CN101056994A - 将患者鉴定为用长效beta激动剂治疗的候选者并用于通过分析beta2肾上腺素能受体基因中的多态性来预测患者对长效beta2激动剂治疗的反应的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于将患者鉴定为用长效beta激动剂治疗的候选者的方法，其包括从患者分离生物样品并鉴定至少一个单倍型C在beta2－肾上腺素能受体基因中的存在或缺失。在患者样品中存在至少一个单倍型C表明所述患者是良好的治疗候选者。例如，所述患者可患有呼吸道疾病，优选阻塞性气管疾病，并最优选COPD或哮喘。本发明也涉及预测哮喘患者对长效beta2激动剂治疗的反应的方法，其包括检测beta2肾上腺素能受体基因中的多态性。

Description

将患者鉴定为用长效beta激动剂治疗的候选者并用于通过分析beta2肾上腺素能受体基因中的多态性来预测患者对长效beta2激动剂治疗的反应的方法
技术领域
本发明涉及鉴定单倍型之间的关系，所述单倍型在β2-肾上腺素能受体基因(beta2-adrenergic receptor gene)中包含一些单核苷酸多态性，还涉及对患者体内的长效beta激动剂的反应，其允许鉴定合适的候选者用于药物治疗。
背景技术
β2-肾上腺素能受体(ADRB2或B2AR)是G蛋白偶联的受体，其介导许多组织中儿茶酚胺(catecholamine)的作用。ADRB2活性在调节心脏、血管、肺和代谢功能中起重要作用。相信ADRB2受体活性或表达的改变增加许多疾病和病症的风险或严重性，所述疾病和病症包括充血性心力衰竭(heartfailure)、心律失常(arrhythmia)、缺血性心脏病(ischemic heart disease)、高血压(hypertension)、偏头痛(migraine)、哮喘(asthma)、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、过敏反应(anaphylaxis)、肥胖症(obesity)、糖尿病(diabetes)、重症肌无力(myasthenia gravis)和早产(premature)。
β-肾上腺素能激动剂(“beta(β)激动剂”)，包括beta-2(β2)激动剂广泛用于哮喘的治疗。还将β2-激动剂的支气管扩张效应用于治疗慢性阻塞性肺疾病(COPD)。支气管扩张药代表COPD治疗的基石，尽管事实根据定义的此患者群体具有有限的气管可逆性。对哮喘患者的研究已表明对于特定激动剂的个体反应是可变的(例如，由Tan et al.，Association between beta(2)-adrenoceptorpolymorphism and susceptibility to bronchodilator desensitisation in moderatelysevere stable asthmatics.Lancet 350，995-999(1997)；Drysdale，C.M.et al.Complex promoter and coding region beta(2)-adrenergic receptor haplotypes alterreceptor expression and predict in vivo responsiveness.Proceedings of theNational Academy of Sciences of the United States of America 97，10483-10488(2000)，Taylor，D.R.et al.The influence of polymorphism at position 16 of thebeta2-adrenoceptor on the development of tolerance to beta-agonist.Journal ofAsthma.37，691-700(2000)，Israel，E.et al.Effect of polymorphism of the beta(2)-adrenergic receptor on response to regular use of albuterol in asthma.International Archives of Allergy & Immunology 124，183-186(2001)描述)。
ADRB2由染色体5q31-32上的无内含子基因所编码(Kobilka，B.K.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，84：46-50，1987)。已经在所述基因的编码模块内鉴定了许多单核苷酸多态性(SNPs)，其在人群中的ADRB2蛋白的结构中引起明显的遗传变异性(Reihsaus，E.et al.，Am J Resp Cell Mol Biol 8：334-339，1993；Liggett，S.B.，News in Physiologic Sciences 10：265-273，1995；和GenBankaccession numbers AF022953.1 GI：2570526；AF022954.1 GI：2570528；和AF022956.1 GI：2570532)。已在启动子区中和5’和3’UTR mRNA中鉴定了许多其它的SNPs(参见，例如，McGraw，D.W.& Liggett，S.B.Coding block and5’leader cistron polymorphisms of the beta(2)-adrenergic receptor.Clinical &Experimental Allergy 29，43-45(1999)；McGraw，D.W.，Forbes，S.L.，Kramer，L.A.，& Liggett，S.B.Polymorphisms of the 5’leader cistron of the humanbeta(2)-adrenergic receptor regulate receptor expression.Journal of ClinicalInvestigation 102，1927-1932(1998).)。
