립형질와 유의적으로 관련된 변수는 성, 말더듬증, 강박증, 정신분열증, 조증, ADHD-R, 틱, ADHD, 행위, 대립적인 반항, 알콜 남용, 학습 및 수면 문제이다. 다른 모든 행동은 동일한 경향을 나타내지만 유의적이지는 않다. 토탈 세트에 대한 2개의 가장 유의적인 행동(말더듬증 및 성)과 가장 덜 유의적인 행동(공포증)에 대한 결과. 조증 행동은 폴리유전자성 세트의 χ 스퀘어 연구에서 가장 유의적이고 표에서 높게 위치한다. 이는 조증 증상이 가장 많은 형태의 Gts 유전자 발현을 나타냄을 제안하는 TS 프로밴드와 관련된 본 발명자의 행동 연구와 일치한다(Comings, 1995d).
TS 프로밴드만을 조사하는 경우에 D2Al 대립형질의 존재와 조증의 중증도간의 관련성의 부족은 데버(Devor, 1992)와 겔런터(Gelernter) 등(1994b)의 연구결과와 일치한다. 그러나, 대조 그룹과 비-TS 친척이 포함되는 경우에 조증의 스코어는 유의적이다. 또한, 경우들을 다른 행동에 의해 등급별로 분류하는 경우, D2Al 대립형질은 이들 다수와 관련된다.
도파민 β-하이드록실라제. DβH Taq B1 대립형질의 보급율은 적당하지만, 148명의 대조그룹(60.8%)의 경우보다 352명의 TS 프로밴드(70.5%) 경우에 상당히 높다. 상당히 증가된 B1 대립형질 보급율을 나타내는 대상의 유일한 다른 그룹은 73.1%의 흡연자들이었다.
319명의 대상으로 이루어진 폴리유전자성 세트에 있어서, DβH B1과 유의적으로 관련된 13개 변수는 ADHD, 학습, 초등학교, ADHD-R, 대립적인 반항, 틱, 조증, 술, 독서, 약물 남용, 수면, 말더듬증 및 강박증이다. 그러나, 이들 중 몇몇, 특히 유의성 경계선상에 있는 변수(알콜, 약물 남용, 말더듬증, 강박관념-강제)에 있어서, B1 대립형질의 보급율은 행동을 갖는 친척에서보다 행동을 갖지 않는 친척 및 TS 프로밴드의 경우에 보다 높은데, 이는 p값이 대조 그룹에서의 보다 낮은 빈도에 의해 유도됨을 제안한다. 이 결과는 신체화, 장기간 우울증 및 말더듬증의 유의성 첨가를 제외하고는 455명의 대상으로 이루어진 보다 큰 토탈 세트의 연구결과와 유사하다.
폴리유전자성 세트에 있어서, 대조 그룹의 경우에 B1 대립형질의 보급율은 46.9% 내지 56.5%이다. 행동 스코어의 의미를 대조 그룹과 TS 프로밴드에 대하여 폴리유전자성 세트와 토탈 세트 둘 모두를 사용하여 조사하는 경우, ADHD, 초등학교, 대립적인 반항 및 수면이 유의적이다. 본 발명자의 연구는 대립적인 반항 행동이 일관되게 행동 질환보다 B1 대립형질와 보다 유의적으로 관련됨을 증명한다.
DAT1 유전자의 가능한 역할을 조사하기 위해서, 본 발명자들은 DRD2 및 DβH 유전자의 연구 경우와 같이 대조 그룹, TS 프로밴드 및 TS 대상 친척에서 상이한 행동에 대한 10/10 유전자형의 보급율을 비교하였다. 이는 신체화, 알콜 의존, ADHD, 장기간 우울증, 강박증, 일반적인 불안, 조증, 성 및 대립적인 반항 질환을 포함하여 코모비드(comorbid) 행동에 대한 다수의 변수와의 유의적인 관련성을 나타낸다.
당해 결과는 DAT1 유전자가 40bp 반복되는 대립형질와의 분명한 생리학적 효과를 보여주는 겔런터 등(1994a)의 연구 결과를 지지하는 한편, 본 발명의 결과는 또한 정신병리학이 9개의 대립형질보다 10개의 대립형질와 관련됨을 제안한다. 이는, 유의적인 효과를 보여주는 모든 행동에서, 9개의 유전자형의 빈도가 점진적으로 감소된다는 발견에 의해서도 지지된다. 예를 들면, 신체화에 있어서, 9개의 대립형질의 빈도는 대조 그룹의 0.37로부터 신체화를 갖지 않는 친척에서 0.29로 감소되고 신체화를 갖는 친척에서 0.20으로 감소되지만, 10개의 대립형질의 빈도는 동일한 그룹들에 대하여 0.54로부터 0.70 내지 0.77로 증가하였다. 가장 통상적인 10개의 대립형질의 빈도가 행동 증상의 각종 세트의 존재하에 추가로 증가하는 것은 중요하다. 하나의 가능한 설명은 9개의 대립형질이 원래 정상 유전자이고 10개의 대립형질은 하나 이상의 열거된 행동들과의 이의 관련성으로 인해 선택에 의해 빈도가 증가하였다는 것이다.
모두 3개의 도파민작용성 유전자. 상당한 수의 비교적 중대하게 영향을 미치는 TS 프로밴드, 이의 친척 및 대조 그룹에 대해서 DNA 샘플을 수득하는 데 필요한 부가 효과 및 마이너스 효과를 연구하고 동일 대상을 모든 유전자에 대해 유전자형화하는 것을 연구한다. 이는 319개의 샘플을 사용하여 수행한다. 우선적인 가정은 2개의 전략 중의 하나가 보다 큰 힘을 제공할 것이라는 것이다. 제1 전략은 힘을 증가시키기 위해서 매우 영향을 받지 않는 친척을 포함하는 전체 폴리유전자성 세트를 조사함을 수반한다. 제2 전략은 대조 그룹과 TS 프로밴드로만 이루어진 폴리유전자성 세트의 하위 부분을 조사하는 것이다. 이는 엄격하게 가장 광범위한 스코어 및 보다 큰 2분화를 제공한다. 2개 기술 모두 긍정적인 결과를 제공하지만, 후자가 보다 효과적인 것으로 입증되었다. 이들 결과는 시험된 행동들 중에서 4개(신체화, 장기간 우울증, 수면 및 독서)에 대하여, 3개의 마크 중에 3개를 갖는 대상으로부터 3개 중에 2개, 3개 중에 1개 및 3개 중에 0개를 갖는 대상으로 진행하는 것으로 스코어가 직선 감소하였다.
본 발명자들은 TS와 ADHD가 기본적으로 유전적 장애가 동일하다(Comings 및 Comings, 1984, Comings 및 Comings, 1987a, Knell 및 Comings, 1993, Comings 및 Comings, 1993)는 것을 제안했다. 이러한 세가지 도파민 작용성 유전자를 배합하는 경우, 가장 중요한 행동 중의 두 가지는 안면 틱이라는 논증은 분자 유전적 수준에서 이러한 가설에 대한 확증을 제공한다. 기타 행동과의 상당한 상관 관계는 유전적으로 상호 관련된 행동들의 스펙트럼을 구성하는 개념을 지지한다. 기타 유전자들의 검사는 도파민 작용성 안면 틱에 의해 덜 영향을 받은 방향에서 유전자형을 예상할 수 있다. 세로토닌 수준에 대한 영향을 주는 트립토판 2,3-디옥시게나제 유전자는 한 가지 예이다(Comings et al., 1996d). 선형 추가적인 영향 이상의 증거는 없다, 즉 우세의 증거는 발견되지 않았다.
이러한 세 가지 유전자 ADHD와 가장 상당하게 관련된 행동이 세 가지 메이커의 모든 가능한 혼합을 열거함으로써 보다 상세하게 시험되는 경우, 이러한 결과는 또한 추가의 효과와 부가적인 효과와 일치한다. 자료는 세 가지 유전자에 대한 충전이 모호하지 않은 진단에 대해 ADFD의 진단 부재로부터 임상적으로 상당한 범위의 스코어를 계산할 수 있음을 나타낸다. 세 가지 메이커를 갖는 일부 대상은 ADHD의 증상이 여전히 없으며 세 가지 메이커의가 없는 일부는 ADHD를 개끗하게 절단하기 때문에, 기타 유전자를 수반하는 것이 분명하다. 따라서, TS와 ADHD에 대한 스크리닝은 이러한 장애에 관련된 기타 유전자의 알레르기 변이를 포함할 수 있다.
행동 스코어는 8개의 순열의 각각에 상관도를 전혀 나타내지 않는다. 이를 입증하기 위해, 동일한 형태의 분기에 대한 결과는 안면 틱 스코어에 대해 표-46에 기재되어 있다. 상이한 순열에대해 안면 틱 스코어가 대략의 그리고 상당한 선형 감소가 반복되는 반면, D2Al 대립형질에 대한 대상 포지티브 DβH B1와 DAT1 10/10 유전자형에 대한 네가티브는 평균 스코어가 5.0인 두드러진 불연속성을 나타낸다. 각각의 그룹에서 대상이 상대적으로 소수이기 때문에, 통계적인 변이가 존재하지만, DRD2 대립형질은 기타 유전자에 대해 보다 강한 효과를 가지며 또 다른 연구를 기다려야만 하는 것으로 나타난다. DRD2 유전자의 연구는 그 자체로 안면 틱 혹독함을 갖는 상당한 관련성을 나타낸다.
본 발명의 발견은 말더듬증이 그 자체당 ADHD 이하이고 안면 틱보다 높은 것으로 평가되고 이러한 제안은 말더듬증이 GTS 유전자의 또 다른 징후라는 것을 지지한다. 행동과 반대의 부족한 장애에 관한 이러한 관찰은 이러한 두 가지 행동 장애가 결핍된 육아를 포함하여 전적으로 정신의학사회적 인자로 인해 일반적으로 공개된 가정과는 반대로 설정된다. 유능한 양친의 비판적으로 중요한 역할을 아무도 의심하지는 않지만, 유전적 인자는 육아 스타일 또는 환경적 인자에 흠이 없는 경우에 행동 및 반대의 부족한 장애에 주된 역할을 할 것이다.
도파민 유전자에 대해 측정한 변이율. 다수의 선형 복귀 분석을 사용하는 상관 관계 계수의 계산은 세 가지 도파민 작용성 유전자에 의해 측정한 상이한 행동에 대한 변이율을 추정한다. 모든 세 가지 유전자에 대해 말더듬에 대한 변이의 1.3%에 대해 ADHD 스코어에 대한 변이 범위는 7.6%이다(표 47). 세 가지 유전자의 상대적인 중요성을 추정하기 위해, r2수치는 모든 행동 변이에 대해 합한다. 이는 세 가지 유전자의 상대적인 중요성이 DRD2, DAT1 및 DβH 유전자에 대해 각각 3:2:1의 대략적인 비율임을 제안한다. 이러한 결론은, DRD2 유전자에 대해 r이 여덟 가지 행동 변이(행동, 열광, 정신분열증, 초등학교, 안면 틱, OCD, ODD 및 공포증)가 중요하다는 사실을 지지한다. DβH 유전자에 대해, r은 변이가 없는 것이 중요하지만, 가장 높은 값을 갖는 세 가지는 ADHD, ODD, 행동, 독서, 및 학습 장애이다. 또한, 이러한 결과는 상이한 유전자와 유전자 배합이 유전자형을 어떻게 나타내는 지에 대한 열할을 하는지를 제공한다. 예를 들면, 모든 세 가지 유전자는 ADHD 및 ODd 속에 대략 동일하게 수반되지만, 행동 장애에 있어서는 DRD2 ＞ DβH ＞ DAT1가 포함된다. 학습과 독서에 있어서, 장애는 DβH ＞＞ DAT ＞ DRD2이다.
만성 안면 틱에 대한 일치율이 100%보다 작으므로(Price et al., 1985), 변이율(약 10 내지 20%)은 환경적 인자에 의한다. DRD2와 DβH 유전자에 대해 사용하는 Taq 다형성은 유전자에서의 기능적 변이에 대해 책임을 지는 서열 변화이지만, 기능적인 돌연변이를 갖는 연결 불균형에만 존재하고, 이들은 수반된 변이율의 추정은 아마도 과소평가된다, 즉 이들은 기능적인 변이가 시험되는 경우에 보다 높을 것이다. 결국, 이러한 추정은 모든 경우, 대조 그룹 및 TS 프로밴드에 대해 평균이 이들은 문제의 행동이 존재하는지 아닌지를 나타낸다. 예를 들면, 282개의 경우 중의 41개의 경우 또는 14.5%만이 말더듬을 갖는 문제가 있지만, 43.7%는 행동 문제가 있다. 실제로 측정된 변이율은 문제의 행동이 존재하며, 아마도 훨씬 높을 것이다.
이러한 결과는 이러한 장애의 폴리유전자성, 다원 계승성 특성과 일치한다. 대조 그룹 부재, 케이스 부재 및 케이스 존재에 대해 상당히 관련성이 있지만, 이러한 세 가지 유전자에 대해 측정된 비교적 낮은 변이율은 표준 연결 분석이 비생산적인 이유와, 이러한 관련성 접근이 폴리유전자에 대해 얼마나 민감한지에 대한 견해를 제공한다.
실시예 7
중독 행동에서 도파민 D1 수용체 유전자
방법
시험되는 3개의 그룹은 튜렛 증후군(Tourette's syndrome: TS) 그룹, 흡연 중지 그룹 및 병리학적 도박 그룹이다. 3개의 그룹의 모든 피검자는 비-스페인계 백인종으로 한정한다.
TS 그룹: 이 그룹은 알콜 또는 약물 남용 부재하의 대조 그룹으로 대부분의 TS 프로밴드는 다양하게 연관된 행동 질환에 심하게 걸렸으며(Comings, 1995b; Comings, 1990a) 및 상대적인 TS 프로밴드도 포함한다. 모두는 TS에 대한 DSM-IV 기준에 부합되고 모두는 개인적으로 인터뷰한다. TS 그룹에 대한 대조 그룹은 TS 프로밴드의 채용 및 단계적인 패런트, 비-정신 질환을 갖는 피검자 및 전문 및 비-전문 병원 스태프로 이루어진다. TS 피검자 및 대조 그룹 모두는 문헌에 상세히 기술되어 있다[참조: Comings et al., 1996f; Comings, 1995b; Comings, 1994b; Comings, 1994c; Comings, 1995a].
행동 스코어: 각각의 대조 그룹 및 TS 프로밴드 또는 상대 그룹이 요구되어 질환 범위에 대한 진단 인터뷰 스케쥴[Robins et al., 1981] 또는 DSM-III-R[American Psychiatric Association, 1987] 기준으로 한 질문서를 채운다. 증상은 주의 부족 과민성 질환(ADHD: 2 스코어), 알콜, 약물, 강박 신경 행동, 학습 질환, 독서 문제, 도박, 조병 증상, 공포증, 패닉 공격, 대립 무시 행동, 콘덕트 질환, 고등 학교에서 진학 문제, 스모킹, 성 행동, 정신분열, 신체화, 우울증, 수면 장해, 일반적인 불안증, 말더듬 및 틱스에 관하여 증상의 수를 평가하는 23개의 상이한 정량 변수로 그룹화한다. 이들 행동 스코어에 대하여 사용된 질문은 문헌에 상세히 기술되어 있다[참조: Comings 1995a; Comings 1994a; Comings 1994b; Comings 1995b; Comings et al., 1996a; Robins et al., 1981; Comings 1995c]. 코모르비드 행동에 대한 시험 원리는 실시예 2에서 기술한 바와 동일하다.
특히 본 연구와 관련된 증상 몇몇은 담배, 알콜 및 약물 사용, 강박 식이 및 도박에 관한 것이다. 알콜 스코어는 알콜 사용에 대한 MAST 시험으로부터 유도된 18개의 질문에 대한 "예" 또는 "아니오" 대답의 합으로 이루어진다[Comings 1994b; Comings 1990a]. 약물 스코어는 약물 남용/의존에 관한 진단 인터뷰 스케쥴을 기준으로한 9개의 질문에 대한 "예" 또는 "아니오" 대답을 기준으로한다[Robins et al 1981; Comings 1994c]. 스모킹에 대한 변수는 질문 "당신이 시가렛, 시가 또는 파이프를 매일 얼마나 피우는지가?"에 대한 대답을 "예"인 경우 1로 "아니오"인 경우 0으로 한다. 쇼핑 스코에 대한 변수는 다음 질문에 대한 대답의 합으로 한다: "당신이 필요로 하는 항목 이상을 사느냐?, 당신이 여유롭게 지불할 수 있는 이상으로 물건을 구입함에 따른 재정상의 곤란을 겪는가?, 당신의 한달 수입을 초과라는 크리디크 카드 사용에 따라 전체적인 균형은 어떠한가?, 쇼핑이 공허함을 총촉시키는가?, 행복감을 주는가?, 이들에 대한 지불없이 취해진 경우? "아니오"에 대한 대답은 0으로 "경우에 따라"에 대답은 1로, "종종"에 대한 대답은 2로 한다. 도박 스코어는 이미 문헌에 기술된 도박에 과한 중증도에 대한 9개의 "예" 또는 "아니오"로부터 유도된다[참조: Comings et al., 1996e]. 강박 식이에 대한 평가는 "당신이 얼마나 강박적으로 음식을 섭취하는가?"에 대한 질문에 대한 대답 "예" 또는 "아니오"로 한다.
흡연 중지 그룹: 두번째 그룹은 흡연 중지 임상을 보살피는 피검자로 이루어진다. 이들 피검자 및 독립적인 세트의 대조 그룹 자체는 흡연에서 DRD 2 유전자의 역할에 대한 선행 연구에 보다 상세하게 기술되어 있다[Comings et al., 1996a]. 흡연 평가 변수는 1일당 피운 시가렛의 팩의 평균수이다. 대조 그룹은 알콜, 담배 및 기타 약물을 포함하는 물질 남용에 대한 모든 유형을 배제시켜 스크린한다.
병리학적 도박 그룹: 세번째 그룹은 병리학적 도박에서 DRD 2 유전자의 역할의 선행 연구로부터 유도된 병리학적 도박 그룹으로 이루어진다. 피검자 평가에 대한 상세한 사항 및 평가는 문헌에 상세히 기술되어 있다[Comings et al., 1996e].
유전자형: DRD1 유전자를 시험하기 위하여, 본 발명자들은 이미 기술한 PCRTM에 의해 시험된 5' UTR에서 A의 G로의 변화로 이루어진 DdeI 다형을 이용한다[Cichon et al 1994a]. DRD2 유전자에 대한 마커는 TaqI A1/A2 다형이다[Grandy et al., 1989].
통계 분석: TS 그룹에서, 행동 스코어의 평균을 SPSS 통계 팩키지로부터 ANOVA 통계 프로그램을 사용하여 상이한 유전형을 갖는 피검자와 비교한다[SPSS, INC., CHICAGO, Ill]. 터키 분석은 2개 이상의 그룹이 시험되는 경우 개개 그룹 사이의 유의한 개개 차에 대하여 시험한다. 상이한 유전자형을 따라 상이한 스코어의 평균에서의 점진적인 증가가 예기되는 경우, 선형 ANOVA를 SPSS 통계 패키지에서 다항식의 서브코맨드를 1로 설정하여 사용한다. ANOVA 분석의 결과를 기준으로 하여 χ2 분석을다음의 3개의 상이한 그룹에서 가장 높은 평균 행동 스코어와 관련된 유전자형의 빈도수를 비교하여 수행한다. 첫번째는 시험되는 행동 부재하의 대조 그룹으로 이루어진다. 대조 그룹은1개 이상의 질문서를 충족시키기 위해 요구되므로, 특이한 행동이 대조 그룹에서 존재하거나 부재하는지 측정할 수 있다. TS 그룹에서, 대조 그룹 및 피검자 모두에서 행동의 존재 또는 부재는 선행 연구에 기술된 이분법 중지점을 기준으로 한다[COMINGS 1995b]. 주어진 행동이 없는 대조 그룹은 대조 부재라 한다. 동일한 이분법 중지점은 2개의 그룹으로 나뉜 TS 프로밴드 및 상대 그룹에 주어지고, 이들은 시험하는 특이 행동이 없으며 행동을 갖는다. 이들 그룹을 경우 부재 및 경우 존재라 하고, 두번째 및 세번째 그룹을 형성한다. 선천적인 가설은 주어진 유전자형 및 행동 사이에 유의한 연관인 있는 경우이며, 이는 3개의 그룹을 따라 이러한 유전형의 빈도수에서 점진적 증가해야 한다. 경우 부재 및 경우 존재 그룹의 사용은 시험되는 것 이외의 행동과 연관이 있으므로 TS 피검자에서 유전자형의 빈도수가 증가할 가능성에 대하여 조절한다. 본 발명자들은 이들 3개의 그룹을 따라 유전자형의 빈도수의 점진적 증가를 예상하므로, 선형 χ2 시험[SPSS 통계 패키지에서 Mantel-Haenszel 시험]을 사용한다. 결과가 3개의 그룹을 따라 선형 증가에 부분적으로 매치되는 것을 확실시하기 위해, 본 발명자들은 또한 시험되는 유전자형의 빈도수가 경우 부재 그룹에서 보다 경우 존재 그룹에서 20% 이상 높아야 함을 요구한다. TS에서 도파민 작용성 유전자의 연구에서와 같이(COMINGS ET AL., 1996f), 회귀 분석이 특이한 유전에 의한 상이한 행동 스코어의 변화율을 측정하는데 돕는다는 것을 발견하였다. 이는 r로 주어지고, r2는 유전자에 의해 계산된 주어진 정량 시험의 변수의 분수이다.
다중 분석에 대한 보정: 23개의 상이한 행동이 TS 그룹에서 시험되므로, 유의 수준으로의 조절이 필요하다. 0.05의 α는 너무 개방적이고, 0.05/23 또는 0.002의 α는 너무 부수적이다. 따라서, 0.05/10 또는 0.005의 중간 α가 선택된다. 선척적 가설을 사용한 흡연 중지 그룹의 연구는 TS 그룹에서의 결과를 기준으로하고, 1일당 흡연한 팩으로 단일 변수 시험을 수반하므로, 0.05의 α를 사용한다. 최종적으로, 병리학적 도박 그룹의 시험을 단지 유전자형 빈도수의 비교를 포함하므로, 0.05의 α를 사용한다.
결과
TS 그룹: 대조 그룹(n=63)에 대한 DdeI 다형의 대립형질 빈도수는 1 대립형질에 대하여 0.34이고 2 대립형질에 대하여 0.66이다. TS 프로밴드(n=227)에 대한 대립형질 빈도수는 1 대립형질에 대하여 0.37이고, 2 대립형질에 대하여 0.63이다. 이들은 χ2=0.43, d.f.=1, p=0.51이므로 유의하게는 상이하지 않다. 대조 그룹 및 TS 그룹에 대한 DdeI 다형에 대한 유전자형의 분포는 표 48-A에 나타내었다. 11 유전자형은 대조 그룹에서 4.9%이고, TS 그룹에서 17.5%이고, χ2는 3.75이고, d.f.은 1이고, p는 0.053이다. 11 또는 22 유전자형을 포함하는 이들 그룹의 변화율은 대조 그룹에서 41.3%이고 TS 프로밴드에서 57.3%이다. 이는 χ2=5.08, d.f.=1, p=0.024이므로 유의하다.
DRD2 유전자의 TaqI A1/A2 대립형질의 선행 연구에서 폭넓은 정량 분석이 12 이형 접합체에 대하여 가장 높은 스코어, 22 동형 접합체에 대하여 중간 스코어 및 11 동종 접합체에 대하여 가장 낮은 스코어를 나타낸다는 것을 항상 관찰하였다. 이들 연구를 기준으로 하여, 3개의 피검자 그룹에서 12 이형 접합체의 %를 시험한다. TS 그룹에 대한 이들 결과는 표 48-B에 나타내었다. 73 대조 그룹 중에서, 19.2%는 12 이형 접합체이고, 345 TS 프로밴드 중에서 35.3%는 이형 접합체이고, χ2=7.19, d.f.=1, p=0.0073이다.
DdeI 유전자형 및 23 정량 변수 상이의 연관은 ANOVA에 의해 시험한다(표 49). 0.005의 α에서 유의하지 않으며, 알콜 스코어에 대한 p 값은 0.0096이다. ＜0.20의 p 값을 갖는 7개 스코어 중에서 5개는 중독 행동-알콜 사용, 흡연, 강박 식이, 도박 및 쇼핑-에 관한 것이다. 11 유전자형을 갖는 그룹은 가장 높은 스코어를 갖는다. 예를 들면, 알콜 사용 변수에 대하여, 11 유전자형을 갖는 그룹은 12 유전자형을 갖는 그룹에 대한 0.23 및 22 유전자형을 갖는 그룹 0.42과 비교하여 1.30의 평균 스코어를 갖는다. 23 변수 전체 중에서, 11 유전자형을 갖는 그룹은 학습 질환 및 신체화를 제외하고는 모든 변수에 대하여 가장 높은 평균을 갖는다.
이들 결과를 기준으로 하여, 본 발명자들은 대조 부재, 경우 부재 및 경우 존재의 3개 그룹을 따라 상이한 행동에 대한 11 유전자형의 빈도수에서 점진적인 증가가 있는지의 여부를 시험한다(표 50). 선형 증가가 0.05 이상의 α에서 유의하고, 11 유전자형의 빈도수는 경우 부재 그룹에서 보다 경우 존재 그룹에서 20@ 이상 높은 경우 3개 행동이 있다. 도박, 알콜 사용 및 강박 쇼핑에서 유의하다. 예를 들면, 도박 스코에 대하여 11 유전자형은 대조 부재 도박 문제에 대하여 4.6%로부터 경우 부재 도박 문제에 대하여 15.5%으로 경우 존재 도박 문제에 대하여 33.3%로 증가시키다(p=0.00095). 0.05 이상의 α가 사용되는 경우, 3개의 추가 변수-약물 사용, 강박 식이 및 흡연-이 중독 행동에 관한 것이다.
일변 회귀 분석(표 51-A)은 2개 행동-도박 및 알콜 사용에 대하여 0.005 이상의 p에서 유의하다. 0.05 이상의 α에서, 4개의 추가의 변수는 강박 식이, 흡연, 틱 및 독서이다. 다음 가장 유의한 행동은 쇼핑이다. Dde 다형에 대한 r2을 기준으로 하여, DRDI 유전자는 도박 스코어의 변수 3.6%, 알콜 스코어의 2.8%, 강박 식이 스코어의 1.9% 및 흡연 스코어의 1.6%에 공헌한다.
다변 회귀 분석에 의한 DRD1 및 DRD2 유전자의 가능한 상호작용을 시험하기 전에, 본 발명자들은 우선 일변 회귀 분석을 사용한 TaqI A1/A2 다형을 기준으로 하여 DRD2 유전자의 효과를 시험한다. DRD2 11 및 22 동종 접합체를 포함하는 피검자는 1로서 12 이종 접합체는 2로 스코어링한다. 0.005 이상의 α에서, DRD2 유전자는 유의하게는 반대되는 결핍 행동, 콘덕트 질환, 강박 식이, 흡연, 도박 및 ADHD와 연관된다(표 51-B). 0.05 이상의 α에서, 추가의 변수는 조광증, 말더듬, 강박-신경증 및 정신분열 행동이다. r2 값을 기준으로 하여, Taq A1 대립형질에 대하여 이종 접합체는 대립 결핍 스코어에 대한 변수의 4.2%, 콘덕트 질환 스코어의 변수의 3.8%, 식이 스코어의 4.1%, 흡연 스코어의 3.3% 및 도박 스코어의 2.9%이다.
다변 회귀 분석은 r이 도박, 강제 식이 및 흡연에 대하여 DRD1 및 DRD2 유전자 모두에 대하여 유의함을 나타낸다(표 51C). 이들 각각에서, 결과는 DRD1 및 DRD2 유전자를 합하는 경우, 이들 스코어의 변수의 5.9 내지 4.8%로 계산되므로 중독성이다. 알콜 스코어는 DRD1 유전자의 11 유전형이 유의한 효과를 갖고 이러한 그룹에서 DRD2 AL 대립형질의 효과가 유의 하지 않는 다는 것을 나타내기 위해 포함된다.
DRD1 및 DRD2 유전자의 중독 효과는 또한 DRD1 Dde 11 및 DRD2 Taq A12 유전자형 모두를 갖는 것은 3으로 한 유전자형을 갖는 것을 2로서 및 유전자형을 갖지 않는 것을 1로서 스코어된 단변 회귀 분석을 사용하여 시험한다(표 51D). 0.005 이상에서 유의한 변수는 도박, 흡연, 강박 식이, 대립 결핍, ADHD, 콘덕트 질환, 강박-신경증, 조광증 및 알콜 사용이다.
DRD1 및 DRD2 유전자의 중독 효과는 DRD1 DdeI 12 또는 22 및 DRD2 TaqI 11 또는 22 부재, DRD1 DdeI 11 또는 DRD2 TaqI 12 중의 하나 또는 DRD1 Dde 11 및 DRD2 Taq 22 모두로 이루어진 3개의 그룹에 대한 선형 ANOVA 를 사용하여 시험한다(표 52). 0.005 이상의 α에서, 이는 변수 강박 식이, 흡연, 대립 결손, ADHD, 콘덕트 질환, 강박신경증, 조박증 및 알콜 행동 변수에 대한 부재, 선택 또는 모든 그룹 중의 하나로부터의 평균 스코어에서 유의한 점진적인 증가를 나타낸다.
DRD1 및 DRD2 유전자의 중독 효과는 또한 DRD1 Dde 11 유전자형 또는 DRD2 Taq A12 유전자형 또는 이들 둘 다이 존재의 빈도수에 대한 선형 χ2를 사용하여 시험한다(표 53). 0.005 이상의 α에서 유의하고 경우 존재 그룹에 대한 평균이 경우 부재 그룹 보다 20% 이상 높은 경우에서의 이들 변수는 조독증, 알콜, 강박신경증, 콘덕트 질환, 정신질환, 성, 강박 식이 및 주 우울 에피소드이다. 다양한 알콜 사용, 강박 식이 및 조독증이 나타난다.
DRD 1 DeI 11 또는 12 유전자형을 포함하는 피검자의 %에서 대조 및 TS 프로밴드 사이의 유의한 차가 존재하므로, 본 발명자들은 또한 3개의 그룹, 즉 대조 그룹, 경우 부재 및 경우 존재 그룹에 따른 11 또는 22 유전자형을 포함하는 피검자의 %를 시험한다. 다음의 변수가 0.05 이상의 α에서 유의하고 경우 존재 그룹에 대한 평균은 도박, 알콜 사용 및 고등 학교 문제에서 경우 부재 그룹 보다 20% 이상 높다.
흡연 중지 그룹: 61 흡연 대조 그룹에서 DdeI 1 대립형질의 빈도수는 0.35이고 177 흡연자 그룹에서는 0.34이다(표 48A). 대조 그룹 중에서, 4.9%는 11 유전자형을 포함하고, 흡연자 그룹에서는 17.5%를 포함하며, χ2=5.88이고, d.f.=1이고, p=0.015이다. 대조 그룹 중에서 39.3%는 11 또는 22 유전자형을 포함하고, 흡연자 그룹에서는 66.1%를 포함하며, χ2=13.45이고, d.f.=1이고, p=0.0002이다.
DRD2 유전자에서, 대조 그룹 중에서 26.2%는 12 유전자형을 포함하고 흡연자 그룹에서는 42.8%를 포함하며, χ2=5.69이고, d.f.=1이고, p=0.017이다. 대조 그룹에서, 24.1%는 DRD1 11 또는 22 유전자형 및 DRD2 12 유전자형을 포함하고, 흡연자 그룹에서는 45.5%를 포함하며, χ2=8.25이고, d.f.=1이고, p=0.0041이다.
흡연 중지 그룹에서 시험된 변수는 1일당 피운 팩이다. 대조 그룹은 모두 TS 그룹에서 사용된 흡연에 대한 동일한 질문을 포함하는 행동 질문서를 완결하였으므로, 시가렛, 시가 또는 파이프를 피우고 약물 또는 알콜 남용한 대조 그룹을 배제할 수 있다. 이들 피검자는 0 팩/일 그룹으로 구성된다. 흡연 중지 그룹에서 피검자는 1 내지 1 1/2 및 2 내지 2 1/2 팩/일을 피운 그룹으로 나눈다. (1 팩/일 이상 피운 피검자만이 연구에 참가하였으므로, 1 팩/일 미만의 피검자는 없다.) DRD1 유전자의 결과는 표 54에 나타내었다. 11 유전자형을 포함하는 피검자의 %는 이들 3개 그룹에 따라 4.9%에서 16.4%에 이어 18.0%로 증가하고 χ2=5.14이고, p=0.023이다. 11 또는 22 유전자형을 포함하는 피검자의 %는 3개 그룹에 따라 39.3%에서 61.8%에 이어 68.0%로 증가하고, χ2=12.87이고, p=0.00033이다. DRD2 TaqI A1/A2 다형에 대한 이종 접합 피검자 %는 3개 그룹을 따라 26.2%에서 34.5%에 이어 46.3%로 증가하고, χ2=7.99이고, p=0.0047이다. DRD 11 또는 22에 대하여 동종이고 DRD2 TaqI A1/A2 대립형질에 대하여 이종인 피검자 %는 3개 그룹을 따라 24.1%에서 34.5에 이어 50.4%로 증가하고, χ2=23.48이고, p=0.0001이다.
흡연에 대한 DRD1 및 DRD2 유전자의 상호작용은 또한 다변 선형 회귀 분석을 사용하여 시험한다(표 55). 이는 이들 다형에 의해 마크된 DRD 1 및 DRD 2유전자가 각각 동일하게 구성됨을 보여준다. 팩/일 변수의 10.5%로 계산된다.
병리학적 도박 그룹: TS 및 흡연 중지 그룹과는 달리, 병리학적 도박 그룹은 그 자체의 대조 그룹을 갖지 않는다. 따라서, 비교 목적으로, TS 및 흡연 중지 대조 그룹을 합하여 전체 대조 그룹을 형성하고, 이를 병리학적 도박 그룹에 대하여 사용한다. 도박 그룹에서, 14.1%는 DRD1 DdeI 1 대립형질에 대하여 동종이고, χ2=5.39이고, p=0.020이고, 55.8%는 11 또는 22 유전자형에 대하여 동종이고, χ2=6.75이고, p=0.009이다. DRD2 유전자에 대하여, 도박 그룹의 45.7%는 TaqI 12 그룹을 함유하고, χ2=18.61이고, p=＜0.0001이다. 도박 그룹 중에서 23.3%는 DRD1 11 또는 22 유전자형 및 DRD2 TaqI 12 유전자형을 포함한다.
정신 질환 범위에서 도파민 D1 및 D2 수용체 사이의 상호작용을 지시하는 많은 연구에도 불구하고, DRD1 유전자의 유전 변이체 및 행동 사이의 가능한 연관 또는 DRD1 및 DRD2 유전자의 유전 변이체의 가능한 상호작용을 시험하는 소수의 연구가 있다. 본 발명자들은 DRD1 유전자의 변이체 또는 DRD1 및 DRD2 유전자의 중독 효과가 이들 행동에 중요한 역할을 하는 가능성에 대하여 흥미가 많다. PCRTM 기본 시험이며 작은 대립형질이 일반적인 피검자에서 통상적이므로, 본 발명자들은 DRD1 DdeI 다형을 선택하였다[Cichon et al., 1994a]. DRD2 유전자의 선행 연구가 하나 이상의 유전자의 상호작용을 시험하는 값을 나타내므로, DRD1 유전자 단독의 유전 변이체 사이의 연관 및 DRD2 유전자의 TaqI A 다형의 가능한 중독 효과를 시험한다. 인종 효과를 최소화하기 위해, 비-스페인계 백인종을 연구한다. 우연 효과를 최소화하기 위해, 본 발명자들은 3개의 상이한 피검자 그룹(이들 중의 2개은 그 자체 대조 그룹을 갖는다)을 시험하여 수득치를 교차 반복한다.
대립형질 및 유전자형 빈도수: 대립형질 및 유전자형 빈도수의 결과는 표 48A에 나타내었다. DRD1 변이체에서, 대조 및 피검자에서 DdeI 1 대립형질의 빈도수는 사실상 동일하다. 3개의 그룹, TS 프로밴드, 흡연자 그룹 및 도박 그룹에서, 1 대립형질 빈도수는 각각 0.37, 0.34 및 0.35이다. 정신병 질환에서 연관 연구의 많은 보고서는 특정 질환을 갖는 피검자에 대한 대조의 유전자 빈도수의 비교로 그 자체 한정된다. 유사한 한정은 DRD1 유전자가 이들 질환에서 역할을 하지 않는다는 것을 제시한다. 그러나, 유전자형의 분포가 상이할 수 있으므로, 유사한 유전자 빈도수에도 불구하고, 본 발명자들은 또한 유전자형 빈도수를 시험한다. 이는 흡연자 그룹 및 도박 그룹에서 11 유전자형의 유의한 증가를 나타내며 경계 유의(p=0.053)는 TS 프로밴드에서 증가한다. TS 프로밴드, 흡연자 그룹, 도박 그룹 및 전체에서 각각 0.024, 0.0002, 0.009 및 0.0001의 p 값을 갖는 4개의 그룹 모두에 대하여 대립형질에 대한 동종 접합이 유의하게 증가한다. 후자의 3개는 ＜0.5/4 또는 0.0125의 본페로니 보정된 α를 사용하는 경우 여전히 유의하다.
DRD2 유전자의 Taq A1 대립 형지레 대한 대립형질 및 유전자형 빈도수는 표 48B에 나타내었다. 이들 결과를 기준으로 하여, 본 연구에서, 본 발명자들은 A1/A2의 % 를 시험한다. TS 프로밴드, 흡연자 그룹, 도박 그룹 및 전체 피검자 그룹에서, 결과는 각각 35.3%, 42.8%, 45.7% 및 40.0%이다. TS, 흡연자 그룹 및 전체 대조 그룹에서, 결과는 각각 19.2%, 26.2% 및 22.4%이다. 모든 4개 그룹에서, A1/A2 이형 접합성의 우세는 p 값 0.0073, 0.017, ＜0.0001 및 0.0001인 대조 그룹보다 유의하게는 더 높다. 4개 그룹 중의 3개는 결과가 0.05/4 또는 0.0125 이상인 본페로니 보정된 α에서 여전히 유의하다.
상기 결과는 DRD1 대립형질에 대한 이형 접합성과의 유의한 네가티브 연관 및 DRD2 대립형질에 대한 이형 접합성과의 유의한 포지티브 연관을 나타낸다. DRD1 및 DRD2 유전자의 가능한 상호작용을 시험하기 위하여, 본 발명자들은 DRD1 대립형질에대한 이형 접합체가 없는 그룹(즉, 11 또는 22 동형 접합성) 및 DRD2 유전자에 대하여 이형 접합체가 있는 그룹으로 나누었다. 이들 유전자형은 양 유전자에 대하여 최적화되므로, 이들 그룹을 모두 함유하는 그룹으로 명한다. 제2 그룹, 즉 선택 그룹은 DRD1 11 또는 12 동형 접합체 또는 DRD2 이형 접합체를 갖는 그룹으로 이루어진다. 제3 그룹, 즉 부재 그룹은 DRD1 대립형질에서 이형 접합성이고 DRD2 대립형질에 대한 11 또는 22 동형 접합체이다. 이들 결과는 표 48-C에 나타내었다. 모두 함유하는 그룹에서 피검자의 %는 TS 대조 그룹(17.9)에 대한 TS 프로밴드(33.2)로 유의하게는 보다 높고(p=0.016), 흡연자 대조 그룹(24.1)에 대한 흡연자 그룹(45.5)로 유의하게는 보다 높고(p=0.0041), 전체 대조 그룹(20.8)에 대한 전체 피검자(34.3)로 유의하게는 보다 높다(p=0.0033). 모두 함유하는 그룹에서 피검자 %는 도박 그룹(23.3)에서는 유의하게 증가되지 않았다.
TS 그룹: 행동에서 DRD1 유전자의 가능한 역할의 초기 실험 연구가 TS 그룹에서 수행되고 하나 이상의 행동이 연구되었으므로, 이들 결과는 보다 상세하게 나타날 것이다. 본 발명자들은 우선 상이한 DRD1 유전자형에서 ANOVA 를 사용하여 23개의 상이한 행동 그룹의 평균을 비교하였다. p 값이 0.2 미만인 7개의 행동자 중에서는 5명은 중독 행동자이다-알콜 사용, 흡연, 강박 식이, 도박 및 쇼핑. 알콜 사용 변수는 가장 유의(p=0.0096)이며, 0.005 이상의 α에서는 유의하지 않다[방법 참조]. 모든 정량 특성은 표 49에 나타내었으며, 나머지 16 변수 중의 14는 11 동형 접합체에 대하여 가장 높은 평균을 갖는다. 22 동형 접합체에서 평균 스코어는 종종 12 이형 접합체에서보다 높으며, 11 대 22 이형 접합체에 대한 스코어의 상대 크기는 TS 그룹에서 11 대립형질에 대한 동형 접합성이 22 대립형질에 대한 동형 접합성 보다 상승된 스코어로 보다 크게 연관됨을 보여준다.
ANOVA 결과를 근거로 하여, 본 발명자들은 대조 부재 대 경우 부재 대 경우 존재 그룹에서 11 유전자형을 포함하는 피검자 %를 시험하였다(표 50). α＜0.005에서, 3개의 행동, 도박, 알콜 사용 및 쇼핑은 모두 유의하다. 도박에서, %는 4.5%에서 15.2%에 이어 35.2%(p=0.00095)로 증가한다. α＜0.05에서 유의한 특성의 모든 6개는 중독 행동자이다.
유사한 결과는 DRD1 DdeI 1 대립형질에 대하여 동형 접합성이 피검자는 2로, 12 또는 22 유전자형을 갖는 피검자는 1로 하여 일변 회귀 분석을 사용하여 수득한다. 도박 및 알콜 사용 변수는 α＜0.005에서 유의하다(표 51). A1/A2 이형 접합체를 2로하고, 동형 접합체를 1로 하는 DRD2 유전자에 대한 일변 회귀 분석에서, 7개의 상이한 특성은 α＜0.005에서 유의하다(표 51B). 이들은 3개의 중독 행동, 강박 식이, 도박 및 흡연이다.
다변 회귀 분석을 사용하여, DRD1 및 DRD2 유전가 모두가 유의한 결과를 제공하는 3개의 특성, 도박, 강박 식이 및 흡연(표 51C)이 있다. 동일한 결과는 모두 함유하는 그룹은 3으로 하고, 둘 중의 하나를 함유하는 그룹은 2로 하고 함유하지 않는 그룹은 1로 하는 다변 회귀 분석을 사용하여 수득된다(표 51D). 도박, 흡연 및 강박 식이에 대한 p 값은 ＜0.0001이다.
스코어의 크기를 평가하기 위하여, 본 발명자들은 ANOVA에 의해 함유하지 않거나, 이들 중의 하나를 함유하거나 모두 함유하는 그룹에서 이들의 평균을 시험한다. 강박 식이, 흡연 및 알콜 사용을 포함하는 8개의 특성이 α＜0.005에서 유의하다. 평균은 모두 함유하는 그룹에서 항상 가장 높다. 최종 시험은 대조 부재, 경우 부재 및 경우 존재 그룹에 따라, DRD1 11 동형 접합체 또는 DRD1 A1/A2 이형 접합체 또는 이들 둘다인 피검자 %를 시험한다(표 53). 알콜 사용 및 강박 식이는 8개의 식이 중에서 0.005 이상의 α에서 유의하다. 알콜 사용에서 %는 이들 3개 그룹을 따라 23.9%에서 46.9%에 이어 70.6%로 증가한다(p=0.00005).
이들 결과의 합은 다수의 중독 및 기타 행동에서 DRD1 유전자의 역할과 일치하고, DRD1 및 DRD2 유전자에서 유전 변이체의 중독 효과에 일치한다. DRD1 1 및 2 대립형질에 대한 동형 접합성은 TS 그룹에서 12 이형 접합성 보다 더 높은 스코어를 제공하고, 1 대립형질에 대한 동형 접합성은 다수의 특성과 가장 강하게 연관된다.
흡연 중지 그룹: 본 발명자들이 전체 상이한 피검자 그룹에서 이들 발견을 복제할 수 있는지를 측정하기 위하여, 본 발명자들은 흡연자에서 DRD2 유전자의 역할의 선행 연구로부터의 피검자를 이용한다[Comings et al., 1996a]. 이러한 그룹에서 모든 피검자는 1일 1개 이상이 시가렛 팩을 피우고, 흡연 중지에 성공하지 못했다. 상기 논의한 바와 같이, 그룹으로 선택된 경우, 흡연자는 DRD1 DdeI 11 유전자형 및 11 또는 22 유전자형의 우세의 유의한 증가를 보인다. DRD 1 유전자 및 흡연 사의의 관계를 보다 상세하기 조사하기 위하여, 본 발명자들은 1일당 피운 팩의 정량 특성을 시험한다(표 54 및 55). 3개의 그룹, 1일 0개의 팩을 피우는 피검자 및 1일 1-1 1/2개의 팩을 피우고 2-2 1/2 팩을 피부는 흡연자 그룹에 따라 DRD1 11 유전자형을 갖는 피검자 %에서 4.9에서 16.4에 이어 18.0%로 점진적이고 유의한 증가한다(p=0.023). TS 그룹과 대조적으로, 흡연자에서 11 또는 22 동형 접합체 그룹은 보다 유의한 결과를 제공한다. 따라서, 동형 접합성 피검자의 %는 1일당 0개의 팩인 대조 그룹에 대하여 39.3으로 증가하고, 1-1 1/2 팩/일을 사용하는 흡연자에서 61.8으로 증가하고 2-2 1/2팩/일을 사용하는 흡연자에서 68.0으로 증가한다(p=0.00033). DRD2 A1/A2 대립형질에 대한 이형 접합성 피검자%는 3개 그룹을 따라 26.2에서 34.5에 이어 46.3%로 증가한다(p=0.047). TS 그룹에서, DRD1 및 DRD2 유전자의 효과는 부가된다. 따라서, 모두 함유하는 그룹에서 피검자 %는 이들 세개 그룹을 따라 24.1에서 34.5에 이어 50.4로 증가한다(p=0.0001). 흡연자에서 DRD1 및 DRD2 유전자의 부가 효과를 추가로 시험하기 위하여, 본 발명자들은 다변 회귀 분석을 사용하여 변화하는 팩/일을 시험하였다. 둘 다 함유하는 유전자의 필적한 말한 효과가 있으며, 이들을 합하며 팩/일의 변수의 10.5%로 계산된다
도박자: 상기 논의한 바와 같이, 전체 대조 그룹과 비교하여 도박자에서 DRD1 11 동형 접합체 또는 11 또는 22 동형 접합체 피검자 %에서 유의한 증가가 있으며, DRD2 A1/A2 이형 접합체 피검자 %에서 유의한 증가가 있다. TS 및 흡연자 그룹과는 달리, 이들 효과는 모두 함유하는 그룹 피검자 %가 전체 대조 그룹에 비해 증가되지 않았으므로 도박자에서 부가되지 않는다.
이형 접합성: 다수의 상이한 피검자 그룹에서 행동 범위에 대한 평균 스코어의 본 발명자들의 관찰은 DRD1 및 DRD2 유전자에서 유전 변이체가 또한 잡종 강세를 나타낼 수 있음을 제시한다. 효과가 2개의 유전자에서 대립된 다는 것이 흥미롭다. 따라서, DRD2 유전자 TaqI A1/A2 이형 접합체는 가장 변화는 보다 비정상적인 스코어를 가지며, DRD1 유전자 이형 접합체는 보다 정상적인 스코어를 갖는다. 본 발명자들은 다형 둘다가 DRD1 및 DRD2 유전자의 기능에 영향을 주는 기타 돌연변이를 갖는 결합 불균형 상태이다고 가정하였다. 이러한 명백한 이형 접합성 이점/단점의 작용 메카니즘은 공지되어 있지 않다. 또한, 2개의 유전자에서 대립 효과가 이들이 사이클릭 AMP에 대한 대립 효과를 갖는다는 사실에 기인하거나, 결합 불균형에 의해 단순히 이들이 연관된 기타 돌연변이 유형에서 유발 변화에 기인하는지에 대해서도 공지되어 있지 않다. 본 결과는 중독 행동에서 DRD1 및 DRD2 유전자의 다원 유전성을 지시한다. 다원 유전성의 인테그날 부분이 유전자 배합의 임계 역할을 하며, 이러한 연구는 또한 대립형질 배합의 임계 효과를 설명한다.
피검자 조사 중요성: 3개의 독립적인 세트의 피검자에 따른 DRD1 유전자의 역할 및 2개의 독립적인 세트의 피검자에서 DRD1 및 DRD2 유전자의 부가 효과의 주요성을 확인한다. 조사된 본 발명자의 피검자의 예비 연구는 주요 진단이 알콜중독증 또는 약물 중독증이므로 DRD1 유전자의 역할을 지지하고, 몇몇 그러나 모든 유형의 물질 남용에서 DRD1 및 DRD2 유전자의 추가 효과를 지지한다. 이는 다원 유전성의 예기된 측면이다. DRD1 및 DRD2 유전자가 주어진 특성의 변수의 6% 미낭르로 개별적으로 계산되고, 특성의 변수의 11% 미만으로 배합 계산되므로, 이들 중간 효과는 피검자 조사에서의 차에 의해 용이하게 압도된다. 예를 들면, 다수의 수용자의 이상이 도파민, 세로토닌, 칸나비노이드, 산화질소, 니토틴 무스카린, GABA 등을 포함하는 다양한 형태의 물질 남용을 수반하는 것이 매우 유사하다. 튜렛 신트럼의 진단은 운동 틱의 존재에 따르고, 도파민은 근육 운동의 조절에서 주요한 역할을 한다. 따라서, TS에서 코모르비드 물질 남용 또는 기타 중독 행동이 임의 유형의 물질 남용을 기본으로 하여 조사된 피검자 그룹에서 보다 도파민 수용체의 유전 결합을 수반하는 것으로 예기된다.
진단 수준에서 보다 증상에서 시험하는 주용성: 이들 및 선행 연구[Comings and Comings, 1987b]은 연관 연구에서 파워의 유의한 손실을 초래하는 단일 이분 진단 카테고리가 광범위할 수 있다는 것을 제시한다. 예를 들면, TS 피검자는몇몇 온화한 틱를 갖고 기타 문제점이 없는 피검자 부터 틱, 말더듬, ADHD, 강박신경증, 콘덕트, 불안증, 기분, 물질 남용 및 학습 장애의 유린 배합을 갖는 피검자로 다양할 수 있다. 주어진 유전자가 TS로 구성되나 특히 말더듬과 연관되고, 말더듬이 경우의 20%로 존재하는 경우, 유전자의 역할은 모든 TS 프로밴드에 대하여 대조와 비교하여 벗어나지만 아마도 말더듬 TS 프로밴드에 대한 말더듬 부재의 대조 그룹과 비교하여 겸출될 수 있다. 이러한 컨셉은 본 연구에서 특히 중요하다. TS 그룹에서, DRD1 유전자와 유의하게 연관된 행동 변수는 중독 행동을 포함한다. 이는 동물 연구가 중독 특성에서 DRD1의 역할을 제시하고 또한 발견이 상이한 피검자 그룹에서 복제되므로 유연한 발견과는 다르다.
본 연구에 관한 몇몇 단서 조항이 있다. DRD1 DdeI 다형이 중성 염기 변화이므로, 본 발명자들은 도파민 D1 수용체 밀도에 영향을 주는 DRD1 로커스 영역 또는 그 근처에서 돌연변이된 결합 불균형 상태라고 가정한다. 연관 연구의 빈번한 관계는 결과가 유전자 자체 보다는 숨겨진 인종 또는 민족 층에 기인할 수 있다는 가능성이다. 본 발명자들은 피검자를 비-스페인계 백인종으로 한정하고, 3개의 독립적인 피검자 그룹에서 발견을 되풀이하여 이를 최소화하기 위해 시도하는 반면, 이는 여전히 가능한 설명을 남긴다. 특히 TS 그룹에서 가능한 제2 문제점은 23개의 상이한 정량 시험이다. 이는 0.005 이상의 매우 보수적인 α를 사용하여 보상된다. DRD1 및 DRD2 유전자의 배합 효과를 시험하는 경우, 대다수의 p 값은 0.05/23 또는 0.0022의 완전한 본페로니 보정 미만인 0.001 미만이다. 또한, 중독 행동(알콜 중독증, 강박 식이, 도박, 쇼핑 및 흡연)에 따른 유의한 결과의 클러스터링은 몇몇 내부 일관성을 제공한다. 최종 단서는 DRD1 11 대립형질에 대한 동형 접합성이 TS 그룹에 대한 표에 요약되어 있으며, 11 또는 22 동형 접합성이 흡연 그룹에 대한 표에 요약되어 있다. 그러나, 표 48에 나타낸 바와 같이, 11 또는 22 동형 접합성은 모든 3개 연구 그룹에 걸쳐 유의하다. 이들 3개 그룹 모두에서 특징은 DRD1 12 이형 접합체에 대한 평균 스코어의 감소 및 DRD2 A1/A2 이형 접합체에 대한 평균 스코어의 증가이다. 상기 노의한 바이어스 조사는 또한 하나의 피검자 그룹에서 1 대립형질에 대한 동형 접합성이 보다 중요하고 1 및 2 대립형질에 대한 동형 접합성이 또 다른 그룹에서 보다 뎌 중요할 수 있다는 것을 측정하는 역할을 할 수 있다.
부재 : DRD1 12 및 DRD2 11, 22
하나 : DRD1 12 및 DRD2 12, 또는 DRD1 11, 22 및 DRD2 11, 12
모두 : DRD1 11, 22 및 DRD2 12
실시예 8
엔게팔리나제 및 방출제로의 치료 효과
본 실시예에서, 루이스(폴리드럭 우선) 및 피셔(비-폴리드럭 우선) 랫트 모두의 도파민의 핵 악쿰벤스(Acb)으로의 방출에 대한 d-페닐알라닌(기타 엔케팔리나제 억제제), Tyr-D-Arg(엔케팔린 방출제) 및 날크렉손(마취 길항제)의 상호작용의 유용성을 시험한다. 루이스 및 피셔 랫트 모두는 2개의 그룹으로 나눈다: 급성 및 만성. 만성 그룹은 3개의 약물을 매일 500mg/kg d-페닐알라닌(DPA)- 1 내지 5mg/kg의 Tyr-D-Arg(TDA) 및 1 내지 2mg/kg의 날트렉손(NX)(DuPont, Wilmington, DE)으로 매일 아침 18일 동안 투여한다. 19일째날, 마이크로투석 샘플링을 만성 처리 또는 급성 그룹에 대하여 시작한다. 약물의 배합을 다양하게 한다; 3개 모두, 2개의 배합물, 각각의 약물 단독 투여. 3개의 약물의 급성 투여량은 다음과 같다: DPA=500mg/kg, i.p., TDA 5mg/kg, i.p., NX, i.p., 2mg/kg.
마이크로투석 방법: 모든 랫트를 시험 7일전에 외과적으로 나트륨 펜토바르비탈 마취제(50mg/kg)하에 브레그마에 대하여 정위식 배위의 좌 Acb에서 마이크로 투석 프로브로 주입한다: A + 2.0, L1.2 및 V-8.0(두개골로부터). 프로브를 동심으로 디자인되고 외부 직경이 0.5mm인 스테인레스 스틸 튜브로 작제된다[Small Parts Company, Roanoake, VA]. 각각의 프로브는 2mm의 노출된 투석막을 갖고 외경이 250㎛이고, Acb의 수직 크기를 사실상 커버한다[Spectra/POr, 중공 셀룰로즈 섬유, MWC05000, Spectrum Medical Industries, Los Angeles, CA].
투석 회수율: 시험관내 연구에서 측정한 바와 같이, 프로브에 대한 상태 회수율은 약 3.9% 도파민(DA), 4.1% 3,4-디하이드록시페닐아세트산(DOPAC) 및 3.2% 동형바닐산(HVA)이다. 주입후 즉시, 프로브 주입을 시작하고 연구 기간 동안 지속한다. 전기 화학적 측정은 모두 Ag/ACL 참조 전극에 대하여 +0.7V로 조정된 2개의 LC-4C 검출기(Bioanalytical Systems, Inc., West Lafayette, IN)에 커플링된 이중 유리 카본 워킹 전극으로 행한다. 하나의 전극을 DA 검출에 사용하고 또 다른 전극은 DOPAC 및 HVA 검출에 사용한다. 동물을 20 내지 24시간 동안 수술로부터 회수한 후 투석 샘플을 시작한다. 투석 샘플을 DA, DOPAC 및 HVA의 투석물 수준이 안정화될때 까지 수집한다. 3개의 20분 기본선 예비-주사 샘플을 수집한다. 만성 주사 전에, 예비-투석물을 기본량에 대하여 분석한다. 만성 주사는 이러한 기본선이 수득된 후 시작한다. 급성 랫트 그룹에서, 연구에 따라 변하는 고정된 예정 간격에서 수집전에 약물 배합이 일어난다. 총 6개의 20분 샘플을 2시간동안에 걸쳐 수집하여 약물 투여한다. 만성 및 급성 그룹 모두에서 랫트는 또한 연구의 처음부터 운동 및 상동성 행동에 대하여 관찰된다. 모든 수집 완결 후, 표준 조직학적 분석을 모든 랫트 뇌에서 수행하여 프로브 위치를 입증한다.
자가-선택: 루이스 대 피셔 랫트에서 자가-선택에 대한 약물 배합의 효과를 포함하는 기타 연구를 수행하여 알콜, 코카인, 당 용액, 마리화나 및 니코닌에 대한 갈망을 전신적으로 감소시키기 위해 DPA 단독 및 TDA 및 NX와의 배합 효과를 구체적으로 측정할 수 있다. GABA 전달의 활성을 억제하는 DPA 및 TDA의 배합물에 의한 중앙 테그멘탈 GABA 작용성 활성의 억제는 Acb로의 DA의 양을 유의하게 증가시키데 가장 강력해야 한다. NX의 사용은 알콜 유도된 쾌감을 예방하는 것으로 여겨진다.
실시예 9
DRD2 A1 대립형질 및 체지방%의 연관
방법
비만 피검자: 연구의 목적은 우세하지만 필수적으로는 병적으로 비만이된 피검자가 배제된 피검자 그룹을 수득하기 위한 것이다. 지방 함량이 34% 이상인 여성과 지방 함량이 28%인 남성이 병적 비만인 것으로 간주한다.
대조: 대조 그룹은 쌍둥이의 양친으로 이루어진다[Minnesota Twin Family study]. 이들은 간단하게는 11 또는 17년된 쌍둥이에 대한 전체적인 상태로부터 조사되므로, 이들은 칼리지 학생보다는 모든 사회경제적인 및 교육 그룹의 가장 랜덤한 세트를 나타낸다. 물질 남용 조사의 결과는 쌍둥이 대조에 대하여 입수할 수 없으므로, 본 발명자들은 "비조사된 대조"라 한다. 비만 샘플에서 피검자가 물질 남용에 대하여 조사되지 않으므로 이는 대조 그룹에 대하여 비만증의 존재를 비교하게 한다.
결과: 비만 그룹은 여성 76명 및 남성 15명의 총 91명의 피검자로 이루어진다. 여성 중에서, 60 또는 78.9%는 병적으로 비만이고, 나먼지 16 또는 21.1%는 과체중이나 지방%는 34% 미만이다. 남성 중에서, 12 또는 80%는 병적으로 비만이고, 나머지 3 또는 20%는 과체중이나 지방 %는 28% 미만이다. 병적 비만이 아닌 피검자의 집단이 독립된 통계 분석을 행하기에 너무 작으므로, 2개의 그룹을 분석에 합한다.
대조 그룹에 대한 비만 피검자에서 DRD2 D2A1의 우세는 표 56에 나타내었다. 비만 피검자의 전체 남성 및 여성에서, 67.0%는 비조사된 대조의 32.3%에 비교하여 D2A1 대립형질을 포함한다(χ2=32.95, p＜0.00001). 이러한 수치는 1990년의 문헌에 보고된 980 비조사 백인 대도에 대한 32.9%에 사실상 일치한다(표 57). 68.4%의 우세는 대조에서 보다 유의하게는 더 높다. DAT1 유전자에 대한 결과는 표 58에 나타내었다. DRD2 유전자와 비교하여, 대조와 비교하여 비만 피검자에서 10/10 유전자형의 우세에 대한 유의한 증가는 없다
실시예 10
RDS의 검출에 대한 기타 다유전성 대립형질의 분석
트립토판 2,3 디옥시게나제: 세로토닌 대사 결핍 및 혈중 세로토닌 및 트립토판 수준 모두에서 이상은 많은 정신병 질환에서 보고되었다. 트립토판 2,3-디옥시케나제(TDO2)는 N-포르밀 케뉴레닌으로의 트립토판의 분해에 대한 속도 한정 효소이다. 이러한 유전자의 작용성 변이체는 각종 질환에서 세로토닌 및 트립토판의 관찰된 동시 증가 또는 감소로 설명할 수 있다. 사람 TDO2 유전자의 상이한 4개의 다형이 확인되었다. 연관 연구는 하나 이상의 이들 다형 및 튜렛 증후군(TS), 주의 결핍 과민성 질환(ADHD) 및 약물 의존의 유의한 연관을 나타낸다. 인트론 σG→T 변이체는 혈소판 세로토닌 수준과 유의 하게 연관된다. TS와의 연관만이 본페로니 보정에서 유의하다(p=0.005).
대상: TS 프로밴드, TS 가족원, ADHD 프로밴드, 자폐증 프로밴드의 2/3 및 대부분의 대조는 TS 및 기타 클리닉(THE CITY OF HOPE NATIONAL MEDICAL CENTER: COH)에서 처리된 피검자 또는 상대 피검자가다. TS, 만성 운동 틱 질환 또는 만성 발음 틱 질환, ADHD 및 자폐증의 진단은 DSM-III-R(AMERICAN PSYCHIATRIC ASSOCIATION, 1987) 기준에 따른다. TS 프로밴드는 이러한 TSS-ADHD 클리닉에서 의학적 주의를 요하는 TS 피검자로 정의된다. 모든 프로밴드 및 다수의 상대는 개인적으로 인터뷰하고 D.E.C.에 의해 시험한다. 프로밴드 중에서, 82%는 TS를 갖고, 나머지 18%는 만성 운동 틱 질환 또는 만성 발음 틱 질환을 갖는다. TS 가족원은 TS 프로밴드의 양친이고, 이들은 TS이거나 아니다. 자폐증의 1/3은 기관(Sagamore Children's Hospital, Dix Hills, NY (J.S.)에서 데려온다. 각각의 프로밴드 및 이들의 상대는 이들의 4대 조부모의 인종 및 민족 배경에 대하여 질문하고, 4대 조부모 모두가 비-스페인계 백인종인 피검자만을 포함한다. 모든 피검자는 일치하고, 연구는 Institutional Review Board에 의해 승인된다. 흡연자(Comings et al., 1996a), 병리학적 도박자(Comings et al., 1996b), 및 알콜 의존자(Comings et al., 1994) 및 약물 의존(Comings et al., 1994)는 이들 질환에서 DRD2 유전자의 역할 연구로부터 유도된다. 이들 피검자의 선택 및 공급은 이들 각각의 처치에서 보다 상세하게 기술된다.
정신 질환 및 우울증이 있는 피검자에 대한 DNA 샘플을 국립 Neurological Research Bank(V.A. Wadsworth Hospital, CA)로부터 진단된 피검자의 뇌 샘플로부터 분리한다. 정신질환 피검자는 만성 정신질환이 있으며, 통상 장기간 정신 병원에 입원한 적이 있다. 우울증 피검자는 자살 행위를 했고, 만성 우울증을 갖는다. 정신질환 및 우울증의 진단을 정신과 의사에 의한 1회 이상의 검사와 동시에 DSM-III 또는 DSM-IIIR 기준에 근거한다. 동반된 알콜 중독증 또는 약물 남용 피검자는 배제된다.
대조: COH 대조는 다음 공급원으로부터 나온다: a) CEPH(Centre d'Etude du Polymorphisme Humain) 가족으로부터 비관련 조부모; b) TS 피검자의 양자, 양육 또는 복합 양친; c) 티로이드 암 또는 비-인슐린 의존 당뇨병을 갖는 내분비 클리닉으로부터의 피검자 및 d) 전문, 반-전문, 전문가 및 유지 워커를 포함하는 병원 관계자. 이러한 폭넓은 범위의 대조를 사용하여 모다 한정된 공급원이 사용되는 경우 발생할 수 있는 가능한 선택 문제점을 배제할 수 있다. 내분비 피검자는 모든 조건이 높은 치료율로 용이하게 처리할 수 있고 다양한 연령에서 존재하는 생물체의 1일 최소 파괴를 생성하고 피검자 염기가 TS 피검자의 것과 동일하므로 대조로서 선택된다. 모든 대조는 조사하여 알콜, 약물 및 타바코 남용은 배제시킨다.
인트론 6의 돌연변이체 영역의 PCRTM 증폭화: TDO2 타겟 서열을 증폭화기 위한 PCRTM 반응은 다음과 같다. 10mM 트리스 HCl, pH8.3, 50mM KCl, 1.5mM MgCl2, 0.05% 트윈 20, 0.05% NP-40, 100μM 각각 dATP, dCTP, dTTP, dGTP, 0.1μM 프라이머. 프라이머는 116번 GACACTTCTGGAATTAGTGGAGG(서열 5) 및 117번 GAAGTTAAATCCATGTGGCTC(서열 6)이다. 다음을 20㎕되게 가한다: 0.5U AmpliTaq(Perkin-Elmer, Foster City, CA), 1㎕(250ng) 게놈성 DNA. 반응을 PE-9600 열 순환기(Perkin Elmer) 또는 PTC-100 프로그램 열 조절기(MJ RAESEARCH, Inc., Watertown, MA)에서 다음의 프로토콜을 사용하여 수행한다: 94℃ 5분, 94℃ 30초, 60℃ 30초, 72℃ 1분, 72℃ 5분의 30 사이클. 증폭을 측정하기 위하여, 반응 혼합물 1㎕을 TBE 완충액 중의 1.5% 아가로스 겔 상에서 전기 영동한다.
클로닝 및 서열화: 프라이머 116(서열 5) 및 117(서열 6)의 PCRTM 생성물을 에탄올 침전시키고 TE 완충액(트리스 HCl 10mM, EDTA 1mM)에 현탁시킨다. 단편을 개질된 블루 스트립트 pBdt(Hoton and Graham, 1991)로 클로닝한다. 결찰 반응물 20㎕는 다음을 함유한다: 20㎕ 10 x 결찰 완충액(Boehringer Mannheim). 100ng의 각각 PCRTM 생성물, pBdT 및 1㎕의 T4 리가제. 이를 18시간 동안 11℃에서 항온처리한다. 단편의 서열을 말단 프라이머 T3, T7 및 내부 프라미어 129번 GCTGATTTTCAGACTGAGTGTG(서열 7) 및 130번 CTACAAACATATTTAAACATATGTT(서열 8)을 사용하여 Applied Biosystems, Inc.(Foster City, CA) 자동 서열화 기기 상에서 측정한다.
변성 구배 겔 전기 영동: 인트론 6 올리고머 116(서열 5) 및 117(서열 6) 사이의 DNA는 PCRTM에 의해 증폭되어 1359bp 단편을 제공한다. 단편을 RasI로 분해하여 816, 470 및 60bp 단편을 수득한다. 이들을 20 내지 80% 변성 6.5% 아크릴아미드 겔에서 60℃, 70V에서 16시간(Grey, 1992) 동안 전기 영동한다. PCRTM을 완충액, 10mM 트리스 HCl, 50mM KCl, 1.5mM MgCl2, 0.05% 트윈 20, 0.05% NP 40, pH 8.3에서 각각의 프라이머 0.2μM 및 각각의 데옥시NTP 0.2mM을 사용하여 수행한다. PCRTM 생성물 20㎕의 RasI 분해는 2.3㎕의 10X 반응 1 완충액(New England Biolabs, Beverly, MA) 5U 효소(1㎕ 중)를 사용하여 37℃에서 밤새 분해시키면서 수행하여 단편의 크기를 분별한다.
BslI 소화: 상기 PCRTM반응으로부터 10㎕ 분획물을 제한 효소 BslI 1.5U와 최종 1x완충액(공급원: New England BioLabs, Bevelry, MA)을 사용하여 소화시키고 55℃에서 밤새 항온처리한다. 소화된 생성물 10㎕ 분획물을 1xTBE(트리스-보레이트 100mM, EDTA 1mM) 중의 4% 메타포 아가로스(제조원: F.M.C., Rockland, ME)겔에서 1시간 동안 100V에서 전기영동시킨다. 겔을 에티디움 브로마이드로 염색시킨다. 3개의 상이한 크기의 단편이 예상된다. 다형성 부위가 G/G인 경우, 673bp 및 359bp 단편을 제공하는 DNA는 완전히 소화된다. 다형성 부위가 A/A인 경우, 1032bp 단편은 소화되지 않는다. G/A 이형접합체인 경우, 3개의 단편 1032bp, 673bp 및 359bp를 갖는다.
