JP2008512114A - 長時間作用型ベータアゴニストでの処置用の候補者として患者を同定するためのおよびベータ２−アドレナリン受容体遺伝子の中の多型性を分析することにより長時間作用型ベータ２アゴニスト治療に対する患者の応答を予測するための方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、患者から生物学的試料を単離することおよびベータ２−アドレナリン受容体遺伝子の中で少なくとも一つのハプロタイプＣの存在もしくは不存在を同定することを含む、長時間作用型ベータアゴニストでの処置用の候補者として患者を同定するための方法に関する。患者の試料の中で少なくとも一つのハプロタイプＣの存在は、患者が処置のために良好な候補者であることを示す。例えば、患者は呼吸器疾患、好ましくは閉塞性気道疾患、および最も好ましくはＣＯＰＤもしくは喘息、を有し得る。本発明はまた、ベータ２−アドレナリン受容体遺伝子の中で多型性を検出することを含む長時間作用型ベータ２アゴニスト治療に対する喘息患者の応答を予測するための方法に関する。

Description

本発明は、β２−アドレナリン受容体遺伝子中の特定の単一ヌクレオチド多型性を含むハプロタイプおよび患者における長時間作用型ベータアゴニストに対する応答との関係の同定に関し、それは薬物処置に適切な候補者の同定を許容する。

β２−アドレナリン受容体(ＡＤＲＢ２もしくはＢ２ＡＲ)は、数多くの組織の中のカテコールアミンの作用を仲介するＧタンパク質共役受容体である。ＡＤＲＢ２活性は、心臓の、血管の、肺のおよび代謝の機能を調節することに重要な役割を果たしている。ＡＤＲＢ２受容体の活性もしくは発現の変化は、うっ血性心不全、不整脈、虚血性心疾患、高血圧、片頭痛、喘息、慢性閉塞性肺疾患(ＣＯＰＤ)、アナフィラキシー、肥満、糖尿病、重症筋無力症、および早産を含む数多くの疾患ならびに状態のリスクまたは重症度を増加させると考えられている。

ベータ−２(β２)アゴニストを含む、β−アドレナリンアゴニスト(“ベータ(β)アゴニスト”)は、喘息の処置に広く用いられている。β２−アゴニストの気管支拡張作用は、慢性閉塞性肺疾患(ＣＯＰＤ)の管理にまた利用されている。気管支拡張剤は、この患者集団が、定義上、限定された気道可逆性を有しているという事実に拘わらず、ＣＯＰＤに対する治療の基礎を代表する。喘息患者における研究は、特定のアゴニストに対する個体の応答は多様であることを立証している(例えばTan等、「中等症状の安定喘息患者におけるベータ(２)アドレノレセプターの多型性および気管支拡張剤脱感作への感受性の間の関連。」(Association between beta (2)-adrenoceptor polymorphism and susceptibility to bronchodilator desensitisation in moderately severe stable asthmatics.)Lancet 350, 995-999 (1997)；Drysdale, C. M.等「複雑なプロモーターおよびコード領域のベータ(２)−アドレナリン受容体ハプロタイプが受容体発現を変えそしてインビボ応答性を予測する。」(Complex promoter and coding region beta (2)-adrenergic receptor haplotypes alter receptor expression and predict in vivo responsiveness.)Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 97, 10483-10488 (2000)、Taylor, D. R.等「ベータ−アゴニストに対する耐容の発生へのベータ２−アドレノセプターの１６位置での多型性の影響。」(The influence of polymorphism at position 16 of the beta2-adrenoceptor on the development of tolerance to beta-agonist.)Journal of Asthma. 37, 691-700 (2000)、Israel, E.等「喘息におけるアルブテロールの常用に対する応答へのベータ(２)−アドレナリン受容体の多型性の作用。」(Effect of polymorphism of the beta (2)-adrenergic receptor on response to regular use of albuterol in asthma.) International Archives of Allergy & Immunology 124, 183-186 (2001)により記述されている)。

ＡＤＲＢ２は、染色体５ｑ３１−３２の上のイントロンの無い遺伝子によりコード化されている(Kobilka, B.K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:46-50, 1987)。遺伝子のコーディングブロック内に、ヒト集団内でＡＤＲＢ２タンパク質の構造において著しい遺伝的多様性に至る数多くの一ヌクレオチド多型(ＳＮＰ)が同定されている(Reihsaus, E. et al., Am J Resp Cell MoI Biol 8:334-339, 1993; Liggett, S.B., News in Physiologic Sciences 10:265-273, 1995; and GenBank accession numbers AF022953.1 GI:2570526; AF022954.1 GI:2570528; and AF022956.1 GI:2570532)。プロモーター領域内でならびに５'および３'ＵＴＲ ｍＲＮＡの中で多数の他のＳＮＰが同定されている(例えば、McGraw, D. W. & Liggett, S. B.「ベータ(２)−アドレナリン受容体のコード化ブロックおよび５'リーダーシストロンの多型性。」(Coding block and 5' leader cistron polymorphisms of the beta(2)-adrenergic receptor.) Clinical & Experimental Allergy 29, 43-45 (1999)；McGraw, D. W., Forbes, S. L., Kramer, L. A., & Liggett, S. B.「ヒトベータ(２)−アドレナリン受容体の５'リーダーシストロンの多型性が受容体発現を調節する。」(Polymorphisms of the 5' leader cistron of the human beta(2)-adrenergic receptor regulate receptor expression.) Journal of Clinical Investigation 102, 1927-1932 (1998)を参照)。

試験検体中のＡＤＲＢ２の配列を分析することにより、数多くのＡＤＲＢ２ハプロタイプが同定されている。ＡＤＲＢ２ハプロタイプの頻度は、異なる集団毎に異なる。ＡＤＲＢ２ハプロタイプおよびβ２−アゴニストに対する気管支拡張応答の個体間の変動との間の関連が示唆されている(Liggett, S. B.「“β_２−アドレナリン受容体多型性の遺伝学：受容体機能および喘息表現型への関連性”」(“The genetics of β₂-adrenergic receptor polymorphisms: relevance to receptor function and asthmatic phenotypes.”)in：Liggett, S. B. & Meyers, D. A., The Genetics of Asthma (1996) pp. 455-478 を参照)。現在までの結果は、硫酸アルブテロール(商品名はサルブタモールおよびベントリン(Ventolin)を含む)のような短時間作用型β２−アゴニスト(ＳＡＢＡ)に集中していて、そして一時点をもしくは短期間の臨床応答を見ている。これらの研究からの結論は矛盾しているが、それは不適切な検体数により一部は説明され得る。矛盾のある観察に関与している他の要因としては、異なる疾患表現型の研究、異なる薬物応答結果の使用および妥当な薬物応答表現型を測定する困難が含まれる。

さらに最近、さらに便利な維持治療を提供し、そして夜間喘息の症状を短時間作用型β２−アゴニストで可能であるよりもさらに効果的に制御する目的で、長時間作用型β２−アゴニストが処置計画の中に導入されている(Johnson, 1995; Ann Allergy Asthma Immunol. Aug;75(2): 177-9)。長時間作用型β２−アゴニストは、アレルゲン、運動、ヒスタミン、およびメトコリン誘発性の気管支収縮に対して少なくとも１２時間気管支保護を提供する(「１９９６年全国喘息キャンペーン、喘息管理ハンドブック１９９６年号、メルボルン：」(National Asthma Campaign 1996, Asthma management handbook 1996, Melbourne:) National Asthma Campaign, Melbourne.)。

これらの長時間作用型β２−アゴニストとしては、サルメテロール(Serevent[登録商標], Serevent Diskus[登録商標])ならびにフォルモテロール(Foradil[登録商標]、ならびにForadil Aerolizer[登録商標]、Oxis[登録商標]およびSymbicort[登録商標])が含まれる。短時間および長時間作用型のβ２−アゴニストの作用機作の差は、例えばLotvall et al. (Pulm Pharmacol Ther. 2002; 15(6):497-501; and Respiratory Medicine 2001; 95 Supplement B; S7-S11)およびvan Schayck et al. (Respiratory Medicine 2002; Mar; 96(3): 155-62)によりレビューされている。

慢性閉塞性肺疾患(ＣＯＰＤ)(または慢性閉塞性肺疾患もしくは慢性気道疾患)とは、様々な程度の肺胞嚢拡大および肺組織破壊を伴う気流制限により特徴付けられる一群の肺疾患を指す。ＣＯＰＤの主な原因は喫煙であり、それは、この疾患の二つの最も一般的な型、疾患肺気腫および慢性気管支炎に至り得る。長期の喫煙は、肺の炎症および種々の程度の肺胞嚢破壊を引き起こす。これは、炎症しかつ狭窄した気道(慢性気管支炎)；もしくは低減した肺弾性を持つ非可逆的肺嚢胞拡大(肺気腫)に至る。長期喫煙者の１５〜２０％がＣＯＰＤを発症する。稀に、アルファ−１アンチ−トリプシン欠損症と呼ばれる酵素欠損症が、非喫煙者に肺気腫を引き起こし得る。ＣＯＰＤに対する他のリスク要因は、受動喫煙(非喫煙者の他人からのタバコの煙への曝露)、男性、および汚染した環境での労働である。

ＣＯＰＤに対する処置用に数多くの薬物が開発されていて、そしてそれらには短時間および長時間作用型β２−アゴニスト(それぞれＳＡＢＡおよびＬＡＢＡ)が含まれる。Viozan[登録商標](塩酸シベナデット)は、ＣＯＰＤの処置のための臨床開発後期にある新薬であったし、そして長時間作用型β２−アゴニスト(ＬＡＢＡ)である。Viozan[登録商標]の臨床的使用は数多くの治験で報告されている(例えば、Calverly et al., Respiratory Medicine, 2003; Jan: 97 Suppl A: S71-1; Hiller et al. Respiratory Medicine, 2003; Jan: 97 Suppl A: S45-52を参照)。第III相の有効性および安全性治験の結果、ならびにViozan[登録商標]の開発を中止する決定をする根拠は、Celli et al., Respiratory Medicine, 2003; Jan: 97 Suppl A: S35-43; Hiller et al., Respiratory Medicine, 2003; Jan: 97 Suppl A: S45-52に議論されている。

徐々に進行する疾患である、ＣＯＰＤのような疾患については、患者は長年、数十年でさえも、治療管理を続ける必要がある。しかしながら、いずれかの薬物の長期使用は、異なる個体へ異なる作用を及ぼし得る。特に、長期間使用は耐性をならびに頭痛、振戦および動悸のような有害な副作用をもたらし得る。

特定の治療薬剤に対する患者の応答を予測する能力は、ＣＯＰＤもしくは喘息のような呼吸器疾患に罹患している患者をいかに処置するかについて医師が決定するのに有用である。良好な作用が遺伝学的試験から予測できるならば、遺伝的プロファイルにマッチするように特異的な薬物プロファイルを選ぶことができ、そしてそれ故に良好な治療応答の可能性を増加して、有害な副作用のリスクを低減することができる。

このアプローチは、個人用医薬品、即ち薬理遺伝学およびファーマコゲノミック情報に基づいた個体に最適な特異的な治療薬および治療計画の処方の開発に貢献する。

薬物を投与する前に、特定の薬物に最も良く応答すると思われる患者を決定することはまた、経費および時間の節約を可能にする。この点では、特異的な変異体もしくは遺伝子について、遺伝子型もしくはハプロタイプが患者が特定の治療薬剤に良好に応答するであろうことを示す喘息もしくはＣＯＰＤの患者は、低度のもしくは中等度の応答を示すと思われる患者よりもその処置に対して優れた候補者である。したがって、ＡＤＲＢ２多型性および／またはハプロタイプと、β２−アゴニストへの応答における変動との関連を同定するために大規模臨床試験の必要性がある。そのような応答を用いて、薬物の動態、有効性、耐容性、および安全性を予測することができる。

(発明の開示)
本発明者等は、長時間作用型β２アゴニストに対する応答およびＡＤＲＢ２遺伝子のハプロタイプとの間の相関を同定している。ＡＤＲＢ２遺伝子のハプロタイプの解析は、長時間作用型β２アゴニストに対する患者の応答の予測を可能にする。特に、本明細書中に記載される研究はＣＯＰＤを罹患している患者に関する。