通过分析研究样品中的ADRB2的序列，已经鉴定了许多ADRB2单倍型。不同群组之间ADRB2单倍型的频率有所不同。已经显示了在对于β2-激动剂的支气管扩张反应中ADRB2单倍型与个体间变异之间的联系(参见，Liggett，S.B.″The genetics of β2-adrenergic receptor polymorphisms：relevance to receptorfunction and asthmatic phenotypes.″in：Liggett，S.B.& Meyers，D.A.，TheGenetics of Asthma(1996)pp.455-478)。迄今的结果已集中于短效β2-激动剂(SABA)如硫酸舒喘灵(albuterol sulphate)(商标名包括Salbutamol和Ventolin)，并且已经于单一时间点或者于短期临床反应上进行观察。来自这些研究的结论是矛盾的，这部分地可以由样品量不足来解释。导致不一致的观测结果的其它因素包括不同疾病表型的研究、不同药物反应结果的使用，和测定有效药物反应表型中的困难。
最近，与短效β2-激动剂相比，为了提供更便利的维持治疗(maintenancetherapy)和更有效地控制夜间哮喘的症状，已经将长效β2-激动剂引入到治疗方案中(Johnson，1995；Ann Allergy Asthma Immunol.Aug；75(2)：177-9)。长效β2-激动剂提供至少12个小时的对于变应原-、锻炼-、组胺-和甲基胆碱(methocholine)-诱导的支气管收缩的支气管保护(National Asthma Campaign1996，Asthma management handbook 1996，Melbourne：National AsthmaCampaign，Melbourne.)。
这些长效β2-激动剂包括Salmeterol(Serevent，Serevent Diskus)和Formoterol(Foradil，和Foradil Aerolizer，Oxis以及Symbicort)。例如Lotvall等(Pulm Pharmacol Ther.2002；15(6)：497-501；and Respiratory Medicine2001；95 Supplement B；S7-S11)和van Schayck等(Respiratory Medicine 2002；Mar；96(3)：155-62)综述了短效和长效β2-激动剂在作用机制上的差异。
慢性阻塞性肺疾病(COPD)(或慢性阻塞性肺部疾病或慢性气管疾病)指以受限的气流为特征，具有不同程度的气囊肿大和肺组织破坏的一组肺部疾病。COPD的主要原因是抽烟，这可能导致这种疾病的两种最常见形式，肺气肿和慢性支气管炎。长期使用烟草引起肺部炎症和不同程度的气囊(气泡)损坏。这导致气管发炎和狭窄(慢性支气管炎)；或伴随肺弹性减小(肺气肿)的肺气囊永久性扩大。15-20％的长期吸烟者将发展出COPD。罕见地，称为α-1抗胰蛋白酶缺陷的酶缺陷能够在非吸烟者中引起肺气肿。COPD的其它风险因素是被动抽烟(非吸烟者暴露于来自他人的香烟烟雾)、男性、和在污染的环境中工作。
已经开发了许多药物用于治疗COPD，包括支气管扩张药如短效和长效β2-激动剂(分别为SABA和LABA)。ViozanTM(Sibenadet HCl)是在晚期临床开发中用于COPD治疗的新药，并且为长效β2-激动剂(LABA)。在许多试验中已经报导了ViozanTM的临床用途(参见，例如，Calverly et al.，RespiratoryMedicine，2003；Jan：97 Suppl A：S71-1；Hiller et al.Respiratory Medicine，2003；Jan：97 Suppl A：S45-52)。在Celli et al.，Respiratory Medicine，2003；Jan：97Suppl A：S35-43；Hiller et al.，Respiratory Medicine，2003；Jan：97 Suppl A：S45-52中讨论了III期功效和安全性试验的结果，和决定中断开发ViozanTM的根本原因。
对于疾病诸如COPD，其为缓慢发展的疾病，患者将需要数年甚至数十年的进行性治疗处理。然而，任何药物的长期使用对不同个体可能有不同的影响。特别是长期使用可能导致耐受和不良副作用如头疼、震颤和心悸。
预测患者对特定治疗剂反应的能力对于医师作出如何治疗患者的决定是有用的，所述患者患有呼吸道疾病如COPD或哮喘。如果能够从遗传学研究预测到良好的效果，那么可以选择特异性药物谱以匹配遗传学谱，并因此增加良好的治疗反应的可能性并减小不良副作用的风险。
该手段有助于开发个性化药品，即基于遗传药理学和药物基因组学信息，最适合于个体的特异性治疗法或治疗方案的处方。
在施用药物之前确定最可能对特定药物反应良好的那些患者还可以节约成本和时间。在这个方面，与可能显示低或中度反应的患者相比，对于特定变体或基因，其基因型或单倍型表明患者对特定治疗剂将有良好反应的哮喘患者或COPD患者；对于所述治疗来说是更好的候选者。因此，需要大量的临床试验以鉴定ADRB2多态性和/或单倍型与响应β2-激动剂的变异性之间的关联。这种反应可用于预测药物配置(drug disposition)、功效、耐受性和安全性。
发明内容
发明人已鉴定了对长效β2激动剂的反应与ADRB2基因单倍型之间的关联。ADRB2基因单倍型的分析得以预测患者对长效β2激动剂的反应。具体地，本文描述的研究涉及患有COPD的患者。
在白种人群中最常见的单倍型的频率列于表4。鉴定为单倍型A、B和C的最常见的3种单倍型，在所报导的3种SNPs的每一种上均有所不同，以对所表达的蛋白具有功能性影响(参见图1和表6)。本文提供的数据确定具有至少一个拷贝的ADRB2‘C’单倍型的患者对长效β2激动剂具有“良好的”临床反应。同时从统计学和临床观点来看，与不具有单个拷贝的反应者单倍型(responder haplotype)(即“非C”单倍型)的患者相比，所述“良好的”反应明显更好。