올리고뉴클레오타이드 결찰 검정(OLA): G→T 변이에 대한 OLA에 사용되는 올리고뉴클레오타이드는 다음과 같다: G 특이성 올리고머에 대하여 OLA-G CTATTCTTATCCCTCTTTTCTTAA-(HEO)1(서열 번호: 9). T 특이성 올리고머에 대하여 OLA-T ATATTCTTATCCCTCTTTTCTTAAT-(HEO)3(서열 번호: 10). 이들 2개의 올리고머의 분자량을 변화시키는 5' 말단에 첨가된 헥사에틸렌 옥사이드 포스파미드를 G 특이성 올리고머는 1을, T 특이성 올리고머는 3U를 갖는다(참조: Grossman et al., 1994). 통상의 올리고머는 FAM-TATATATTACGGGTTTATTACCGT-PO4(서열 번호: 11)이며, 여기서, FAM은 5'카복시플루오레스세인 포스포라미다이트(참조: Applied Biosystems, Foster City, CA)이다. G 특이성 올리고머와 통상의 올리고머를 리가제 반응에 의해 연결시키는 경우, 2개의 예상되는 중량은 50.5bp이다. T 특이성 올리고머와 통상의 올리고머를 리가제 반응에 의해 연결시키는 경우, 2개의 예상되는 중량은 56.5bp이다. OLA 반응을 위한 반응 혼합물은 다음과 같다: 20mM 트리스 HCl, pH 7.6, 100mM KCl, 10mM MgCl2, 10mM 디티오트레이톨, 1mM NAD, 0.1% 트리톤 X-100, 10nM 올리고머. 리가제(제조원: New England Biolabs) 10U와 PCRTM생성물 1㎕를 반응 혼합물 20㎕씩에 가한다. 다음 사이클 프로토콜을 사용하여 PE-9600 열 사이클기에서 반응을 수행한다: 94℃ 30초, 54℃ 2분 30초의 20회 사이클. 반응물 2㎕씩을 탈이온화 포름아미드 0.5㎕와 혼합하고 92℃에서 2분 동안 가열하여 변성시킨다. 모두 2.5㎕를 TBE 및 8M 요소 중의 8% 아크릴아미드에 로딩하고 3시간 동안 전기영동시킨다. 반응 생성물을 형광 염색된 프라이머를 사용하는 어플라이드 바이오시스템즈 DNA 서열기(Applied Biosystems DNA Sequencer)에서 전기영동시키거나 은 염색법에 의해 동정한다. 후자는 먼저 스테인즈-올(Stains-All)로, 이어서 은 염색으로의 이중 염색으로 이루어진다. 겔을 50% 포름아미드 중에서 제조된 스테인즈-올(제조원: Eastman Kodak, Rochester, NY)의 0.01% 용액(pH 7.5)에 20 내지 30분 동안 넣은 다음 2% 글리세롤 중에서 밤새 탈색시킨다. 이어서, 겔을 30분씩 10% 에탄올, 0.5% 아세트산으로 2회 세척한다. 이어서, 겔을 0.1% AgNO3용액 중에서 20 내지 30분 동안 항온처리하고 탈이온수로 2회 세척한 다음, 갓 제조된 1ℓ 증류수 중의 1.5% NaOH, 0.01% NaBH4, 37% 포름알데하이드 4ml의 용액에 넣는다. 밴드를 10 내지 20분 동안 전개시킨 다음, 반응을 0.75% Na2CO3를 사용하여 중단시키고 5% 아세트산으로 고정시킨다.
DpnII 소화에 의한 G→T 변이의 동정: G→T에 바로 인접한 3' 서열은 GATA이다. GATC는 DpnII 제한 엔도뉴클레아제에 대한 인식 부위이다. 3' 23bp 올리고머를 G→T 변이에 바로 인접한 3' ATC 서열에 적합시키기 위해 다음과 같이 설계한다(올리고머는 밑줄을 긋고, 변이에 대한 2개의 g 부위는 두줄을 긋는다): 5'-TCATTAATCCTCTGGGTATTGTAAATGTGGATTTAGGTTAATGTATTATATATAATGCCAAATAATGGCAGATAAGAATAGGGAGAAAAAGAATTA-3'(서열 번호: 12) 5'-ATTAATCCTCTGGGTATTGT-3'(서열 번호: 13) 5'-TAGTCTTATCCCTCTTTTTCTTA-3'(서열 번호: 14). 세번째 위치에서의 이러한 부적합은 이의 PCRTM프라이머로서의 효능을 거의 절충시키지 않는다. 5' 프라이머는 92bp의 생성물을 제공하도록 선택한다. G→T 변이가 A이 인겨우, 92bp 단편만이 존재한다.
PCRTM반응에 대한 조건은 다음과 같다: 각각의 프라이머에 대하여 0.1μM, 각각의 dNTP 0.2mM, 50mM KCl, 10mM 트리스 HCl, 1.5mM MgCl2, 0.01%(w/v) 젤라틴, 앰플리타크R(AmpliTaqR) DNA 폴리머라제(제조원: Perkin-Elmer, Foster City, CA) 100㎕당 2.5U, 게놈 DNA 80ng. PCRTM사이클은 94℃ 4분 동안; 94℃ 30초 동안, 52℃ 90초 동안, 72℃ 120초 동안의 30회 사이클이다. DpnII 소화에 대한 조건은 PCRTM생성물 10㎕, DpcII의 10U㎕-10.05㎕; 1M NaCl, 0.5M 비스 HCl, 0.1M MgCl2, 10mM 이티오트레이톨의 1.5㎕(pH 7.9); H2O 3.5㎕, 37℃에서 하룻밤이다. 생성물은 4% 메타포 아가로스에서 전기영동시킨다.
CCCCT 반복 증폭: 인트론 5 CCCCT를 검출하는데 사용되는 올리고머는 166번 5'-CTCTTACAATAGAAGAAACCATTT-3'(서열 번호: 15) 및 167번 5'-TCTCCTCTCTTTCCCTTCCC-3'(서열 번호: 16)의 역 보체이다. 증폭 조건은 95℃에서 5분에 이어서, 95℃ 1분 동안, 50℃ 1분 동안 및 72℃ 1분 동안에 이어 72℃에서 5분의 30회 사이클이다. 반응 혼합물에서 최종 농도는 50mM KCl, 1.5mM MgCl2, 10mM 트리스(pH 8.3), 프라이머 0.1μM, dATP, dCTP, dTTP 각각 200μM, dGTP 및 7-데아조-dGTP 각각 100μM 및 형판 0.5㎕이다.
엑손 7 A→C 돌연변이(Asn→His) 다형태의 동정: A→C 변이의 PCRTM증폭에 대한 프라이머는 5'-GCATGGCTGGAAGAACTCC-3'(서열 번호: 17) 5' 프라이머 및 5'-TCTTCCAGGCCTCTGGTCATAT-3'(서열 번호: 18) 3' 프라이머이다. 이는 C 변이 부위에서 NdeI에 의해 67 및 22bp 조각으로 소화된 89bp 생성물을 생성한다.
관련 연구: 사용된 시도는 동일 종족 그룹의 프로밴드 대 비관련 대조에서 각종 대립형질의 우세를 비교해야 한다. 표 59, 60 및 61에서 본페로니(Bonferroni) 보정값 α는 0.05/10 또는 0.005이다. 이러한 연구는 몇 년에 걸쳐 수행한다. 새로운 다형성이 동정될 때, 수백개 대상의 초기 연구가 변이가 행동 표현형과 유의성있게 관련되지 않음을 제시하는 경우, 추가로 대상을 조사하지 않는다. 그 결과, 연구되는 대상의 수는 상이한 변이에 대하여 다양하다.
OR = 확률비 GA, AA/GG
CI = OR의 신뢰 구간
경우에 따라, 피셔 정확 시험(Fisher's exact test)
OR = 확률비 GA, TT/GG
CI = OR의 신뢰 구간
*피셔 정확 시험
OR = 확률비 A 또는 T, A 및 T/GG GG
CI = OR의 신뢰 구간
*피셔 정확 시험
비랜덤 대립형질 연과: 군 연구는 수행되지 않기 때문에, 상 특이적 하플로형 빈도는 측정할 수 없으며, 따라서 고전적인 연결 불균형 분석법에 대하여 완화된다(참조: Lewontin and Kojima, 1960; Lewontin, 1964). 연구되는 4개의 상이한 다형성 중에서 비랜덤 대리형질 회합도는 대상들 중에서 교차-집계에 의해 평가하며, 단, 2개 이상의 시험을 동일한 대상에 수행한다. 모든 진단 범주내의 모든 대상은 이러한 분석법에 포함된다.
특이적 행동에 의한 분석: TS에서의 도파민 D2수용체 유전자 DRD2, DβH 및 DAT1 유전자의 역할 연구에 있어서(참조: Comings et al., 1996c), 본 발명자들은 상이한 집락의 행동 증상에 의한 분석이 매우 정보를 제공한다는 것을 발견하였다. 이는 문제성 대 TS 프로밴드에서의 행동이 없고 문제의 행동과 관련된 대조에서 특이적 대립형질의 우세를 조사한다.
세로토닌 및 트립토판 농도: 혈소판 세로토닌 농도, 세로토닌/혈소판 비율 및 혈장 트립토판 농도의 분석 기술은 다른 문헌(참조: Comings, 1990b)에 제공되어 있다.
결과
대조: 관련되지 않은 CEPH 조부모는 대조의 60%를 구성한다. 임의의 발명자들 자신의 대조 그룹이 상이한 결과를 제공하는 경우, 측정하기 위해서, 다형성의 빈도를 상이한 그룹과 교차하여 비교한다. 카이 제곱 분석에 의해 어떤 유의성있는 차이도 없다.
인트론 6 DGGE 다형성: 다형성은 폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 측정한다. 원래의 인트론 6 DGGE 다형성으로의 결과는 표 62에 나타내었다. 대립형질 2를 나타내는 보다 덜 빈번한 밴드는 91 대조 중의 12.1%에 존재한다. 이는 40 TS 피검자에서 27.5%, 26 병적 도박자에서 28.4%, 10 약물 탐닉자에서 50% 및 8 자살한 우울증 대상에서 37.5%로 유의성있게 증가한다. 그러나, 이러한 숫자는 작고 본 발명자들은 보다 다수의 대상에 대한 연구를 진행시키기 전에 관련된 변이를 확인하기를 원했다. 서열 연구로 떨어진 2개의 다형성, G→T 변이와 제2 G→A 변이 2개의 염기쌍을 확인하였다(참조: Comings et al., 1995). 본 발명자들은 먼저 이러한 변이를 개별적으로 조사하기 위해서 결찰 검정을 사용한 다음, 조절제 프라이머와 제한 엔도뉴클레아제를 사용하는 보다 간단한 공정을 진행시킨다(방법 참조).
OR = 확률비 12, 22/11
CI = OR의 신뢰 구간
*2개 테일링된 피셔 정확 시험
G→A 변이: 인트론 6 G→A 변이의 결과는 표 59에 나타내었다. 141개의 대조 중에서 3.5%만이 A 대립형질을 수반한다. 조사된 10개 그룹 중에서, 단지 α = 0.05에서 유의성있는 결과는 299 TS 대상에서 10.4%(확률비 3.15) 및 151 TS 제1도 관계자에서 10.6%로 A 대립형질의 증가를 나타낸다. 이들 중 어떠한 것도 0.05/10 또는 0.005의 본페로니 보정된 p값에서 유의성이 없다.
G→T 변이: G→T 변이의 결과는 표 60에 나타내었다. 197 대조 중에서, 15.7%는 T 대립형질을 수반한다. 이는 108 ADHD 피검자에서25/0%(p = 0.048), 73 약물 또는 폴리물질 의존성 피검자에서 28.7%(p = 0.016 증가하고, 65 알콜 의존성 피검자에서 6.1%(p = 0.049)로 감소한다. 이들 중 어떤 것도 α = 0.005에서 유의성이 없다.
G→A 또는 G→T 변이: 본 발명자들은 G→A 또는 G→T 다형성의 존재의 우세를 조사하였다(표 61). 2개의 시험을 수행한 135 대조 중에서 17%가 대립형질을 수반한다. 이는 96 ADHD 피검자에서 29.1%(p = 0.028), 70 약물 의존성 피검자에서 32.9%(p = 0.01) 및 271 TS 피검자에서 29.9%(p = 0.005)로 증가한다. 이는 64 알콜 의존성 피검자에 대하여 6.3%(p = 0.03)로 감소한다. TS로의 결과만이 α = 0.005에서 유의성이 있다.
엑손 7 A→C, 748 Asn→His 변이: 본 발명자들은 Asn→His 변이가 엑손 변이이고 헴 결합에 중요한 아미노산을 포함하기 때문에 매우 정보성이 있을 것으로 기대하였다. C 또는 His 대립형질은 6.3%의 48 대조에 존재하고, 이러한 숫자는 ADHD, 자폐증, 정신분열병 및 TS 피검자에 대하여 거의 변화되지 않으며, 어떠한 것도 유의성이 없다.
CCCCT 다형성: 시험된 모든 대상에 대한 인트론 5의 3' 말단에서 CCCCT 반복 영역의 대립형질의 염기쌍 길이 및 빈도는 다음과 같다:
대립형질 크기 빈도
210bp 0.018 240bp 0.838
215bp 0.053 245bp 0.018
220bp 0.023 260bp 0.005
230bp 0.045
240 대립형질 및 240/240 유전자형이 단연 가장 빈번하다. 분석하기 위해서, 240/비-240 및 비-240/비-240 유전자형의 빈도는 240/240 유전자형의 빈도에 필적한다. 125개의 대조에 있어서, 31.2%가 240/비-240 또는 비-240/비-240 유전자형을 수반한다. 다른 그룹에 대한 우세는 실질적으로 22.1 내지 30.5%의 범위로 동일하고, 어떠한 것도 대조와 유의성있게 상이하지 않다.
비랜덤 대립형질 회합: 표 63은 연구된 4개의 TDO2 변이들간의 비랜덤 대립형질 회합의 평가 결과를 나타낸다. 전체 1245 대상을 G→A 및 G→T 변이 둘다에 대하여 시험하고, 단지 10 대상만이 A 및 T 대립형질 둘다에 대하여 이형접합성이며, 2개의 변이가 동일한 염색체에 존재함을 지시하는, 하나는 TT 동형접합체 및 A 이형접합체이다. 각각의 변이 대립형질은 비교적 드물고, T 대립형질 18.0%이고 또는 24.1%이다. 이러한 결과는 이들 2개의 인접한 변이(2bp 떨어진)가 별개의 염색체에 존재하고 관찰된 분포가 독립적인 경우의 우연성 조합과 상이하지 않음을 나타낸다. G→T 및 A→C 변이 둘다에 대하여 시험된 312 대상 중에서(표 63-B), 어떠한 것도 둘다에 대하여 이형접합성이 아니다. 전체 집합에 있어서, 7.4%만이 동일한 염색체에 C 대립형질을 수반한다(AA 동형접합체에서 AC 이형접합체). G→A 및 CCCCT 다형성 둘다에 대하여 시험한 621 대상 중에서(표 63-D), 6개만이 A 및 비-240bp CCCCT 대립형질에 대하여 이형접합성이고, 하나의 비-240/비-240 동형접합체는 GT 이형접합체이다. 이러한 분포는 이들이 완전히 별개의 염색체에 존재함을 제시하는 우연성과 상이하지 않다.
최종적으로, G→T 및 CCCCT 다형성 둘다에 대하여 시험한 696 대상 중에서, (표 63-E), 169 240/비-240 이형접합체 중의 80(47.6%)는 GT 이형접합체이고, 비-240/비-240 동형접합체 중의 19(70.3%)는 GT 또는 TT이고, TT 동형접합체 중의 10(100%)은 비-240/비-240 동형접합체이다. 이러한 관계는 비-240 CCCCT 변이와 T 대립형질과의 높은 비랜덤 대립형질 회합도를 나타내는 매우 유의성이 있다(χ2= 421.07, p＜0.00001). 결과는 50% 이상의 비-240 대립형질이 T 대립형질 염색체 상에서 발생하고, 78% 이상의 T 대립형질이 비-240 대립형질 염색체 상에서 발생함을 제시한다.
4개의 상이한 TDO2 변이들간의 비랜덤 대립형질 회합의 평가(df = 4)
개개의 행동에 의한 비교: 상이한 행동 스코어의 평균을 A 또는 T에 대하여 비교하는 경우, 다발성 공포증의 존재에 대한 결과만이 2.89의 평균 스코어로(p = 0.043) 유의성있다. 공포증 대 TS 프로밴드가 없는 대조엣의 변이 및 공포증 대 TS 프로밴드가 없는 친척 및 공포증이 있는 친척의 우세를 비교하는 경우, 공포증에 대한 결과는 가장 높은 선형 χ2(3.45)를 가지나 유의성은 없다(p = 0.06). 여기서, 이들의 우세는 이들 3개의 그룹에서 18.8% 내지 24.15 내지 34.1%로 증가한다. 대상의 행동이 유의성있는 경우, 어떠한 것도 CCCCT 다형성의 비-240bp 대립형질과 회합되지 않는다.
TDO2 다형성 및 세로토닌 농도: 데이터는 선행 연구(참조: Comings, 1990b)로부터 혈소판 세로토닌 및 혈중 트립토판 농도를 이용한다. 몇몇 대상은 두 연구에 포함되기 때문에 상이한 TDO2 대립형질을 갖는 대상에서 혈소판 세로토닌 또는 혈중 트립토판 농도가 임의의 차이가 있는 경우 측정할 수 있다. 이러한 결과는 표 64에 나타내었다. G→A 변이에 있어서, ANOVA 분석법 또는 만-휘트니(Mann-Whitney) 비파라미터 시험에 따라 G/G 대상과 비교하여 G/A 및 A/A에서의 세로토닌/혈소판의 유의성있는 변화가 없다. 세로토닌/혈소판 비에 대한 값의 분포는 GG 또는 GT, TT 유전자형에서와 같다.
값의 범위가 유사한 반면, 분포는 표준 분포와 상이하다. G→T 다형성의 GG 유전자형을 수반하는 앞쪽의 것은 많은 값이 0.5 내지 1.25의 범위에 집락된다. 대조적으로, T 대립형질을 수반하는 것은 이 범위에 거의 없다. 또한 T 대립형질에 있어서 10.9의 아웃라인값이 있다. 이러한 아웃라인값을 제거하지 않는 경우, T 대립형질을 수반하는 것에 있어서 평균 세로토닌/혈소판 비가 상당히 높다(p = 0.003). 이 값이 배제되는 경우, p값은 0.081로 떨어진다. 그러나, T 대립형질 그룹은 보다 적절한 만-휘트니 비파라미터 시험을 사용하여 여전히 상당히 높은 평균을 갖는다. CCCCT 반복 다형성에 있어서, 예상되는 바와 같이, 비-240 대립형질을 수반하는 것은 보다 높은 세로토닌/혈소판 비를 갖는다. 그러나, 차는 유의성 있지 않다. 트립토판 농도는 특정 다형성에 있어서 유의성 있지 않다.
실시예 11
유전학적 회합의 첨가
PSA 유전자 다형성: 프레세닐린-1(presenilin-1; PS1) 다형성은 알쯔하이머병에서 나타나는 염색체 14에 위치한 이대립형질 마커이다. 담배 흡연자가 알쯔하이머병의 진행의 위험이 감소된다는 보고서를 고려하여, 본 발명자들은 알콜 및 담배 사용 패턴이 측정된 일련의 132명의 비스페인계 백인에서 PS-1 유전자를 조사하였다. 본 발명자들은 이 유전자(유전자형 1/1 및 2/2)에 대한 동형접합체가 담배 흡연자에게 상당히 보다 빈번하고(p ＜0.05), 미시간 알콜중독 선별 시험(Michugan Alcoholism Screening Test; MAST)에서 상당히 상승된 스코어(p ＜0.01)를 가짐을 밝혀냈다.
대상의 게놈 DNA를 표준 과정에 따라 전혈로부터 추출한다. PCRTM법(참조: Saiki et al., 1988)을 개개의 반응에서 각각의 프라이머 5' CACCCATTTACAAGTTTAGC 3'(서열 번호: 19) 및 5' CACTGATTACTAATTCAGGATC 3'(서열 번호: 20)을 사용하여 표적 DNA를 증폭시키는데 사용한다. 반응은 먼저 94℃에서 5분 동안 변성시킨 다음 94℃에서 30초 동안 두번째 단계에서 변성시키고 50℃에서 30초 동안 어닐링시키고 72℃에서 30초 동안 연장시킨다. 두번째 단계는 34사이클로 반복하고 마지막 연장 단계는 72℃에서 5분 동안이다. 증폭된 생성물 199bp를 제한 효소 BamHI 2.5U를 사용하여 37℃에서 밤새 소화시킨다.
소화된 생성물은 150V에서 2시간 동안 10% PAGE로 수행하고 에티디움 브로마이드로 염색시킨다. 유전자형은 2개의 단편 181bp 및 18bp를 생성하는 제한 절단 부위 A-C에 근거함에 주목한다(참조: Wragg et al., 1996).
ADRA2C 디뉴클레오타이드 반복 다형성: 염색체 4p에서의 ADRA2C 디뉴클레오타이드 반복 다형성은 염기쌍 179 내지 193에 걸쳐 있다. 이 다형성에 대한 사람 게놈 데이터베이스 접근 번호는 M94915이다. 본 발명자들은 일련의 53명의 비스페인계 백인 물질 남용자에서 이러한 유전학적 마커를 조사하고 저 염기쌍 대립형질(≤181bp)의 존재가 덜 심각한 알콜중독 사용이 아닌 보다 심각한 약물 사용 패턴(코카인, 암페타민 및 헤로인 사용)과 관련이 있음을 밝혀냈다. 본 발명자들은 다음 방법으로 디뉴클레오티드 반복 대립형질로부터 유전자형을 구축한다: 유전자형 1=≤181bp에 대한 동형접합체성; 유전자형 2=이형접합체성(대립형질 1≤181bp, 대립형질 2≥183bp) 및 유전자형 3=≥183bp에 대한 ≥동형접합체성에 대한 동형접합체성. 유전자형 1은 약물에 대한 증가된 돈 소비량(p ＜0.01), 암페타민 사용의 증가된 년수(p ＜0.05) 및 헤로인 사용의 증가된 년수(p ＜0.05)와 관련이 있다. 역으로, 높은 염기쌍 대립형질(유전자형 3)은 지난 30일에서의 보다 많은 알콜 사용(p ＜0.01), 알콜 사용의 증가된 년수(p ＜0.05) 및 치료를 구하는 주요 원인으로서의 알콜중독(약물보다)의 표시(p ＜0.05)와 관련이 있다.
이러한 다형성에 대한 사람 게놈 접근 번호는 GDB:196352이고 서열은 M94915이다. 대상의 게놈 DNA는 표준 과정에 의해 전혈로부터 추출한다. PCRTM법(참조: Saiki et al., 1988)을 개개의 반응에서 각각의 형광 표지된 프라이머 5' AGTGGGCAGGGCGGGGCAGGT 3'(서열 번호: 21) 및 5' CGCTGCCTCCCTTCCACCTGTTG 3'(서열 번호: 22)을 사용하여 표적 DNA를 증폭시키는데 사용한다. 반응은 먼저 94℃에서 5분 동안 변성시킨 다음 94℃에서 30초 동안 두번째 단계에서 변성시키고 57℃에서 30초 동안 어닐링시키고 72℃에서 30초 동안 연장시킨다. 두번째 단계는 1사이클을 29회 반복하고 프로그램 마직막은 72℃에서 5분 동안의 연장 단계이다. 겔 분석을 위하여, 각각의 반응물은 희석시킨(탈이온수 75㎕ 중의 15㎕) 증폭된 PCRTM생성물 0.5㎕, 탈이온화된 포름아미드 2.0㎕ + ROX 500 .25㎕ + 블루 독스트란 염색액 .25㎕를 함유하는 혼합물 2.5㎕로 제조되고, 92℃에서 2분 동안 변성시킨다. 변성된 샘플을 어플라이드 바이오시스템즈 373 DNA 서열기(GeneScanTM)의 6% PAGE에 로딩하고 겔을 일정한 30W에서 및 1500볼트에서 5시간 동안 진행시킨다. 겔을 예비처리하고 내부 표준(ROX 500)을 사용하여 분석한다. 2개의 피크를 단편의 색 및 크기를 근거로 하여 유전자형기(버젼 1.1)에 의해 인지한다. 지정된 값은 대립형질 크기의 정확성 결정을 나타내는 단편에 존재한다. 각각의 샘플에 대한 완전한 정보는 모든 겔 파일로부터 인쇄하고 수집된 데이터를 분석한다.
본 발명자들은 일련의 64명의 물질 남용자에서 PENK 유전자의 디뉴클레오타이드 반복 다형성, 3' 말단에서의 CA 반복을 조사하였다. 본 발명자들은 높은 염기쌍 대립형질(≥80 염기쌍)에 대해 동형접합성인 대상이 상당히 많이 심각한 알콜중독 및 약물 탐닉을 가짐을 밝혀냈다. 높은 염기쌍 대립형질은 음주 중독의 증가된 년수(p ＜0.05), 약물 해독 치료의 증가된 횟수(p ＜0.01), 헤로인 사용의 증가된 년수(p ＜0.05), 약물 치료의 보다 많은 횟수(p ＜0.05) 및 메타돈 유지 요법의 보다 빈번한 사용(p ＜0.05)과 관련이 있다.
실시예 12
펜칼TM요법에 감수성인 대립형질 다형성의 측정
RDS 유전자, 구체적으로 다형성이 특별한 RDS 유전자를 억제하는 약리학적 중재에 가장 감수성 있는 대상을 진단하는 것을 측정하기 위해서, 잠재적인 후보자를 특정 RDS 유전자 중의 다형성에 대해서 시험하고 RDS 행동을 확인하기 위해서 각종 정신측정학적 검정을 진행하고/하거나 본원에 기재된 조성물로 약물학적 치료를 한다. 특별한 RDS 유전자 또는 유전자의 다형성의 존재는 정신측정학적 검정에 의해 확인된 RDS 행동의 존재 및/또는 본원에 기재된 조성물을 사용하는 치료시의 RDS 행동의 변화에 대하여 통계적으로 평가할 수 있다. 신경영양소 조성물에 의해 억제되는 RDS 행동에 대하여 p ＜0.05와 같은 통계적으로 유의성있는 관계를 나타내는 RDS 유전자 다형성은 신경영양소 조성물을 사용하여 성공적으로 치료될 것으로 보다 여겨지는 개인의 진단으로서 확인된다. RDS 치료 조성물의 성분의 화학식은 표 4에 나타내었고, 이는 나열된 하나 이상의 성분이 본원에 기재ㅚㄴ 하나 이상의 RDS 행동을 증명하는 피검자를 치료함에 있어서 효과적일 것으로 절출된다. 추가로, 표 6 내지 16은 본원에 기재된 특정 RDS 행동의 치료에 바람직한 특정 ㅘㄱ식을 함유한다. 또한, 특정 원소가 자극제(코카인 등), 오피트 및 진정수면제에 의해 유발된 보상에 어떻게 영향을 미치는가에 대한 간략한 개략도는 표 17 내지 19를 참조하라. RDS 행동에 대한 유전학적 진단된 병용되는 치료방법의 특정예는 아래에 기술한다:
탄수화물 밤참 증후군 또는 항-비만증: 탄수화물 밤참 증후군 및 성공적인 치료에 대한 유전학적 관련의 측면에서, 본 발명자들은 현재 다수의 프로밴드를 유전자형으로 하고 대상에게 6 캡슐의 펜칼TM(PHENCALTM)을 제공하고 90일 동안에 파운드 감소, 탄수화물 밤참 증후군 스코어를 측정하고 다음 6 내지 8개월에 걸쳐 체중 재획득을 측정하고 있다. 연구하에 각종 유전자형에 가장 큰 개선이 발생하는 경우, 이를 측정하고자 한다. 비만증 연구에 있어서, 본 발명자들은 다음 유전자와 가능한 다른 유전자 및 펜칼TM로의 성공적인 치료에 대한, 이미 본원에 제공된 개개의 다형성을 측정하고자 한다: D1, D2, D4, DAR1, DβH, COMT, MAOA(x), TDO2, APO-D, 염색체-2- 마커, UCP-2, CNR1, GABAB3, HTR2A, HTR1A 및 nVOS1a(표 5 참조).
프로토콜의 상세: 펜칼TM및 유전자형 기능으로서 임상적 반응의 크롬 니코틴에이트 염을 함유하는 근접한 변이
연구 참여자: 이 연구에서 참여자는 병적으로 비만이고 이상 체중의 130 내지 180%로 무게가 나가거나, 여성에 있어서 34%의 체지방을 갖고 남성에 있어서 28%의 체지방을 갖는다. 피검자는 18 내지 65세이다. 고혈압, 당뇨병 또는 기타 쇠약 질환을 갖는 경우 배제된다.
연구 설계: 매칭 위약(제조원: Weider Nutrition Group, Salt Lake City, Utah)에 비교되는 펜칼TM(일반식에 대해서는 표 4를 참조하고 구체식은 표 7을 참조하라)을 1일 6캡슐 투여한 대상의 이중-맹목-위약-조절된 연구이다. 이는 14주 연구이다. 첫번째 2주는 스케일 중량 측정 뿐만 아니라 혈액 스크리닝 및 설하 면봉 DNA 수집을 포함하는 광범위한 워크-업을 포함한다. 일단 대상이 연구에 등록하고 기준 정보의 동의서에 서명을 하고. 잔류 폐 용적을 콜린스 헬륨 희석(Collins Helium Dilution) 폐 작용 장치(Warren E. Collins, Inc, Braintree, Mass)를 사용하여 독립적인 지방 폐 실험실에 의해 측정한다. 수질 시험(치환법)하에 유체정력학적 칭량과 매우 관계가 있고 0.96 내지 0.99(Ward et al., 1978)의 시험 재시험 신뢰도를 갖는 휘트모어 용적계(Whitmore Enterprises, San Texas)를 사용하여 수행한다. 1pound의 1/10로 검량된 디텍토 시판 플랫폼 스케일(Model 8850, Deteco Scale company, Web City, Missouri)을 스케일 중량을 수득하는데 사용한다. 추가로, 본 발명자들은 듀얼 에너지 X선 흡수계(DE＆A) 시험(Dual Energy X-Ray Absorptometry Test)를 이용하여 골밀도를 측정한다.
이러한 모든 시험이 완결되는 2주 기간 이내에, 대상에게 이들의 유전자형(연구가 분석될 준비가 될 때까지 맹목 상태를 유지한다) 및 펜칼TM또는 이의 매칭된 위약을 함유하는 미리 암호화한 병 중의 하나를 무작위로 선택하는 것을 제외하고는 이들 시험 결과를 제공한다. 대상에게 식사 1시간 전에 아침, 점심 및 저녁에 2회 1일당 6캡슐을 소비했는지를 질문한다. 제조업자는 수탁자로서 행동하고 분배전에 각각의 뱃치를 암호화한다. 관찰자, 생성물을 분배하는 연구 기술자 또는 대상 중 어느 누구도 어떤 암호가 펜칼TM또는 매칭된 위약에 상응하는가를 알지 못한다. d-펜플루로아민 또는 펜테라민 단독 또는 병용으로 특별히 수행된 일부 다른 연구와는 달리, 어떠한 식이 또는 운동 정보도 제공되지 않으며, 대상은 이들이 규정된 보충을 엄격하게 준수하는 한, 시험 기간 동안 이들이 원하는 어떤 프로그램인지를 알기 위해서 질문할 수 없다. [특정수의 대상에 있어서, 본 발명자들은 길버트 카아츠(Dr. Gilbert Kaats; San Antonio, Texas) 박사에 의해 개발된 "최적 건강 식이 계획"을 인용한다). 대상은 매주마다 또 다른 병 보충물 또는 위액을 가지고 스케일 중량을 얻기 위해서 센터를 방문한다. 시험 기간의 결론부에서(캡슐 섭취 출발로부터 추가의 12주), 결말 몸 조성 시험을 완결한다. 모든 데이터는 텍사스 건강과학센터-휴스턴-샌-안토니오(Texas) 대학에서 컴퓨팅 연구부에서 컴퓨터화하고 분석한다. 분석시 수탁자는 암호를 풀 것을 요구받는다. 소비된 펜칼TM과 위약의 실제량은 생성물 사용의 자기-보고서로부터 계산된 것이다.
이 연구에서 주요 결과 측정은 위약 또는 펜칼TM을 투여받은 대상간의 신체 조성 변수의 평균 변화의 비교이다. 크롬을 함유하지 않는 펜칼TM과 크롬 피콜리네이트, 크롬 니코틴에이트 또는 이 둘의 혼합물을 함유하는 펜칼TM을 평가한다. 평균 신체 조성 변화는 유전자형에 근거하여 아그룹으로 비교한다. 상기 기술된 바와 같이 시험된 모든 유전자를 교차하는 다수의 하플로형은 앞서 논의한 문헌(참조: Comings)에 의해 이용된 바와 같이 표준 다수 유전자 회귀 분석법을 사용하여 분석한다(유전자형에 관한 명세서에 대하여 OBKITTM을 참조하라).
흡연 방지: 니코레스트TM(NicorestTM)을 사용하여 다수의 심한 흡연자를 본 발명자들의 기본 계획에 따라 유전자형화시킨다. 90일 동안 1일 6캡슐(표 10 참조)의 니코레스트TM의 계획에 따라, 결과는: 쉽게 끊음; 금단 증상(우울증 포함); 재발의 용어로 측정한다. 이 데이터는 상기 유전자 모두에 대하여 평가한다. 문헌[Comings et al., (1996)]의 선행 작업에 따라 완전한 흡연 병력을 취한다(유전자형에 관한 명세서에 대하여 NICOKITTM을 참조하라).
상세 프로토콜: 유전자형 기능으로서 알코트롤TM(AlcotrolTM) 및 코코트롤TM(CocotrolTM)
연구는 항-알콜 및 항-코카인 처방을 제공받은 외래피검자를 포함하고, 결과는 프로그램으로 돌아가지 않거나 약물 선택으로 돌아가는 것으로 알려진 것에 의해 측정된 바와 같이 초기 해독 금단 증상 및 재발 속도의 용어로 측정한다(표 5 참조).
대상 참여: 이 연구에서 모든 피검자는 입회시 수행하는 미네소타 다수상 개인 목록작성(Minnesota Multiphasic Personality Inventory; MMPI) 및 혈액 분석(CBC/SMAC-24)를 사용하여 평가한다. 어떤 추가의 혈액 시험도 연구의 말기에 실행하지 않는다. 그룹은: 알콜-알코트롤TM; 알콜-위약; 자극성 남용자(코카인)-코코트롤TM; 자극성 남용자-위약이다.
연구 설계: 나이, 체중, 성별, 종족 및 참가 BAL은 의존성 측정에 대하여 가능한 공변수로서 시험한다. 입원피검자 치료 기관, 의사, 간호사 및 대상 또는 데이터 수집자 어느 누구도 대상이 알코트롤TM또는 코코트롤TM또는 매칭된 위약을 투여받고 있는지를 관한 정보를 제공받지 못한다. 투여량은 각가의 처방을 1일당 2캡슐, 식전 1시간 전에 분복투여한다.
시험 측정
피부 전도도 수치(SCL): 피부의 전기 특성은 동작 반응의 평가에 널리 이용되어 왔다. 이러한 기술은 피검자에서의 스트레스 수치의 측정값으로서 매우 신뢰성이 있는 것으로 증명되었다(예를 들면, 흥분 또는 화의 정도). 이와 같이, 이는 피검자에서 간접적으로 스트레스 수치를 측정하는 것이다. Scl, 갈바니 피부 저항(GSR)의 역은 마이크롬호스(Edelberg, 1972)에 의해 측정된 바와 같은 절대 피부 전도도 수치를 모니터링한다. 관계는 교감신경계 활성화에 의해 피부 전도도의 증가를 초래하는 순응 및 흥분 반응사이에 존재한다. 따라서, 전도도의 감소는 자율신경 각성의 감소와 관련이 있다(Luthe, 1969). 이를 측정하기 위해서, 오토젠(Autogen) 3000을 각 피검자의 우세한 손의 가운데 3개의 손가락에 부착하고, 판독한다. 측정은 계획되지 않은 시간에 연구를 위해 선택된 각각의 피검자에 대하여 수행하여 피검자가 언제 측정될 지를 알지 못하게 한다.
임상적 측정: 물리적(Clinical Institute Withdrawl Assesment for Alcohol[CIWA-A]와 일치(Shaw et al., 1981)) 및 BESS 스코어는 이러한 28일 입원피검자 치료 센터에 완전히 체류하는 동안 각각의 피검자에게 적용되는 주관적인 측정이다. 물리적 및 BESS 스코어 둘다 문헌에 기술되어 있다(참조: Blum et al., 1989). 치료 기간 동안 이러한 인자의 변화는 임상 감독자, 스탭 의사 및 임상 간호 감독자에 의해 매일 관찰되고, 이들의 관찰들은 일치에 도달하도록 논의하고 통합한다. 입회시 각각의 피검자는 5의 기준선 스코어값을 배정받는다. 매일 향상 또는 퇴보는 향상 6 내지 10의 범위 및 퇴보 0 내지 4의 범위로 주의하고 5는 입회 상태로부터 어떠한 변화도 없음을 나타낸다.
유전자형화: 클리닉에 입회시 각각의 피검자에게 이러한 용도의 SUDKITTM에 묘사된 바와 같이 DNA-설하 면봉 시험을 제공한다. 모든 유전자형을 의학 감독자를 포함하는 전체 스탭에게 맹목으로 유지한다. 디이터를 분석할 준비가 되면 통계 목적을 위해 유전자형을 텍사스-휴스턴/샌 안토니오 대학의 컴퓨팅 자원부에만 보낸다. 시험되는 유전자는 D1, D2, D4, DAT1(10/10, 9/9), TDO2, nNOS1a, CNR1, GABAB3, MAOA(X), COMT이다.
데이터의 통계학적 분석: 알코트롤TM및 코코트롤TM치료 효과는 위약과 병용된 알콜 및 자극제 남용자 그룹에 대하여 분석한다. 가장 중요하게는, 본 발명자들은 기능 유전자형으로서 물리적 및 Bess 스코어를 포함하는 스트레스 및 임상 측정에 대한 치료 반응을 평가한다.
상세한 프로토콜: 유전자형의 기능으로서의 ADHD 프로밴드에서의 HyperGenTM
연구 참여자: 본 발명자들은 ADHD 스케일, TOVA 시험 및 CCPT를 사용하는 외래피검자 클리닉에서 ADHD 어린이에게 HyperGenTM처방을 1일 6캡슐을 이중-맹목-위약 조절된 연구에서 투여하는 방법으로 수행한다. 이어서, 본 발명자들은 시험에 대한 예비- 및 후 시험 스코어를 비교하고, 결과를 문제의 각종 유전자와 관련시킨다. 이 연구는 두 지역(텍사스 및 테네시)에서 외래피검자 클리닉에서의 ADHD 대상을 참여시킨다. 대상은 TOVA, ADHD 스케일(Cull and Blum, 1997) 및 위스콘신 카드 분류 시험을 포함하는 여러 정신측정 시험에 의해 진단한다. 참여자는 Axis II 진단을 제외한 정신병 상태에 대한 병력이 음성이다. 시험시 모든 대상은 조제 약물을 복용하지 않고, 각각의 대상은 정보 동의서 및 프로토콜에 따라 캡슐을 복용하는 동의서에 서명할 것이 요구된다.
연구 설계: 대상은 시험-재시험 모델을 형성하는 전체 일련의 시험(TOVA, Cull/Blum ADHD 스케일 및 수행 작업(아래 참조)을 포함)을 2회 수행한다. 최초 시험을 0일째(예비 시험) 수행한 다음 90일 후에(후 시험) 다시 수행한다. 사이에 대상들에게 1일 6캡슐의 용량으로 HyperGenTM또는 매칭된 위약을 소비하는지를 질문한다(식사 약 1시간 전에 아침, 점심 및 저녁에 2번). HyperGenTM의 조성은 표 12에 나타내었다. 이는 이중-맹목-위약 조절된 연구이고 제조업자는 연구 말기에 통계자에게 제공되는 정보를 미리 암호화한 채로 유지한다. 어느 개인 또는 대상도 암호화된 병에 속하는 정보를 갖고 있지 않다.
수행 작업: 2개의 수행 패러다임이 전기물리적 반응을 밝히는데 사용된다:
공간 방향: 이는 프라이밍 신호가 가시 영역의 왼쪽 및 오른쪽에 존재하는 반응 시간 작업(SOT)(Posner et al., 1988)이다. 반응 시간은 프라이밍 신호가 있거나 유용하지 못한 경우를 비교한다. 반응 시간의 비교를 통해, 가시 영역들 사이에 주의를 매끄럽게 바꾸는 개인의 능력을 평가하는 것이다. 이러한 연구에서, 작업은 보다 숨기는 주의 동작에 대하여 보다 기본적인 주의 처리를 평가하게 하고, 보다 자율적인 주의 단계에 대하여 보다 심각하게 부하되는 경향이 있다(Defrance et al., 1993).
우발적인 연속 수행: 우발적인 연속 수행 작업(CCPT)는 선택적이고 지속되는 주의 둘다의 요소에 포함되는 고전적인 주제의 변수이다. 이러한 작업은 주의 처리의 보다 조절된 단계를 색인하는 수행의 질을 보장하기 위해 분석한다. 알파벳 문자를 스크린의 중앙에 있을 때 대상에게 준다. 기본적으로, 개인은 특정 문자 순서에 대한 왼쪽 마우스 단추를 누름으로써 그의 우세한 손을 사용하여 응답하도록 요청받는다: 예를 들면, 또 다른 "T"에 의해 바로 선행되는 경우, "T". 한 쌍의 "Ts" 중의 이니셜 "T"는 경고 신호로서 작용하고, 두번째 "t"는 표적이다. 모든 다른 문자는 대상에 의해 무시되어져야 하는 "혼란"으로 간주된다. 데이터의 기본적인 계산은 선행 기술(참조: Defrance et al., 1997)에 따른다. 전두엽 피질이 주의 및 노력을 지속하는데 가장 비중있게 관여하는 것으로 보이는 것은 주목할 만하고, 이는 이 작업의 전체적인 수행과 관련하여 중요한 인자이고, 자극제 약물에 매우 민감하다(Sostek et al., 1980).
기록 설계: 문헌(참조: Defrance et al., 1996)에 기술된 바와 같이 EEG를 연결된 귓불(A1-A2)에 참조된 28개의 활성 기록 부위로부터 기록한다. 각 자극 프레젠테이션의 온셋은 800msec를 추적한다. ERP를 구성하고, 각각의 시기에 포함되는 EEG의 샘플링은 기준선 보정에 사용되는 100msec 예비자극 샘플링이다.
데이터 분석: 기본적인 분석은 선행 작업(참조: Defiance et al., 1997)을 따르고, 일반적으로 3개의 파라미터의 평가를 포함하고, 이들 각각은 개개의 주목 처리의 효능에 따라 다양할 수 있다. 이러한 파라미터는 ERP 성분의 잠복, 진폭, 대칭(공간 분포)이다.
이 작업은 ADHD와 관련된 유전자 대립형질에 대한 HyperGenTM에 기인하는 주의 처리의 변화와 관련이 있다(앞서 논의되고 본 출원에서 기술된 HYPERKITTM에서 지시한 바와 같이). DRD2A1 대립형질, DβH B1 대립형질, DAT1의 VNTR 10/10 반복 및 TDO2, MAOA(X)의 다형성 및 HTR1A 유전자를 수반하는 대상이 가장 큰 반응을 보일 것으로 적어도 예상된다.
항-폭력 및 공격성: 정신분열병과 회피 행동과의 관련 뿐만 아니라 "병적 폭력" 및 도파민성 다형성(즉, DRD2 및 DAT1 대립형질)과 관련이 있는 것으로 밝혀졌기 때문에, 이는 표 14 및 15에 나타낸 바와 같은 이러한 행동에 공격성 처방의 사용을 평가하는 것이 논리적이다. 용량은 표준 위약에 대하여 1일 6캡슐이다. 결과 측정은 여러 프로밴드(즉, 청춘기 및 죄수)에서의 비동기성 폭발의 회수 감소 및 저하된 적의감을 갖는 일반적인 고요함이다. 결과 측정은 6개월 시간 프레임 내에서 상기 논의된 바와 같이 유전자형(참조: TEMPKIT)와 관련이 있다. 이 연구에서, 본 발명자들은 표 14 또는 15에 상응하는 처방을 사용한다. 이 연구는 청년 센터(Larned Kansas)에서 40명의 투옥된 청년에서 수행한다.
실시예 13
다원성 장애에서의 유전자 확인을 위한 다수 부가 회합 기술(MAA): 동시발병 장애에 대한 결과
ADHD는 대부분의 소아 심리학자 및 정신병 의사에 의해 치료되는 가장 통상적인 장애이고, 학령 어린이의 2 내지 8%로 존재하는 것으로 추정된다. ADHD는 유기성, 신경학적 및/또는 유전학적 장애인 것이 분명하게 입증되어 있다. 대조와 비교하여, ADHD 또는 과활성 어린이의 아버지는 ADHD, 알콜 중독 및 반사회적 인격 장애(ASPD)의 빈도가 보다 크고, 어머니는 ADHD, 알콜 중독 및 "히스테리" 또는 히스테리성 인격의 빈도가 보다 크다(참조: Morrison and Stewart, 1971; Cantwell, 1972). ADHD 어린이의 형제는 ADHD의 빈도가 보다 크고(참조: Augest and Stewart, 1972; Pauls, et al., 1983; Weiner et al., 1977), 특히 한쪽 부모가 ADHD를 가지고 있거나 어린이가 동일한 쌍둥이인 경우 그러하다(참조: Hechmann, 1994). 형제 대 1/2-형제에서의 이러한 행동의 비율은 ADHD의 유전학적 병인론과 일치하는 2.0 내지 5.2의 범위이다. ASP를 가지고 있는 부모의 어린이는 정상 어린이에 비하여 ADHD, 광포 및 울화의 빈도가 유의성있게 증가한다(참조: Cadoret et al., 1978).
ADHD 프로밴드의 친족은 대조의 친족의 8%에 비하여 보다 많이 ADHD를 갖는다. 또한, 주요 우울 장애, 압박 반항 장애(ODD), 행동 장애, 반사회적 인격 장애, 알콜 의존성, 약물 또는 알콜 의존성, 일반화된 불안 장애를 포함하는 불안 장애에 대한 위험이 상당히 증가한다(참조: Biederman et al., 1990). ADHD 및 기분 장애는 통상의 가족성 이손성(참조: Biederman's et al., 1993a)를 공유할 수 있고, 행동 장애가 있는 ADHD는 ADHD의 뚜렷한 아형일 수 있고(참조: Farone et al., 1993a), ADHD와 불안 장애(참조: Hodge et al., 1986) 및 ADHD와 학습 장애(LD)(참조: Farone et al., 1993b)는 가족에서 독립적으로 전달된다.
도파민 대사 결함은 오랫동안 ADHD의 병인론으로 여겨져왔다. 대뇌변연계(복부 피개 영역)의 도파민성 뉴론의 병변으로 인해 설치류에서 과활성, 과반응성, 스트레스에 대한 불량한 반응 및 다른 장애 스펙트럼이 초래된다(참조: Lemoal et al., 1976; Lemoal et al., 1991). 생성 후 단시간에 전엽 도파민성 뉴론의 화학적 파괴는 자극제에 반응하는 ADHD의 동물 모델을 생성한다(참조: Shaywitz et al., 1976; Shaywitz et al., 1991). HVA의 보다 낮은 농도가 투렛 장애(TD)가 있는 어린이에서 검출된다(참조: Cohen et al., 1979k; Butler et al., 1979k). 낮은 CSF HVA는 ADHD가 있는 어린이에서 보고되어 있으나(참조: Shaywitz et al., 1979k), CSF HVA 및 과활성 스코어 및 행동 장애, ADHD간의 포지티브 관계가 또한 보고되어 있다. 뇌 영상 연구에서 ADHD에서의 도파민 선조체에서 결핍(참조: Comings et al., 1991k; Noble et al., 1994k)을 보여주고, ADHD 및 TD에서 전엽의 저기능성을 보여준다(참조: Zametkin et al., 1990). 연구에서 도파민 수송자 또는 DRD3 유전자를 손실한 넉아웃 마우스에서 과활성을 보여준다. 도파민성 효능제는 ADHD의 치료에 성공적으로 사용되어 왔다.
본 발명자들에 의한 일반적인 가설은 ADHD가 도파민, 노르에피네프린, 세로토닌, GABA 및 기타 신경전달자에 영향을 미치는 유전자의 부가 효과로 인한 다원성 장애이다. 관련된 특정 유전자 중 일부는 도파민 유전자(DRD1, DRD2, DRD3 및 DRD4 수용체 유전자, 도파민 베타하이드록실라제 및 도파민 수송자); 노르에피네프린(NE) 및 에피네프린(EPI) 유전자(ADRA2A 및 ADRA2C 수용체, PNMT, 노르에피네프린 수송자, MAOA, COMT); 세로토닌 유전자(TDO2, 세로토닌 수송자, 세로토닌 수용체 유전자); GABA 유전자(GABA 수용체 유전자 GABRB3 및 기타) 및 기타 아직 확인되지 않은 유전자이다.
본 발명자들은 ADHD 및 기타 동시발생 장애에 대한 3개의 도파민성 유전자, DRD2, DBH 및 DAT(참조: Comings et al., 1997b), 3개의 아드레날린성 유전자, DBH, ADR2C 및 ADR2C(참조: Comings et al., 1998a) 및 안드로젠 수용체 유전자, AR. + DRD2 및 세로토닌 수송자 유전자, HTT(참조:Comings et al., 1998b)의 부가 영향을 조사하였다. 이러한 연구는 2개의 원칙을 증명한다: 첫째, 이들 유전자 중의 0, 1, 2, 또는 3에서 변이의 존재를 나타내는 그룹으로 대상을 나누는 경우, 임의의 단일 유전자에 대한 회합보다 유의성있는 QTV 크기가 점진적으로 증가된다. 둘째, 이들 연구는, 이러한 기술이 QTV 스코어를 증가시킴으로써 표현형에서 역할을 하는 유전자 뿐만 아니라, 이들이 QTV 스코어를 감소시키기 때문에 표현형에서 적거나 무시할 수 있는 역할을 하는 유전자를 확인하는데 사용할 수 있음을 나타낸다.
본 발명자들은 이러한 원칙을 ADHD에서 전체 29개의 상이한 유전자의 부가 역할을 조사하기 위해서 확장하였다. 본 발명자들은 이를 다수 부가 회합(Multiple Additive Associations; MAA)이라고 명명한다. 본 발명자들은 MAA 기술에 관한 몇몇 가설을 조사하였다. 상이한 QTV는 스코어의 범위 및 크기가 넓게 변할 수 있기 때문에, 상이한 QTV와 교차하여 다수 유전자의 크기 영향을 비교하기 위해서, 본 발명자들은 회귀 관계식(r)의 면에서 결과를 분석하고 플롯팅하고, 변수의 %를 r2로서 설명한다. 다음은 이러한 연구에 인용된 몇몇 가설 및 시도이다.
ADHD 및 다른 행동을 연구하기 위한 MAA 기술은 대부분의 정신병 장애가 도파민, 세로토닌, 노르에피네프린, GABA, NMDA 및 기타 신경전달자에 영향을 미치는 유전자의 여러 변이 대립형질을 양쪽 부모로부터 물려받은 결과라는 가설을 근거로 한다(참조: Blum et al., 1990; Comings, 1996a; Comings 1998a). 본 발명자들이 이 보고서에서 조사하기 위해 선택하는 후보자 유전자는 이러한 가설에 근거한다. 신경전달자와 관련되지 않은 유전자는 이들이 행동 표현형에 역할을 함을 나타내는 선행 연구에 근거하여 선정한다. 선택을 위해 첨가된 기준은 후보자 유전자와 관련된 유용한 다형성이 유용해야 한다는 것이다.
둘째, 한쌍의 연구는 ADHD 및 행동 장애를 포함하는 대부분의 다원성 장애가 유전병의 50 내지 90%임을 나타낸다(참조: Sherman et al., 1997; Slutske et al., 1997). 각각의 유전자는 분산값의 1 내지 2%만 설명되기 때문에, 간단한 산수는 20 내지 40 이상의 유전자가 참여해야 함을 나타낸다. 수는 제공된 대상보다 작아야 한다. 셋째, 순환성 이유를 피하기 위해서, 각각의 유전자에 대한 유전자형의 스코어링이 본 발명자들 또는 기타에 의해 연구된 대상의 옥립적인 그룹에서 유효성을 가짐을 나타내는 것이 중요하다. 본 발명자들이 조사한 유전자는 표 65에 나열하였다. '입증된' 컬럼은 사용된 스코어링이 대상의 독립적인 그룹에서 입증되었음을 나타낸다. 넷째, 각각의 유전자는 0, 1 또는 2의 값으로 스코어링한다. 예를 들면, 이대립형질 다형성이 관여하고 독립적인 연구가 1 대립형질에 대하여 우세성을 나타낸다면, 스코어링은 11 또는 12 = 2 및 22 = 0이다. 독립적인 연구가 유전자형들이 함께 우세한 것을 나타낸다면, 스코어링은 11 = 2, 12 = 1 및 22 = 0이다. 유사한 3개의 스코어 기술이 반복 다형성에 대해 사용된다. 이는 각 유전자의 부가 영향의 시험을 촉진하고 각각의 유전자가 0 내지 2의 유사한 크기로 스코어링되도록 한다. 다섯째, 다원성 장애는 통상적이기 때문에, 여러 유전자가 관여한다는 사실은 관여된 유전학적 변이가 그 자체적으로 매우 통상적이어야 함을 나타낸다. 이 때문에, 본 발명자들은 1 또는 2로서 스코어링된 대상의 %를 최대화하기 위해서 다형성 및 유전자형 그룹핑을 사용하고자 한다. 이러한 결과는 칼럼 1,2% 아래에 표 65에 나타내었다. 대부분의 경우에 1+2의 %의 합은 25% 이상이고, 종종 50% 이상임을 유의해야 한다.
X = X-연관된
* homo 154 = ＜154bp에 대해 동형접합성이고3154bp에 대해 동형접합성; hetero = 이형접합성
** homo 183 = ＜183bp에 대해 동형접합성이고3183bp에 대해 동형접합성; hetero = 이형접합성
*** 2 = 남성3320bp, 여성3320. 0 = 기타
# 2 = a-c/a-c 또는 d-g/d-g 동형접합성, 0 = 이형접합성
### 2 = 남성의 경우216 반복, 여성의 경우216/216 반복, 0 = 기타
MR = 모노뉴클레오타이드 반복
DN 디뉴클레오타이드 반복
SS 짧은 서열 반복
RFLP = 단일 염기쌍 다형성(제한 단편 길이 다형성)
unp = 독립 피검자 그룹에서 하나 이상의 다른 표현형에 대한 이들 유전자 및 다형성의 효과에 대해 본 발명가들의 실험으로부터 공개되지 않은 관찰사항
GDB = 게놈 데이타 베이스
6번째, 다인자성 질환과 연관된 유전 변이가 통상적인 경우, 이들은 단일 유전자 질환을 야기시키는 변이와는 근본적으로 상이해야 하는데, 즉 이들이 유전자 발현에 주요한 변화를 야기시킬 경우 이들이 단일 유전자 질환을 유발시킬 수 있기 때문에 이들은 단지 유전자 발현에 적당한 변화를 야기시켜야 한다(문헌 참조; Comings, 1998b). 이러한 관찰사항을 근거로 하여, 본 발명가들은 Z-DNA의 길이를 다양하게 형성시킴으로써 통상의 디뉴클레오타이드 반복 다형성 자체가 디인자성 유전에 주요한 역할을 한다고 시사하였다(문헌 참조; Comings, 1998b). 이러한 반복은 풍부하고, 대립형질은 흔하며, 형성된 Z-DNA은 유전자 발현에 적당한 영향을 미친다. 여러 표현형 효과는 작용면에서 관련된 여러 다른 유전자에 변이 효과를 함께 부가함으로써 생길 수 있다. 본 연구에서 이는 이용가능할 경우, 발명가가 짧은 직렬식 반복 다형성을 사용하는데 특히 관심을 가지며, 단일 염기쌍 다형성이 유전자와 관련된 하나 이상의 짧은 직렬식 반복 대립형질과 결합 불균형 상태에 있음을 의미한다. 후자의 사실로 인해, 발명가들은 단일 뉴클레오타이드 다형성이 엑손 또는 프로모터와 관련성이 없다하더라도, MAA 기법에 대한 유용한 정보를 제공해줄 수 있는 것으로 간주한다. 7번째, 주어진 신경전달자 또는 작용 그룹에 영향을 미치는 2개 이상의 유전자의 부가적인 효과를 실험하기 위해, 다인자성(PG)이라고 불리우는 모의 변수를, 각각의 개별 유전자에 대한 스코어의 단순 합계에 기초하여 정한다. 주어진 작용 그룹 내의 다양한 유전자 조합이 분산도(%)에 미치는 효과를 실험함으로써 정량 스코어에 대해 부가 효과를 갖는 유전자를 확인할 수 있다. 그후, 이러한 유전자 세트를 사용하여 상이한 작용 그룹 전반에 대한 유전자의 부가 효과를 실험하는 트랜스 다인자성 스코어(TPG)를 형성한다. PG 또는 TPG 스코어가 높을수록 통과하는 표현형-관련 유전자 변이의 수가 커진다.
8번째, 선행 연구(문헌 참조; Comings et al., 1996b; Comings et al., 1998a; Comings et al., 1998b)에서와 같이, 선형 회귀 분석을 사용하여 부가적인 유전자 스코어를 실험한다. 이로서 r2또는 실험 유전자가 특성에 기여한 분산도를 계산할 수 있으며, 여기서 F는 효과의 크기를 나타내고, p는 효과의 유의도를 나타낸다. 유전자가 특성 변화에 대해 단지 약 1%로 고려된다는 사실은 효과가 거의 중요치 않는다는 것을 의미하지는 않는다. 수많은 인자에 따라, 이는 표현형 효과의 예측가능성의 10%(r)까지 제공할 수 있다(문헌 참조; Rosenthal and Rubin, 1982; Ozer, 1985). 9번째, 다양한 행동 스코어의 크기는 매우 상이하기 때문에, 행동 스코어 보다는 누적 r2값을 사용하여 상이한 표현형에 대한 29가지 유전자의 효과를 정확하게 비교한다.
10번째, 본 발명가들은 DSM-IV(Diagnostic and Stastical Manual of the American Psychiatric Assn. IV, 1994) 기준에 근거하여 주의력 결핍 기능항진증(ADHD) 스코어를 주로 실험하였다. 본 발명가들은 2가지로 양분된 진단을 강조하기 보다는 각 대상에 있어서의 ADHD 스코어의 평균을 상이한 표현형 그룹과 비교함으로써 전 범위의 스코어를 사용하는 방법을 사용하였다. 11번째, 회귀 분석을 사용하는 2가지 가능한 방법이 있다; 일변수 및 다변수. 일변수 분석의 경우, 각 유전자에 대한 스코어를 더하여 단일 스코어 및 다음 이들 스코어와 측정된 QTV 간의 상관성을 끌어낸다. 이는 0, 1, 2, 3 스코어링 방법을 확대한 것이다. 이러한 방법의 장점은 하나 이상의 유전자가 QTV에 대해 부가 효과를 가지는 경우에만 r값이 증가된다는 점이다. 감쇄 효과를 갖는 유전자를 부가할 경우, r값은 감소한다. 이는 최종 r 및 r2값의 측정치를 그대로 유지한다. 그러나, 모든 유전자 스코어를 일변수로 합하기 때문에, 유전자의 수를 더하더라도 자유도는 항상 1이다. 이는 p값에 대해서는 비-보수적이다.
두번째 방법으로서, 각각의 유전자 스코어를 다변수 회귀 방정식에서 평가하여 QTV와 관련시킨다. 각각의 유전자를 부가함에 따라 자유도가 증가하기 때문에, 이는 p값을 그대로 유지한다. 그러나, 부가 및 감쇄 유전자가 r에 기여하기 때문에, 이러한 방법은 r 및 r2값에 대해서는 비-보수적이어서, 이들 값은 유전자가 이의 효과에 대해 부가적인지 감쇄적인지에 따라 증가한다.
본 발명가들은 2가지 이유에서 일변수 방법을 선택하였다. 첫째로, r 및 p값은 QTV에 기여하지 않는 유전자를 부가할 경우에는 감소하기 때문에 보다 보수적이다. 두번째, 유전자는 실험 유전자의 수와는 관계없이 단일 자유도에 의해 표현되기 때문에, 전력을 손실하지 않으면서 수백가지 유전자의 효과를 동시에 실험할 수 있다.
12번째, ADHD와 동시에 발병하는 질환의 대부분은 대개 유전자를 공유한다는 가설을 실험하기 위해, 본 발명가들은 또한 동일한 29개 유전자 세트가 저항 장애(ODD, oppositional defiant disorder), 행동 장애(CD, conduct disorder), 틱, 학습 장애(LD, learning disorders) 및 그외의 QTV에 대한 정량 스코어에 미치는 부가 효과를 실험하였다. 본 발명가들은 또한 14세 이상의 피검자를 대상으로 알콜 오용/의존, 약물 오용/의존 및 흡연에 대한 QTV를 실험하였다. 13번째, 이러한 동시발병된 질환을 실험함으로써 본 발명가들은 또한 동시발병된 상이한 질환이 유전자를 공유할 뿐만 아니라 특정 표현형에 대해 유일한 몇가지 유전자 및 유전자 조합을 이용한다는 가설을 실험하였다(문헌 참조; Comings et al., 1996b; Comings, 1996a). 14번째, 각각의 유전자 및 주어진 표현형 간의 상관성에 대한 유의도 p가 0.5 미만인 경우 유전자가 부가 효과를 가지는지의 유무에 대한 관련성이 있는가를 조사하기 위해, 발명가들은 이들이 표현형 스코어에 부가 효과 또는 감쇄 효과를 가지는지에 관한 145개 유전자-표현형 관련성의 r2및 p값 간의 상관성을 실험하였다. 최종적으로, 모든 참가자를 사용하여 초기 통과한 후, 유전자가 부가 효과를 가지는 것으로 확인되었으며, 각각의 부가 유전자를 새로운 TPG 스코어에 누진합계하여 문제시되는 QTV과 관련시켰다. 이는 문제시되는 QTV로 인해 기인되는 바와 같이 확인된 유전자만을 사용하여 수득될 수 있는 총 r2의 추정치를 제공한다.
부가 스코어의 장점
부가 스코어를 사용하여 다인자성 유전의 가장 탁월한 양태를 이끌어낸다 - 상이한 유전자의 부가 효과, 상이한 유전자의 감쇄 효과, 잡종 강세 및 울체의 역할 및 다수의 다른 유전자들이 유전자가 존재할 수 있는 주어진 개인 또는 이의 그룹에 동일한 표현형을 야기시킬 수 있다는 사실. 가장 중요하게는, 이러한 방법은 상이한 개인에서의 상이한 유전자 세트의 존재를 보상할 수 있다. 따라서, 하나의 관련 연구가 여러번 후속 연구들에 의해 일부 반복되게 된다. 이는 유전자가 단지 적은 분산도에 기인하며, 유전제 세트 중의 어느 하나는 한 그룹의 피검자에서만 연관되고 다른 유전자 세트는 또다른 피검자 그룹과연관된다는 사실때문이다. 동일하게 유효한 결론이란, 하나 또는 다른 결과가 잘못되었다는 것을 의미하기 보다는, 상이한 유전자 세트가 개인의 상이한 그룹에서 동일한 표현형을 만들 수 있다는 것이다. 부가 스코어가 관련된 전체 유전자 세트의 효과를 측정하기 때문에, MAA 기법은 상이한 피검자 그룹 전반에 걸쳐 훨씬 더 재연적일 수 있다. 특정한 예를 들어 보면, DRD2(TaqI A1 대립형질)(문헌 참조; Coming et al., 1996b; Blum et al., 1998), DRD4(48 bp 7반복)(문헌 참조; Lahost et al., 1995), DBH(TaqI B1 대립형질)(문헌 참조; Coming et al., 1996b) 및 DAT1(10반복 대립형질)(문헌 참조; Coming et al., 1996b, Cook et al., 1995, Gill et al., 1997, Waldmaqn et al., 1996) 유전자의 변종이 모두 ADHD의 병인에 포함되기 때문에, 이들 각각은 몇몇 피검자 그룹에서 유의적인 효과를 가질 수 있다. 그러나, 생리학적 효과가 각 유전자에 대해 유사한 경우(도파민 대사 상의 변화), 4가지 모두에 대한 부가 스코어는 대조 그룹과 비교하여 모든 ADHD 피검자 그룹에서 균일하면서도 유의적으로 보다 높은 것으로 판명되며, 이러한 사실은 이것이 ADHD에서 병인학적으로 중요한 단일 유전자라기 보다는 도파민 대사에서의 전반적인 유전자 결함임을 나타낸다. 동일한 이론적 근거가 상이한 신경전달자 그룹 전반에 걸쳐 부가 유전자에 대해서도 수립되어 있다. 부가 스코어의 최종 강도는 상이한 유전자 조합을 사용함으로써 유익한 최대의 세트를 주어진 표현형과 동일하도록 최적화시킬 수 잇다는 것이다. 유전자 각각의 미세한 효과와는 달리, 이러한 최적화된 세트는 매우 예시적이고 진단적인 유용성을 제공할 수 있다.
가설
제1 가설은 다인자성 질환은 다중 유전자의 부가 효과를 포함하기 때문에 MAA 기법이 한번에 한개씩 유전자를 실험하기 보다는 관련 유전자의 동정에 있어서 훨씬 더 많은 전력을 제공한며, 부가 효과를 가지는 이러한 유전자를 봉입함으로써 r2및 p값이 최대로 된다는 것이다. 이를 시험하기 위해, 본 발명가들은 투렛 증후군을 앓고 있는 274명 및 ADHD의 중증도에 따라 등급을 분류한 대조 그룹 62명으로 구성된 336명의 백인을 대상으로 29개 우전자의 효과를 실험하였다. 제2 가설에서, 2가지 독립 샘플을 실험할 경우, 본 발명가들은 상이한 샘플은 상이한 유전자 세트를 이용하기 때문에, 한가지 샘플에서 부가적인 유전자는 전부는 아니지만 대부분에서 재-시험 샘플에 부가적이고, 한가지 샘플에서 감쇄적인 유전자는 전부는 아니지만 대부분에서 재-시험 샘플에 감쇄적이며, 두가지 샘플 모두에 대해 다중 유전자의 부가 효과는 모든 단일 유전자의 효과보다 유의적으로 크다고 가정하였다. 본 발명가들은 또한 r2의 변화가 N보다 더 클 것으로 예측하였다. 이를 시험하기 위해, 336명의 피검자들을 무작위로 2가지 독립적인 그룹으로 분류하여 TS 168명 및 대조 그룹 168명으로 하고 각 그룹에서의 남성 및 여성의 수도 동일하게 하였다. ADHD 스코어에 대한 PG 및 TPG 스코어 간의 상관성을 각 그룹별로 실험하였다. 제3 가설에서, 상이한 표현형을 실험할 경우, 본 발명가들은 동시발병된 질환은 몇가지 ADHD 유전자를 공유하며, 몇몇 유전자 및 유전자 조합이 동시발병된 질환에 대해 특이적이라고 가정하였다. 이를 시험하기 위해, 본 발명가들은 상이한 QTV-저항 장애, 행동 장애, 틱, 학습 장애 및 기타 장애-에 대한 29개 유전자의 부가 및 감쇄 효과를 측정하였다.