白人集団において、最も一般的なハプロタイプの頻度を表４に詳述する。ハプロタイプＡ、ＢおよびＣとして同定される、最も一般的な３種のハプロタイプは、発現されたタンパク質の上で機能上の作用を有すると報告されている３種のＳＮＰのそれぞれにおいて異なっている(図１および表６を参照)。本明細書中に提示されるデータは、ＡＤＲＢ２の‘Ｃ’ハプロタイプの少なくとも一つのコピーを持つ患者が長時間作用型β２アゴニストに対して‘良好な’臨床応答を有することを同定している。‘良好な’応答は、応答者のハプロタイプの単一のコピーを有していなかった対象(即ち‘非Ｃ’ハプロタイプ)と比較して、統計的なおよび臨床上の両方の見地から、有意に優れていた。

したがって、本発明の第一の局面では、
ａ)患者から生物学的試料を単離すること；
ｂ)ＡＤＲＢ２ハプロタイプＣの少なくとも一つのコピーの存在もしくは不存在を当該試料で同定することを含む、長時間作用型β２−アゴニストでの処置用の候補者として患者を同定するための方法が提供されて、ここで、患者試料中の少なくとも一つのハプロタイプＣの存在が、患者が処置用の良好な候補者であることを示す。

そのような方法は、ＡＤＲＢ２ハプロタイプ、もしくは選択された機能的ＳＮＰにおけるＡＤＲＢ２遺伝子型の知識に基づいて最適な投与量および処置計画を決定することにまた有用であり得る。

処置用の良好な候補者は、ＡＤＲＢ２‘Ｃ’ハプロタイプの一つもしくはそれ以上のコピーを有する個体である。そのような候補者は、その処置の良好な応答者であると思われる。良好な応答者は、長時間作用型β２アゴニストの投与後に呼吸器疾患の‘症状’の改善を示す個体として特徴付けられる。好ましい態様では、‘症状’の改善は、長時間作用型β２アゴニストの投与により長期間に亘って維持される。症状は、疾患の幾つかの構成要素を組み合わせている定性的スコアであり得るか、もしくは肺機能の定量的尺度であり得る。増悪の発生率もしくは重症度の低減は、良好な応答とまた考えられる。

インビボおよびインビトロで機能的作用を有すると示されているＡＤＲＢ２多型性は、表４および６に示されるとおり、アミノ酸１６および２７をコードする配列中のものならびにベータ−上流ペプチド(ＢＵＰ)中の多型性である。これらの三つのＳＮＰのそれぞれについて、ハプロタイプＣ中にコードされている変異体は、一般的でないハプロタイプＤにより共有される。したがって、方法はさらに、これらの同一な三つのＳＮＰを共有するハプロタイプＤを持つ患者を同定することを含む。

適当には、患者は呼吸器疾患および、特に、閉塞性気道疾患を有する。呼吸器疾患としては、急性肺障害、急性呼吸促迫症候群、慢性閉塞性肺疾患(ＣＯＰＤ)(または慢性閉塞性肺疾患もしくは慢性気道疾患)および喘息が含まれる。特に好ましい態様では、患者はＣＯＰＤもしくは喘息の任意の段階もしくは重症度を有する。

ＣＯＰＤの症状としては、職業性粉塵および化学物質、タバコの煙、および家庭の調理および暖房用燃料からの煙を含むリスク要因への曝露の履歴にしばしば関連する慢性咳嗽、慢性喀痰生成、急性気管支炎、呼吸困難が含まれる。診断は、努力肺活量(ＦＶＣ)および一秒量(ＦＥＶ１)を測定する肺活量測定法で同定され得る。ＣＯＰＤの患者は典型的に、患者の性、年齢および身長についての正常値と比較して、ＦＥＶ１およびＦＥＶ１／ＦＶＣの両方の減少を示す。ＣＯＰＤの重症度はGold分類にしたがって分類され、そして０：リスクあり、Ｉ：軽症、ＩＩ：中等症、およびＩＩＩ：重症の段階を含む。

喘息の症状としては、咳嗽、呼吸困難、胸苦しさ、胸痛、うるさい呼吸音等が含まれる。喘息の重症度は、症状、活動の障害、肺機能、気管支過敏症の程度、緊急来院の回数、入院および医薬品の使用の回数に基づいて分類されることができる。重症度の範囲は、重症持続性の、中等症持続性の、軽症持続性のおよび軽症間欠性の喘息を含んで記述される。

上述のように、呼吸器疾患の症状を数多くの方式で評価することができる。肺活量測定法は、閉塞性気道疾患において肺機能をモニターするために一般的に用いられる。例えば、ＦＥＶ１(リットルで測定される、一秒量)は、気道閉塞への介入療法の作用を評価するために臨床試験において広く利用されている。肺機能の評価のためのＦＥＶ１測定の値は、例えば、Am Rev Respir Disease 1991 144 1202-1218に記述されている。ＦＥＶ１の測定のための標準的手順は、例えば、American Thoracic Society,「肺活量測定法の標準化」(Standardization of spirometry) Am. J. Resp. Crit. Care Med. 1995, 149, 1107- 1136に記述されている。

ＣＯＰＤの患者は、気道機能の制限された可逆性を有している。ＦＥＶの僅か５０ｍＬの移動が、肺機能の臨床的に有意な改善を示すことができる。息切れ、咳嗽および喀痰を含むＣＯＰＤ症状の管理が、ＣＯＰＤ患者における介入療法の有効性の優れた評価を提供すると考えられる。息切れ、咳嗽、喀痰のスケール(ＢＣＳＳ)が、ＣＯＰＤ患者用の処置の対症有用度を評価するためのツールとして開発されている(Leidy et al, (2003), Respiratory Medicine, Vol 97, Suppl A, S59-S70)。

したがって、長時間作用型β２アゴニストの投与に対する良好な応答者は、殆ど直ちに起こり始めそして数時間に亘り持続するＦＥＶ１の改善を示す。ＦＥＶ１を時間に対してプロットすれば、初期応答の大きさ(最大ＦＥＶ１)および作用の持続時間の両方を反映している、曲線下面積(ＡＵＣ)は、生理的応答の良好な尺度であるであろう。

加えて、良好な応答者は、ＢＣＳＳおよび／もしくは全症状に改善を示すであろう。全症状は、本明細書中で記述されるように、標準的な“全症状スコア”分析に対して測定され得る。特に、全症状スコアは、それらのそれぞれがＣＯＰＤ表現型に関与する、息切れ、咳嗽および喀痰生成の測定を考慮する。

“長時間作用型ベータ２(β２)アゴニスト”とは、ＡＤＲＢ２受容体と相互作用しそして一般的に使用される短時間作用型ベータ２アゴニスト(例えばアルブテロール)と比較して長い作用時間で応答を生成するアゴニストを意味する。典型的には、長時間作用型ベータ２アゴニストに対する応答は、１２時間もしくはそれ以上の間持続し得る。長時間作用型ベータ２アゴニストの範囲は当業者に公知でありそしてViozan[登録商標](塩酸シベナデット)、バムブテロール(バムベック、オキセオール)、サルメテロール、およびフォルモテロールを含む。

患者からの生物学的試料は、血液もしくは口腔切屑のような組織抽出物を含む任意のＤＮＡを含有する生物学的物質を含むことができる。典型的には、血液試料が使用される。遺伝子型同定に使用するために多くのタイプの生物学的試料から、ＤＮＡを分析のために抽出することができる。例えば、ＤＮＡは、血液試料からの直接遺伝子型同定が実施可能であるけれども、QiagenもしくはNucleonおよびPureGene(Flowgen)から入手可能なもののような市販のキットを用いて、血液から典型的に抽出される。

本明細書中で記載されるように、ハプロタイプは、単一の染色体の上に見出される連鎖的な、遂次ＳＮＰの特定のパターンである。患者の試料の中のハプロタイプ対の決定は、ハプロタイプブロック(表４を参照)中のそれぞれのＳＮＰについて患者のＤＮＡを遺伝子型同定することを伴う。それぞれの染色体の上にどのＳＮＰ変異体が存在するかを直接に決定することにより、ハプロタイプを実験的に決定することができる。さらに一般的には、特に大多数の対象についての遺伝子型のデータが入手可能であるときには、ハプロタイプは、統計的アルゴリズムを用いて間接的に決定される。同一の遺伝子／遺伝子座について、任意の一つのハプロタイプを全ての他のハプロタイプから区別するために遺伝子型同定されなければならない最低数のＳＮＰは、最低ＳＮＰセットもしくはハプロタイプ−標識ＳＮＰと言われる。ハプロタイプ−標識ＳＮＰは、ハプロタイプの間で区別するために最も効率的なアプローチでありそしてＡＤＲＢ２ハプロタイプについての診断的試験の中に組み入れられる可能性がある。これらの最低ＳＮＰもしくはＨＡＰ−標識ＳＮＰは、特定の集団の中で大多数のハプロタイプの多様性を捕獲するＳＮＰのサブセットである。結果として、異なる集団内で同一の程度の多様性を捕獲するためには、ｈｔＳＮＰの多数の異なるセットが必要とされ得る。適当なプローブは、例えば、ＷＯ０１／７９２５２の中に、記述されている。

さらなる態様では、方法は、ハプロタイプ対中の両対立遺伝子の同一性を決定することを含む。特に、そして本明細書中で記述されるように、患者がＣハプロタイプの一つもしくはそれ以上のコピーを有するならば、彼らは長時間作用型β２アゴニストでの処置に良好な応答を示す可能性が最も高い。応答の大きさは、Ｃハプロタイプのコピーを何も持たない対象ではさらに小さい。例えば、本明細書中で示されるように、ハプロタイプＢＣを持つ対象は、さらに高い最大ＦＥＶ１応答を有し、そして、ＢＢハプロタイプ対を持つ対象と比較するときに、さらに長期間(８時間でのＦＥＶ１)応答を維持する。したがって、患者のＡＤＲＢ２ハプロタイプ対の状態は、それぞれの特異な患者に対してどの薬物を投与するか、最も適切な投与量および処置計画についての決定をするために有用な情報を医師に提供する。

個体の試料内でハプロタイプおよび／または遺伝子型を決定するための数多くの方法が、当業者に公知である。特に、本発明は、ＡＤＲＢ２遺伝子内で公知の多型性の定義された位置における特定のヌクレオチドの同一性を検出することに基づく方法に関する。

したがって、一つの局面では、
ａ)患者から取られた生物学的試料から核酸を単離すること；および
ｂ)ＡＤＲＢ２のゲノムＤＮＡの一つの対立遺伝子の中で、以下の位置に存在する以下のヌクレオチド(表４を参照)：
位置 ヌクレオチド
−４７ Ｔ
４６ Ｇ
７９ Ｃ
を検出することを含む良好な応答者を同定するための方法が提供される。
適当には、そのような方法は、ハプロタイプＡ、ＢおよびＥからのハプロタイプＣならびにＤの区別を可能にする。

さらなる局面では、
ａ)患者から取られた生物学的試料から核酸を単離すること；および
ｂ)ＡＤＲＢ２のゲノムＤＮＡの一つの対立遺伝子の中で、以下の位置に存在する以下のヌクレオチド(表４を参照)：
位置 ヌクレオチド
−４７ Ｔ
４６ Ｇ
７９ Ｃ
５２３ Ａ
を検出することを含む少なくとも一つのハプロタイプＣの存在もしくは不存在を同定するための方法が提供される。
適当には、そのような方法は、ハプロタイプＡ、ＢおよびＤからのハプロタイプＣの区別を可能にする。

適当には、方法はさらに、ＡＤＲＢ２のゲノムＤＮＡの一つの対立遺伝子の中で、以下の位置に存在する以下のヌクレオチド(表４を参照)：
位置 ヌクレオチド
−１４２９ Ａ
−１０２３ Ｇ
−６５４ Ｇ
−３６７ Ｔ
−２０ Ｔ
２５２ Ａ
をさらに加えて検出することを含む。
適当には、そのような方法は、稀なハプロタイプを含む全ての他のＡＤＲＢ２ハプロタイプからのハプロタイプＣの区別を可能にする。

好ましい態様では、少なくとも一つのハプロタイプＣの存在もしくは不存在を同定するための方法は、
ａ)患者から取られた生物学的試料から核酸を単離すること；および
ｂ)ＡＤＲＢ２のゲノムＤＮＡの一つの対立遺伝子の中で、以下の位置に存在する以下のヌクレオチド：
位置 ヌクレオチド
−１４２９ Ａ
−１０２３ Ｇ
−６５４ Ｇ
−３６７ Ｔ
−４７ Ｔ
−２０ Ｔ
４６ Ｇ
７９ Ｃ
２５２ Ａ
５２３ Ａ
を検出することを含む。