因此，在本发明的第一个方面提供将患者鉴定为用长效β2-激动剂治疗的候选者的方法，其包括：
a)从患者分离生物样品；
b)鉴定所述样品中存在或缺失至少一个拷贝的ADRB2单倍型C；
其中在患者样品中存在至少一个单倍型C表明所述患者是良好的治疗候选者。
基于对所选功能性SNPs的ADRB2单倍型、或ADRB2基因型的认识，这样的方法也可用于确定最佳的剂量和治疗方案。
良好的治疗候选者是具有ADRB2‘C’单倍型的一个或多个拷贝的个体。这样的候选者对于那种治疗可能是很好的反应者。好的反应者鉴定为施用长效β2激动剂后显示呼吸道疾病的“症状”改善的个体。在优选实施方案中，在一段时间中，以施用长效β2激动剂来维持“症状”的改善。症状可以是组合几种疾病成分的定性分数，或者可以是肺功能的定量测量值。减小恶化的发生率或严重程度也将被认为是良好的反应。
显示在体外和体内具有功能性影响的ADRB2多态性是那些在编码序列中的氨基酸16和27，以及beta-上游肽(BUP)中的多态性，如表4和6所示。对于这三个SNPs的每一个，在单倍型C中编码的变体与不太常见的单倍型D所共有。因此，所述方法进一步包括用单倍型D鉴定患者，所述单倍型D共享这同样的三个SNPs。
适合地，所述患者患有呼吸道疾病并且尤其是阻塞性气管疾病。呼吸道疾病包括急性肺损伤、急性呼吸窘迫综合征、慢性阻塞性肺病(COPD)(或慢性阻塞性肺部疾病或慢性气管疾病)和哮喘。在特别优选的实施方案中，所述患者患有任何阶段或严重程度的COPD或哮喘。
COPD症状包括长期咳嗽(chronic cough)、长期生痰(chronic sputumproduction)、急性支气管炎(acute bronchitis)、呼吸困难(dyspnea)，这些常常与暴露于风险因素的历史相关，这些风险因素包括职业尘末(occupational dust)和化学品、烟草烟雾和来自家庭烹饪和加热燃料的烟雾。可以用肺活量测定法(spirometry)测定用力肺活量(FVC)和一秒钟用力呼气量(FEV1)来证实诊断。对于患者的性别、年龄和身高来说，与正常值相比，患COPD的患者通常同时表现出FEV1和FEV1/FVC的减小。依照Gold分类法(Gold classification)对COPD严重程度分类，并包括0期：有风险、I期：轻微、II期：中度和III期：严重。
哮喘症状包括咳嗽、呼吸困难、胸闷、胸痛、呼吸噪音等等。可以根据症状、活性的缺损、肺功能、支气管高反应性程度、急诊的次数、住院的次数和药物应用对哮喘严重程度进行分类。所描述的严重程度的范围包括严重持久的、中度持久的、轻度持久的和轻度间歇性哮喘。
如以上所指出的，呼吸道疾病的症状可以用许多种方法评估。肺活量测定法常用于在阻塞性气管疾病中监测肺功能。例如，FEV1(1秒钟用力呼气量，以升为单位测量)广泛用于临床试验中以评估干预气道阻塞的效果。例如，在Am Rev Respir Disease 1991 144 1202-1218中描述了用于评估肺功能的FEV1测量值。例如，在American Thoracic Society，Standardisation of spirometryAm.J.Resp.Crit.Care Med.1995，149，1107-1136中描述了测量FEV1的标准方法。
患有COPD的患者具有受限的气管功能可逆性。仅50mL的FEV1变化就能够代表肺功能的明显临床改善。认为COPD症状包括气促(breathlessness)、咳嗽和多痰的治疗(management)提供了在COPD患者中干预的有效性的更好评估。已经开发了气促、咳嗽和多痰量度法(BCSS)作为工具用于评估治疗COPD患者的症状性益处(Leidy et al，(2003)，RespiratoryMedicine，Vol 97，Suppl A，S59-S70)。
因此，对施用长效β2激动剂的良好反应者将显示FEV1的改善，所述的改善几乎立即开始发生并持续超过几个小时。如果将FEV1对时间作图，同时反映初始反应强度(最大FEV1)和作用持续时间的曲线下的面积(AUC)将是生理反应的良好量度。
此外，好的反应者将显示BCSS和/或全部症状的改善。全部症状可以相对于本文描述的标准“全部症状分数”分析来测量。具体地，所述全部症状分数将气促、咳嗽和生痰的测量考虑在内，它们每一种都对COPD表型作出贡献。
“长效beta 2(β2)激动剂”指与ADRB2受体相互作用的激动剂，并且，与常用的短效beta 2激动剂(例如舒喘灵)相比，其产生具有更长的作用持续期的反应。通常，对长效beta 2激动剂的反应可持续12小时或更多。长效beta2激动剂的范围是本领域技术人员已知的，并包括ViozanTM(Sibenadet HCl)、Bambuterol(Bambec，Oxeol)、Salmeterol和Formoterol。
来自患者的生物样品可以包括任何含DNA的生物材料，其包括血液或组织提取物如口腔刮取物(buccal scrape)。通常使用血液样品。可以从许多类型的用于基因分型(genotyping)的生物样品提取DNA用于分析。例如，通常使用商业试剂盒例如可由Qiagen或Nucleon and PureGene(Flowgen)获得的那些试剂盒从血液提取DNA，虽然直接从血液样品确定基因型是可行的。
如本文所讨论的，单倍型是存在于单个染色体上的连锁、连续SNPs的特定模式。测定患者样品中的单倍型对(haplotype pair)涉及在单倍型模块(haplotype block)中对于每个SNPs将患者的DNA进行基因分型(参见表4)。可以通过直接测定哪个SNP变体存在于每个染色体上而通过实验测定单倍型。更常见地，使用统计算法间接测定单倍型，尤其是当可以获得大量受试者(subject)的基因型数据时。对于相同基因/基因座，必须进行基因分型以将任何一个单倍型与所有其它单倍型相区分的SNPs的最小数目被称为最小SNP组或单倍型标记SNPs。单倍型标记SNPs是区分单倍型最有效的手段，并可以组合到ADRB2单倍型的诊断测试中。这些最小SNPs或HAP-标记SNPs是在特定群体中捕获大多数单倍型多样性的SNPs的亚组。因此可能需要许多不同的htSNPs组，以在不同群体内捕获相同程度的多样性。例如WO01/79252中描述了合适的探针。