시험 피검자
연구 그룹은 336명의 상관성이 없는 비-라킨 아메리카계 백인 피검자로 구성된다. 이들 중에서, 274명은 투렛 증후군(TS)을 알고 있는 것으로 진단되었고 62명은 대조 그룹이다. TS 피검자는 시티 오브 홉 메디칼 센터의 투렛 증후군 클리닉으로부터 차출되었다. 모두 TS에 대한 DSM-IV 기준을 충족하였으며, 모두 발명가와 개인면담을 하였다. 이들은 선행 연구들(문헌 참조; Comings 1995a, comings 1990)에 참가한 동일한 피검자를 우선으로 하였으며, 선행 연구에 참여한 일부 피검자의 DNA 샘플이 고갈된 경우에는 몇몇 신규 TS 프로밴드를 추가하였다. 발명가들은 먼저 발명가의 TS 피검자를 경미한 수준(1등급, 너무 경미해서 치료할 필요가 없는 만성 틱), 중정도의 수준(2등급, 치료가 필요할 정도로 심함) 및 심각한 수준(3등급, 일상의 여러 측면에서 매우 심각한 영향을 미침)을 가진 피검자로 분류한다. TS 피검자 중에서 3등급은 30%, 2등급은 62%, 1등급 8%였다. TS 및 ADHD는 유사한 질환이며, 클리닉에 참가한 TS 피검자의 대다수는 ADHD를 동시에 앓고 있었다(문헌 참조; Comings and Comings, 1987b, Comings and Comings, 1984). TS 피검자 중에서, 54%가 ADHD에 대한 DSM-IV 기준을 충족시켰다. 대조 그룹 및 ADHD를 앓거나 앓지 않는 TS 피검자의 존재로 인해 이들 그룹은 연속 변수로서 상이한 유전자 및 ADHD의 대립형질 간의 상관성을 실험하는데 매우 특히 적합하다. TS 피검자의 평균 연령은 18.0세(S.D. 13.2)이다. 대다수가 고학년 어린이 및 청소년인 반면, 29%는 21세 이상이었다. 대조 그룹의 평균 연령은 46.3세(S.D. 15.38)이었다. TS 피검자와 대조 그룹 둘다 다른 문헌에 기술되어 있다(문헌 참조; Comings et al., 1996b, Comings 1995b, Comings 1994b, Comings 1994a, Comings 1995b).
각각의 대조 그룹 및 TS 프로밴드들은 질환 범위에 대한 진단학적 면담 스케쥴(Diagnostic Interview Schedule, Robins et al., 1981), DSM-III-R(Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders, 1987) 및 DSM-IV(Diagnostic and Statistical Manual of American Psychiatric Assn. IV, 1994) 기준을 근거로 한 설문지를 작성하여야 한다. 설문지에서는 아동기 및 청소년기 동안 DSM-IV ADHD 증세가 전혀 없었거나 드물게 나타났는지(스코어=0), 가끔 나타났는지(스코어=1), 또는 항상 나타났는지(스코어=2)를 묻는다. 저항 장애(ODD) 및 행동 장애(CD)의 스케일은 이들 장애에 대한 DSM-IV 기준의 수의 합계를 기준으로 한다. 학습 장애와 관련한 문제의 존재 유무를 평가하기 위해서는, 피거자에게 3가지 질문을 한다. 1. 교육상 불리한 특수반에 있었던 경험이 있는가(EH), 학습상 불리한 특수반에 있었던 경험이 있는가(LH), 또는 학습장애 특수반(LD)에 있었던 경험이 있는가? 2. 우수반에 있었던 경험이 있는가? 3. 당신이 학습장애가 있다고 말한 적이 있는가? 이러한 질문에 대해 부정의 대답시에는 0, 긍정의 대답시에는 1의 스코어를 주고 이를 더하여 LD 스코어를 나타낸다. 캘리포니아에서는, 상기 특수반에서의 반 편성에 대해서도 한명 이상의 교육 심리학자에 의한 전반적인 평가 및 학생이 그의 동료보다 2년 이상 뒤지는에 대한 평가를 필요로 한다. 알콜 스코어(문헌 참조; Comings, 1994b)는 알콜 오용/의존에 대한 합산된 DSM-IV 증세를 근거로 한다. 틱 스코어는 운동 및 음성 틱의 존재의 합산을 근거로 한다(문헌 참조; Comings, 1995a). 행동 스코어에 대해 사용되는 특정 질문들이 다른 문헌에 상세하게 기술되어 있다(문헌 참조; Comings et al., 1996b, Comings et al., 1998a, Comings, 1995a, Comings, 1990, Comings 1994a, Comings 1995b, Robins et al., 1981, Comings 1995c, Comings 1994c). 정확성을 위해 설문지를 각각의 피검자와 재검토한다. 설문지에 기초한 증세 평가법의 정확도, 유용도 및 만감도는 이러한 수단의 사용을 동일하게 구조화된 기구에 대한 면담자의 관리사항과 비교함으로써 다른 문헌에 의해 입증된다(문헌 참조; Gadow and Sprafkin 1994, Grayson and Carlson, 1991).
부가 유전자만을 사용할 경우 무작위로 채점된 대립형질 세트가 상당한 효과를 나타낸다는 가능성을 실험하기 위해, 각각의 유전자를 표 65에 보고된 바와 같이 동일한 최종 대립형질 빈도를 야기시키는 알고리즘에서의 순환하는 무작위수를 근거로 하여 0 및 2의 스코어를 할당한다.
본 발명의 발명가들은 선형 회귀 분석에서 수득된 큰 F값에 대한 정확한 p값을 제공하기 위해 dstatt10.exe 프로그램(http://odin.mdacc.tmc.edu/anonftp/)을 사용하였다. ADHD를 앓고 있는 피검자와 비교하여 ADHD를 앓고 있지 않는 피검자에서의 유전자 수에 대한 유의적인 차이를 시험하기 위해 선형 X제곱 분석법을 사용하였다. SPSS 통계 소프트웨어(제조원; SPSS, Inc., Chicago, IL)를 사용하였다.
결과
표 65에는 29가지 유전자 명칭, 다형성의 유형,
유전자형에 대한 기법, 유전자형의 스코어를 매기는 방법, 1 또는 2의 스코어를 받은 피검자의 비율, 독립 피검자 그룹에서 유전자형에 대한 스코어를 매기는 방법이 입증이 되었는가의 유무를 포함하는 다형성에 대한 참고사항 및 이용가능할 경우 이에 대한 참고사항이 열거되어 있다. 첫번째 가설을 시험하기 위해, ADHD 변수에 대한 진행성 PG 및 TPG 유전자 스코어의 r, r2, F 및 p값을 선형 회귀 분석에 의해 계산하였다(표 66). 결과를 나타내는데 있어서, 본 발명가들은 유전자를 신경전달자 또는 이들이 영향을 미치는 작용을 기준으로 하여 그룹별로 분류하였다.
도파민 유전자
도파민 수용체 유전자 및 도파민 운반자 유전자(DAT1) 5가지 모두를 실험하였다. 이들 중에서, DRD2(문험 참조; Comings et al., 1996b, Comings et al., 1991), DRD4(문헌 참조; Lahoste et al., 1996, Swanson et al., 1998) 및 DAT1(문헌 참조; Comings et al., 1996b, Gill et al., 1997) 유전자는 이미 ADHD에 포함되어 있다. DRD1, DRD2, DRD5 및 DAT1 유전자가 ADHD 스코어에 가장 큰 영향을 미치며, 여기서 r2값은 0.0022 내지 0.0088이다. 각각의 p값은 0.388 내지 0.093이다. 본 연구에서 DRD4 유전자는 ADHD에 아무런 작용을 하지 못하는데 반해, 분 발명가 자체 연구에서 2가지 대립형질이 또한 중요하였음에도 불구하고, 선행 연구에서와 같이, 본 발명가들은 6 내지 8개의 보다 긴 반복 대립형질에 역점을 두고 이들 유전자의 스코어를 매겼다(문헌 참조; Comings et al., 1997a).
PG 스코어는 DRD1 및 DRD2 유전자가 이들의 효과에 대해 부가적이므로 이의 각각의 r2값의 합계(0.0041+0.0084=0.0125)가 D1+D2에 대해 관찰된 PG 스코어(0.0125)와 동일함을 보여준다. 본 발명가들은 이를 부가 유전자로서 명명하였다. 이와는 달리, DRD3 유전자 스코어를 D1+D2 PG 스코어어 더하여 산출된 r2는 DRD1+DRD2 유전자에 대한 값보다 더 작다(0.0092). 따라서, ADHD 표현형과 관련하여, 본 발명가들은 이러한 DRD3를 감쇄 유전자로서 명명하였다. DRD4 유전자(0.0071)를 더해줌에 따라 r2가 계속해서 감소되기 때문에, 이것 또한 감쇄 유전자로서 간주된다. r2값은 그후 DRD5 및 DAT1 유전자를 더해줌으로써 다시 증가하기 때문에, 이들은 부가 유전자로서 간주된다. 부가 유전자 및 감쇄 유전자를 둘다 PG 스코어에 포함시킨 경우의 총 r2가 0.0138인데 비해, 부가 유전자 만이 PG 스코어에서 포함되는 경우, 총 r2는 0.0208이다.
이러한 결과를 근거로 하여, 본 발명가들은 유전자를 더할수록 r2및 F는 증가하고 p는 감소할 경우, 이는 표현형에 있어 부가적인 역할을 하는 것인 반면, 그 역일 경우에는 이는 표현형에 대해 감쇄 효과를 나타낸다는 규칙을 정립하였다. 본 연구를 상기하면서, 본 발명가들은 PG 또는 TPG 스코어에서 유전자를 포함하는 기준으로서 임의의 p값보다는 이를 선택하였다. 따라서, 본 발명가들은 TPG 스코어에 대한 부가적 도파민성 유전자 세트(D)로서 DRD1, DRD2, DRD5 및 DAT1을 선택하였다. 이러한 4가지 도파민성 유전자와 함께, ADHD 스코어의 분산도는 2.08%였다(p†=†0.0081).
세로토닌 유전자
6가지 세포토닌 유전자에 대한 r2값은 세로토닌 운반자(HTT)의 경우 0.0106 내지 HTR2C 유전자에 대한 0.0002의 범위였다. HTR1A 유전자를 HTT 유전자에 부가할 경우, r2값이 0.0106에서 0.0143으로 증가하였다. HTR1Dβ 유전자를 부가할 경우 r2값은 감소하였으며, 그후 HTR2A 유전자를 부가하였더니 r2값은 증가하였고 HTR2C 유전자에 의해서는 감소하였으며, TDO2 유전자에 의해서는 증가하였다. 이는 HTT, HTR1A, HTR2A 및 TDO2 유전자가 최상의 부가적 세로토닌성 유전자임을 시사한다. 이러한 유전자에 대한 r2는 0.0161이었다. 그러나, HTR2A 유전자에 대한 r2값(.0016)이 이들 4가지 중에서 가장 낮기 때문에, 본 발명가들은 또한 HTT, HTR1A 및 TDO2에 대한 r2값도 조사하였다. HTR2A 유전자의 r2값은 보다 높기 때문에(0.0167), HTR2A 유전자를 세로토닌성 유전자의 부가 세트에서 뺀다. 다음으로 가장 낮은 r2값을 나타내는 유전자를 빼더라도 부가 r2값은 더이상 증가하지 않는다. 이들 4가지 유전자와 함께, ADHD 스코어에 대한 분산도는 1.67였다(p†=0.0004).
노르에피네프린 유전자
4가지 노르에피네프린 유전자에 대한 r2값은 0.0066 내지 0.0122였다. 이러한 경우, 이들 4가지 유전자는 총 r2값에 대해 누진적인 부가 효과를 나타낸다. 이러한 경우 ADHD스코어에 대한 분산도는 4.22%(p†=0.00015)이며, 이는 노르에피네프린 유전자가 도파민 또는 세로토닌 유전자보다 ADHD에 대해 보다 큰 역할을 한다는 사실을 나타낸다. 사실상, 두가지 노르아드레날린성 α2수용체 유전자 자체는 도파민과 세로토닌의 조합된 유전자만큼 높은 ADHD 스코어의 분산도(3.44%)를 야기시킨다. 다른 문헌(참조; Comings et al., 1998a)에 ADHD에서의 이들 아드레날린성 유전자의 역할이 보다 상세하게 기술되어 있다. 도파민성 유전자+세로토닌성 유전자+노르아드레날린성 유전자의 효과(DSN TPG 스코어)를 합할 경우, ADHD 스코어에 대한 분산도는 7.41%(p†=0.0000040)이다.
카테콜라민 감성 유전자
2가지 카테콜라민 감성 유전자의 ADHD 스코어에 대한 r2값은 MAOA 유전자의 경우 0.0244 내지 COMT 유전자의 경우 0.0098이었다. (C)를 더할 경우, ADHD 스코어에 대한 분산도는 3.33%(p†=0.00077)였다. DSN 스코어를 더할 경우, ADHD 스코어에 대한 분산도는 10.05%(p†=2.8X10-8)였다.
GABA 수용체 유전자
두가지 GABA 수용체 유전자의 ADHD 스코어에 대한 r2값은 GABRA3 유전자의 경우 0.0082 내지 GABRAB3 유전자의 경우 0.0066였다. 이들 둘을 조합할 경우의 r2값은 0.0143(p†=0.028)이었다. DSN 및 C 스코어를 합할 경우, ADHD 스코어에 대한 분산도는 10.87%(p†=5.9X10-9)였다.
다른 신경전달자 유전자
4가지의 부가적인 신경전달자 유전자에 대한 r2값은 칸나비노이드 수용체 유전자 CNR1의 경우 0.0017, 니코틴 콜린성 α4 유전자 CHNRA4의 경우 0.0143, NMDA 수용체 유전자 NMDAR1의 경우 0.0058, 프로엔케팔린 유전자 PENK의 경우 0.0011이었다. 이들 각각을 상기한 유전자에 더할 경우, ADHD 스코어의 분산도는 11.09%, 11.78%, 12.26% 및 12.34%로 점진적으로 증가하였다. 전체 신경전달자-관련 유전자 세트(NT)의 경우, p†=3.4X10-10이었다.
안드로겐 수용체 유전자
본 발명가들이 실험한 모든 행동이 남성에서 보다 일반적이었기 때문에, AR 유전자를 또한 실험하였다. ADHD, ODD 및 CD에서의 이들 유전자의 역할에 대해서는 다른 문헌(참조; Comings et al., 1998b)에 상세하게 기술되어 있다. AR 유전자의 ADHD 스코어에 대한 r2값은 0.0111이었다. 이를 상기한 유전자에 더할 경우, ADHD 스코어의 분산도는 13.27%였다(p†=5.5X10-11).
면역 유전자
최근 ADHD(문헌 참조; Warren et al., 1995) 및 TS(문헌 참조; Swedo et al., 1998)에서의 면역 인자의 잠재적 역학에 대한 관심이 커져감에 따라, 본 발명가들은 2가지 면역 유전자, 인터페론-γ 및 CD8A 유전자를 실험하였다. 둘다 감쇄 유전자인 것으로 판명되었으며, 부가 세트에는 포함되지 않았다.
기타 유전자
그외의 2가지 유전자, 프레제닐린-1(PS1) 및 코르티코트로핀 방출 인자 유전자(CFR)를 실험하였다. 이들의 r2값이 유사하기는 하지만(.0051 및 .0050), CRF 유전자 만이 부가적이었다. 부가 유전자를 전부 조합할 경우, ADHD 스코어의 분산도는 13.62%였다(p†=2.8X10-11).
ADHD 스코어
도 4는 변이 부가 유전자 수의 증가가 ADHD 스코어에 미치는 효과를 나타내고 있다. 이는 변이 유전자가 단지 4 또는 5개일 경우 1.0에서 변이 유전자를 15개 함유할 경우 25.0으로 점진적으로 증가됨을 보여준다. ADHD 스코어의 점진적 증가에 대한 선형 X제곱 시험 p값은 ＜10-8이었다.
도 5는 시험한 29개 유전자의 누진 부가에 대한 r2값을 나타낸다. 유전자 라벨의 인접한 왼쪽의 곡선 기울기는 ADHD 스코어에 대한 유전자의 상대적 기여도를 나타낸다. 기울기가 증가될 경우, 유전자는 ADHD 스코어에 기여한다. 기울기의 각도가 높아질수록 기여도도 커진다 기울기가 감소할 경우, 유전자는 감쇄적이며, 초기 유전자 스코어링이 1 또는 2로서 매겨진 유전자형에 대해 보다 높은 표현형 효과를 보여준다는 사실에도 불구하고, 다른 유전자에 비해 ADHD 스코어에 거의 또는 전혀 역할을 하지 않는다. 실험 결과, DRD1, DRD2, DRD5 및 DAT1 도파민 유전자는 ADHD 스코어에 기여하는 반면, DRD3 및 DRD4 유전자는 그렇지 않았다. 세로토닌성 유전자 중에서, HTT, HTR1A 및 TDO2 유전자는 ADHD 스코어에 기여하는 반면, HTR2A 및 HTR2C 유전자는 그렇지 않았다. 4가지 모르아드레날린성 유전자는 다른 신경전달자 그룹의 유전자보다 ADHD에 더많이 기여하였다. 부가 유전자 및 감쇄 유전자 29가지를 모두 포함시킬 경우, 최종 r2값은 0.113이었다(p†=2.7X10-9).
본 발명가들은 동일한 유전자 세트를 무작위로 대립형질에 할당하고, ADHD 스코어에 양의 상관관계를 갖는 유전자를 사용할 경우, 산출된 r2값이 유의적인가에 대한 가능성을 실험하였다. 결과가 도 5의 하단부에 제시되어 있다. r2값의 누진적인 부가 효과는 공제곱에 의해 나타내며, 단지 양의 상관관계를 사용한 경우의 부가 효과는 x를 포함하는 제곱에 의해 나타낸다. 부가 및 감쇄 유전자 둘다를 사용한 경우의 최종 r2값은 0.0001이었다. 부가 랜덤 유전자 만을 사용한 경우의 최종 r2값은 0.004였다. 이들 둘다 유의하지 않다. 또한, 누적 r2값이 랜덤 PENK 유전자에서 0.008로 높기는 하지만, 마지막 랜덤 부가 유전자(CD8A)를 더할 경우, 이는 0.0004로 다시 낮아진다.
성별로 인한 가능한 혼동을 실험하기 위해, 본 발명가들은 남성과 여성을 분리하여 실험하였다. 두 그룹에서 r2값의 유의적인 상승을 나타내었으며, 이는 각 그룹에서의 피검자의 수의 감소로 인한 힘의 감소에 의해 주로 감소된다.
따라서, 제1 가설에 대한 시험은 29개 유전자의 부가 효과가 다른 단독 유전자보다도 유의적으로 더 높은 r2및 p값을 제공함을 보여주었다. 제2 가설의 시험 결과가 도 6에 제시되어 있다. 이는 관찰된 결과가 가설에서의 결과에 필적함을 보여준다. 14개 유전자는 2가지 세트에서 모두 부가적이었고, 3개는 2가지 세트에서 모두 감쇄적이었으며, 13개는 2가지 세트에서 서로 상이하였다. 일반적으로, 전체 세트에서 가장 부가적인 유전자, 예를 들면, DRD5, DAT1, HTT, HTR1A), 4개의 아드레날린성 유전자(DBH, ADRA2C, ADRA2C, NT), MAOA, COMT 및 AR 유전자는 두가지 세트에서 모두 부가적인 유전자였고, 전체 세트에서 가장 감쇄적인 유전자(DRD3, DRD4)는 두가지 세트에서 모두 감쇄적이었다. 두가지 세트에서 가장 상이한 유전자는 CNR1, CNRA4, NMDAR1 및 PENK 유전자였다. 예를 들면, NMDAR1 유전자는 그룹 1에서는 다소 부가적이지만, 그룹 2에서는 감쇄적이었다. 그러나, 두가지 세트에서, N이 보다 작은데도 불구하고, 이들 둘의 p값 ＜†5.0X10-4에 대한 r2는 점진적으로 증가하였다. 부가 유전자 만을 포함시킬 경우, 둘다 p＜10-6에서 유의적이었다. 두가지 그룹에 대해 모두 부가적인 유전자 만을 전체 세트에 사용할 경우, r2=0.108, F=40.82, p†=5.6X10-9이었다. 두가지 또는 한가지 세트에서 부가적인 유전자를 전체 세트에 사용할 경우, r2=0.11, F=43.71, p†=1.5X10-9이었다. 이러한 결과는 또한 단일 유전자를 실험할 때 복제하기가 종종 어렵다는 것을 예시한다. 이와는 달리, MAA 기법은 조건 범위하에서 로버스트한 결과를 산출한다. 도 4, 5 및 6은 동시발병한 질환이 adhd와 함께 유전자를 공유하며 몇가지 독특한 유전자를 사용한다는 제3 가설의 시험 결과를 나타낸다.
ODD 및 CD
29개 유전자가 ODD 및 CD 스코어에 대한 r2값에 미치는 효과를 실험하였다. 부가 유전자 및 감쇄 유전자 둘다를 포함할 경우, ODD 스코어에 대한 최대 r2값은 0.0775,p†=3.1X10-6이었고, CD 스코어에 대한 최대 r2값은 0.0225, p=0.0059였다. 실험함으로써, ODD 및 CD 스코어에 기여하는 유전자를 용이하게 동정할 수 있다. 부가 유전자 만을 사용할 경우, ODD 스코어에 대한 최대 r2값은 0.10, p†=3.2X10-8이었고, CD 스코어에 대한 최대 r2값은 0.075, p†=3.7X10-6이었다. ODD에 대해 가장 중요한 유전자는 DRD1, DRD2, DRD3, DAT1, HTT, HTR1A, HTR2A, HTR2C, DBH, ADRA2A, ADRA2C, MAOA, GABRA3, GABRAB3, CNR1, CHRNA4, NMDAR1, PENK, AR 및 CD8A였다. CD에 대해 가장 중요한 유전자는 DRD1, DRD2, HTT, HTR1A, HTR2A, HTR2C, DBH, ADR2C, CHRNA4, AR 및 CD84였다. 따라서, 29개 유전자 중에서 20개가 ADHD에 대해 역할을 하였으며, 20개 유전자는 ODD에 대해, 10개 유전자는 CD에 대해 역할을 하였다. ODD 유전자는 둘다 유사하지만 ADHD 유전자와는 다른 반면, CD 유전자는 ADHD 스코어와 동일하다.
LD 및 틱
29개 유전자가 LD 및 틱 스코어에 대한 r2값에 미치는 효과를 실험하였다. 부가 유전자와 감쇄 유전자를 둘다 포함시킬 경우, LD 스코어에 대한 최대 r2값은 0.011, p=0.054였고, 틱 스코어에 대한 최대 r2값은 0.014, p†=0.029였다. 부가 유전자 만을 포함시킬 경우, LD 스코어에 대한 최대 r2값은 0.043, p=0.0005였고, 틱 스코어에 대한 최대 r2값은 0.061, p=0.00005였다. 당해 실험은 틱 스코어에 관여하는 유전자는 DRD1, DRD5, HTR1A, HTR1Dβ, HTR2C, TDO2 DBH, ADR2C, COMT, GABRA3, CNR1 및 CHRNA4임을 보여준다. CD 스코어에 관여하는 유전자는 DRD1, HTR2C, TDO2, DBH, ADRA2A, ADRA2C, MAOA, CNR1 및 CNRA4였다. 따라서, 12개 유전자가 틱에 연관되며, 9개 유전자가 학습 장애에 연관된다.
알콜 또는 약물 오용/의존 및 흡연
14세 이상의 164명의 피검자를 대상으로 하여 알콜 오용/의존 스코어에 대해 29개 유전자를 실험하였다. N이 보다 적을 경우, r2값은 보다 광범위하게 변한다. 따라서, 성인 만을 대상으로 실험할 경우, 부가 유전자가 감쇄 유전자로부터 쉽게 구별된다. 알콜 오용/의존 QTV에 대하여, 두가지 유전자 세트를 사용한 최종 r2값은 0.049, p†=7.5X10-6이었다. 하기에 논의되는 바와 같이, 이러한 유전자 또는 신경전달자 시스템의 대부분은 이미 알콜 오용에 대해 역할을 하는 것으로 알려져 있다.
약물 오용/의존 QTV(흡연제외)에 대한 결과는 알콜 오용/의존에 대한 결과와 유사하다. 그러나, 약물 오용은 알콜 오용/의존 보다 덜 확산되어 있기 때문에, r2값에 대한 직선의 크기가 더 작다. 주된 차이점은 HTR1Dβ 및 HTR2A, ADRA2C 유전자는 약물 오용/의존에서 감쇄적이지만 알콜 오용/의존에 대해서는 부가적이고, HTR2C 및 NT는 약물 오용에 대해서는 부가적이지만 알콜 오용에 대해서는 감쇄적이며, INFG는 알콜 중독에 대해서는 감쇄적이지만 약물 오용에 대해서는 분명치 않다. 흡연은 보다 만연되어 있으며, 이의 결과를 또한 실험하였다. QTV는 1개월 동안 흡연한 적이 있으면 1, 흡연한 적이 없으며 0으로 스코어를 매겼다. 피검자를 대상으로 한 당해 연구에서, DRD2 그룹은 단독으로 0.055의 r2값을 산출하는데 주요한 역할을 하였다. 다른 부가 유전자는 NMDAR1, PENK, AR 및 INFG이다. 최종 r2값은 0.10, p=0.00038이다.
기타 QTV
본 발명가들은 또한 통상적으로 ADHD와 동시발병하는 행동들에 대한 몇가지 다른 QTV를 실험하였다. 총 r2값, p값 및 주요 부가 유전자는 다음과 같다 : 조병 -- r2†=0.0721, p†=5.8X10-6, DRD1, DRD2, DRD3, DAT1, HTR1Dβ, HTR2C, TDO2, ADR2AC, GABRB3, CNR1, CHRNA4; 분열병질 -- r2=0.058, p=8.3X10-5, DRD2, DRD3, HTR1Dβ, HTR1A, HTR2A, HTR2C, DBH, CNR1, CHNRA4; OCD -- r2=.46, p=1.0X10-4, DRD1, DRD2, HTR1Dβ, GABRB3, CNR1, NMDAR1; 일반적인 불안증 -- r2=0.0032, p=0.001, DRD1, DAT1, HTR1Dβ, CHRNA4, PENK; 및 주요 우울증 -- r2=0.0271, p=0.0025, DRD1, DAT1, HTT, HTR1Dβ, TDO2, CNR1, CHRNA4, NMDAR1.
사용된 유전자 수
특정한 2가지 양분된 표현형을 가진 피검자 및 가지지 않은 피검자에서 변이 유전자 수의 상대적 기여도를 실험하기 위해, 본 발명가들은 ADHD에 대한 DSM-IV 기준을 충족시키는 피검자와 비교하여, ADHD에 대한 DSM-IV 기준을 충족시키지 않는 피거자에서의 부가적 변이 유전자의 수를 플롯팅하였다. 변종의 평균수는 ADHD 증상이 없는 피검자에서는 약 10이었고, ADHD로 진단된 피검자에서는 약 12였다. ADHD 증상이 없는 피검자에서 기여도는 3 내지 14인데 반해, ADHD로 진단된 피검자에서는 7 내지 18이었다.
p값과 비교한 부가 효과
당해 연구로부터, 본 발명가들은 5가지 정량 스코어(ADHD, ODD, CD, LD 및 틱)과 비교한 29개 유전자 모두에 대한 145r2및 p값 결과를 플롯팅하여, 문제시된 표현형에 대해 감쇄적인 유전자와 부가적인 유전자를 동정하였다. 이는 유전자를 한번에 한개씩 실험할 경우, 임의로 ＜0.05로 설정한 p값은 유전자가 부가적이고 표현형에 기여하는지, 아니면 감쇄적이고 표현형에 기여하지 않는지와는 거의 관련이 없음을 보여준다. 따로 분리하여 실험할 경우, 부가 유전자의 대부분에서 p값은 0.05 이상이며, 대개는 0.10 내지 0.40의 p값을 나타낸다. 0.45 이상의 p값에서는 보편적으로 감쇄 유전자가 동정되는 반면, 0.12 내지 0.45 범위의 p값에서는 일부는 부가적이고 나머지는 그렇지 않다.
토의
다인자성 질화에 관여하는 유전자의 동정이 어려운데 대한 염려가 종종이 토로되어 왔다. 본 연구에서, 발명가들은 다수의 지원 유전자의 부가효과를 실험함으로써 다인자성 질환의 주여한 단일 특성인 여러 상이한 유전자의 부가 효과를 장점으로 전환시키고자 시도하였다. 여러 관련 연구의 부가 효과 및 감쇄 효과가 사용되었기 때문에, 본 발명가는 이를 다중 부가 관련 기법으로서 명하였다. 복합 질환을 실험하기 위해 연결 기법을 사용할 경우, 유의도가 양의 허수가 되는 것을 피하기 위해 매우 엄격한 유의수준을 사용해야 한다(문헌 참조; Lander and Krugyak, 1996). 이러한 권장 사항으로 인해, 발명가들은 표 66 및 도 5와 6에 불완전한 p값보다는 유의도를 나타내었다. 이는 MAA 기법, 29개 유전자 및 단 344명의 피검자를 사용함으로써 10-11이하의 p값이 용이하게 성취됨을 보여준다.
이는 새로운 기법이기 때문에, 사용되는 통계법을 주의해서 면밀히 검토하는 것이 바람직하다. 이는 분명히 몇가지 가능성있는 비판의 여지가 있다. 첫째, 연구가 단일 피검자 그룹에서만 수행된다면, 유전자 스코어링이 주어진 표현형에 대한 효과보다 최대로 되도록 설정될 경우, 단순히 이러한 유전자 스코어를 더해줄 경우 r2값이 더 높아진다. 이로 인해, 발명가들은 본 발명가에 의해 연구되거나 다른 문헌의 발명가에 의해 연구된 단독 피거자 그룹에서 유전자 스코어링을 주의해서 확인하였다. 표 65에 제시된 바와 같이, 모든 유전자는 이러한 기준을 충족시켰다. 일부 유전자의 경우, 실행가능한 스코어링이었다. 예를 들면, 두가지 대립형질 다형성을 가진 유전자의 경우, 1 대립형질의 빈도가 낮아서 11 표현형을 나타내는 경우가 거의 없다면 22=0이고 11 또는 12는 2로 스코어링할 수 밖에 없다.
두번째로 가능한 비판은, 충분한 유전자를 실험하고 부가 유전자 만을 사용할 경우, 유의한 결과가 무작위로 수득될 수 있다. 이러한 가능성을 실험하기 위해, 본 발명가는 제2 스코어 세트를 설정하여, 여기서 각각의 피검자에 대한 각각의 더미(dummy) 유전자를 관찰 결과에서 밝혀진 사항에 부합되도록 설정한 빈도로 스코어를 무작위로 할당한다. 양의 결과 및 음의 겨과를 둘다 누진합계한 효과가 도 5에 제시되어 있다. 29번째 유전자까지, 음의 결과에 대한 양의 결과를 서로서로 상쇄함으로써 최종 r2값은 0.0001이다. 보다 중요하게는, 양의 상관성을 제공하는 랜덤 유전자 만을 사용한 경우, 누진 r2값은 PENK 유전자에 대해 최대 0.006으로 증가한다. 그러나, 마지막 2가지 양의 랜덤 유전자를 더할 경우, r2값은 다시 0.004, p＞0.25로 낮아진다. 이러한 감쇄 효과는 CD8A 및 CRF 랜덤 스코어의 효과가 양의 값을 나타낸다 하더라도, r2값은 0.0000 내지 0.0003이며 감쇄 효과를 유발시킨다는 사실에서 기인하는 것으로 보인다. 양의 r값을 사용하여 동일한 과정을 반복할 경우 의심할 여지없이 결국에는 유의적인 결과가 나오기는 하지만, 주요사항은 표현형 효과와 관련된 다른 연구들에서 독립적으로 입증된 지원 유전자를 사용할 경우 최종 p값은 랜덤 유전자에서보다 매우 높아진다(10-5내지 10-11)는 점이다.
제3의 가능한 비판은 결과가 무작위 스코어링으로부터의 예측치보다 훨씬 높다 하더라도, 단일변수 회귀법을 사용하고 부가 유전자만을 포함시킬 경우 산출된 p값은 여전히 높다는 점이다. 이러한 합당한 비판책에 대한 2가지 방법이 있다. 첫번째, 모든 유전자 연구의 금 본위제는 리플리케이션 또는 다중 독립세트의 실험이다. 본 발명가들은 MAA 기법에 대한 합당한 기준이 부가 세트가 적당한 N을 가진 모든 연구에서 부가적인 것으로 나타난 모든 유전자를 포함해야 한다고 시사하였다. 예를 들면, 발명가들의 자체 시험-재시험 연구에서, 선택된 부가 유전자 세트는 둘중 하나의 세트에서 부가적인 유전자를 포함할 수 있다. 이들 중의 일부가 다른 연구에서는 감쇄적이기 때문에, 이는 r2및 p값의 인위적인 상승을 피할 수 있도록 도와준다. 이를 수행할 경우, 최종 r2값은 실질적으로 0.11이며, 매우 유의적이다(p＜2/0X10-9).
감쇄 효과에 대한 이유
중정도의 감쇄 효과는 당해 유전자에 의해 야기되는 분산도가 비교적 작다는 사실에서 기인할 수 있다. 예를 들면, 유전자 A의 11 표현형이 ADHD 스코어에 매우 작은 효과를 나타낸다면, 다른 유전자는 A11 피검자보다 더 높은 ADHD 스코어를 갖는 비-A11 피검자에 대한 책임이 있다. 비-A11 피검자가 여전히 상당한 증상을 갖고 있기 때문에, 유전자의 감쇄 효과가 야기된다. 감쇄 효과에 대한 두번째 이유는 다수의 상이한 표현형을 실험할 경우에 야기될 수 있다. 예를 들면, 유전자의 11 표현형은 ADHD와 유의적으로 연관될 수 있는 반면, 22 표현형은 우울증과 같은 상이한 표현형과 연관될 수 있다. 이러한 결과로, 11 표현형을 2로서 스코어링할 경우, 이는 ADHD 스코어에 대해서는 부가 효과를 야기하지만 우울증 스코어에 대해서는 감쇄 효과를 야기시킨다.
복합 질환의 유전학적 연구에 대한 관련성
본 발명가들은 이러한 연구가 정신병 유전학 뿐만 아니라 복합 다인자성 질환의 유전학에도 상당한 관련이 있다고 믿는다.
1. 단일 유전자에 반대되는 다중 유전자 시험 능력
이러한 연구들은 유전자를 한번에 한개씩 실험하는 관련 연구의 재연성에 관한 문제점에 대한 약간의 식견을 제공해준다. 이는 다중 유전자가 사용되고, 단일 유전자는 중요하지 않으며, 각각의 유전자가 분산도에 단지 조금 기여할 뿐이라는 사실에서 기인한다. 그 결과, 유전자를 한번에 한개씩 실험하는 경우, 하나의 유전자는 어떠한 연구에서는 유의성을 갖지만, 다른 연구에서는 그렇지 않을 수 있다. 끝없는 실패의 원인이라거나(문헌 참조; Moldin, 1997) 어떠한 연구도 정확치 않다는 생각에서라기 보다는, 이는 복합 질환의 유전학 측면에서 기대되는 결과로서 평가되어야 한다(문헌 참조; Comings, 1998a). 본 발명가들은 유전자 및 행동 특성을 사용한 145개의 관련 연구의 결과에 대한 분산도 및 p값을 본원에 보고하였다(알콜 오용/의존 제외). 이는 p＜0.05의 단일 유전자 유의도에 대한 통상의 기준을 사용할 경우 부가 유전자의 대부분이 거절됨을 보여준다. 이는 또한 p＜0.05 컷오프를 사용할 경우, 2개의 실험실이 동일하기가 어려운 이유를 입증해준다. 0.0008 내지 0.025의 r2값을 야기시키는 연관도가 상이한 실험실로부터의 실질적으로 독립적인 연구인 경우, 단지 6 내지 20%만이 양의 '비-리플리케이션'인 것으로 간주되고 나머지 24%는 음의 '비-리플리케이션'으로 간주된다. 그러나, MAA 기법에 의해 이러한 모든 연관성이 이용된다.
다인자성 유전의 가장 뚜렷한 한가지 특징은 다중 유전자가 관여된다는 점이기 때문에, 본 발명가들은 복합 장애에 연관되는 유전자를 동정하기 위해 이러한 특성을 이용할 필요가 있다고 제안하였다(문헌 참조; Comings et al, 1996b, Comings, 1996a, Comings 1998a, Comings 1998b). 본 연구는 이러한 개념을 입증하며, 다인자성 유전력이 다중 유전자의 부가 효과 실험으로부터 야기됨을 제시한다. 본 발명가들은 또한 유전자가 주어진 질환에 대해 역할을 하는지를 측정하기 위한 적합한 기준이 유전자가 관련된 정량 스코어에 대해 감쇄 효과보다는 부가 효과를 가지는가임을 제안하였다. 이는 표 66 또는 도 5와 6에 제시된 바와 같은 결과를 살펴봄으로써 쉽게 확인할 수 있다.
2. 다인자성 유전에 대한 최적 접근책으로서의 관련 연구들
최근, 복합 질환에서 유전자를 동정하는데 가장 널리 사용되는 방법은 로드 스코어 결합을 사용한 전체 게놈의 선별, 병에 걸린 자손 쌍 기법(sib pair technique) 또는 단일유형 상관 위험 기법으로 이루어진 방법이다. 이는 매우 큰 유전적 논리를 가지기 때문에, 종종 복재하기가 어렵고, 무가적 유전자 방법에 근거하여 본 발명가들에 의해 ADHD 또는 TS에 역할을 하는 것으로 밝혀진 상기 유전자의 대부분이 이러한 연구에 기초하여 배제되었다(문헌 참조; Pakstis et al., 1991). 관련성이 없는 대조 그룹 및 병에 걸린 프로밴드를 이용한 관련 연구는 특이적으로 다인자성 유전의 작은 효과 특성을 검지할 수 있는 반면(문헌 참조; Risch and Merikangas, 1996, Comings, 1998a), 이들은 또한 복제할 수 없다는 문제가 있다. 다중 유전자의 부가 효과를 실험하기 위한 MAA 기법은 관련 연구의 파워를 사용하여 복제할 수 없다는 문제점을 피할 수 있다. 이는 p＜0.05에서의 단일 유전자 유의도 기준을 누적 r2에 대해 부가 효과를 나타내는 다소 덜 엄격한 매개변수로 대체하기 때문이다. 이러한 방법은 또한 동일한 기구로 실험된, 단일 비관련 프로밴드 및 비관련 대조 그룹의 확인이 병에 걸린 자손-쌍을 확인하는 것보다 훨씬 용이하기 때문에, 보다 더 실용적이다. 다수의 상이한 질환에 관여하는 유전자를 동정하기 위한 시도로서, 병에 걸린 자손 쌍 및 병에 걸리지 않은 자손 쌍으로 이루어진 DNA 은행이 수립되었다. 이러한 DNA 은행의 식별 속도 및 유전자 확인 능력은 단일 프로밴드 및 동일한 시험 기구로 선별한 상응하는 수의 비관련 대조 그룹을 포함시킴으로써 극적으로 증가될 수 있었다. 이의 효능은 상이한 은행으로 하여금 동일하면서 널리 이용가능한 선별 대조 그룹을 공유함으로써 극대화될 수 있다. CEPH(Centre d'etude du Polymorphism Humain)(문헌 참조; Dausset et al., 1990) 샘플의 경우, 이는 일정 시간 후, 모든 표현형 결과가 공개되어 여러 조사 결과를 조합함으로써 더욱 강화된다.
결과는 관련 연구들이 기계를 기본으로 한 연결 기법보다 더 우수한가에 대한 추가의 이유를 제공해준다. 이는 최적으로 분리한 이들 2가지 그룹을 사용하더라도, 변이 유전자의 총 수가 조금 다르다는 것을 보여준다(평균 10 대 12). 이는 가계에서 비교할 경우, 로드 스코어, 자손 쌍, 단순유형 관련 위험, 및 병에 걸린 피검자와 병에 걸리지 않은 피검자를 실제로 또는 함축적으로 비교하는 TDT 분석(문헌 참조; Spielman and Ewans, 1996)에서 발생하는 바와 같이, 차이가 훨씬 더 하다는 것을 시사한다. 한번에 단지 한 개의 유전자를 실험함으로써 문제가 해결되는 경우에는, 경계 로드 스코어 또는 p값에서 관련 유전자를 검지하기 위해 매우 다수의 피검자가 필요하다. 이의 예로서, 지금까지, 매우 다수의 가계 및 자손 쌍을 사용하더라도, 행동 질환에 관한 연결 연구의 대부분에서는 특이 유전자를 동정하지 못했다. 이는 350명 미만의 피검자를 사용하여 ADHD에 대한 20개의 특이 유전자, 알콜 오용/의존에 대한 15개의 특이 유전자를 동정하고 각각의 표현형에 대한 각 유전자의 상대적 중요도를 짐작할 수 있는 데이타를 제공하는 도 5 및 6의 결과와는 상충된다.
3. 보이지 않는 인종 계층의 문제
관련 연구에 대해 가장 빈번하게 언급되는 염려 중의 하나는 보이지 않는 인종 계층의 잠재적 문제이다. MAA 기법은 이러한 하기의 이유로 인해 이러한 염려를 최소화시킨다. 단일 유전자를 실험하는 경우에 보이지 않는 인종 계층이 작용할 수 있기는 하지만, 모든 유전자의 빈도가 동일한 방향으로 변할 것으로는 보이지 않는다. 실험되는 유전자의 수가 증가됨에 따라, 보이지 않는 인종 계층의 잠재적 영향은 줄어준다.
4. 다수 유전자 실험에 대한 논란
유전자 조사 및 관련 연구에서 종종 야기되는 항의 중의 또다른 하나는 충분한 유전자를 대상으로 할 경우, 이들 중 일부는 단지 우연히 유의적일 수 있다는 점이다. 이는 유전자를 한번에 한개씩 실험하고 종결점에서 p값이 0.05 미만인 경우에 특히 유효하다. 그러나, 부가적인 다중 관련 기법은 유전자 각각의 p값과는 무관하며, 대신 다른 유전자의 이면에서 유전자가 부가 또는 감쇄 방식으로 표현형의 r2값에 기여하는가를 요한다. 다인자성 질환의 이러한 특성을 강조함으로써, 기법은 본질적으로 또는 자연적으로 다수의 지원 유전자 실험을 도모한다. 이는 틱, LD 및 알콜 오용/의존 스코어에 대한 단일 r2값의 상하 변동에서 보여진다. 이는 수백가지 유전자를 가하여 최종 r2값을 계속해서 변화시킬 수 있음을 시사한다. 그러나, 실험되는 유전자가 많을수록 동정되는 부가 유전자의 수는 커지고 이러한 유전자의 하위세트가 이용되는경우 최종 r2값도 높아진다. 따라서, 한번에 한가지 유전자를 실험함으로써 실험되는 각각의 부가 유전자에 의해 파워가 손실되는 방법과는 달리, 부가적인 다수 관련 기법의 파워는 보다 많은 유전자를 실험함에 따라 증가된다.
5. 동시발병된 질환은 관련 유전자 세트를 이용한다
ADHD가 본 발명가들이 실험한 주요 표현형이기는 하지만, ADHD 유전자의 다수가 저항 장애, 행동 장애, 알콜 오용/의존, 약물 오용/의존, 흡연, OCD, 조병. 분열병질 행동 및 다른 대표적인 RDS 행동과 같은 관련 표현형에 대해 부가적인 효과를 나타낸다.
6. 동시발병된 질환은 상이한 유전자 세트를 이용한다
동시발병된 질환은 유사한 유전자 세트를 이용하는 것 이외에도, 상이한 유전자 세트를 사용하기 때문에 상이한 표현형을 가질 수 있다. 두가지 발견사항을 후자의 사실을 시시한다. 첫째, 부가 유전자 만을 사용하더라도, ODD, CD, LD, 틱 및 기타의 스코어에 대한 최종 r2값은 ADHD 스코어에 대한 r2값보다 더 낮다. 본 발명자들이 이러한 각각의 표현형에 대한 전체 유전적 기여도가 ADHD에 대한 것과 유사하다고 가정할 경우, 실험된 것 이외의 유전자는 r2값을 상당한 수준으로 높이는데 관여해야 한다. 이는 이러한 동시발병된 질환이 유전자를 공유할 뿐만 아니라 특유의 유전자를 사용한다는 사실을 나타낸다. 둘째, 부가 유전자 및 감쇄 유전자 둘다를 사용한 누적 r2값에 대한 직선 기울기는 동시발병된 질환이 상이한 유전자 세트 또는 상이한 유전형을 사용함을 보여준다. 예를 들면, MAOA 유전자는 ADHD 스코어에 대해 부가적인데 반해 알콜 오용/의존 스코어에 대해서는 감쇄적이다. 이는 MAOA 유전자가 ADHD 스코어보다 알콜 오용/남용 스코에 대해 중요도 낮다는 것을 시사한다.
7. 상이한 표현형은 상이한 유전형을 사용할 수 있다
상이한 유전자 세트를 사용하는 대안은 상이한 표현형은 상이한 유전자형을 사용할 수 있다는 것이다. 예로서, 대신에 알콜 오용/의존 스코어에서 덜 중요한 MAOA 유전자를 사용할 경우, 이는 상이한 유전자형을 이용할 수 있다. 추가의 예로서, 우울증 및 공격성은 종종 낮은 CNS 세로토닌 농도와 관련되는 반면(문헌 참조; Brown et al., 1982, Coccaro et al., 1989) 강박반응 행동은 CNS 세로토닌 또는 수용체 민감성 증가와 관련된다(문헌 참조; Insel et al., 1985). 따라서, 주어진 유전자형이 우울증/공격성과는 양의 상관관계를 갖지만 강박반응 행동과는 음의 상관관계를 갖는다는 것은 놀라운 사실이 아니다. 이러한 발견사항은 유전자 스코어링이 각 표현형에 따라 달라져야 하지 않는가하는 문제를 재기한다. 본 발명가들은 이를 수행하되 이러한 스코어링이 독립 피검자 세트에서 타당하도록 하였다.
8. 상이한 다형성의 사용
본 연구에서, 발명가들은 유전자 1개당 단지 하나의 형태를 사용하였다. 다른 다형태 또는 몇몇 다형태를 단일형태로 조합하여 사용할 경우 r2값이 증가될 수 있다. 따라서, 관찰된 총 r2값은 실질적으로 이러한 유전자의 각각의 표현형에 대한 기여도를 상당히 과소평가할 수 있다.
9. 상이한 표현형에서의 상이한 각각의 유전자의 비교 효과
MAA 기법의 가장 강력한 측면 중의 하나가 상이한 유전자의 상대적 중요도를 확인할 수 있는 능력이다. 이는 모든 유전자가 동일한 피검자 그룹에서 실험되기 때문에 가능하다. AR 유전자의 경우를 예를 든다. ADHD(도 5), ODD 및 CD 스코어에 대한 AR 유전자의 왼쪽에 인접한 r2곡선의 기울기의 증가는 모든 3가지 조건에서의 이들 유전자의 상대적 중요도를 나타낸다. 이와는 달리, AR 유전자는 감쇄적이며, 틱 및 LD 스코어에는 역할을 하지 않고 알콜 오용/의존 스코어에 대해서는 분명치 않다.
10. 상이한 표현형에서 상이한 유전자 그룹의 비교 효과
MAA 기술의 또다른 양상은 상이한 표현형에 대한 특이 신경전달자에 영향을 미치는 유전자 그룹의 중요한 역할을 확인하는 능력이다. 따라서, 아드레날린성 유전자의 4개 세트는 ADHD 스코어에서 중요한 역할을 담당한다. 상가(additive) 유전자를 기준으로 하여, 이들은 함께 총 r2스코어의 42% 편차를 설명한다. 이에 비해, 세로토닌작용성 유전자는 총 9.5%만을 설명한다. 이것은 ADHD에 있어서 노레피네프린 대사 결손을 강력히 암시하는 다수의 연구와 일치한다[참조: Halperin et al., 1997; Pliszka et al., 1996; Arnsten et al., 1996]. 이에 비해, 반대의 경향이 도관 질환에서 발견되었다. 여기서, 세로토닌작용성 유전자는 상가 유전자를 기준으로 하여 전체 r2스코어의 30% 편차를 설명하지만, 아드레날린성 유전자는 단지 13%만을 설명한다. 이것은 반사회적 행동에 있어서 중추 세로토닌 대사의 결손을 시사하는 다수의 연구와 일치한다[참조: Brown et al., 1982; Lidberg et al., 1985; Coccaro et al., 1997].
11. 관련성 연구에 대한 다중 단계 및 단일 유전자 연구의 공개에 대한 암시
MAA 기술의 결과는 관련성 연구가 다중 단계에서 수행되어져야 한다는 것을 시사한다. 첫번째 단계에 있어서, 유용할 수 있는 다형성의 종류 및 이들이 암호화되는 방법을 측정하기 위해서는 1회 1유전자(one-gene-at-a-time)의 예비 연구를 필요로 한다. 그러나, 본 발명자들은 단일유전자 연구에 대한 중요한 발견이 주어진 유전자의 다형성의 유전자형을 스코어링하는 방법임을 시사한다. 샘플의 크기에 따라, 심지어 p 값이 0.05를 초과하는 경우에도, 이 정보는 유용할 수 있다. r2＞ 0.005, 또는 r ＞ 0.07을 제공하는 대부분의 단일 관련성 연구는 부가성이기 때문에, N이 적절한 경우, 이것은 p＜0.05보다 오히려 공개용 표준일 수 있다.
제2 단계는 모든 가능한 후보 유전자를 사용하는 MAA 기술을 사용할 것이다. 이 결과는 도 5중의 부가 및 제거 유전자에 대한 주로서 표시되며, 모든 유전자의 비 선택적 봉입을 나타낸다. 제3 단계는 상가 유전자만을 사용한 것을 기준으로 하여 제공된 표현형에 대한 "새로운 모델"을 개발하는 것이다. 이것은 도 5중의 상가 유전자에 대한 주로서 나타낸다. 최종 단계는 새로운 상가 유전자를 확인하고 상가 유전자의 축적 세트를 기준으로 하여 생성된 "새로운 모델"을 연속적으로 시험 및 재시험하기 위한 독립적인 반복 연구일 것이다.
12. 알콜중독, 약물 남용 및 흡연에 대한 유전자
쌍둥이 및 양자 연구는 적어도 일부 형태의 알콜중독, 약물 남용 및 흡연이 강력히 유전성임을 분명히 지시하지만, 1회 1유전자 방법을 기준으로 하여 수반된 특이적 유전자의 확인은 현저히 효과적이지는 않았다. 사실, DRD2 유전자의 Taq A1 대립인자와 알콜 중독[참조: Blum et al., 1990b] 사이의 보고된 관련성의 복제 및 비-복제[참조: Noble, 1993; Blum et al., 1995b]의 조합은 관련성 연구 능력에 대한 회의론의 원인중 하나이다. 알콜 남용/의존성 스코어에 대한 MAA 기술의 사용 결과는 알콜 중독의 분자 유전학과 관련되는 다수의 문제를 통찰한다. 먼저, DRD2 유전자의 좌측으로 r2곡선의 급경사는 Taq A1/A2 다형성을 사용하는 DRD2 유전자가 이러한 객체 그룹의 알콜 스코어에서 중요한 역할을 담당한다는 것을 나타낸다. 그러나, 이것은 총 r2스코어의 10%만을 설명하고, 총 r2스코어는 단지 0.14이기 때문에, 이 유전자는 알콜 남용/의존성 스코어의 전체 편차중 단지 1.4%만을 설명한다. 이것은 상가 유전자의 명백한 전형이고, 1회 1유전자 방법을 사용하는 복제를 어렵게 하는 주요 이유이다. 둘째, 도파민생성, 세로토닌작용성 및 가바에르직 유전자 세트 모두는 알콜 스코어에서 중요한 역할을 담당한다. 셋째, MAA 기술의 능력은 매우 유의적인 최종 r2값(p†=7.5×10-6)에 의해 설명된다. 본 발명자들의 지식에 따라, 비교가능한 N의 경우, 이것은 1회 1유전자 방법을 사용하여 이미 보고된 모든 결과를 훨씬 초과한다. 넷째, 연구의 초점은 알콜 중독보다는 ADHD에 맞추어져 있으나, ADHD 및 알콜 중독(DRD1, DRD2, DAT1, HTT, HTR1A, DBH, ADRA2C, GABRB3, CNR1, NMDA 및 CRF)에 의해 공유되는 다수의 유전자는 알콜 중독에서의 높은 ADHD 빈도 및 ADHD에서의 높은 알콜 중독 빈도와 일치한다[참조: Loney et al., 1981; Cantwell, 1972; Alterman et al., 1983; Tarter, 1988; Biederman et al., 1995].
흡연의 결과는 DRD2 유전자의 강력한 효과를 나타낸다. 그러나, 이들 피검자는 DRD2 유전자[참조: Comings et al., 1991]와 자체로 관련되는 토레트 증후군을 갖기 때문에, 흡연과의 관련성은 피검자가 흡연자만인 것보다 향상될 수 있다. ADHD의 유전자에 대한 주요 초점에도 불구하고, 알콜 남용/의존성 스코어의 결과는 ADHD에 대해 확인된 다수의 유전자가 알콜 중독에 대한 후보 유전자인 것으로 문헌에서 이미 시사되었음을 나타낸다.
13. 단일 그룹의 피검자에서 다중 표현형의 연구
행동에 대한 유전자 연구에서 통상적인 전략은 공동-병적 상태가 거의 없거나 없는, "순수한" 질환을 갖는 피검자를 수집하고 진단을 받았거나 받지 않은 것으로 피검자를 양분하여 스코어링하는 것이다. 이러한 연구는 두가지 이유로 그 능력을 소실할 수 있다. 첫째, 다수의 공동-병적 상태를 갖는 피검자는 유전자 부하의 전반적인 수준이 보다 높아서 유전자 확인 능력을 증가시킬 것 같다. 둘째, 다양한 행동의 스크리닝은 다수의 상이한 질환을 동일한 그룹의 피검자에서 시험되도록 한다. 이것은 본 연구에서 설명된다. TS가 다수의 공동-병적 상태와 관련되기 때문에[참조: Comings and Comings, 1987a; Comings, 1995a; Millet et al., 1996], 모든 피검자 그룹에서 다수의 질환과 특이적으로 관련된 유전자를 시험할 수 있다. 이 결과는 상이한 표현형에 대한 유전자의 독특한 조합을 확인할 수 있음을 나타낸다. 이것은 다중의 DSM-IV 진단을 가능케 하고 고도의 공동-병적 상태를 갖는 단일 피검자 그룹에서 다중 정량 특성의 개발을 가능케 하기 위해 구조화된 인터부의 이용은 각각의 특정한 질환에 대해 다수의 DNA 데이터 베이스를 축적하는 것보다 다양한 질환에 대한 유전자 발견에 있어서 보다 효율적인 방법일 수 있음을 나타낸다.
14. 진단 및 예측가능성에 대한 위험 인자
폴리유전자 유전에 대한 통상적인 가정중의 하나는 단일 유전자 질환과는 대조적으로 관련된 유전자가 단지 위험 인자로서 작용하고, 유전자 시험을 진단 방식으로 이용할 수 없다는 것이다. 그러나, 유전자의 부가 효과에 의해 설명된 편차 %가 증가함에 따라서 r이 또한 증가하고, 이와 더불어 예측가능성도 증가한다. ADHD 스코어에 대한 0.37의 최종 r은 이러한 유전자 세트를 사용함으로써 ADHD 스코어의 예측가능성이, 유전 정보가 없는 것과 비교하여, 37% 이하임을 나타낸다. 보다 많은 유전자를 부가함에 따라서, 이러한 크기의 2배인 r 값이 수득될 수 있다. DNA 칩 기술의 이용가능성과 함께, 예비형성되어야 하는 다수의 유전자 시험은 더이상 문제가 되지 않는다. 도 7에 도시된 바와 같이, ADHD에 대한 DSM-IV 표준에 부합하는 것과 비교하여 ADHD의 어떠한 증상도 없는 피검자에 대한 다수의 관련 유전자의 분포 곡선이 다수의 중첩을 나타내지만, 존재하는 차이는 매우 현저하다. 다수의 상가 유전자의 2배 및 3배 배가는 결국 비-중첩 곡선을 크게 형성할 수 있다. 본 발명자들은 진단 능력이 부가된 유전자에 따라 증가할 것으로 생각한다.
15. 복제
결합 및 관련성 연구에 있어서 복제가 표준이기 때문에, 이것은 또한 MAA 기술의 복제에 대한 표준이어야 한다. 다수의 피검자에서의 편차, 중증도에 대한 프로밴드의 조성, 대조 그룹 대 피검자의 비율, 정량적 스코어의 범위 및 기타 인자가 모두 트이적 유전자의 효과와 독립적인 최종 r2값을 변화시킬 것으로 예상할 수 있다. 이러한 인자 이외에, 본 발명자들은 상이한 수준의 복제를 예상한다. 최고 수준은 동일한 세트의 유전자가 상이한 그룹의 피검자에서 부가성 또는 제거성이고 곡선의 경사가 유사한 것이다. 유사한 표현형을 생성하는 상이한 유전자의 능력이 폴리유전자 질환의 특성중 하나이기 때문에, 본 발명자들은 이러한 수준의 복제가 유사하지도 않고 예상할 수도 없을 것으로 예상하며, 상이한 연구는 상이한 유전자 세트 및 상이한 곡선 경사가 관련됨을 나타낸다. 이것은 별도의 샘플 시험에서 입증되었다(도 6).
복제에 대한 제2의 및 보다 실질적인 표준은 특정 그룹에 대한 상가 유전자중 전부가 아닌 대부분이 복제 그룹에 대해 부가성이고, 보다 많은 유전자가 포함됨에 따라서 r2값이 유의성 수준이 점차적으로 증가하지만 상이한 유전자에 대한 곡선 경사는 달라질 수 있는 것이다. 이 수준에서, 당해 유전자 그룹의 상대적인 중요성이 복제될 것으로 예상할 수 있다. 따라서, 본 연구는 아드레날린성 유전자가 ADHD에서 상대적으로 더욱 많이 중요하고 세로토닌작용성 유전자가 도관 질환에 있어서 상대적으로 더욱 많이 중요하다는 것을 나타내는 본 연구는 복제되어야 한다. 이것은 ADHD에서 노르아드레날린성 유전자의 중요성이 양족 샘플에서 복제된 별도의 샘플 시험에서 입증되었다. MAA 기술의 궁극적인 복제 수준은 폴리유전자 질환과 관련된 유전자의 확인을 가속화시키는 경우에 발생할 것이다.
16. 기술적 문제
부가적 다중 관련성 기술의 대부분의 중요한 양태가 포함되었지만, 강조할만한 몇가지 양태가 있다. 본 발명자들은 종량적 특성이 몇가지 이유로 인해 바람직할 것으로 생각한다. 대조 그룹은 피검자로서 동일한 성질에 대해 평가되어야 한다. 이것은 본 발명자들의 경험상 대조 그룹 및 피검자 모두가 다양한 스코어를 가질 수 있기 때문에 중요하다. 또한, 충분한 범위의 정량적 특성이 검사되는 경우, 분석력은 더욱 크다. 최대 능력의 경우, 대조 그룹의 수는 피검자의 수에 인접해야 하거나, 스코어가 낮은 피검자의 수는 스코어가 높은 수에 인접해야 한다.
최종 r 및 r2값은 독립적인 순서일지라도, 제거 유전자를 명백히 확인하기 위해서는 상가 유전자의 도입 순서를 변화시켜 최대 포지티브 관련성을 갖는 것을 먼저 도입해야 한다. 초기 유전자가 r 또는 r2값의 적절한 증가를 나타내지 않는다면, 제거 유전자를 확인하는 것은 어려울 것이다.
17. 치료학적 및 약리학적 징후
관련된 유전자를 확인하고 이들의 상대적인 중요성을 정량하는 능력에 기초하는 MAA 기술의 최종 양태는 치료학적 및 약리학적 간섭을 유도하는 이들의 잠재적인 능력이다. 예를 들면, 4개의 아드레날린성 유전자가 ADHD 스코어에 대한 최종 r2값의 40%을 설명하는 관찰은 아드레날린성 α2수용체에 작용하는 약물이 ADHD의 치료에 유용할 수 있음을 시사한다. 임상적 연구는 사실 ADHD의 치료에 있어서 클로니딘 및 구아니파신, 아드레날린성 α2수용체 길항제의 효과를 지지한다[참조: Hunt et al., 1985].
실시예 14
비만을 치료하기 위한 크롬 피콜리네이트 및 크롬 니코티네이트 식이 보충
본 연구에 있어서, 크롬 피콜리네이트가 주요 관심사이지만, 최상의 조건(운동 훈련과 조합하여)하에 시험된 크롬 니크티네이트에 대한 예비 데이타가 또한 유용할 수 있을 것으로 생각된다. 어린 비만 여성에 미치는 크롬 보충의 효과에 관한 본 연구는 2가지 목적을 갖는다. 첫번째 목적은 크롬 피콜리네이트 보충이 단독으로 체중 및 조성, 글로코즈 내성 및 혈장 지질을 바람직하게 변화시키는지의 여부를 측정하고 이들 효과가 운동 훈련에 따라 증가될 수 있는지의 여부를 측정하기 위한 것이다. 두번째 목적은 운동 훈련과 조합된 크롬 니코티네이트 보충 효과에 대한 데이타를 제공하기 위한 것이다.
방법
피검자는 43명의 건강한 사무직의 비만 여성이다. 비만에 대해 다수의 통계학적 컷-오프 정의가 사용되지만, 본 연구의 목적상 비만은 어린 여성의 권장된 체지방 비율보다 체지방이 20 내지 25% 높은 것으로 정의한다[참조: Blackburn et al., 1994]. 본 발명자들은 본 발명자들의 모집단 부분이 단지 약간의 비만임을 인식한다. 시작하기에 앞서, 질문서를 이용하여 피검자의 건강 상태 및 활성 패턴을 측정한다. 어떠한 피검자도 건강 문제를 기록하지 않았고, 이러한 상태에 대한 약물 치료도 없었다. 연령은 18 내지 35세의 범위이고, 평균 24.4±0.70세이다. 최기 중량은 50.8 내지 96.1kg이며, 평균 71.3±1.9kg이다. 정수학적 칭량에 의한 측정한 체지방(%)은 25.0% 내지 45.0% 범위이고, 평균 33.0%±0.91%이다. 초기의 최대 VO2값은 1.53 내지 3.3L/분이고, 평균 값은 2.38±0.13L/분이다. 각각의 피검자에게 참가와 관련된 잠재적인 위험성 및 잇점을 알려준 후 정보화된 동의 서류에 서명하게 하였다. 본 연구는 텍사스 대학교의 Institutional Review Board에 의해 승인되었다.
실험 설계
피검자를 4개의 처리 그룹중 하나에 무작위로 지정한다: 운동 훈련 부재하의 크롬 피콜리네이트 보충(CP); 위약과 함께 훈련 운동(E/P), 크롬 피콜리네이트 보충과 함께 운동 훈련(E/CP) 및 크롬 니코티네이트 보충과 함께 운동 훈련(E/CN). 처리 기간은 9주이다. 생리 주기 단계의 효과는 조절하지 않는다. 시험전 및 시험후를 예정된 28일 생리 주기의 상이한 단계에서 수행하지만, 경우에 따라 이러한 효과는 모든 연구 참가자에 대해 무작위로 하여 데이타에 영향을 주지 않아야 한다.
크롬 보충물 및 위약 정제는 샤클린 인코포레이티드[참조: Shaklee, Inc., USA; San Francisco, CA]가 제조한 것이며, 각각 100개의 정제로 이루어진 암호화된 병에 넣어 본 연구자에게 보내졌다. 피검자에게는 크롬 피콜리네이트(200㎍), 크롬 니코티네이트(200㎍) 또는 위약(불활성 성분)을 함유하는 16개의 정제가 매주 제공되었다. 피검자에게는 처리 전체 및 후-시험 기간 동안 매일 아침 및 저녁에 하나의 정제를 섭취하여 크롬 보충물을 섭취한 피검자가 1일 400㎍의 용량을 섭취하도록 구두로 처방한다. 피검자에게 매주 사용하지 않은 정제를 반환하도록 한다. 컴플라이언스는 반환된 정제를 계수하여 측정한다. 컴플라이언스에 대한 문제는 없었다.
운동 훈련은 몇몇 구성 요소와 함께 교차-훈련 프로그램으로 이루어진다. 첫번째 구성 요소는 에어로빅 단계이며, 이는 높이 12 내지 24인자의 벤치에서 잘 알려진 음악을 이용하는 에어로빅 댄싱 형태로서, 강사는 전신 에어로빅 운동을 제공하기 위해 고안된 일련의 동작을 통해 참가자를 유도한다. 각각의 운동 피검자는 이러한 1시간 반에 1주일에 2회 참석하고, 공인된 강사가 지도한다. 피검자에게는 그들 자신의 벤치 높이를 선택하게 한다. 연구가 진행됨에 따라, 강사는 점차적으로 운동 강도를 증가시킨다.
제2 구성 요소는 사이클이다. 사이클 운동은 최대 심박동수(초기의 최대 VO2시험중에 측정함)의 75 내지 80%의 목적하는 심박동수에서 30분 동안 1주 2회 수행한다. 일반용 호흡자전거(Universal Gym Equipment, Inc., Cedar Rapids, Iowa)가 사용되었다. 목적하는 심박동수는 각 기간의 시작부에 측력계로 프로그래밍하고, 목적하는 심박동수를 유지하기 위해 내성을 조절하는 적재 컴퓨터로 운동중에 모니터한다.
세번째 구성 요소는 내성 훈련이다. 내성 훈련은 The Rowercise Fitness System(TruTrac Therapy Products, Inc., Temecula, California)를 사용하여 1주 2회 수행한다. 내성이 전기적 차단 장치에 의해 설정된 5개의 분리된 기계가 사용된다. 이것은 효능제/길항제 근육 그룹으로부터 집중-유일 수축을 제거하는 "이중 포지티브" 시스템이다. 사용된 5개의 기계는 상부 및 하부 신체의 모든 주요 그룹을 운동한다. 각 피검자의 최대 강도는 부하가 더이상 들어올리지 못할 때까지 각각의 반복(10 lb 증가)에 따라 정차적으로 무거운 중량을 들어올림으로써 초기에 측정한다. 최대 강도가 측정되면, 운동 중량을 최대 강도의 50%로 자동적으로 설정하고, 피검자에게 각 기계에 대해 15회 반복의 3세트로 이루어진 운동을 지시한다. 이어서, 피검자에게는 집중 수축당 대략 15초의 보측 광선을 허용한다. 세트간의 휴식 시간은 25 내지 28초이다. 기계 사이의 시간은 엄격하게 조절하지는 않는다. 피검자에게는 15회 반복의 3세트를 완성함과 동시에 들어올린 중량을 증가시키기 위해연구 전체에 걸쳐 용기를 주고, 이러한 증가를 기록한다. 또한, 피검자에게는 20회의 "복부 처리"(일어섬)의 3세트를 수행하도록 지시한다.
모든 훈련 기간을 1명 이상의 조사자가 감독한다. 출석, 사이클 운동중의 심박동수, 및 내성 훈련 기준(들어올린 중량 및 반복회수 및 세트의 완성)을 기록한다. 피검자에게 연구 과정중에 이들의 식이를 변화시키지 말 것을 요청한다.
실험 프로토콜
처리를 개시하기전의 주 동안에, 감작성이 ±200g인 Health-o-Meter 저울[Continental Scale Corporation, Bridgeview, IL)을 사용하여 피검자의 체중을 2회 별도로 칭량하고, 정수학적 중량화에 의해 신체 조성 분석을 수행한다[참조: Behnke et al., 1974]. 최대 VO2는 변형된 Burke 프로토콜을 사용하여 트레드밀상에서 측정하고, 본 발명자들의 실험을 위해 이미 기술된 바와 같이 흡입 용적 및 배출 기체를 측정한다[참조: Yaspelkis et al., 1993]. 단식 혈액 샘플을 별도의 2일에서 채취하고, 경구 글루코즈 내성 시험(OGTT)를 이하 기술되는 바와 같이 수행한다.
9주의 처리 기간 동안, 상기 상세히 설명한 바와 같이 보충 및 훈련 운동 그룹에게 투여한다. 처리후 9주에서, 모든 처리후 측정을 반복한다. 시험물은 처리전 및 처리후 모두에서 동일한 순서로 투여된다. 보충 및 운동 훈련은 시험후 기간 전체에서 계속한다. 운동 훈련에 관련된 모든 피검자는 후-OGTT 전에 2일 동안 에어로빅 단계 기간에 참가하였고, 시험 전날 휴식하였으며, 마지막 운동 기간과 OGTT 사이는 약 40시간이다.
샘플 수집 및 분석
카페인 또는 니코틴을 포함하지 않는 호르몬 및 기질 분석용 혈장은 단식후 12시간 경과하여 오전 7시 내지 9시에서 수득한다. 혈액(10ml)을 주전 정맥의 정맥천자에 의해 수집한다. 경구 글루코즈 부하에 대한 글루코즈 및 인슐린 반응의 측정은 처리전 혈액 샘플의 하나로서 동일한 날에 수행한다. 피검자는 덱스트로즈 100g을 함유하는 실온의 음료(Tru-Gly 100 오랜지/카보네이트화된, 10oz. Fischer Scientific, Pittsburgh, PA)를 섭취하였고, 혈액 샘플(3ml)은 섭취전 주전 정맥내에서 및 섭취후 15분, 30분, 60분, 90분, 120분 및 180분에서 21게이지의 내재하는 정맥 카테터로부터 수득한다.