本発明のもう一つの態様では、ＨＡＰ−標識ＳＮＰは、ハプロタイプの間で区別するために、遺伝子型同定される可能性がある。異なる集団の間での多様性に因り、ＨＡＰ−標識ＳＮＰの中に含まれることが必要である、実際のＳＮＰは、処置されるべき集団／個体の民族的背景に依存して異なり得る。

これらの位置のそれぞれにおいて存在するヌクレオチドを同定するための適当な方法は、本明細書中で記述されそしてTaqMan、SNaPshot、対立遺伝子特異的ポリメラーゼ連鎖反応増幅、対立遺伝子不応性の変異システム(ＡＲＭＳ)、制限フラグメント長の多型性分析およびシークエンシングを含む。そのような方法は、本明細書中で記述されるとおり、遺伝子型同定プローブもしくはオリゴヌクレオチドを使用することができる。

ＡＤＲＢ２ ｃＤＮＡは、ＮＣＢＩから入手可能なEntrezヌクレオチドデータベースの中で受入番号Ｍ１５１６９の下で詳述される配列を有する。Entrezヌクレオチドデータベースは、GenBank、RefSeq、およびPDB(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=Nucleotide)を含む、数個の供給源からの配列の収集である。ＡＤＲＢ２ ｃＤＮＡ配列(Ｍ１５１６９)は、配列番号１と以下に呼ばれそしてこの説明の最後に記載されている。

もう一つの態様では、少なくとも一つのハプロタイプＣの存在もしくは不存在を同定するための方法は、
ａ)患者から取られた生物学的試料からタンパク質を単離すること；および
ｂ)１６位置でＧｌｙをかつ２７位置でＧｌｎを有しているＡＤＲＢ２タンパク質(表６を参照)の存在を検出することを含む。

この態様では、Ｃハプロタイプの発現を同定するための適当な方法は、Ｇｌｙ１６およびＧｌｎ２７においてアミノ酸の変化を有するＡＤＲＢ２受容体を特異的に認識する抗体を用いている方法を含む。

もう一つの好ましい態様では、少なくとも一つのハプロタイプＣの存在もしくは不存在を同定するための方法は、リーダーペプチド／シストロン(ＬＣ)(ベータ−上流ペプチド(ＢＵＰ))の中で−４７位置でのＡｒｇの存在を検出することをさらに含む。しかしながら、このペプチドは、成熟タンパク質には存在しない。

もう一つの好ましい態様では、少なくとも一つのハプロタイプＣの存在もしくは不存在を同定するための方法は、任意の一対象について、多重ｃＤＮＡクローンをシークエンシングすることを含み、−４７ＢＵＰ多型性ならびに５'ＵＴＲ、コード領域および３'ＵＴＲ(図１)の中の他の変異体に対して、該対象が異型接合性であるかどうかを確立する。このアプローチをまた使用して、ＡＢＲＢ２遺伝子の示差的な対立遺伝子の発現があるかどうかを確立するであろう。

もう一つの態様では、少なくとも一つのハプロタイプＣの存在もしくは不存在を同定するための方法は、
ａ)患者から取られた生物学的試料からタンパク質を単離すること；および
ｂ)正常な個体と比較して患者の中の発現の増加されたレベルがハプロタイプＣの存在を指示する、ＡＤＲＢ２タンパク質のレベルを検出することを含む。

もう一つの局面では、本発明は、長時間作用型β２アゴニスト治療に対するＣＯＰＤもしくは喘息の患者の応答を予測するための方法を提供して、この方法は、ＡＤＲＢ２用のコード配列の−４７、４６および７９ヌクレオチドにおいて患者に対する遺伝子型を検出することを含み、ここで、該患者が同一のＡＤＲＢ２対立遺伝子の上でＴ(−４７)、Ｇ(４６)およびＣ(７９)変異体を有するならば、長時間作用型β２アゴニストの標準用量に対してその患者が良好な応答を示す可能性が高い。

したがって、さらなる局面では、患者においてＣＯＰＤもしくは喘息を処置するための治療計画を決定する方法が提供されて、その方法は、
ａ)患者から試料を得ること；
ｂ)当該試料からゲノムＤＮＡを単離すること；
ｃ)表２に詳述される配列を有しているヌクレオチドプライマーの任意の一対を用いる増幅にゲノムＤＮＡを供すること；
ｄ)ＡＤＲＢ２遺伝子の中の任意の多型性変異体における患者の遺伝子型を決定すること；
ｅ)遺伝子型同定データに基づいて患者のハプロタイプを決定すること；および
ｆ)ハプロタイプに基づいて当該患者のための治療計画を決定すること：
を含む。

本発明のさらなる局面では、表２に詳述されるオリゴヌクレオチドプローブの任意の一つの配列を含む単離された核酸分子が提供される。適当には、そのようなプローブは１０〜３０の塩基対の長さである。好ましい態様では、当該プローブは、表２に詳述される配列の任意の一つから成っている。

表２は、１２個のＶＩＣプローブ(配列番号２〜配列番号１３)、１２個の６ＦＡＭプローブ(配列番号１４〜配列番号２５)、１２個のフォワード(Ｆｗｄ)プライマー(配列番号２６〜配列番号３７)および１２個のリバース(Ｒｅｖ)プライマー(配列番号３８〜配列番号４９)の配列を提供する。
もう一つの局面では、遺伝子型同定のプローブのセットを含む、長時間作用型β−アゴニストに対する個体の応答を予測するための診断用のキットが提供される。

もう一つの局面では、ＡＤＲＢ２ハプロタイプの検出用のアレイが提供される。そのようなアレイは、異なるＡＤＲＢ２ハプロタイプのそれぞれに特徴的なＳＮＰに特異的な遺伝子型同定プローブを含む。

任意のＡＤＲＢ２多型性を遺伝子型同定するための方法は、呼吸器疾患を持つ個体のための最も適切な処置計画を決定するために形式化された一群の遺伝子型同定アッセイの一部であり得る。ＡＤＲＢ２ ＳＮＰは、代謝および輸送体の遺伝子の中にＳＮＰを持つ、ならびに／または呼吸器疾患の処置に使用されるｂ２−アゴニストならびに他の医薬品(例えば吸入コルチコステロイドおよびロイコトリエン阻害剤)への応答経路の中で他の遺伝子を持つ一群の中に含まれ得る。
したがって、一つの態様では、他のＳＮＰの検出のためのプローブをさらに含むアレイが提供される。

適当には、治療計画は、維持処置として定期的なスケジュールベースで長時間作用型ベータ２アゴニストの投与、および／または必要時ベースで救済医薬品としてＬＡＢＡの投与を伴う。

したがって、本発明は、薬物開発への個人用医薬品のアプローチを提供して、それによりＡＤＲＢ２ハプロタイプの状態に基づいた臨床試験に対象を前向きに集めることにより、ＬＡＢＡをＣハプロタイプのサブグループのために開発する。

適当には、ＡＤＲＢ２ハプロタイプの状態を用いて、最も適切なＬＡＢＡ、薬物の投与量、および治療計画、例えば、ＬＡＢＡの定期的なもしくは必要時の投与を選択する。

加えて、ＡＤＲＢ２ハプロタイプの決定は、適切な薬物、投与量および投与計画の決定に関与して、そこではｂ２−アゴニストならびにＣＯＰＤ、喘息および他の呼吸器疾患の管理に使用される他の治療薬に対する個体の応答を決定する役割を持つ他の遺伝子についての遺伝子型／ハプロタイプと一緒に、ＡＤＲＢ２ハプロタイプが決定される。

表および図面の簡単な説明
表１は、ＡＤＲＢ２遺伝子の中の多型性、ＡＤＲＢ２ ｃＤＮＡの参照配列(Ｍ１５１６９)の中のそれらの相対位置、アミノ酸変異体および大部分が白人の集団中のそれぞれの多型性の頻度を示す。

表２は、TaqManプライマーおよびＡＤＲＢ２ ＳＮＰを遺伝子型同定するための対立遺伝子特異的なプローブを示す。
表３は、SNaPshot ＰＣＲおよびＡＤＲＢ２ ＳＮＰを遺伝子型同定するためのプライマー伸長プライマーを示す。

表４は、５個の最も一般的なＡＤＲＢ２ハプロタイプについて、それぞれの多型性の位置に存在する、変異体のＡＤＲＢ２塩基および大部分が白人の臨床試験集団中のこれらの一般的なハプロタイプの頻度を示す。

表５は、大部分が白人の臨床試験集団中の、ＡＤＲＢ２ハプロタイプ対の頻度を示しそしてそれぞれのＡＤＲＢ２ハプロタイプ対の観察された頻度をまとめており、そこではハプロタイプ対は、２４５０人の対象の臨床試験集団の中でハプロタイプＡ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥの組合せである。
表６は、以前のインビトロおよびインビボ研究で機能的に有意であると報告された三つの変異体について、最も一般的なＡＤＲＢ２ハプロタイプによりコードされたアミノ酸の変異体を示す。

図１は、遺伝子のコード領域、５'ＵＴＲおよび３'ＵＴＲ領域の中で多型性の相対位置を示しているＡＤＲＢ２遺伝子の概略図を示す。

図２は、Viozan[登録商標]の臨床試験に集められた患者のサブセットにおける一連のＦＥＶ１分析の結果を示す。応答がＡＤＲＢ２ハプロタイプ対により層別化されている、Viozan[登録商標]での最初の処置来院において、一連のＦＥＶ１応答を測定した。

図３は、３ヶ月(ＳＣ−３９７−５０９８)のおよび６ヶ月(ＳＣ−３９７−５０９７)の臨床試験のコースに亘り投与前ベースラインにおいて測定されたＦＥＶ１を示す。この図は、最初の来院時の処置前ベースライン(ＦＥＶ１)と、次の来院時の投与前ＦＥＶ１(トラフＦＥＶ１)を比較した変化を例示する。‘Ｃ’ハプロタイプの一つもしくはそれ以上のコピーの存在に依存して、患者をグループ分けする。

図４は、３ヶ月および６ヶ月の有効性試験において作成された合併した一連のＦＥＶ１データを示す。グラフは、‘Ｃ’ハプロタイプの少なくとも一つのコピーを持つものおよび残りの‘非Ｃ’ハプロタイプの対象に層別化された対象について最初の来院時および３ヶ月の処置後の一連のＦＥＶ１応答を示す。

図５は、Viozan[登録商標]で処置されそして、３ヶ月の有効性治験(ＳＣ−３９７−５１６３)のコースに亘り、ＡＤＲＢ２ハプロタイプ対に基づいてサブグループに層別化されている患者についてベースラインＢＣＳＳ(息切れ、咳嗽および喀痰のスコア)からの変化を示す。

図６は、Viozan[登録商標]に対する応答がＡＤＲＢ２‘Ｃ’ハプロタイプの存在に基づいて二つのサブグループに層別化されている、３ヶ月の治験(ＳＣ−３９７−５１６３)に亘りベースラインからＢＣＳＳの平均変化を示す。

図７は、層別化されていない患者の集団(全ハプログループ)の中の平均応答と比較して、Ｃハプロタイプの存在にもしくは不存在に基づいて、２つのグループに層別化されている患者のサブグループについてベースラインＢＣＳＳ(息切れ、咳嗽および喀痰のスコア)からの平均変化を示す。患者がＣハプロタイプのおよび非Ｃハプロタイプのグループに層別化されるときに、Viozan[登録商標]に(図７Ａ)ならびにプラセボに(図７Ｂ)対する応答の解析は、少なくとも一つの‘Ｃ’ハプロタイプを持つ患者がViozan[登録商標]にさらに良く応答することを示している。治験ＳＣ−３９７−５１６３およびＳＣ−３９７−５０９８についての合併されたデータ。

図８は、Viozan[登録商標]およびプラセボで処置され、そしてＣハプロタイプおよび非Ｃハプロタイプのサブグループに層別化されている対象について一次臨床試験エンドポイントにおけるベースラインからのＢＣＳＳの平均変化(９週から１２週を含む処置について平均のＢＣＳＳ応答)を示す。治験ＳＣ−３９７−５１６３およびＳＣ−３９７−５０９８についての合併されたデータ。Viozan[登録商標]で処置されたＣハプロタイプを持つ対象は、Ｃハプロタイプの一コピーを持たない(非Ｃハプロタイプ)それらの対象に比較して、ＢＣＳＳ応答の統計的に有意な差があった。