在又一实施方案中，所述方法涉及确定单倍型对中的两个等位基因的同一性(identity)。具体地，如本文所述，如果患者具有一个或多个拷贝的C单倍型，他们最可能对用长效β2激动剂治疗显示良好的反应。在没有C单倍型拷贝的患者中反应的强度较小。例如，如本文所示，与具有BB单倍型对的患者相比，具有单倍型BC的患者具有更高的最大FEV1反应，并且所述反应保持更长时间(FEV1在8小时)。因此，患者的ADRB2单倍型对情况为医师提供信息，该信息用于为每个独特的患者对于施用哪种药物、最合适的剂量和治疗方案作出决定。
测定个体样品中的单倍型和/或基因型的许多方法是本领域技术人员已知的。具体地，本发明涉及基于检测特定核苷酸同一性的方法，所述特定核苷酸位于ADRB2基因内已知多态性的确定位置。
因此，在一个方面提供鉴定良好反应者的方法，包括：
a)由已从患者去除的生物样品中分离核酸；和
b)在ADRB2基因组DNA的一个等位基因中检测存在于下述位点的下述核苷酸(参见表4)：
位点                核苷酸
-47                 T
46                  G
79                  C
合适地，这样的方法能够将单倍型C和D与单倍型A、B和E相区别。
在又一个方面提供鉴定至少一个单倍型C存在或缺失的方法，包括：
a)由已从患者去除的生物样品中分离核酸；和
b)在ADRB2基因组DNA的一个等位基因中检测存在于下述位点的下述核苷酸(参见表4)：
位点               核苷酸
-47                T
46                 G
79                 C
523                A
合适地，这样的方法能够将单倍型C与单倍型A、B和D相区别。
合适地，所述方法进一步包括附加地在ADRB2基因组DNA的一个等位基因中检测存在于下述位点的下述核苷酸(参见表4)：
位点              核苷酸
-1429             A
-1023             G
-654              G
-367              T
-20               T
252               A
合适地，这样的方法能够将单倍型C与所有其它的ADRB2单倍型包括稀有单倍型(rare haplotype)相区别。
在优选实施方案中，所述鉴定至少一个单倍型C存在或缺失的方法包括：
a)由已从患者去除的生物样品中分离核酸；和
b)在ADRB2基因组DNA的一个等位基因中检测存在于下述位点的下述核苷酸：
位点            核苷酸
-1429           A
-1023           G
-654            G
-367            T
-47             T
-20             T
46              G
79             C
252            A
523            A
在本发明的另一实施方案中，为了区分单倍型，可以对HAP-标记SNPs进行基因分型。由于不同群体之间的多样性，根据待治疗的群体/个体的人种背景，需要包括于HAP-标记SNP中的实际SNPs可有所不同。
本文描述了鉴定存在于这些位点中每一个的核苷酸的合适方法，并包括TaqMan、SNaPshot、等位基因特异性聚合酶链式反应扩增(allele-specificpolymerase chain reaction)、等位基因耐受性突变系统(allele refractory mutationsystem，ARMS)、限制片段长度多态性分析和测序。这些方法可以利用基因分型探针或如本文所述的寡核苷酸。
ADRB2 cDNA具有可由NCBI获得的Entrez核苷酸数据库中以登录号M15169列出的序列。Entrez核苷酸数据库是来自几种来源包括GenBank、RefSeq和PDB的序列的集合(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi？db＝Nucleotide)。ADRB2 cDNA序列(M15169)以下称为SEQ.IDNO：1，在本说明书的最后给出。
在另一实施方案中，所述鉴定至少一个单倍型C存在或缺失的方法包括：
a)由已从患者去除的生物样品中分离蛋白质；和
b)检测ADRB2蛋白的存在，所述ADRB2蛋白在位点16具有Gly，并在位点27具有Gln(参见表6)。
在该实施方案中，鉴定C单倍型的表达的合适方法包括使用特异性识别ADRB2受体的抗体的方法，所述ADRB2受体在Gly16和Gln 27具有氨基酸改变。
在另一优选实施方案中，鉴定至少一个单倍型C存在或缺失的方法进一步包括检测前导肽/顺反子(LC)(beta-上游肽(BUP))中位点-47的Arg的存在。然而，此肽在成熟蛋白中是不存在的。
在另一优选实施方案中，鉴定至少一个单倍型C存在或缺失的方法包括对于任一患者，对多个cDNA克隆测序，以证实所述患者对于-47BUP多态性和5’UTR、编码区和3’UTR中的其它变体而言是否为杂合(图1)。此手段也将用于证实是否有ADRB2基因的差异等位基因表达。
在另一实施方案中，所述鉴定至少一个单倍型C存在或缺失的方法包括：
a)由已从患者去除的生物样品中分离蛋白质；和
b)检测ADRB2蛋白的水平，其中与正常个体相比，患者体内表达水平的提高表明存在单倍型C。
另一方面，本发明提供预测COPD或哮喘患者对长效β2激动剂治疗的反应的方法，包括检测患者ADRB2编码序列的核苷酸-47、46和79处的基因型，其中如果患者在同一ADRB2等位基因上具有T(-47)、G(46)和C(79)变体，那么该患者可能对标准剂量的长效β2激动剂显示出良好的反应。