모든 혈액 샘플을 250ml의 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)(Sigma Chemical Company, St. Louis, MO)로 항-응고시킨다. 기저 샘플로부터의 전체 혈액(200ml)의 분취량은 친환성 컬럼, 열량측정, 종점 절차(Sigma Diagnostics, St. Louis, Mo.)에 의한 글리코실화된 헤모글로빈 측정에 사용된다. 잔류하는 샘플을 15분 동안 1,000×g에서 원심분리하고, 혈장을 제거하여 후속 분석을 위해 -20℃에서 동결시킨다. 인슐린 농도는 방사선면역검정(ICN Biomedicals, Inc., Costa Mesa, CA)에 의해 측정한다. 혈장 샘플을 글루코즈, 트리글리세라이드 및 전체 콜레스테롤(Sigma Diagnostics, St. Louis, MO.)에 대해 효소 분석에 의해 분석한다. HDL-C는 LDL-C 및 VLDL-C(Sigma Diagnostics, St. Louis, MO)를 침전시킨 후 효소에 의해 측정한다. LDL-C는 하기 등식으로 계산한다: LDL-C=(전체 콜레스테롤)-(HDL-D)-(트리글리세라이드/5)(Sigma Diagnostics, St. Louis, MO). 표준물을 각각의 분석과 함께 작동하여 일관성을 입증한다. 모든 샘플은 2중으로 시험하고, 각 피검자의 샘플을 연속적으로 시험한다.
통계학적 분석
다중변이체 ANOVA는 모든 처리 그룹에 대해 전 및 후 값에 대한 각각의 변수에 대해 시험한다. OGTT에서의 시점뿐만 아니라 전 및 후 값은 반복된 측정치로서 처리힌다. 유의적인 F 값이 관찰(p＜0.05)되는 경우, 추가의 분석을 수행하여 이들 변화가 발생하는지를 측정한다. 선행 유의차(p＜0.05)가 추가 시험의 기준으로서 사용된다. 그 다음의 시험은 데이타의 성질에 따라 측정 ANOVA 또는 피셔 PSLD(p＜0.05)을 반복하였다. 이러한 낮은 엄격성을 사용하여 소형의 샘플 크기 및 이에 따른 통계학적 설계의 제한된 능력에 기인하는 타입 II 오차의 발생 빈도로부터 보호한다. 분석은 Statistic Package for Social Sciences(SPSS) 소프트웨어, 버젼 6.0(매킨토시용)을 사용하여 수행한다.
결과
훈련 운동에 참가하는 피검자는 90.0%(±2.2)의 지시된 훈련 기간을 완결하였다. 처리 그룹 사이에서는 어떠한 컴플라이언스도 없었다. 사이클중의 심박동수는 일관되게 최대 HR의 75% 내지 80%이었다. 에어로빅 단계중의 심박동수는 매우 높았고, 분당 박동수는 175회 내지 190회이다(최대 HR의 85% 내지 95%). 최대 VO2는 모든 처리 그룹에서 유의적으로 변화하지 않았다.
처리한 후, CP 그룹에서는 체중이 현저히 증가하였고, E/CN 그룹에서는 체중이 현저히 감소하였다. 체지방(%), 지방 덩어리 또는 지방-비함유 덩어리는 유의적 변화가 없었다. E/P 그룹에서의 지방-비함유 덩어리는 처리전 및 처리후 모두에서 다른 모든 그룹에서보다 현저히 높았다. E/P 그룹에서 비-현저하게 높은 초기 중량은 거의 전적으로 보다 큰 지방-비함유 덩어리에 기인할 수 있다는 것은 놀라운 것이다.
처리전 및 처리후의 기조 혈장 글루코즈 또는 인슐린 수준에서는 유의차가 없었다. 또한, 글리코실화된 헤모글로빈은 처리한 후에 변화하지 않았다. 9주의 처리 기간 동안 각각의 처리 그룹에 대한 처리전 및 처리후의 글루코즈 내성과 인슐린 반응 곡선을 3시간 경구 글루코즈 내성 시험으로부터 도식화한다. 피검자에게는 크롬 보충(CP), 위약을 사용한 운동 훈련(E/P), 크롬 피콜리네이트(E/CP), 또는 크롬 니코티네이트를 사용한 운동 훈련(E/CN)을 제공한다.
크롬 보충(CP), 위약을 사용한 운동 훈련(E/P), 크롬 피콜리네이트를 사용한 운동 훈련(E/CP), 또는 크롬 니코티네이트를 사용한 운동 훈련(E/CN)을 제공한 피검자에서 처리전 및 9주 처리후의 3시간 경구 글루코즈 내성 시험으로부터 글루코즈 내성 곡선 또는 글루코즈 곡선하의 면적의 비교는 모든 그룹에 있어서 현저한 처리 효과를 나타내지 않았다. 마찬가지로, CP(p=0.433), E/P(p=0.087), 또는 E/CP(p=0.110) 처리에 따른 인슐린 반응 곡선에서 유의적 증가도 없었다. 그러나, E/CN 처리후에는 경구 글루코즈 부하후의 60, 90 및 120분에서 인슐린 반응이 현저히 감소하였는데, 이는 전체 인슐린 반응 곡선에서 유의적 감소를 나타냈다(p=0.041). E/CN 처리에 대한 인슐린 반응 곡선하의 면적은 훈련후에 현저히 감소하는 것으로 밝혀졌다. 처리전 및 처리후 샘플 사이의 트리글리세라이드, 전체 콜레스테롤, LDL-C 및 HDL-C의 경우 유의차는 발견되지 않았다.
논의
본 발명자들의 연구는 어린 비만 여성에 있어서의 크롬 피콜리네이트 보충, 운동 훈련 또는 이들 둘다의 효과를 비교하였다. 시험관내 연구는 크롬 니코티네이트가 또한 이들 위험 인자를 변화시키는데 효과적일 수 있음을 시사하기 때문에, 데이타는 또한 운동 훈련과 조합하여 크롬 니코티네이트 보충 효과에 대해 수집되었다.
체중은 처리한 후의 CP 그룹에서 현저히 감소하였다. 이것은 크롬 피콜리네이트가 종종 중량 감소에 기인하여 촉진되기 때문에 중요한 발견이다. 본 발명자들의 결과는 운동의 부재하에 크롬 피콜리네이트 보충이 중량 감소을 유발하는데 있어서 비효과적일 수 있을 뿐만 아니라 다시 체중을 증가시킬 수 있음을 나타낸다. 체중 증가는, 피검자의 상이한 유전형 패턴뿐만 아니라 비조절된 식이 및 활성 팬턴에 기인하여[즉, DRD2 A1 대 DRD2 A2 대립인자의 캐리어), 크롬 보충의 선행 연구에서 관찰되지 않았다[참조: Kaats et al., 1991; Page et al., 1991; Riales, 1979]. 또한, 본 발명자들의 피검자 모집단(어린 비만 여성)은 사전에 연구되지 않았으며; 이는 발견의 차이를 설명할 수 있다. 유사하게는, 본 연구에서 투여된 크롬의 양(400㎍/d)은 여성에 의해 사전에 연구된 양의 2배량이다. 이 농도에서 크롬은 중량 증가에 대한 촉진 효과를 가질 수 있는 반면, 낮은 농도에서는 억제 효과를 가질 수 있다.
E/P 또는 E/CP 그룹에서는 체중의 유의적 변화가 관찰되지 않았는데, 이는 중량 감소가 종종 9주의 운동 훈련에서 관찰되지 않음을 나타내는 선행 연구를 입증한다[참조: Stefanick, 1993]. 그러나, E/CN 그룹에서는 체중이 현저히 감소하였다. 본 발명자들의 지식에 따르면, 이것은 운동 훈련과 조합된 크롬 니코티네이트 보충이 체중 손실의 효과적인 수단일 수 있음을 시사하는 최초의 연구이다.
처리후 상대적인 체지방, 지방 덩어리, 또는 지방-비함유 덩어리는 유의적 변화가 없었다. 체중과 관련하여, 본 연구 결과와 선행 연구 결과의 불일치는 연구 모집단, 비조절된 식이 및 활성 패턴, 및/또는 크롬의 투여량의 차이에 기인할 수 있다.
최대 VO2수준은 훈련 기간 후에 현저히 감소하지는 않았다. 이것은 훈련의 특이성 결여에 기인하였다: 처리전 및 처리후의 최대 시험은 트레드밀상에서 수행되었고, 훈련은 사이클 및 에어로빅으로 이루어진다. 또한, 훈련 프로그램의 내성 구성 요소는 에어로빅 변화를 차단 또는 감소시킬 수 있다.
기저 글루코즈 수준은 모든 처리 그룹에서 현저히 변화하지 않았다. 이 결과는 정상-혈당성 모집단에서 크롬 보충[참조: Abraham et al., 1992; Wilson et al., 1995] 및 운동 훈련[참조: Wallberg-Henriksson, 1992]의 다른 연구와 일치한다. 경구 글루코즈 부하에 대한 혈장 글루코즈 수준의 반응은 E/P 그룹과 비교하는 경우 처리전 및 처리후 둘 다의 CP 그룹에서 현저히 높았다. 그룹의 평균은 지방-비함유 덩어리와 곡선하의 면적 사이의 역관계를 암시하는데, 보다 큰 지방-비함유 덩어리는 절대량의 글루코즈를 보다 신속히 처리한다는 것을 시사한다. 그러나, 개개의 데이타는 이들 두 인자 사이의 약한 상관관계를 나타냈다(r=-0.26).
경구 글루코즈 부하에 대한 글루코즈 반응은 처리 효과가 관찰되지 않았다. 기저 글루코즈 수준과 관련하여, 경구 글루코즈 부하후에 피검자는 초기에 정상의 글루코즈 수준을 나타냈다. 6주에 걸친 혈장 글루코즈 수준을 나타내는 글리코실화된 헤모글로빈은 처리후에 변화하지 않았다. 초기에 정상 범위내에 포함되는 기저 인슐린 수준은 처리후에 모든 그룹에서 현저히 변화하지 않았다.
경구 글루코즈 부하에 대한 인슐린 반응은 처리후 E/CN 그룹에서 현저히 감소하였다. 인슐린 반응의 향상은 과혈당증 피검자에 의해 이미 관찰되었다[참조: Djordjevic et al., 1995]. 인슐린 반응의 어떠한 유의적 변화도 다른 운동 훈련된 그룹에서 관찰되지 않았는데; 이는 운동 훈련에 따른 감소가 이미 보고되어 있기 때문에 예상하지 못했다[참조: Heath et al., 1983; Mikines et al., 1989; Sharma, 1992; Wallberg-Henriksson, 1992]. 그러나, 이러한 감소는 단기간 유지되는 것으로 발견되었고[참조: Heath et al., 1983; Mikines et al., 1989]; 따라서 이들 피검자에서 글루코즈 도전에 대한 감소된 인슐린 반응을 검출하는 본 발명자들의 무능력은 향상된 인슐린 작용의 소실에 기인할 수 있다. E/P 및 E/CP 그룹에서 인슐린 작용에 미치는 운동 훈련 효과의 결핍에 대한 원인이 무었이든지간에, 이 결과는 운동 훈련과 크롬 니코티네이트의 조합이 유익할 수 있음을 시사한다.
기저 혈장 지질은 처리에 의해 변화하지 않았다. 이것은, 변화가 현저하지는 않지만, 초기 지질 수준이 비정상인 소수의 피검자가 처리후에 정상화 방향으로 이동되었음에 주목하였다.
요약하면, 운동 연습의 부재하에 고도의 크롬 피콜리네이트 보충은 어린 비만 여성에서 현저한 중량 증가를 유발하였지만, 크롬 니코티네이트 보충과 조합된 운동 훈련은 현저한 중량 감소 및 경구 글루코즈 부하에 대한 낮은 인슐린 반응을 포함하여 몇몇 잠재적으로 유익한 변화를 나타냈다. 본 발명자들은 크롬 피콜리네이트의 높은(400㎍/d) 보충량이 어린 비만 여성에서 중량 감소를 위해 금기시된다고 결론지은 반면, 크롬 니코티네이트 보충과 조합된 운동 훈련은 위험 인자 변형을 통해 CAD 및 NIDDM에 대한 일부 보호를 제공함에 있어서 운동 훈련 단독보다 더욱 유익할 수 있다고 결론지었다.
크롬 보충은 체중 및 조성, 기저 혈장 호르몬 및 기질 수준, 및 경구 글루코즈 부하에 대한 반응을 포함하여 관상 동맥 질환 및 비-인슐린 당뇨병에 여러가지 위험 인자를 초래할 수 있다. 연구는 어린 비만 여성에서 이들 위험 인자에 대해 운동 훈련의 존재 또는 부재하에 1일 400㎍의 크롬 효과를 검사하였다[참조: Grant et al., Med. and Sci. Sports and Exercise, 29: 992-998, 1997]. 크롬 피콜리네이트(CP) 보충은 이 모집단에서 현저한 중량 증가를 나타낸 반면, 크롬 니코티네이트(CN) 보충과 조합된 운동 훈련은 현저한 중량 감소를 나타냈고 경구 글루코즈 부하에 대한 인슐린 반응을 저하시켰다. 본 발명자들은 고도의 크롬 피콜리네이트 보충이 어린 비만 여성에 있어서 중량 감소를 위해 금기시된다고 결론지었다. 더욱이, 본 발명자들의 결과는 크롬 니코티네이트 보충과 조합된 운동 훈련이 특정한 CAD 및 NIDDM 위험 인자의 변형을 위해 운동 훈련 단독보다 더욱 유익할 수 있음을 시사한다.
처리후에 CP 그룹에서는 체중이 현저히 증가하였고 운동한 CN 그룹에서는 체중이 현저히 감소하였다(P=0.05 이상). 체지방(%), 지방 덩어리, 또는 지방-비함유 덩어리에서는 현저한 변화가 없었다. 운동한 위약 그룹의 지방-비함유 덩어리는 처리전 및 처리후 둘다의 모든 다른 그룹에서보다 현저히 높았다. 더욱이, CP 그룹과는 달리, 운동한 CN 처리는 60분, 90분 및 120분에서 인슐린 반응의 유의적 감소를 나타냈다. 경구 글루코즈 부하후에는 전체 인슐린 반응 곡선에서 유의적 감소가 나타났다(P=0.041).
본 연구 데이타는 운동 훈련의 부재하에 고도의 크롬 피콜리네이트 보충이 어린 비만 여성에서 현저한 중량 증가를 유발하는 반면, 크롬 니코티네이트 보충과 조합된 운동 훈련이 현저한 중량 감소 및 경구 부하에 대한 낮은 인슐린 반응을 포함하여 몇몇 유익한 변화를 초래한다는 것을 시사한다. 이들 데이타는 크롬 피콜리네이트의 높은(400㎍ d-1) 보충량의 사용이 어린 비만 여성의 중량 감소를 위해 금기시되는 반면, 크롬 니코티네이트 보충과 조합된 운동 훈련이 운동 단독보다 중량 감소의 측면에서 더욱 유익할 수 있음을 시사한다. OB/유전자 및 DRD2 유전자의 조합된 대립인자 빈도는 어린 비만 여성에서 22%와 같이 많은 비만성 편차를 설명하고, 이러한 유전자형은 당해 모집단에 특이적인 중량 감소에 대한 크롬 염의 효과에 영향을 주어 사람에 있어서 중량 감소에 대한 크롬 효과를 발생시킬 수 있다[참조: Comings, 1997]. 암모늄 니코티네이트 및/또는 크롬 피콜리네이트와 같은 크롬 염을 사용하여 표 4에 기재된 바와 같은 RDS 관련된 질환 및 특히 표 6에 기재된 바와 같은 비만과 관련된 질환을 치료하기 위한 조성물의 보충이 중량 감소의 유지를 보조할 수 있을 것으로 생각된다.
실시예 15
크롬 피콜리네이트는 TAOI 도파민 D2수용체 A2 대립인자의 작용에 의해 신체 조성의 변화를 유도한다
방법
본 연구에 있어서, 본 발명자들은 표준 PCRTM기술[참조: Blum et al., 1997]을 이용하여 도파민 D2수용체(DRD2) 및 도파민 전달 유전자(DAT1) 모두에 대해 100명의 피검자를 유전자형으로 나누었다. 피검자는 밀도계측기를 사용하여 체중 및 체지방(%)을 평가한다. 피검자를 문헌[참조: Kaats, et al., 1998]에 의해 개발된 방법에 따라 위약 그룹과 크롬 피콜리네이트(CrP) 그룹(일당 400mg)으로 나눈다.
결과
문헌 대조에 있어서, TaqI DRD2 A1 대립인자는 714명의 피검자에서 26% 존재하고(185/714), 매우 잘 평가된 수퍼 대조 그룹의 30명에서 3.3% 존재한다(1/30). Chi Square 분석은 이들 두 대조 그룹 그룹 사이에 유의차를 나타냈다(p＜0.006).
DRD2 A1 대립인자는 체지방이 28% 이상인 비만 피검자에 67.4%(58/86) 존재하고; 체지방이 28% 이상인 비만 남성에 61.5%(8/13) 존재하며, 체지방이 28% 이상인 비만 여성에 68.5%(50/73) 존재한다. DRD2 A1 대립인자는 체지방이 34% 이상인 비만 피검자에 65.3%(49/75) 존재하고; 체지방이 34% 이상인 비만 남성에 62.5%(5/8) 존재하며; 체지방이 34% 이상인 비만 여성에 65.7%(44/67) 존재한다. DAT1 10/10 대립인자는 91명의 대조 그룹 피검자의 37.4%(34/91)에 존재하고, 체지방이 28% 이상인 비만 피검자의 비만 피검자의 47.7%(41/86)에 존재하며, 체지방이 28% 이상인 비만 남성의 38.5%(5/13)에 존재하고, 체지방이 28% 이상인 비만 여성의 49.3%(36/73)에 존재한다. DAT1 10/10 대립인자는 체지방이 34% 이상인 비만 피검자의 46.7%(35/75), 체지방이 34% 이상인 비만 남성의 37.5%(3/8) 및 체지방이 34% 이상인 비만 여성의 47.8%(32/67)에 존재한다. Chi Square 분석은 문헌 또는 수퍼 대조 그룹과 비교하여 TaqI DRD2 A1 대립인자와 병적 비만의 유의적 관련성을 나타냈다. 표 67은 유의적 관련성이 문헌 대조 그룹(Chi Square=62.6, df=1, p=＜0.0001)과 비교하여 체지방이 28% 이하인 남성 및 여성 모두; 및 수퍼 대조 그룹(Chi Square=36.6, df=1, p=＜.0001)에 대해 발견되었음을 보여준다. 유의적 관련성이 문헌 대조 그룹(Chi Square=50.6, df=1, p=＜.0001)과 비교하여 체지방이 34% 이하인 남성 및 여성 모두; 및 수퍼 대조 그룹(Chip Square=33.0, df=1, p=＜.0001)에 대해 발견되었다. 체지방이 28% 이하인 남성에 대한 효과를 문헌 대조 그룹(Chi Square=8.31, df=1, p=.004) 및 수퍼 대조 그룹(Chip Square=18.6, df=1, p=＜.0001)과 비교하고; 체지방이 28% 이하인 여성에 대한 효과를 문헌 대조 그룹(Chip Square=57.34, df=1, p=＜.0001) 및 수퍼 대조 그룹(Chip Square=36.11, df=1, p=＜.0001)과 비교한다. 체지방이 34% 이하인 남성에 대한 효과를 문헌 대조 그룹(Chip Square=5.46, df=1, p=.02) 및 수퍼 대조 그룹(Chi Square=16.6, df=1, p=＜.0001)와 비교하고; 체지방이 34% 이하인 여성에 대한 효과를 문헌 대조 그룹(Chip Square=46.73, df=1, p=＜.0001) 및 수퍼 대조 그룹(Chi Square=32.38, df=1, p=＜.0001)과 비교한다. 대조적으로, 이들 병적 비만 모집단에서 10/10 유전자형을 포함하는 DAT1 유전자에 대한 모든 대립인자 조합에 대한 관련성도 발견되지 않았다. 체지방이 28% 이하인 남성 및 여성에 대한 효과를 문헌 대조 그룹(Chi Square=2.27, df=1, p=.32)와 비교하였고, 체지방이 28% 이하인 남성에 대한 효과를 문헌 대조 그룹(Chip Square=.02, df=1, p=.89)와 비교하였으며, 체지방이 28% 이하인 여성에 대한 효과를 문헌 대조 그룹(Chip Square=2.73, df=1, p=.089)와 비교하였다. 체지방이 34% 이하인 남성 및 여성에 대한 효과를 문헌 대조 그룹(Chi Square=1.75, df=1, p=.185)와 비교하였고, 체지방이 34% 이하인 남성에 대한 효과를 문헌 대조 그룹(Chi Square=.01, df=1, p=.96)과 비교하였으며, 체지방이 34% 이하인 여성에 대한 효과를 문헌 대조 그룹(Chi Square=2.02, df=1, p=.16)과 비교하였다.
a=괄호는 비율(%)을 나타낸다.
b=34/91=37.4%
a=괄호는 비율(%)을 나타낸다.
b=1/30=3.3%
논리 퇴화 분석으로 명명된 통계학적 기술을 사용하여 체지방이 34% 이상인 수퍼 대조 그룹과 모든 경우를 비교하면, DRD2 A1 대립인자는 통계학적으로 유의적인(Chi Square=43.47, df=1, p＜.0001) 45.9%의 편차를 설명한다. 대조적으로, 문헌 대조 그룹과 비교하여 DAT1(10/10 대립인자)는 3%의 편차를 설명하며 연구 모집단에서 편차에 대해 통계학적으로 유의적인 인자가 아니다.
CrP 데이타와 관련하여, 샘플을 2개의 독립된 그룹, 즉 A1/A1 또는 A1/A2 대립인자를 갖는 그룹 및 A2/A2 패턴만을 갖는 그룹으로 나눈다. 이들 그룹 각각을 위약 및 다양한 중량 변화 측정을 위한 처리 수단 사이의 차이에 대해 별도로 시험한다. 이러한 측정은 지방 중량 변화 비율, 지방 중량의 변화, 체중의 변화, 지방 비함유 덩어리의 변화, 지방 중량의 변화율(%), 체중 조성 지수 및 체중 변화(kg)의 계산으로 이루어진다. 위약과 처리 그룹 사이의 평균차는 독립적인 그룹 t-시험을 사용하여 통계학적으로 시험한다. 통계학적 유의성은 p=0.05에 알파 표준을 설정함으로써 이들 비교에 대해 결정한다. 0.05보다 작은 임의의 p 값은 위약과 처리 그룹 사이에 통계학적으로 유의차를 나타내는 것으로 간주한다.
T 시험 분석은 DRD2 A2 대립인자의 캐리어가 DRD2 A1 대립인자 캐리어보다 CrP의 효과에 대해 더욱 반응성임을 나타냈다. 지방 중량의 변화(p＜0.032), 체중의 변화(p＜0.011), 중량의 변화율(%)(p＜0.035) 및 체중 변화(kg)(p＜0.012)의 측정치는 모두 유의적인 반면, DRD2 A1 대립인자를 보유하는 피검자에서는 어떠한 파라미터에 대한 유의성도 발견되지 않았다.
논의
이들 결과는 도파민생성 시스템, 특히 D2수용체의 밀도가 중량 감소 및 체지방의 변화와 관련하여 CrP의 현저히 상이한 치료 효과를 제공한다는 것을 시사한다. 이것은 과식과 DRD2 유전자의 A1 대립인자간의 관계를 고려할 때[참조: Blum et al., 1995] 유의적인 것이다. 본 발명자들의 견해는 A2 DRD2 캐리어의 포지티브 반응성이 CrP의 포지티브 대사 효과를 보유하지만, 대조적으로 탄수화물 탐식의 증가로 인해 A1 DRD2 캐리어가 중량 감소 및 체지방 변화에 미치는 CrP의 효과를 차단한다는 것이다. 이들 데이타는 추가로 A1 DRD2 캐리어에서와 같이 아미노산 전구체 치료와 함께 다른 크롬 염으로서의 CrP의 조합이 감소된 갈망 및 현저한 중량 감소를 나타내야 한다는 것을 시사한다[참조: Blum et al., 1997]. 더욱이, 본 발명자들은 신체 조성과 관련하여 CrP 투여에 의해 현재 관찰된 혼합 효과가 처리전에 유망한 피검자를 유전자형으로 나눔으로써 해결될 수 있음을 제안한다. 크롬 피콜리네이트 또는 니코티네이트가 관찰된 효과를 가지는 이유는 크롬 염이 주요 대사 파라미터에 영향을 미치는 반면, 아미노산이 하이포도파민 결핍증에 영향을 주어 사탕에 대한 갈망을 감소시킨다는 것이다.
실시예 16
주의 과정의 향상을 위한 아미노산 및 약초 조성물: 주의-결핍성 과활성 질환에서의 전위 효과
본 발명자들은 사람에 있어서 도파민 D2수용체 유전자의 다형성과 뇌 전기생리학적 이상 사이의 관련성을 관찰하였다. 이와 관련하여, 증가된 선형 기울기 분석은 DRD2 A2 유전자형 및 공동-병적 물질 사용 질환(SUD; Substance Use Disorder)[p＜0.0001]과 비교하여 DRD2 A1 대립인자의 존재하에 시험-관련된 전위(EP)의 현저히 악화되는 효과를 나타냈다. 관련된 유발 전위의 P300 파의 감소된 진폭 및 잠복기는 알콜 및 약물 의존성과 오랜 동안 관련되어 왔다. 또한, 본 발명자들은 P300 잠복기의 현저한 연장이 3개의 위험 인자: 즉 (1) 양친의 SUD, (2) 화학적 의존성(즉, 코카인 의존성) 및 (3) 탄수화물 탐식과 상호관련됨을 발견하였다. 또한, 본 발명자들은 A2 형태의 유전자(A2/A2)와 비교하여 2카피의 DRD2 A1 대립인자(A1/A1)가 P300 파의 연장된 잠복기와 현저히 상호관련됨을 발견하였다. 더욱이, P300 진폭은 알콜 중독 및 SUD의 가계와 상호관련되며, 에스 힐(S. Hill, University of Pittsburgh)은 또한 DRD2 A1 대립인자와 P300 진폭의 현저한 관련성을 발견하였다. 이들 결과는 주의 과정 및 전위 RDS 관련된 행동(즉, SUD 및 ADD/ADHD)을 포함하여 뇌 작용을 수반하는 비-행동적 생리학적 표현형에서 DRD2 A1 대립인자의 역할을 시사한다. P300 이상은 잘 기록되어 있지만 약물 남용에 특이적이지 않음에 주목하여야 한다. 또한, 이들은 혼합된 ADD, 정신분열병, 환각, 비만, 및 기타 정신 질환에 통상적이다.
다수의 치료학적 관여는 콜린작동제, 콜린에스테라제 억제제, 도파민작동성 및 세로토닌성 제제, 자극제, 미량 원소, 식이(낮은 정제 탄수화물), 두부 자극, 바이오피드백 등과 같은 스펙트럼 분석 뿐만 아니라 유발 전위 이상을 개선시키는 것으로 밝혀졌으며, 이는 상이한 비특이적 방법을 시사하는 것이다.
도파민작용성 기능이 D2수용체의 감소에 의해 잠재적으로 뇌 전기생리학적 이상과 관련되기 때문에, 치료 수단은 뇌 D2수용체 작용을 향상시키기 위해 개발된 기술에 존재할 수 있다. 도파민 D2수용체와 관련하여 유전자 산물의 발현은 도파민작용성 결핍증을 나타내는 다른 대립인자 뿐만 아니라 TaqI A1, TaqI B1에 의해 현저히 감소된다. 유전자 수복과 관련하여, 영구적인 방식으로 이러한 수용체 결핍증을 회복시키는 기술은 현재 공지되어 있지 않지만, 본 발명의 특정 부분은 그 가능성을 해결하여 D2Bmax에서 유전적으로 유도된 감소를 극복시킨다. 브로모크립틴 및 N-n-프로필노르아포모르핀을 포함하는 효능제에 의한 D2도파민 수용체의 상향-조절이 관찰되었다[참조: Fitz et al., 1994]. 더욱이, mRNA의 변화는 효능제 처리후 수용체의 증가에 기인하는 것 같지 않다. 대신에, 단백질-합성 억제제인 사이클로헥스이미드를 사용한 연구는 증가된 단백질 합성(유전자 발현의 상향-조절) 및 감소되지 않은 단백질 분해가 도파민작용성 효능제에 의한 상향-조절에 기인할 수 있음을 시사한다. 이러한 논리를 사용하여, 본 발명은 D2수용체의 만성적 점유를 촉진하기 위해 엔켈랄리나제 억제(D-페닐알라닌)에 의한 시냅스 도파민 방출의 향상 이용을 형질감염된 HEK-293 세포에서 제시된 바와 같은 잠재적인 D2수용체 증식 또는 상향-조절과 함께 결합할 것을 제안한다. 이것은 또한 본 발명의 기초를 형성한다.
전기생리학적 신경전달자 작용
QEEG 및 피질성 유발 전위를 포함하는 뇌 전기적 활성 맵핑은 정신분열증[참조: Braverman et al., 1990; Christian et al., 1994; Blum et al., 1995], 범죄[참조: Lovinger et al., 1995; Seiden et al., 1995], 우울증[참조: Hudson, 1995], 알츠하이머[참조: Scourfield, 1996; Lawford, 1995], AIDS[참조: Meiswanger et al., 1995], ADD/ADHD 및 처방에 대한 이들의 반응[참조: Kokkevi et al., 1995; Nunes et al., 1995; Yoshida et al., 1984] 및 SUD[참조: Gilman et al., 1990; Morrow et al., 1992; Brown et al., 1994; Comings et al., 1996; Neshinge et al., 1991]을 포함하여 다양한 피검자[참조: Porjesz, et al., 1987]에서 미세한 신경학적 변화의 존재를 나타냈다. 약물이 병소의 전기생리학적 이상을 유도하는 심연 구조(측두엽에 존재함)에서 신경전달자 결핍을 유도할 수 있음은 공지되어 있다[참조: Yoshida et al., 1984; (Gilman et al., 1990]. 이들 국소해부학적 변화는 물질 사용시 관여하는 피검자의 요구를 유발하는 중요한 표지 또는 구성 요소일 수 있다. 연 시스템의 흥분 현상이 SUD 피검자의 갈망 및 금단증상 모두의 요인일 수 있음은 공지되어 있다[참조: Ballenger et al., 1980]. 더욱이, 발병전 우울증과 같은 SUD는 후속적인 알츠하이머 뇌질환, 동시 ADD/ADHD, 및 후두엽에서 기원할 수 있는 다른 정신병에 대한 프로밴드를 발병전에 걸리게 할 수 있다. 뇌 맵핑 후두엽 이상은 PET 스캔에 대한 대사저하와 관련되는데, 이는 대사저하를 또한 갖는 발작간 후두염 발작 질환 피검자와 유사하다[참조: Adams et al., 1993]. DRD2 A1 대립인자는 전두엽에서 PET 스캔에 의해 측정한 바에 따르면 낮은 글루코즈 대사와 관련되는 것으로 보고되었다[참조: Noble et al., 1997]. 이것은 장애를 유도하는 뇌의 전두엽에서 대사저하가 낮은 도파민 D2수용체와 관련됨을 시사한다. 다수의 연구보고서는 SUD가 과다한 유발 전위 및 스펙트럼 분석 이상을 유도할 수 있는 흥분[참조: Goldstein et al., 1994] 또는 전기생리학적 불안정성을 촉진한다는 것을 시사한다. 더욱이, 코카인 및 에탄올 모두는 흥분 반응 또는 전기생리학적 불안정성을 유도하고, 급성 원리에 따라 도파민 방출에 의해 유발 전위 이상을 일시적으로 교정한다. 약물 남용자의 회복은 여전히 약물 사용을 중단한 후에도 낮은 P300을 갖는다. P300 활성은 단지 부분적으로 회복하고, 또한 알콜 중독에서 관찰된 것과 유사한 코카인 또는 헤로인 남용을 유도하는 약물 사용을 앞당기는 유전적 특징을 나타낸다[참조: Gilman et al., 1990].
본 발명자들은 약물 의존성이 잠재적인 발병전 상태를 현저히 악화시키고 유전자-환경 상호작용을 강력히 시사한다는 것을 이론화한다. 특히 약물을 사용하여 이들 전기생리학적 장애를 완화시키기 위해 사용된, 핵 측좌내에서 도파민의 방출을 유발하는 약물의 자가-투약 또는 행동 작용(즉, 코카인, 알콜, 니코틴, 당, 섹스 등)은 불운하게도 뇌 장애의 악화를 초래한다.
상이한 도파민 유전자의 부가 효과
제4대까지 유전자형으로 나눈 ADHD/ADD 및 RDS 모두와 유사한 3개의 도파민작용성 유전자 DRD2, DβH 및 DAT1 유전자를 포함하는 본 발명자들의 최근 연구의 요약이 본원에 제시되어 있다. 이들 결과는 함께 분자 유전학 수준에서 ADHD, TD 및 다른 질환이 폴리유전자 방식으로 다양한 관련 질환에서 유전되고, 공유된 유전자에 의해 유발되며, 모집단에 통상적인 대립인자에 의해 유발되고, 이들의 효과에 상가성인 유전자에 의해 유발되며, 도파민 시스템(그 중에서도)을 와해시키는 유전자에 의해 유발된다는 개념을 지지한다.
4대 까지의 주의-결핍/과활성(ADHD) 프로밴드 및 다중 가계 구성원에서 도파민작용성 유전자의 세대 관련성 연구
도파민 D2수용체 유전자의 다형성은 "보상 결핍 증후군(RDS; Reward Deficiency Syndrome)" 또는 다수의 관련 충동-탐닉성-강박 행동과 관련되고; 도파민 전달자 유전자(DAT1)의 VNTR 10/10 유전자형은 ADHD 및 토렛트 질환(TD)와 관련되며; 도파민-베타-하이드록실라제 유전자(DβH)의 B1 대립인자는 TD 및 다수의 RDS 행동 아-특성과 관련된다.
본 발명자들은 2가지의 다중 발병된 가계로부터 유도된 4대 이하의 51개 피검자를 유전자형으로 나누었다. DNA는 PCRTM-기본된 방법에 따라 협측 면봉으로부터 추출한다. 2개의 초기 프로밴드는 ADHD를 갖도록 다수의 표준 장치에 의해 주의하여 진단한다. 후속적으로, 추가의 가계 구성원을 ADHD 및 다른 관련된 RDS 행동에 대해 진단한다. 모든 피검자는 3개의 도파민작용성 유전자(DRD2, DAT1 및 DβH)에 대해 유전자형으로 나눈다. 모든 피검자중 80%(40/50)는 DRD2 TaqA1을 포함한다. "수퍼" 대조 그룹(1/30 또는 3.3%가 DRD2 A1 대립인자를 포함한다)과 비교하는 경우, 116의 나머지 비율[95% 신뢰도는 13.6 내지 2,575 범위이다]에서 현저한 관련성이 관찰되었다[Chi Square=41.1, df=1, p=0.00000001, 보정된 Yates]. 본 발명자들은 이들 데이타를 제시하여 고도로 선택된 대조 그룹에 대한 중요성을 지적한다. 유사하지만 덜 강력한 발견은 본 발명자들이 문헌의 714명의 비-알콜 및 비-약물 남용 대조 그룹을 사용한 데이타를 비교하는 경우(185/714 또는 26%는 DRD2 A1 대립인자를 포함한다)에 수득되었다. 현저한 관련성이 11.4의 나머지 비율[95% 신뢰도는 5.38 내지 24.93 범위이다]에서 관찰되었다[Chi Square=63.2, df=1, p=0.00000001, 보정된 Yates]. 91명의 선택된 대조 그룹에서는 DAT1 10/10 대립인자의 우성이 34/91 또는 37.4%이었고, 51명의 선택된 대조 그룹에서는 DβH B1 대립인자의 우성이 27/51 또는 53%이었다. 현저한 관련성은, 2.64의 나머지 비율[95% 신뢰도는 1.31 내지 5.38 범위이다]에서 선택된 대조 그룹[Chi Square=7.51, df=1, p=0.0061]과 비교하는 경우, ADHD-유도된 2종류의 가계 구성원(30/50 또는 60%)내의 DAT1(VNTR 10/10 유전형) 사이에서 발견되었다. 대조적으로, 비-유의성은, 0.63의 나머지 비율[95% 신뢰도는 0.28 내지 1.4 범위이다]에서 선택된 대조 그룹(Chi Square=1.27, df=1, p=0.259)와 비교하는 경우, DβH B1(32/50 또는 64%)의 캐리어에서 발견되었다. 본 발명자들은 단일의 탐닉-충동-강박 행동 아-특성에 의해 통상 발견되는 40 내지 50%와 비교하여 이들 피검자내의 고도의 DRD2 A1 대립인자가 RDS를 포함하는 다중 행동 아-특성에 기인한다고 생각한다. 특정한 가계에 있어서, DRD2 A1 대립인자는 ADHD를 갖는 것으로 진단된 100%의 피검자내에 존재한다.
이 데이타가 완성되면, 공동-변수로서 가계 구성원내에 존재하는 하나 이상의 RDS 행동을 사용하여 결합 분석을 수행한다. RDS 행동의 회수가 피검자에서 증가함에 따라 DRD2 A1 대립인자의 존재도 또한 증가한다는 것에 주목하여야 한다. 먼저, 다른 2개의 도파민작용성 유전자와 관련하여 DRD2 A1 대립인자는 현재 시험된 당해 샘플내에서 적어도 ADHD 및 RDS 행동을 예상하는데 있어서 보다 많은 정보를 제공하는 것 같다. 이러한 데이타는 현재 처리되고 있고, 추가의 결과가 제시되어 충동과 관련하여 논의되며, 이러한 발견은 하나의 중요한 아-특성 ADHD 뿐만 아니라 충동-탐닉-강박 행동(RDS)의 생물유전학에 기초하는 것이다.
인지, 전기생리학적 및 신경전달자 작용
본 발명의 한가지 중요한 양태는 주의 과정이 "보상" 및 다른 관련된 행동에 기인하는 뇌 부위(중엽)에서 특히 신경전달자 작용의 변화에 의해 영향을 받는다는 것이다. 더욱이, 약물, 섹스 및 스트레스와 같은 유전적 및 환경적 요인에 의한 "보상 캐스케이드"의 장애는 주의 과정에 영향을 미칠 수 있다. 다수의 신경전달자 경로는 궁극적으로 초점 맞추기, 기억 및 인지에 관련되지만, 일반적으로 4개 이상의 주요 경로가 세로토닌작용성, 아편중독성, GABA작용성 및 도파민작용성과 관련되는 본 발명에 바람직하다. 인지 및 신경전달자에 관한 문헌의 간단한 고찰은 도파민작용성 시스템 및 주의 과정 사이의 포지티브 관계를 지지할 것이다. 이러한 관계는 도파민 작용성 시스템을 활성화시키고 도파민 수용체에서 효능제 상호작용을 촉진하거나 천연 도파민을 방출하는 화합물이 피검자에서 주의 과정 및 초점 맞추기를 향상시킬 수 있다는 개념을 조장한다.
도파민 D 2 수용체 유전자의 다형성은 사람의 뇌 전기생리학적 이상과 관련된다
이것은 본 발명자에게 공지된 첫번째 연구로서, 사람에 있어서 도파민 D2수용체 유전자의 다형성과 뇌 전기생리학적 이상 사이의 관련성을 입증한다. 이와 관련하여, 증가된 선형 기울기 분석은 DRD2 A2 유전자형 및 동시-병적 약물 사용 질환[SUD](p＜0.0001)과 비교하여 DRD2 A1 대립인자의 존재하에 시험-관련된 전위(EPs)의 악화 효과를 나타냈다. 던칸 랭지(Duncan's Range) 시험은 DRD2 A2 대조 그룹과 비교하여 DRD2 A1 대립인자의 존재 또는 부재하의 SUD가 DP를 현저히 악화시켰음을 나타냈다. 더욱이, 본 발명자들은 본 발명자들의 "수퍼 대조 그룹"(p＜0.0000033) 및 다수의 문헌 대조 그룹(p＜0.0021)과 비교하여 중증의 약물 사용 질환(SUD)와 DRD2 A1 대립인자 사이의 현저한 관련성을 관찰하였다. 관련된 유발 전위(EPR)의 P300 파의 감소된 진폭 및 잠복기는 알콜 및 약물 의존성과 오랫동안 관련되어 왔다. 본 연구에 있어서, 본 발명자들은 P300 잠복기의 현저한 연장이 3개의 위험 요인, 즉 (1) 양친의 SUD, (2) 화학적 의존성(즉, 코카인 의존성) 및 (3) 탄수화물 탐식(p＜0.03)과 상호관련됨을 발견하였다. 당해 모집단에 있어서, 본 발명자들은 또한 감소된 P300 진폭이 가계의 알콜 중독 및 SUD(p＜0.049)와 상호관련되지만, DRD2 A1 대립인자와는 상호관련되지 않음을 발견하였다. 이들 결과는 뇌 작용 및 잠재적인 탐닉 의존성을 수반하는 비-행동의 병리생리학적 표현형에 있어서 DRD2 A1 대립인자의 역할을 시사한다.
본 연구의 목적은 도파민 D2수용체 유전자(DRD2) TaqI A1 대립인자가 개인적인 외래피검자 진료를 담당하는 사람에 있어서 약물 사용 질환(SUD)의 존재 또는 부재하에 뇌 전기생리학적 이상과 관련되는지의 여부를 측정하는 것이다. D2도파민 수용체 유전자의 A1 대립인자와 알콜 중독 사이의 강력한 관련성을 본 발명자들이 실험실에서 발견[참조: Blum et al., 1990]한 후에, 몇몇 그룹은 당해 관찰을 반복할 수 없었다[참조: Gelernter et al., 1997]. 본 발명자들은 두가지의 가능한 이유를 제안하였다: 첫째, 다른 관련된 행동 뿐만 아니라 알콜, 약물 및 담배 남용에 대한 대조 그룹의 부적절한 선택 및 둘째, 질환의 만성 및 중증도에 대한 알콜 중독의 특성화와 관련한 샘플링 오차[참조: Blum et al., 1996]. 그러나, 문헌의 고찰은 "보상 결핍증 증후군"(RDS)로 명명된 분열병/회피 행동 뿐만 아니라 다중약물 남용, 흡연, 주의-결핍/과활성(ADHD), 탄수화물 탐식, 토레트 질환, 병리학적 갬블링, 외상후 스트레스 질환을 포함하는 충동-탐닉-강박 질환 그룹과 알콜 중독 그룹에 있어서 DRD2 유전자 사이에 다수의 포지티브 관련성을 나타낸다[참조: Blum et al., 1996]. DRD2 대립인자내의 변화는 알콜 중독이 단순한 징후인 도파민작용성 기능과 관련된 매우 통상적인 잠복성 특성의 변화를 나타내는 것으로 주장되었다[참조: Hill and Neiswanger, 1997]. 더욱이, 대조 그룹 및 발병자로부터 "다른 병인"을 제외하는 것은 문헌[참조: San Antonio, Los Angeles, Duarte, and Pittsburgh; Hill et al., 1997; Blum et al., 1996]에서 이미 달성되었다. 따라서, 본 발명자들의 견해는 결합 또는 가계내 관련성을 발견하지 못하는 것이 분석을 위한 적절한 표현형의 불완전한 이해에 기인할 수 있다는 것이다.
따라서, 유사 결과를 감소시키기 위해, 본 발명자들은 DRD2 TaqI A1 대립인자를 사용한 후속적인 관련성 연구를 위한 마커로서 뇌-전기생리학적 이상으로 공지된 비-행동적-병리생리학적으로 기초하는 표현형을 사용하기로 결정했다. DRD2 TaqI A1 대립인자를 사용한 다른 사람 관련성 연구는 본 발명을 시사하였다[참조: Boble et al., 1994; Blum et al., 1994]. 현재까지, 기타 분열 행동 질환 가운데 SUD, ADHD, 도관 질환(CD), 병리학적 유독성 행동, 알츠하이머 질환을 포함하는 다수의 행동 질환에 대한 스펙트럼 및 유발 전위 모두의 이상간에 상호관련성이 존재한다[참조: American Psychiatric Association Task Force, 1991].
본 발명자들은 SUD 및 비만에 따른 현저한 유발 전위 이상을 발견하였기 때문에, 본 발명자들은 뉴저지 프린세톤에서 신경정신학적 및 의학적 진단을 받고 있는 피검자에 있어서 이상 뇌 전기적 활성 및 DRD2 A1 대립인자의 직접적인 상호관련성에 대한 가능성을 전체적으로 평가하기로 결정하였다. 포지티브 상호관련성은 발병전에 유전학적으로 기초하는 뇌 이상을 진단하기 위한 중요하고 관련된 임상 정보를 제공할 수 있다.
DRD2 대립인자 편차, SUD 및 스펙트럼 분석 사이의 관련성을 검사하였다. DRD2 TaqI A2/A2 대립인자를 포함하는 전형적인 정상 피검자에서 가시적 유발 반응(VER)의 현저한 가능성 맵(SPM)을 측정한다. 표준 편차(SD) 최대(0.34) 및 최소(-1.00)을 SPM으로서 계산하고, 본 발명자들의 대조 그룹 그룹은 표준화된 BEAMTM(뇌 전기적 활성 맵핑) 대조 그룹과 현저하게 다르지는 않았다. SUD의 부재하에 DRD2 TaqI A1/A2 대립인자를 갖는 피검자에서 VER의 특징적 뇌 맵은 2.92 SD에 대한 밝은 전면 측두엽 과다 네가티브성을 사용하여 밝은 백색-청색으로서 가시화한다. 밝은 백색 청색 면적에 의해 나타낸 우측 전면 측두엽 이상은 SUD의 존재 또는 부재하에 기분의 현저한 변화, 고동, 불안 및 스트레스의 전형이다. DRD2 A1/A2 유전자형을 갖는 SUD 피검자에 있어서 VER의 특징적 뇌 전기적 활성 맵은 6.13 SD에 대한 좌측 및 우측 전면 측두엽 과다 네가티브성을 이용하여 밝은 백색 광선에 의해 가시화된다.
또한, 본 발명자들은 3가지 위험 인자, 즉 (a) 양친의 SUD, (b) 화학적 의존성(즉, 코카인 의존성) 및 (c) 탄수화물 탐식(p＜0.03)과 관련된 P300 잠복기의 현저한 연장을 발견하였다. 또한, 본 발명자들은 감소된 P300 진폭이 가계의 알콜 중독 및 SUD(p＜0.049)과 상호관련되지만, DRD2 A1 대립인자와 상호관련되지 않음을 발견하였다.
가장 중요하게는, 증가된 선형 기울기는 DRD2 A2 유전형 및 동시-병적 SUD(p＜0.0001)과 비교하여 DRD2 A1 대립인자의 존재하에 시험-관련된 전위의 현저한 악화 효과를 나타냈다. 던칸 랭지(Duncan's Range) 시험은 DRD2 A1 대립인자의 존재 또는 부재하의 SUD가 DRD2 A2 대조 그룹과 비교하여 EP를 현저히 악화시켰음을 보여준다.
본 연구에 있어서, 중증의 SUD 피검자중 52%(N=29)가 DRD2 TaqI A1 대립인자를 포함한다는 것은 주목할 만하다. 우성(%)은 DRD2 A1 대립인자 우성이 3.3%[Chi Square=17.47, df=1, p＜0.0000033]인 본 발명의 "수퍼 정상" 대조 그룹(알콜 중독, SUD, 흡연 행동, ADD/ADHD, 탄수화물 탐식, 병리학적 갬블링, 분열병/회피성 성격 질환 행동, 유해한 행동, 및 알콜 중독, SUD 및 비만에 양성인 가계를 제외함)과 비교하는 경우 현저히 상이하다. 더욱이, 714명의 비-알콜중독성, 비-SUD(흡연 제외), 비-히스패닉 코카시안 대조 그룹 중에서 25.9%는 DRD2 A1 대립인자를 포함한다.비-히스패닉 코카시안 SUD 프로밴드와 비교하는 경우, 매우 강력한 관련성이 발견되었다(Chi Square=9.44, df=1, p＜0.0021).
본 발명자의 지식에 있어, 이는 신경정신과학 셋팅에 참여한 피검자의 VER 및 청각-유발된 반응(AER) 모두에 있어, 뇌의 전기생리학적 비정상성의 수의 증가와 DRD2 A1 대립형질와의 사이의 상당한 관련성을 관찰하기 위한 첫 번째 연구이다. 정신흥분제 남용/의존에 빠지기 쉬운 개인의 전기생리학적 장해에 대한 기타 연구와 함께 상기와 같은 유전적 증거는 또한 도마핀원성 유전자와 흥분제 남용 경향간의 관계를 제시해준다. SUD가 뇌의 맵핑(mapping) 파라미터를 악화시키고[참조: Braverman et al., 1996; Blum et al., 1995; Lovinger et al., 1995; Seiden et al., 1995; Hudson, J., 1995], 금단시, 대부분의 경우에 있어 일부 약물-유도된 뇌의 전기생리학적 손상이 지속됨이 나타난다[참조: Scourfield et al., 1996; Lawford et al., 1995; Neiswanger et al., 1995]고 보고되어 왔다. 본 발명자들은, 정신병 프로밴드중에서 코모비드(comorbid) SUD는 잠재적인 발병전 상태를 심각하게 악화시킨다는 것을 이론화시키고, 유전자-환경 상호작용을 강력히 제시한다[Kokkevi et al., Nunes et al., 1995]. 예를 들어 상기 전기생리학적 장애를 완화시키는데 사용되는 코카인과 같은 불법 약물에 의한 자가-처방은 뇌 기능 장애, 특히 만성적인 반복 사용시 뇌의 양쪽 측두엽을 손상시키는 불행한 결과를 낳는다. 또한, P300의 진폭 및 연장의 감소는 알코올 중독 및 약물 중독과 관련이 있다[Yoshida et al., 1984; Gilman et al., 1990]. 이는 알코올 및 약물의 급성 효과와 무관한데, 이는 알코올 자체를 복용하지 않은 알코올 중독자의 지식에게서 발견되었기 때문이다[Morrow et al., Brown et al., 1994]. 이는 P300 파의 진폭을 감소시키고 잠복기를 연장시키는 것과 연관이 있고, SUD 위험의 증가와 관련된 유전자의 존재에 대한 것이다.
전반적으로, 본 발명자들은 상기 관찰이 뇌 기능(즉, 응답(reward))에서의 도파민의 추가적 역할을 지지해주는 전기생리학적 관련성에 있어 중요하다고 믿는다. 연결성 DRD2 다형성은 도마핀 수용체의 기능과 연관이 있다[Pohjalainen et al., 1996]. 33 명의 핀란드 남성 지원자중에서, DRD2 유전자의 TaqI A1 대립형질은, A2/A2 피검자에 비해 조정된 Bmax에서의 통계학적으로 유의있는 감소와 관련이 있었다. Kd는 그룹간에서 유의적이지 않았다. 이는 A1/A2 피검자의 경우 수용체의 수가 감소되는 반면, 수용체 기능에 있어서의 변화는 전혀 보이지 않는다는 증거로서, 이는 수용체 합성에 있어 3' 매개된 다형성의 조절 역할을 나타낸다. 또한, DRD2 녹 아웃트(knock out) 마우스의 경우, D2수용체 Bmax가 상당히 감소되며, kd는 조금도 변화지 않는다[Grandy et al., 1989]. 따라서, 조절 유전자 요소는 TaqI A 다형성에 의해 연결 불균형 상태에 있을 것이다. 따라서, DRD2 A1 대립형질와 같은 뇌의 전기생리학적 비정상으로 인식된 특이적 분자 다형성의 입증은 임상적으로 대단히 유용함에 틀림없다. 이론상으로, 상기 연구로 부터, 도파민원성 시스템의 다형성은, 비정상적 행동(RDS의 아속성)을 매개하는 것으로 보이는 특이적 뇌의 전기생리학적 기능 장애(즉, VER 및 AER)와 관련이 있다.
이러한 관련성이 계속적으로 한정되는 경우, 본 발명자들은 특히 고 위험 그룹에서 더 나은 예방책을 제공할 수 있을 것이다. 또한, 더욱 특이적으로 표적화된 치료법은 궁극적으로, 발명자의 견해에 따르면 사람의 행동 병리학에 상당한 충격을 주는 상기 조사로부터 유래될 것이다.
피검자
총 294명의 피검자를 본 연구에 이용한다. 피검자 모두 공지된 동의서에 서명한 비-스페인계 카프카그인이었다; 본 연구는 기관[Path Research Foundation Institutional Review Board]에서 승인하였다. 본 연구를 위해 피검자는, 1년의 기간에 걸쳐 PATH 외래피검자 사설 임상 실험에 참여한 800 명의 피검자를 약 500번 방문하여 무작위로 선발하였다.
SUD 그룹중 모든 피검자를 임상적으로 확립하여 SUD를 초기에 완전히 (DSM IV) 경감시켰다[Brown et al., 1994]. 본 발명자의 173명의 샘플을 기본으로 하는 인구통계의 내역은 표 69에 기술되어 있다. 성별 및 정신병 지단은 시험된 모든 그룹간에 유의적으로 상이하지는 않았다. 모든 그룹간의 평균 연령이 산정되었고, 유의적으로 다양하지는 않았다(p＜0.00001). 53.1%의 남성과 46.9%의 여성을 포함하는 성별 선발을 조사한 경우, 이러한 연령 차이가 정신병 잔단에서 발견되었으나, 성별에서는 발견되지 않았다.
전기생리학적 유전자형 결정 방법
SUD 표현형(코카인 남용, DSM IV Code N0.305.00; 코카인 의존, DSM IV Code No. 304.20; 알코올 남용, DSM IV Code No. 305.00; 및 알코올 의존, DSM IV Code No. 303.90)을 판정하기 위한 선별 기준 및 산정 수단에 대해, 본 발명자들은 본 발명자들이 문헌[Braveman et al., 1996]에 이미 보고한 바와 동일한 방법을 이용하였다. 당해 피검자들은 문헌[Comings et al.,1996]에 따라 DRD2 대립형질 변화(DRD2 TaqI A1 및 A2)에 대해 유전자형을 결정했다. Nicoplette BEAMTM을 사용하여 다음을 산정하였다: 전체 뇌의 비정상, 전체 스펙트럼 비정상, 유발된 퍼텐셜(EP, AER, VER) 및 P300. 이러한 방법을 상세히 설명하기 위해 뇌의 전기생리학적 비정상을 산정한다[Braveman and Blum, 1996]. 또한, 본 발명자들은 이러한 연구에 일치된 비교 목적으로 유전자형이 결정되지 않은 P300 대조 그룹 그룹을 포함시켰다. P300 대조 그룹 그룹에는 약물, 알코올 및 음식 중독이 없고, 정신 질환이 없는 15명의 남성 지원자가 포함되었다.
통계학적 분석
통계학적 분석을 위해, 모든 뇌 지도 데이타를 비정상 또는 정상으로 분류하였다. 구체적으로, EEG는 정상 또는 비정상으로 나뉘었고, 스펙트럼 분석은 3회의 독립적인 수행 후, (동일한 위치에서) 결손의 반복을 갖는 표준화된 BEAMTM 대조 그룹으로 부터 2.5 SD에서 나뉘었다. P300 전압은 10dv의 확립된 정상적 전압에서 나뉘었고[Neshinge et al., 1991], P300 잠복기는 350ms에서 니뉘었다. 이러한 수치는 300ms의 산정치를 기초로 한다. 플러스는 대조 그룹의 연령을 의미하고, 이는 기관[Lexicor, Inc., Boulder, Colorado]에 의해 개발된 기준이며, 18세 이후에 P300에 있어 연간 약 1.25ms가 증가한다. 통계학적 방법에 대한 완전한 내용이 이미 공개되었다[Braveman et al., 1996]. 또한, 본 발명자들은 평균의 쌍으로서 비교하기 위해 Duncan's Range Test를 사용하였다. 알파 수준은 유의성을 위한 0.05에 고정시켰다.
Kantroll TM1 에 의한 건강한 사람에서의 주의 과정의 증진:
엔케팔리나제 억제 특성을 지닌 코카인 대용물
이는 사람이 특이적 아미노산 혼합물, KantrollTM을 매일 섭취한 경우, 실행과 관련된 인식 사건-관계된 퍼턴셜(ERP: Event-Related Potential]에 미치는 효과에 대한 첫번째 보고서이다. 인식 ERP는, 정상적인 젊은 성인 지원자에서, 두개의 컴퓨터 처리된 시각 주의 작업, 즉 공간 방향 작업(SOT: Spatial Orientation Task) 및 우발적 계속적 실행 작업(CCPT: Contingent Continuous Performance Task)에 대한 반응에 의해 발생되는데, 이 경우 각각의 피검자는 아미노산 섭취 후 28일 내지 30일 경과 전 및 후의 시험을 위해 그자신이 대조 그룹이 된다. ERP의 P300 성분의 통계학적으로 유의있는 진폭의 증진은 두 작업 모두에서 KantrollTM섭취후 나타났다. 이러한 연구에서 관찰된 변화는, 정상적인 대조 그룹에 관하여, 신경생리학적 기능의 증진은, 아미노산 대체물, KantrollTM의 섭취 후, 응답 결함 증후군 행동(즉, ADD/ADHD, 물질 남용 장해, 탄수화물 탐식, 니코틴 남용, 등)의 회복을 촉진하는 토대가 될 수 있다.
신경생물학에서 가장 흥미있는 발견중의 하나는, 뇌 기능 및 기분 조절에 중요한 역할을 하는 다수의 신경전달물질(예: 도파민, 노르에피네프린, 에피네프린, 세로토닌, 멜라토닌 및 글리시딘)이 이들의 전구체 아미노산 영양분의 수준을 순환시킴으로써 급격하게 영향받을 수 있다는 것이다[Wurtman, 1983]. 각각의 전구체 아미노산은 L-티로신(또는 L-페닐알라닌), L-트립토판 및 L-트레오닌이다. 이들 신경전잘물질 합성 시스템은 모두 두 개의 중요한 특징을 나타낸다. 첫째, 이들이 합성되는 아미노산은 9개의 필수 아미노산 중의 하나이다: 히스티딘, 이소루이신, 루이신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 트레오닌, 트립토판 및 발림(트로신은 페닐알라닌으로 부터 합성된다). 둘째, 합성 경로중 제1 단계는 포화되지 않은 효소를 이용한다. 이러한 두개의 특징의 결과로, 이들 아미노산의 규정량을 섭취하면 특이적 신경전달물질의 합성이 유도될 수 있다. 이는, 수 많은 조절성 피드백 기전 때문에, 반득시 선형 관계는 아니지만, 매우 중요한 조절 루트임이 밝혀졌다[Hernandez-Rodriques and Chagoyn, 1986; Wurtman and Fernstrom, 1976; Wurtman et al., 1981].
동물에서의 뇌의 화학적 순환의 복잡한 측정, 예를 들면 미세투석 측정에 의해, 전구체 아미노산의 적용 후 신경전달물질 생성에서의 변화가 입증되었다[Hernandez et al., 1988]. 보완적 행동 변화가, 전구체 아미노산을 전신적이고 직접적으로 중추 신경계에 전달한 후 동물에서 입증되었다[Blum et al., 1972]. 특정 아미노산은 신경전달물질 및 신경조절물질 전구체인 반면에, 이들의 라세메이트, D-아미노산도 또한 생물학적 활성을 갖는다. 특히, D-페닐알라닌 및 D-루이신은, 기분 및 행동의 조절에 중추적인 오피오이드 펩티드의 분해를 감소시킨다[Blum et al., 1987; Carenzie et al., 1980; Della Bella et al., 1979; Ehrenpreis et al., 1979].
신경전달물질 작용은 행동의 신경화학적 기반을 형성하고, 이들의 교란은 각종 정신병 및 행동 장해에 있어 중요할 것이다. 중독성 질환에 대한 이들의 기여가 여러 논평의 촛점이 되고있다[Koob and Bloom, 1988; Wise and Bozart, 1985; Blum et al., 1990; Blum and Kozolowski, 1990; Amit and Brown, 1982]. 구체적으로, 도파민, 세로토닌, 노르에피네프린, 감마-아미노부티르산(GABA), 글루타민 및 오피오이드 펩티드가 중독성 장해, 특히 알코올, 헤로인 및 코카인 남용에 있어 중요한 역할을 하는 것으로 교시되어 있다[Blum et al., 1977; Geller et al., 1972]. 결과적으로, 이러한 관찰로 부터, 선택된 영양분의 섭취가 사람의 기분 및 행동에 영향을 줄 수 있다는 생각을 가질 수 있다.
과거에는 영양 정책이 수 차례 사용되어 왔지만[Williams, 1959], 명료한 정량적 입증이 결정적으로 제한되었다. 그러나, 최근의 임상 데이타에 의하면, 아미노산 전구체 및 엔케팔리나제 억제제가 알코올, 코카인 및 음식 중독으로 부터의 회복에 미치는 실밀적인 효과를 제시된다[Blum et al., 1988; Halikas et al., 1989]. 관련 연구[Blum et al., 1989]는, 코카인 중독에 대한 30일간의 입원 치료프로그램에서, 아미노산 보충물, KantrollTM의 사용을 조사하였다. 실험군과 대조 그룹과의 유일한 차이는 이들 보충물의 사용여부 였다. 두 개의 주요 측정이 사용되었다: 의학적 권고 완료전 또는 의학적 권고에 대한(AMA:Against Medical Advice) 남은 프로그램 및 약물 금단. 약물 금단은 생생한 코카인-관련 환상, 신체적 고통, 약물에 대한 요구, 약물-관련 대항 반응, 프로그램 순응성, 흥분과 난폭 또는 남은 AMA의 위협으로 측정한다. 아미노산 보충 그룹은 대조 그룹 그룹 보다 두가지 측정 모두에서 상당히 더 나은 상태를 보인다. AMA 속도는 9배 감소하고, 측정된 약물 금단은 상당히 감소된다. 또한, 직원들은 흥분, 집중 이탈 및 갈망의 결정적인 감소를 보고했다. 그러나, 측정은 복잡하고, 종종 정성적이고, 수 많은 입력 인자에 의존적이다[Brown et al., 1990].
본원의 연구는 KantrollTM의 신경생물학적 결과의 기본적 이해와 임상적 경험사이의 간격의 밀접한 부분을 찾고자 하는 것이다. 본원에서, 이러한 시도는 KantrollTM에 의한 치료와 관련된 정성적 전기생리학적 변화를 평가하는 것이다. 신경생리학적 부문은, 2개의 시각적 주의 작업에 의해 유발된 인식 사건-관련 퍼텐셜(ERP)의 P300 성분에 집중하고 있다. 종래의 EEG 분석에 대한 이러한 전기생리학적 시도의 이점은, 실행 작업에 매달리는 덕택에, 주의 과정에 중요한 특이적 시스템이 활성화된다. 이러한 주의 프로브는, 정보 처리의 단계를 각각 나카내는, ERP 성분의 군을 발생시킨다. 그러나, 본원에서 ERP 분석은 인식 ERP, 특히 P300 성분에 중점을 두고 있다. 최근에, 정량적 ERP 변화는 폭 넓은 임상적 장해; 예를 들면, 주의적 장해[Buschbaum et al., 1973; Hallidat et al., 1976 Prichep et al., 1976], 정신분열병[Braveman, 1990], 우울증[DeFrance et al., 1995a; Vasile et al., 1992], 치매[Duffy et al., 1984], 및 물질 복용 장해[Braveman et al., 1990, and Braveman and Blum, 1996]에 대해 예견가능하게 변화된다는 것을 보여준다.
이러한 예비적 보고서에 대한 촛점은 주의 처리과정인데, 이는 부분적으로 주의/또는 집중 모두에서의 변경이 지속적 물질 남용보다 먼저 일어나거나 이를 수반하기 때문이고, 주의에 있어 중요하다고 여겨지는 다수의 전달 기질이 KantrollTM의 투여를 통한 조절을 표적으로 하기 때문이다. 본원의 연구의 또 다른 목적은 신경전달물질의 전구체 또는 조절인자로서 작용하는 아미노산이 중추 신경계에 영향을 주는지에 대한 의문을 설명하고자 하는 것이다. 이어서, 본 연구는, 전기생리학적 및 실행이 정상 피검자에 대한 만성적 KantrollTM투여와 상관있는지의 문제를, 특히 인식 ERP의 P300 성분의 변화로 지시된 바대로 설명한다.
피검자
본 연구는 20명의 정상 지원자를 포함한다; 이들은 공인 정신병 의사회에 의한 DSM IV 기준에 의해 판정된 바와 같은 심리학적, 신경학적 또는 정신병적 상태가 없다. 모든 피검자는 공지된 동의된 서명했고, 각각 본 연구의 참여에 대한 보상을 받았다. 처음 시험은 0일(시험 전)에 수행되었고, 이어서 28 내지 30일 후(시험 후) 수행되었다. 피검자는 28 내지 30일 동안 매일 6개의 KantrollTM캡슐을 복용하였다. 조성은 표 6에 기재되어 있다. 두 명의 피검자로 부터의 데이타는 포함되지 않았는데, 이는 시험 전 또는 시험 후 기록 상태가 불량하기 때문이었다.
실행 작업
두 개의 실행 범례를 전기생리학적 연구를 위한 행동 프로브로서 사용한다. 제1 프로브는 공간 정위이다. 이는 프라이밍(priming) 신호가 시야의 여러 부위에 제시되는 경우의 반응 시간을 기초로 하는 작업이다. 반응 시간은 프라이밍 신호가 이용가능한 경우와 이용불가능 한 경우에, 오른쪽 및 왼쪽 시야를 비교한다. 반응 시간의 비교를 통해, 주의를 원활하게 전환시킬 수 있는 개인의 능력을 산정할 수 있다. 모니터 스크린 중심의 교차점에 집중한 후, 오른쪽 박스에 '*"가 나타나면 오른쪽 마우스 버튼을 누르고, 왼쪽 박스에 '*'가 나타나면 왼쪽 버튼을 누르도록 지시한다. 박스는 가장 밝을때를 기준으로 교대된다. 반응 시간을 기록하고, ERP를 4개의 범주 관점에서 작성한다: (1) 오른쪽 시야의 촉진, (2) 오른쪽 시야의 비-촉진, (3) 왼쪽 시야의 촉진, 및 (4) 왼쪽 시야의 비-촉진. 제시는 무질서적이나, 4개의 상태의 가능성은 동일하다. 촉진 박스를 표적의 제시전에 500msec 밝게한다. 왼쪽 및 오른쪽 시야에 대한 정확한 스코어 및 반응 시간을 기록함은 물론, 각각의 A'(표준 시그날 검출 파라미터) 값을 기록한다. 이러한 범례는 자극에 대한 정위, 주위의 유동성과 함께 인식 처리 속도를 샘플화한다.
제2의 프로브는 우발적 계속적 실행이다. 이러한 작업은 전통적 주제의 변형이다[Rosvolod]. 각 개인에게 특정 문자 명령: 예를 들면 'T'가 다른 T 다음에 나오면, 왼쪽 마우스 버튼을 눌러 반응하도록 요청한다. 당해 작업의 이러한 형태는 일정한 자극간 간격(ISI)이 0.8초이고, 500회 작업을 수행한다. 'T'가 아닐 가능성은 50%로 고정시키고, 예고 'T'의 가능성을 30%로 고정시키고, 표적 'T'의 가능성을 20%로 고정시킨다. 3개의 조건중의 하나에 따라 평균 ERP를 작성한다: 착각인자('T'이외의 모든 문자), 예고 시그날(쌍중 첫번째 'T'), 및 표적(쌍중 두번째 'T'). 주요 실행 측정치는 실행의 일관성의 척도인 불일치 지수[Ringholz, 1989]이다. 전두엽 피질이, 상기와 같은 종류의 작업을 양호하게 수행시키게 하는, 지속적 주의 및 노력과 가장 밀접하게 관련되어 있는 것으로 여겨지며[Cohen, et al., 1987; Corbetta, et al., 1991] 이러한 작업이 자극제 투여에 대해 매우 민감하다는 것[Sostek et al., 1980]은 주목할 만하다.
기록 계획
EEG를 연결된 귓불(A1-A2)과 관련된 28개의 기록 부위로 부터 기록한다. 몽타주는 국제 10 내지 20 시스템를 기초로 하고, 추가로 전극을 전두-측두(FTC1, FTC2), 중심-두정(centro-parietal)(CP1, CP2), 측두-두정골(TCP1, TCP2), 및 두정-후두(PO1, PO2) 영역에 놓는다. 전극 임피던스를 5 KOhm 미만으로 유지한다. 추가 전극을 사용하여 눈밖의 인공물을 모니터링항다. 수직 눈 운동 및 깜작임(즉, VEOG)를, 왼쪽 눈의 안와의 상부 및 하부에 바로 위치된 전극을 통해 기록한다. 수평 눈 운동(즉, HEOG)를 외부 안각에서 추가 전극 쌍을 사용하여 모니터링한다.