(詳細な説明)
それ以外の定義がない限り、本明細書中で使用される全ての技術的なおよび科学的な用語は、当業者により(例えば、細胞培養、分子遺伝学、核酸化学、ハイブリダイゼーション技法および生化学において)一般的に理解されるのと同一の意味を有する。標準的な技法が、分子の、遺伝のおよび生化学の方法のために使用される。一般的には、Sambrook等「分子クローン化：実験室便覧(第２版)」(Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed.)、(1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.およびAusubel等「分子生物学における短い実験計画」(Short Protocols in Molecular Biology)(1999) 4^thEd, John Wiley & Sons, Inc.；ならびにGuthrie 等、「酵母遺伝学および分子生物学への手引き」(Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology)、Methods in Enzymology, Vol. 194, Academic Press, Inc., (1991)、「ＰＣＲ実験計画：方法および応用への手引き」(PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications)(Innis, et al. 1990. Academic Press, San Diego, Calif.)、McPherson 等、 PCR Volume 1, Oxford University Press, (1991)、「動物細胞の培養：基本技法便覧第２版」(Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, 2nd Ed.)(R. I. Freshney. 1987. Liss, Inc. New York, N.Y.)、ならびに「遺伝子の転移および発現の実験計画」(Gene Transfer and Expression Protocols)、pp. 109-128, ed. E. J. Murray, The Humana Press Inc., Clifton, N.J.を参照されたい。これらの文書は出典明示により本明細書の一部とする。

(定義)
“対立遺伝子”とは、その特定のヌクレオチドのもしくはアミノ酸の配列により他の型から区別される、遺伝子座の特定の型を指す。

“抗体”は、全体抗体またはそれらの抗原結合性フラグメントであり得る。例えば、本発明は、ＦｖおよびＦａｂ、ならびにＦａｂ'およびＦ(ａｂ')_２のようなフラグメントならびにｓｃＦｖ、一ドメイン抗体、Ｄａｂ抗体および他の抗原結合性抗体をベースにする分子のような抗体変異体を含む。

“シストロン”は、単一のタンパク質鎖、即ち遺伝子をコード化するＤＮＡのセグメントである。それは、コードＤＮＡの前および後にある領域ならびにエクソンの間のイントロンを含むことができる。それは、遺伝の単位と考えられている。

“発現”とは、相当するｍＲＮＡを生産するための遺伝子ＤＮＡ鋳型の転写および相当する遺伝子生成物(即ち、ペプチド、ポリペプチド、もしくはタンパク質)を生産するためのこのｍＲＮＡの翻訳を指す。

“遺伝子”は、プロモーター、エクソン、イントロン、および発現を制御する他の非翻訳領域を含む、ＲＮＡ生成物の調節的生合成についての全ての情報を含有するＤＮＡのセグメントである。
“遺伝子型”は、個体の中で相同染色体の対の上の遺伝子座の中で一つもしくはそれ以上の多型性部位において見出されるヌクレオチド対(複数を含む)の非位相の５'から３'への配列である。
“遺伝子型同定”は、個体の遺伝子型を決定する方法である。

“ハプロタイプ”は、単一の個体からの単一の染色体の上の遺伝子座の中で二つもしくはそれ以上の多型性部位において見出されるヌクレオチドの位相の５'から３'への配列である。
“ハプロタイプ対”とは、単一の個体の中で遺伝子座について見出される二つのハプロタイプを指す。
“ハプロタイプ同定”は、個体のハプロタイプを決定する方法である。

“完全ハプロタイプ”は、単一の個体からの単一の染色体の上の遺伝子座の中で全ての公知な多型性部位において見られるヌクレオチドの５'から３'への配列である。
“サブハプロタイプ”は、単一の個体からの単一の染色体の上の遺伝子座の中で公知な多型性部位のサブセットにおいて見られるヌクレオチドの５'から３'への配列である。

本明細書中で定義されるとおり、ハプロタイプ“Ｃ”は、ＡＤＲＢ２遺伝子内で多くの多型性の組合せを含む。これらは、表４に詳述されている。ハプロタイプＣは、−４７位置でのＴ、４６位置でのＧ、７９位置でのＣおよび５２３位置でのＡ、の存在により最低限に定義される。５２３位置でのヌクレオチドの変化は同意義であるので、−４７、＋４６および＋７９位置単独における変異体の組合せによりハプロタイプＣを区別することは、合理的である。これらの多型性は、−４７においてＣｙｓ／Ａｒｇの変化、アミノ酸１６残基においてＧｌｙ／Ａｒｇの変化およびアミノ酸２７残基においてＧｌｎ／Ｇｌｕの変化(表６)があるように、アミノ酸の変化をもたらす。

同様に、ハプロタイプＡ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥを含む変異体は、本明細書中で表４に記述されている。１位は、コード領域の中で最初のヌクレオチドであり、そしてＡＴＧのＡに相当する。ＡＴＧに比して負の位置を持つ変異体は、ベータ−上流ペプチドおよび５'ＵＴＲ(表１)の中でコード領域の上流に位置している。ｃＤＮＡの完全配列は、配列番号１に詳述されている。
“イソ型”は、その特定の配列および／もしくは構造により他の型と区別される、遺伝子、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡまたはそれによりコード化されるタンパク質の特定の型である。

ＲＮＡ、ＤＮＡ、オリゴヌクレオチドもしくはタンパク質のような生物学的分子に適用される“単離される”とは、分子がその元の環境から除去されそして、実用的目的のために、望まれない核酸、タンパク質、脂質、炭水化物、または細胞の破片および増殖培地のような他の物質のような他の生物学的分子を含まないことを意味する。一般的には、用語“単離される”は、そのような物質の完全な不存在をまたは水、緩衝液、もしくは塩の不存在を、これらが本発明の方法を実質的に妨害する量で存在しない限り、指すことを意図していない。
“遺伝子座”とは、遺伝子または物理的なもしくは表現型の特徴に相当している染色体のまたはＤＮＡの分子上の位置を指す。

本明細書中で使用される、“核酸”とは、当分野で公知であるとおり、自然に見出される天然の核酸および／または修飾されたバックボーンもしくは塩基を有する修飾された、人工の核酸を含む一本鎖のまたは二本鎖のＤＮＡならびにＲＮＡを指す。

遺伝子座の中で二つもしくはそれ以上の多型性部位についてヌクレオチド対の配列に適用される、“位相の”とは、遺伝子座の一コピー上でこれらの多型性部位に存在するヌクレオチドの組合せが公知であることを意味する。
“多型性部位”は、そこで少なくとも二つの別の配列が集団の中に見出される遺伝子座内の位置である。

本明細書中で同定される多型性部位を記述するには、遺伝子のセンス鎖を便宜上言及する。しかしながら、ＡＤＲＢ２遺伝子を含有している核酸分子が相補的な二本鎖分子であり得ることは、当業者により認識されるであろう。それ故に、センス鎖の上の特定の部位への言及は、相補的なアンチセンス鎖の上の相当する部位をまた指す。いずれかの鎖の上の同一の多型性部位を言及し得て、そして多型性部位を含有している標的領域におけるいずれかの鎖へ特異的にハイブリダイズするためのオリゴヌクレオチドをデザインし得る。それ故に、本発明は、本明細書中で記述されるＡＤＲＢ２のゲノム変異体のセンス鎖に相補的である一本鎖のポリヌクレオチドの使用をまた含む。

“多型性変異体”は、そのヌクレオチドのもしくはアミノ酸の配列が、遺伝子の中の多型性の存在に因り参照配列から変動する遺伝子、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ポリペプチドまたはペプチドである。

“多型性”は、多型性部位において個体の中で観察される配列の変型である。多型性としては、ヌクレオチドの置換、挿入、欠失およびマイクロサテライトが含まれそして遺伝子の発現もしくはタンパク質の機能に検出可能な変型をもたらし得るが、必要ではない。

“一ヌクレオチド多型性(ＳＮＰ)”とは、単一の多型性部位において観察されるヌクレオチドの特異的対を指す。稀な場合には、三つのもしくは四つのヌクレオチドが見出され得る。

“緊縮ハイブリダイゼーション条件”とは、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ(７５０ｍＭ ＮａＣｌ、７５ｍＭクエン酸三ナトリウム)、５０ｍＭリン酸ナトリウム(ｐＨ７.６)、５×デンハート溶液、１０％硫酸デキストラン、および２０ｐｇ／ｍｌの変性し、せん断したサケ精液のＤＮＡを含む溶液の中で４２℃で終夜のインキュベーションに引き続く０.１×ＳＳＣの中で約６５℃でのフィルターの洗浄を指す。

遺伝子座の中で二つもしくはそれ以上の多型性部位についてヌクレオチド対の配列に適用される、“非位相の”とは、遺伝子座の単一のコピーの上でこれらの多型性部位に存在するヌクレオチドの組合せが公知でないことを意味する。

(ＳＮＰおよびハプロタイプを測定する方法)
試料の中でＳＮＰを同定して特性化するための広範囲のアッセイが、現在使用されている。これらとしては、制限フラグメント長の多型性分析(ＲＦＬＰ)、一本鎖立体配座多型性分析(ＳＳＣＰ)(Orita et al. P.N.A.S. USA, 1989, 86: 2766-2770)、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション(ＡＳＯ)(Saiki et al. P.N.A.S. USA, 1989, 86:6230-6234)、オリゴヌクレオチド連結反応アッセイ(ＯＬＡ)(Landegren et al. 1988, Science 241; 1077-1080)、ＡＲＭＳ(増幅不応性変異システム)、プライマー伸長もしくはミニシークエンシングタイプアッセイ(Syvanen et al. 1999; Hum. Mutat. 13:1-10)、TaqMan[登録商標](Livak et al. 1995; Nat. Genet. 9: 341-342)、分子ビーコン(Tyagi et al. 1998; Nat. Biotechnol. 16:49-53)、ヌクレアーゼ(Goldrick 2001; Hum. Mutat. 18;190-204)および構造特異的ヌクレアーゼインベーダー技術(Fors et al. 2000; Pharmacogenomics; 1:219-229)が含まれる。
これらのアッセイからの読取りは、数多くのタイプ：サイズ、電荷もしくは質量等の放射性の、蛍光性の、化学発光性の、酵素性の、分析のいずれかであり得る。

種々の技術プラットホームが、処理能力を増加するために開発されている。数多くのそのようなプラットホームが、例えばWeiner and Hudson in BioTechniques 32; S4-S13 (June 2002)、によりレビューされている。
ＳＮＰのおよびハプロタイプの分析のための大抵のアッセイならびにプラットホームは、ゲノムＤＮＡで始まり、そしてある形の増幅工程を必要とする。

多くのＤＮＡの増幅方法が公知であり、それらの大抵は、酵素連鎖反応(ポリメラーゼ連鎖反応、リガーゼ連鎖反応、もしくは自己持続性配列複製のような)にまたはその中にそれがクローン化されているベクターの全部または部分の複製に依存する。

多くの標的のおよびシグナルの増幅方法が、文献に、例えば、これらの方法の一般的総説がLandegren, U., et al., Science 242:229-237 (1988) and Lewis, R., Genetic Engineering News 10:1, 54-55 (1990)に記述されている。

ＰＣＲは、米国特許第４,６８３,１９５号および第４,６８３,２０２号の中にとりわけ記述されている核酸の増幅方法である。ＰＣＲを用いて、診断状況における任意の公知の核酸を増幅することができる(Mok et al., (1994), Gynaecologic Oncology, 52: 247-252)。自己持続性配列複製(３ＳＲ)は、ＴＡＳの変型であって、それは、酵素カクテルおよび適切なオリゴヌクレオチドプライマー(Guatelli et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874)により仲介される連続数ラウンドの逆転写酵素(ＲＴ)、ポリメラーゼならびにヌクレアーゼ活性を経由して核酸の鋳型の等温増幅を伴う。連結反応増幅反応もしくは連結反応増幅システムは、ＤＮＡリガーゼおよび四つのオリゴヌクレオチド、標的鎖当り二つ、を使用する。この技法は、Wu, D. Y. and Wallace, R. B. (1989) Genomics 4:560により記述されている。Ｑβレプリカーゼ技法では、一本鎖ＲＮＡを複製する、バクテリオファージＱβに対するＲＮＡレプリカーゼを使用して、Lizardi et al. (1988) Bio/Technology 6:1197により記述されるとおり、標的ＤＮＡを増幅する。