因此，在又一方面提供确定治疗方案的方法，所述治疗方案用于治疗患者的COPD或哮喘，该方法包括：
a)从所述患者获得样品；
b)从所述样品分离基因组DNA；
c)使用具有表2所列出的序列的任一对核苷酸引物将基因组DNA进行扩增；
d)确定患者在ADRB2基因中任一多态性变体的基因型
e)根据基因分型数据确定患者的单倍型；和
f)根据单倍型确定用于所述患者的治疗方案。
在本发明的又一方面，提供分离的核酸分子，其包括表2中列出的任何一个寡核苷酸探针的序列。合适地，这样的探针的长度在10和30个碱基对之间。在优选实施方案中，所述探针由表2列出的任何一个序列组成。
表2提供如下序列：十二个VIC探针(SEQ.ID NO：2至SEQ.ID NO：13)、十二个6FAM探针(SEQ.ID NO：14至SEQ.ID NO：25)、十二个正向(Fwd)引物(SEQ ID NO：26至SEQ.ID NO：37)和十二个反向(Rev)引物(SEQ.ID NO：38至SEQ.ID NO：49)。
在另一方面提供预测个体对长效β-激动剂的反应的诊断试剂盒，其包含一组基因分型探针。
在另一方面提供检测ADRB2单倍型的阵列。这样的阵列将包含基因分型探针，所述基因分型探针特异于每个不同的ADRB2单倍型的SNPs特征。
对任何ADRB2多态性进行基因分型的方法可以是一系列(a panel of)基因分型测试的一部分，所述基因分型测试设计用于为患呼吸道疾病的个体确定最合适的治疗方案。ADRB2 SNPs可以与代谢和转运蛋白基因中的SNPs一起，和/或与对于b2-激动剂的反应途径中的其它基因和用于治疗呼吸道疾病的其它药物(例如吸入的皮质类固醇(inhaled corticosteroid)和白三烯抑制剂(leukotriene inhibitor))一起包括在一个系列中。
因此，在一个实施方案中提供阵列，其还包含用于检测其它SNPs的探针。
合适地，所述治疗方案涉及在定期日程基础上施用长效beta2激动剂作为维持治疗和/或需要时施用LABA作为缓解(reliever)药物。
因此，本发明为药物开发提供个性化的用药(medicine)手段，由此根据ADRB2单倍型状况，通过预期地(prospectively)招募受试者进行临床试验，而对C单倍型亚组开发LABA。
合适地，ADRB2单倍型状况用于选择最合适的LABA、药物的剂量和治疗方案，例如定期或根据需要施用LABA。
此外，确定ADRB2单倍型有助于确定合适的药物、剂量和方案，其中ADRB2单倍型与其它基因的基因型/单倍型一起测定，所述的基因型/单倍型在对b2-激动剂和其它用于治疗COPD、哮喘和其它呼吸道疾病的治疗剂的个体反应测定中有作用。
图表简述
表1显示ADRB2基因中的多态性、其在ADRB2 cDNA参考序列(M15169)中的相对位点、氨基酸变体和在占优势的白种人群中每种多态性的频率。
表2显示用于对ADRB2 SNPs进行基因分型的TaqMan引物和等位基因特异性探针。
表3显示用于对ADRB2 SNPs进行基因分型的SNaPshot PCR和引物延伸引物(primer extension primer)。
表4显示对于5种最常见的ADRB2单倍型，存在于每个多态性位点的变体的ADRB2碱基，和占优势的白种人临床试验群体中这些常见单倍型的频率。
表5显示占优势的白种人临床试验群体中ADRB2单倍型对的频率，并概括了每种ADRB2单倍型对的观测的频率，其中单倍型对是2450个受试者的临床试验群体中单倍型A、B、C、D和E的组合。
表6显示由最常见的ADRB2单倍型编码的氨基酸变体，对于三种变体，被报导在之前的体外和体内研究中，在功能上是显著的。
图1为ADRB2基因的示意图，其显示该基因的编码区、5’UTR和3’UTR区中多态性的相对位点。
图2显示在招募进行ViozanTM临床试验的患者亚组中系列FEV1分析的结果。在首次用ViozanTM治疗就诊时测定系列FEV1反应，其中用ADRB2单倍型对所述反应进行分层(stratify)。
图3显示在3个月(SC-397-5098)和6个月(SC-397-5097)的临床试验过程中，在剂量给药前(pre-dose)基线测定的FEV1。该附图显示与后续就诊时的剂量给药前FEV1(波谷(trough)FEV1)相比，首次就诊时治疗前基线(FEV1)的变化。根据一个或多个拷贝的“C”单倍型的存在将患者分组。
图4显示在3个月和6个月的功效研究中产生的组合的系列FEV1数据。图表显示对于分层到那些具有至少一个拷贝“C”单倍型的受试者和其余“非C”单倍型的受试者，首次就诊时和3个月治疗后的系列FEV1反应。
图5显示在3个月的功效试验(SC-397-5163)过程中，对于用ViozanTM治疗并分层到基于ADRB2单倍型对的亚组中的患者自基线BCSS(气促、咳嗽和多痰分数)的变化。
图6显示在3个月的试验(SC-397-5163)中，自基线的BCSS平均变化，其中将对ViozanTM的反应根据ADRB2“C”单倍型的存在分层到两个亚组中。
图7显示与未分层的患者群体(所有Haps组)的平均反应相比，根据C单倍型的存在或缺失分层到2个组中的患者亚组自基线BCSS(气促、咳嗽和多痰分数)的平均变化。当把患者分层到C单倍型组和非C单倍型组中时，分析对ViozanTM(图7A)和安慰剂(图7B)的反应，显示具有至少一个“C”单倍型的患者对ViozanTM的反应更好。组合SC-397-5163和SC-397-5098的试验数据。
图8显示对于用ViozanTM和安慰剂治疗并分层到C单倍型和非C单倍型亚组中的患者，在初始(primary)临床试验终点(治疗9至12周(包含)的平均BCSS反应)时自基线的BCSS平均变化。组合SC-397-5163和SC-397-5098的试验数据。与那些不具有单一拷贝的C单倍型(非C Haps)的受试者相比，在用ViozanTM治疗的具有C单倍型的受试者中，BCSS反应有统计学上的显著差异。
发明详述