EEG 및 EOG를 32-채널의 NeuroScience Brain Imager(0.1-40Hz, 6dB/옥타브 저주파통과, 36dB/옥타브 고주파통과)를 사용하여 증폭시킨다. 원 EEG를, SCAN EP/EEG 획득 및 분석 시스템(NeuroScan, Inc)의 제어하에, 16-비트 아나로그-대-디지탈 전환기(TECAMAR Labmaster DMA)로 2.56초 동안 샘플채취한다. 사건-관련 퍼텐셜(ERP)를 작성하기 위하여, 파형 평균을 800msec 간격에 걸쳐 산재된 256 점으로 부터 작성한다. 샘플링을 자극 제시 전 100msec에서 시작하여 자극전 기준선을 확립하고, 이를 교정 과정의 일부로서 사용한다. 단일-스위프(sweep) 데이타는 평균을 공제하여 교정된 기준선이다. 기록된 스위프의 수는 행동 프로브에 따라 다양하다. 총 200개의 스위프를 공간 정위에 대해 기록하고, 500개의 스위프를 우발적 계속적 실행 시험에 대해 기록한다. 행동 범례의 각각의 부분. 개인의 주의 처리과정의 효율에 따라 달라질 수 있는 3개의 파라미터 각각을 조사한다. 이들 파라미터는 잠복기, 진폭 및 ERP 성분의 대칭(공간적 분포)이다.
데이타 분석
먼저, T-시험 통계적 지도가, 시간 경과의 각 지점 마다에서 모두 28개의 전극에 대해 생성된다. 이는 Duffy 등(1981)의 통계적 가능성 맵핑에 대한 편차이다. 비록 탐구적이긴 하지만, 이러한 방법에 의해 용이하게 시각화된 지도가 작성되며, 이는 전극 부위가 추가 분석을 가능케함을 의미한다. P300은 목적하는 성분이므로, Pz는 통계적 분석을 위한 부위로서 선택되며, 상기 지도로 부터, 이는 성분의 촛점이 시각 작업을 위해 존재하는 것으로 여겨지는 경우이다. 이 후, 피크 잠복기 및 피크 진폭(275 내지 325msec 간격내)을 측정한다. 통계적 분석의 두 번째 단계는, 기준선 및 처리 상태를 비교하면서, 한 쌍의 T-시험 모델(Statgraphics, 1988)을 사용한다. 실행 데이타를 동일한 모델을 사용하여 분석한다.
예시하기 위한 28개의 두피 기록 부위에 대해 놓여진 CCPT 작업으로 부터의 ERP를 지닌, 전극 배열의 도해를 만든다. 또한, 인공물 교정 및 거부를 위해 사용되는 수직 엑스트라-오쿨로그램(VEOG: Vertical Extra-Oculogram) 및 수평 엑스트라-오쿨로그램(HEOG: Horizontcal Extra-Oculogram)의 기록을 포함한다.
SOT로 부터의 결과를 먼저 논의할 것이다. 다시, 이러한 특별한 범례는 수 많은 흥미로운 성분(DeFrance et al., 1993), 예를 들면 100 내지 200msec 간격내에 생성되는 N2 음성을 발생시킨다. N2 성분은 반응의 방향을 정하는 초기 단계인 처리과정 음성이다[DeFrance et al., 1993]. 이러한 성분은 처리 후 증진되는 것으로 나타났으나, 진폭 변화는 유의성[F(1,17)=2.30, p=0.0259]을 위한 발명자의 예비-확립된 한계치를 통과하지 못했다. 그럼에도 불구하고, 시험 후 조건에서의 후기 정점 양성(즉, P300 성분)은 왼쪽[F(1,17)=8.531, p=0.0095] 및 오른쪽[F(1,17)=16.31, p=0.009] 촉진 조건 모두에 대해 진폭이 현저히 더 커지는 것으로 보여졌다. 따라서, KantrollTM투여 후 P300 성분의 그룹 평균은 오른쪽 및 왼쪽 시야 모두에 방향을 맞추는 경우에 상당히 증진되는 것으로 밝혀졌다.
국소적 지도를, 왼쪽 시야에 대한 촉진(즉, '프라이밍된') 조건에 대한 기준선 및 처리 조건에 대해 조사한다. 오른쪽 시야에 대한 패턴은 왼쪽 시야에 대한 패턴을 반영하므로, 이들은 제시되지 않을 것이다. 100 내지 200 msec 간격에서, N2 음성은 오른쪽 측두-두정 영역에 대해 나타난다. 또한, 상시 성분에 대한 KantrollTM의 효과는 통계적 유의성에 근접하겠으나, 더 큰 변화가 P300 성분과 관련이 있고, 300 내지 400msec 간격을 비교함으로써 쉽게 평가될 수 있다. 실질적으로, P300 성분의 국소적 특징은 동일하게 유지되나. 피크 진폭은 KantrollTM처리에 의해 증진된다. 실행 데이타에 관해, 왼쪽 및 오른쪽 시야에 대한 합해진 반응 시간은 232±0.03 msec 대 238±0.08 msec 처리[F(1.17)=8.62, p=0.001] 후 더 신속해졌다. 결론적으로, N2 성부네 대한 경계 증진과 함께, P300 성분에 대한 현저한 효과가 있었다. 또한, 현저한 효과는 불면증 작업, CCPT와 관련된 P300 성분상에 나타났다.
우발적 계속적 실행 작업(CCPT)와 관련된 인식 ERP의 다양한 성분은, 현저한 P300 성분을 특징으로 하는, 기타 계속적 실행 작업에 의해 발생된 것과 많은 유사점을 갖는다[DeFrance et al., 1995b; Hillyard et al., 1973]. 파형의 3가지 셋트(착각 인자, 예고 시스날, 및 표적)를 분석을 위해 작성하지만, 단지 표적 파형만이 논의할 필요가 있다. 시험 전 대 시험 후 조건에 대한 비교에 의하며, P300 진폭을 유의적[F(1, 16)=7.422, p=0.015]으로 증진시키는 것으로 나타났다. 효과를 측정하기 위하여, 기준선 및 처리 상태에 대한 Pz에서의 평균 표적 파형을 비교한다. 약 300 msec 주변을 정점으로하는, 높은 양성-진행성 퍼텐셜은 전통적인 P300 성분이다. 또한, 표적 파형은, 지시된 대로, 피검자가 한 쌍중 두 번째 'T'에 반응하는 경우에 취해진 것들이다. KantrollTM의 투여 전(기준선) 및 투여 후(처리)의 표적 조건에 대한 300 내지 400 msec 간격 동안의 국소적 지도를 측정하고, P300 성분의 국소적 특징은 동일하게 유지되나, 시험 전 대 시험 후를 비교하는 경우 진폭의 증진이 나타났다. 즉, 기준선과 처리 조건 모두에서, P300 성분은 후미중심 부위를 점하였고, SOT의 경우와 동일하게 대칭적이었다. 그럼에도 불구하고, P300 성분의 진폭은 처리 조건에서 증진되었다. 약 처리 4주 후 전기생리학적 차이점이 있는 반면에, 상기 행동 프로브에 대한 주요 실행 변수-불일치 지수- 면에서는 유의적 차이가 없었다. 이에 대한 가능한 이유는, 상기 정상적인 피검자가 이미 이들의 정확도의 관점에서 이들의 최적 실행에 근접해 있었다는 것이다. 그러나, 실행 차이점이 임상적 집단중에서 생길 수 있을 것이라는 것을 기대할 수 있다.
KantrollTM을, 코카인 남용의 표시중 하나가 추가적 처리과정[Robledo et al., 1993]에 의해 변형된다는 것을 인식하면서, 코카인 남용에 대한 퍼텐셜 처리로서 고안한다. 또한, 사람 주의 처리과정과 인식 ERP의 P300 성분은 종종 연계되어 있다[Hillyard et al., 1973]. 그러면, 이 시점에서, P300 성분의 신경학을 재검토할 필요가 있는데, 이는 P300이 이와 관련하여 중요한 발견을 제공하기 때문이다. 널리 공지된 바와 같이, P300은 여러 개의 내생적 인식 ERP 성분중의 하나이며, 이의 잠복기, 형태, 및 공간상의 분포는 자극이 가해진 심리학적 상태에 대해 매우 의존적이다[Sutton et al., 1965]. 결론적으로, P300 성분은, 주의 및 기억에 있어서의 이의 추정상의 역할 때문에, 수 많은 연구의 대상이었다. 사람에서의 심부 기록으로 부터의 증거에 따르면, 전두엽 구조와 함께, 전방 측두엽(예: 유편도 복합체) 및 중간 측두엽(예: 해마 형성) 구조가 P300 성분의 조절과 관련이 있고, 실제로 측두 영역에 대한 이의 표시에 관여할 것이다[Halgren and Smith, 1987; Wood et al., 1980]. 그러나, 심부의 측두 구조는, 앞선 연구로 부터 믿어왔던 바와 같이, P300 성분의 유일한 발생인자인데, 이는 측두엽 절제술로 상기 성분을 없애지 못하기 때문이다[Johnson and Fedio, 1986; Smith et al., 1985]. 그럼에도 불구하고, 측도엽의 심부 부위는, 전두 영역과 마찬가지로[Simon et al., 1977], P300 성분에 대한 조절 역할을 갖는 것으로 여겨진다[Halgren and Smith, 1987].
임의의 인식 ERP의 특징이 유도성 행동 범례에 매우 대단히 고정되기 때문에, 본 연구에서 사용된 실행 프로브가 지속적 및 선택적 주의 작업 모두의 요소를 갖는다는 것을 유념하는 것이 중요하다. 따라서, ERP의 특정 성분(예: P300)은 주의 모든 면에 대해 언급될 수 있다. 흥미롭게도, 최근의 PET 연구[Corbetta et al., 1991]은, 안와전두 피질이 주의의 선택적 면과 상당히 관련이 있는 반면에, 지속적 주의가 전두 피질의 중간 부위를 더욱 이해시켜 주며[Cohen et al., 1991), 오른쪽 반구 부분이 특히 중요한 역할을 한다는 것을 보여준다[Pardo et al., 1991; Wilkins et al., 1987]. 안와전두 피질이 전방 측두 영역의 활성을 구상속을 통해 조절하기 때문에, 유편도 손상이 선택적 주의에도 또한 영향을 주어야 한다는 것은 놀라운 것은 아니다. 지극에 대해 충분한 감정적 가치를 부여하지 못하기 때문에, 유편도 손상이 선택적 주의를 손상시킨다는 것이 제시되어 왔다[LeDoux, 1993]. 또한, 주의 실행이 주입되는 정보의 특징 및 식별성에 의해 영향받는 다는 것이 공지되어 있다. 해마가 선택적 주의의 전반적인 과정에서 역할을 한다는 것이 정확한 역할이라는 분명한 증거가 있다[Salzmann et al., 1993; White, 1993]. 따라서, 안와전두-유편도 복합체-해마 형성 축이 선택적 주의의 조절에서 중요한 것으로 여겨지며, 이 경우 유편도 복합체는 자극 복합체에 특징 값을 부여하며, 해마 형성은 자극 중에서 특징 값을 비교한다. 이를 골간으로 하여, P300은 선택적 주의 처리과정-후속적 감정, 기억 및 인식 처리과정에 필요한 기초-의 양식-무관한 부산물로서 행동한다. 이후, 이들 실행 프로브는 전두-측두축을 따라 경로의 기능성을 첼린지한다. 코카인에 대한 뇌의 반응과 관련이 있는 것은 분명히 이들 전뇌 영역이다.
또한, 주의 처리과정은 생물기원의 아민 조절에 의존적인 것으로 밝혀졌다[Stanzione et al., 1990; Scatton et al., 1982]. 아민 합성을 위한 전구체는 음식 섭취에 의존적이기 때문에, 음식 보충물이 뇌의 이용가능한 생물기원의 아민 저정소를 변경시킬 수 있다. 이는, 특정 장해의 치료를 위해 뇌의 화합물의 영양적 개선을 표적으로 하는 다양한 임상적 전략을 도출해내었다[Blum, 1989c]. 이러한 시도는 정상적 세포 조절 기전을 이용하고, 심리학적 사고방식, 행동적 실행, 및 재발 예방 면에서 결정적인 개선을 가져왔다. 이러한 영양적 개선은, 주요 신경전달물질의 아미노산 전구체와 함께 이러한 신경전달물질의 합성에 중요한 바티민과 무기질의 투여에 의존한다. 이들 화합물(전달물질, 비타민 및 무기질) 모두 활성 알코올 및 약물 남용자에서 결핍된 것으로 나타났을 뿐만 아니라, 회복으로의 결손 웰(well)에서 잔존하는 것으로 나타났다[Blum, 1991a].
이어서, 본 연구는, 영양 보충이 정상 대조 그룹에서 신경심리학적 기능을 증진시킬 수 있고, 이는 코카인 회복 과정에서 아미노산 보충물의 이용에 대한 중요한 분기점이 될 것이다[Blum et al., 1989; Trachtenberg and Blum, 1988]. 장래의 계획은 어떻게 주의 및 기억 기능이 코카인 남용자의 회복과정에서 영향 받는지를 조사하는 것이다. 주의에 있어 중요한 각종 신경전달물질은 이들의 전구체를 위ㅎ한 영양 공급원에 의존적이기 때문에, 선택적 전구체 증진에 의해 주의 결핍 및/또는 회복 속도를 최소화 할 수 있다. Reward Cascade 모델의 내용은, 약물 복용 및/또는 유전적 이형의 결과로서 기능적으로 변형될 수 있는 것으로 밝혀진 이들 신경전달물질[Blum et al., 1990; Noble et al., 1991a; Nobel et al., 1991b; Blum et al., 1991a; Blum et al., 1991b; Blum et al., 1992; Nobel et al., 1992; Blum et al., 1994a; Blum et al., 1994b; Blum et al., 1995b; Blum et al., 1995a; Nobel et al., 1995] 각각을 조작하여 개선된 뇌 기능을 촉진시키고, 이로써 잠재적으로 느낌, 기분 및 행동을 개선시킨다는 것이다. Blum 등(1995a; 1996a)에 의해 처음으로 이러한 명명된 일반적 질환 "응답 결함 증후군"은 "응답 캐스캐이드"의 기능부전이다. 본 발명자들에 의한 결과는 "응답 결함 증후군"의 치료가 엔케팔리나제 억제 특성을 갖는 아미노산 적용 기술에 의해 최소한 부분적으로 달성될 수 있었다.
수 년의 연구 후, 연구자들은 유형 A 또는 유형 B로서 알코올중독자를 분류하는 인자를 인식할 수 있다. 최근의 NIDA-기금에 의한 연구는, 일반적으로 동일한 다중 기준이 코카인 남용자를 분류하는데 있어 유효하다는 것을 보여준다. 당해 결과는 남용의 상이한 원인을 설명하고, 특정 예방 및 치료 조정을 고안하는데 있어 유용한 것으로 입증된다.
실시예 17
다른 다형성 속성을 위한 MAA 기술
콜레스테롤 및 저-밀도 지방단백질 수준
심장 혈관 질환에서의 각종 유전자의 역할에 대한 본 발명자의 연구에서, 본 발명자들은 콜레스텔로 및 지방단백질과 관련된 4개의 유전자를 동정하였다. 이들은 세로토닌 수송인자(HTT), 옥시토신 레포터(OXYR), 도파민 DRD2 수용체(DRD2) 및 프레세닐린 유전자(PSI) 유전자이다. 각각의 다형성은 HTT 유전자에서의 프로모터 삽입 결실[Colllier et al., 1996], OXYR 유전자의 이뉴클레오티드 다형성[Mechelini et al., 1995], DRD2 유전자의 프로모터 삽입/결실 다형성[Arinami et al., 1997], 및 PSI 유전자에서의 RFLP[Huguchi et al., 1996]이다. 피검자의 각각의 그룹에 대한 연구를 기초로 하는 경우, 스코어는 다음과 같다: HTT 유전자 -0=SS, LL, 2=SL; OXYR 유전자 278/267=1, 276/276=2; DRD2 11=0, 12=1, 22=2; 및 PSI 유전자 22=0, 12=1, 11=2.
도 8은 콜레스테롤 및 LDL 대사에서의 상기 4개의 유전자의 역할을 산정하는데 있어서의 MAA 기술의 용도를 보여준다.
이들 결과는, MAA 기술이 임의의 폴리유전자 질환 또는 속성으로 일반화될 수 있다는 것을 입증해준다. 이들 4개의 유전자로 인해, 콜레스테롤 및 LDL 수준의 변동은 각각 16.2% 및 11.5%로 된다. p 값은 콜레스테롤의 경우 0.0002이고, LDL의 경우 0.002이다.
실시예 18
도파민원성 유전자, 난폭성 및 정신분열병/회피성 행동
"병리학적 난폭성에 대해, 본 발명자들은 DRD2 및 DAT1 유전자 변이체 모두에 대해 텍사스 마르코그에서 주거 치료 프로그램에 참여한 12 내지 19세의 11명의 청년의 유전자형을 결정했다. 이들 피검자를 충동-공격적 난폭성 행동을 갖는 것을 진단하기 위한 1시간의 인터뷰를 토대로 하여 선발하였다. 본 연구를 위해 선발된 각각의 피검자는 공인 신경학자회에 의해 해석된 Nicolett(TM)에 의해 측정된 2.5 SD 비정상 뇌 전기 활성 지도를 갖는다. 11명의 피검자중 6명이 D2A1 대립형질을 갖고(56%), 11명의 피검자중 11명이 DAT1(VNTR 10 대립형질)를 수반하였다. 피검자중의 D2A1 대립형질을 "초-대조 그룹"(1/30 또는 3.3%)과 비교하는 경우, 유의적인 관련성이 관찰되었다(X2=14.9, df=1, p,0.0001). 유사하게, 문헌의 대조 그룹(34/91 또는 37.4%, X2=7.6, df=1, p,0.006)과 비교시, 유의적 관련성이 DAT1 10 대립형질의 경우 발견되었으나, 10/10 유전형(p=0.093)의 경우 발견되지 않았다.
본 발명은 다양한 도파민원성 유전자와 SAB간의 관련성을 기술한다. SAB 데이타 셋트를 위해, 본 발명자들은, 172개의 스크리닝된 대조 그룹은 물론 3개의 도마민원성 유전자(DRD2, DAT1, DβH)에 대해 뉴저지주 프린스턴에 있는 외래피검자 클리닉에 다니고 있는 총 109명의 피검자의 유전자형을 결정했다. 카이(chi) 스퀘어를 이용하여, 본 발명자들은, D2A2 대립형질(X2=7.6, df=1, p=0.006)에 비해, D2A1 대립형질이 SAB(스코어 ＞84)를 갖는지에 대한 Millon Clinical Multi-Axial Inventory 컴퓨터처리된 시험에 의해 식별된 피검자와 유의적으로 관련있다는 것을 밝혀 내었다. 본 연구에서 D2A1 대립형질의 운반자가 정신병 피검자의 11/22 또는 50% 및 회피성 피검자의 12/27 또는 44%에서 발견되었으며, 초 대조 그룹(X2=16.75, df=1, p=0.000044)과 비교시 유의적 관련성이 있다. 상기 방법을 이용한 SAB로, 카이 스퀘어 분석이 DβHB1 및 DAT110/10 대립형질의 관련성을 밝히지 못한 반면, 대조 그룹(X2=6.3, df=1, p=0.012)과 비교시 SAB로 진단된 이들 개인(18/28 또는 68%)에서의 DAT1 480bp VNTR 10/10 대립형질간에서 유의적 관련성이 발견되었다. 유사한 경향이, 스크리닝된 대조 그룹(초 대조 그룹은 아님)(X2=2.9, df=1, p,0.09)와 비교시, DβHB1 대립형질(17/23 또는 76%)에서 발견되었다. 선형 경향 분석은 SAB 중증도가 증가함에 따라 D2A1 대립형질의 빈도가 증가함을 보여주었다(A1/A1=835; A1/A2=41%; 및 A2/A2=23%; p=0.0005). 다중 변성 관련성을 이용하여, D2A1 대립형질 및 성은 둘다 SAB 중중도의 유의적인 예견인자이다. D2A1 대립형질을 이용하여, 본 발명자들은 불균등 비가 2.79(p=0.018)이고, 성별이 3.6(p=0.007)이라는 것을 발견하였다. p=0.778 에서의 Hosmer-Lemeshow 적합도 및 변동에 대한 조합된 공헌은 17.9%이다. SAB에서, DRD2 유전자가 DAT1 유전자 보다 더 중요한 것으로 여겨진다.
실시예 19
유전적 다형성에 대한 특이적 분석의 예
다음은 RDS의 질병소인, 관련 행동 및 기타 폴리유전자 속성을 진단하는데 사용되는 본 발명에서 제안된 각종 유전자에 특이적 검출 방법의 예이다. 다수의 특이적 분석은 문헌에서 밝혀진 바와 동일하고, MAA 기술에서의 다형성에 대한 이러한 분석의 용도를 예시한다. 당업자는 특이적 대립형질 다형성을 검출하기 위하여 이러한 분석을 변형시킬 수 있으며, 본원에서 기술된 것 이외의 추가적 유전자 및 분석이 MAA 분석에 사용될 수 있다는 것을 인식할 것이다.
DRD1.
DRD1 유전자를 조사하기 위하여, 본 방법은 문헌[Cichon et al., (1994)]에 기술된 PCRTM방법에 의해 처리된 5'UTR에서의 A 에서 G 로의 변화로 이루어진 Ddel1 다형성의 이용을 포함한다.
DRD2.
이 유전자의 검출은 피검자의 DNA를 수득하는 단계, 상기 DNA를 TaqI 제한효소로 분해시키는 단계, 생성된 DNA 단편을 분리하는 단계, 상기 분리된 DNA 단편을 표지된 재조합 파지-hD2G1(ATCC#61354 및 61355) 또는 사람 도파민 D2 수용체의 6.6kbA1 대립형질에 특이적으로 결합하는 이의 단편에 하이브리드화시키는 단계, 및 사람 D2 수용체의 상기 A1 대립형질의 존재를 판정하는 단계를 포함한다. 특히, 재조합 파지-hD2G1(ATCC#61354 및 61355)의 단편은 약 1.7kb 크기의 BamHI 단편일 것이다. 다른 검출 방법은 PCRTM기술[Nobel et al, 1994]을 포함한다.
DRD4.
DNA를 추출하고, 어닐링 및 5분간 70℃에서의 연장 반응과 함께 고온의 변성 온도(1분간 98℃) 및 VENT 폴리머라제를 사용하여 PCRTM로 증폭시킨다[Sommer et al., 1993]. 사용된 프라이머[Nanko et al., 1993]는 5'-AGG TGG CAC GTC GCG CCA AGG TGC A-3'(서열 23) 및 D4=42: 5'-TCT GCG GTG GAG TCT GGG GTC GGA G-3'(서열 24)이다.
DAT1.
DAT1 반복 다형성의 측정은 VNTR 유전자결정을 포함한다. 게놈 DNA를 추출하고, DAT1 40-bp VNTR의 PCRTM으로 증폭시킨다. 3'UTR에서의 대립형질을, 문헌[Vandenbergh et al., 1992a]에 보고된 올리고머 및 PCRTM조건을 이용하여 PCRTM으로 측정한다. PCRTM증폭 후, 생성물을 8% 아크릴아미드 겔에서, 크기 마커의 셋트로 전기천공시킨다.
DβH.
문헌[D'Amato et al.,(1989)]은 A 및 B로 명명된 두 개의 Taq DβH 다형성의 존재를 보고한다. EcoRI 부위의 2.7kb 삽입체로 구성된 DβH cDNA 클론 AII[Lamouroux et al., 1987]을 사용한다. 표지화를 개선하기 위하여, 벡터를 BamHI 및 SalI으로 분해하여 5개의 밴드를 생성시킨다. 3.5kb 단편을 B 다형성을 시험하기 위하여 표지화한다. TaqI 제한 엔도뉴클레아제에 의한 분해, 아가로즈에서의 전지천공, 나일론 필터로의 서던 전달, 32P 표지화된 프로브로의 하이브리드화, 및 자동방사선사진은 2,8kb(B1) 및 1.4kb(B2)의 단편을 입증해준다.
MAOA.
MAOA VNTR 다형성을 이용한다[Hinds et al., 1992]. 이 복합 다형성은 불완전하게 복제된 신규 23bp VNTR 모피트(mofit)에 근접한 GT 미세부수체(microsatellite)로 이루어지고, 대립형질은 이뉴클레오티드 반복체 및 VNTR 반복체 모두에서 상이하다. DNA 표준 방법으로 추출한 후, PCRTM으로 증폭시키고 각각의 프라이머를 형광 HEX 또는 FAM 아미디트[Applied Biosystems, Forster City, CA] 프라이머[＜320; 320-333; 334; ≥335]로 표지시킨다. 10배 희석된 PCRTM생성물의 2㎕를 탈이온화된 포름아미드 2.5㎕ 및 ROX 500 표준물 0.5㎕에 가하고, 92℃에서 2분간 변성시킨 후, Applied Biosystem 373 DNA 서열분석기중의 6% 폴리아크릴아미드상에 충전시킨다. 겔을 5시간 동안 1100 볼트 및 일정한 30W에서 전기영동시킨다. 이 후, 겔을 레이저로 스캐닝하고 내부 ROX 500 표준물을 이용하여 분석한다. 피크는, 염기쌍 길이에 의해 크기가 결정된 채색 단편을 기초로 하여 Genotyper(버젼 1.1)[Applied Biosystem]으로 인식된다.
인트론 6의 돌연변이체 영역의 트립토판 2,3-디옥시게나제 유전자 PCR TM 증폭
표적 유전자를 증폭시키기 위한 PCRTM반응물은 다음가 같다: 10mM Tris HCl, pH 8.3, 50mM Kcl. 1.5mM MgCl2, 0.05% Tween 20, 0.05% NP-40, 100μM의 각각의 dATP, dCTP, dTTP, dGTP, 0.1μM 프라이머. 프라미머는 #116 GACACTTCTGGAATTAGTGGAGG(서열 25) 및 #117 GAAGTTAAATCCATGTGGCTC(서열 26)이다. 다음을 20μL에 가한다: 0.5U AmpliTAq(Perkin-Elmer, Foster City, CA), 1μl(250mg) 게놈 DNA. 반응을 다음 프로토콜을 사용하여 PE-9600 열 순환기(Perkin Elmer) 또는 PTC-100 프로그램가능한 열 제어기(MJ Research, Inc., Watertown, MA)상에서 수행한다: 94℃에서 5분, 이어서, 94℃에서 30초, 60℃에서 30초, 72℃에서 1분의 30 사이클, 이어서 72℃에서 5분. 증폭이 일어났는지를 판정하기 위하여, 반응 혼합물 10μl을 TBF 완충액중의 1.5% 아가로즈 겔상에서 전기영동시킨다.
상기 PCRTM반응물로 부터, 분액 10μl을 제한 효소 Bs1I의 1.5 단위를 사용하여 분해시키고, 최종적으로 완충액(New England BioLabs로 부터 공급)으로 세척한 후, 55μ에서 밤새 배양한다. 분해된 생성물의 분액 10μl을 4% 메타포(Metaphor) 아가로즈(F.M.C. Products, Rockland, ME) 겔에서 1시간 동안 전기영동시킨다. 겔을 에티듐 브로마이드로 염색시킨다. 3개의 큭기의 단편이 기대된다. 다형성 부위가 G/C인 경우, DNA는 완전히 분해되어 673bp 및 359bp 단편이 생성된다. 다형성 부위가 A/A인 경우, 1032bp 단편은 분해되지 않는다. G/A 이형접합체는 3개의 단편, 1032bp, 673bp 및 359bp를 갖는다.
G-＞T 돌연변이에 대한 3' 인접 서열은 GATA이다. GATA는 DpnII 제한 엔도뉴클리아제의 인식 부위이다. 3' 23bp 올리고머를 설계하여 G-＞T 돌연변이에 대한 3' 인접 서열 ATC에 일치시키며, 이는 다음과 같다(올리고에는 밑줄이 그어있고, 돌연변이를 위한 두개의 g 부위에 2개의 밑줄이 그어있다):
5'TCATTAATCCTCTGGGTATTGTAAATGTGGATTTAGGTTAATATATTATATATAATGCCAAATAATGGCATAGATAAGGAATAGGGAGAAAAAGGGAATTA-3'(서열 27)
TAGTCTTATATCCCTCTTTTTCTTA(서열 28)
세번째 위치에서의 상기와 같은 불일치는 드들게 PCRTM프러이머로서의 이의 효과를 손상시킨다.
5' 프라이머를 선택하여 29 염기쌍의 생성물을 수득한다. G-＞ T 돌연변이가 G인 경우, GATC 부위를 절단하여 22bp 및 70bp 단편을 수득한다. G-＞ T 돌연변이가 A인 경우, 단지 92bp 단편이 존재한다. PCRTM반응물의 조건은 다음과 같다: 1 μM 각각의 프라이머, 0.2mM 각각 dNTP, 50mM KCL, 10mM Tris HCL, 1.5mM MgCl2, 0.001%(w/v) 겔라틴, 2.5 U/100μL, AmpliTAq(R) DNA 폴리머라제, 80ng 게놈 DNA. PCRTM사이클은 94℃에서 4분에 이어, 94℃에서 30초, 52℃에서 90초, 72℃에서 120초의 30 사이클, 이어서 72℃에서의 5분이다. DpnII 분해를 위한 다음 조건에서 에서 밤새 배양한다: PCRTM생성물 10μL, DpnII의 10U/μL중의 0.05μL; 1M NACL, 0.5M Bis HCL, 0.1M MgCl2, 10mM 디티오트레이톨 의 1.5μL, pH 7.9: H2O 3.5μL, 37℃. 생성물을 4% 메타포 아가로즈에서 전기영동시킨다.
HTR1A 반복 다형성
상기 복합 다형성을 결정하는데 사용된 방법은 문헌[Bolos et al., 1993]에 기술되어 있다. PCRTM생성물을 표지시키기 위하여, 각각의 형광 표지된 프라이머 0.1μM을 반응중에 사용한다. 형광 안료는 FAM 아미드트(Applied Biosystem, Foster City, CA)이다. 10배 희석된 PCRTM생성물 2μl를 탈이온된 포름아미드 2.5μl 및 ROX 500 표지된 표준물 0.5μl에 가하고, 2분간 변성시킨다. 92℃에서, Applied Biosystem 373 DNA 셔열분석기중의 6% 폴리아크릴아미드 겔상에 충전시킨다. 겔을 5 시간 동안 1100 전압 및 일정한 30W에서 전기영동시키고, 레이저로 스캐닝한 후, 내부 ROX 500 표지된 표준물을 사용하여 분석한다. 각 레인중의 내부 표준물의 존재로 인해, 매우 정확한 길이 측정이 가능하다. 피크를 Genotyper(버젼 1.1, Applied Biosystem)으로 분석하고, 염기쌍 길이로 크기를 판정한다. 컴퓨터가 유사한 높이의 두 개의 피크를 검출하는 경우, 짧은 피크는 항상 a 대립형질의 컬럼에 위치하고, 긴 피크는 h 대립형질 컬럼에 위치한다. 컴퓨터에 의해 단일 피크가 확인되면, 피검자는 a 대립형질에 대해 상동접합성인 것으로 추측된다.
HTR2A 유전자
HTR2A를 문헌[Williams et al., 1996]에 기술된 단일 염기쌍 다형성을 사용하여 산정한다. Applied Biosystem DNA 서열분석기를 사용하는 방법은 상기한 바와 같다.
OB 유전자
사람 Ob 유전자를 함유하는 YAC 콘티그(contig)상에 존재하는 이뉴클레오티드 반복체는 문헌[Green et al., 1995]에 기술되어 있다: D7S1813, D7S1875, D7S514 alc D7S780. 이들중 D7S1875는 OB 유전자에 가장 근접하다. 이후, 이를 OB1875이라 칭한다.
칸나비노이드 수용체 유전자
DNA를 문헌[Dawson 1995]에 기술된 바와 같은 하기 프라이머를 사용하여 증폭시킨다: 5'-GCTGCTTCTGTTAACCCTGC-3'(서열 29) 및 5'-TACATCTCCGTGTGATGTTCC-3'(서열 30). 이로써 (AAT)n 3조(triplet) 반복체의 대립형질을 동정된다. 표분 방법을 사용하여 PCRTM생성물을 표지화시키고 생성된 다형성을 측정한다(상기 참조).
GABRB3 유전자
DNA 샘플을 문헌[Mutirangura et al., 1992]에 기술된 하기의 프라이머를 사용하여 증폭시킨다: CA 쇄: 5'-CTCTTGTTCCTGTTGCTTTCAATACAC-3'(서열 31) 및 GT 쇄: 5'-CACTGTGCTAGTTTAGATTCAGCTC-3'(서열 32). 이로써 길이가 181 내지 201bp로 다양한 (CA)n 반복체의 11 대립형질이 동정된다. 표준 방법을 사용하여 PCRTM생성물을 표지화시키고 생성된 다형성을 측정한다(상기 참조).
뉴런성 니트르 옥사이드 산타제 유전자
최근에 니트르 옥사이드 신타제 유전자가 마우스의 공격성 행동과 관련이 있는 것으로 밝혀졌다. 문헌[Hall et al., 1994]의 방법을 이용한다. 본 발명자들은 뉴런성 니트르 옥사이드 신타제 유전자(nNos1a)의 이뉴클레오티드 반복 다형성의 관련성을 조사했다. Applied Biosystem DNA 서열분석기를 사용하는 방법은 상기한 바와 같다.
COMT 유전자
COMT 유전자의 분석의 경우, 단일 염기쌍 다형성이 문헌[Lachman et al., 1996]에 기술되어 있다. 이러한 다형성이 COMT의 상이한 활성 수준과 관련이 있는 것으로 밝혀졌다[Daniels et al., 1995].
아포리포(apolipo)단백질-D 유전자
DAN를 추출하고, 제한 효소 TaqI으로 분해한다. 아가로즈 겔 전기영동 후, 이를 나일론 막(Hybrid N. Amersham, UK)상에 이동시키고 표준방법을 사용하여 32P-표지된 APO-D 프로브로 하이브리드하 시킨다. 두개의 대립형질 2.2kb 및 2.7kb가 동정된다.
사람 염색체-2
2p21(짧은 암(arm)의 정단으로 부터의 약 74cM)에 맵핑된 미세부수체 다형성, D2S1788이 동정되었다[Comuzzie et al., 1997]. DNA를 림프구로 부터 수득하고, 약 20cM에 산재된 169개의 고도로 다형성인 미세부수체 마커를 포함하는 MapParis 6a Linkage Screening Set(Rsearch Genetics)로 부터의 형광으로 표지된 프라이머를 이용하는 PCRTM에 사용한다.
UCP-2 유전자
이 유전자를 비만과 과인슐린증과 연관된 사람 염색체 11과 마우스 염색체 7의 영역에 맵핑시킨다. 이 유전자의 경우, 정방향 프라이머 서열은 5'-CATCTCCTGGGACGTAGC-3'(서열 33)이고, 역방향 프라이머는 5'-AGAGAAGGGAAGGAGGGAAG-3'(서열 34)이다. 사람 UCP2 암호 서열에 대한 GenBank 수탁번호는 U76367이다.
실시예 20
유전적 다형성을 MAA 기술의 예
이 실시예는 정신병 장해와 무관한 많은 폴리유전자 속성을 제시하고, MAA 기술이 모든 폴리유전자 장해 및 모든 폴리유전자 속성에 일반화될 수 있음을 설명해준다. 하기의 내용은 상이한 폴리유전자 장해의 다양한 예가 MAA 기술을 이용하여 연구될 수 있는지를 교시한다.
골관절염
단계 1
연구될 폴리유전자 장해 또는 속성을 동정한다. 잔신 골관절염(GOA)가 관절 질환중 가장 일반적이다. 이는 불구의 원인이며, 개발 국가에서 3개의 주요 건강 보건 문제중의 하나로 여겨진다. GOA는 45세 이상의 남성 및 여성 10 내지 15% 및 60세 이상의 고령자의 70%에게 통증과 기능의 손실을 준다. GOA의 발병학은 복잡하고, 환경 및 유전적 인자와 관련이 있다. 여성에서의 쌍둥이 연구에 따르면, 부가 유전자가 GOA의 54%에 해당한다고 추측된다.[Kaprio et al., 1996]. 산발성 GOA는 폴리유전자 장해로서 유전된다.
단계 2
폴리유전자의 중중도를 측정하는 스케일 정한다. OA의 중증도를 Kellgren 스코어를 사용한 x-레이를 토대로 하여 측정한다[Kellgren and Lawrence, 1957].
단계 3
시험할 후보 유전자를 동정한다. OA는, 연골의 합성 또는 분해에서 일정한 역할을 하는 한계치의 변이체 유전자의 존재 때문에, 매우 일어나기 쉽다. 이러한 개념 및 잠재적인 후보 유전자의 일부가 표 70에 기술되어 있다. OA에서의 후보 유전자는 연골의 합성 또는 분해를 조절하는데 있어서의 이들의 역할을 기준으로 한다.
단계 4
각각의 유전자와 관련된 하나 이상의 다형성을 동정한다. 하기는 OA를 위한 MAA 기술에 사용될 수 있는 일부 다형성의 리스트이다.
VNTR=변화가능한 직렬 반복
DN= 이뉴클레오티드 반복
TN= 삼뉴클레오티드 반복
RFLP= 제한 단편 길이 다형성
단계 6
더미(dummy) 폴리유전자 또는 PG 변수를 정한다. 상이한 후보 유전자에 대한 스코어를 합하여 PG 스코어를 만든다.
단계 7
PG 대 QT 또는 DV의 일변수 회귀 분석을 수행한다. 통계적 프로그램을 사용한 일변수 회귀 분석을, 제1의 OA(oa) 후보 유전자(cg)(PG+PG oacg1)에 대한 스코어를 사용하고, 이어서 제2 후보 유전자(PG+oacg2)를 가하여 PG에 대하여 수행한다. 이를, "n" OA 후보 유전자가 가해질 때(PG+oacgn)까지 지속한다(여기서, n은 가해진 유전자의 수이다).
단계 8
결과를 플로팅한다. 이어서, 결과를 도 4의 ADHD 스코어에 대한 부가 + 공제 유전자에 대해 되시된 바와 같이 그래피한다.
단계 9
단지 부가 유전자만을 사용하여 방법을 반복한다. 유일한 부가 유전자를 도 5의 ADHD에 대한 부가 유전자에 대해 도시된 바와 같이 플로팅한다.
콜레스테롤 수준
단계 1
연구할 폴리유전자 장해 또는 속성을 동정한다. 수 년간의 연구를 통해, 혈액 콜레스텔로의 증가된 수준과 관상 동맥 질환 및 발작사이의 관련성이 밝혀졌다. 유전적 인자 및 식사가 콜레스테롤 수준에 일정한 역할을 하기 때문에, 관련된 유전자의 동정은 위험한 사람을 찾자내고, 콜레스테롤 수준을 저하시키는데 있어서 중요할 수 있다.
단계 2
폴리유전자의 중등도를 측정하는 스케일을 정한다. 금식 샘플에 기초한 혈액 콜레스테롤 수준은 가장 우수한 중증도 스케일을 제공할 것이다.
단계 3
시험할 호보 유전자를 동정한다. 콜레스케롤 합성 경로에 직접적으로 관련된 수 많은 유전자가 콜레스텔로 대사에 일정한 역할을 하는 것으로 제장되어 왔다. MAA 기술력을 설명하기 위하여, 본 발명자들은 이를 사용하여 콜레스텔로 경로 밖의 다수의 유전자의 역할을 평가하고, 콜레스테롤 수준의 조절에서의 가능한 역할을 인식했다. 본 발명자들은 콜레스테롤 및 지방단백질 대사와 관련된 4개의 유전자를 동정했다. 이들은 세로토닌 수송인자(HTT), 옥시토신 수용체(OXYR), 도파민 DRD2 수용체(DRD2) 및 프레세닐린 유전자(PS1) 이다.
단계 4
각각의 유전자와 관련된 하나 이상의 다형성을 동정한다. 각각의 다형성은 HTT 유전자에서의 프로모터 삽입 결실[Collier et al., 1996], OXYR 유전자의 이뉴클레오티드 다형성[Mechelini et al., 1995], DRD2 유전자의 프로모터 삽입/결실 다형성[Arinami et al., 1997] 및 PSI 유전자에서의 RFLP[Hioguchi et al., 1996]이다.
단계 5
유전형에 스코오를 부여한다. 피검자 각각의 그룹의 연구를 토대로 한 스코어는 다음과 같다: HTT 유전자-0=SS, LL, 2=SL; OXYR 유전자 278/278=0, 278/267=1, 276/276=2; DRD2 11=0, 12=1, 22=2; 및 PSI 유전자 22=0, 12=1, 11=2.
단계 6
더미 폴리유전자 또는 PG 변수를 정한다. 상이한 후보 유전자에 대한 스코어는 합하여 PG를 얻는다.
단계 7
PG 대 QT 또는 DV의 일변수 회귀 분석을 수행한다. 통계적 프로그램을 사용한 일변수 회귀 분석을, 제1의 콜레스텔로(c) 후보 유전자(cg)(PG+ccg1)에 대한 스코어를 사용하고, 이어서 제2 후보 유전자(PG+ccg2)를 가하여 PG에 대하여 수행한다. 이를, "n" 콜레스테롤 후보 유전자가 가해질 때(PG+ccgn)까지 지속한다
단계 8
결과를 플로팅한다. 이어서, 결과를 도 4의 ADHD 스코어에 대해 되시된 바와 같이 그래피한다. 도 8은 콜레스테롤 및 LDL 대사에서의 이들 4개의 유전자의 역할을 인정하는 MAA 기술의 용도를 보여준다.
단계 9
첨가 유전자만을 사용하여 과정을 반복한다. 첨가 유전자만이 도 5에서 ADHD 스코어에 대한 첨가 유전자에 대하여 나타낸 바와 같이 도시한다. 이 경우, 4개의 유전자 모두는 첨가물이다.
수명
단계 1
연구할 폴리유전자 질환 또는 행도을 확인한다. 노화는 인구에서 생존자의 평균 연령이 증가하고 65세 이상의 개인의 수가 증가함에 따라 관심이 증가하는 과제이다. 사람이 생존하게 되는 기간을 적게 예측할 수 있는 유전자의 수의 확인은 단명하는 위험에서 개인을 확인하는데 있어서 가치를 갖는다. 특정의 중용한 유전자의 영향에 대한 조정은 생명 자체 뿐만 아니라 생명의 질을 연장시키는데 있어서 상당한 이점이 될 수 있다.
단계 2
폴리유전자 질환의 심각성을 측정하는 스코어를 설정한다. 노화에 대한 본질적인 심각성의 스코어는 연령이다. 그러나, 이 경우, 스코어가 높아질수록(연령이 많아질수록), 표현형이 더 양호해진다.
단계 3
시험할 선택 유전자를 확인한다. 슈퍼옥사이드 디스뮤타제, 유리 라디칼 스캐빈저와 같은 특정한 유전자는 콜레스테롤 물질 교대와 마찬가지로 노화시의 동물 모델에 포함되는 것으로 오랫동안 공지되어 왔지만, MMA 기술은 장수에 역할을 담당하는 미리 추정되지 않은 유전자의 다수의 신규한 유전자를 확인하는 잠재성을 갖는다. 콜레스테롤 양은 심혈관 질한으로부터의 사망과 상관관계가 있기 때문에, 본 발명자들은 콜레스테롤 양에 있어서 중요한 역할을 담당하는 2개의 유전자를 조사하는 것을 선택한다. 본 발명자들은 또한 APOE 유전자도 포함시킨다.
단계 4
각각의 유전자와 관련된 하나 이상의 다형성을 확인한다. 이러한 유전자는 다음과 같은 방식으로 스코어링한다. 선택된 유전자의 유전자형을 연령이 상이한 그룹에 대하여 카이 평방근 분성으로 비교한다. 특정한 유전자형이 이들 연령 그룹에 대하여 주기적으로 진보적으로 증가하는 경우, 이러한 유전자형은 = 2로서 스코어링한다. 나머지 유전자형은 이들 상이한 연령의 피검자에서 이들의 상대 주기에 따라 = 0 또는 = 1로서 스코어링한다.
단계 5
스코어를 유전자형에 대하여 할당한다. 상이한 선택 유전자에 대한 스코어를 가하여 PG 스코어를 수득한다. 각각의 유전자는 폴리유전자 스코어에 점차적으로 가한다.
단계 6
동체 폴리유전자 또는 PG 변형물을 설정한다. 상이한 선택 유전자에 대한 스코어를 가하여 PG 스코어를 수득한다.
단계 7
PG 대 QT 또는 DV의 단변형성 회귀 분석을 수행한다. 특정한 통계학적 프로그램을 이용하는 단변형물 회귀 분석은 첫번째 수명(I) 선택 유전자(PG + lcg1)에 대한 스코어, 이어서 두번째 선택 유전자(PG + lcg2)에 대한 스코어를 사용한 경우의 PG에 대하여 수행한다. 이는 모든 수명 선택 유전자가 가해질때까지 계속한다(PG + lcgn).
단계 8
결과를 도시한다. 이후에, 결과를 도 5에서 ADHD 스코어에 대하여 나타낸다. 유전자 대 수명에 관한 데이타를 도시하는 경우, 208개의 피검자의 연구에서 조합하는 경우 3개의 유전자를 확인하는 MAA 기술은 p= 1.5 x 10-7인 매우 중요한 결과를 제공한다.
단계 9
첨가 유전자만을 사용하는 과정을 반복한다. 첨가 유전자만을 도 5에서 ADHD 스코어에 대한 첨가 유전자에 대하여 나타낸 바와 같이 도시한다.
이들은 MMA 기술이 연구할 득정한 질환 또는 특성과 관련된 특정한 사람 유전자를 이용하는, 특정한 폴리유전자 질환 또는 특성에 일반화할 수 있다. 게놈 프로젝트가 다음 10년내에 이의 결론에 근접함에 따라, 다형성이 모든 사람 유전자에 대하여 확인되어 모든 폴리유전자 질환 또는 특성에 대한 철저한 시험이 가능하게 하는 것으로 기대된다. 본 발명자들은 MMA 기술은 또한 기타의 동물 및 식물에서 폴리유전자 특성에 적용할 수 있으며, 이 기술을 기타 종에 이용하는 것은 본 발명에 의해 포함된다.
실시예 21
항-갈망 조성물 및 심한 중독으로부터 트렉산R이후의 신속한 제독에 대한 순응의 증진
지난 십년간에 걸쳐, 마취성 날트렉손(TreanR, Dupon, Delaware)을 이용하는 메타돈 또는 헤로인 중독을 제독하는 신규하고 신속한 방법이 미국, 캐나다 뿐만 아니라 전세계적으로 다수의 기타 국가에서도 많은 치료 센터에서 관심이 집중되었다. 치료불능의 아편 중독자중에서의 탈락율은 현재에도 90%에 근접한다. 이러한 신속한 방법에서의 기본적인 개념은 피검자에게 아편 유도된 도취 효과를 차단하는 마취성 길항제를 제공하는 것이다. 이러한 접근법을 이용하는 경우, 대부분의 피검자는 순응하지 않으며 상습성은 비율은 99% 이상이다(S. Hall, San Antonio Methadone Clinic). 비순응성에 대한 주요한 이유는 마취성 길항제(TrexanR)가 마약 또는 알콜 유도된 병적 쾌감을 차단하지만(O'Malley et al., 1992; Volpicelli et al., 1992), 약제는 갈망하는 거동에 대한 효과가 거의 없다는 사실로 인한 것이다. 본 발명자들은 아미노산 치료가 다수의 도취자에 대한 갈망 거동을 감소시키기 때문에, 이들은 트렉산R및 아미노산 치료의 조합이 도취물을 30년 이하로 사용해온 중중 중독자에 잇어서의 트렉산R에 댜한 순응을 연장하는지 여부를 시험하기로 결정하였다.
방법.이 연구는 샌 안토니오 메타돈 클리닉에서 수행하였다. 연구에 포함되는 기준은 에로인/아편 의존성에 대해 DSM III을 이용하여 진단한 바와 같이 심한 중독증으로 고려되는 남성 및 여성 피검자 모두에 포함된다. 각각의 피검자는 0.4 내지 0.8mg의 주사를 먼저 받아서 예비 평가한다. 나르칸 및 이의 회수를 검정한다(너무 심한 경우에는, 이들은 연구에 도입시키지 않는다). 이들이 상기 첫번째 시험을 통과한 경우, 이들은 이후에 듀퐁의 트렉산R12.5mg을 경구 용량으로 투여한 다음, 1시간 및 반시간에 걸쳐 회수 증상에 대하여 평가한다. 피검자가 이 시험을 통과하는 경우, 이를 1일 50mg의 트렉산R을 제공한다. 이 연구에서, 총 12명의 피검자를 평가한다. 이 연구에서, 각각의 피검자는 상기 처방에 따라 마취 길항제를 접수하는 외의 각각의 피검자는 또한 매일 다음 아민노산을 접수할 수 있다: DL 페닐알라닌(2,700mg), L-트립토판(450mg), L-티로신(300mg), L-글루타민(150mg) 크롬(피콜리네이트-200mg으로서) 및 피리독살-5-포스페이트(30mg). 트렉산 단독 또는 아미노산 제형과의 혼합물 형태의 트렉산을 취하는 것을 거부하는 재발 또는 자체 리포트를 사용하지 않는 일 수를 계산한다. 각각의 피검자를 전화 또는 개인 접촉을 통해 일일 기준으로 평가한다(접촉하는데 실패한 일부 정도).
결과.결과는 트렉산R이용을 계속하는 것에 대한 순응성을 상당히 증진시킨다는 점에서 현저하다. 샌 안토니오 메타돈 클리킥이 이의 수백명의 피검자에 대하여 계산하고, 이러한 신속한 제독 접근법에 직면한 평균 순응 일수는 37일이다. 현저하게 대조적으로, 트렉산과 아미노산 치료 모두를 받은 이 연구에서의 12명ㅇ의 피검자들은 재발이 없거나 평균 262일의 조합을 취하는 것으로 기록되었다( p＜0.05 이상에서의 p).
결론.항-갈망 제형의 첨가는 아편에 대한 갈망을 상당히 감소기키며, 따라서 재발 방지, 특히 마취성 길항제 트렉산과 혼합되는 경우 심한 아편 중독자들을 보조하는데 있어서 중요한 것으로 판단된다.
실시예 22
보상 결핍증의 결정자로서의 D 2 도파민 수용체 유전자
요약.도파민성 시스템, 특히 도파민 D2수용체는 뇌의 보상 메카니즘에 깊이 영향을 기쳐왔다. D2도파민 수용체의 기능부전은 이상한 물질 추구 행동(알콜, 약물, 담배 및 식품) 및 기타 관련 행동(병적인 도벽, 토우렛 증후군 및 주의력 결핍 과대행동 질환)을 유발한다. 본 발명자들은 D2도파민 수용체 유전자의 변형체가 '보상 결핍 증후군'의 중요한 공동 유전성 결정자라는 것을 제안한다.
본 발명자들은 충동성-첨가제-강박성 질환에서의 DRD2유전자의 A1대립형질의 예측적인 값을 평가하는 수학적 방법으로서 바이에스(Rosner, 1986)이론을 이용해 왔다.
바이에스 이론은 특별한 사건(결핍)이 여기서 또다른 사건(질병)을 생성하고, 예를 들면, DRD2의 A1대립형질의 소유는 비정상적인 약물 및 알콜 추구 행동을 유발하는 경향을 예측하는 약제에서 광범위하게 사용된다.(표 72).
선별 시험을 평가하는 경우, 민감성은 이 시험이 문제의 질병을 갖는 사람에게서 긍정적으로 되는 가능성이며, 특수성은 시험이 질병을 갖지 않은 사람에게는 부정정으로 되는 가능성이다. 바이어스 이론에 있어서, 본 발명자들은 다음 식을 사용한다:
*C1복대립형질은 동형지코트 유전형이다. 알콜중독(47/82); 대조(29/87):(χ2=9.8, df=1, P=0.002)
데이타를 지지하는 가정은 문헌[블럼 등, 1995]에 설명되어 있다.
특수성을 계산하기 위하여, 본 발명자들은 양호하게 특성화된 대조, 알콜에 대한 스크리닝, 약물, 및 일부 샘플에서의 담배 사용을 사용하였다(표 7). 어떠한 선행의 연구도 대조(블럼 등, 1995a)에 대한 강한 배제 기준을 사용하였고, 이러한 효과는 알콜 중독 자체가 DRD 유전자 다형성과 관련된 진정한 표현형이 아니기 때문에 필수적이다[참조: Blum et al., 1995b; Neiswagner et al., 1995; Cummings et al., 1991]. 더구나, 표현형의 민감성을 계산하기 위하여, 본 발명자들은 프로밴드가 질병의 만성 또는 중증도에 대하여 특성화한 연구로부터의 데이타를 취한다.
시험의 긍정적인 예측치(PV+)는 시험이 건강하고 질환이 있는 개인(Galen et al., 1975) 둘다를 포함하는 집단에 적용하는 경우 진정으로 긍정적이라는 긍정적인 결과의 비율이다. TaqI A1유전형을 사용하는 경우, PV+는 0.774 또는 74%이며, 다시 말해서 긍정적인 예측치는 높지만, PV-는 단지 0.548 또는 54.8%이다. 본 발명자들은 충동적-중독성-강박성 행동과 관련된 개인이 대조 그룹으로부터 제외되는 경우의 연구에서 보다 부정적인 예측치를 기대한다. 이러한 질환을 지닌 피검자에서의 합체된 데이타는 DRD2유전자 변형체와 강한 긍정적 상관관계에 집중된다[Yates χ2=68.38, df=1, P＜10-7].
실시예 23
주의력 결핍-과대 행동 질환 증후군 평가 스케일(ADHD SAS)
최근의 문헌(지난 15년간에 걸침)은 주의력 결핍에 대한 진단학적 기준을 나타내고, 과대 행동 질환은 매우 가변적이다. 주의력 결핍 질환(ADD)의 특성은 어린이 심리학에서의 연구의 논쟁적인 이슈로 남아있다[McGree, et al., 1989].
피검자, 교사, 젊은이, 보행자, 가정 의학 개업의, 학교 카운셀러 등이 공지도어 있고 젊은이의 주의력 결핍 질환 증후군 및 과대 행동 질환 증후군을 관찰하였지만, 우리는 북아메리카에서 이러한 현상을 기술함에 있어서 곤란함을 경험하였다. 문헌에서의 많은 연구는 임상의들이 과대 행동 및 주의력 결핍 질환이, 이들이 동시 존재하는 상태에 있거나 별도의 진단학적 실재물인 경우, 실제로 진단학적 상태로서 존재하는지 여부를 결정하는데 곤란함을 지속적으로 가지고 있었음을 나타낸다.
과대 행동을 지닌 주의력 결핍 질환(ADHD) 및 과대 행동을 지니지 않은 주의력 결핍 질환(ADD)이 만연되어 있다. 미국에서 3백만 내지 4백만의 어린이 뿐만 아니라 다수의 성인들이 이러한 병으로 고생하고 있다.
ADHD를 지닌 사람들은 과부하로 고생하고 있다; 즉, 이들은 들어오는 감각, 득히 시각, 청각 및 촉각의 두려움이 가중되었다. 이들은 이들 전의 일에 집중하고 배경 "소음"을 여과할 수 없은 환경에서의 정상적인 자극에 의해 이와 같이 고생한다. 이들은 문제 또는 일에 집중되는 고통을 지닌다. 짧은 주의력 범위를 상용하는 경우, 이들은 발생하는 문제들을 돌보지 못하기 때문에 약속을 잃어버리고 지불할 것을 망각하고, 기한을 놓치며 빈번한 법률적 곤란성을 지닌다. 항상 서두르기 때문에, 이들은 목표 또는 목적을 해결함에 있어서 곤란성을 지닌다.
ADHD를 지닌 사람은 조직에서 이탈하는 경향이 있다. 어린이는 방을 어질르며, 성인은 책상이 어수선하며, 매일의 행동이 혼동성이 있는 경향이 있다. 모든 연령에서, 이들은 문제를 일으키는 계획을 가지며 계획을 순서대로 수행함에 있어서 훨씬 더 문제가 있다. 이들이 집중에 대한 능력이 없기 때문에, ADHD를 지닌 사람들은 그들이 시작하는 것을 완수하는데 곤란을 지닌다. 이들은 일을 종료하지 않은 채 남겨두며 계획은 비현실적이다. 다락방과 지하실은 부분 완성된 바느질 물건, 목재작업 물건, 수선할 물건, 노트북으로 가득차 있는 경향이 있으며, 책상 서람은 완성하지 않은 편지, 아웃트라인 및 목적하는 계획으로 어수선한 경향이 있다.
ADHD는 지능과는 아무런 관련이 없다. 이러한 질환을 갖는 많은 사람들은 지능이 높지만, 흥미에 집중하거나 이를 지속시킬 수 없기 때문에 성취를 하지 못하는 사람들인 경향이 있다. 결과적으로, 가족, 친구, 교사 및 동료들이 참을 수 없게 되며 이들은 실패하는 것으로 예측된다.
ADHD를 지닌 사람들은 변화에 적응하는데 어려움을 지닌다. 이들의 생활은 이들의 일상생활에서의 조그마한 추가의 변화가 교란될 수 있는 법석으로 가득차 있다. 부모가 여행을 떠나고 새로운 교사가 학급을 인수하고, 가족이 새로운 도시로 이사를 가고, 고양이가 죽는 어떠한 변화도 ADHD을 지닌 사람에게는 위기를 생성할 수 있다.
ADHD로 고통을 받는 사람은 너무 심한 스트레스하에 살기 때문에 좌절을 참을 수 없으며, 이들이 좌절하는 경우, 이들은 화를 내게 되기 쉽다. 이러한 화는 갑자기 일어나는 경향이 있으며 문을 거칠게 닫으며, 거친 말을 하고, 울화를 내는 경향이 있다. 어린이는 싸움을 하게 되고, 성인은 주먹질을 하며 직업을 상실하며 친구들과 멀어지게 된다. 이후에, 이들은 미안해 하지만, 손상을 입는다.
이들의 좌절도가 높은 경우, ADHD을 갖는 사람들는 참을 수 없게 된다. 이들은 줄지어서 기다리는 것을 싫어하며, 어떠한 종류의 지체에도 미친듯이 날뛴다. 어떠한 여행, 영화, 학습 또는 토론을 진행하는 경우에도, 이들은 서둘러서 진행하여 종료하고 싶어한다.
이들의 비인내성은 ADHD을 갖는 사람들을 충동적이되게 만든다. 어린이인 경우, 이들은 결과를 생각하지 않고 행동에 옮기게된다. 성인인 경우, 이들은 난폭하게 운전하고, 주의하지 않고 파우어 툴을 사용하며, 위험을 생각하지 않고 행동에 옮긴다. 결과는 이들이 종종 자신들이나 다른 사람들을 다치게 하는 것이다.
ADHD을 갖는 사람들은 시간과 공간에 대한 이들의 배열에 있어서 곤란을 지닌다. 이들은 멈춰서 생각하고 자신의 오른손이 어느 것이고 왼손이 어느 것인지를 생각해야 할 수 있으며, 이들은 지시, 지도 판독 또는 반응 시간의 셋트를 따르는데 곤란성을 지닐 수 있다.
다수의 ADHD로 고통을 받는 개인들은 과대행동성이다. 유아 또는 어린이인 경우, 이들은 일정하게 움직이고, 고함을 지르며, 비틀고 모든것에 참견을 한다. 성인인 경우, 이들은 안정되지 않으며, 쉽게 지루함을 느끼며 일상생활을 따르라고 요청받는 경우 반항적으로 되며 항상 계속 움직인다.
ADHD를 갖는 사람들에게 있어서의 또다른 차이점은 이들이 비정상적인 뇌파 패턴을 갖는다는 점이다. 이들의 베타파-이완과 관련됨-는 높아서, 낮잠과 졸음과 관련이 있어왔다. 따라서, 베타파와 관련된 행동, 주의깊은 예측 및 문제 해결은 ADHD를 갖는 개인들에게는 지속하기가 곤란하다는 것은 놀라운 것이 아니다. 이들은 최소의 외부 자극에 의해 쎄타 상태에 머무르도록 하는 행동을 좋아한다(Lubar et al., 1991).
이러한 증상들은 함께 살펴보면, 사진이 나타난다: 개인이 과부하로 고통을 받고, 너무 밝고 너무 시끄럽고, 너무 소모적이며 안락함 면에 있어서 너무 신소가게 변하는 세상에 적응하고자 한다.
ADHD의 원인에 관한 초기의 관점은 부부 질병, 불량한 육아, 뇌 손상, 정신과 질병 또는 가족의 알콜 중독 또는 약물 남용과 같은 인자들에 촛점이 맞추어 졌다. 관련된 행동은 행동 장애 및 개인의 반사회성을 포함한다. 이후에, 이러한 행동은 물질 사용 질환(SUDs)에 유전적으로 연결되는 것으로 나타났다. 가장 최근에, 이러한 행동 장애, ADHD 및 특수한 유전적 이상성 사이에 유의적인 관련을 타나내기 위한 연구가 시작되었다.
ADHD의 원인 또는 근원은 무었인가? 이는 기원이 유전적이고 신경전달자의 불균형의 결과인 강박성 질환이다. 이는 어린시절에 나타나며 성인이 되어서도 지속된다. 이의 영향은 치료와 상담에 의해 완화된다. 이러한 질환에 대한 생물학적 기초는 다수의 연구자들에 의해 설정디어 왔다. 이러한 질환에 대한 생물학적 기초는 다수의 연구자들에 의해 설정되어 왔다.[Biederman].
매우 단순한 측면에 있어서, 직접적인 원인은 ADHD를 지닌 피검자들은 결핍성 여과 시스템으로 고통을 받는다. 다시 말해서, 이들의 뇌 스템 망상 형성은 관련되지 않은 자극을 차단하지 않는다. 이러한 사람들은 모든 소리, 모든 물체, 모든 접촉을 알고 있으며, 이들은 모두 해체되고 참을 수 없는 혼란에 흡수된다. 비-필수적인 자극은 일에 필수적이거나 기타 사람들과 관련된 것과 동일한 주의를 하게된다.
보다 심한 수준에서, ADHD는 가능하게는 ADHD 사람에 있어서 신경간의 메시지를 전달하는 신경전달자를 포함하는, 뇌 세포, 또는 뉴으런 중에서의 의사소통의 문제이다. 이러한 뇌 메신저는 짧은 공급상태에 있다. 들어오는 자극을 억제하는 메신저가 결핍되는 경우, 너무 많은 신호가 통가하여 혼동일 일으킨다.
여전히 더 심한 수준에서, 신경전달자 제조를 위한 청사진을 제시하는 유전자에 있다. ADHD를 갖는 사람들은 하나 이상의 결핍성 유전자를 가지며, 뉴으런이 도파민에 응답기 곤란하게 만드는 DRD2유전자, 기쁜 감정 및 주의력의 조절에 포함되는 신경전달자를 갖는다. 유전적 이상성에 대한 기타 연구는 ADHD에 있어서의 원인성 인자로서 DRD 수용체 유전자, 도파민 베타 하이드록실라제(DβH) 유전자 및 도파민 운반자 유전자와 같은 기타 도마민성 유전자를 관련시켜 왔다.[Cook et al., 1995; Waldman, et al., 1996].
유전자 시험.ADD 및 ADHD의 병인학의 복잡성으로 인하여, 본 발명자들은 멀티-플렉스 DNA계 보상 결핍증 유전자 시험을 사용함으로써 ADD 및/또는 ADHD의 존재를 검정하고자 고련한다. 다형성의 존재에 대한 이러한 유전적 시험 수단은 시험할 개인의 유전자 구조내에 존재한다. 멀티-플렉스 DNA계 보상 결핍증 유전자 시험은 다형성이 존재하는 경우 및 이들중 하나 및 이들이 동형 접합자 또는 이형 접합자인 경우를 나타낸다. ADHD 손상 및 증상의 심각성과 특히 상기한 유전자의 대립형질 사이의 관계가 존재하기 때문에, 멀티-플렉스 DNA계 보상 결핍증 유전자 시험은 사람의 ADHD 증후군과 행동의 심각성을 예측할 수 있게 된다.
멀티-플렉스 DNA를 기반으로 한 보상 결핍 시험은 처리 전문용의 매우 귀중한 도구이다. 결점은 현재로서는 교정될 수 없지만, 본원에서 항갈망제로서 공개된 화합물은 뇌의 도파민 생성 및 도파민 수용체 부위의 활성 수준을 자극함으로써 갈망을 억제하는데 임상적으로 효과적인 것으로 입증되었고, 사람이 더욱 날카롭게 주의를 집중하고, 집중 이동을 용이하게 하고, "작업중" 행동을 증가시키고, 주목 기간을 증가시키는 능력을 증가시키는데 효과적인 것으로 나타났다.
보상 결핍증 행동(ADHD는 유전자적으로 이러한 증후군으로 인한 장애를 기반으로 한다)은 매우 신뢰할만 하고 RDS에 대해 유효한 반면, 차별적인 진단이 더욱 흥미롭다. 멀티-플렉스 DNA를 기반으로 한 보상 결핍 시험은 현저한 확정 데이터 및 개념적인 차별적 진단을 제공하지만, 발명자들은 노쓰 텍사스 대학 건강 과학 센터 DNA 확인 연구소(University of North Texas Health Sciences Center DNA Identity Laboratory) 및 테네시 대학(University of Tenessee)과 함께 현재 포괄적인(그리고 다소 신속하게 완료된) 연구의 윤곽을 잡고 있다. 이러한 연구는 합동 연구라기 보다는 연결 연구일 것이다. 발명자들은 현재의 연구의 결과가 발명자들이 확정된 차별 진단을 하고, ADHD의 진단에서 거짓 포지티브를 감소시키고(현재, 정신 측정 시험 및 인터뷰 기술의 현재 기술 상태의 다수의 진단은 거짓 포지티브이다), 진정한 포지티브를 강화하고, 피검자 및 그의 가족의 부정을 감소시키고, 잘못된 진단(ADHD 등에 대한 잘못된 걱정)을 감소시키고, 따라서 리탈린에 대한 불완전한 처방을 변화시키고, 치료 계획 방법을 강화시키며, ADD와 AH/HD 사이의 진정한 차별 진단을 하도록 할 것이라고 믿는다.
멀티-플렉스 DNA를 근거로 한 보상 결핍 테스트 장비는 도파민성 유전자 결함을 겸출하도록 설계되었다. 당해 시험은 정확도가 99.9%이고, 비침해적이다. 구강 면봉을 사용할 필요가 있으므로, 시험을 진행하는데 어떠한 특수 훈련이 필요하지 않고, 시험은 (다른 DNA 시험에서 요구하는 것 처럼) 혈액을 뽑아낼 필요가 없다. 이어서 면봉을 처리를 위하여 인증된 DNA 연구실에 우편 또는 커리어로 전송한다. 발명자들은 노쓰 텍사스 대학 건강 과학 센터 DNA 확인 연구소와 함께 특정 DNA 시험을 위해 독점적으로 계약을 맺었다. 결과는 72 내지 96시간 내에 처리된다("개시" 평가가 요구되는 경우 시간은 24 내지 48시간 정도일 것이다).
문헌[참조: Diagnotic and Statistical Manual of Mental Disorders (DSM-II) published by the American Psychiatiric Association (1968)]의 제2판에서 진단 카테고리는 "유년기의 과도운동학적 반응"이다. 1980년에 출판된 문헌[참조: Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders, (DSM-III)]의 제3판에서는 이러한 카테고리를 2개의 개별적인 진단, 즉 "과도활성을 갖는 주의 부족 장애"(ADD-H) 및 "과도활성을 갖지 않는 주의 부족 장애"(ADD)로 나눈다.
문헌[참조: Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders (DSM-III-R)]의 개정된 제3판은 1987년에 출판되었다. 당해 판에서 미국 정신의학 협회는 이들 두 진단 카테고리를 다시 합하는 것을 선택하였다. 이때의 진단 카테고리는 "주의 부족 - 과도활성 장애"(ADHD)이다.
1994년에 출판된 문헌[참조: Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders (DSM-IV)]의 현재판은 3개의 진단 공식화: "주의-부족/ 과도활성 장애, 조합형", "주의-부족/ 과도활성 장애, 현저한 부주의형", "주의-부족/ 과도활성 장애; 현저한 과도활성-충동형"이 기술되어 있다.