別の増幅技術を本発明で利用することができる。例えば、ローリングサークル増幅(Lizardi et al., (1998) Nat Genet 19:225)は、ＤＮＡポリメラーゼにより駆動されそして等温条件下で直線的なもしくは幾何学的な速度論のいずれかで円形のオリゴヌクレオチドを複製することができる商業的に入手可能な(ＲＣＡＴ[登録商標])増幅技術である。さらなる技法、鎖置換増幅(ＳＤＡ；Walker et al., (1992) PNAS (USA) 80:392)は、特異的標的にユニークな特異的に規定される配列で始まる。

種々の増幅技法での使用に適するプライマーを当分野で公知の方法にしたがい作製することができる。特に有用なプライマーは、表２および３に詳述されるように配列を有して本明細書中で記述されている。

Ｃハプロタイプを検出するための組成物は、少なくとも一つのＡＤＲＢ２遺伝子型同定オリゴヌクレオチドを含むことができる。適当には、ＡＤＲＢ２遺伝子型同定オリゴヌクレオチドは、Ｃハプロタイプの一部として本明細書中で記述されている多型性部位に近接して位置している、もしくはそれを含有する、標的領域にハイブリダイズする能力のあるプローブまたはプライマーである。

本明細書中で使用される用語“オリゴヌクレオチド”とは、約１００個以下のヌクレオチドを有しているポリヌクレオチド分子を指す。適当には、本発明のオリゴヌクレオチドは、１０〜３５個のヌクレオチド長である。さらに好ましくは、オリゴヌクレオチドは、長さで１５〜３０個の、そして最も好ましくは２０〜２５個のヌクレオチドである。オリゴヌクレオチドは、任意のリン酸化状態のリボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、および非環式ヌクレオチド誘導体、ならびに他の機能的に同等な誘導体から成り得る。これに代えて、オリゴヌクレオチドは、リン酸エステルを含まないバックボーンを有し得て、それはカルボキシメチル、アセタミデート、カルバメート、ポリアミド(ペプチド核酸(ＰＮＡ))等(Varma, R. in Molecular Biology and Biotechnology、「総合的机上参照文献」(A Comprehensive Desk Reference)、Ed. R. Meyers, VCH Publishers, Inc. (1995), pages 617-620)のような結合から成り得る。

オリゴヌクレオチドは、当分野で公知の任意の適当な方法論を用いる化学合成により作成され得るか、もしくは生物学的試料から、例えば、制限消化により誘導され得る。オリゴヌクレオチドは、放射性標識、蛍光性標識、酵素性標識、タンパク質、ハプテン、抗体、配列標識等の使用を含む、当分野で公知の任意の技法にしたがい、標識化され得る。

本発明の方法で使用の遺伝子型同定のプローブもしくはオリゴヌクレオチドは、その中でハプロタイプＣに特徴的な多型性が位置しているＡＤＲＢ２ポリヌクレオチドの標的領域に特異的にハイブリダイズできなければならない。本明細書中で使用される特異的ハイブリダイゼーションとは、特定のハイブリダイズ条件下で標的領域を持つ逆平行二本鎖構造を、オリゴヌクレオチドが形成されるが、同一のハイブリダイズ条件の下で非標的領域もしくは非ＡＤＲＢ２ポリヌクレオチドとインキュベートするときに、そのような構造を形成しないことを意味する。好ましくは、オリゴヌクレオチドは、従来の高度緊縮条件下で標的領域に特異的にハイブリダイズする。当業者は、ＡＤＲＢ２遺伝子についての公知の配列情報に関連して本明細書中で提供される多型性情報および日常的技法を用いてＡＤＲＢ２遺伝子の中で多型性を検出するために適当なオリゴヌクレオチドのプローブならびにプライマーを、容易にデザインしかつ試験することができる。

オリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドのような核酸分子は、一つの分子のそれぞれのヌクレオチドが他の分子の相当する位置においてヌクレオチドに相補的であるならば、もう一つの核酸分子の“完璧な”または“完全な”補体であると言われる。核酸分子は、それが十分な安定性を持ってもう一つの分子にハイブリダイズして、従来の低緊縮条件下で二重らせん型に留まるならば、その分子に“実質的に相補的で”ある。

従来のハイブリダイゼーション条件は、例えば、「分子クローン化：実験室便覧(第２版」(Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed.)、Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)の中でSambrook等によりおよび［核酸のハイブリダイゼーション、実用的アプローチ］(Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach)、IRL Press, Washington, D.C. (1985)の中でHaymes, B. D.等により記述されている。完璧に相補的なオリゴヌクレオチドが多型性を検出するために好ましいが、完全な相補性からの逸脱は、そのような逸脱は分子が標的領域に特異的にハイブリダイズすることを妨げない場合には、意図されている。例えば、オリゴヌクレオチドプライマーは、その５'末端において非相補的なフラグメントを有して、プライマーの残りは標的領域に相補的であり得る。これに代えて、非相補的なヌクレオチドを、オリゴヌクレオチドのプローブもしくはプライマーの中に、生じたプローブまたはプライマーが標的領域に特異的にハイブリダイズする能力がなおある限り、割り込み得る。

本発明の好ましい遺伝子型同定オリゴヌクレオチドは、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドである。本明細書中で使用される、用語の対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド(ＡＳＯ)とは、十分な緊縮条件下で、多型性部位を含有する標的領域において、遺伝子、もしくは他の遺伝子座の一つの対立遺伝子に特異的にハイブリダイズすることができるが、他の対立遺伝子(複数を含む)中の相当する領域にハイブリダイズしないオリゴヌクレオチドを意味する。当業者により理解されるとおり、対立遺伝子−特異性は、ハイブリダイゼーションおよび洗浄の工程の両方についての塩およびホルムアミドの濃度、ならびに温度を含む、種々の容易に最適化される緊縮条件に依存する。ＡＳＯプローブのために典型的に使用されるハイブリダイゼーションおよび洗浄条件の例は、「ＰＣＲ実験計画、方法および応用への手引き」(PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications) Academic Press, 1990の中でKogan等、「“血友病Ａの遺伝子的予測”」("Genetic Prediction of Hemophilia A")およびRuano et al., 87 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 6296-6300, 1990の中に見出される。典型的には、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドは、一つの対立遺伝子に完璧に相補性的である一方で、もう一つの対立遺伝子については単一のミスマッチを含有する。

異なる対立遺伝子の間で通常良好な識別を提供する対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブは、オリゴヌクレオチドプローブの中心位置が標的領域の中の多型性部位と整列するものである(例えば、１５マーの中でおよそ第７のもしくは第８の位置、１６マーの中で第８のもしくは第９の位置、２０マーの中で第１０のもしくは第１１の位置)。ハプロタイプＣの中で見出されるＡＤＲＢ２遺伝子の多型性を検出するための好ましいＡＳＯプローブは、表２に詳述されるヌクレオチド配列を含む。

特に好ましい態様では、ハプロタイプ同定法は、表２に詳述される配列を有するプライマーの少なくとも一つを使用する。適当には、最低２組のプライマーが使用される。

本発明の対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプライマーは、特定のＳＮＰの唯一つのヌクレオチドに相補的である、３'末端ヌクレオチド、もしくは３'末端から２番目のヌクレオチドを有し、それにより、そのヌクレオチドを含有している対立遺伝子が存在するときにのみ、ポリメラーゼが仲介する伸長のためのプライマーとして作用する。コードもしくは非コード鎖のいずれかにハイブリダイズする対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプライマーは、本発明により意図されている。

本発明の他の遺伝子型同定のオリゴヌクレオチドは、本明細書中で同定される新規な多型性部位の一つの１〜数個のヌクレオチドの下流に位置する標的領域にハイブリダイズする。そのようなオリゴヌクレオチドは、ＡＤＲＢ２遺伝子の多型性を検出するためのポリメラーゼが仲介するプライマー−伸長方法で有用であり、かくして本明細書中で“プライマー−伸長オリゴヌクレオチド”と言われる。好ましい態様では、プライマー−伸長オリゴヌクレオチドの３'−末端は、多型性部位に直ぐ隣接して位置するヌクレオチドに相補的なデオキシクレオチドである。プライマーの伸長により−１４２９、−１０２３、−６５４、−３６７、−４７、−２０、４６、７９、２５２および５２３の位置においてＡＤＲＢ２遺伝子の多型性を検出するための特に好ましいオリゴヌクレオチドプライマーは、表２ならびに３に詳述されるように配列を有しているプライマーからなる群より選択されるヌクレオチド配列において終止する。

ある態様では、組成物は、二つもしくはそれ以上の多型性部位においてヌクレオチドの同一性を同時に精査するための二つもしくはそれ以上の異なって標識された遺伝子型同定オリゴヌクレオチドを含有する。プライマーの組成物は、二つもしくはそれ以上の組の対立遺伝子特異的プライマー対を含有して、多型性部位を含有している二つもしくはそれ以上の領域の同時の標的化および増幅を許容することがまた意図されている。

本発明のＡＤＲＢ２オリゴヌクレオチドは、試料を多型性について迅速にスクリーニングするための規則正しいアレイを提供するように固体表面の上に配列され得る。アレイ技法は当分野で公知でありそして、例えば、ＷＯ９８/２００２０およびＷＯ９８/２００１９の中に記述されている。

一つの態様では、ＡＤＲＢ２ハプロタイプの検出は、正確な診断もしくは処置計画の決定のために他のＳＮＰまたはハプロタイプの検出と組合わされ得る。適当な組合せは、例えば、代謝のおよび輸送体の遺伝子ならびに／もしくはβ２アゴニストへの応答経路に関与する他の遺伝子、のような他の呼吸器疾患に関連する遺伝子を含む。

遺伝子型同定法の一つの態様は、個体に存在する、二つのコピーのＡＤＲＢ２遺伝子、もしくはそのフラグメントを含む核酸混合物を個体から単離し、そして二つのコピーの中で図１で同定される一つもしくはそれ以上の位置においてヌクレオチド対の同一性を決定して、個体にＡＤＲＢ２伝子型を割り当てることを含む。当業者により容易に理解されるとおり、個体の中の遺伝子の二つの“コピー”は、同一の対立遺伝子(同型接合型)であり得るかもしくは異なる対立遺伝子(異型接合型)であり得る。

典型的には、血液試料もしくは組織試料のような、個体から取られる生物学的試料から、核酸混合物を単離する。適当な組織試料としては、全血、精液、唾、涙、尿、糞便、汗、口腔、皮膚および髪の毛が含まれる。核酸混合物は、ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、もしくはｃＤＮＡから成り得てそして、後者の二つの場合には、生物学的試料を、ＡＤＲＢ２遺伝子が発現される器官から取得しなければならない。さらに、ｍＲＮＡもしくはｃＤＮＡの標本を、イントロンの中にまたは５'および３'非転写領域の中に位置する多型性を検出に用いないことは、当業者により理解される。ＡＤＲＢ２遺伝子のフラグメントが単離されるならば、それは遺伝子型同定されるべき多型性部位(複数を含む)を含有しなければならない。

さらに下で記述されるように、本発明者等は、長時間作用型β２アゴニストに対する患者の気管支拡張応答がハプロタイプＣの存在を同定することにより予測され得ることを、本明細書中で発見している。これは、ＡＤＲＢ２遺伝子の中の多型性部位の三箇所のみ、即ち−４７(Ｔ)、４６(Ｇ)および７９(Ｃ)を遺伝子型同定することにより決定され得る。