除非另外限定，本文使用的所有技术和科学术语具有与一个本技术领域(例如，在细胞培养、分子遗传学、核酸化学、杂交技术和生物化学领域中)普通技术人员通常理解的相同的含义。将标准技术用于分子的、遗传学的和生物化学的方法。一般参见，Sambrook et al.，Molecular Cloning：A LaboratoryManual，2d ed.(1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.and Ausubel et al.，Short Protocols in Molecular Biology(1999)4th Ed，JohnWiley & Sons，Inc.；以及Guthrie et al.，Guide to Yeast Genetics and MolecularBiology，Methods in Enzymology，Vol.194，Academic Press，Inc.，(1991)，PCRProtocols：A Guide to Methods and Applications(Innis，et al.1990.AcademicPress，San Diego，Calif.)，McPherson et al.，PCR Volume 1，Oxford UniversityPress，(1991)，Culture of Animal Cells：A Manual of Basic Technique，2nd Ed.(R.I.Freshney.1987.Liss，Inc.New York，N.Y.)，和Gene Transfer and ExpressionProtocols，pp.109-128，ed.E.J.Murray，The Humana Press Inc.，Clifton，N.J.)。通过引用将这些文献并入本文。
定义
“等位基因”指遗传基因座的特定形式，它在其特定核苷酸或氨基酸序列不同于其它形式。
“抗体”可以是完整抗体或其抗原结合片段。例如，本发明包括片段如Fv和Fab、以及Fab’和F(ab’)2，和抗体变体如scFv、单域抗体、Dab抗体和其它抗原结合抗体类分子。
“顺反子”是编码单个蛋白质链的DNA区段，即基因。它可能包括编码DNA之前和之后的区域以及外显子之间的内含子。它被认为是遗传单位。
“表达”指转录基因DNA模板以产生相应的mRNA，并翻译该mRNA以产生相应的基因产物(即，肽、多肽、或蛋白质)。
“基因”是包含用于调控RNA产物的生物合成的全部信息的DNA区段，包括启动子、外显子、内含子和其它控制表达的非翻译区。
“基因型”是在个体中一对同源梁色体上的基因座中，存在于一个或多个多态性位点的核苷酸对的非定相(unphased)5’到3’序列。
“基因分型”是确定个体基因型的方法。
“单倍型”是单一个体的单个染色体上的基因座中，存在于两个或多个多态性位点的核苷酸的定相(phased)5’到3’序列。
“单倍型对”指存在于单一个体中的基因座的两个单倍型。
“单倍分型”是确定个体的单倍型的方法。
“完全-单倍型”是单一个体的单个染色体上的基因座中，存在于所有已知的多态性位点的核苷酸的5’到3’序列。
“亚-单倍型”是从单一个体的单个染色体上的位点中，于已知多态性位点的亚组上发现的核苷酸的5′到3′序列。
如本文所定义的，单倍型“C”包括ADRB2基因内许多多态性的组合。这些列于表4中。单倍型C最低限度地通过位点-47的T、位点46的G、位点79的C和位点523的A的存在来限定。由于位点523的核苷酸改变是同义的，因而通过单独在位点-47、+46和+79的变体的组合来区分单倍型C是合理的。这些多态性导致氨基酸改变，使在-47有Cys/Arg改变、在氨基酸残基16有Gly/Arg改变，和在氨基酸残基27有Gln/Glu改变(表6)。
类似地，本文表4中描述了包含单倍型A、B、C、D和E的变体。位点1是编码区中的第一个核苷酸，并对应于ATG的A。相对于ATG具有阴性位点(negative position)的变体位于beta-上游肽中的编码区和5’UTR的上游(表1)。SEQ.ID NO：1中列出了cDNA的完整序列。
“同种型”是基因、mRNA、cDNA或由其编码的蛋白质的特定形式，通过其特定序列和/或结构与其它形式相区别。
“分离的”应用于生物分子如RNA、DNA、寡核苷酸、或蛋白质时，指将所述分子从其初始环境去除，并出于实用目的不含有其它生物分子如非所需核酸、蛋白质、脂质、碳水化合物、或其它材料如细胞碎片和生长培养基。通常，术语“分离的”不意味着完全不存在这种材料或不存在水、缓冲液、或盐，除非它们以实质上干扰本发明所述方法的量存在。
“基因座”指对应于基因或者物理特征或表型特征的染色体或DNA分子上的位置。
本文所用“核酸”指单链或双链DNA和RNA分子，包括自然界中发现的天然核酸和/或具有修饰的骨架或碱基的修饰的、人工的核酸，如本领域已知的。
“定相的”用于基因座中两个或多个多态性位点的核苷酸对的序列时，意思是核苷酸的组合是已知的，所述核苷酸存在于基因座的单拷贝上的那些多态性位点。
“多态性位点”是基因座内的位置，在群体中，至少在所述基因座存在两种可替换的序列。
在描述本文鉴定的多态性位点时，为方便起见参照基因的有义链。然而，技术人员会认识到包含ADRB2基因的核酸分子可以是互补双链分子。因此，参照有义链上特定位点还指互补反义链上的相应位点。可以参照任何链上相同的多态性位点，并且可以设计寡核苷酸以在包含多态性位点的目标区域与任何一条链特异性地杂交。因此本发明还包括单链多核苷酸的用途，所述单链多核苷酸与本文所述ADRB2基因组变体的有义链互补。
“多态性变体”是基因、mRNA、cDNA、多肽或肽，其核苷酸或氨基酸序列由于在基因中存在多态性而不同于参照序列。
“多态性”是在个体中于多态性位点观测到的序列变异。多态性包括核苷酸取代、插入、删除和微卫星，可能但不必然导致在基因表达或蛋白质功能中的可探测的差异。
“单核苷酸多态性(SNP)”指在单一多态性位点观测到的特异性核苷酸对。在罕见情况中，可发现三个或四个核苷酸。