DSM III의 "과도활성을 갖는 주의 부족 장애"와 DSM III-R의 "주의-부족 과도활성 장애"(Newcorn, et al., 1989)에 대한 진단 기준 사이에는 "적합성의 장점"에서 현저한 차이가 있다. 이러한 조건의 진단 기준에서의 변화가 지속적이고, 진단 기준의 그룹 사이에서 뚜렷한 일치가 부족하여, 문헌[참조: Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorder]의 판 및 개정판중 어느 하나의 진단 기준을 만족시키도록 구성된 평가 등급은 적용성이 제한적인 것으로 보인다. 이러한 점은 다른이들에 의해 이루어 졌으며. 즉, ""아동을 위한 진단 인터뷰 스케쥴(DISC)"(Costello, 1983) 및 "아동 및 청년을 위한 진단 인터뷰(DICA)"(Herjanic and Campbell, 1977)와 같은 구조화 진단 기구는 DSM-III 기준을 기반으로 하고, 새로운 진단 시스템에서 주제 선택에 적합한 것으로 고려될 수 없다."(Newcorn, et al., 1989)
주의 부족 장애는 가장 널리 진단된 유년 장애가다. 표면적으로, 이러한 상태의 진단적 기술이 매우 많은 변화를 거친다는 것은 다소 기이하지만, 이러한 상태의 증상은 일정하게 모든 주위에서 나타나지 않는다(Brown, 1986). 단지 20%의 주의 부족 - 과도활성 장애 어린이들만이 소아학 검사 동안에 ADHD 증상을 나타내었다(Sleator and Ullman, 1981). 종종 많은, 과도활성으로 인한 심리학적 평가를 위해 조회된 어린이들은 진찰한 심리학자들에 의하여 조용하고 실제 시험 환경에 대해 협조적인 것으로 보고되었다(Tobiessen and Darowe, 1969). 질환으로서의 ADD의 상태는 다른 질환과 ADD를 구별하는 주의적 또는 인식적인 상호관련의 단일 패턴이 존재하는 경우 더욱 보장될 것이다(McGee, et al., 1989).
증상의 표시에서 이러한 변화성으로 인하여, ADHD SAS는 주로 부모, 교사 또는 어린이들의 행동에 친숙한 다른 이들로부터 반응하도록 예정된다. 그러므로, 어린이들과 가장 집중적이고 가장 빈번하게 서로 영향을 끼치는 개인들은 어린이들의 행동을 평가하고 보고하는데 있어서 최상의 위치를 차지한다. 문헌(Schachar et al,, 1986; Atkins et al,m 1985)에서의 보고에 따르면, 유년기와 청년기의 행동에 대한 교사의 평가는 임상적 평가, 신경정신과 평가 및 직접적인 교실 관찰 데이터와 매우 상호연관된다는 것을 나타낸다.
ADHD SAS는 일정 기간에 걸쳐 어린이에 의해 나타나는 주의 부족 - 과도활성 장애 증후군의 수준의 신속한 평가를 제공하기 위하여 개발되었다. 이러한 평가 등급은 과도활성 및 과도운동성 어린이들을 진단하는데 사용되는 결정적인 진단 기구라는 것을 의미하지는 않는다. 주의 부족 - 과도활성 장애의 정도, 표현 및 한도의 정확하고, 결정적인 진단을 하는데는 발달 소아학, 소아 신경학, 임상 심리학, 신경정신학, 연설 및 언어, 특수 교육 및 직업적 치료법을 포함한 수개의 전문 영역으로부터의 종사자와 함께 상세한 시험 기간을 필요로 한다. 또한 이러한 등급은 상세한 진단 정밀검사를 대신하도록 발전되지는 않았다. 이러한 정밀검사 유형은 상기 기술된 분야를 대표하는 다양한 전문 종사자의 협력적 노력을 필요로 한다. 따라서 이러한 등급은 심리학적 평가, 신경학적 평가, 정신의학 평가, 신경정신학 평가, 소아학 평가 등이 아니다.
아동 및 청소년과 종종 작업하는 많은 전문인들은 주의 부족 - 과도활성 증상의 존재 및 수준을 나타내는, 신속하게 진행되고, 계산되고, 해석되는 등급을 필요로 한다. 이러한 필요중 일부는 이미 보고된 발생 수로 인하여 명백하다. 이러한 환경의 발생은 모든 취학 아동들중 1% 미만 내지 20% 초과까지의 범위이다(Auguwt and Garfinkel, 1989). DSM IV에 따라, 주의 부족/과도활성 장애의 발생률은 취학 아동들중 3 내지 5%로 추정된다. 청소년 및 성인의 발생률에 대한 데이터는 제한적이다.
많은 예에서 부모 및 교사들은 나태, 완강함, 흥미 부족, 노여움, 미숙함 등으로 설명될 수 있는 주의 부족 과도 활성 장애의 행동 특징에 주목한다. 때로는 교사, 카운셀러, 주치의 및 건강 보호 및 교육 분야의 다른 이들은 ADHD 어린이들의 행동을 징벌의 결핍 또는 부모의 책임하의 잘못된 징벌 습관의 결과로서 해석한다. 그리고, ADHD 어린이들은 그들의 증상을 일정하게 나타내지 않기 때문에, 관심을 가진 부모에 의한 어린이들의 행동의 설명은 아동의 기능 장애라기보다 친자관계의 책임으로 부담을 가진 부로로부터 유래된 것으로 해석될 수 있다(아동은 의사의 사무실에서는 매우 조용하고 행동거지가 얌전하기 때문에). 부모 또는 교사가 이러한 가정 또는 해석에서 행동하는 경우, 이들은 어린이의 반응을 어린이의 근원적인 문제로 악화시킨다. ADHD SAS의 중요한 값은 카운셀러, 교사, 가족 의료 종사자, 소아과 의사, 신경학자 및 다른 전문 종사자들이 어린이에게 나타나는 주의 부족 및/또는 과도활성 증상의 수준을 신속하고 쉽게 결정하는 즉석의 경제적인 이용성이다. 그러므로, 전문 종사자는 부모 또는 다른 이들이 어린이들의 행동과 관련하여 내리는 가정 또는 해석을 유효하게 하거나 반박할 수 있다.
ADHD SAS는 부모 또는 교사중 하나가 약 15분 내에 계산하고, 분석하고, 해석하여 대답할 수 있는 43 항목 등급이다. 등급은 행동, 태도 및 느낌의 존재 및 빈도에 관련하여 반응하는 어린이들의 행동에 친숙한 부모 또는 다른 이들에게 묻는 객관적으로 계산된 기구이다. 등급은 무모들로 하여금 4점 라이커트(Likert) 등급에서 객관적인 방식으로 반응할 것을 요구한다. 등급의 선택은 "전혀 또는 약간"에서 "대부분 또는 항상"인 범위이다.
ADHD SAS는 효과적이고 저렴한 스크리닝 장치이다. 이는 진행하고 점수를 매기는데 용이하고, 교육받은 전문가 또는 자격을 갖춘 전문인의 감독하에 전문 보조원들에 의해 사용될 수 있다. 그러나, ADHD SAS는 어린이의 철처히 숙련된 임상 평가에 대한 요구를 미연에 방지하지 않는다. 이러한 평가 장치의 체재는 부모의 보고 형태이므로, 이는 특히 의식적이고 무의식적으로 왜곡되기 쉽다. 이러한 이유 및 하기에 상술한 기구의 다른 특수한 제한때문에, ADHD SAS는 주의 부족 과도활성증의 존재 및 수준의 지시로서만 사용되어야 하고, 치료 조정 또는 치료 기간을 계획하는 유일하게 사용되는 기구가 되지 않아야 한다. 스크리닝 장치는 숙련된 임상 판단자에 대한 보충으로 계획된 것이지 이들을 대체시키는 것은 아니다.
과도활성을 갖거나 갖지 않는 주의 부족 장애를 갖는 개인은 이들의 색심적인 주의 부족에 있어 상이할 수 있다(Lahey, et al., 1985). 둘 다 교사들에 의해 전반적으로, 주의 기간, 건망증, 지시 수행의 어려움 및 미숙으로 언급하는 항목에 대한 대조 그룹과 비교하여 유사한 주의 부족을 나타내는 것으로 평가된다. 그러나, 과도활성을 갖지 않는 주의 부족 장애와 이들의 대조 그룹 모두와 비교하여, 주의 부족 장애 - 과도 활성 그룹은 책임감 없고, 산만하고, 충동적이고, 생각 없이 대답하고, 부주의하다고 기술되어 있다. 상기(Delamater and Lahey, 1983; Cahey 1994)와 관련된 이들의 발견을 교려해보면, 주의에 문제를 가진 2개의 다소 상이한 그룹의 아동의 그림이 나타난다.
ADHD SAS는 ADHD 장애 증상의 전체적인 수준뿐만 아니라, 주의 부족 - 과도활성 장애의 우세한 유형(August and Garfinkel, 1989) 둘 다 평가하는 것과 같은 방법으로 구성된다. ADHD SAS의 결과는 전체 주의 부족 - 과도활성 증상(또는 ADHD, 조합형), 주의 부족 증상 및 과도활성 증상의 존재 및 정량화 수준을 반영한다.
등급으로 주의 부족 - 과도활성 장애 증상을 검출되는 경우, 결과는 또한 이러한 증상이 최소인지, 가벼운지, 중간인지, 심한지 또는 극심한지 나타낸다.
ADHD SAS는 4세 이상의 아동 및 청소년의 행동을 부모에 의해 기술하는데 사용하기 위하여 의도된 것이다. 당해 등급은 의사의 사무실에서, 또는 정신치료학자의 부모와의 임상 인터뷰 동안, 또는 부모-교사-카운셀러 회의 등의 동안에 사용되도록 계획된다. 이러한 스크리닝 기구가 귀중하게 되는 다수의 환경이 존재한다.
그러나, 부모가 비협조적이고, 적대적이고, 말하려들지 않고, 왜곡하기 쉽거나, 그의 생각에 있어서 너무나 혼란스러워서 반응이 부모의 인식을 정확하게 반영하지 않는 경우에는 사용할 수 없다. 또한, 4학년 독서 기능(당해 등급의 독서 곤란은 4학년 수준에 근접한다)의 부족으로 인하여 낮은 구두 능력을 가진 사람, 제2 언어로서 제한된 영어를 사용하는 2개국 언어 배경을 가진 사람, 신경 정신적인 손상을 가진 사람 또는 심한 정신 지체 완화자는 당해 등급을 완성하기 어렵다.
ADHD SAS는 교육받은 전문직보조원 또는 전문가에 의해 진행되어 점수를 매길 수 있다. 그러나, ADHD SAS의 사용 및 해석에 대한 최종 책임은 진보된 임상적 훈련 및 경험을 가진 전문가가 맡아야 한다. ADHD SAS를 진행시키기 전에, 잠재적인 사용자는 이의 안내서에 상술된 바와 같이, 등급의 이론적인 해석, 구성의 방법, 정신 측정 특성 및 특수 제한에 철저하게 친숙해져야 한다. 추가로 사용자는 어린이의 의학적 상태, 학교에서의 행동 및 동년배와의 행동에 관련된 정보를 갖는 추가 시험 데이터에 의해 사용되는 설정에서의 등급 결과의 유효성에 대하여 임상적인 판단을 할 준지가 되어 있어야 한다.
ADHD SAS의 적합한 사용을 보장하는 것을 돕기 위하여, 잠재적인 사용자는 또한 미국 심리학 협회에 의해 규정된 시험 사용에 대한 표준(1994)에 친숙하고 이를 따라야 하거나, 시험 및 평가 분야의 기본 서적을 정독하여야 한다. 주의 부족 과도활성 장애된 청소년을 평가하고 관리하는 경우가 부족한 사용자들은 등급을 사용하기 전에 당해 영역의 관련 문헌을 정독해야 한다. 주의 부족 과도활성 장애된 청소년에 대한 논점에 대하여 수개의 탁월한 서적이 존재한다(예: Rourke, 1985; Rourke, 1989; Rourke, et al,m 1983; Rourke et al,m 1986).
임상적인 환경 및 연구 환경 둘 다에서 ADHD SAS의 사용은 미국 심리학 협회에 의해 제시된 전문적이고 윤리적인 지침(1981)에 따라야 한다. 아동에 촛점을 맞춘 평가 과정으로, ADHD SAS는 어린이의 부모중 한사람의 정보에 입각한 동이 없이 사용하지 않아야 한다. 추가로, 사용자는 결과의 비밀성을 보호하고 전문적인 "알 필요"가 있는 이들에게 이의 사용을 제안하기 위한 필요 예방 조치를 취해야 한다. 개개인의 어린이 또는 어린이의 부모에게 등급을 알려주는 것은 항목 반응의 특수 분석에 집중거나 이에 대해 보고하기 보다는, 주의 부족 과도활성 장애의 정성 측면에 집중하여야 한다. 등급 결과를 해석하는 것이 가능한 사람은 개개인의 주의 부족-과도활성 장애 및 자녀의 현재 감정 상태의 인식을 고려하여,등급 결과를 이해하고 증폭시키는데 있어서, 부모의 도움을 얻어야 한다.
주의 부족 - 과도활성 장애의 확인은 임상적 민감성 및 신경정신학에 대한 임상 및 연구 문헌의 완전한 지식 및 불능 습득을 필요로 하는 복잡한 작업이다. ADHD SAS는 스크리닝 기구로서만 의도된다. 단독으로 사용하지 않아야 한다. 소아과 평가, 소아과 신경학적 평가, 뇌 엑스레이 촬영적 평가, 연설 및 언어 평가, 정신병 치료적 평가와 같은 다른 진단 방법이 시험 결과를 보충하고, 확증하고, 조사하는데 사용되어야 한다.
ADHD SAS는 또한 시험 결과를 해석하는 경우 명심해야 하는 다수의 특정 제한을 갖는다. 우선, 등급의 취지는 구체적으로 감추지 않는다. 이렇게 하여, 점수는 등급을 완성하는 개인에 의해 의식적으로 및 무의식적으로 왜곡된다. 두번째로, 등급은 앞으로 1점에서 부모의 자녀의 행동에 대해 부모가 보고한 평가를 평가한다.
주의 부족 - 과도활성 장애의 증상은 일정하게 모든 주변에서 나타내지 않으므로, ADHD SAS는 ADHD 증상의 수준에 있어서 일시적인 변화를 정확하게 예측할 수는 없다(Brown, 1986).
ADHD SAS의 수행.
ADHD SAS를 수행하는데 필요한 모든 것은 펜 또는 연필 및 평가 양식이다. 평가 양식은 어린이의 부모중 한명 또는 둘 다에 의해 채워져야 한다. 이는 정보를 확인하고, 선택된 사회인구학적 인자를 포함하도록 요구한다. 43개의 시험 항목은 지시 및 각 항목에 대응하는 공간과 함께 이 시트의 앞뒤에 포함되어 있다.
인구학적 정보가 ADHD SAS 평가 양식의 상부에 완전히 들어갔다는 것을 확인한 후에, 시험관은 다음 지시를 내려야 한다: "여기에 내가 당신 자녀의 행동을 더욱 잘 이해하도록 도와줄 문장이 있습니다. 나는 당신이 각각의 문장을 읽고 적합한 난에 "X"를 기록함으로써, 각 문장이 진실인 시간의 길이를 표시해주기를 바랍니다. 예를 들면, 다음 문장 "손과 발을 놓고 안절 부절 못한다(Is 'fidgety' with hands and feet)."를 생각해 봅시다. 이 문장은 당신의 자녀에게 "전혀 또는 약간", "어느 정도", "상당히" 또는 "대부분 또는 항상" 적용됩니까?"
이러한 지시를 소리내어 제시하면서, 시험관은 항목 및 각각의 4가지 답안 난을 지적한다. 어린이의 부모가 반응한 후, 검사관은 적합한 박스의 "X"를 표시하고 말한다: "이제 나머지 항목을 끝내십시오. 질문이 있으면 나에게 알려주세요."
때때로 시험을 치르는 개인은 단어 또는 개념을 이해하지 못할 것이다. 부모가 특정 항목을 이해하는데 어려워하는 경우, 시험관은 가능한 한 중립적으로 항목을 설명해야 한다. 예를 들면, 부모가 "손과 발을 놓고 안절부절 못한다"라는 항목에서 단어 "안절부절 못한다(fidgety)"를 이해하지 못하는 경우, 시험관은 "이 항목은 당신이 얼마나 자주 당신의 자녀가 그의 손과 발을 얌전히 두는데 어려워 한다고 생각하는지를 질문하는 것입니다"라고 말할 수 있다.
등급을 완료한 개인과의 관계의 발전 및 유지는 매우 중요하다. 정신 측정적 견지에서, 적합한 관계의 성립은 반응 특히 부모의 자녀에 있어서의 어려움을 부정하는 의도적인 왜곡의 정도를 최소화하는데 필수적이다. 응답자가 하는 어떠한 말도 개인의 아동의 행동을 해석하는데 있어서 유효한 표면이든 아니든, 등급을 채워가는 태도를 평가하는데 도움을 줄 수 있다.
ADHD SAS의 점수 기록.
평가 양식만이 ADHD SAS를 점수 매기고 해석하는데 필요하다. ADHD SAS의 점수를 매기기 위하여, 우선 ADHD SAS 평가 양식에 대한 각각의 항목이 항목이 주의 부족을 측정하는지 또는 과도활성을 측정하는지를 나타내는 부호에 따라 항목 숫자를 갖는다는 것에 주의한다. 예를 들면, H01은 과도활성을 측정하는 제1 항목이고, D04는 주의 부족을 측정하는 제4 항목이다. 항목이 약 20%에서, 부호화된 지시는 "*"가 선행된다는 것을 또한 주목한다. 당해 항목의 점수 패턴은 응답자가 점수 패턴에 익숙해지는 것을 방지하기 위하여 균형을 이룬다. 모든 항목은, "*"로 표시된 항목을 제외하고는, 다음 방식으로 점수를 매기는데, 응답자가 "전혀 또는 약간"에 표시하면 "1"점, "어느 정도"이면 "2"점, "상당히"이면 "3"점, "대부분 또는 항상"이면 "4"점이다. "*"로 표시된 항목은 반대 방항으로, 즉 "전혀 또는 약간"이 "4"점, "어느 정도"가 "3"점, "상당히"가 "2"점, "대부분 또는 항상"이 "1"점으로 기록된다. 그다음 "D"로 부호화된 모든 항목을 더하여 주의 부족 장애 부등급에 대한 총 점수를 측정한다. 이어서 "전체 주의 부족 장애 등급 원 점수(TOTAL ATTENTION DEFICIT DISORDER SCALE RAW SCORE)"라는 문장 다음의 공백에 원 점수를 넣는다.
"H"로 부호화된 항목 전체를 더하여 과활성 장애 부등급에 대한 총 점수를 측정한다. 이어서 "총 주의 과활성 장애 등급 원 점수(TOTAL ATTENTION HYPERACTIVITY DISORDER SCALE RAW SCORE)"라는 문장 다음의 공맥에 원 점수를 넣는다. "ADHD 증상의 수준(LEVEL OF ADHD SYMPTOMS)"이라는 프로파일 밑에, 기록한 원 점수를 기입한다. 원 점수를 기록함으로써 원 점수에서 주의 부족 증상, 과활성 증상 및 주의 부족 - 과활성 증상의 수준을 직접 읽을 수 있도록 하는 전환된 점수로 자동 전환이 된다. 소견 및 권고(COMMENT AND RECOMMENDATIONS) 부분에는 특정 이러한 특정 피검자 또는 가족에 대한 조치를 위한 생각 및 지시를 기록할 수 있다.
ADHD SAS의 원리적 및 이론적 배경.
출판되고 사용되는 주의 부족 평가 등급중 일부는 미국 정신의학 협회에 의해 출판된 문헌[참조: Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders]의 가장 최신판의 진단 기준을 통합시킨 것에 불과하다. 그러나, 이러한 접근은 매우 시간 제약적이라는 점에서 적용성이 제한된다. 주목되는 바와 같이, 주요 증상이 규정 시간외에도 현저하게 변화할 뿐만 아니라, 당해 상태가 존재하는 경우, 부의 부족만으로서 존재하는지 또는 주의 부족이 때대로 과도활성과 결합되어 존재하는지에 대한 의문이 실제로 존재한다. 상기 문헌 조사로부터 주목되는 바와 같이, 현재의 이해 상태는 다소 유동적이다. 발명자들은 구성의 유효성을 믿고, 이것이 일반적이고 널리 분포되어 있고, 어린이들 사이에서 다소 퍼져 있는 상태라는 것을 믿고 있다. 여기에 ADHD 진단의 바람직한 방법이 있다.
과거 30년에 걸쳐 다양한 증상 및 주의 부족 - 과도반응성 장애의 다양한 증상의 중요성에 대한 상당한 논의가 있어 왔다. 주의 부족 - 과도활성 장애의 진단 및 이해가 미국 정신의학 협회에 의해 출판된 문헌[참조: Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders]에 묶여 있는 개인은 개졈의 변화성으로 인하여 다소 취약하다. 이는 시험 구성자에 대해서 특히 진실하다. 상기 평가(Newcorn et al,al, 1989)에 따르면 문헌[참조: Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders] 판 및 개정판중의 어느 하나의 진단 기준을 만족시키키도록 구성된 등급은 적용성이 제한된다. 가장 최근의 문헌[참조: Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders]의 진단 표준을 근거로 한 다양한 평가 장치에 관해서는, 상기(Newcorn et al., 1989)에서는 '아동에 대한 진단 인터뷰 스케쥴(DIDC)'(Costello, 1983) 및 '아동 및 청소년에 대한 진단 인터뷰(DICA)(Herjanic and Campbell, 1977)와 같은 "구조화된 진단 기구"는 DSM-III 표준을 근거로 한 것이며 신규한 진단 시스템에서의 주제 선택에 적합하다고 여겨질 수 없다고 주장하고 있다.
ADHD SAS의 항목 선택 및 유효성 고찰.
ADHD SAS에 대한 항목은 과거 20년 동안 전문적 문헌에서 발견되는 설명적인 원리로부터 유도된다. 전문적인 문헌을 조사한 후, 주의 부족 또는 과도활성의 기본이 기술되거나 이를 설명한 원리 및 이론적 구성에 대한 모든 지지되고 일치되는 것은 행동 진술로 전환된다. 예를 들면, 이들 어린이들의 산만성은 보편적으로 우세한 인자로서 언급되므로, "재빨리 쉽게 산만해진다", "시작되는 것을 끝내버린다"와 같은, 산만성에 관련된 항목이 존재한다.
ADHD SAS의 표준화.
어떠한 다른 등급과의 ADHD SAS의 상관성을 결정하거나, 교사의, 또는 심리학자 또는 의사 또는 부모의 판단을 ADHD SAS를 측정하기 위한 비교 기준으로서 이용하는 등급의 전통적인 표준화는 불필요한 것으로 여겨진다. 발명자들은 ADHD SAS의 유효성을 측정하기 위한 우수한 기준 척도를 찾지 못하고 있다. 등급 구성의 방법은, 등급이 과거 20년 이상에 걸쳐 전문적인 문헌에서 내세운 바와 같은 구성의 조작상 한정을 측정하는 것이라는 점에서 등급의 유효성에서 이루어진다.
ADHD SAS는 주의 장애를 한정하도록 한 구성을 측정하도록 계획된다. 점수는 개인에 의하여 나타내는 징후학의 양과 등급의 상한선에 의해 나타내는 이용 가능한 총량 사이의 관계를 측정하도록 계획된다.
개인은 다음 등급에 따라 측정된다. 개인이 등급으로 측정된 주의 부족 증상의 총 잠재성의 40% 미만을 나타내는 경우, 해석은 "주의 부족 장애의 어떠한 증상도 나타내지 않는다"는 것이다. 개인이 등급으로 측정된 주의 부족 증상의 총 잠재성의 40 내지 51% 사이를 나타내는 경우, 해석은 "주의 부족 증상의 최소 수준을 나타낸다"는 것이다. 개인이 등급으로 측정된 주의 부족 증상의 총 잠재성의 52 내지 64%를 나타내는 경우, 해석은 "주의 부족 증상의 가벼운 수준을 나타낸다"는 것이다. 개인이 등급으로 측정된 주의 부족 증상의 총 잠재성의 65 내지 77%를 나타내는 경우, 해석은 "주의 부족 증상의 중간 수준을 나타낸다"는 것이다. 개인이 등급으로 측정된 주의 부족 증상의 총 잠재성의 78 내지 90%를 나타내는 경우, 해석은 "주의 부족 증상의 심한 수준을 나타낸다"는 것이다. 개인이 등급으로 측정된 주의 부족 증상의 총 잠재성의 91 내지 1005를 나타내는 경우, 해석은 "주의 부족 증상의 극심한 수준을 나타낸다"는 것이다.
개인은 또한 다음 등급에 따라 평가한다. 개인이 등급으로 측정된 과도활성 장애 증상의 총 잠재성의 40% 미만을 나타내는 경우, 해석은 "과도활성 장애의 어떠한 증상도 나타내지 않는다"는 것이다. 개인이 등급으로 측정된 과도활성 장애 증상의 총 잠재성의 40 내지 51%를 나타내는 경우, 해석은 "과도활성 장애의 최소 증상을 나타낸다"는 것이다. 개인이 등급으로 측정된 과도활성 장애 증상의 총 잠재성의 52 내지 64%를 나타내는 경우, 해석은 "과도활성 장애의 가벼운 증상을 나타낸다"는 것이다. 개인이 등급으로 측정된 과도활성 장애 증상의 총 잠재성의 65 내지 77%를 나타내는 경우, 해석은 "과도활성 장애의 중간 증상을 나타낸다"는 것이다. 개인이 등급으로 측정된 과도활성 장애 증상의 총 잠재성의 78 내지 90%를 나타내는 경우, 해석은 "과도활성 장애의 심한 증상을 나타낸다"는 것이다. 개인이 등급으로 측정된 과도활성 장애 증상의 총 잠재성의 91 내지 1005를 나타내는 경우, 해석은 "과도활성 장애의 극심한 증상을 나타낸다"는 것이다.
개인은 최종적으로 다음 등급에 따라 평가한다. 개인이 등급으로 측정된 주의 부족 - 과도활성 장애 증상의 총 잠재성의 40% 미만을 나타내는 경우, 해석은 "어떠한 주의 부족 - 과도활성 장애 증상의 증상을 나타내지 않는다"는 것이다. 개인이 등급으로 측정된 주의 부족 - 과도활성 장애 증상의 총 잠재성의 40 내지 51%를 나타내는 경우, 해석은 "과도활성 장애의 최소 증상을 나타낸다"는 것이다. 개인이 등급으로 측정된 주의 부족 - 과도활성 장애 증상의 총 잠재성의 52 내지 64%를 나타내는 경우, 해석은 "과도활성 장애의 가벼운 증상을 나타낸다"는 것이다. 개인이 등급으로 측정된 주의 부족 - 과도활성 장애 증상의 총 잠재성의 65 내지 77%를 나타내는 경우, 해석은 "과도활성 장애의 중간 증상을 나타낸다"는 것이다. 개인이 등급으로 측정된 주의 부족 - 과도활성 장애 증상의 총 잠재성의 78 내지 90%를 나타내는 경우, 해석은 "과도활성 장애의 심한 증상을 나타낸다"는 것이다. 개인이 등급으로 측정된 주의 부족 - 과도활성 장애 증상의 총 잠재성의 90 내지 100%를 나타내는 경우, 해석은 "과도활성 장애의 극심한 증상을 나타낸다"는 것이다.
주의 부족 - 과도활성 장애 증상 평가 등급의 해석 및 임상적 용도
ADHD SAS 결과의 해석
사례 연구
실시예 24
투레트 증후군에서의 안드로겐 수용체 유전자(AR)의 트리뉴클레오티드(GCC) 반복 폴리모르피즘과 ADHD, 행동 장애 및 반대 저항 장애와의 결합
ADHD, CD, ODD, 반사회적인 성격 장애, 난독증 및 기타 협력 장애 및 자폐증을 포함한 행동적이고 인식적 장애중 다수는 여성보다 남성에서 3 내지 5배 정도 더욱 일반적이다(DSM-IV, 1994). 일반적으로 호르몬 및 환경적인 요인으로 인한 것이라고 가정되는 한편, 유전적 요인도 수반될 수 있다. 특정 유전자의 역할은 유전자가 X 연결된 경우 가장 쉽게 이해될 수 있을 것이다. 따라서, 관련 대립형질의 빈도수 및 유전자에 기인한 변화율(%)에 따라서, 그리고 유전성의 열성 양식을 주로 가정하여, X 연결 유전자는 남성에서 과도한 부분을 설명할 수 있다. 유전자가 또한 테스토스테론에 반응하여 중요한 역할을 하는 경우, 남성/여성 비율로 역할을 하는데 유별나게 매우 적합할 것이다. 안드로겐 수용체 유전자(AR)는 이러한 유전자이다. 이는 Xq11-12에서 X-크로모좀 위에 위치한다(Migeon et al,m 1981; Brown et al., 1989).
본 발명자들은, 안드로겐 수용체 및 테스토스테론에 대한 민감성의 증가된 수준과 관련하여, AR CAG 및 GGC의 정상 대립형질의 더 짧은 부분은 유년기의 파괴적 행동 장애들중 하나 이상, 특히 행동 장애 및 반대 저항 장애와 관련될 수 있고, 이들 장애중 남성 우세의 부분을 설명할 수 있을 것이라는 가설을 세웠다. 이를 시험하기 위하여, 본 발명자들은 GGC, 투레트 증후군을 가진 267명과 59명의 대조 그룹으로 이루어진, 326명 개인에 대해 연속적으로 AR 유전자의 엑손 1중의 트리뉴클레오티드 반복 폴리모르피즘을 검사하였다(Sleddens et al., 1992, 1993). 도파민(Valzelli, 1981) 및 세로토닌(Brown et al., 1982; Lindberg et al., 1984; van Praag, 1991; Coccaro. 1989)과 공격적인 행동과의 빈번한 결합 때문에, 행동 장애 및 ODD에 대한 AR 유전자의 효과를 도파민 D2수용체 유전자(DRD2) 및 세로토닌 운반 유전자(HTT)의 그것과 비교한다. 이러한 연구는 사람 안드로겐 수용체 유전자(AR)의 GGC 트리뉴클레오티드 반복 폴리모르피즘의 더욱 짧은 대립형질이 행동 장애(CD), 반대 저항 장애(ODD) 또는 주의 부족 과도활성 장애(ADHD)의 증상과 결합되는지를 결정하도록 수행한다.
방법.대립형질의 빈도수는 투레트 증후군을 가진 267명 개인 및 59명의 대조 그룹, 237명의 남성과 89명의 여성, 모두 히스패닉 백인이 아닌 326명의 주체에서 검사한다. 8명의 양적 행동 측정은 여성에서 더욱 짧은 대립형질에 대한 반접합자 또는 남성에서 더욱 짧은 대립형질에 대한 동형접합자의 존재와의 상관성에 대한 MANOVA에 의해 동시에 검사한다. 선형 열성 분석은 AR 유전자로 인한 변화의 비율(%)을 결정하는데 사용된다. 이를 도파민 D2 수용체 유전자(DRD2) 및 세로토닌 운반 유전자(HTT)로 인한 변화율(%)과 각각 그리고 합하여 비교한다.
시험 주체는 투레트 증후군을 갖는 267명의 개인과 59명의 대조 그룹으로 구성되었다. 주체와 대조 그룹 및 행동 평가에 관한 세부사항을 본원에 제시하였다. 이러한 연구에서 본 발명자들은 다음 정량적 특성을 따라서 검사한다: 부주의, 충동, 과도활성, CD, ODD, 학습 장애(LD) 및 초등학교 학업 성취(GSAP). 현재 연구 및 동반 연구중 하나에서 본 발명자들은 정량적 tic 점수를 가하였다(Comings et al., 1996).
AR 유전자의 GGC 반복 폴리모르피즘은 기술(Sleddens et al,m 1992, 1993)에 의해 폴리머라제 연쇄 반응에 의해 증폭된다. 어빈(Irvine) 등은 1995년에 16반복이 가장 일반적인 대립형질, .57이고, 이어서 17반복(.32) 및 15반복(.08)이 후속한다는 것을 반복하였다. 유일한 다른 대립형질은 10반복이었다. AR 대립형질과 개인의 정량적 행동 점수 사이의 가능한 상관성의 분석에 대하여, AR 유전자는 다음과 같이 점수를 매긴다: 남성에 대하여: ＞16반복 = 0, ≥\16반복 = 1; 여성에 대하여: ＞16/＞16 반복 = 0; 이형접합자 - 0; ≥16/≥16반복 = 1.
도파민 D2유전자(DRD2)의 TaqI A 폴리모르피즘(Grandy et al., 1989)은 행동 장애에서, AR 유전자와 비교하여 이러한 장소의 역할을 설명하는데 사용된다. 이러한 폴리모르피즘에서 양성 잡종강세의 증거를 기본으로 하여(Comings and MacMurray, 1998), 11, 22 = 0, 12 = 1로 점수가 기록되었다.
세로토닌 운반 유전자의 촉진 영역의 삽입/제거 폴리모르피즘을 사용한다(Hell et al., 1995, 1996). HTT 유전자는 SS = 1, 그리고 SL, LL = 1로서 점수가 기록된다(Kauck et al., 1997; Lesch et al., 1996).
TS 주체 대 대조 그룹에 있어서 AR 대립형질 또는 대립형질의 그룹의 빈도수에서의 가능한 차이는 chi 스퀘어 분석에 의해 시험한다. 보니페로니 정정에 대한 요구를 피하기 위하여, 8명의 개인 점수를 MANOVA를 사용하여 동시에 검사한다. 세 유전자의 추가 효과를 검사하기 위하여, AR+DRD2+HTT 점수가 형성된다. 여기에 개인 유전자 점수를 각각의 개인에 대해 더한다. 이는 0(세 유전자중 어느것에 대해서도 관련 유전자형이 없음) 내지 3(모든 세 유전자에 대한 관련 유전자)의 범위를 제공한다. 선형 열성 분석을 사용하여 AR, DRD2 및 HTT 유전자에 의해 단독으로 또는 함께 설명되는 CD, ODD 및 ADHD의 변화율(%)을 측정한다. 세 유전자가 이의 효과에 추가적이라는 가설을 시험하기 위하여, 총 ADHD 점수를 포함한 각각의 점수에 대한 수단을 선형 ANOVA에 의해 검사한다.
결과.AR 대립형질 빈도수를 측정한다. 59명의 대조 그룹중에서 상이한 반복 대립형질의 빈도수는 다음과 같다: 10 - .01, 12 - .09, 15 - .03, 16 - .47, 17 - .36, 18 - .01, 20 - .01. TS 주체에서의 빈도수와 비교된 대조 그룹의 대립형질의 빈도수를 검사한다. 모든 대립형질을 포함하여 대조 그룹과 TS 주체 사이의 chi 스퀘어 = 19.69, d.f. = 11, p = .073 1. 반복 대립형질의 길이 과 표현형 효과 사이의 잠재적 관계에 대한 본 발명자들의 연구에서, 본 발명자들은 가장 절약적인 접근은 대립형질을 짧고 긴 그룹으로 나누어 가능한 한 동일한 크기로 두 그룹을 만드는 것이라는 것을 밝혀내었다. 이러한 접근에 따라 본 발명자들은 AR 대립형질을 ≥16 및 ≥16 반복으로 나누었다. 대조 그룹(.60)과 비교하여 ≥16 대립형질(.66)의 빈도수 증가를 갖는 TS 주체에 대한 중요하지 않은 경향성,λ2 - 1.06, d.f. = 1, p = 30이 있었다. 따라서, 대조 그룹과 TS 주체 사이를 비교하는 경우 α = .05로 별 차이가 없었다.
현저한 수의 감소로 분류되는 MANOVA의 결과를 표 I에 나타내었다. CD 점수는 가장 현저하였고(p = .005), ODD 점수는 다음이며(p = .022), 과도활성 점수 또한 현저하였다(p = .032). tic, GSAP 및 LD 점수는 가장 덜 현저하였다(p＞.6) CD와의 이러한 우선적인 결합이 남성에서만 나타나는 것인지에 대한 의문을 검사하기 위하여, 본 발명자들은 남성(n = 237) 및 여성(n = 89)에서의 결과를 비교하였다. 더 작은 수로 인한 힘의 손실 때문에, 웨이트중 어느것도 두 성중 하나에 현저하지는 암ㅎ았다. 그러나, p 값에 의해 분류하는 경우, CD가 가장 두 성에 대하여 현저하였다.
AR 변수와 성적인 행동 사이의 잠재적 결합 때문에, 본 발명자들은 14세 이상의 조에서 AR 유전자와 성적인 행동 점수와의 가능한 결합의 후 hoc 분석을 수행하였다(Comings, 1994). 이는 현저하지 않았다. 후 hoc 분석을 또한 수행하여 더욱 짧은 대립형질의 효과가 열성인지 또는 우성인지를 결정하였다. 모든 점수에 대하여 이형접합자에 대한 수단이 ＞16/＞16 동형접합자에 대하여 일관되게 유사하고나 더 작고, ≥16 반복 대립형질의 효과가 이의 효과에서 열성이고 여성의 ≥16/≥16 동형접합자만이 효과를 나타낸다는 것을 나타낸다.
열성 분석의 결과를 표 74에 나타내었다. CD 점수에 대하여, AR 유전자는 변화율 2.4%로 설명된다(p = .005). 비교에 의하여, DRD2 유전자는 1.3%1.3%(p = .041)로, HTT 유전자는 0.5%로 설명된다. 조합된 AR 및 DRD2 유전자는 3.3%의 변화율(p = .0009)로 설명된다. 이는 HTT 유전자가 가해지는 경우(p = .022) 3.5%로 증가한다. AR 유전자는 ODD 점수(p = .022)의 변화율 1.6%로 설명된다. 여기서 AR 및 DRD2 유전자는 1.4%의 변화율로 설명되는 DRD2 유전자와 비교할만 하고, HTT 유전자는 0.7%로 설명된다. 모든 세 유전자는 ODD 점수(p = .001)의 변화율 3.2%를 설명한다. AR 유전자는 ADHD 점수(p = .053)의 변화율 1.1%를 설명한다. 모든 세 유전자는 변화율 2.7%(p = .0027)를 설명한다.
추가의 AR+DRD2+HTT의 선형 ANOVA 결과을 선형 ANOVA에 의해 검사하여 관련 유전자형의 수가 증가하는 추체의 점수의 진보적 증가가 있는지를 결정한다. 부주의, 충동, 과도활성, ADHD, ODD 및 CD 점수는 α = .05에서 모두 현저하다. 몬페로니 정정된 .05/6 또는 .0083에서, 과도활성, 충동, ADHD, ODD 및 CD 점수는 여젼히 현저하다.
MANOVA에 의하여 AR 유전자의 짧은 GGC 대립형질과 CD(p = .005), ODD(p = .022) 및 과도활성(p = .023)의 증상의 존재 사이의 현저한 결합이 존재한다. 이러한 대립형질의 결합은 남성 및 여성 둘 다에 대하여 CD에 대해 가장 크다. AR 유전자는 CD 점수의 변화율 2.4%를 설명한다. AR, DRD2 및 HTT 유전자의 조합은 행동 장애 점수(p = .0007)의 변화율 3.5%, ODD 점수(p = .001)의 변화율 3.2% 및 ADHD 점수(p = .0027)의 변화율 2.7%를 설명한다.
실시예 25
바디 조성물에 대한 크롬 피콜리네이트 보충 효과: 랜덤화된 이중 마스킹된 의약 조절 연구
본 발명자들은 또한 수개의 방법론적 이슈에 대한 답변을 찾았다. 먼저, CrP가 보충된 용량은 식욕에서 이의 충격을 통해 칼로리 흡수에 영향을 미치며 증가된 대사성
도는 1일 활동량을 통해 칼로리 소비를 증가시킨다. 둘째로, 본 발명자들이 실험 그룹과 대조 그룹 사이의 칼로리 흡수 및/또는 에너지 소비에서의 차이를 조절하고 행동에 넣는 경우에도 동일한 결과가 성취될 수 있을까? 셋째, 이러한 결과는 물속에서의 시험조다 시엄을 수행함에 있어서 피검자의 성능에 훨씬더 정밀하고 덜 의존적인 이중 에너지 X선 흡수계(DEXA)와 같은 바디 조성물의 기타 수단으로 반복하는 것이 가능할까? 넷째, 기타 연구(Anderson, 1995)(29.7%)에서 발견되는 비교적 높은 탈락율이 바디 조성물의 모든 기준 수단에 대한 3개의 연구 그룹의 유사성에도 불구하고 선택적인 기여를 통한 발견에 치우쳤는가? 방법을 사용하여 파일 탈락률을 감소시키는 경우 또는 "의도 대 치료" 통계학적 분석을 사용하는 경우 이러한 동일한 결과가 발생하였는가?
이러한 질문에 답변하기 위하여, 본 발명자들은 물리적 활동과 칼로리 흡수에서의 차이점을 조절하기 위한 수단을 사용하고, 바디 조성물에 대한 DEXA 시험을 사용하며 최종 시험의 완결에 따라 거의 완벽한 순응성을 수득하는 방법을 사용하였다.
물질 및 방법. 총 13명의 피검자를 연구에 포함시키고, 122명(93.8%)중에서 평균 연령이 42.3세인 17명의 남성 및 105명의 여성에 대하여 모든 최종 측정을 완결한다. 피검자는 참여자 또는 모집한 친구 또는 참여자의 친척인 클럽 구성원에 대한 연구에 대한 정보를 제공한 운동 교습자 및 세일즈 패널이 텍사스주 샌 안토니오 및 휴스턴의 다양한 건강 및 운동 클럽에서 모집한다. 대부분의 경우, 운동 교습자는 이들이 주당의 트랙킹 데이타에서의 물리적 활동량 및 칼로리 흡수를 기록하고 최종 시험을 완결하는 것을 보장하는 연구를 통해 진행됨에 따라 피검자를 모니터하도록 한다. 모든 피검자에게는 알려진 동의를 제공하기 전에 개인 의사와 상담하도록 한다.
또한 무수한 연구들은 DEXA가 육류 샘플 및 동물의 시체에서 지방 및 살코기의 함량을 정확하게 측정할 수 있고[참조 문헌: Evans, 1989; Evans and Meyer, 1992; Evans, 1993; McCarty, 1993], 1% 미만의 총 신체 골 무기질 함량에 대해 전형적인 정밀 오차를 갖는 뉴론 활성화 분석에 의해 총 신체 칼슘 및 실제 골격 질량과 밀접한 상호관련이 있음을 나타내고 있다[참조 문헌: Felig, 1975]. 또한 비만 피검자 및 비-비만 피검자 둘다의 신체 조성을 평가하는 정확한 방법이 나타나있다[참조 문헌: Page et al., 1993; Eckel, 1992]. DEXA의 정밀도에 관한 초기 연구는 1990년에 보고되었으며[참조 문헌: Mooney and Cromwell, 1993], DEXA가 수중 중량, 중수소 희석액 및 총 신체 칼륨과 매우 밀접한 상호관련이 있지만[참조 문헌: Page et al., 1992], DEXA 측정시의 오차는 수중 시험 또는 총 신체 수분을 사용하여 수득되는 것의 절반 미만임을 제안하는, 3가지의 연속적인 연구[참조 문헌: Page et al., 1993; Hasten et al., 1994; Evans, 1989]에서 확인되었다. 구체적으로 루나 코포레이션(Luna Corporation)의 DEXA의 가변 계수(CV%)는 다음과 같이 언급되어 있다: 지방 질량=500g + -2.5g; FFM=600g + -1.3g; 및 총 조직 질량=400g + -0.6g. 각종 임상학적 장애을 평가하는데 사용되는 것 이외에[참조 문헌: Lindemann et al., 1993], DEXA의 신뢰성은 부분적 및 전체적 신체 조성에 대한 비교적 단기간의 식이 제한 및/또는 운동을 모니터하는 것을 가능하게 한다[참조 문헌: Page et al., 1993; Eckel, 1992]. DEXA에 대한 최근 연구는 연구자들이 DEXA가 오늘날 이용할 수 있는 가장 중요하게 분석되는 신체 조성 기구중의 하나라는 결론을 이끌어내도록 한다[참조 문헌: Lindemann et al., 1993].
DEXA는 신체 조성의 3가지 구획 모델을 제공한다; 지방, 살코기 조직 질량 및 골 무기질 함량. 40 및 70keV의 유효 에너지를 갖는 안정한 이중 에너지 빔의 합동 빔을 성취하기 위해 일정한 전위의 에너지 공급원을 사용하여 78kVp에서 K-에지(K-edge) 필터(세륨)을 사용하여 측정을 수행한다. 단위는 머리에서 발까지 1㎝ 간격으로 일련의 횡방향 스캔을 이동시킴으로써 수행한다: 스탠 영역은 약 60㎝×200㎝이다. 각가의 화소가 약 5×10분인, 횡방향당 약 120 화소의 요소에 대해 데이타를 수집한다. 총 신체 측정은 8㎝/초의 스캔 속도를 사용하여 20분내에 또는 16㎝/초의 스캔 속도를 사용하여 10 내지 20분내에 완료한다. R-값(연조직에서의 저에너지에 대한 고에너지 감쇠의 비)는 1.2m 1.4의 범위이다[참조 문헌: Lindemann et al., 1993].
중량 비율, 체지방%, 지방 질량 및 FFM에서의 변화를 비교하는 것 이외에, 또한 본 발명자들은 본 발명자의 이전 연구에서 상기한 바와 같은 신체 조성 개선(BCI) 지수를 사용하였다[참조 문헌: Glinsmann and Mertz, 1996]. BCI는 지방 질량의 수득 및 FFM에서의 손실이 음성 치료 결과이지만 체지방 손실 및 FFM의 수득이 양성 치료 결과라는 가정을 기본으로 한다. 따라서, 지방 질량의 손실 및/또는 FFM에서의 수득은 양성으로, 지방 질량의 수득 및/또는 FFM에서의 손실은 음성으로 스코어링되고, BCI는 이러한 스코어들을 종합한 총 결과이다. 변화의 측정으로서 중량 비율에 대한 BCI의 탁월함은 행동 개질 프로그램을 사용하는 약물 요법 및 프로그램을 사용하지 않는 약물 요법하에 있는 피검자뿐만 아니라[참조 문헌: Hasten et al., 1994] 감독된 운동 프로그램[참조 문헌: Liarn et al., 1993]에 참여하는 동안에 신체 조성의 변화를 측정하는 연구로 입증되었다. 칼로리 흡수 및 소비가 동등한 그룹에 대한 동시 가변성 분석을 사용함으로써 동일한 가변성의 가정을 갖는 2개의 표시된 스튜던트 t-시험을 사용하는 위약 그룹 및 실험 그룹의 2개의 그룹을 비교한다.
공지된 동의 형태를 나타내면서 탈락률을 감소시키는 방법으로는, 피검자에게 DEXA 시험 말기 및 당해 연구의 말기에, 피검자가 이를 완벽하게 수행하지 못한 경우에는 소유하지 못하는, 100달러 수표를 제공하겠다고 요청하였다. 피검자는 이들의 예탁된 수표 반환이, 이들이 얼마나 많이 또는 얼마나 적게 지시에 따랐는가에 관해 솔직히 언급하는 한, 연구 프로토콜에 얼마나 잘 따랐는냐 또는 거의 따르지 않았는냐에 관계없이 시험 종결 완료시의 상황에 전적으로 따르는 것으로 피검자들에게 충고하였다. 초기 DEXA 시험을 완료한 후, 피검자들은 이들의 시험 결과에 관한 보고서를 제출하고, 외형적으로 동일한 불활성 위약 또는 크롬 피콜리네이트 400mcg을 갖는 캡슐을 포함하는 병에 상응하게 1 내지 130개의 수로 이를 랜덤하게 할당하였다. 조사자들, 생성물을 분배하는 연구 기술자들 또는 피검자들 누구도 위약 또는 활성 생성물에 상응하는 피검자의 수를 알지 못한다. 독립적인 지역 약제사가 연구에 대한 관리인으로서 활동하고, 활성 또는 위약 생성물에 상응하는 "X" 또는 "Y"로서 미리 표시된 병에 대해 랜덤하게 실험 번호를 할당하였다. 연구를 완료하고 모든 데이타를 수집하고 컴퓨터로 처리되면, 관리인은 생성물이 활성임을 지시하는 제조자에 의해 제공되는 봉투를 개봉하고, 후속적으로 이는 선임 조사자(GRK)에게 통보하였다. 모든 정보는 제2 입안자의 감독하에 텍사스 헬스 사이언쓰 센터의 대학(University of Texas Health Science Center)에서 컴퓨터처리 지원부에 의해 분석하였다. 시험 기간 동안의 모든 결론은, 신체 조성 시험 종결을 완료한 피검자에게는 이들의 시험 결과 및 예탁된 수표를 제공하고, 사용되는 생성물 양을 비교 검토함으로서 매일 실질적으로 소비된 캡슐의 수를 언급하도록 요청하였다. 이러한 데이타의 후속적인 분석은 1일 CrP 357㎎의 평균 활성 물질이 소비된 것을 나타낸다.
피검자들에게는 칼로리 흡수, 이상적인 음식에 대한 영양 정보 및 1일 칼로리 균형의 계산 및 기록에 관한 로그를 추정하는 일반적인 방법을 지시하는 학습장을 제공한다. 이들이 깨어있는 동안의 물리적인 활동을 통한 에너지 소비에 있어서의 상이함을 모니터하고 조절하기 위해, 모든 피검자는 각각의 일일 동안에 수행하는 단계의 수 또는 단위를 착용하는 것이 비실용적인 활동에 대해 동등한 단계의 수를 반영하는, 이전의 연구에 사용되는 보수계를 착용한다[참조 문헌: Evans and Press, 1989; Kitchalong et al., 1993]. 피검자는 동일한 날에 수행된 단계의 총 수를 기록하고, 피검자에서 체지방의 1파운드의 변화에 대해 + 또는 -3,500칼로리의 공식을 사용하여 체지방의 총 변화를 조절하는데 사용되는 칼로리 흡수를 기록하는데 로그를 사용한다.
표 75의 결과는 연구를 완료한 122명의 피검자에 대해 기본적인 설명적 통계를 제공한다. 연구를 완료하지 않은 사람과 임의의 신체 조성 파라미터가 차이가 없음을 나타내는 사람들에 대한 연구를 비교한다.
* 평균+-SD
표 76은 90일의 시험 기간 동안 발생하는 변화를 비교한 것이다.
* 평균 + -SD
** 2개의 표시된 스튜던트 t-시험
토의: 표 76의 기본 데이타의 검토는 임의의 신체 조성 파라미터의 2개의 그룹 사이에는 실질적인 차이가 없음을 나타내고 있고, 이는 랜덤화 방법이 피검자의 2개의 동등한 그룹을 제공하는데 성공적임을 제안하고 있다. 표 77의 데이타는 칼로리 흡수 및 에너지 소비 사이의 상호관계가 동등한 그룹들로 구성되어 있고, CrP의 보충은 비례 중량, %체지방 및 BCI에 대한 매우 중요한 효과를 가짐을 나타내고 있다. 또한, 칼로리 흡수와 소비에 대한 보정 없이도, 활동 그룹의 변화는 체지방의 상당한 감소(p=0.02)를 포함하는 본 발명자들의 이전의 연구에서 관찰되는 변화와 일치한다는 것 또한 별로 중요하지 않다.
상기한 연구에서 신체 조성의 중요 개선이 체지방의 감소임은 중요하지 않다. DEXA 시험은 지방 조직의 직접적인 물리적 측정을 제공하는, 신체 조성을 측정하기 위한 몇몇 신규한 기술 중의 하나이다. 신체 조성을 측정하는 다른 많은 수단뿐만 아니라 유체정역학적 시험 모두는, 몇몇 시체에서 발견되는 바와 같이, 신체 밀도가 동일한 퍼센트의 지방을 반영한다는 가정을 기본으로 피검자의 체지방을 측정하는 것에 의존한다. 더욱이, 유체정역학적 시험이 신체 밀도를 계산하기 위해 피검자의 신체 용적을 실질적으로 측정하지 않더라도 수분의 유무하에 수득되는 비례 중량으로부터 추정된다. 따라서, 유체정역학적 체중 측정을 사용하더라도, 피검자의 체지방은 지방 조직의 물리적인 측정으로부터가 아닌, 2가지 상이한 추정으로부터 유도된다. 그리고, 물론 유체정역학적 시험으로부터 유도된 추정은, 숨을 내쉬는 것이 일정하더라도 시간에 걸쳐 폐 용적 뿐만 아니라 수분이 변하기 때문에 일정하게 내쉬는 기체에 대한 능력에 의해 유효할 수 있다. DEXA 시험은 신체를 스캐닝하는 동안에 15 내지 20분 동안 시험 테이블에서 노출될 것만을 필요로하는 측정법을 수득하였기 때문에 이러한 어려움을 해결하였다. 발명자들에게는, 신체 조성의 비교적 작은 변화를 생성하는 생성물의 효능을 측정하려고 시도하는 경우, 시험 기술의 가변성을 조절하는 것이 필수적인 것으로 보인다.
조건적으로 환불가능한 예탁금을 제공하기 위한 피검자의 요건은 "치료 의도"와 같이 통계적인 대조를 사용할 필요가 없는 최종 시험을 완료한 피검자의 수에 있어서 극적인 차이를 나타내는 것으로 보인다. 후기 연구 비평문은 피검자들이 합당한 요구와 같이, 처리되지 않은 예탁금을 제공하기 위한 요건을 검토하였음을 나타내었다. 상기 연구에 채용된 130명의 피검자중 단지 8명만이 최종 시험을 완료하지 못했다. 한명의 피검자는 임신해서 연구를 그만둘 것을 요청하였고, 다른 세명은 그 지역으로부터 이주하였고, 한명은 후기 시험 동안에 아팠으며, 세명은 이유를 밝힐 수 없었다. 따라서, 모든 의도된 목적에 대해, 결과에 영향을 미칠 수 있는, 연구로부터의 탈락자는 없었다. 본 발명자의 데이타에 한정적이지 않더라도, 예탁 요건은 추가의 연구에 있어 다소 가치있는 것으로 보인다.
조건적으로 환불가능한 예탁금을 제공하기 위한 피검자의 요건은 전적으로 피검자가 연구 및 연구 종결시의 질문을 완료하는 것을 기본으로 하고 있기 때문에, 피검자가 얼마나 많이 또는 적게 프로토콜에 따랐는지는 상관없다. 위약 및 활성 그룹에 있어서 생성물을 섭취하지 않은 동일한 수의 피검자는 물론 그룹을 통한 효과가 균형적이지 않다. 생성물을 섭취하지 않은 위약 피검자는 위약이 활성 성분을 포함하지 않기 때문에 결과 측정시 아무런 효과가 없다. 그러나, 활성 그룹에서 생성물을 섭취하지 않는 것은 생성될 수 있는 활성 생성물의 효과를 감소시킬 것이다. 사실, 완전하게 비협조적인 피검자는 실질적으로 위약 피검자가다. 따라서, 협조 결여는 얼마나 많은 생성물을 피검자가 소비하였는가에 관한 정확한 데이타를 수득할 필요성이 강조되는 두 그룹 사이의 매우 자연스런 차이의 감소에 따른다. 매주 체크하고 개인적으로 모니터링하는 것은 보다 포괄적인 데이타를 발명자에게 제공하고 결과 측정시에 협조 결여에 미치는 영향을 감소시키는 것으로 나타난다.
결론: 상기한 데이타는, 신체 조성 지수가 체지방의 총 손실의 합에 비지방 질량의 총 수득의 합을 더한 것으로 나타나는 결과 기준으로 사용되는 경우, 크롬 피콜리네이트를 보충시키는 것이 신체 조성에 있어서 상당한 개선을 가져올 수 있음을 나타내고 있다.
실시예 26
다유전자 유전성 및 마이크로/미니부수체
정신의학 유적학에서의 마이크로/미니부수체의 다형성체:
미니부수체는 길이가 65염기쌍 이하인 반복 서열로서 정의된다[참조 문헌: Wright, 1994]. 미니부수체는 길이가 2 내지 5bp로서 정의되는 다양한 보다 짧은 반복체로 이루어져 있다. 이를 예를 들어 구체적으로 언급하지 않더라도 본 발명자들은 마이크로/미니부수체 둘다를 포함하는 용어를 사용할 것이다.
게놈의 도처에 있는 마이크로/미니부수체 반복의 높은 빈도 때문에, 발명자들 및 다른 이들은 연관 연구에서 상기한 다형성체를 종종 사용한다. 발명자들의 초기 가정은 중성 또는 사일런트 단일 염기쌍 다형성체와 같이, 마이크로/미니부수체 대립형질이 유전자 기능에 영향을 미치는 다른 '중요한' 돌연변이를 가지면서 불균형적으로 연결되어 있다는 것이다. 그러나, 수년에 걸쳐 이러한 다형성체를 사용하여 연구한 후, 발명자들은 마이크로/미니부수체 자체가 '중요한' 돌연변이일 수 있음을 의심하기 시작하였다. 본 발명에는 다유전자 유전체가 반복되는 극히 매우 긴 트리플렛이 포함되지는 않았지만, 이러한 연구들은 다양한 길이의 반복 대립형질이 '정상'의 범위에 있더라도 각종 메카니즘을 통해 유전자 기능에 영향을 미칠 수 있다는 개념을 도입하였다. 관련된 이러한 마이크로/미니부수체 다형성체에는 2가지 양태가 있다-이들의 돌연변이률 및 이들의 크기.
마이크로/미니부수체 대립형질의 돌연변이률은 비반복 서열의 것보다 높다[참조 문헌: Jeffrey et al., 1987]. 플랭킹 마커(flanking marker) 교환의 결여는 신규한 돌연변이가 복제 실패 또는 복잡한 전환-유사 사건에 기인하는 것으로 제시되어 있다[참조 문헌: Wolff et ai., 1989]. 높은 돌연변이률은 이러한 다형성체가 연관 연구의 경우에서 보다 쓸모없도록 만들 수 있는데 왜냐하면, 너무 많은 세대 생성으로 인해 2개의 상이한 다형성체가 다수의 세대 생성에 있어서 동일상으로 유지될 것을 요구하는, 연결 불균형 관계에 너무 많은 노이즈가 도입되기 때문이다. 그러나, 마이크로/미니부수체 돌연변이 자체가 '중요한' 대립형질인 경우, 이들은 높은 돌연변이률에도 불구하고 연관 연구에서 실질적으로 보다 강력할 수 있다.
연결 불균형이 특정 표현형을 갖는 마이크로/미니부수체의 관계에 수반되는 경우, 각각의 경우에 부수체에 새로운 돌연변이가 발생하면, '중요한' 대립형질로서 동일한 염색체상에서 특별한 변화가 발생하게 된다. 그러나, 평균적으로, 이러한 '중요한' 대립형질을 갖는 연결 불균형에서 보다 길거나 짧은 돌연변이 대립형질이 바람직하다는 경향이 있지는 않다. 그러나, 반복체의 크기가 유전자 조절에서 중요 역할을 하는 경우(하기를 참조한다), 관련된 정량적인 특성에서, 특별한 개개의 대립형질 또는 대립형질 서열을 갖기 보다는 상이한 크기의 대립형질 그룹을 갖는 경향이 있다.
길이 및 서열 둘다가 수반될 수 있는 가능성이 있으며, 상이한 크기의 마이크로/미니부수체 대립형질이 유전자 기능에 영향을 미칠 수 있다. 이러한 가설은, 상이한 마이크로/미니부수체 대립형질이 유전자의 전사률 또는 해독률에 영향을 미치는 것으로 나타나는 경우에 보다 설득력이 있다. 사실, 이에 대해 많은 예들이 있다.
다유전자 유전성의 일반적인 가설:
다유전자 유전성의 마이크로/미니부수체 가설의 다양한 양태는 하기와 같다: 다수의 마이크로/미니부수체가 이들이 연관된 유전자의 발현에 영향을 미친다: 많은 유전자가 하나 이상의 마이크로/미니부수체 다형성체와 연관되어 있다: 그 결과, 많은 유전자가 광범위한 기능한 대립형질형성 변형체로서 나타나다. 각각 다수의 대립형질을 갖는, 몇몇 마이크로/미니부수체 다형성에 연관된 유전자는 특별히 다수의 기능적인 반수형으로 나타난다. 대부분의 유전자가 유전자 활성 평균 수준이 ±10 내지 15%로 연관되어 있지만, 이의 범위는 ±40%이고, 다수의 마이크로/미니부수체 다형성이 수반되는 경우, 이의 효과는 더해진다.
추가로, 중요한 기능적인 변형체는 1 내지 100% 범위의 발생률로서 일반적인 군집에서 일반적이다. 100% 발생률은, 대립형질의 도수 분포가 과다기능 대립형질(평균 10% 미만) 및 저기능 변형체(평균 10% 초과)로 이루어진 경우에 발생할 수 있다. 개별적으로, 이들 기능적 변형체는 표현형에 대해서는 온화한 효과만을 가지고(0.5 내지 8% 가변성), 드물게 질환을 유발시키는데, 즉 이들은 일반적으로는 1개의 유전자-1개의 질환의 성염색체성 우성 또는 열성 질환 부류에 대해 책임이 있지 않다. 대부분의 마이크로/미니부수체 다형성체가 엑손에 있지 않기 때문에, 다유전성 질환에서의 돌연변이는 일반적으로는 엑손 외에서 및 종종 전사된 서열 외에서 일어난다. 6개 이상의 유전자가 소정의 질환에 수반되는 경우, 로그 스코어 연결 연구는 효과를 상실하게 된다[참조 문헌: Risch and Merikangas, 1996l Weeks and Lathrop, 1995]. 연결 연구는 소정의 대립형질의 존재가 질환의 존재와 연관되어 있고, 대립형질의 부재가 질환의 부재와 연관되어있다는 가설을 기본으로 한다. 이와는 반대로, 다유전자 유전성에 있어서, 질환은 몇몇 상이한 유전자의 역치수의 존재와 연관되어 있다. 이와 같이, 다른 돌연변이 유전자의 필수적인 역치수가 없기 때문에, 다수의 가계가 질환을 수반하지 않는 소정의 돌연변이 유전자를 운반하게 된다. 따라서, 다수의 가족은 특이적 유전자를 운반하지만 질환을 갖지는 않으며, 질환이 있는 다른 가족 구성원은 돌연변이 대립형질을 운반하지 않을 수 있다[참조 문헌: Comings, 1996f, I'm]
과다기능 및 저기능 대립형질 둘다가 표현형에 영향을 미칠 수 있다. 예를 들어, 정신의학 유전학에서, 수용성 과다감수성을 유발시키는 소정의 수용체 유전자의 발현 또는 수용체 저감수성을 유발시키는 수용체 유전자 발현의 감소 둘다가 변화된 표현형과 연관될 수 있다. 개개가 동일한 표현형에 영향을 미치는 과다 또는 저기능 유전자의 역치수를 전달하는 경우, 다유전자 질환이 발생한다. 따라서, 20개의 상이한 다유전자가 소정의 정량적인 가변성에 중요한 역할을 하고, 10개 이상의 과다기능 또는 저기능 가변성을 갖는 피검자에는 상당히 변화된 표현형이 존재할 수 있다. 역치수는 대립형질의 과다기능 및 저기능 정도에 좌우되고, 변화된 표현형의 중증도는 다유전자의 수가 중요한 역치수를 능가하는 정도에 좌우된다.
마이크로/미니부수체는 일반적이기 때문에, 발생하는 다유전자 질환의 가능성은 비교적 높다. 따라서, 다유전자 질환은 단일 유전자 질환보다 훨씬 일반적이다. 25 내지 50%의 범위인 다수의 다유전자의 일반적인 군집 빈도에서, 역치수를 물려주는 기회는 단일 유전자 질환의 것보다 높다. 소정의 마이크로/미니부수체의 경우, 대립형질은 기타 유전자의 유전적인 배경 및 표현형의 성질에 좌우되는 표현형에 부정적이거나 긍정적인 효과를 갖는다. 실질적인 실시예로는 도파민 전달자 유전자(DAT1)의 9개의 대립형질와 코카인 유발된 망상증 사이의 연관성을 겔런터 등(Gelernter et al., 1994)이 관찰한 것이 있다. 이와는 반대로, 쿡 등(Cook et al., 1995)과 커밍스 등(Comings et al., 1996)은 DAT1 유전자의 10개의 대립형질와 주의 결여 과다활성 질환 사이의 연관성을 관찰하였다. 이러한 다양한 보고로부터, 하나 이상의 관찰이 부정확하다는 결론을 낼 수 있다. 그러나, 둘다 정확하다는 합당한 가능성이 있을 수 있는데, 소정의 마이크로/미니부수체의 상이한 대립형질이 상이한 표현형과 연관될 수 있기 때문이다. 다유전자 질환을 연구하기 위한 합당한 접근법은 후보 유전자를 선택하고, 관련된 정량적인 특성에 대해 가장 근접한 마이크로/미니부수체 다형성의 대립형질 효과를 조사하는 것이다.
상기에서 제안한 유전자 고유성의 특성은 다수의 추가적 함축성을 내포하고 있다. 다수의 마이크로/미니부수체 다형성체가 유전자의 전사률 또는 해독률을 변화시키는 잠재성을 갖고 이들이 가장 접근해있는 경우 및 다수의 유전자가 하나 이상의 마이크로/미니부수체와 연관되어 있는 경우, 다수의 가능한 유전자가 이들이 조절하는 표현형의 다유전자 유전성 정도에 기여하는 잠재성을 갖는다.
정신의학 및 기타 질환에서 특정 유전자의 잠재적인 역할에 관한 많은 연구는 후보 유전자의 엑손에서의 돌연변이에 대한 연구로부터 시작되었다. 이러한 연구가 음성인 경우, 유전자는 검토되는 질환과는 아무 상관이 없는 것으로 종종 결론을 내린다. 대다수의 돌연변이가 복잡하게 수반되는 경우, 다유전성 특성은 비엑손이어서 유효하지 않다. 본 발명의 가설은 유전자의 기능에 소수의 효과만을 갖는 엑손 돌연변이의 역할도 배제하지 않으며 유전자의 기능적으로 중요한 변형체의 존재에도 불구하고 이러한 연구가 음성일 수 있다는 사실을 강조하고자한다.
평균적으로, 각각의 후보 유전자가 연구의 표현형 및 크기에 좌우되는 소정의 정량적인 특성의 0.5 내지 8%의 가변성에 기여하는 경우, 결과는 보통, 경계 또는 부정적인 의미일 수 있다. 그러나, 2개 이상의 후보 유전자의 추가 또는 우세한 효과의 조사로 상당히 큰 효과를 나타낼 수 있다.
다수의 연관 연구는 단순히 대조와 비교되는 피검자에서 특정 대립형질의 빈도를 조사하는 것이다. 그러나, 진단이 증상의 복잡한 세트를 기본으로하는 경우, 소정의 대립형질은 진단에 수반되는 몇몇 정량적인 특성을 나타낼 수 있지만, 진단 그 자체는 나타낼 수 없다. 예를 들어, 정신분열증이 다유전자 질환인 경우, 특정 후보 유전자의 대립형질은 존재하는 음성적인 증상(예: 정서적인 기력저하)과 상당한 연관을 나타낼 수 있으며, 모든 경우는 아니지만 몇몇 경우에는 양성 증상(예: 망상 또는 환각) 또는 정신분열증 자체의 진단과는 연관성이 없다. 하위 증후군성 정량적인 특성의 조사 이외에 단순히 양분된 진단에 대한 분석의 한계로 다유전성 질환에 중요하게 기여하는 유전자를 놓칠 수도 있다. 또한 잡종 강세가 대조 대 피검자에서 개개의 대립형질 빈도가 상이하지 않는 경우 표현형에 대해 상당한 효과를 가질 수 있다[참조 문헌: Comimgs and McMurray, 1977].
즉각적인 발견적 가치를 갖는 경우, 가설은 매우 유용하다. 연관 연구에서 다형성성이 큰 마이크로/미니부수체 다형성체를 사용하는 경우의 한가지 단점은 각각의 많은 대립형질 및 보다 더 많은 수의 잠재적인 유전형이 조사되는 경우, 연구력이 심각하게 손상되어 무용하게 될 수 있다는 점이다. 그러나, 반복체의 크기가 중요한 가치일 수 있는 경우, 가장 복잡한 다형성체가 보다 짧은 대립형질의 동형접합체, 보다 긴 대립형질의 동형접합체 및 이형접합체로 이루어진 3가지 유전형으로 감소될 수 있다. 본 발명은 행동 특성에서 다수의 유전자(OB, MAOA, MAOB, CNR1, CABRA3, GABRB3, DBH, FRAXA 및 NOSI)의 역할 연구에 대한 이러한 접근법을 발견하였다.
다수의 잠재적으로 흥미로운 후보 유전자가 클로닝되고 서열화되는 경우, 대부분은 게놈 데이타 베이스에서 다형성체를 가지지 않기 때무에 연관 연구가 불가능하다. 본 발명의 가설을 기준으로, 서열이 공지된 경우, 유용한 마이크로/미니부수체를 확인하는 한 방법은 상업적인 공급원으로부터 흥미로운 유전자를 운반하는 크기가 큰 게놈성 클론을 수득하는 것이다. 이어서, 이들은 반복 서열에 대해 선별하여 연관 연구에 대한 정보를 수득할 수 있다.