かくして、本発明はまた、長時間作用型β２アゴニストに対する個体の応答を予測するための診断キットを提供する。一つの態様では、キットは、ＡＤＲＢ２遺伝子の中のハプロタイプＣを遺伝子型同定するためにオリゴヌクレオチドを遺伝子型同定するセットを容器の中に包装されて含む。キットは、オリゴヌクレオチドが対立遺伝子特異的プローブとして使用されるとき、ハイブリダイゼーション緩衝液、もしくは多型性部位がプライマー伸長により検出されるとき、ジデオキシヌクレオチド三リン酸(ｄｄＮＴＰ)のような他の成分をまた含み得る。キットは、ポリメラーゼおよびポリメラーゼにより仲介されるプライマー伸長のために最適化された反応緩衝液をまた含有し得る。好ましいキットは、ビオチンでもしくは蛍光で標識されたオリゴヌクレオチドまたはｄｄＮＴＰならびに／または酵素で標識された抗体ならびに酵素の作用を受けたときに、検出可能なシグナルを発生する一つもしくはそれ以上の基質のような、検出試薬をまた含み得る。好ましい態様では、キットの中の遺伝子型同定オリゴヌクレオチドのそれぞれおよび全ての他の試薬は、ハプロタイプＣを検出するための遺伝子型同定アッセイにおける最適な性能について品質試験されており、そしてキットはまた、アッセイを実施してかつ結果からＡＤＲＢ２ハプロタイプ対を割り当てるための指示書を含有する。遺伝子型同定アッセイを実施するための遺伝子型同定するオリゴヌクレオチドおよび試薬のセットは、生物学的なもしくは化学的な活性を保存しそしてアッセイで適当な使用を可能にするのに適切であるならば、容器中に置かれる別々の入れ物の中で提供されることは、当業者により理解される。

異なるハプロタイプに特徴的である多型性部位において多型性を検出することに加えて、特定の他の多型性部位が上流もしくは下流の他の多型性の存在を非常に予測する、即ち、それらは個体中で連結され；それらは常に一緒に遺伝されることが認識される。したがって、異なる部位でもう一つの連結された多型性を同定することにより特定のハプロタイプの存在を検出することは、本発明の範囲内にある。これは、特定のハプロタイプ内の興味ある対立遺伝子に特異的に結合するプローブに加えて、本発明がまた連結される多型性を検出することを含むことを意味する。

もう一つの態様では、ハプロタイプＣの存在の決定は、アミノ酸変化のＧｌｙ１６ＡｒｇおよびＧｌｎ２７Ｇｌｕを有しているハプロタイプＣに相当しているｃＤＮＡから発現されるタンパク質型に特異的に結合する抗体を使用することにより成し得る。適当な抗体を作成するためのおよび試料へのそれらの結合を検出するための方法は、当業者に周知である。

(ハプロタイプの存在を検出することの使用)
下でさらに詳細に開示されるように、ＡＤＲＢ２Ｃハプロタイプの少なくとも一つのコピーの存在は、長時間作用型β２アゴニストに対する臨床的に有意な気管支拡張剤応答の予測である。かくして、本発明は、気管支痙攣の長期間処置のためにβ２アゴニストを処方する際に有用である。ハプロタイプの情報を使用して、適当な薬物処置計画を決定することができる。本明細中で開示されるとおり、ハプロタイプＣの存在は、長時間作用型ベータアゴニストでの処置に対して、“非Ｃ”個体において観察されるより、さらに長い持続時間の応答をもたらす。本明細中で開示されるように、ハプロタイプＣの存在は、息切れ、咳嗽および喀痰の症状の臨床的に有意な低減と相関した。Ｃハプロタイプ群の患者の間でＢＣＳＳ応答の差は、非Ｃハプロタイプサブグループの患者に対する応答よりも統計的に優れていた。したがって、医師は、ハプロタイプの情報を使用して、用いられるべき正確な薬物、最適な処置のための投与量、および薬物処置を施すべき頻度等を決定し得る。

ハプロタイプの状態は、薬物の動態、有効性、耐容性および安全性の予測にまた有用であり得る。そのような情報の提供は、個人用医薬品を可能にする。臨床試験への薬理遺伝学の導入は、特異的な群の患者に対してさらに安全でかつさらに効果的な治療の期待を増加する。

当業者が本発明を行う補助として役立つことを意味し、そして本発明の範囲を限定することを決して意図しない、実施例を介して、本発明をここでさらに記述する。

実施例１
四つのViozan[登録商標]の第三相臨床試験、即ちＳＣ−３９７−５０９７、ＳＣ−３９７−５０９８、ＳＣ−３９７−５０９９およびＳＣ−３９７−５１６３で、集められた２４５０名の患者から、遺伝子型同定用の試料を取った。患者集団は、安定なＣＯＰＤ、≧２年間の症状、および少なくとも１５箱年数の喫煙経暦を持つ、４０〜８０歳の、男性ならびに女性の患者を含んだ。気管支拡張剤投与前および投与後のＦＥＶ１／ＦＶＣ(努力性肺活量)が予想正常の＜６５％ならびに気管支拡張剤投与前および投与後ＦＥＶ１が予想正常の２０〜７０％を示している患者が試験に含まれた。患者集団についてのさらなる詳細、および試験のデザインは、Laursen et al. Respiratory Medicine (2003), Vol 97, Suppl A, S23-S33の中に記述されている。遺伝学の部分試験への参加は任意であった。患者に、遺伝的分析についての別の書面によるインフォームドコンセントを与えた。患者全員、Viozan[登録商標]に対する応答を研究するのに使用のためにＤＮＡを提供することに同意した。Viozan[登録商標]は、β２−アドレナリン受容体のおよびドーパミンＤ２受容体の遺伝子を標的にしている、ＣＯＰＤの処置のために開発された(Rennard, 2003, Respiratory Medicine, Vol 97, Suppl A, S1-S2)、二重アゴニストである。

ＡＤＲＢ２遺伝子型同定のための方法
コード領域および５'プロモーター領域(図１)に位置する、アドレナリン受容体の中の１４個のＳＮＰについての遺伝子型を、TaqManもしくはSNaPshot(Applied Biosystemsにより支援される遺伝子型同定の方法論)のいずれかを用いて決定した。遺伝子型同定されたＳＮＰの位置を表１にまとめている。ＳＮＰの位置は、その配列が配列番号１に詳述されているｃＤＮＡの参照配列Ｍ１５１６９に基づいていて、ヌクレオチドの位置は、ＡＴＧおよびＡ＝＋１に対してであり、そして負の数は翻訳開始コドンに対する５'位置を示す。対立遺伝子の頻度は、９８％白人であった臨床試験の集団に基づいている。

TaqManの遺伝子型同定を、Assays-by-Designサービスの下でＡＢＩから得られた試薬を用いて標準条件下に実施した。TaqManにより遺伝子型同定された１２個の２ＡＤＲＢ２ ＳＮＰのためのＰＣＲプライマーおよび対立遺伝子特異的プローブを表２にまとめている。SNaPshotの遺伝子型同定を用いて、二つの別なＳＮＰ(ａｚ０００３８７３およびａｚ０００３８７５)を遺伝子型同定して、それについてＰＣＲプライマーならびにプライマー伸長プローブを表３(二つのフォワードＰＣＲ、配列番号５０、５１；二つのリバースＰＣＲ、配列番号５２、５３；二つのSNaPshotリバースプライマー、配列番号５４、５５)にまとめている。ＳＮＰ ａｚ０００３８７３のアッセイを最適化しないで、そして遺伝子型データを全てのその後の解析に用いなかった。ＳＮＰ ａｚ０００３８７３は、1％の頻度で以前に報告されている(例えば、Am J Respir Cell Mol Biol. 1993 Mar;8(3):334-9を参照)。

(連鎖不均衡解析のための方法)
対様連鎖不均衡の尺度をＥＨ(Xie, Ott, Am J Hum Genet, suppl, 53,1107 (1993))の修飾バージョンを用いてＡＤＲＢ２の中の１４個のＳＮＰの中から１２個について計算した。ＳＮＰ番号ａｚ０００３８７３およびａｚ０００３８７５を解析に用いなかった。遺伝子型データをａｚ０００３８７３について得なかった。この臨床試験集団の中で低い対立遺伝子頻度に基づいて、ＳＮＰ ａｚ０００３８７５を除外した。大部分の遺伝子に亘って高程度の連鎖不均衡があるが、しかしながらこの連鎖不均衡は、遺伝子の３'末端で分解する。それ故に、両方とも同義のＳＮＰであるＳＮＰ番号ａｚ０００３８７７およびａｚ０００３８７８を、全てのその後の解析から除外した。

(ハプロタイプ解析およびハプロタイプ対の割り当てのための方法)
解析された１４個のＡＤＲＢ２ ＳＮＰの中から、１０個のＳＮＰについての遺伝子型データをＡＤＲＢ２ハプロタイプの割り当てに用いた。ＳＮＰ番号ａｚ０００３８７３およびａｚ０００３８７５についてのデータを、低い対立遺伝子頻度に基づいて除外した。両方とも同義のＳＮＰであるＳＮＰ番号ａｚ０００３８７７およびａｚ０００３８７８を、連鎖不均衡が遺伝子の３'末端で弱かったので、ハプロタイプ解析から除外した。これらの二つの３'ＳＮＰの包含は、予測される稀なハプロタイプの数を増加する作用を持った。

SNPHAPパッケージ(http://www-gene.cimr.cam.ac.uk/clayton/software/)を用いて、０.３％レベル以上でハプロタイプを予測した。０.３％の切捨てを選んで、予測されたハプロタイプを持つ個体の数を最適化し、そして稀なハプロタイプの数を低減した。これは、０.３％以上の頻度を持つ５個の共通なハプロタイプをもたらし、そして２４１２名の対象についてハプロタイプ対を予測した。

遺伝子型同定された２４５０名の対象の中で、５個の共通なハプロタイプが、臨床試験集団(９８％白人)の中で９９％のハプロタイプ多様性を占めると見出された。５個の最も共通なハプロタイプについてのハプロタイプ頻度、およびこれらのハプロタイプの中でそれぞれのＳＮＰにおけるヌクレオチド変異体を、表４にまとめている。

ハプロタイプ対をそれぞれの対象に割り当てた。５個の最も共通なハプロタイプに基づいて、３８名を除く全員の対象にハプロタイプ対を割り当てた。残りの対象は、少なくとも一つの稀なハプロタイプを有した(＜０.３％)。それぞれのハプロタイプ対の観察された頻度を、表５にまとめている。

(ＡＤＲＢ２遺伝子型およびViozan[登録商標]に対する応答の相関)
５'リーダーシストロン(ベータ−上流ペプチド、ＢＵＰ)中で二つの非同義のＳＮＰ、ａｚ０００３８７１およびａｚ０００３８７２、ならびにＳＮＰのａｚ０００３８６９のそれぞれにおけるアミノ酸変異体は、表６にまとめられているとおり、ＡＤＲＢ２ハプロタイプの間で異なる。β２アゴニスト薬物、Viozan[登録商標]、に対する応答を、ＡＤＲＢ２遺伝子の中の一ＳＮＰと、ハプロタイプ対とおよび‘貯蔵した(binned)’ハプロタイプ群と相関した。例えば、‘Ｃ’ハプロタイプの一つもしくはそれ以上のコピーを含有する対象は、一緒に群分けされ(Ｃハプロタイプ群)、そして‘Ｃ’ハプロタイプのコピーを持たない対象(非Ｃハプロタイプ群)と応答を比較した。

実施例２−ハプロタイプ−肺の機能解析
投与前および投与後の、ＦＶＣ策略の最初の１秒間に吐き出された空気の容積(リットルで表わされた)であるＦＥＶ１(一秒量)の測定を臨床試験計画書に記述されるように、患者全員についてそれぞれの試験来院において行った。肺活量測定を、それぞれのセンターにおいて標準的技法を用いて実施した。使用した肺活量計および検量記録についてのデータは、それぞれのセンターにより提供された。１５分間の休憩の後で、低速肺活量(ＳＶＣ)、努力性肺活量(ＦＶＣ)およびＦＥＶ１を少なくとも三つの別々の策略について測定した。それぞれのパラメターについての最大値を記録した。

患者(それらの全員は、吸入したＳＡＢＡサルブタノール４００μｇに応答してＦＥＶ１の≧５％可逆性を示した)のサブセットでは、８時間(投与後８時間まで、５、１５、３０、４５、６０、９０、および１２０分ならびにその後１時間毎に)に亘って一連のＦＥＶ１測定を行った。１日目(試験ＳＣ−３９７−５０９７およびＳＣ−３９７−５０９８)、８および１２週目(ＳＣ−３９７−５０９８)ならびに１４および２６週目(ＳＣ−３９７−５０９７)に一連のＦＥＶ１測定を行った。ＡＵＣ_０〜８、８時間における平均ＦＥＶ１および投与前(最大ＦＥＶ１)からの平均最大変化(ＦＥＶＡｍａｘ)を計算した。これらの測定を用いて、長時間作用型β２アゴニストであるViozan[登録商標]の気管支拡張特性を検討した。