“严紧杂交条件”指在包含50％甲酰胺、5x SSC(750mM NaCl，75mM柠檬酸三钠)、50mM磷酸钠(pH 7.6)、5x Denhardt’s溶液、10％硫酸葡聚糖(dextran sulphate)和20pg/ml变性、剪切的鲑精DNA的溶液中，于42℃过夜温育，然后于大约65℃在0.1x SSC中洗涤滤器。
“非定相的”当应用于基因座中两个或多个多态性位点的核苷酸对的序列时，意思是存在于所述基因座的单拷贝上的那些多态性位点的核苷酸组合是未知的。
测定SNPs和单倍型的方法
目前使用用于在样品中鉴定和表征SNPs的多种测试。这些测试包括限制片段长度多态性分析(RFLP)、单链构象多态性分析(SSCP)(Orita et al.P.N.A.S.USA，1989，86：2766-2770)、等位基因特异性寡核苷酸杂交(ASO)(Saiki et al.P.N.A.S.USA，1989，86：6230-6234)、寡核苷酸连接测试(OLA)(Landegren et al.1988，Science 241；1077-1080)、ARMS(扩增耐受性突变系统)、引物延伸或微测序类型测试(mini-sequencing type assay)，(Syvanen et al.1999；Hum.Mutat.13：1-10)、TaqMan(Livak et al.1995；Nat.Genet.9：341-342)、分子信标(molecular beacons)(Tyagi et al.1998；Nat.Biotechnol.16：49-53)、核酸酶(Goldrick 2001；Hum.Mutat.18；190-204)和结构特异性核酸酶侵入物技术(structure-specific nuclease invader technology)(Fors et al.2000；Pharmacogenomics；1：219-229)。
从这些测试的读出(read out)可以是以下许多类型的任一种：放射性、荧光、化学发光、酶学、分析大小、电荷或质量等。
已经开发了许多技术平台以提高生产量。综述了许多这样的平台，例如由Weiner和Hudson在BioTechniques 32；S4-S13(2002年6月)中所述的。
大多数用于SNP和单倍型分析的测试和平台以基因组DNA开始，并需要一些形式的扩增步骤。
许多DNA扩增方法是已知的，其大多数依赖于酶促链式反应(如聚合酶链式反应、连接酶链式反应或自动维持序列扩增(self-sustained sequencereplication))或来自全部或部分载体的复制，所述载体中已克隆了该DNA。
文献中已描述了许多目标和信号放大方法，例如，在Landegren，U.，et al.，Science 242：229-237(1988)和Lewis，R.，Genetic Engineering News 10：1，54-55(1990)中的这些方法的概括性综述。
PCR是在美国专利4,683,195和4,683,202中特别描述的核酸扩增方法。PCR可以用于扩增任何诊断学情况(context)下已知的核酸(Mok et al.，(1994)，Gynaecologic Oncology，52：247-252)。自动维持序列扩增(3SR)是TAS的变化，其涉及核酸模板通过反转录酶(RT)、聚合酶和核酸酶的活性(activity)的连续循环的等温扩增，所述活性由酶鸡尾酒和合适的寡核苷酸引物介导(Guatelli et al.(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：1874)。连接扩增反应或连接扩增系统使用DNA连接酶和四个寡核苷酸，每个目标链两个。此技术由Wu，D.Y.和Wallace，R.B.(1989)Genomics 4：560描述。在Qβ复制酶技术中，将复制单链RNA的用于噬菌体Qβ的RNA复制酶用于扩增目标DNA，如由Lizardi et al.(1988)Bio/Technology 6：1197所述。
在本发明中可以利用替代的扩增技术。例如，滚环扩增(rolling circleamplification)(Lizardi et al.，(1998)Nat Genet 19：225)是商业上可获得的扩增技术(RCATTM)，其由DNA聚合酶所驱动并能够在等温条件下以线性或几何动力学(geometric kinetics)复制环形寡核苷酸探针。另一种技术，链置换扩增(strand displacement amplification)(SDA；Walker et al.(1992)PNAS(USA)80：392)始于只有特定目标才有的特别限定的序列。
适合用于多种扩增技术的引物可以按照本领域已知的方法制备。本文描述了特别有用的引物，其具有如表2和3列出的序列。
用于检测C单倍型的组合物可以包含至少一种ADRB2基因分型寡核苷酸。合适地，ADRB2基因分型寡核苷酸是能够与目标区域杂交的探针或引物，所述目标区域位于靠近或其含有作为C单倍型的部分的本文所述的多态性位点。
如本文所用，术语“寡核苷酸”指具有少于约100个核苷酸的多核苷酸分子。合适地，本发明的寡核苷酸为10至35个核苷酸长。更优选地，所述寡核苷酸为15至30之间，并最优选地，长度在20至25个核苷酸之间。所述寡核苷酸可以包括任何磷酸化状态的核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸和非环状核苷酸衍生物，以及其它功能上等同的衍生物。或者，寡核苷酸可具有无磷酸的骨架，其可包括例如羧甲基、乙酰胺化物(acetamidate)、氨基甲酸酯(carbamate)、聚酰胺(肽核酸(PNA))等等的连接(Varma，R.in Molecular Biologyand Biotechnology，A Comprehensive Desk Reference，Ed.R.Meyers，VCHPublishers，Inc.(1995)，pages 617-620)。
寡核苷酸可利用本领域已知的任何合适的方法学通过化学合成制备，或者例如，通过限制性消化可得自生物样品。所述寡核苷酸可按照本领域已知的任何技术进行标记，包括使用放射性标记、荧光标记、酶学标记、蛋白质、半抗原、抗体、序列标签等等。