본 모델은 다유전자 유전성 연구에 있어 가장 가치있는 다형성성을 입증하는 Z-DNA를 형성할 수 있는 반복 서열을 제안하고 있다. 이는 Z-헌트-II 프로그램[참조 문헌: Schroth et al., 1992]을 사용하여 공지된 서열을 선별하는 것이 가장 유익한 다형성 영역의 위치에 대한 중요한 실마리를 제공할 수 있음을 제안하고 있다. 이를 시험하기 위해, 본 발명자들은 상기한 프로그램을 사용하여 NOSI 서열을 조사하였다[참조 문헌: Hall et al., 1994]. NOSI 유전자가 없는 녹 아웃 마우스에서 호전성을 나타내는 연구 결과를 기본으로[참조 문헌: Nelson et al., 1995], 본 발명자들은 NOSI 유전자의 서열의 가시적인 조사에 의해 확인되는 반복 다형성체를 사용하여 사람에서 각종 행동 특성을 조사하였다[참조 문헌: Hall et al., 1994]. 몇몇 연관이 관찰되기 때문에, 발명자들은 Z-헌트-II 프로그램에 의해 본 발명자들이 사용하는 다형성체를 확인할 수 있는지, 유익한 다형성성을 포함할 수 있는 유전자에서 다른 영역이 있는지 의문을 제시하였다. 양쪽 예측은 사실이었다. 다양한 길이의 NOSI(CA)n대립형질의 길이가 NOSI 유전자의 기능에서 중요한 역할을 한다는 가설을 기본으로, 본 발명자들은 가장 짧은 50%의 대립형질(199bp 미만) 및 가장 긴 50%의 대립형질(199bp 이상)으로 이루어진 두 그룹으로 대립형질을 나누었다. 일차적인 연구는 행동 표현형에 몇몇 연관이 있음을 제안하였다. 이어서 본 발명자들은 Z-헌트-II 알고리즘을 사용하여 Z-DNA 여역에 대한 NOSI 유전자의 공개된 서열을 선별하였다[참조 문헌: Wang et al., 1979]. 이는 본 발명자들이 사용하는 다형성체가 3개의 Z-DNA 고함량 영역 중 하나임을 나타내고 있다. 심지어 높은 Z-스코어를 갖는 제2 영역이 이전에는 검출되지 않은 신규한 다형성성 영역으로 확인되었다.
이러한 세가지 실시예는 다유전자 질환에 수반되는 유전자 확인을 가속화시킬 수 있는 모델의 예측 방법을 실질적인 용어로 기술하고 있다. 사람의 게놈 프로젝트로부터 곧 입수할 수 있는 서열 데이타와 결합시켜 이러한 모델을 사용하는 것은, 공지된 후보 유전자에 대한 근접성에 대해 마이크로/미니부수체의 존재를 확인하는 능력을 증가시킴으로써 다유전자 질환에 대한 발명자의 지식 확보에 기여할 수 있다.
모노아민 옥사다제 A 유전자(MAOA) 및 VNTR 다형성체 대립형질은 4그룹으로 나눈다. 특정 증상에 관련된 다수의 정량적인 변수를 사용하는 경우 상당한 연관성이 있다. 결과는 351명의 토렛트 증후군으로 선정된 사람, 이의 친지들 및 대조에서 조병 증후군에 대해 나타내었다. 가장 긴 대립형질을 갖는 피검자에서의 스코어가 상당히 증가되었다[참조 문헌: Gade et al., 1997]. (b) 약물 남용자 및 대조 그룹에서의 동일한 다형성체 사용: 가장 긴 대립형질 및 약물 남용자 스코어를 사용하는 경우에도 상당한 연관성이 있다[참조 문헌: Gade et al., 1997]. (c) SCL-90 시험을 기본으로 하는 불안에 대한 정량적인 스코어와 피검자를 208bp 이하의 대립형질에 대한 동형접합체(왼쪽) 및 208bp 대립형질에 대한 개개의 동형접합체 또는 이형접합체(오른쪽)로 나눈 비만 유전자(OB) 마이크로부수체 다형성체 대립형질 사이의 연관성, (d) 사건 연관된 잠재성(ERP) P300 파동(u볼트)의 증폭과 피검자를 5 이상의 반복 대립형질에 대한 동형접합체(오른쪽) 및 5 미만의 반복 대립형질에 대한 개개의 동형접합체 또는 이형접합체(왼쪽)로 나눈 CNR1 카나비노이드 수용체 유전자 미세부수체 다형성성 대립형질 사이의 연관성[참조 문헌: Johnson e tal., 1997]. (e) 브라운 성인 ADD 집게와 피검자를 185bp 이상의 대립형질에 대한 동형접합체(왼쪽) 및 185bp 미만의 대립형질에 대한 개개의 동형접합체 또는 이형접합체(왼쪽)로 나눈 GABAA, B3(GABRB3) 수용체 유전자 마이크로부수체 다형성성 대립형질 사이의 연관성. (f) 수행 IQ와 IQ에 대해 평가되는 랜던한 성인에서 FRAXQA 위치의 정상적인 대립형질사이의 연관성[참조 문헌: COmings e tal., 1997a, b 또는 c?].
실시예 27
학습 무능력이 있는 피검자 및 학습 무능력이 없는 피검자에 있어서 ADHD에 대한 3개의 아드레날린성 유전자(ADRA2A, ADEA2C, DBH)의 추가 효과
본 발명자들은 아드레날린성 유전자, 아드레날린성 α2A 수용체(ADRA2A), 아드레날린성 α2C 수용체(ADRA2C) 및 도파민 β-하이드록실라제(DBH)와 학습 무능력(LD)이 있는 ADHD 및 학습 무능력이 없는 ADHD 사이의 연관성 및 추가 효과를 시험한다.
본 발명자들이 선정한 이러한 2가지 유형의 ADHD 및 잠재적인 후보 유전자를 표 78에 요약하였다.
할페린 등[참조 문헌: Halperin et al., 1997]에 의해 언급된, 혈장 MHPG와 언어능은 있지만 수행 IQ가 없는 것 사이의 상호 관계는 폭력 또는 기타 주요 범죄로 구속된 범법자에 있어서 낮은 언어 IQ 스코어의 발견과 현저하게 유사하다[참조 문헌: Hirschi and Hindelang, 1977; Miller, 1998l Shulman, 1951; Moffitt and Silva, 1988]. 혈장 MHPG 수준과 낮은 언어 IQ사이의 부정적인 관계는 NA 유전자가 또한 반사회적 행동에 수반될 수 있음을 제시한다.
클로니딘의 작용 부위인 아드레날린성 α2 수용체는 전두엽 전부 및 두정부의 집중된 중심에 풍부하고, NA 회전을 조절하는데 중요한 역할을 하기 때문에, 본 발명자들은 아드레날린성 α2A(ADRA2D) 또는 아드레날린성 α2C(ADRA2C) 수용체, 또는 도파민 β-하이드록실라제 유전자의 상이한 유전형이 특히 ADHD와 연관되어 있는지, 그리고 ADHD + 인식 장애 아유형을 갖는 바람직한 연관성이 있는지를 측정하고자 하였다. 본 발명자들은 ADRA2A 유전자의 촉진 영역에서 MapI 다형성체[참조 문헌: Lario et al., 1997], ADRA2C 유전자의 디뉴클레오티드의 반복 다형성체[참조 문헌: Riess et al., 1992] 및 DBH 유전자의 TaqI B1/12 다형성체를 사용하였다[참조 문헌: d'Amato et al., 1989; Wu et al., 1997].
방법: ADRA2A 및 DBH 유전자에서의 단일 염기쌍의 다형성체의 유전형 빈도는 및 ADRA2C 유전자에서의 디뉴클레오티드 반복 다형성체는 325명의 피검자, 토렛트 증후군이 있는 267명의 피검자 및 58명의 대조에서 측정한다. ADHD 및 LD에 대해 다양한 행동은 모 질문 또는 자체-보고 질문 및 개인적인 면접으로 평가한다. 반사회적인 행동에 대한 가능한 관계를 평가하기 위해, 행동 증후군 및 적대적인 반항 장애를 또한 평가한다.
연구 그룹은 325명의 비친척 피검자로 이루어진다. 이들중 267명은 토렛트 증후군에 대한 DSM-III-R 및 DSM-IV 기준을 충족시키고, 모두는 개인적으로 D.E.C와 면접하였다. 나머지 58명은 대조이다. 모두 비라틴계 백인이다. TS 피검자는 호프 메디칼 센터(Hope Medical Center) 도시의 토렛트 증후군 클릭으로부터 왔다. 본 발명자들은 본 발명의 TS 피검자를 온순한(1등급, 치료하기에는 약한 만성적인 집착), 보통(2등급, 치료가 요구될 만큼 충분히 중증임) 및 심각함(3등급, 이들의 생활 형태에 있어 매우 중요한 영향을 미침)으로 미리 나눈다[참조 문헌: Comings, 1990: Comings and Comings, 1987b; Comings and Comings, 1984]. TS 피검자들중 25%는 3등급, 12%는 1등급, 나머지 71%는 2등급이다. TS 및 ADHD는 유사한 장애이고, 진료소에서 온 TS 피검자의 대다수는 코모르비드 ADHD를 갖는다[참조 문헌: Comings, 1990: Comings and Comings, 1987b; Comings and Comings, 1984]. 대조, ADHD가 없는 TS 피검자 및 ADHD가 있는 TS 피검자의 존재는, 이들 그룹들이 특히 연속적인 특성 가변성으로 상이한 유전자의 대립형질 및 ADHD 사이의 연관성을 조사하는데 적합하게 한다. TS 피검자 및 대조 둘다는 문헌에 상세하게 기술되어 있다[Comings et al., 1996j: Comings 1994a; Comings, 1994b; Comings 1995a, Comings, 1995b]. TS 피검자의 평균 연령은 18.0세이다(S.D. 13.2). 대다수가 보다 나이가 많은 어린이 및 청소년이지만, 29%는 21세 이상이다. 대조의 평균 나이는 46.3세이다(S.D. 15.38).
각각의 대조 및 TS 선정인은 ADHD에 대한 DSM-II, DSM-III-R 및 DSM-IV 기준의 평가를 포함하는 질문지를 채워야한다. 보다 나이든 피검자의 경우, 질문은 이들이 어린이일 때를 언급한다. ADHD 스코어는 ADHD에 관한 DSM-IV(1994) 기준을 기본으로 한다. 질문은, 어린이 또는 청소년기 동안에 이러한 증후군이 전혀 존재하지 않거나 거의 존재하지 않았다(스코어=0), 가끔 존재하였다(스코어=1) 또는 항상 존재하였다(스코어=3)으로 질문하고 있다. 모든 중증도를 갖는 사람들 사이에서 완벽한 판단을 제공하기 위해 모든 3가지 반응을 사용한다. ADHD 스코어는 DSM-IV 부주의, 충동 및 과다행동 증후군의 합이다.
부모는 14세 이하의 어린이였을 때의 질문지에 답하고, 14 이상의 피검자는 그들 자체 또는 이들의 부모의 도움을 받아 질문지에 답한다. 질문은 이들의 정확성을 보장하기 위해 피검자 및 가족들과 함께 개인적으로 검토한다.
협력 장애가 있는 문제 여부를 평가하기 위해, 피검자는 다음 3가지 질문에 답한다: 1) 교육적인 심신장애(EH), 학습 심신장애(LH) 또는 학습 장애(LD)의 특별 학급에 있어본 적이 있는가, 2) 재활 학습에 있어본 적이 있는가, 3) 당신이 가지고 있는 학습 장애에 대해 이야기해 본 적이 있는가. 각각의 질문에서 없다=0이고 있다=1로서 스코어링하고, 이를 더하여 LD 스코어를 생성한다. 캘리포니아에서는, 상기한 특별 학급에 있으려면, 한명 이상의 교육 심리학자에 의한 평가를 요구하며, 이의 조사를 지지하는 학생이 2학년 이상인 평가를 요구한다. ]
초등학교에서 학술적 수행능을 평가하기 위해, 피검자는 1 내지 6학년 동안의 학급 수행능이 전체 평균인지, 평균 이하인지 또는 평균 이상인지에 대해 다음 질문에 답한다 : a) 수학, b) 읽기, c) 쓰기. a 내지 c에 대한 답은 평균 이상이다=0, 평균이다=1 및 평균 이하이다=2로서 스코어링하고, 이들을 GSAP 스코어로 합한다.
행동 장애 또는 적대적 반항 장애에 대한 DSM-IV 기준의 유사한 0, 1 및 2등급을 사용한다.
양분법의 경우, 피검자가 주의 결여/과다반응 장애, 결합된 유형; 우세하게 부주의한 유형; 또는 우세하게 과다반응 충동 유형에 대한 DSM-IV 기준에 부합하는 경우, 이들은 상당한 ADHD 문제를 갖는 것으로 간주한다. 피검자는 상기한 특별 학급중 하나에 있었고 학습 장애가 있는 것으로 이야기 하는 경우에 이들은 학습 장애가 있는 것으로 간주한다. ADHD에 대한 기준에는 부합하지 않지만 학습 장애에 대한 기준에는 부합하는 피검자는 A-LD+ 그룹으로 분류한다. ADHD에 대한 기준에는 부합하지만 LD에 대한 기준에는 부합하지 않는 피검자는 A+LD- 그룹으로 분류한다. 최종적으로, 두가지 기준에 둘다 부합하지 않는 피검자는 A-DL- 그룹으로 분류한다. 0 내지 4의 GSAP 스코어는 GS-로, 5 내지 6의 GSAP 스코어는 GS+로 스코어링하는 GSAP 스코어를 기준으로, 유사한 그룹화를 사용한다.
질문[참조 문헌: Comings , 1990]은 ADHD와 관련된 정량적인 가변성, ADHD 기준, 학습 문제, 초등학교 학술적 수행능, 행동 장애 및 적대적 행동의 서브스코어를 제공하는 매우 구조화된 방법을 제공하는 수단다. 증후군 평가를 위한 방법을 기준으로 하는 질문의 정확도, 유용성 및 민감성은 동일한 구조화된 수단을 면접자에게 시행하기 위한 수단과 같은 것을 사용하는 것과 비교함으로써 다른 이들에 의해 입증되었다[참조 문헌: Gadow and Sprafkin, 1994; Grayson and Carlson, 1991]. 각각의 피검자와 본 발명자의 질문 검토는, 이들이 개인적인 면접에 의해 수득되는 정보를 정확하게 반영함을 나타낸다.
ADRA2A는 프로모터 영역의 단일 염기쌍의 MapI 다형성체를 사용하는 유전형이다[참조 문헌: Lario et al., 1997]. 이들의 PCTTM조건 및 프라이머가 사용된다. ADRA2C는 이뉴클레오티드 반복 다형성체 및 PCRTM공정을 사용하는 유전형이다[참조 문헌: Riess et al., 1992]. 각각 형광 표지된 프라이드 0.1μM을 사용하여 표적 DNA를 증폭시키는데는 폴리머라제 연쇄 반응(PCRTM)을 사용한다. PCRTM생성물은 탈이온수 100㎕로 희석시키고, 0.5㎕를 포름아미드 75㎕+ROX 표준 9.5㎕+블루 덱스트린 염료 9.5㎕의 혼합물 2.5㎕에 가한다. 이를 92℃에서 2초 동안 변성시키고, 샘플은 어플라이드 바이오시스템스 373 DNA 서열기[Applied Biosystems, Inc., (ABI), Foster City, CA]의 6% PAGE에 로딩하고, 겔은 1200볼트에서 30W로 4시간 동안 영동시킨다. 겔은 내부 표준 ROX 500을 사용하여 예비 처리하고 분석한다. 피크는 단편의 색 및 크기를 기준으로 제노타이퍼(genotyper, 버전 1.1, Applied Biosystems)에 의해 인식된다. 이는 몇몇의 매우 소수의 대립형질이외에 183 및 185bp에서 다수의 대립형질, 181bp의 대립형질을 생성한다. 이는 3가지 유전형으로 나타낸다: ≤183/≤183bp=1, 이형접합체=2, 및 ≤183/≤183bp=3.
DBH 유전자는 TaqI B1/B2 다형성체에 대한 유전형이다[참조 문헌: d' Amato et al., 1989]. 원래 이는 표지된 DBH 클론을 사용하는 서던 블롯팅을 요구하지만, 본 발명자들은 PCRTM계의 시험에 이를 적용하였다[참조 문헌: Wu et al., 1997].
도파민 유전자(DRD2 및 DAT1)의 유전형 확인은 이전에 기술되어 있다[참조 문헌: Comings et al., 1996]. DRD5 유전자의 경우, 본 발명자들은 마이크로부수체 다형성체 및 기술을 사용하였다[참조 문헌: Scherrington et al., 1994].
3가지 유형의 통계적 분석을 수행한다. 먼저, ADRA2A 및 ADRA2C의 효과를 평가하기 위해, 각각의 유전자가 11=1, 12=2 및 22=3으로 스코어링된 ANOVA를 총 ADHD 스코어 상에서 수행한다. 유전자형 그룹화를 선택하면, 각각의 유전자에 관련 유전형의 존재 또는 부재를 확인하기 위해 이분적 가변성을 지정한다. 2개의 유전자의 추가 효과를 평가하기 위해 A2A+A2C 스코어를 만든다. 여기서 ADRA2A 스코어 0 및 ADRA2C 스코어 0은 0이다. 여기서 ADRA2A 스코어 1 및 ADRA2C 스코어 1은 2이다. 유전자에 대한 1의 스코어는 1로서 스코어링된다. 3가지 모든 NA 유전자에 대한 개별적인 스코어를 더함으로써 NA 유전자 스코어를 수득한다.
본페로니 교정을 제거하기 위하여, 모든 6개의 행동성 스코어를 MANOVA를 이용하는 그룹으로서 조사한다. 이는 각각의 유전자에 대하여 별도로 그리고 유전자들에 대하여 함께 수행한다. 각각의 유전자 개개에 대하여 그리고 모두에 대하여 계산한 스코어의 변형률을 평가하기 위하여, 개개의 유전자 스코어, A2A+A2C 유전자 스코어, 및 NA 유전자 스코어 각각에서 행동상의 스코어에 대한 선형 회귀 분석을 수행한다. 이러한 효과의 크기를 통계학적으로 평가하기 위해 NA 유전자의 영향이 부가적으로 되는 프리오리 가설에 기초하여, 선형 ANOVA(다명식 서브코맨드 = 1)을 ADRA2A ALC ADRA2C 유전자, 또는 ADRA2A, ADRA2C 및 DBH 유전자를 첨가하는 결과에 대하여 수행한다. α= .05에서 매우 상이한 평균에 대한 포스트 혹 터키 분석을 수행한다. 모든 통계학적 시험은 SPSS 통계학적 패키지를 이용하여 수행한다(SPSS, Inc, Chicago, IL).
결과.ANOVA를 수행하여 ADHD 스코어에서 ADRA2A 유전형의 영향을 조사한다. 11개의 유전형을 수행하는 것들에 대한 평균 스코어는 17.4(n=180, s.d.= 11.1)이고, 12개의 유전형에 대해서는 19.05(n=125, S.D.=10.52)이며 20개의 유전형은 22.05(n=20, S.D.=11.67)이고, F-비= 2.05, p= .13이다. MANOA에 있어서, ADRA2A 유전자는 11=1, 12=2 및 22=3으로 스코어링된다. 회귀 분석에 있어서 이는 11,12 및 22=1로서 스코어링된다.
MANOVA는 6개의 스코어에 대하여 수행한다[표 80-A]. 중요한 연합은 LD, GSAP, 충동성, 및 총 MANOVA를 사용한 것이다. ADHD, LD, GSAP, CD 및 ODD 스코어에 대하여 선형 회귀 분석을 수행한다(표 3). LD 및 GSAP 스코어와 중요한 관련이 있다. 본테로니 교정된 α가 .05/5 또는 .01인 경우 LD 스코어는 중요하게 잔류하게 된다.
ANOVA를 수행하여 ADHD 스코어에 미치는 ADRA2C 유전자형의 영향을 조사한다. 11 유전자형을 보유하는 것에 대한 평균 스코어는 18.9(n=122, S.D.=10.41)이고, 12 유전자형에 대해서는 15.90(n=112, S.D.=10.099)이고, 22 유전자형에 대해서는 20.54(n=91, S.D.=11.1)이고, F-비율은 4.90이고, p는 .0080이다. 이후 튜키(Tukey) 시험에 의한 12 이형접합체에 대한 평균은 네가티브 잡종강세의 존재를 나타내는 11 또는 22 동형접합체에 대한 것보다 상당히 낮다[참고 문헌: Comings and MacMurray, 1998]. 따라서, ADRA2C 유전자에 대한 선형 회귀 분석은 12 = 0 및 11 또는 22 = 1로서 평가된다.
ADRA2C 유전자 스코어에 대한 MANOVA를 6가지 행동 스코어에 대해 수행한다(표 80B). 유의한 관계는 주의산만 및 충동성이다. 선형 회귀 분석(표 81)에 의해, 상관관계는 ADHD 스코어에 대해 유의하다. α=.01에서, ADHD 스코어는 여전히 유의하다.
본 발명자들은 TS-ADHD 피검자에서 도파민 B-하이드록실라제 유전자를 이미 연구하였고(Comings et al., 1996j) ADHD와 관련된 Taq B1 대립형질(d'Amato et al., 1989)의 존재를 밝혀내었다. 따라서, 본 발명자들은 DHB 유전자를 22=0 및 11 또는 22=1로서 평가하였다. MANOVA(표 80C)에 의해 어떠한 스코어도 유의하지 않다. 선형 회귀 분석에 의해, GSAP 스코어와의 상관관계는 유의하다. α=.01에서, 어떠한 것도 유의하지 않다.
아드레날린작용성 α2 수용체 유전자의 가능한 부가적인 효과를 조사하기 위해, 각각의 유전자 스코어를 더하여 A2A+A2C 스코어를 형성시킨다. 325명의 피검자 중, 106명(32.6%)은 0점이고, 205명(63.1%)은 1점이고, 14명(4.3%)은 2점이다. A2A+A2C 스코어 및 6가지 행동 스코어에 대한 MANOVA의 결과는 표 80D에 제시한다. 결과는 주의산만, 충동성, 기능항진, GSAP, LD 및 ODD 스코어에 대해 유의하다. 선형 회귀 분석(표 81)에 의해, 상관관계는 ADHD, LD, GSAP 및 ODD 스코어에 대해 유의하다. α= .01에서, ADHD. GSAP 스코어는 여전히 유의하다. CD 스코어를 제외한 모든 것에 대한 선형 ANOVA 분석은 0, 1 또는 2개의 돌연변이 유전자를 갖는 피검자로부터 진행되는 모든 스코어에서 점진적인 증가를 나타낸다. ADHD, 주의산만, 충동성, 기능항진 및 GSAP 스코어는 p＜.01에서 모두 유의하다.
아드레날린작용성 유전자의 가능한 부가적인 효과를 조사하기 위해, ADRA2A, ADRA2C 및 DBH 유전자 스코어를 더하여 NA 유전자 스코어를 형성시킨다. 325명의 피검자 중, 36명(11.1%)은 0점이고, 132명(40.6%)은 1점이고, 145명(44.6%)은 2점이다. NA 유전자 스코어 및 6가지 행동 스코어에 대한 MANOVA의 결과는 표 80E에 제시한다. 주의산만, 충동성, 기능항진, GSAP, LD 및 ODD에 대한 스코어는 모두 유의하다. 선형 회귀 분석(표 81)에 의해, ADHD, LD, GSAP 및 ODD에 대한 스코어는 유의하다. α= .01에서, ADHD. GSAP 및 ODD 스코어는 여전히 유의하다.
NA 유전자 스코어에 대한 ADHD 서브스코어, LD, GSAP 및 ODD 스코어의 선형 ANOVA 분석은 0, 1, 2 또는 3개의 돌연변이 유전자를 갖는 피검자에 걸친 모든 스코어에서 점진적인 증가를 나타낸다. ADHD, 기능항진, 주의산만, 충동성, GSAP 및 ODD 스코어는 p＜.01에서 모두 유의하다.
본 발명자들은 선형 ANOVA를 사용하여 NA 유전자 스코어 대 4개의 그룹 ADHD-LD-, ADHD+LD-, ADHD-LD+ 및 ADHD+LD+의 카이 스퀘어 분석을 수행하였다. 이들 결과는 표 82에 제시한다. 이는 3개의 NA 유전자를 모두 보유하는 피검자의 발병률이 ADHD-LD- 그룹에 대해 .6%로부터, ADHD+LD- 그룹에 대해 5.4%로, ADHD-LD+ 그룹에 대해 7.7%로, 및 ADHD+LD+ 그룹에 대해 11.4%로 이들 그룹에 걸쳐 증가함을 제시한다. 돌연변이 NA 유전자를 전혀 보유하지 않는 피검자의 발병률은 상기 4개의 그룹에 걸쳐 14.4%로부터 8.9%로 7.7%로 2.9%로 감소한다. 전체 4×4 표를 선형 트렌드 카이 스퀘어 분석(Cochran, 1954)에 의해 시험할 경우, p=.0005이다. A-LD+ 및 A+LD+ 그룹을 합할 경우, 피어슨 카이 스퀘어=17.6, d.f.=6, p=.007, 선형 트렌드 카이 스퀘어=12.9, d.f.=1, p=.0003이다.
NA 유전자 및 GSAP 스코어간의 관련은 종종 LD 스퀘어와의 것보다 크기 때문에, 본 발명자들은 또한 GSAP 스코어 및 NA 유전자 스코어간의 교차 표작성을 조사하였다. 이는 3의 NA 유전자 스코어를 갖는 피검자의 발병률이 0 내지 2의 GSAP 스코어를 갖는 경우 1.6%에서 3 내지 4의 스코어를 갖는 경우 .8%까지, 5 내지 6의 스코어를 갖는 경우 11.8%까지의 범위임을 제시한다. 양쪽 스코어의 전체 범위에 대해, 선형 카이 스퀘어는 p=.004에서 유의하다. 따라서, ADHD의 존재 또는 부재와 무관하게 초등학교의 2명 또는 3명의 학생 피검자에서 평균 이하로 수행된 어린아이는 돌연변이 NA 유전자를 거의 보유하는 것으로 보인다.
ADHD의 존재 또는 부재의 영향을 조사하기 위해, 피검자를 다시 4개의 그룹으로 분배하였다. 여기서, GS+는 5 내지 6의 GSAP 스코어를 갖는 그룹이고 0 내지 4의 GSAP 스코어를 갖는 그룹이고, 4개의 그룹은 A-GS-, A+GS-, A-GS+ 및 A+GS+이다. 카이 스퀘어 분석 대 NA 스코어의 결과는 표 83에 제시한다. 3의 NA 유전자 스코어를 갖는 그룹의 발병률은 4그룹에 걸쳐 .6%로부터 2.4%로 4.8%로 12.5%로 증가한다. 4×4 표에 대한 선형 카이 스퀘어는 p=.0003에서 유의하다.
본 발명자들은 수학, 읽기 및 쓰기에서 각각 평균 이하의 국민 학생 능력을 조사한다. 이는 NA 유전자 스코어 대 수학, 읽기 및 쓰기 능력을 평균 또는 평균 이상을 0으로, 평균 이하를 1로 평가함의 카이 스퀘어 분석에 의해 수행한다. 수학의 경우, 피어슨 χ2=9.17, p=.027, 선형 χ2=4.18, p=.04이다. 읽기의 경우, 피어슨 χ2=15.14, p=.0017, 선형 χ2=13.14, p=.0003이다. 쓰기의 경우, 피어슨 χ2=13.18, p=.004, 선형 χ2=10.54, p=.001이다. 따라서, 3개의 영역 모두에서 평균 이하의 능력이 NA 유전자 스코어와 상당히 관련된 반면, 영향은 쓰기에 가장 크고, 다음, 읽기, 제일 적게는 수학에 대해서이다.
비교용으로, 본 발명자들은 또한 각각의 학습 주제에 대해 도파민 유전자 스코어를 조사하였다. 읽기의 경우, 피어슨 χ2=12.08, p=.007, 선형 χ2=8.24, p=.004이다. 수학의 경우, 피어슨 χ2=2.90, p=.41, 선형 χ2=2.21, p=.137이다. 읽기의 경우, 피어슨 χ2=11.11, p=.011, 선형 χ2=.02이다. 따라서, 도파민 유전자는 또한 읽기 능력에 작용하지만, 쓰기 및 수학 능력에 별로 작용하지 않는다.
NA 대 도파민(DA) 유전자의 상대적 중요성을 조사하기 위해, 본 발명자들은 MANOVA(표 80F)에 DA 유전자를 포함시켰다. 6개의 유전자를 모두 가질 경우 주의산만, 충동성, 기능항진, GSAP, LD, 거동 및 ODD 스코어는 모두 유의하다. 6개의 유전자 모두의 선형 회귀 분석(표 81)에 의해 상관관계는 ADHD, LD, GSAP 및 ODD 스코어에 대해 유의한다. 이미 제시된 바와 같이(Comings et al., 1996), 도파민 유전자는 DHD에서 중요한 역할을 한다. 이는 본원에 사용된 3개의 DA 유전자를 사용하여 입증한다. 이들은 ADHD 스코어의 분산을 2.5%로 평가하고 NA 유전자에 가할 경우, 6개의 NA 유전자 모두의 분산은 6.1%로 평가된다(P＜0.0001). 반대로, DA 유전자는 LD와 GSAP 스코어에 거의 역할을 하지 않는다. 그러나, GSAP 스코어의 경우, 분산율은 3개의 NA 유전자 단독에 대해 3.4%로부터 DA 유전자를 가할 경우 4.2%로 증가한다. DA 유전자가 거동 스코어에 거의 작용하지 않는 반면, ODD 스코어에서는 분산(p=.004)이 2.6%로 유의한 작용한다. 6개의 유전자 모두의 ODD 스코어에 대한 분산(p=.0001)은 4.9%이다.
본 발명자들이 4개의 ADHD:LD 그룹에서 3개의 DA 유전자의 빈도를 조사할 경우, 3개의 유전자는 모두 ADHD-LD- 그룹의 10.0%에, ADHD+LD- 그룹의 19.8%에, ADHD-LD+ 그룹의 15.4%에, ADHD+LD+ 그룹의 17.1%에 존재한다. 따라서, NA 유전자와는 대조적으로, 3개의 그룹에 걸쳐 점진적인 증가는 없다. 전체 4×4 표의 경우, 피어슨 카이 스퀘어=10.48, d.f.=9, p=.31이고, 선형 카이 스퀘어=.90, d.f.=1, p=.34이다.
MANOVA는 NA 유전자를 사용하여 조사된 주의산만, 충동성, 기능항진, 학습 장애, 초등학교 학습 능력 및 적대 행동에 대한 정량적 스코어간의 유의한 관련을 제시한다. 가장 큰 관련(p=.0003)은 3개의 유전자 모두의 부가 효과에 대한 것이다. ADHA(A-) 또는 학습 장애(LD-) 부재의 피검자로부터 A+LD로, A-LD+로, A+LD+(p=.0005)로 진행하는 돌연변이 NA 유전자의 수에서의 유의한 증가가 존재하나, 도파민 유전자에 대해 필적할 만한 효과는 없다.
토의.뇌의 별개의 영역, 별개의 신경전달물질, 및 별개의 유전자 세트를 포함한, 인식력 결함을 갖는 것 및 가지지 않는 것인 2개의 ADHD의 아유형의 동정(표 80)은 ADHD 어린아이의 보호에서 상당한 진단 및 치료 치를 가질 수 있다. 그러나, ADHD는 다중 돌연변이 유전체가 양쪽 부모로부터 유전되는(Comings, 1996b) 폴리유전자성 질환(Comings, 1996a)이라는 것을 유념해야 한다. 이와 같이, 대부분의 어리아이와 양쪽 유형의 성분을 갖는 성인이 상당히 중복되는 것으로 보인다.
그러나, 표 82 및 표 83에 제시된 바와 같이, NA 대사에서의 결함 및 돌연변이 NA 유전자는 인식력 결함을 갖지 않는 ADHD 어린아이보다 인식력 결합을 갖는 ADHD에 보다 더 관련되는 것 같다.
부가적인 스코어를 보면 또한 유전자가 제공된 피검자, 피검자 그룹에서 작용하지 않으나, 유사한 기능을 갖는 상이한 유전자가 존재할 경우, 둘다의 효과를 포함할 수 있다는 이점을 갖는다. 이는 본 연구에서 잘 설명된다. 예를 들어, 3개의 NA 유전자 각각의 표현형의 영향을 각각 조사할 경우, MANOVA의 유의한 수준은 적당하고(표 80A, 표 80B 및 표 80C) 상관 계수는 종종 선형 회귀 분석(표 81)에 의해 조사된 5개의 스코어에 대한 본페로니 보정을 견딜 수 없다. 그러나, ADRA2A 및 ADRA2C 또는 ADRA2A 및 ADRA2C 및 DBH 유전자를 가할 경우, 결과는 확고하다. 이는 또한 점진적인 부가적 효과를 선형 ANOVA에 의해 시험할 경우에도 해당된다. ADHD 스코어를 예로써 사용한, 단일변량 회귀 분석은 각각의 유전자가 별개로 정량적인 스코어의 분산을 단지 .7 내지 2.6%로 가짐을 제시한다(표 82). 그러나, ADRA2A 및 ADRA2C 유전자를 가할 경우, 분산(p=.001)은 3.3%이고, 3개의 NA 유전자를 모두 가할 경우, 이들의 분산(p=.0003)은 4.0%이다. 3개의 도파민 유전자는 ADHD 스코어의 분산을 2.5%로 평가하고, 6개의 유전자를 모두 병용할 경우, 이들의 분산(p＜.0001)은 6.1%이다. 이는 NA 및 DA 유전자가 ADHD에서 부가적인 작용한다는 것을 지시한다.
쌍둥이 연구는 부가적인 유전자 영향이 ADHD의 70% 이상을 차지함을 암시한다(Sherman et al., 1997a, Sherman et al., 1997b, Gills et al., 1992). 이는 3개의 NA 유전자가 ADHD의 유전자 성분의 약 6%를 차지하고, NA 플러스 DA 유전자가 유전자 성분의 약 10%를 차지함을 지시한다. 이는 작은 것처럼 보여도, 보다 맣은 유전자가 가해짐에 따라, 백분율은 계속 상승한다(Comings et al., 1998). 6개의 유전자가 보정 계수 .25를 기준으로 하여 ADHD 스코어의 분산의 약 6.1%를 차지하더라도, 다른 변수에 따라, 이들 6개의 유전자는 ADHD에 대해 25% 이하의 예측성을 갖는다.
NA 유전자의 부가적인 효과는 또한 1.0%로부터 각각의 유전자에 대해 1.6%로, 3개 모두에 대해 3.4%로 증가하는 분산율을 갖는 GSAP 스코어에 대해 인상적이다.
A-LD-, A+LD-, A-LD+ 및 A+LD+ 그룹에 걸쳐 2개 이상의 돌연변이 NA 유전자를 보유하는 피검자의 발병률에서의 점진적인 증가를 보여주는 결과는 표 83에 제시한다. 그러나, 또 다른 가설은 ADHD+LD 그룹 또는 ADHD+다른 이외의 공병리학적 질환 그룹이 모든 ADHD 유전자에 대해 보다 큰 유전자 로딩을 갖는 그룹을 나타낸다는 것이다. 본 발명자들은 3개의 상이한 도파민작용성 유전자에 대한 스코어가 3개의 그룹에 걸쳐 동일한 점진적인 증가를 제공할 경우 측정함으로써 상기 대안을 시험할 수 있다. 피검자에서, 본 발명자들은 6개의 상이한 도파민 유전자(DRD1, DRD2, DRD3, DRD4, DRD5 및 DAT1) 중 DRD2, DAT1 및 DRD5가 ADHD 스코어 상에 가장 유의한 부가적인 효과를 미친다는 것을 관찰하였다. 개별적으로 이들은 .5 내지 1.0%의 분산을 가지나 함께는 2.5%의 분산을 갖는다. 따라서, 본 발명자들은 0 내지 3의 범위인 도파민 유전자 스코어를 만들었다. 3개의 돌연변이 유전자를 모두 보유하는 피검자의 백분율은 A-LD- 그룹에 경우 10.0%의 범위에서, A+LD- 그룹의 경우 19.8%, A-LD+ 그룹의 경우 15.4%, A+LD+ 그룹의 경우 17.1%까지의 범위이다. 따라서, 또다른 가설과는 대조적으로, A+LD- 그룹과 비교한 A+LD+ 그룹에 대한 도파민 유전자에 대한 증가된 유전자 로딩은 존재하지 않는다. 또한, 도파민 유전자 스코어의 전체 범위에 대해, 피어슨 또는 선형 트렌드 카이 스퀘어 결과는 둘 다 유의하지 않다. 이는 NA 유전자 스코어에 경우 선형 카이 스퀘어 p=.0005와 현저하게 대조적이다. 이들 결과는 또한 NA 유전자가 ADHD+LD 피검자에 우선적으로 관련되는 반면, 도파민 유전자는 인식력 결함이 존재하든 존재하지 않든 ADHD에 동등하게 관련된다는 개념을 지지하는 할페린-플리츠카 가설 b를 지지한다.
주목할 만한 부가적인 특성은 수학, 읽기 쓰기에 대한 초등학교에서의 개인 학습 능력에 관한 단순한 질문이 이들이 특정 LD 클래스에 위치하느냐만큼 다수의 NA 유전자에 의한 우수한 분류를 제공한다는 것이다. 개별적으로 조사할 경우, 효과는 쓰기와 거의 필적할 만큼 읽기가 크고, 수학 능력에 대해서는 가장 적다. 이들 결과는 읽기, 쓰기 및 수학에서 평균 이하로 하는 초등학교 아이가 돌연변이 NA 유전자를 보유하는 아이와 거의 비슷함을 암시한다. 이는 또한 상기 어린이의 학습 문제의 치료에서 클로니딘의 효능의 장기간 더블 블란이드 연구에 대한 필요성을 암시한다. 발명자(D.E.C) 중 한명의 개인의 임상적 경험에서, 수개월에 걸쳐, 불량한 등급의 ADHD 어린이의 클로니딘을 단독으로 경피적으로 사용한 학습 능력에서 상당한 증가를 유발한다.
낮은 언어 IQ 및 공격적 아동 반사회적 행동간의 관계는 다수의 연구에서 모사되어 왔다(Hirschi and Hindelang, 1977,; Miller, 1988, Shulman, 1951; Moffitt and Silva, 1988; Moffitt, 1990). 이러한 낮은 언어 IQ와 범죄와의 관계는 시험할 때의 사회경제적 현상, 인종, 학습 성취 및 동기의 인자에 대해 조절한 후에도 유지된다(Moffitt, 1993). 모피트 및 실바(Moffitt and Silva, 1988)는 또한 낮은 IQ와 범죄와의 관계는 인터뷰에 의해 확인된 들키지 않은 범죄자들이 낮은 IQ를 갖는 것으로 밝혀졌기 때문에 경찰에 보다 쉽게 붙잡인 이해력이 낮은 범죄자의 인위 결과가 아니라는 것을 제시한다. 본 발명자들은 행동 장애 또는 적대적 장애와의 가능한 관계에 대해 NA 유전자를 시험하였다. 3개의 유전자 중 어느 것도 행동 장애간의 유의한 관계가 없는 반면, 적대적 행동과는 다소간의 관계가 있다.
ADHD를 연구하기 위한 TS를 앓는 피검자의 사용은 우선적으로 이점 및 단점을 둘 다 갖는다. 실용적 이점은 발명자들이 TS 피검자에서 다이아그노스틱 인터뷰 스케쥴(Diagnostic Interview Schedule)(Robins et al., 1981) 및 DMS-IIIR 표준을 기초로 한 광범위한 고도로 구조화된 질문서를 고려하여 1,500개가 넘는 DNA 샘플을 다량 수집하였다는 것이다. 이는 발명자가 상대적으로 심각한 증상을 앓는 피검자를 연구용으로 선택가능하게 한다. 이와 같이, 이들은 극소의 증상을 갖는 피검자보다 고도의 유전자 로딩을 갖는 것으로 보인다. 보다 극단적인 표현형의 사용은 유전학 연구에서 광범위하게 추천되고 있다(Risch and Zhang, 1996; Plomin et al., 1994). 대부분, 그러나 전체는 아닌(Comings and Comings, 1984; 1987b; Knell and Comings, 1993) 클리닉으로 불리는 TS 피검자는 ADHD를 갖고 있기 때문에, 이는 ADHD를 갖고 가지지 않는 피검자의 세트를 제공한다. 이는 단지 ADHD 피검자만을 연구할 경우 보다 넓은 범위를 제공하기 때문에, 특히 정량적 ADHD 특성의 전체 범위를 조사하는 발명자의 접근법에 유용하다(Comins et al., 1996j). TS 집단은 또한 TS 프로밴드 및 이의 친척에서의 ADHD, 행동 장애, 적대적 장애, 학습 장애와 같은 공병리학적 장애의 고도의 발병률 때문에 유용하다(Knell and Comins, 1993; Comins and Comins, 1987a; Comins, 1995a, Comings, 1995b). 비더만 및 이의 동료는 ADHD 프로밴드 및 이의 친척에 대한 동일한 높은 정도의 공질병률을 보고하였다(Biederman et al., 1990a,b; Biederman et al., 1993). TS 샘플을 사용하는 잠재적인 단점은 임상적 및 유전적 국면에서 상당히 중복됨에도 불구하고(Comings and Comings, 1993), 틱증을 앓는 ADHD 피검자는 틱증을 앓지 않는 피검자보다 돌연변이 유전자의 경미하게 상이한 세트를 가질 수 있다는 것이다. 따라서, 틱증을 앓지 않는 ADHD 피검자에서의 이러한 발견을 모사하는 것이 중요하다. 이러한 연구의 추가 제한은 부모 및 자신의 보고 질문서에의 의존이다. WISC-R, WRAT-R 및 이외의 직접 시험을 사용한 연구가 바람직하다. 그러나, 연구된 모든 피검자를 대상으로 한 실질적인 개인 인터뷰를 기초로 하는 발명자들의 경험에서, 이러한 질문서는 피검자의 개별적 행동을 정확하게 반영하는 것이다. 또한, 발명자들은 어린이가 사실상 유의한 학습 문제를 갖지 않는 EH, LD, LD 또는 특정 교육을 받고 있는 경우를 전혀 관찰하지 않았기 때문에, 발명자들은 상기 방식을 사용한 LD 스코어의 평가는 인식 무능의 존재에 대한 힘이 드는 시험을 나타낸다고 믿는다. 반어적으로, 어린이가 초등학교에서 2개 이상의 학습 과목(수학, 읽기, 쓰기)을 평균 이하로 수행하는지의 평가는 LD 클래스에서 갖는 것보다 NA 유전자 스코어의 우수한 분류를 제공한다. 이는 실질적 교실 능력이 인식 능력의 책임있는 평가를 제공할 수 있고, 불완전한 학습 능력을 갖는 다수의 어린이들을 특수반으로 편성하지 않는다는 것을 나타낸다.
ADRA2A 유전자에서의 보다 적은 22개의 동형접합체가 존재하기 때문에, 소수의 피검자가 아드레날린작용성 α2 유전자 또는 3개의 NA 유전자를 모두 보유하는 것은 평가되므로, 본 결과는 상기 소수 동형접합체에서 높은 스코어의 기회 존재에 의해 구동될 될 수 있음을 주장할 수 있다. 이를 시험하기 위해, 본 발명자들은 또한 ADRA2A 유전자를 11=0 및 12 또는 2=1로서 평가한다. 2개의 α2 유전자를 상기 득점을 사용하여 조합할 경우, MANOVA는 여전히 주의산만에 대해(p=.010), 충동성에 대해(p＜.001) 및 기능항진에 대해(p=.021) 유의하고 선형 회구에 의해 이들 조합은 분산(p=.0014) 3.1%로평가된다. 상기 방식으로 평가된 ADRA2A 유전자를 ADRA2C 및 DBH 유전자에 가할 경우, 3의 NA 유전자 스코어를 갖는 66명의 피검자가 존재한다. MANOVA는 주의산만(p=.001), 충동성(p=.001) 및 기능항진(p=.004) 스코어에 대해 유의하다. 선형 회귀 분석에 의해, 이들 NA 스코어는 분산(p=.0002) 4.1%로 평가된다. 이러한 결과는 본 발견은 소수의 ADRA2A 22명의 피검자에서 높은 스코어의 단순히 당연한 기회 발생은 아니다는 것을 나타낸다.
본 발명자들은 수개의 부가적인 NA 유전자의 첨가에 의해 강화될 수 있는 본 발견은 본 연구에 포함되지 않음을 고려한다. 이들은 시냅스의 NA 수준의 조절에 작용하는, 노르아드레날린 트랜스포터(NT)에 대한 유전자, 아드레날린작용성 α1 수용체(ADRA1A 내지 ADRA1D) 및 PNMT 유전자를 포함한다.
실시예 28
뉴런의 니코틴산 아세틸콜린 수용체 α4(CHRNA4) 유전자와 관심 결손 기능항진 장애 및 투렛 증후군과의 관계
서론.니코틴은 도파민 보상 경로를 자극하고, 관심, 각성, 학습 및 기억을 증강시키고 투렛 증후군 및 ADHD의 치료에 경피적으로 유효하게 사용되어 온 중독성 약물이다. 니코틴산 아세틸콜린 수용체의 가장 우세한 뉴런 형태는 α4β2이다. 본 발명자들은 뉴런의 니코틴산 아세틸콜린 β4 수용체 CHRNA4 유전자가 ADHD 또는 투렛 증후군과 관련이 있을 것이라는 가설을 세웠다.
뉴런의 니코틴산 아세틸콜린 수용체는 중추 채널 주위에 배열된 α(α2-α9) 및 β(β2-β9) 서브유니트로 이루어져 있다(Unwin, 1993). α 서브유니트는 α1 니코틴산 아세틸콜린 수용체의 근육 유형의 α1 서브유니트와 유사한 한쌍의 시스테인을 보유한다. β 서브유니트는 이러한 시스테인 쌍을 가지지 않는다. 주요 신경의 니코틴산 아세틸콜린 수용체 서브타입은 α4 및 β2 서브유니트로 이루어져 있다(Whiting et al., 1991; Schoepfer et al., 1988). α4 및 β2는 뇌에서 가장 널리 나타나기 때문에(Wada et al., 1989; Whiting and Lindstrom, 1988; Whiting et al., 1991), 본 발명자들은 투렛 증후군 및 ADHD에서의 CHRNA4 유전자 및 CHRNB2 유전자의 대립형질간의 관계를 조사하고자 하였다. 적합한 다형성은 단지 CHRNA4 유전자에 대해서만 구입가능하기 때문에(Weiland and Steinlein, 1996), 이것이 본 발명자들이 조사할 유전자이다.
방법.본 발명자들은 282명의 친척이 아닌, 비-라틴 아메리카계 백인 투렛 증후군 피검자 및 63명의 대조 그룹에서 CHRNA4 유전자의 복합 VNTR 다형성의 대립형질의 관계를 조사한다. 연구 그룹은 345명의 친척이 아닌 피검자로 이루어져 있다. TS에 대한 DSM-IV 표준을 이행한 이들 중 282명 모두를 개인적으로 D.E.C.에 의해 인터뷰한다. 나머지 63명은 대조 그룹이다. TS 피검자는 시티 오브 호프 메디칼 센터(City of Hope Medical Center)의 투렛 신드롬 클리닉(Touretter Syndrome Clinic)에서 왔다. 이들은 ADHD 및 학습 장애에서 노르에피네프린 유전자의 역할을 다룬 실시예 27에 기술된 피검자와 동일한 그룹이다. 행동 스코어 및 ADHD 및 학습 장애의 존제 또는 부재에 의한 분리는 이 기사에 기술된 바와 같다. ADHD 스코어는 ADHA에 대한 DSM-IV(Diagnostic, 1994) 표준을 기준으로 한다. 유년기 및 장년기 동안, 상기 증상이 전혀 또는 거의 존재하지 않았는지(스코어=0), 가끔 존재하였는지(스코어=1) 또는 항상 존재하였는지(스코어=3)를 질문한다. 3개의 대답을 모두 사용하여 모든 중증도를 갖는 사람들간에 완전한 구별을 제공한다. ADHD 스코어는 DSM-IV 주의산만, 충동성 및 기능항진 증상의 합계이다.
벨란트와 슈타인라인(Weiland and Steinland, 1996)에 의해 기술된 CHRNA4 유전자의 제1 인트론에서의 다형성을 사용한다. PCR™ 프라이머 및 이들에 의해 보고된 조건을 사용한다. 88명의 비친척 백인의 연구에서, 이들은 196 내지 264bp 길이 범위의 14개 대립형질을 확인하였다(참조: 표 84).
폴리머라제 쇄 반응(PCR™)을 사용하여 각각 형광 표지된 프라이머 0.2μM를 사용하는 표적 DNA를 증폭시킨다. PCR™ 제품을 탈이온수로 10배 희석시키고 희석액 0.5㎕를 75㎕ 포름아미드+9.5㎕ ROX 표준물+9.5㎕ 블루 덱스트린 염료로 제조된 혼합물 2.5㎕에 가한다. 이를 92℃에서 2분 동안 변성시키고 샘플을 어플라이드 바이오시스템즈 373 DNA 시퀀서(Applied Biosystems, Inc., (ABI) Folster city, CA)의 6% PAGE 상에 로딩시키고 겔을 1200볼트 및 상수 30W에서 5시간 동안 흘려내린다. 겔을 예비처리하고 내부 표준물, ROX 500을 사용하여 분석한다. 피크를 단편의 색 및 크기를 기초로 하여 게노타이퍼(버젼 1.1)(Applied Biosystems, Inc.)에 의해 인식한다.
결과.본 발명자들은 본 연구에서 345명의 개인 및 다른 연구에서 수백명을 유전자형화시켰다. 예상대로, 벨란트와 슈타인라인(Weiland and Steinland, 1996)에 의해 기술된 것과 함께 본 발명자들은 다수의 추가의 대립형질-전체 중에서 21개를 발견하였다. 이들 중에서 17개를 본 연구의 피검자에서 관찰하였다. 벨란트와 슈타인라인(Weiland and Steinland, 1996)은 은 염색을 사용하였고 겔의 상부로부터 하불로 대립형질을 카운팅하였기 때문에, 이들의 낮은 번호의 대립형질은 가장 높은 bp의 것이고, 가장 높은 번호의 대립형질은 가장 낮은 bp의 것이다. ABI 시퀀서는 밴드가 겔의 하부에 도달할 때 스캐닝하기 때문에, 본 발명자들의 과정에서 낮은 번호의 대립형질은 가장 낮은 bp 대립형질을 나타내는 반면, 가장 높은 번호의 대립형질은 가장 큰 대립형질이다. 본 발명자들은 처음에는 벨란트와 슈타인라인(Weiland and Steinland, 1996)의 것과 동일한 넘버링 시스템을 사용하고자 하였으나, 서열화를 기초로 한 bp 단위의 대립형질 크기는 이들의 것, 특히 극단에서 상이하기 때문에 이는 곤란하다. 따라서, 본 발명자들은 ABI 넘버링 시스템을 사용하였고 비교 목적으로 본 발명자들은 표 84에 2종의 명명법을 기재하였다.
표 85는 상이한 대립형질에 대한 PCR™ 제품 4개를 서열화한 결과를 제시한다 이는 상기 VNTR 다형성의 복잡성을 예시한다.
주요 대립형질 중, 9, 12, 14 및 16번의 대립형질의 빈도가 TS 피검자에서 가장 높은 반면, 13, 15 및 18번 대립형질의 빈도가 대조 그룹에서 가장 높다. 17번 대립형질의 카이 스퀘어 분석에 의해 χ2=33.65, d.f.=16, p=.0061이다. 분석을 빈도 .05 이상인 대조 그룹 또는 TS피검자에 존재하는 대립형질에 한정할 경우, χ2=71.6, d.f.=16, p＜.0000001이다. 대립형질 빈도에서 가장 큰 차이는 대립형질 #9의 경우이다.
분석을 간단화시키고 및 정량적 변수의 조사 및 동형접합체 대 이형접합체의 영향을 가능하게 하고 회귀 분석에 대한 생성시키기 위해, CNRNA4 유전자 스코어를 x/x 유전자형(비-9/비-9)=1, 9/x=2 및 9/9=3을 갖는 것을 지시한다.
노르에피네프린 유전자 상에서 실시예 28에서 조사된 행동 변수의 세트(Comings et al., 1998)와 더불어, 본 발명자들은 또한 전체 틱증 스코어를 조사한다(Comings et al., 1998). CNRNA4 유전자 스코어와 이들 변수와의 관계를 MANOVA를 사용하여 동시에 조사한다. 결과(표 86)는 CNRNA4 유전자와 초등학교 학습 능력(GSAP), 학습 장애(LD), 적대심(OPP) 및 기능항진 스코어간의 유의한 관계가 있음을 제시한다.
상기 스코어 상의 상이한 유전자형의 작용을 평가하기 위해, 전체 ADHD 스코어 및 p＜.1에서 MANOVA에 의해 유의한 각각의 변수의 이후 ANOVA 분석을 수행한다(표 87). 이는 모든 스코어가 9/9 동형접합체 경우에 가장 높다는 것을 제시한다.
부가적인 질문은 CNRNA4 유전자와 흡연간의 관계가 있는지 없는지이기 때문에, 본 발명자들은 17살 이상의 피검자에서 2개의 변수, '흡연한 적은 있는지?' 및 '7일에 몇갑을 피우는지'를 조사하였다. 하루에 피는 평균 담배수는 9/9 동형접합체의 경우 0.5갑이고 다른 유전자형의 경우 .10 내지 .20이고, 둘다 유의하지 않다. 9/9 동형접합체인 피검자는 단지 9명이기 때문에, 보다 큰 샘플이 유의한 결과를 제공할 것이다.
3개의 CNRNA4 유전자형 대 ADHD-LD-, ADHD+LD-, ADHD-LD+ 및 ADHD+LD+의 4개의 범주의 카이 스퀘어 분석을 조사할 경우, 9/9 유전자형의 빈도는 ADHD-LD- 그룹의 경우 5.6%로부터, ADHD+LD- 그룹의 경우 6.0%로, ADHD-LD+의 경우 7.1%로 및 ADHD+LD+의 경우 13.5%로 증가한다. 전체 보정은 피어슨 카이 스퀘어(p=.385)에 의해 유의하지 않고 선형 카이 스퀘어(p=.051)에 의해 경계선 유의하다. 따라서, 조사된 노르에피네프린 유전자(Comings et al., 1998)와 달리, CNRNA4 유전자는 두정부엽과 관련된 ADHD-LD의 유형에서 작용하다는 증거가 거의 없다.
유전자형 변수 대 전체 ADHD 스코어를 사용하는 단일변량 회귀 분석은 다음 결과를 제공한: r=.123, r2=.015, T=2.30, p=.022. 9, 12, 14 및 16번의 대립형질의 빈도가 TS 피검자에서 가장 높은 반면, 13, 15 및 18번 대립형질의 빈도가 대조 그룹에서 증가하고 13번 대립형질이 가장 높다. 모든 대립형질을 카이 스퀘어에 의해 비교할 경우, 이는 p=.002에서 유의하게 상이하다. 단지 .05 이상의 빈도를 갖는 대립형질을 비교할 경우, 그룹은 χ2=71.6, d.f.=6, p＜.0000001에서 유의하게 상이하다. ADHD, 틱증, 행동 및 학습과 관련된 8개의 정량적 스코어 대 9개의 대립형질을 기초로 한 유전자형 분류(9/9, 9/x, x/x)를 MANOVA에 의해 조사한다. 관계는 초등학교 학습 능력, 학습 무능, 적대심 및 기능항진 스코어에 대해 유의하다. ANOVA는 모든 스코어의 크기가 9/9 동형접합체의 경우 가장 크다는 것을 보여준다. 유전자형 득점의 선형 회귀 분석은 CNRNA4 유전자의 ADHD 스코어의 분산(p=.022)이 1.5%에 달한다는 것을 보여준다.
결론.이들 결과는 CHRNA4 좌위가 ADHD 및 TS에 대한 위험에 기여하는 유전자의 폴리유전성 세트임을 암시한다.
상기 연구에서 사용된 PCR™ 증폭된 단편의 서열화는 이것이 크기에서의 차이 및 서열에서의 차이를 둘다 포함하는 매우 복잡한 다형성임을 보여준다. 복사 다형성 자체는 이들이 관련된 유전자의 조절에 작용할 수 있다. 이는 이들 복사에 대한 경향을 기초로 하여 Z-DNA를 형성시킨다. 복사체의 길이 및 서열 둘다에서의 변화는 다수의 방식으로 유전자 조절에서 작용하는 형성된 Z-CNA의 양을 측정하는데 작용한다(Comings, 1997). 여기서 조사된 복잡한 다형성은 길이 및 서열 둘다에서의 유의한 변화를 보여준다. 이와 같이 이는 관계 연구에 유일하게 적합할 수 있다.
다수의 이외의 스코어의 독립적인 평가에 포함된 파워의 손실을 방지하기 위해, 본 발명자들은 이의 분석을 실시예 27에서 조사된 바와 동일한 행동 스코어 플러스 전체 틱증 스코어에 제한한다. 니코틴은 틱증의 치료에 사용되기 때문에, 이를 가하여 상기 유전자가 특히 틱증과 관련되었는지를 결정한다. MANOVA를 사용하여 스코어를 그룹으로서 평가하여 본페로니 보정에 대한 필요를 방지한다. 이는 8개 스코어 중 4개와의 유의한 관계를 보여준다(표 86). 각각의 변수의 이후 ANOVA 연구를 착수할 경우, 스코어는 9/9 동형접합체에 대해 가장 높다. 연합된 결과는 CHRNA4가 ADHD 및 TS, 특히 ADHD를 앓고 있는 TS 피검자에서 유전적 위험 인자로서 작용하는 유전자 중 하나임을 암시한다. 회귀 분석은 이것이 ADHD 스코어의 분산이 1.5%에 이르게 하는데 기여할 수 있음을 암시한다.
CHRNA4가 ADHD 서브스코어보다 학습 장애 및 초등학교 학습 능력과 다소 큰 관계를 나타내더라도, 참고 기사에 조사된 노르에피네프린 유전자와는 달리, ADHD를 앓고 있거나 앓고 있지 않으며 학습 장애를 앓고 있거나 앓고 있지 않는 사람의 4개의 그룹에 걸쳐 9/9 유전자형의 빈도에서의 점진적인 증가에 대한 증거가 거의 없다.
본 발명자들은 기술된 유전자형 분류가 CHRNA4A 유전자의 발현에서의 증가 또는 감소와 관련이 있는지 없는지를 아직 모르지만, 본 연구는 ADHD 및 TS 증상에서의 니코닌의 임상적 효능을 지지한다. 또한, 다른 집단에서 대조 그룹 및 TS 또는 ADHD간의 차이는 9번 대립형질 이외의 몇몇 대립형질을 포함할 수도 있을 것이다. 다수 샘플에 있어서, 가장 재현가능한 결과는 대조 그룹 대 TS 또는 ADHD 피검자에서의 보통 대립형질의 빈도의 카이 스퀘어 분선에 의해 비교할 수 있다.
실시예 29
투렛 증후군 및 약물 남용에서 X-결합된 MAOA 유전자에서의 VNTR 대립형질의 길이와 표현형의 영향의 상관관계
서론.모노아민 옥시다제(MAO) 수준에서의 비정상은 광범위한 정신의학적 장애에 포함된다. 본 발명자들은 X-결합된 MAOA 유전자에서의 VNTR 다형성을 조사하여 다음 2가지 가설을 시험하였다: (1) MAOA 우전자의 돌연변이체가 투렛 증후군 또는 약물 남용과 관련된 행동에 관한 장애에 작용하는가? (2) 그럴 경우, 대립형질의 길이와 표현형의 영향간의 상관관계는 있는가? 본 발명자들은 2개의 독립적 그룹을 조사하였다: 375명의 TS 피검자, 친척 및 대조 그룹, 및 280명의 물질 남용자 및 대조 그룹. 대립형질을 증가하고 있는 크기로 4개의 그룹으로 분배한다. 2그룹에서 MAOA 유전자 및 행동에 관한 표현형간의 유의한 관계가 있고, 2그룹 중 가장 긴 대립형질이 가장 큰 표현형의 영향과 관련이 있다. 가장 강력한 영향은 약물 의존성의 진다에 관한 것이다(P=.00003). VNTR 대립형질 그룹은 MAO-A 활성과 관련된 것으로 이미 제지된 Fun4H1 다형성과 유의한 결합 불균형에 있다. 이들 결과는 짧은 복사 다형성의 상이한 크기의 대립형질 자체가 유전자 조절에 작용할 수 있다는 가능성과 일관된다.
혈소판 효소 수준(Flower et al., 1982)에 미치는 나이(Devor et al., 1994), 알콜, 항억제제, 약물, 성, 실습 기술, 다이어트 및 이외의 변수의 잠재적인 영향때문에, MAO 유전자에서의 유전자의 다형성의 사용은 효소 수준보다 더 재현가능한 결과를 제공할 것이다. MAOA 및 -B 유전자의 클로닝 및 서열화 및 관련된 다형성의 확인은 현재 이러한 유전자 연구를 가능하게 한다.
MAOA 유전자에서의 유전자 돌연변이체가 TS 또는 ADHD와 관계하는지를 측정하기 위해, 본 발명자들은 TS에서의 DRD2, DβH 및 DAT1 유전자에서 보고된 기술(Comings et al., 1996a)을 사용하여 일련의 대조 그룹, TS 프로밴드 및 이의 친척에서 MAOA VNTR 다형성을 조사하였다(Hinds et al., 1992). 대조 그룹 대 TS 프로밴드에서 상이한 대립형질의 빈도의 단순 비교는 MAo 유전자가 모든 경우에 존재하지 않는 몇몇 특정 행동과 단지 관련된다는 가능성을 놓칠 수 있기 때문에, 본 발명자들은 27개의 상이한 행동에 관한 변수에서의 상기 유전자의 가능한 역할에 대해 시험하였다.
본 발명자들은 대립형질의 길이 그 자체가 표현형의 용향에 관련될 수 있다는 가설에 관심을 가져왔다. 이에 대한 이론적 해석은 가장 간단한 복사체의 서열은 양이 복사체의 길이에 의존하는 Z-DNA의 형성을 유발한다는 것이다(Schroth et al., 1992). Z-DNA 형태는 DNA 헬릭스를 개방시키고 각각의 염기를 노출시켜, 이것이 유일하게 핵 단백질과 상호작용할 수 있도록 만든다(Rich et al., 1984). 이런저런 이유로 Z-DNA는 유전자 조절에 관련되어 왔다(Comings, 1996a; 1996b). 미니- 및 마이크로새틀리트 다형성이 폴리유전성 유전질에 관련된 유전자 기능에서의 돌연변이에 작용할 경우, 영향이 두드러질 경우에 이들은 장애보다는 단일 유전자를 유발하기 때문에 이들의 영향은 미세하다.
적어도 웅성에서는 각각의 대립형질이 반접합적으로 존재하여 이형접합성의 혼동스러운 인자를 제거함으로써 상이한 크기의 다수의 대립형질이 존재할 경우 대규모일 수 있기 때문에, X-결합된 유전자는 유일한 비히클을 형성시켜 상기 가설을 조사하고 미세한 영향을 조사한다. 복사체 길이는 표현형의 영향에 관련될 수 있다는 가설을 시험하기 위해, 본 발명자들은 VNTR 대립형질을 증가하고 있는 길이로 4개의 그룹으로 분배한다. 이는 본 발명자들이 보다 짧거나 보다 긴 대립형질이 보다 큰 표현형의 영향과 우선적으로 관련되는지의 여부를 측정가능하게 한다.
방법.피검자는 57명의 대조 그룹, 대부분 다수의 연합된 행동에 관한 장애를 심하게 앓고 있는 229명의 TS 프로밴드(Comings, 1990), 및 90명의 TS 선조의 병에 걸리고 걸리지 않은 친척을 포함한다. 모든 피검자는 비-라틴 아메리카계 백인이고 90% 이상의 서부 유럽계이다. TS 그룹에 대한 대조 그룹은 TS 프로밴드의 양자 및 의붓어버이, 시티 오프 오브의 다른 클리닉으로부터의 비-정신의학적 장애를 앓고 있는 피검자, 및 시티 오브 호프 메디칼 센터로부터의 전문 및 비전문적 병원 직원으로 이루어져 있다. TS 피검자 및 대조 그룹 둘다는 이외의 것에도 상세히 기술되어 있다(Comings, 1995b; Comings et al., 1996a; 1997b).
각각의 TS 대조 그룹 및 TS 프로밴드 또는 친척은 다이아그노스틱 인터뷰 스케쥴(Robins et al., 1981) 또는 DMS-III-R(Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders, 1987) 기준을 기초로 하여 질문서를 기입할 필요가 있다. 이는 광범위한 정신의학적 증상의 구조화된 관찰을 제공한다. 이들 증상은 ADHD, 물질 남용, 불쾌감, 불안, 학업 능력, 말더듬, 틱증 등을 포함한 27가지의 상이한 행동으로 그룹을 나눈다. 상기 행동에 관한 스코어에 사용되는 질문은 이외에 상세하게 기술되어 있다(Comings, 1995a; 1994a, 1994b; 1995b, Comings et al., 1996a; Robins et al., 1981; Comings, 1995c). 2개의 행동에 관한 스코어를 사용하여 ADHD를 평가한다. 먼저, 소위 ADHD를 DSM-III 및 DSM-III-R 기준으로부터의 일련의 22개의 ADHD 변수의 적어도 반이 존재함을 기초로 한다. 둘째, ADHD-R은 DSM-III-R 진단 기준을 기초로 한다. 미리 사용되지 않은 세가지 QTV는 주의산만, 충동성 및 기능항진이다. 이들은 ADHD 스코어를 점증적으로 생성시키는 3개의 서브스코어이다. QTV 약어는 행동 장애에 대한 CD, 적대적 장애에 대한 ODD(Comings, 1995a) 및 두드러진 울증 에피소드에 대한 MDE(Comings, 1995c) 증상을 포함한다.
공병리학적 행동을 조사하는 이론적 근거는 특정 유전자가 진단 그 자체보다 TS에 존재하는 특정 공병리학적 행동과 더욱 강력하게 관련될 수 있다는 이전의 관찰이다(Comings et al., 1996a). 상기 질문서는 DSM-III-R 또는 DSM-IV 진단을 제공하고자 하는 것은 아니며, 상이한 행동 영역에 대해 QTV를 생성시키는 고도로 구조화된 방법을 제공하고자 하는 것은 더욱 아니다. 연속적인 특성의 이점은 2분 진단보다 큰 범위의 중증도를 제공한다는 것이다. 증상 평가에 대한 질문서-기초한 접근법의 정확도, 유용도 및 민감도는 이러한 기구의 사용을 동일한 구조화된 기구의 인터뷰자 투여와 비교함으로써 그밖의 사람에 의해서도 입증되어 있다(Gadow and Sprafkin, 1994; Grayson and Carlson, 1991). 수백명 피검자와의 질문서를 본 발명자들이 조사한 결과, 이는 개인 인터뷰에 의해 수득된 정보를 정확하게 반영한다는 것을 알았다.
두번째 환자 그룹은 1994년 10월 설립의 캘리포니아 로마 린다 소재의 제리 엘 페티스 베터란스 어드미니스트레이션 호스피톨(Jerry L Pettis Veterans Administration hospital)의 입원 중독 치료 유니트(ATU)로부터의 120명의 비-라틴계의 코카서스 출신의 남성으로 이루어졌다. 정보화에 동의한 ATU에의 모든 입원 환자는 약물 남용/의존에서의 유전 인자에 관한 연구로 지원되는 약물 남용 국립 기구에 등록된다.
모든 ATU 환자는 미시건 알콜리증 세버리터 테스트(Michigan Alcoholism Severity Test)(Davis et al., 1987)로평가되고, 물질 의존 장애의 존재를 진단하기 위한 약물 남용 {MAST-R}, 임상의-투여된 진단 인터뷰 계획(DSM-Ⅲ-R 버젼)(Robins et al., 1981), 및 알콜 및 약물 사용 변수의 범위를 평가하기 위한 임상의-투여된 중독 심각성 인덱스 5판(ASI)(Hodgins and Guebaly, 1992)를 포함하는 24개의 항목 자가 투여된 질문서가 재검토된다.