図２は、ＡＤＲＢ２ハプロタイプ対により層別化された、治験ＳＣ−３９７−５０９７およびＳＣ−３９７−５０９８における、患者の中の一連のＦＥＶ１応答を示している。ハプロタイプ対は、ＡＡ(Ｎ＝２１)；ＡＣ(Ｎ＝１５)；ＢＡ(Ｎ＝３５)；ＢＢ(Ｎ＝１３)；ＢＣ(Ｎ＝２１)である。ＣＣ群を解析から除外した。Viozan[登録商標]への最初の暴露における一連のＦＥＶ１を、上で記述するように、解析した。Viozan[登録商標]に対する応答を、処置後５分で観察した。ＦＥＶ１は、処置後２時間までの間連続して増加した。最大増加は、試験薬物後１〜２時間においてであった。８時間におけるＦＥＶ１は、Viozan[登録商標]での処置の作用の持続時間を示す。およそ１００ｃｃの差が、ＡＤＲＢ２ハプロタイプ対により層別化されたサブグループの間に観察された。ＣＯＰＤでの肺機能の乏しい可逆性に因り、５０ｃｃのシフトは、臨床的に有意であると考えられる。ＬＡＢＡに対する応答の大きさ(最大ＦＥＶ１)、および作用の持続時間(８時間におけるＦＥＶ１)の両方は、特定のＡＤＲＢ２ハプロタイプを持つ対象においてさらに大きいと立証されている。ＡＵＣ(曲線下面積)解析は、最大ＦＥＶ１および８時間におけるＦＥＶ１応答と相関する。さらに高い最大ＦＥＶ１および８時間におけるＦＥＶ１を持つ患者は、さらに高いＡＵＣ_０〜８値をまた有する。最大の応答は、ＢＣハプロタイプを持つ患者において得られた。ＢＢハプロタイプ対を持つ患者は、ＬＡＢＡに応答したが、応答は他のハプロタイプ対を持つ対象におけるそれより“さらに小さい”であった。これは、ハプロタイプの４／６および４／４がＢＣおよびＢＢにそれぞれ相当する、Drysdale et al. PNAS, 97, 2000により公表された試験と広く一致する。

一連のＦＥＶ１の測定は、少数の対象だけに対して入手可能であるので、そして解析の力を増加するために、それぞれの患者のハプロタイプ対；“Ｃ”ハプロタイプ(即ち、‘Ｃ’ハプロタイプの少なくとも一つのコピーを有する患者)および非Ｃハプロタイプ(即ち、‘Ｃ’ハプロタイプのコピーを何も持たない患者)に基づいて、データを二つのサブグループ(‘貯蔵している’)において引き続いて解析した。‘Ｃ’ハプロタイプ群は、ハプロタイプＡＣ、ＢＣおよびＣＣを持つ患者を含んだ一方で、非Ｃハプロタイプ群は、ハプロタイプＡＡ、ＢＢおよびＡＢを持つ対象を含んだ。‘貯蔵された’ハプロタイプ解析については、ハプロタイプＤおよびＥの一つもしくはそれ以上のコピーをもつ対象を、これらのハプロタイプ対を持つ対象が殆ど無かったので、含まなかった。

ＡＤＲＢ２ハプロタイプおよび長時間作用型ＦＥＶ１応答の間の関係の評価を、処置前および投与前のベースラインを比較することにより達成した。“処置前”ＦＥＶ１ベースラインは、試験薬物に何も以前の暴露が無いことであり、そしてViozan[登録商標]での処置直前に、１日目(２回目の来院)に測定された。“投与前”ＦＥＶ１ベースラインは、治験のコースの間で、次の来院日、即ち、８および１２週目(ＳＣ−３９７−５０９８)ならびに１４および２６週目(ＳＣ−３９７−５０９７)に、薬物の投与前に測定されたものである。一連のＦＥＶ１患者において、これらの試験のコースに亘るベースライン(トラフ)ＦＥＶ１の変化の解析は、ベースラインがＣ−ハプロタイプサブグループで増加し、そしてＣ−ハプロタイプの一コピーを欠如するそれらの対象で僅かに減少する傾向を説明している。これは、３ヶ月および６ヶ月の処置期間の両方に亘る、二つの別々の治験において観察された。観察は、Ｃハプロタイプサブグループにおける延長された気管支拡張ならびにViozan[登録商標]および長時間作用型β２アゴニストでの規則的な処置に応答する優れた長期間全体の肺機能についての傾向と一致する。

最初の処置およびそれに続く３ヶ月のViozan[登録商標]処置の間の一連のＦＥＶ１応答の解析を、２回目の来院(１日目)に収集された絶対的なＦＥＶ１の測定ならびに１２週目(ＳＣ−３９７−５０９８)および１４週目(ＳＣ−３９７−５０９７)についての合併されたデータから処置前ベースライン(２回目の来院)を差し引くことにより決定した。図４は、試験ＳＣ−３９７−５０９８およびＳＣ−３９７−５０８７についての合併された一連のＦＥＶ１データ、処置前からの変化を示し、そこでは応答は、ハプロタイプ群(最初の来院−Ｃハプロタイプ：Ｎ＝３６；最初の来院−非Ｃ：Ｎ＝６５；３ヶ月−Ｃハプロタイプ：Ｎ＝２９；３ヶ月−非Ｃハプロタイプ：Ｎ＝５４)により層別化されている。図４は、非Ｃハプロタイプを持つ患者は３ヶ月後にさらに貧弱な応答を有し得ることを示唆する。１日目(２回目の来院)における一連のＦＥＶ１応答は、‘Ｃ’ハプロタイプサブグループの中の患者について、処置後３ヶ月におけるそれと重ねる。同様な応答は、１日目(２回目の来院)における非Ｃハプロタイプ群について観察される。しかしながら、非Ｃハプロタイプ群における、一連のＦＥＶ１応答は、処置の３ヵ月後に低減されているように見える。この観察は、‘Ｃ’ハプロタイプのおよび‘非Ｃ’ハプロタイプのサブグループの間で観察された示差ＦＥＶ１ベースラインの反映である。ＡＤＲＢ２ハプロタイプ対による肺機能応答の層別化は、β２アゴニストに対する応答がさらに大きく、そして‘Ｃ’ハプロタイプを持つＣＯＰＤ患者において、長期間処置の間に維持されることを示唆する。ＬＡＢＡの薬物は、ＡＤＲＢ２‘Ｃ’ハプロタイプの少なくとも一つのコピーを持つＣＯＰＤ患者において、延長された作用持続時間を介して、さらに大きい気管支保護を提供し得る。

まとめると、これらのデータは、少なくとも一つの‘Ｃ’ハプロタイプを保持する個体全員がViozan[登録商標]に対して優れた臨床的応答を有する一貫した傾向を立証している。‘Ｃ’ハプロタイプを持つ対象は、Viozan[登録商標]に対して最良の初期応答を有した。ハプロタイプ対のＢＣは、薬物への最初の暴露の上で達成される最大の最高ＦＥＶ_１を有すると見出された。‘Ｃ’対‘非Ｃ’ハプロタイプ群における、延長された作用持続時間(残存気管支拡張)が、二つの独立した有効性治験においてViozan[登録商標]で処置された対象の中での投与前のＦＥＶ_１測定の評価により示唆されている。

実施例３−ハプロタイプ−症状スコアの相関
ＣＯＰＤ症状の変化を、ＴＳＳ(総症状スコア)とも言われる、ＢＣＳＳ(息切れ、咳嗽および喀痰のスコア)を用いて評価した。息切れ、咳嗽および喀痰である、それぞれの症状を、患者により毎日評価しそして５点Likertスケール(０〜４の範囲で、高い値は重篤な症状を示す)を用いて日記に記録した。三項目のスコアを合計して、ＢＣＳＳの総スコアを計算し、０〜１２の値をもたらした。ＣＯＰＤの中で症状を評価するためのＢＣＳＳの信頼性および有効性はLeidy et al, 2003, Respiratory Medicine, Vol 97, SupplA, S59-S70に議論されている。ＢＣＳＳの総スコアの上の±１点の平均変化は、中程度〜重症のＣＯＰＤを持つ患者について症状の重症度の実質的な改良を表している(Celli et al. Respiratory Medicine, (2003) Vol 97, SupplA, S35-43)。

図５は、ＡＤＲＢ２ハプロタイプ対により層別化された患者のサブグループについてＢＣＳＳベースラインからの変化を示している。患者をViozan[登録商標]で処置した。ハプロタイプ対は、ＡＡ(Ｎ＝６１)；ＡＣ(Ｎ＝３５)；ＢＡ(Ｎ＝１００)；ＢＢ(Ｎ＝４０)；ＢＣ(Ｎ＝４１)；ＣＣ(Ｎ＝８)であった。ベースラインからの変化が、１２週治験(ＳＣ−３９７−５１６３)における患者について示されて、そこでは２週間の間隔に亘る平均ＢＣＳＳスコアが、それぞれのハプロタイプ対について示されている、(F−upは処置後４週間の追跡期間である)。応答の幅広い層別化が、ハプロタイプ対に依存して観察された。ＢＣＳＳ応答の層別化は、１〜２週目に観察されそして処置のコースを通して維持された。ＢＣＳＳの０.３単位の差は、臨床的に有意であると考えられる。この故に、最良の応答を示すサブグループ(ＢＣ、ＣＣおよびＡＣ)および低い応答の患者(サブグループＡＡおよびＢＡ)との間の差は臨床的に妥当である。Ｃハプロタイプの少なくとも一コピーを持つ対象は、症状において最大の低減を示すように見えるので、上に(実施例２)記述した、‘貯蔵された’ハプロタイプ群を用いて、データを解析した。

図６は、試験ＳＣ−３９７−５１６３においてViozan[登録商標]で処置した患者についての、ＢＣＳＳ、ベースラインからの平均変化を示し、そこでは患者はサブグループの中に層別化されている。Ｃハプロタイプ(Ｎ＝８４)のおよび非Ｃハプロタイプ(Ｎ＝２０１)のサブグループにおけるＢＣＳＳ応答を、非層別化の患者集団(全ハプロタイプ、Ｎ＝２８５)における平均応答と比較することができる。図６は、少なくとも一つの‘Ｃ’ハプロタイプを持つ患者はViozan[登録商標]に対してさらに良く応答することを示している。ＣハプロタイプサブグループにおけるＢＣＳＳ応答は、通算平均応答(患者全員)より優れて、そして非ＣハプロタイプサブグループにおけるＢＣＳＳ応答より有意に優れていた。‘Ｃ’ハプロタイプを持つ患者は、Viozan[登録商標]で処理されたときに、症状スコアのさらに大きい低減を経験した。

ＢＣＳＳ応答の層別化は、一つの独立した３ヶ月有効性治験、ＳＣ−３９７−５０９８において再現されたが、６ヶ月有効性治験、ＳＣ−３９７−５０９７においては再現されなかった。図７は、二つの３ヶ月有効性試験についてのデータが合併されている、ＢＣＳＳ応答を示す(患者がサブグループの中に層別化されている、Viozan[登録商標]試験ＳＣ−３９７−５１６３およびＳＣ−３９７−５０９８における患者について、ＢＣＳＳ、ベースラインからの平均変化)。Ｃハプロタイプおよび非ＣハプロタイプのサブグループにおけるＢＣＳＳ応答を、非層別化の患者集団における平均応答と比較することができる。図７Ａは、Viozan[登録商標]で処置された対象全員についての平均応答、および患者がＡＤＲＢ２‘Ｃ’ハプロタイプの存在もしくは不存在に基づいて層別化される後でのＢＣＳＳ応答を示す。図７Ａは、Ｃハプロタイプ(Ｎ＝１６７)、非Ｃハプロタイプ(Ｎ＝３７０)、全ハプロタイプ(Ｎ＝５３７)についてのデータを示す。‘Ｃ’ハプロタイプ(ＡＣ、ＢＣ、ＣＣ)を持つViozan[登録商標]患者は、‘非Ｃ’ハプロタイプ(ＡＡ、ＢＢ、ＢＡ)に比較して平均ＢＣＳＳの０.６までの低減を有する。図７Ｂは、プラセボで処置した患者について同一の解析を示しそしてプラセボ応答の層別化の証拠は殆ど無いことを立証している。図７Ｂは、Ｃハプロタイプ(Ｎ＝１４１)、非Ｃハプロタイプ(Ｎ＝２６５)、全ハプロタイプ(Ｎ＝４０６)についてのデータを示す。ＡＤＲＢ２ハプロタイプによる層別化は、Ｃハプロタイプの少なくとも一コピーを持つ患者が優れた症状スコアを有する傾向があることおよびこれが処置のコースを通して維持されることを立証している。Ｃハプロタイプ群は、この臨床試験集団のおよそ３０％を占めている。この故に、患者のおよそ３０％は、平均プラセボ応答と比較するときに、Viozan[登録商標]に対して臨床的に有意なＢＣＳＳ応答を有する。