발명자는 약물/알콜 사용 및 ASI의 법적 상태 상태 구분을 사용했다. 적용된 영역은 다음과 같다:
a) 사용된 특정 물질. 특정 물질의 사용을 평가하기 위해, 중독, 헤로인, 다른 오피트/진통제, 바르비투레이트, 다른 진정제/최면제/정신 안정제, 코카인, 암페타민, 카나비스, 환각제 및 흡입제에의 알콜 사용의 일생 동안의 사용(연수로)에 대해 질문한다.
b) 투여 경로. 상기의 각각에 대해, 관련 환자들에게 투여 경로에 대해 질문한다. 선택은 경구, 코, 흡연 및 Ⅳ 주입이다. 사용된 연속적인 여러가지 #Ⅳ 약물은 Ⅳ주입된 다른 약물의 총수를 합하여 계산된다. 여러가지 Ⅳ 약물 사용은 어떠한 Ⅳ 약물 사용도 하지 않은 것에 대해 0으로, 하나 이상의 Ⅳ 약물 사용에 대해 ≤1로 하는 양분법으로 나타낸다.
c) 장애. " 당신은 몇회 정도 알콜 DT를 먹었는가? 약물을 과량 복용했는가? "지난 30년간 며칠 정도 알콜 장애를 경험했는가? 약물 장애?"
d) 소요 경비. "지난 30년간 알콜에 어느 정도의 비용을 소비했는가? 약물에?"
e) 심각성. 0(치료 필요 없음) 내지 9(생명-위협 상황으로 치료 개입이 필요)범위의 치료 요구정도에 대한 인터뷰-기초한 심각성 평가. 알콜 남용? 약물 남용?
f) 법적 상황. 약물 및 알콜 남용의 여러가지 법적 측면에 대해 질문한다. "당신은 일생 동안 몇 번 정도 음주 운전으로 적발되었는가? " 당신은 일생 동안 몇 번 정도 약물 사용으로 고발당하거나 체포되었는가? 이러한 고발중에 몇 번정도 징역을 살았는가?
g) 합계 점수. 반응이 0 내지 임의의 숫자 범위일 경우, 0에 대해서는 '0'으로, 임의의 다른 숫자에 대해서는 '1'로 점수화 된다. 알콜 사용에 관한 질문들은 총 알콜 점수로 합산되고, 약물 사용에 관한 질문들은 약물 점수로 합산된다.
물질 남용 그룹을 위한 조절은 TS 환자의 조절과는 무관하다. 이들은 2개의 조로 이루어져 있다. 제1조는 45세 이상의 남자이고, 샌 베르나디노의 캘리포니아 주립 대학 출신의 비-라틴계 코카서스 출신 학생들(30.1살의 평균 연령)이다. 물질 남용으로 심각한 장애를 갖는 사람들은 MAST-R 시험에 기초하여 배제된다. 제2조는 미네소타 트윈 패밀리 스터디로부터의 쌍둥이 남자 부모들로 이루어져 있다. 이들은 단지 11 내지 17살 쌍둥이를 갖고 있다는 기준으로 전국으로부터 조사었으므로, 이들은 대학 학생들보다 모든 사회경제적 및 교육적 그룹의 보다 무작위의 조를 나타낸다. 모든 조절이 물질 남용 변수에 음성적으로 평가될지라도, 물질 남용 평가의 결과가 쌍둥이 조절에 아직 유용한 것은 아니므로, 몇몇은 양성적일 수 있다. 하지만, 이것은 주로 시골 지방의 무작위 단면이므로, 발명자는 이러한 그룹내의 거짓 음성적 요소의 수는 작다고 가정한다.
MAOA 유전자에서 VNTR 다형성을 선택하기 위한 원리는 다음과 같다. 짧은 직렬식 반복 다형성은 반복의 길이가 표현형 효과와 관련되어 있다는 가설을 특별히 조사하기 위해 선택된다. X-연관 유전자는, 적어도, 남성이 연구대상일 경우, 이형 접합자의 해석 방법에 대한 복잡성을 피하기 위해서 선택된다. MAO 유전자는 이것이 X-연관되어 있기 때문에 선택된다. MAOA 유전자는 2개의 다른 반복 다형성이 이것과 관련되어 있다고 보고되고 있으므로 선택되었다. 발명자는, 이것이 (CA)n 반복(16bp)보다 대립 유전자 크기(40+bp)에서 더 넓은 분포를 제공하므로, VNTR 다형성(Hinds et al., 1992)을 선택했다.
이러한 복잡한 다형성은 불완전 복제된 신규한 23-bp VNTR 모티프에 부착되고, 디뉴클레오티드 반복 및 VNTR 반복 둘 다에 있어서 다른 대립 유전자를 갖는 GT 극소형 인공위성으로 구성되어 있다. VNTR 다형성은 MAOA 유전자의 첫번째 엑손을 포함하는 파지 6.12로부터의 2.9-kb salI-EcoRI 단편내에 존재한다. DNA는 표준 절차에 의해 전체 혈액으로부터 추출된다. 표적 DNA는 PCRTM(Mullis et al., 1986)에 의해 증폭된다. PCRTM생성물을 표식하기 위해, 각각의 프라이머의 0.1μM을 형광성 HEX 또는 FAM 아미다이트(Amidite)(미국 캘리포니아 포스터 시티 소재의 바이오시스템으로부터 공급된)로 표식하고, 프라이머는 반응(표 88)에서 사용된다. 10배 희석된 PCRTM생성물의 2μl를 2.5μl의 탈이온화된 포름아미드 및 0.5μl의 록스(ROX) 500 표준에 첨가하고, 2분 동안 92℃에서 변성시키고, 공급된 바이오시스템 373 DNA 서열기(sequencer)내에서 6% 폴리아크릴아미드 겔에 적하한다. 겔을 1100V 및 고정 30W에서 5시간 동안 전기 영동한다. 겔을 레이져 스캔하고, 인터널 록스 500 스탠다드를 사용하여 분석한다. 염기 쌍 길이에 의해 크기 조절된 칼라 단편에 기초에 기초한 지노타이퍼(버젼 1.1)에 의해 피크를 인식한다. 각각의 샘플에 대한 완전한 정보는 모든 겔 파일로부터 인쇄되고, 수집된 데이타는 분석을 위해 제출된다.
MAOA 대립 유전자의 길이가 표현형 효과와 관련되어 있다는 가설을 조사하기 위해, 대립 유전자를 4개의 그룹으로 분할한다(결과 참조). 이것을 가장 짧은 것에서 가장 긴 것으로 1 내지 4의 번호를 붙혀 MAOA 유전자형 변화표를 형성한다. 여성은 TS 그룹으로만 사용된다. 소정의 대립 유전자 그룹에 대해 동질 접합체인 것들만 분석에 포함된다.
발명자는 비닝(bining)을 위한 두 가지 규칙을 사용했다: a) 길이의 범위를 조사하기 위한 충분한 그룹이 있어야 한다; 및 b) 통계학적인 힘을 최대화하기 위해 환자의 수를 각각의 그룹에서 비슷하게 해야 한다. 따라서, 대립 유전자 빈도수의 단일 피크일 경우에, 분할은 가장 짧은 것 1/3, 중간 것 1/3 및 가장 긴 것 1/3으로 된 것이다. 하지만, MAOA VNTR에 대한 대립 유전자 크기의 분포는 2개의 피크를 보인다. 남성의 경우에만, 더 작은 피크는 길이가 299 내지 314 bp인 크기의 범위를 갖는 대립 유전자의 32%를 함유한다. 더 큰 피크는 길이가 323 내지 338 bp인 크기의 범위를 갖는 대립 유전자의 68%를 함유한다. 대립 유전자의 대부분이 이러한 피크 내에 있으므로, 발명자는 단일 피크가 있는 것과 같이 그것을 분할했다(즉, 더 짧은, 중간 및 더 긴 대립 유전자). 이러한 피크의 중간은 더 이상 세분될 수 없는 대립 유전자의 31%로 이루어진 단일 334bp 그룹을 포함한다. 이러한 규칙의 적용은 32, 23, 31 및 14%의 대립 유전자로 이루어진 4개의 빈(bin), ＜320bp, 320 내지 333bp, 334bp 및 ≥335bp을 초래한다.
문헌[참조:Hinds et al.(1992)]에 기재된 비닝(binning)을 사용할 수 없는데, 이는 이들 5개의 그룹 중에서 3개가 매우 낮은 대립 유전자 빈도수를 갖기 때문이다. 사실상, 발명자는 이러한 3개의 소그룹내에 속하는 어떠한 환자도 가지고 있지 않다.
Fnu4H1 다형성이러한 다형성을 위한 시험은 호타미스리길(Hotamisligil) 및 브렉케필드(Breakefield)(1994)에 기초한다. 발명자는 그들의 '-'를 발명자의 '1' 대립 유전자 및 그들의 '+'를 발명자의 '2' 대립 유전자라고 칭한다. 그들의 연구에서 + 대립 유전자는 더 높은 MAOA 활성을 갖는다.
투어렛(Tourette) 증상 그룹에 있어서, ANOVA는 4개의 대립 유전자 그룹에 대한 각각의 QTV의 상대적 크기를 조사하기 위해 사용되었다. 선형 ANOVA는 4개의 대립 유전자 그룹을 통한 평균에 있어서 상당한 점진적 증가를 시험하기 위해 사용되었다. SPSS(미국 일리노이주 시카고 소재의 SPSS), 통계적 패키지가 사용되었다. 선형 ANOVA에 있어서, 하위명령 다항식을 1로 놓는다. MANOVA는 모든 변수들이 동시에 조사될 경우에, QTV의 어떤 것이 중요한가를 결정하기 위해 사용되었다. 모든 변수들이 동시에 조사될 경우에, QTV의 어떤 것이 중요한가를 결정하기 위해 다변수 선형 회귀 분석이 두 번째 접근으로서 사용되었다. MAOA 유전자형은 종속 변수로서 놓고, 27 QTV를 독립 변수로서 단계적으로 추가한다.
카이 스퀘어 분석은 가장 긴 대립형질을 갖는 그룹이 다수의 QTV에 대한 가장 높은 평균 값을 갖는다는 것을 보여준다. 335bp 이상의 빈도수를 갖는 대립형질 그룹에서 잠재 점진적 감소는 점진적으로 더 적은 TS 증상을 갖는 4개의 그룹과 비교된다: ADHD를 갖는 TS 프로밴드, ADHD를 갖지 않는 TS 프로밴드, TS를 갖는 친척 및 TS를 갖지 않는 친척.
물질 남용 그룹에 있어서, MANOVA는 4개의 MAOA 대립형질 그룹과 2개의 합계 변수(알콜 점수 및 약물 점수)간에 상당한 관련성이 있는가를 결정하기 위해 사용되었다. ANOVA는 4개의 대립형질에 대한 알콜 및 약물 점수의 평균을 조사하기 위해 사용되었다.
선형 카이 스퀘어법은 3개의 그룹[조절, 행동없이 물질 남용자(ATU 없이) 및 행동을 갖는 물질 남용자(ATU와 함께)]에 걸쳐 335bp이상의 그룹의 빈도수에서의 잠재 점진적 증가를 결정하기 위해 사용되었다. ATU 없는 그룹은 다른 행동을 위한 공동 병적 상태로 인한 이러한 대립형질 그룹이 물질 남용자에서의 빈도수를 증가시킬 수 있다는 가능성을 배제시키기 위해 포함된다. 이것을 배제하는 것을 돕기 위해, 대립형질 그룹의 빈도수는 행동을 갖지 않는 것보다 행동을 갖는 물질 남용자에서 20% 이상의 더 높아야 한다. 이러한 대립형질은 이러한 3개의 그룹에 거쳐 점진적으로 증가한다는 가설이 있으므로, 선형 카이 스퀘어 통계가 사용된다.
MAOA 유전자에 의해 설명되는 약물-관련 변수의 변위의 최대 백분율을 결정하기 위해, 회귀 분석법이 수행되는데, 여기서 335bp 미만의 대립형질을 보유하는 피검자는 1로 계산하고, 335 이상의 대립형질을 보유하는 피검자는 2로 계산한다. 이것은 약물 의존 변수에 대해 수행되는데(조절: 1, ATU 없음은 2, ATU 있음은 3으로 계산됨), 이것이 MAOA 유전자와 가장 관련이 깊은 카이 스퀘어 변수이기 때문이다.
결과.MAOA VNTR 다형성에 대한 대립형질의 분포(대립형질의 총수는 768이다). 이것은 복잡한 VNTR이므로, 대립형질은 염기 쌍의 홀수 또는 짝수의 명확한 패턴으로 되지 않는다. 결과는 지노타이퍼 프로그램에 의해 발생된 것과 똑같이 보여진다. 316bp와 323bp사이의 대립형질은 없고, 320bp 미만과 320bp 초과의 2개의 분명한 주된 그룹을 생성한다. 하지만, 표현형 효과가 크기와 관련되어 있다는 가설을 검증하기 위해, 더 큰 323 내지 333bp 그룹의 대립형질을 320 내지 333bp의 주된 피크보다 더 짧은, 주된 피크의 및 335이상의 주된 피크보다 더 긴 대립형질로 이루어진 3개의 하위 그룹으로 분할한다. TS 그룹내에 총 375명의 피검자, 219명의 남성 및 156명의 여성이 있다. 여성 중에서, 88명이 이형 접합자이다. 이들은 그것으로부터 제거될 경우, 36명이 조절인 287명의 피검자가 남게된다. 이러한 최종 그룹에서, 남성 대 여성에서 4개의 대립형질 그룹의 빈도수 분포에서의 심각한 차이는 없다.
TS 그룹에 대한 QTV 대 4개의 대립형질 그룹의 각각에 대한 ANOVA 결과를 표 88에 기재한다. 정상 ANOVA에 대한 결과는 F-비율 및 P 값 아래에 기재한다. 선형 ANOVA에 대한 F-비율은 F2칼럼 아래에 기재되고, 0.05 미만의 심각한 것에 대해서는a라는 위첨자를 표시한다. QTV는 F2칼럼에서 F-비율의 감소 크기에 의해 정열시킨다. 0.05 이하에서 1조로 하여 터키(Tukey) 시험으로 결정된, 평균이 335bp 그룹보다 상당히 작은 대립형질 그룹은 *로 표시한다. 말더듬증, 쇼핑 및 공포를 제외하고는, 남아있는 24 QTV에 대한 평균이 35이상의 대립형질을 보유하는 피검자들에게 있어서 가장 높았다.
모든 27 QTV에 대한 MANOVA의 결과는 성별(P=0.012), 학습 문제(P=0.023), 도박(P=0.025) 및 조병(P=0.025)에 있어서 심각했다.
모든 27 QTV가 단계적 다변수 회귀 분석으로 동시에 조사될 경우, 여러가지 등급의 학교 문제(P=0.012) 및 도박(P=0.038)이 심각했다. r2값에 기초하여, MAOA 유전자는 이러한 QTV의 변수중에 단지 3.9%만을 설명했다.
카이 스퀘어 분석을 사용하여, 335이상의 대립형질을 보유하는 피검자의 백분율에 있어서 상당한 점진적 감소가 있었고, ADHD를 갖는 TS 조상(24%, n=129), ADHD를 갖지 않는 TS 조상(20.0%, n=50), TS를 갖는 친척(12.5%, n=16) 및 TS를 갖지 않는 친척(5.6%, n=56)순으로 점진적으로 감소하였다(P=0.003).
물질 남용 그룹에서 조절 대 ATU 피검자가 비교된다. 160 결합된 조절에 대해, 4개의 대립형질 그룹의 분포는 다음과 같다: 320 미만 34.4%, 320 내지 335 21.3%, 335 이상 6.3%. 120 ATU 피검자에 대해, 빈도수는 다음과 같다: 320 미만 39.2%, 320 내지 333 18.3%, 334 20.8%, 335이상 21.7%. 이것은 상당한 차이인데, X2=22.17, P=0.00006이다. 235bp 이상의 그룹의 빈도수는 2개의 조절 그룹에서 비교할만한데, 샌 베르나르디오 그룹에 대해 8.9%이고, 쌍둥이 부모들에 대해 5.2%이다(X2=0.744, P=0.38).
알콜과 약물에 대한 MANOVA는 이들 둘 다가 MAOA 유전자 VNTR 대립형질와 상당한 관련성을 보여줌을 나타내는데, 이는 알콜 점수(P=0.012)보다 약물 점수(P=0.001)에 있어서 더욱 중대하다(표 89). 결합된 MANOVA에 대한 결과가 또한 중대하다(P=0.007). 257인 n은 160 조절+ 120 ATU, 즉 총 280보다 더 적은데, 이는 단지 97 ATU 피검자만이 ASI를 완료했기 때문이다. 반면에, 모든 120은 알콜/약물 의존도의 DSM 진단의 검증에 대해 DIS를 완료했다.
각각의 대립형질 그룹에 대한 평균을 보여주는 2개의 점수에 대한 ANOVA는 표90에 기재된다. TS 그룹에 대해, 가장 높은 평균은 335bp 이상의 대립형질 그룹에 존재한다. 약물 점수에 대해서, 3개의 다른 대립형질 그룹은 터기 시험에 있어서 335bp 이상의 그룹에 대해서보다 상당히 더 낮다.
MAO 유전자가 특정한 형태의 물질 남용과 우선적으로 관련되어 있는지를 결정하기 위해, 사용된 물질 형태에 관련된 14개의 변수가 카이 스퀘어 분석에 의해 조사된다. 조절 대 행동이 없는 ATU 피검자(ATU without) 대 행동이 있는 ATU 피검자(ATU with)에 대한 335bp 이상의 대립형질 그룹의 빈도수가 표 91에 기재된다. 14 종류의 물질 사용 변수가 조사되므로, 0.0036(0.05/14) 미만의 P를 갖는 것들만이 봉페로니(Bonferroni) 교정에서 중대하다고 여겨진다. 0.01 미만의 P를 갖는 것들만이 기재된다. 알콜 의존만이 예외적인데, 이것은 약물 의존 또는 약물 및 알콜 의존 피검자에 비해 알콜 의존만의 피검자에게서 335bp 이상의 대립형질의 빈도수에 있어서 약간의 증가가 있음을 예증하기 위해 기재된다. 반면에, 약물 의존만의 변수는 가장 높은 값을 제공한다(X2=17.4, P=0.00003).
대립형질 그룹(335미만 대 335이상) 대 약물 의존의 진단의 회귀 분석의 결과는 다음의 결과치를 제공한다: r=0.25, r2=0.0625, T=4.305 및 P=0.0001.
VNTR 및 Fnu4H1 대립형질간의 잠재 연관 불균형을 조사하기 위해, 발명자는 VNTR 다형성에서 또한 유전자형화된 273명의 남성을 유전자형화시켰다. 발명자는 분석을 남성에 제한하였는데, 이는 결과가 여성에서 보다 더욱 분명하기 때문이다. 2개의 다형성에서 대립형질들의 상당히 중대한 비-무작위 관련성이 있다((X2=132.91, P＜0.000001). 320 미만의 VNTR 대립형질 그룹은 덜 알려진 Fnu4H1 2와 관련되어 있고, 남아있는 3개의 VNTR 그룹은 Fnu4H1 1 대립형질와 관련되어 있다.
데이타의 비교에 기초하여, VNTR 대립형질을 320bp 미만과 320bp 초과로 분할할 경우, Fnu4H1 2＜320 및 Fnu4H1 1 대립형질＞320을 갖는 Fnu4H1 다형성과 유사한 결과를 제공할 것으로 예상된다. TS 그룹에 있어서, 2개 모두의 다형성에서 유전자형화된 71명의 피검자가 있었다.
조병은 가장 심각한 결과를 제공하는데(표 88), 이러한 변수는 비교를 위해 사용되었다. Fnu4H1 1 대립형질을 보유하는 53명의 피검자에 대한 평균은 2.01(s.d. 2.12)이고, 2 대립형질에 대해서는 1.55(s.d.)이었다. VNTR에 대한 비교할 만한 수치는 320bp 초과에 대해서는 1.94이고, 320 bp 미만에 대해서는 1.75이었다. 상대적으로 적은 숫자로 인해, 그룹화는 중요하지 않았다. 호타미슬리길 및 브렉케필드 연구(1994)는 Fnu4H1 대립형질(발명자의 I 대립형질)가 더 낮은 MAOA 활성과 관련되어 있음을 보여주므로, 발명자는 335 이상의 VNTR 대립형질 그룹이 가장 낮은 MAOA 활성과 관련되어 있다고 가정한다.
투어렛 증상은 이러한 연구에 유일하게 적합한데, 이는 이것이 고도로 유전성이 있고, 종종 충동적, 공격적, 감정적, 성욕과잉적 및 다른 행동과 관련되어 있기 때문이다. 본 결과는 MAOA 유전자가 TS내에서 수많은 관련된 행동의 원인론에서 적당한 역할을 수행하는 유전자중의 하나임을 제시한다.
MANOVA는 MAOA 대립형질와 알콜 및 약물 점수간의 중대한 관련성을 보여주지만, 물질 남용의 이러한 2가지 형태에서 상당한 양의 공동 병적 상태가 있다. 표91에 기재된 바와 같이, 약물 의존 및 알콜 의존은 따로 조사할 경우, 관련성은 알콜 의존보다 약물 의존에서 훨씬 더 크다.
남성에서의 우세는 호르몬 및 환경적 인자에 일부 기인하지만, X-연관된 유전자 또한 인자일 수 있다. TS 그룹에 대해, 회귀 계수를 사용한 r2의 결정은, 다른 QTV에 대해, X-연관된 MAOA 유전자가 TS, ADHD 또는 관련된 장애의 남성 우세를 설명하지 못함을 제시하는 임의의 QTV의 변수중에 2.5% 이하를 설명함을 나타낸다. 반면에, 335bp이상의 대립형질 대 약물 의존의 존재 또는 부존재에 대한 r2는 6.2%이하의 변수가 MAOA 유전자에 기인할 수 있음을 보여준다. 이것은 약물 의존의 남성 우세에서 적당한 역할을 수행할 수 있다.
발명자는 극소형 및 소형 인공위성 다형성의 다른 길이의 대립형질이 이들과 관련된 유전자의 규제에서 역할을 수행할 수 있음을 짐작하기 시작하였다. 투어렛 증상 그룹에서 더 긴 소형 인공위성 대립형질와 특정한 QTV와의 관련성은 표 89에 기재한 바와 같이 중간정도이고, 모든 QTV에 걸쳐 상당한 단일성의 경향이 있다. 이것은 우연한, 무작위 관련성일 수 있으므로, 발명자는 이들이 피검자 및 조절의 전체적으로 분리된 그룹에서 이러한 결과를 재현하는지를 조사하려 했다. 이러한 그룹(물질 남용 그룹)은 TS 그룹에서 관찰된 것보다 MAOA VNTR의 더 긴 대립형질, 특히 335bp 이상의 대립형질들 사이에서 훨씬 더 강한 관련성을 보여주었다. 2개의 그룹의 형태는 현저히 유사하여, 335bp 이상의 대립형질에 대해서는 가장 높은 점수, 가장 낮은 크기의 대립형질(＜320)에 대해서는 약간 높은 점수 및 334 내지 335bp 대립형질에 대해서는 중간정도의 점수이었다.
335bp이상의 대립형질이 더 높은 또는 더 낮은 MAOA 활성과 관련되어 있는지를 조사하기 위해, 발명자는 또한 Fnu4H1 다형성에 대해 발명자의 남성 273명을 유전자형화시킨다. VNTR 대립형질을 갖는 연관 불균형은 상당히 심각했다(P＜0.000001). 덜 알려진 Fnu4H1 2 대립형질은 320 미만의 VNTR 그룹과 관련되어 있지만, 보다 알려진 1 대립형질은 320 내지 333, 334 및 ＞335 VNTR 그룹과 관련되어 있다. 다른 것들은 행동 장애의 범위가 낮은 MAOA 활성과 관련되어 있음을 보여주고, 발명자는 VNTR 다형성의 가장 큰 표현형 효과는 335bp이상의 그룹과 관련되어 있음을 관찰했으므로, 이것은 이러한 그룹이 또한 가장 낮은 MAOA 활성과 관련되어 있음을 제시한다. 이러한 결과는 Fnu4H1 1 대립형질을 보유하는 피검자가 VNTR 다형성에 기초한 하위그룹에 놓여질 경우, 이것은 Fnu4H1 결과를 유도하는 335bp이상의 대립형질을 보유하는 피검자임을 나타낸다. 이러한 제안의 궁극적인 증거는 혈청 또는 섬유아세포 MAOA 활성에 대해 시험된 피검자내의 VNTR 대립형질의 연구를 요구하고, 발견된 사실은 Fnu4H1 다형성이 MAO-A 활성의 차이와 관련되어 있다는 이유는 1 대립형질이 335 이상의 VNTR 대립형질와 연관 불균형 상태에 있고, 320 미만의 대립형질(높은 MAO-A 활성) 대 335이상의 대립형질(가장 낮은 MAO-A 활성과 관련되어 있다고 예상됨)간의 반복수의 차이가 MAO-A 유전자의 조절에 역할을 수행한다는 가능성과 일치한다.
반복 대립형질의 크기와의 이러한 관련은 소형 인공위성 그 자체가 MAO 유전자의 조절에 역할을 수행할 수 있다는 가능성과 일치한다. 하지만, 이것은 가설을 증명하지 못함이 분명한데, 이는 아직 규명되지 않은 사이트와 같은 다른 것과의 연관 불균형이 여전히 발생할 수 있기 때문이다. 표현 벡터 및 더 긴 대립형질의 전사 인자와의 가능한 상호작용에 대한 연구가 MAOA 유전자의 경우를 증명하기 위해 요구된다.
TS 그룹에 대한 결과는 상대적으로 낮은 크기의 행동 범위에 대한 MAOA 유전자의 영향을 나타낸다. 4개의 변수가 MANOVA에 의해 중대하고, 2개는 다변수 회귀 분석에 의해 중대하고, 27개중의 12개는 선형 ANOVA에 의해 중대할지라도, 완벽한 봉페로니 교정이 ANOVA 결과에 적용될 경우, 0.05/27 또는 0.0018의 어떠한 것도 중대하지 않다고 반박할 수 있다. 하지만, 다른 행동에서의 MAO를 포함하는 많은 문헌에도 불구하고, 특정한 유전자 다형성의 수준에서 조사될 경우, MAOA 유전자는 넓은 범위의 행동 변수에 중간정도만으로 기여하는 것처럼 보인다라는 것이 중요하다. 효과는 약물 남용에서 훨씬 더 강하지만, 여기서조차 MAOA 대립형질에 의해 설명되는 변수들의 백분율은 여전히 중간정도이다. 복제는 관련 연구의 중요한 측면이고, 이러한 결과는 2개의 완전히 다른 피검자들의 조에서 발견된다. 이러한 발견은 수많은 유전자가 여러가지 행동에 관련하고, 각각은 작게 영향을 끼치며, 소형 인공위성 다형성 그 자체가 폴리유전자 유전에 근본적인 작용성 상대 형질 변수를 제공하는데 역할을 수행할 수 있다는 가설을 갖는 폴리유전자 유전의 개념과 일치한다.
실시예 30
아미노산 치료법 및 월경전 불쾌 장애(PMDD)에 관련된 예방적 실시예
월경전 불쾌 장애(PMDD)는 월경 순환의 대부분 동안에 순환적으로 발생하는 월경전 기분 장애이다. DSM-Ⅳ내의 "달리 특정되지 않은 우울증의 장애"의 범주내에 있는 것이 포함된다. 하지만, 수많은 인자들(생물학적 및 인식 연구, 치료 반응)이 다른 기분 장애(Yonkers, 1997)와 PMDD를 차별화시킨다.
황체 상태 증상 표현 의 예상가능성에도 불구하고, 이러한 장애의 원인론은 설립되어 있지 않다. 호르몬 보조 비타민 결핍에 관한 이론이 PMS와 관련되어 있고, PMDD와 관련될 수도 아닐수도 있다. 그럼에도 불구하고, 프로게스테론, 에스트로겐, 프로스타글란딘, 인슐린, 비타민 B6또는 티로이드 호르몬(참조: Severino, 및 Moline, 1989)의 절대적인 및 상대적인 결핍 모두가 PMS 또는 PMDD를 갖는 피검자 그룹에서 설립되어 있지 않다. 유사하게, 티로이드-자극성 호르몬에의 티로이드-방출 호르몬의 반응과 같ㅇ느 작용성 호르몬 시험 및 글루코스 내성 시험의 결과는 PMDD의 피검자에게서 비정상적이지 않다(참조:Casper et al., 1989; Girdler et al., 1995; Haskett et al., 1984; Roy-Byrne et al., 1987).
월경전 증상이 내생적인 오피트의 사용 중지에 의해 유도된다는 가설을 상기하면서, 몇가지 그룹이 증상의 여성 및 조절내에서 β엔돌핀 수준을 평가한다. 과거에 월경전 증상을 보고한 여성을 포함한 연구에서, 기아니니(Giannini)등은 순환의 황체 상태 동안에 β엔돌핀의 감소를 발견했다(참조: Giannini et al., 1984);하지만, 이러한 연구에서 어떠한 조절 그룹도 있지 않았다. 그럼에도 불구하고, 4개의 다른 연구는 컨트롤에 비해 증상 피검자에게서 더 낮은 황체 상태 β엔돌핀 수준을 발견했다(참조: Tulenheimo et al., 1987; Facdhinetti et al., 1987; Chuong et al., 1985 및 Giannini et al., 1990). 상기의 연구중의 하나는 황체 상태뿐 아니라 여포 상태에서도 더 낮은 수준을 발견했고(참조:Tulenheimo et al., 1987), 추가의 연구에서, β엔돌핀 수준은 배란기 근처 상태 동안에 증상 여성에게서 더 낮다는 것을 발견했다(참조:Chuong et al., 1994). 현저하게, 상기의 조사중의 단지 2개만이 증상이 증상이 PMDD 진단에 대해 심각성 범주를 충족시키거나 충족시키지 못할 것으로 예상대로 결정되는 사람들을 포함한다. 피검자 수, 작은 샘플 크기 또는 이들 둘의 조합에서의 차이는 순환의 어떠한 상태 동안에 PMDD 피검자 및 컨트롤간의 차이를 발견하지 못한 최근의 연구에서 다른 결론의 기초가 될 수 있다(참조: Bloch et al., 1996). 하지만, 이러한 연구에서 β엔돌핀 수준은 두 그룹 모두에서 월경전 순환동안에 감소한다. 차이가 배란 근처 상태 동안에 가장 현저할 지라도, 월경전 순환 동안에 β엔돌핀의 문맥혈 수준에서의 변화는 또한 영장류에서 발견되었다(참조:Wehrenberg, et al.], 1982).
월경전 순환 동안에 급경사로 감소하는 β엔돌핀의 변동은 PMDD를 갖는 여성에게서 아드레날린 효능 활성을 증가시킬 수 있고, 아드레날린 효능 수용체 결합으로 조사의 결과를 설명할 수 있다. 할브레이크(Halbreich) 등은 월경전 증상을 경험하는 여성에게서 순환의 황체 상태 동안에 증가된 이미다졸린 수용체 결합을 발견하였다(참조: Holbreich et al., 1993). 그룬하우스(Grunhaus,1990)등에 의해 검토된 바와 같이, 변화의 방향이 혈소판 제조 및 분석에 사용된 리간드에 의존할지라도, 아드레날린 효능 수용체 결합에서의 대체는 또한 MDD 및 공포 장애와 관련되어 있다.
게다가, 엔돌핀 및 에스트로겐 수준은 변하는 것으로 보여졌다. 산후 및 월경전 기간 동안에, 이들 둘 수준은 빠르고 실질적으로 변하고(참조: Halbreich 및 Endicott, 1981), 다른 것은 마취성의 길항근이 PMS 증상을 감소시킴을 보여주었다.
할브레이크 등은 불쾌 월경전 증상을 갖는 여성에게서 황체 상태 동안에 플라즈마 감마-아미노부티르산(GABA) 수준에서의 감소를 발견하였다(참조: Halbreich et al., 1996). 이것이 얼마나 상기의 발견들과 관련되어 있는지는 알려져 있지 않을 지라도, 낮은 플라즈마 GABA 수준은 MDD를 갖는 피검자에게서 또한 발견되었다(참조:Petty et al., 1992).
PMS의 원인론에 관한 이론은 거의 독점적으로 에스트로겐, 프로게스테론 또는 프로락틴 분비에 초점을 맞추어 왔다. 반면에, 80년대 중반에 래브럼(Labrum, 1983)이 PMS에서 발생하는 증상은 두뇌 수준에서의 또는 세로토닌, GABA 및 상호연관된 신경내분비 방법에서의 비정상적인 변동과 관련되는 통상의 원인론적 기초를 갖는다라고 처음으로 제안했다. 에스트로겐 피드백은 과도한 변동, 특히 세로토닌의 과도한 변동의 인자일 수 있다.
세로토닌에 관해서, 수많은 다른 접근이 PMS 및 PMDD 둘다를 갖는 여성에게서 이러한 시스템을 평가하기 위해 사용되어 왔는데, 전체 혈액에서의 세로토닌 측정, 혈소판 5-HT 업테이크, 및 신경내분비 공격을 포함한다. 낮은 세로토닌은 수면, 식욕 및 흥분성에 있어서의 변화와 관련되어 있다는 영장류 및 다른 증거에 기초하여, 랜킨(Rankin, 1992)은 심각한 월경전 불쾌를 갖는 여성에서의 전체 혈액 세로토닌을 조사했고, 비증상의 컨트롤에 비해, 증상의 여성은 더 낮은 수준의 세로토닌을 가짐을 발견하였다. 몇몇 조사자(Ashby et al., 1988; Taylor et al., 1984; Ashby et al., 1990)는, 모든 그룹은 아니지만(Mahngren et al., 1987; Rojansky et al., 1991), 황체 상태 혈소판 5-HT 업테이크가 컨트롤에 비해 PMS 및 PMDD를 갖는 여성에게서 감소함을 발견하였다. 이미프라민 결합 위치가 순환의 두 상태(Steege et al., 1992) 또는 초기 황체 상태(Rojansky et al., 1991)동안에 컨트롤 그룹에 비해 PMDD에 대해 특별히 평가된 여성에게서 감소됨을 또한 보여준다. 그 후의 연구에서, 여포 상태 동안에만 통계적 중대성이 얻어졌다.
PMDD를 갖는 여성에게의 트립토판의 투여는 PMDD 피검자 및 컨트롤과의 특징적 차이를 제시하면서, 월경 순환의 두 상태 동안에 둔화된 성장 호르몬 및 코티솔 반응을 생산한다(참조: Bancroft et al., 1991). 하지만, 동일한 2개의 그룹에서, 트립토판에의 프로락틴의 반응은 순환의 월경전 상태 동안에만 둔화된다(참조: Bancroft et al., 1991). 반면에, 5-HT1A부분적 작용 물질 부스피론이 PMDD 피검자 및 건강한 컨트롤에게 여포 상태 동안에 투여될 경우, 이것은 둔화된 프로락틴 반응을 생산한다(참조: Yotham, 1993). 펜플루라민 투여에 대한 둔화된 프로락틴 반응에 관한 데이타는 잘 특징화된 PMDD 피검자 대 컨트롤(FitzGerald et al., 1996)에서의 둔화된 반응을 발견한 한 그룹과 어떠한 차이도 발견하지 못한 또 다른 그룹(Bancroft and Cook, 1995)과 혼합된다. 마지막으로, 세로토닌 전구체 트립토판을 고갈시키는 것은 비증상적 여성에 비해 PMDD 피검자에게서 황체 및 여포 상태 둘다의 동안에 월경전 증상을 유발시키는 경향이 상당히 크다(참조: Menkas et al., 1994).
수많은 최근의 조사가 특정한 정신활성의 약물을 PMDD의 완화에 대해 평가하기 위해 수행되었고, 이는 항울제를 포함하고, 이는 클로니프라민(Sunblad et al., 1993) 플루옥세틴(Stone et al.,1991; Wood et al., 1992; Steiner et al., 1995; brandenberg et al.,; Pearlstein and Stone, 1994), 부프로피온(Pearlstein et al., 1995), 파로섹틴(Eriksson et al., 1995; Yonkers et al., 1996a), 마프로틸린(Eriksson. et al., 1995), 세르트랄린(Eriksson et al., 1995; Yonkers et al., 1996a), 네팍소돈(Girdler et al., 1995) 및 펜플루라민(Brzezinski et al., 1990)을 포함한다.
본 발명자는 단일 또는 2개의 각각의 신경전달자에 대한 제한된 효과만을 갖는 단일의 약물은 월경전 및 월경후 상태 동안에 여성에게서의 호르몬 변이에 의해 발생하는 "응답" 시스템의 비정상적인 상태를 극복하기에 불충분하다는 것을 예상한다. 게다가, 상기의 생물학적 증거는 임의의 단일, 신경 생물학적 시스템을 명확하게 포함하지 않지만, 5-HT 시스템에 대한 아드레날린 효능 수용체 결합, GABA 수준 및 여러가지 분석에서의 변화는 신경생물학적 비정상은 PMDD의 표현과 관련되어 있다는 것을 제시한다. 이러하 표시에서의 변화는 단극의 MDD에 대해서 발견되었다. 엔케팔리나제 억제제의 PMDD에의 양성적 효과에 관해 보고된 어떠한 연구도 없다. 사실상, 트렉산R(듀폰, 델라웨어)마취성 길항근의 사용은, 발명자가 본 발명에서 하고자 하는 것과 반대인, PMDD를 강화하기 보다는 감소시킴을 보여주었다.
이것을 염두하면서, 피구에롤라 등(deLourdes-Figuerola et al., 1997)에 의한 가장 최근의 발견과 결합하는데, 이는 월경 편두통 그룹에서의 22일째 날의 플라즈마 ME에서의 증가 및 플라즈마 노르에피네프린(NE) 수준에서의 감소 및 통증 동안에 플라즈마 ME, NE의 증가를 보여준다. 저자는 통증 동안뿐 아니라 황체 중간 상태에서도 변화가 플라즈마 ME 및 교감신경 아드레날린 작용에서 발생한다고 결론지었다.
발명자는 아미노산 치료의 사용이 PMDD 피검자에게 유리할 것이라고 생각하였다. 이러한 장애에 대해 표11에 특별히 제시된 조성물을 사용하는 수많은 알콜 피검자에게서 수행된 작업은 흥분, 긴장, 통증의 가슴, 두통 및 우울을 포함하는 전형적인 PMS 증상을 감소시킨다. 사용되는 특정한 예는 표11에 제시된 PMXTM공식으로 신체화된다.
이중 블라인드 플라시보 조절된 연구는 텍사스주 달라스 소재의 외래 PMDD 치료에서 사용된다. 총 100명의 피검자가 연구된다. PMDD 스케일은 발명자에 의해 개발되었고, 모든 100명의 참가자에게 공급된다. 스케일은 임의의 치료를 받기 전에 계산된다. 이러한 연구에서 3번 이상의 순환은 연구로의 포함을 위한 최소값이다. 피검자는 자녀 출산 나이에 있고, 임신중이 아니어야 한다. 비교는 2개의 그룹사이에서 행해지고, 통계적 분석은 로버트 우드(Robert Wood)의 지휘하에 있는 텍사스 헬스 사이언쓰 센터의 대학의 컴퓨터처리 지원부에 의해 수행된다. DSM-Ⅳ 범주에 의해 평가된 병적인 PMDD 후보자들만이 연구된다. 3개월의 상태후에, 각각의 피검자는 플라스보 또는 PMXTM으로 교차된다. 추가로, 각각의 피검자는 본 발명에 제시된 바와 같이 MAA 기술을 사용하여 유전자형화된다. 따라서, 총 29개 이상의 유전자가 평가된다.
DRD2 A1 대립형질의 캐리어 및 본원에서 기재된 대립형질와 관련된 다른 RDS가 PMXTM에 잘 반응할 것이고, 플라스보하에 가장 힘든 시간을 갖을 것이 예상된다. 또한 개개인을 위한 유전자형화는 특정한 목적의 치료 결과를 예측하기 위한 추가의 정보를 제공할 것으로 예상된다.
참조 문헌
아래의 참조문헌은 본원의 기재사항에 보충적인 방법 또는 기타 세부사항을 예시하는 정도로 구체적으로 본원에 참고로 인용되어 있다.
U.S. Patent No. 4,761,429
U.S. Patent No. 5,189,064
본 발명은 부분적으로는, 보상 행동의 신경전달자 기능과 관련된 다수 유전자의 특이적 유전형 결정과 특정의 항-열망(anti-craving) 조성물의 결합에 관한 것이다. 본 발명의 양태는 행복의 감정을 초래하는 뇌의 중연계(meso-limbic system)의 신경경로를 활성화하는데 협조하기 위해 특정의 확립된 신경전달자의 작업이 어떻게 관련되는지를 이해하고, 이러한 신경경로에 영향을 주는 조성물을 개발하는 것이다. 본 발명은, 부분적으로는, 전구체 아미노산 및 특정 약초 화합물을 사용하여 건강한 피검자의 주의력 진행 및 기억력을 증진시키기고 또한 집중력을 향상시키며, 체중 감량을 증가시키고 과식을 조절하는 양태에 관한 것이다. 신경전달자 유전자의 유전적 다형성을 사용하여 신경성 질환 및 행동을 진단하는 다양한 방법 및 이에 의해 확인된 피검자를 본 발명의 조성물을 사용하여 치료하는 치료 방법이 기술되어 있다. 또한 폴리유전자 소질에 대한 진단 방법이 기술되어 있다.

Claims (94)

  1. a) 뉴로펩티드 오피트의 효소적 파괴를 억제하는, 아미노산, 펩타이드 및 이들의 구조적 동족체 또는 유도체로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 오피트 파괴-억제량의 하나 이상의 물질,
    b) 도파민 전구체 L-Tyr, L-Phe 및 L-dopa, 세로토닌 전구체 L-Trp 및 5-하이드록시트립토판 및 감마 아미노 부티르산 (GABA) 전구체 L-글루타민, L-글루탐산 및 L-글루타메이트로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 신경전달자 합성-촉진량의 하나 이상의 신경전달자 전구체, 및
    c) 트립토판 농축 증진량의 크롬 피콜리네이트 또는 크롬 니코티네이트를 필수 구성으로 하며, 오피트 파괴-억제 물질, 신경전달자 전구체 및 크롬 화합물이 RDS(Reward Deficiency Syndrome; 보상 결핍 증후군) 행동을 저하시키기에 효과적인 양으로 함유된, RDS 행동을 치료하기 위한 조성물.
  2. a) 뉴로펩티드 오피트의 효소적 파괴를 억제하는, 아미노산, 펩타이드 및 이들의 구조적 동족체 또는 유도체로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 오피트 파괴-억제량의 하나 이상의 물질,
    b) 도파민 전구체 L-Tyr, L-Phe 및 L-dopa, 세로토닌 전구체 L-Trp 및 5-하이드록시트립토판 및 감마 아미노 부티르산(GABA) 전구체 L-글루타민, L-글루탐산 및 L-글루타메이트로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 신경전달자 합성-촉진량의 하나 이상의 신경전달자 전구체, 및
    c) 트립토판 농축 증진량의 크롬 피콜리네이트 또는 크롬 니코티네이트를 필수 구성으로 하며, 오피트 파괴-억제 물질, 신경전달자 전구체 및 크롬 화합물이 바람직하지 않은 체중 증가를 억제하거나 감소시키기에 효과적인 양으로 함유된, 바람직하지 않은 체중 증가를 억제하거나 치료하기 위한 조성물.
  3. a) 뉴로펩티드 오피트의 효소적 파괴를 억제하는, 아미노산, 펩타이드 및 이들의 구조적 동족체 또는 유도체로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 오피트 파괴-억제량의 하나 이상의 물질,
    b) 도파민 전구체 L-Tyr, L-Phe 및 L-dopa, 세로토닌 전구체 L-Trp 및 5-하이드록시트립토판 및 감마 아미노 부티로산 (GABA) 전구체 L-글루타민, L-글루탐산 및 L-글루타메이트로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 신경전달자 합성-촉진량의 하나 이상의 신경전달자 전구체,
    c) 크롬 피콜리네이트 및 크롬 니코티네이트로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 트립토판 농축 증진량의 무기 화합물, 및
    d) 로딜라 (Rhodila) 또는 후바진 (hubazine)으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 신경전달자 합성-촉진량의 하나 이상의 신경전달자 합성 촉진 물질을 필수 구성으로 하며, 오피트 파괴-억제 물질, 신경전달자 전구체, 무기 화합물 및 신경전달자 합성-촉진 물질이 주의력 부족 장애, 주의력 프로세싱 또는 기억을 저하시키기에 효과적인 양으로 함유된, 주의력 부족 장애를 치료하기 위한 조성물.
  4. a) 뉴로펩티드 오피트의 효소적 파괴를 억제하는, 아미노산, 펩타이드 및 이들의 구조적 동족체 또는 유도체로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 오피트 파괴-억제량의 하나 이상의 물질,
    b) 도파민 전구체 L-Tyr, L-Phe 및 L-dopa, 세로토닌 전구체 L-Trp 및 5-하이드록시트립토판 및 감마 아미노 부티로산 (GABA) 전구체 L-글루타민, L-글루탐산 및 L-글루타메이트로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 신경전달자 합성-촉진량의 하나 이상의 신경전달자 전구체, 및
    c) 트립토판 농축 증진량의 크롬 피콜리네이트 또는 크롬 니코티네이트를 필수 구성으로 하는 조성물을, SUD, 비만, 흡연, 튜렛 (Tourettes) 증후군, ADHD, 분열병질/회피 행동, 공격, 외상후 스트레스 증후군, PMS 또는 담배 소비로 필수적으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 RDS 행동을 나타내는 피검자에게 투여하여, 상기한 피검자를 치료하는 방법.
  5. 제4항에 있어서, 투여가 32 내지 10,000 mg의 DL-페닐알라닌, 5 내지 5,000 mg의 L-트립토판 및 3 내지 30,000 mg의 L-글루타민을 함유하는 조성물을 매일 복용하는 것으로 이루어지며, 조성물에 1 내지 300 mg의 피리독살-5'-포스페이트가 추가로 함유되는 방법.
  6. 제4항에 있어서, RDS 행동이 비만인 방법.
  7. 제6항에 있어서, 투여가 약 460 mg의 DL-페닐알라닌, 25 mg의 L-트립토판 및 25 mg의 L-글루타민을 함유하는 조성물로 매일 복용하는 것으로 이루어지며, 조성물에 5 mg의 피리독살-5'-포스페이트가 추가로 함유되는 방법.
  8. 제6항에 있어서, 피검자가 화학적 의존성을 갖는 가계에 속하고, 이러한 가계가 성공적 개선 가능성을 나타내는 방법.
  9. 제6항에 있어서, 투여가 탐식을 억제하는 방법.
  10. 제6항에 있어서, 투여가 갈망을 억제하는 방법.
  11. 제6항에 있어서, 피검자에게 있어 D2TaqI A1, B1, C1, 또는 exon6-7하플로타입, HTR2A-C 대립형질(OB의 동형접합성: 사람 염색체 2 미소부수체 다형성의 1875 디뉴클레오타이드 반복 다형성의 208 BP 미만의 대립형질에 대한 동형접합성), APO-D-TaqI 2.2 또는 2.7 BP, 또는 OB 유전자 D7S1875 대립형질중 하나 이상의 존재가 성공적 반응의 개선 가능성을 나타내는 방법.
  12. 제6항에 있어서, 투여가 유효량의 크롬 니코티네이트를 포함하고, 피검자에게 있어 DRD2 A1 대립형질의 존재가 성공적 반응의 개선 가능성을 나타내는 방법.
  13. 제11항에 있어서, 투여가 유효량의 크롬 피콜리네이트를 포함하고, 피검자에게 있어 DRD2 A2 대립형질의 존재가 성공적 반응의 개선 가능성을 나타내는 방법.
  14. 제4항에 있어서, RDS 행동이 흡연인 방법.
  15. 제14항에 있어서, 피검자에게 있어 대립형질 D1 (Dde A1의 동형접합성) D2 (TaqI A1) D4 (VNTR 2) D5 (디뉴클레오타이드 13 대립형질 범위 135-159 BP) DAT1 VNTR (10/10) DβH (TaqI B1 대립형질) 중 하나 이상의 대립형질의 존재가 성공적 반응을 위한 개선 가능성을 나타내는 방법.
  16. RDS 행동이 자폐증, 튜렛 증후군 또는 ADHD를 추가로 포함하고, 피검자가 대립형질 D (Dde A의 동형접합성) D (Taq) D (VNTR) D (디뉴클레오타이드 대립형질 범위-BP) DAT VNTR (/) DβH (Taq B 대립형질) MAOA(X) 중 하나 이상의 대립형질을 가지며 하나 이상의 대립형질의 존재가 성공적 반응을 위한 개선 가능성을 나타내는 방법.
  17. 제16항에 있어서, 투여가 유효량의 로딜라 또는 후바진을 추가로 포함하는 방법.
  18. 제4항에 있어서, RDS 행동이 병적 도박이고, 피검자에게 있어 대립형질 D (Dde A의 동형 접합성) D (Taq A, B, C) 중 하나 이상의 존재가 성공적 반응의 개선 가능성을 나타내는 방법.
  19. 제4항에 있어서, RDS 행동이 병적 폭력, 분열병질/회피 (SAB), 공격, 분노, 적의 또는 외상후 스트레스 장애를 추가로 포함하고, 피검자에게 있어 대립형질 D (Taq A, B, C, exon) DAT (VNTR /) mNOSIa - ≤ BP 대립형질에 대한 동형 접합성 중 하나 이상의 존재가 성공적 반응의 개선 가능성을 나타내는 방법.
  20. 제4항에 있어서, RDS 행동이 PMS이고, 대립형질 DAT1 VNTR(10/10) D2TaqI A1, B1, C1, exon6-7하플로타입, 또는 대립형질 DRD1, DRD2, DRD4, HTT, HTRIA, TDO2, DβH, MAO, COMT, GABRAB, GABRB3, PENk, ADRA2A 또는 ADRA2C 유전자중 하나 이상의 존재가 성공적 반응의 개선 가능성을 나타내는 방법.
  21. 제4항에 있어서, RDS 행동이 물질 남용 장애을 추가로 포함하는 방법.
  22. 제21항에 있어서, RDS 행동이 물질 소비 장애인 방법.
  23. DRD1, DRD2, DRD3, DRD4, DRD5, DAT1, HTT, HTR1A, TDO2, DBH, ADRA2A, ADRA2C, NET, MAOA, COMT, GABRA3, GABRB3, CNR1, CNRA4, NMDAR1, PENK, AR, CRF, HTR1Dβ, HTR2A, HTR2C, 인터페론-γ, CD8A 또는 PSI 유전자를 포함하는 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 대립형질을 검출함을 포함하여, 하나 이상의 RDS 행동을 갖는 피검자의 유전적 소인을 측정하는 방법.
  24. 제23항에 있어서, RDS 행동이 열광증 (mania), OCD, 성(sexual), 수면(sleep), 초등 학교 행동(grade school behavior), 도박, 학습, 부주의, ADHD, ADDR, 충동(impulsivity), MDE, CD, 기능항진, 공포증, 분열병질 행동, 일반적 불안 (general anxiety), 신체화, 약물, IV 약물, 읽기, ODD, 틱 및 알콜 또는 담배 소비를 수반하는 장애를 포함하는 그룹 중에서 선택되는 방법.
  25. 제24항에 있어서, 대립형질이 MAOA 유전자의 VNTR 다형성인 방법.
  26. 제23항에 있어서, RDS 행동이 분열병질 또는 회피인 방법.
  27. 제26항에 있어서, 대립형질이 DRD2유전자 A1대립형질, DAT1유전자, VNTR 10/10 대립형질 또는 DβH 유전자 B1대립형질을 포함하는 그룹 중에서 선택되는 방법.
  28. 제23항에 있어서, RDS 행동이 약물 소비인 방법.
  29. 제28항에 있어서, 대립형질이 CNR1 유전자중 증가된 갯수의 (AAT)n트리플렛 반복체인 방법.
  30. 제23항에 있어서, RDS 행동이 비만, 불안, 우울, 정신병, 적의, 유편집병적 사고과정(paranoid ideation), 강박(obsessive-compulsive), 증후군 전체(symptom total), 일반 증후군 인덱스(general symptom index), 새로운 것에 대한 추구(novelty seeking), 전부(overall total), 신경질 및 성실을 포함한 그룹 중에서 선택되는 방법.
  31. 제30항에 있어서, 대립형질이 OB 유전자중 증가된 갯수의 D7S1873, D7S1875, D7S514 또는 D7S680 디뉴클레오타이드 반복체를 포함하는 그룹 중에서 선택되는 방법.
  32. 제31항에 있어서, D7S1875 뉴클레오타이드 반복체의 갯수가 CNR1 유전자의 두 카피 모두에서 길이로 225bp 초과인 방법.
  33. 제32항에 있어서, 대립형질이 DRD2 유전자의 D2A1 대립형질인 방법.
  34. 제30항에 있어서, 검출이 DRD2 유전자의 D2A1 대립형질 및 OB 유전자중 증가된 갯수의 D7S1873, D7S1875, D7S514 또는 D7S680 디뉴클레오타이드 반복체를 포함하는 그룹 중에서 선택되는 대립형질을 검출함으로써 수행되는 방법.
  35. 제34항에 있어서, 측정이 비만에 대한 것인 방법.
  36. 제23항에 있어서, RDS 행동이 튜렛 증후군, 열광 증후군, 저항적 반항, 성, ADHD-R, 분열병질, ADHD, 틱, 메이저 우울증 (major depression), 행위 (conduct), 말더듬, 강박, 신체화, 알콜 중독, 학습 및 수면 문제를 포함하는 그룹 중에서 선택되는 방법.
  37. 제36항에 있어서, 대립형질이 DRD2 유전자의 D2A1 대립형질인 방법.
  38. 제23항에 있어서, RDS 행동이 튜렛 증후군, ADHD, 흡연, 학습, 초등 학교, ADHD-R, 저항적 반항, 틱, 열광증, 알콜, 읽기, 약물 남용, 수면, 말더듬, 강박, 신체화 및 메이저 우울증을 포함하는 그룹 중에서 선택되는 방법.
  39. 제38항에 있어서, 대립형질이 DβH 유전자의 Taq A1 대립형질인 방법.
  40. 제38항에 있어서, RDS 행동이 튜렛 증후군이고, 측정이 DβH 유전자의 증가된 갯수의 Taq B1 대립형질 및 Taq A1 대립형질을 검출하는 방법.
  41. 제23항에 있어서, RDS 행동이 튜렛 증후군, 자폐증, 신체화, 알콜, ADHD-R, 메이저 우울증, 공황, 강박, 일반적 불안, 열광증, 저항적 반항, 성, 읽기 및 ADHD를 포함하는 그룹 중에서 선택되는 방법.
  42. 제41항에 있어서, 튜렛 증후군이 DAT1 유전자의 하나 이상의 10 대립형질의 증가된 갯수를 검출함으로써 측정되는 방법.
  43. 제23항에 있어서, RDS 행동이 ADHD, 말더듬, ADHD-R, 저항적 반항, 틱, 행위, 강박, 열광증, 알콜, 일반적 불안, 공황, 분열병질, 수면, 성, 약물 및 메이저 우울증을 포함하는 그룹 중에서 선택되는 방법.
  44. 제43항에 있어서, RDS 행동이 DAT1 유전자의 10 대립형질, DβH 유전자의 Taq A1 대립형질 또는 DRD2 유전자의 D2A1 대립형질을 포함하는 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 증가된 갯수의 대립형질을 검출함으로써 측정되는 방법.
  45. 제23항에 있어서, RDS 행동이 알콜, 흡연, 강박적 식사 (compulsive eating), 틱, 도박, 약물, 읽기, 쇼핑, 저항적 반항, 메이저 우울증 에피소드, 분열병질, ADHD, 행위 장애, 강박 및 열광증과 관련된 그룹 중에서 선택되는 방법.
  46. 제45항에 있어서, 측정이 DRD1 유전자의 Ddel 대립형질에 대한 동형접합성을 검출함으로써 수행되는 방법.
  47. 제23항에 있어서, RDS 행동이 저항적 반항, 행위 장애, 식사, 흡연, 도박, ADHD, 강박, 열광증 및 알콜을 포함하는 그룹 중에서 선택되는 방법.
  48. 제47항에 있어서, DRD2 유전자의 TaqI A1 및 TaqI A2 대립형질을 검출함을 포함하는 방법.
  49. 제23항에 있어서, RDS 행동이 튜렛 증후군, 흡연 및 도박을 포함하는 그룹 중에서 선택되는 방법.
  50. 제49항에 있어서, 측정이 DRD1 유전자의 11 또는 22 유전자형을 검출함으로써 수행되는 방법.
  51. 제50항에 있어서, 측정이 DRD1 유전자의 Dde1 대립형질의 게놈당 2개의 카피를 검출함으로써 수행되는 방법.
  52. 제23항에 있어서, RDS 행동이 저항적 반항 행동, 행위 장애, 강박적 식사, 흡연, 도박, ADHD, 열광증, 말더듬, 강박 및 분열병질 행동을 포함하는 그룹 중에서 선택되는 방법.
  53. 제52항에 있어서, 측정이 DRD1 유전자의 11 유전자형의 증가된 갯수로 검출함으로써 수행되는 방법.
  54. 제23항에 있어서, 측정이 DRD2 A1 대립형질을 검출함으로써 수행되고, RDS 행동이 도박, 흡연, 강박적 식사, 저항적 반항, 메이저 우울증 에피소드, ADHD, 행위 장애, 분열병질, 강박증, 열광 및 알콜을 포함하는 그룹 중에서 선택되는 방법.
  55. 제54항에 있어서, 측정이 DRD1 유전자의 Dde1 대립형질의 게놈당 2개의 카피를 검출함으로써 수행되는 방법.
  56. 제23항에 있어서, RDS 행동이 알콜, 흡연, 강박적 식사, 틱, 도박, 약물, 읽기, 쇼핑 및 초등 학교 문제를 포함하는 그룹 중에서 선택되는 방법.
  57. 제56항에 있어서, 측정이 DRD1 유전자의 11 또는 22 유전자형을 검출함으로써 수행되는 방법.
  58. 제23항에 있어서, RDS 행동이 튜렛 증후군인 방법.
  59. 제58항에 있어서, 측정이 트립토판 2,3 디옥시게나제 유전자의 인트론 6 GA 다형성을 검출함으로써 수행되는 방법.
  60. 제23항에 있어서, RDS 행동이 ADHD, 알콜 의존, 약물 의존 및 병적 도박을 포함하는 그룹 중에서 선택되는 방법.
  61. 제60항에 있어서, 측정이 트립토판 2,3 디옥시게나제 유전자의 인트론 6 GT 다형성을 검출함으로써 수행되는 방법.
  62. 제23항에 있어서, RDS 행동이 ADHD, 알콜 의존, 약물 의존, 병적 도박 및 우울증을 포함하는 그룹 중에서 선택되는 방법.
  63. 제62항에 있어서, 측정이 트립토판 2,3 디옥시게나제 유전자의 인트론 6 DGGE 다형성을 검출함으로써 수행되는 방법.
  64. 제23항에 있어서, RDS 행동이 약물 소비인 방법.
  65. 제64항에 있어서, 측정이 ADRA2C 디뉴클레오타이드 반복체 다형성의 낮은 염기쌍 대립형질 (≤181 bp) 다형성을 검출함으로써 수행되는 방법.
  66. 제23항에 있어서, RDS 행동이 음주인 방법.
  67. 제66항에 있어서, 측정이 ADRA2C 디뉴클레오타이드 반복체 다형성의 2개의 높은 염기쌍 대립형질 (≥183 bp)을 검출함으로써 수행되는 방법.
  68. 제23항에 있어서, RDS 행동이 음주 및 흡연을 포함하는 그룹 중에서 선택되는 방법.
  69. 제68항에 있어서, 측정이 프레세닐린-1 (PS1) 다형성에 대한 2개의 동형 대립형질을 검출함으로써 수행되는 방법.
  70. 제68항에 있어서, 측정이 PENK 유전자의 CA 디뉴클레오타이드 반복체 다형성의 80 bp 초과의 2개의 동형 대립형질을 검출함으로써 수행되는 방법.
  71. 제23항에 있어서, RDS 행동이 CD, ODD 또는 활성항진을 포함하는 그룹 중에서 선택되는 방법.
  72. 제71항에 있어서, 측정이 AR 유전자의 짧은 GGC 대립형질의 존재를 검출함으로써 수행되는 방법.
  73. 제23항에 있어서, 측정이, 알콜 중독, 코카인 중독 또는 RDS 프로밴드 (proband)에서 유형 B 행동에 대한 것으로, 상기 피검자에서의 소인과 관련된 DRD2 대립형질의 존재를 검출함으로써 수행되는 방법.
  74. DRD1, DRD2, DRD5, DAT1, HTT, HTR1A, TDO2, DBH, ADRA2A, ADRA2C, NET, MAOA, COMT, GABRA3, GABRB3, CNR1, CNRA4, NMDAR1, PENK, AR, CRF, DRD3, DRD4, HTR1Dβ, HTR2A, HTR2C, 인터페론-γ, CD8A 또는 PS1 유전자를 포함하는 그룹 중에서 선택된 것과 관련된 하나 이상의 대립형질을 검출함을 포함하여, 폴리유전자 특성에 대한 유전적 소인을 측정하는 방법.
  75. 제74항에 있어서, 유전적 소인이 ADHD에 대한 것이고, 측정이 DRD1, DRD2, DRD5, DAT1, HTT, HTR1A, TDO2, DBH, ADRA2A, ADRA2C, NET, MAOA, COMT, GABRA3, GABRB3, CNR1, CNRA4, NMDAR1, PENK, AR 또는 CRF 유전자와 관련된 하나 이상의 대립형질을 검출함을 포함하는 방법.
  76. 제74항에 있어서, 유전적 소인이 ADHD의 결여에 대한 것이고, 측정이 DRD3, DRD4, HTR1Dβ, HTR2A, HTR2C, 인터페론-γ, CD8A 또는 PS1 유전자와 관련된 하나 이상의 대립형질을 검출함을 포함하는 방법.
  77. 제74항에 있어서, 유전적 소인이 OOD에 대한 것이고, 측정이 DRD1, DRD2, DRD3, DAT1, HTT, HTR1A, HTR2A, HTR2C, DBH, ADRA2A, ADRA2C, MAOA, GABRA3, GABRB3, CNR1, CHRNA4, NMDAR1, PENK, AR 또는 CD8A 유전자와 관련된 하나 이상의 대립형질을 검출함을 포함하는 방법.
  78. 제74항에 있어서, 유전적 소인이 틱에 대한 것이고, 측정이 DRD1, DRD5, HTR1A, HTR1Dβ, HTR2C, TDO2, DBH, ADR2C, COMT, GABRA3, CNR1 또는 CHRNA4 유전자와 관련된 하나 이상의 대립형질을 검출함을 포함하는 방법.
  79. 제74항에 있어서, 유전적 소인이 LD에 대한 것이고, 검출이 DRD1, HTR2C, TDO2, DBH, ADR2A, ADR2C, MAOA, CNR1 또는 CNRA4 유전자와 관련된 하나 이상의 대립형질을 검출함을 포함하는 방법.
  80. 제74항에 있어서, 유전적 소인이 증가된 LDL 수준에 대한 것이고, 측정이 HTT, OXYR, DRD2 또는 PS1 유전자와 관련된 하나 이상의 대립형질을 검출함을 포함하는 방법.
  81. 제74항에 있어서, 유전적 소인이 증가된 콜레스테록 수준에 대한 것이고, 측정이 HTT, OXYR, DRD2 또는 PS1 유전자와 관련된 하나 이상의 대립형질을 검출함을 포함하는 방법.
  82. 제74항에 있어서, 유전적 소인이 장수에 대한 것이고, 측정이 PS1, OXYR 또는 APOE 유전자와 관련된 하나 이상의 대립형질을 검출함을 포함하는 방법.
  83. a) 조사할 특성 (trait)을 확인하는 단계,
    b) 조사할 특성의 중증도를 측정하는 척도 (scale)를 정하는 단계,
    c) 특성에 기여할 수 있는 하나 이상의 후보 유전자를 선택하는 단계,
    d) 후보 유전자와 관련된 하나 이상의 다형성을 확인하는 단계,
    e) 다형성의 대립형질 패턴을 척도와 연관시키는 단계,
    f) 대립형질 패턴의 관련성을 특성에 대한 후보 유전자의 연관성과 비교하는 단계,
    g) 특성과 양성적으로 연관된 대립형질 패턴이 부가되는 경우, 진단용의 폴리유전자적 검정을 형성하는 단계를 포함하여, 진단용의 폴리유전자적 검정을 발전시키는 방법.
  84. 제83항에 있어서, 후보 유전자가 DRD1, DRD2, DRD5, DAT1, HTT, HTR1A, TDO2, DBH, ADRA2A, ADRA2C, NET, MAOA, COMT, GABRA3, GABRB3, CNR1, CNRA4, NMDAR1, PENK, AR, CRF, DRD3, DRD4, HTR1Dβ, HTR2A, HTR2C, 인터페론-γ, CD8A 또는 PS1 유전자를 포함하는 방법.
  85. 제83항에 있어서, 폴리유전자적 특성이 ADHD, ADHD 결여, ODD, CD, LD, 틱, 약물 남용/의존, 흡연, 골관절염, 증가된 콜레스테롤 수준, 증가된 LDL 수준 또는 장수를 포함하는 방법.
  86. 제85항에 있어서, ADHD에 대한 폴리유전자적 검정이 DRD1, DRD2, DRD5, DAT1, HTT, HTR1A, TDO2, DBH, ADRA2A, ADRA2C, NET, MAOA, COMT, GABRA3, GABRB3, CNR1, CNRA4, NMDAR1, PENK, AR 또는 CRF 유전자와 관련된 하나 이상의 대립형질을 검출함을 포함하는 방법.
  87. 제85항에 있어서, ADHD 결여에 대한 폴리유전자적 검정이 DRD3, DRD4, HTR1Dβ, HTR2A, HTR2C, 인터페론-γ, CD8A 또는 PS1 유전자와 관련된 하나 이상의 대립형질을 검출함을 포함하는 방법.
  88. 제85항에 있어서, OOD에 대한 폴리유전자적 검정이 DRD1, DRD2, DRD3, DAT1, HTT, HTR1A, HTR2A, HTR2C, DBH, ADRA2A, ADRA2C, MAOA, GABRA3, GABRB3, CNR1, CHRNA4, NMDAR1, PENK, AR 또는 CD8A 유전자와 관련된 하나 이상의 대립형질을 검출함을 포함하는 방법.
  89. 제85항에 있어서, 틱에 대한 폴리유전자적 검정이 DRD1, DRD5, HTR1A, HTR1Dβ, HTR2C, TDO2, DBH, ADR2C, COMT, GABRA3, CNR1 또는 CHRNA4 유전자와 관련된 하나 이상의 대립형질을 검출함을 포함하는 방법.
  90. 제85항에 있어서, LD에 대한 폴리유전자적 검정이 DRD1, HTR2C, TDO2, DBH, ADR2A, ADR2C, MAOA, CNR1 또는 CNRA4 유전자와 관련된 하나 이상의 대립형질을 검출함을 포함하는 방법.
  91. 제85항에 있어서, 증가된 LDL 수준에 대한 폴리유전자적 검정이 HTT, OXYR, DRD2 또는 PS1 유전자와 관련된 하나 이상의 대립형질을 검출함을 포함하는 방법.
  92. 제85항에 있어서, 장수에 대한 폴리유전자적 검정이 PS1, OXYR 또는 APOE 유전자와 관련된 하나 이상의 대립형질을 검출하는 방법.
  93. 제85항에 있어서, 골관절염에 대한 폴리유전자적 검정이 COL2A1, COL2A1, COL2A1, COL9A1, COL9A1, AGC1, IGF1, IGF1, IGF1R, IGF1R, IGF2, IGF2R, TGFB1, TGFB2, IL1A, IL1B, IL1R1, IL1RN, MMP9, TIMP1 또는 비타민 D3 유전자와 관련된 하나 이상의 대립형질을 검출함을 포함하는 방법.
  94. a) 뉴로펩티드 오피트의 효소적 파괴를 억제하는,아미노산, 펩타이드 및 이들의 구조적 동족체 또는 유도체로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 오피트 파괴-억제량의 하나 이상의 물질,
    b) 뉴런 엔돌핀 또는 엔케팔린을 방출하는, 폴리펩타이드 또는 아미노산으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 엔케팔린 방출 물질 및
    c) 델타, 무 (mu), 카파, 시그마 또는 엡실론 수용체에서 오피트의 효과를 차단시키는, 날로포톤 또는 IC1154129와 같은 마취성 길항제로 이루어진 그룹중에서 선택되는 오피트 길항량의 하나 이상의 화합물을 필수 구성으로 하며, 오피트 파괴-억제 물질, 신경전달자 전구체, 크롬 화합물 및 오피트 길항제가 RDS 행동을 저하시키기에 효과적인 양으로 함유된, RDS 행동을 치료하기 위한 조성물.
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