Viozan[登録商標]での大規模臨床検討の一次評価項目の一つは、平均ＢＣＳＳにおける、処置期間の最終４週間目への、ベースラインからの変化であった。非層別化患者の集団では、Viozan[登録商標]のおよびプラセボの処置群の間での、処置期間の最終４週間目へのベースラインからの変化の差は、統計的に有意でもなく、臨床的な重要性を持つとも考えられなかった。患者がＡＤＲＢ２Ｃハプロタイプの存在もしくは不存在に基づいて層別化された、同一のデータの解析は、Ｃハプロタイプの少なくとも一つのコピーを持つ対象がViozan[登録商標]に対して良好に応答したことを例示する。Ｃハプロタイプサブグループにおける、Viozan[登録商標]に対する応答は、非Ｃハプロタイプサブグループにおける応答より有意に優れておりそしてプラセボに対する応答より有意に優れていた。図８は、Ｃハプロタイプおよび非Ｃハプロタイプのサブグループの間でのならびにViozan[登録商標]およびプラセボの処置の間でのＢＣＳＳ応答の統計的比較を示す。図８は、Viozan[登録商標]Ｃハプロタイプ(Ｎ＝１６７)、Viozan[登録商標]非Ｃハプロタイプ(Ｎ＝３６９)、プラセボＣハプロタイプ(Ｎ＝１４１)およびプラセボ非Ｃハプロタイプ(Ｎ＝２６５)についてのデータを示す。Viozan[登録商標]Ｃのおよび非Ｃのハプロタイプの間の差は高度に有意である(ｐ＝０.００２３)。

(まとめ)
一つもしくはそれ以上の‘Ｃ’ハプロタイプを持つ患者は、臨床結果の肺機能およびＢＣＳＳ尺度の両方について、非Ｃハプロタイプの個体より、Viozan[登録商標]に対してさらに良好に応答する。我々は、ＡＤＲＢ２ハプロタイプおよびViozan[登録商標]で処置されたＣＯＰＤ患者における症状の低減との間に統計的に有意な関連を示している。Ｃハプロタイプ群におけるＣＯＰＤ症状の改善は、Viozan[登録商標]非Ｃハプロタイプ群およびプラセボＣハプロタイプ群におけるそれより有意にさらに大きい。

ＢＣＳＳスコアは、ＦＥＶ１およびＳＧＲＱ(Leidy et al, 2003, Respiratory Medicine, Vol 97, SupplA, S59-S70)を含むＣＯＰＤ管理における介入療法の有効性の他の尺度と良く相関している。この故に、規定されたＡＤＲＢ２ハプロタイプを持つ、ＣＯＰＤ対象の３０％までが、β２−アゴニストに対して臨床的に有意なＢＣＳＳ応答を有するという観察は、有意である。気管支拡張の増加した持続時間についての傾向は、ＬＡＢＡへの規則的な暴露の後で、Ｃハプロタイプサブグループにおける改良された長期間の肺機能の観察と一致している。

本試験では、応答するサブグループが患者の３０％を占めている。‘応答者群’の中の対象の比率は、白人の出身である臨床試験集団の９８％と一致している。応答者群のサイズは、Ｃハプロタイプがさらに高い頻度を有する、集団においてさらに大きいと期待される。例えば、アフリカ系アメリカ人では、Ｃハプロタイプが最も一般的なＡＤＲＢ２ハプロタイプである(Drysdale et al.)。

Drysdale et al.は、ＡＤＲＢ２ハプロタイプおよび肺機能により評価されるとおり、喘息における短時間作用型β２アゴニスト、アルブテロールに対する応答との間の相関を報告した。その研究では、最良の応答が４／６のハプロタイプで観察された。これは、ＢＣハプロタイプが最良の応答を示している、長時間作用型β２アゴニスト、Viozan[登録商標]について本明細書中で提示される結果と一致している。同様に、最低の応答が、ＢＢハプロタイプとのViozan[登録商標]結果に相当している４／４のハプロタイプで観察され、そして中間の応答が、ＡＡハプロタイプでのViozan[登録商標]結果に相当している２／２のハプロタイプで観察された。

したがって、これは、長期維持治療へのＣＯＰＤ集団におけるβ２−アゴニストに対する応答の薬理遺伝学的層別化の最初の例である。データは、規則正しいスケジュールのβ２−アゴニストでの長期処置に最適に応答する、ＣＯＰＤ患者の集団を遺伝子型同定アプローチを用いて同定できることを立証している。Ｃハプロタイプサブグループは特に、Ｃハプロタイプ群に比較してｂ２−アゴニストに対する応答の延長された持続時間を示すように見える。患者のＡＤＲＢ２ハプロタイプの知識を用いて、個体の患者についてのｂ２−アゴニストの投与量および処置計画を最適化することができて、この故にＣハプロタイプの一つもしくはそれ以上のコピーを持つこれらの個体への通算の薬物負荷および暴露を低減することができた。

(表)
上記で言及した表１〜６をここで提供する。

(配列)
配列番号１
ＡＤＲＢ２ ｃＤＮＡ配列(Ｍ１５１６９)；長さ：３４５１

配列番号２〜配列番号１３
表２：ＶＩＣプローブ配列

配列番号１４〜配列番号２５
表２：６ＦＡＭプローブ配列

配列番号２６〜配列番号３７
表２：フォワードプライマー配列

配列番号３８〜配列番号４９
表２：リバースプライマー配列

配列番号５０〜配列番号５１
表３：ＰＣＲフォワード配列

配列番号５２〜配列番号５３
表３：ＰＣＲ逆配列

配列番号５４〜配列番号５５
表３：SNaPshotプライマー逆配列

図１は、遺伝子のコード領域、５'ＵＴＲおよび３'ＵＴＲ領域の中で多型性の相対位置を示しているＡＤＲＢ２遺伝子の概略図を示す。 図２は、Viozan[登録商標]の臨床試験に集められた患者のサブセットにおける一連のＦＥＶ１分析の結果を示す。応答がＡＤＲＢ２ハプロタイプ対により層別化されている、Viozan[登録商標]での最初の処置来院において、一連のＦＥＶ１応答を測定した。 図３は、３ヶ月(ＳＣ−３９７−５０９８)のおよび６ヶ月(ＳＣ−３９７−５０９７)の臨床試験のコースに亘り投与前ベースラインにおいて測定されたＦＥＶ１を示す。この図は、最初の来院時の処置前ベースライン(ＦＥＶ１)と、次の来院時の投与前ＦＥＶ１(トラフＦＥＶ１)を比較した変化を例示する。‘Ｃ’ハプロタイプの一つもしくはそれ以上のコピーの存在に依存して、患者をグループ分けする。 図４は、３ヶ月および６ヶ月の有効性試験において作成された合併した一連のＦＥＶ１データを示す。グラフは、‘Ｃ’ハプロタイプの少なくとも一つのコピーを持つものおよび残りの‘非Ｃ’ハプロタイプの対象に層別化された対象について最初の来院時および３ヶ月の処置後の一連のＦＥＶ１応答を示す。 図５は、Viozan[登録商標]で処置されそして、３ヶ月の有効性治験(ＳＣ−３９７−５１６３)のコースに亘り、ＡＤＲＢ２ハプロタイプ対に基づいてサブグループに層別化されている患者についてベースラインＢＣＳＳ(息切れ、咳嗽および喀痰のスコア)からの変化を示す。 図６は、Viozan[登録商標]に対する応答がＡＤＲＢ２‘Ｃ’ハプロタイプの存在に基づいて二つのサブグループに層別化されている、３ヶ月の治験(ＳＣ−３９７−５１６３)に亘りベースラインからＢＣＳＳの平均変化を示す。 図７は、層別化されていない患者の集団(全ハプログループ)の中の平均応答と比較して、Ｃハプロタイプの存在にもしくは不存在に基づいて、２つのグループに層別化されている患者のサブグループについてベースラインＢＣＳＳ(息切れ、咳嗽および喀痰のスコア)からの平均変化を示す。患者がＣハプロタイプのおよび非Ｃハプロタイプのグループに層別化されるときに、Viozan[登録商標]に(図７Ａ)ならびにプラセボに(図７Ｂ)対する応答の解析は、少なくとも一つの‘Ｃ’ハプロタイプを持つ患者がViozan[登録商標]にさらに良く応答することを示している。治験ＳＣ−３９７−５１６３およびＳＣ−３９７−５０９８についての合併されたデータ。 図８は、Viozan[登録商標]およびプラセボで処置され、そしてＣハプロタイプおよび非Ｃハプロタイプのサブグループに層別化されている対象について一次臨床試験エンドポイントにおけるベースラインからのＢＣＳＳの平均変化(９週から１２週を含む処置について平均のＢＣＳＳ応答)を示す。治験ＳＣ−３９７−５１６３およびＳＣ−３９７−５０９８についての合併されたデータ。Viozan[登録商標]で処置されたＣハプロタイプを持つ対象は、Ｃハプロタイプの一コピーを持たない(非Ｃハプロタイプ)それらの対象に比較して、ＢＣＳＳ応答の統計的に有意な差があった。

Claims (9)

1. 長時間作用型ベータアゴニストでの処置用の候補者として患者を同定するための方法であって、
   ａ)患者から生物学的試料を単離すること；
   ｂ)少なくとも一つのハプロタイプＣの存在もしくは不存在を当該試料で同定することを含み、ここで、患者試料中の少なくとも一つのハプロタイプＣの存在が該患者が処置のための良好な候補者であることを示す、方法。
2. 少なくとも一つのハプロタイプＣの存在もしくは不存在を同定するための方法が、
   ａ)患者から取られた生物学的試料から核酸を単離すること；および
   ｂ)ＡＤＲＢ２のゲノムＤＮＡの一つの対立遺伝子の中で、以下の位置に存在する以下のヌクレオチド(表４を参照)：
   位置 ヌクレオチド
   −４７ Ｔ
   ４６ Ｇ
   ７９ Ｃ
   を検出することを含む、請求項１に記載の方法。
3. 少なくとも一つのハプロタイプＣの存在もしくは不存在を同定するための方法が、
   ａ)患者から取られた生物学的試料から核酸を単離すること；および
   ｂ)ＡＤＲＢ２のｃＤＮＡの一つの対立遺伝子の中で、以下の位置に存在する以下のヌクレオチド：
   位置 ヌクレオチド
   −１４２９ Ａ
   −１０２３ Ｇ
   −６５４ Ｇ
   −３６７ Ｔ
   −４７ Ｔ
   −２０ Ｔ
   ４６ Ｇ
   ７９ Ｃ
   ２５２ Ａ
   ５２３ Ａ
   を検出することを含む、請求項１または２に記載の方法。
4. 少なくとも一つのハプロタイプＣの存在もしくは不存在を同定するための方法が、
   ａ)患者から取られた生物学的試料からタンパク質を単離すること；および
   ｂ)アミノ酸１６位にＧｌｙをかつアミノ酸２７位にＧｌｎを有しているＡＤＲＢ２タンパク質の存在を検出することを含む、請求項１に記載の方法。
5. 患者が呼吸器疾患、好ましくは閉塞性気道疾患、および最も好ましくは、ＣＯＰＤもしくは喘息、を有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
6. 長時間作用型ベータ２アゴニストがViozan[登録商標]である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
7. 長時間作用型β２アゴニスト治療に対する喘息患者の応答を予測するための方法であって、ＡＤＲＢ２用のコード配列のＢＵＰ、１６および２７ヌクレオチドにおいて患者に対する遺伝子型を検出することを含み、ここで、患者がＣｙｓ(ＢＵＰ)、Ｇｌｙ１６およびＧｌｎ２７を有するならば、長時間作用型β２アゴニストの標準用量に対して患者が良好な応答を示す可能性がある、方法。
8. 表２に詳述されている任意の一つのオリゴヌクレオチドプローブの配列を含む単離された核酸分子。
9. 請求項８にクレームされるとおりの少なくとも一つの単離された核酸分子を含む長時間作用型β２アゴニストに対する個体の応答を予測するための診断キット。

Images