用于本发明所述方法的基因分型探针或寡核苷酸必须能够与ADRB2多核苷酸的目标区域特异性地杂交，单倍型C的多态性特征位于所述目标区域中。如本文所用，特异性杂交的意思是所述寡核苷酸在一定杂交条件下与目标区域形成反向平行双链结构，而在相同杂交条件下与非目标区域或非ADRB2多核苷酸一起温育时，不能形成这样的结构。优选地，所述寡核苷酸在常规的高严紧条件下与目标区域特异性杂交。熟练技术人员能够使用本文提供的多态性信息结合ADRB2基因已知的序列信息和常规技术，容易地设计和测试适用于检测ADRB2基因中的多态性的寡核苷酸探针和引物。
如果其中一个核酸分子的每个核苷酸与另一个核酸分子相应位置上的核苷酸互补，那么核酸分子例如寡核苷酸或多核苷酸被称为另一个核酸分子的“完美的”或“完全的”互补。如果一个核酸分子在常规的低严紧条件下以保持双链形式的足够稳定性与另一个核酸分子杂交，那么核酸分子对另一个分子是“基本互补”。
描述了常规杂交条件，例如，由Sambrook J.et al.在Molecular Cloning，ALaboratory Manual，2nd Edition，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989)中以及Haymes，B.D.et al.在Nucleic Acid Hybridization，APractical Approach，IRL Press，Washington，D.C.(1985)中所述。尽管完美互补的寡核苷酸对于检测多态性是优选的，但完全互补的偏离(departure)是预期的，其中这样的偏离不妨碍所述分子与目标区域的特异性杂交。例如，寡核苷酸引物在其5’端可以具有非互补片段，引物的其余部分与目标区域互补。或者，非互补核苷酸可以散布在寡核苷酸探针或引物中，只要所得探针或引物仍然能够与目标区域特异性杂交。
本发明优选的基因分型寡核苷酸是等位基因特异性寡核苷酸。如本文所用，术语等位基因特异性寡核苷酸(ASO)的意思是寡核苷酸，其能够在足够严紧的条件下，在包含多态性位点的目标区域与基因的一个等位基因或其它基因座特异性杂交，而不与另一等位基因中的相应区域杂交。如熟练技术人员所理解，等位基因特异性将依赖于许多容易优化的严紧条件，包括盐和甲酰胺浓度，以及杂交和洗涤步骤的温度。通常用于ASO探针的杂交和洗涤条件的实例见于Kogan等，“Genetic Prediction of Hemophilia A”in PCR Protocols，A Guide to Methods and Applications，Academic Press，1990和Ruano等，87Proc.Natl.Acad.Sci.USA 6296-6300，1990中。通常，等位基因特异性寡核苷酸将与一个等位基因完美地互补，而对于另一等位基因含有单个错配。
通常在不同等位基因之间提供良好的辨别力(discrimination)的等位基因特异性寡核苷酸探针是那些其中寡核苷酸探针的中心位置与目标区域中的多态性位点(例如，15聚体(mer)中约第7或第8位置、16聚体中第8或第9位置、20聚体中第10或第11位置)对准(align)的。用于检测存在于单倍型C中的ADRB2基因多态性的优选的ASO探针包含如表2列出的核苷酸序列。
在特别优选的实施方案中，单倍分型方法使用具有表2所列序列的至少一个引物。合适地，使用最少2组引物。
本发明的等位基因特异性寡核苷酸引物具有3’末端核苷酸或优选3’倒数第二个核苷酸，其只与特定SNP的一个核苷酸互补，从而只有在含有所述核苷酸的等位基因存在时才能作为用于聚合酶介导的延伸的引物起作用。本发明预期了与编码或非编码链杂交的等位基因特异性寡核苷酸引物。
本发明的其它基因分型寡核苷酸与目标区域杂交，所述目标区域位于本文鉴定的一个新的多态性位点下游的一至几个核苷酸。这些寡核苷酸可用于聚合酶介导的引物延伸方法，该方法用于检测ADRB2基因多态性，并因此在本文中被称为“引物-延伸寡核苷酸”。在优选实施方案中，引物-延伸寡核苷酸的3’-末端是脱氧核苷酸，其与位于所述多态性位点直接相邻处的核苷酸互补。用于检测ADRB2基因在位置-1429、-1023、-654、-367、-47、-20、46、79、252和523多态性的特别优选的寡核苷酸引物通过引物延伸终止于选自下组的核苷酸序列：具有如表2和3所列的序列的引物。
在一些实施方案中，组合物含有两种或两种以上不同标记的基因分型寡核苷酸，其用于同时在两个或两个以上多态性位点探测核苷酸的同一性。还预期引物组合物可以含有两组或两组以上等位基因特异性引物对，以允许同时靶向(target)和扩增含有多态性位点的两个或两个以上区域。
本发明的ADRB2寡核苷酸也可以排列(array)到固体表面上，以提供用于快速筛选样品多态性的有序阵列(ordered array)。阵列技术是本领域已知的，例如，在WO 98/20020和WO 98/20019中描述。
在一个实施方案中，检测ADRB2单倍型可以与其它SNPs或单倍型的检测组合，用于精确诊断或确定治疗方案。合适的组合包括其它呼吸道疾病相关基因，例如，代谢和转运蛋白基因和/或涉及对β2-激动剂的反应途径(response pathway)的其它基因。
基因分型方法的一个实施方案涉及从个体分离核酸混合物，所述核酸混合物包含存在于所述个体中的两个拷贝的ADRB2基因或其片段，并在图1鉴定的一个或多个位置测定在两个拷贝中所述核苷酸对的同一性，从而为所述个体指定ADRB2基因型。如熟练技术人员所容易理解的，个体中两个“拷贝”的基因可以是相同的等位基因(纯合的)或可以是不同的等位基因(杂合的)。
通常，所述核酸混合物从取自所述个体的生物样品，例如血液样品或组织样品中分离。合适的组织样品包括全血(whole blood)、精液、唾液、泪液、尿、粪便材料、汗、口腔物(buccal)、皮肤和毛发。所述核酸混合物可以包括基因组DNA、mRNA或cDNA，并且在后两种情况下，所述生物样品必须从表达ADRB2基因的器官获得。另外熟练技术人员会理解mRNA或cDNA的制备不能用于检测位于内含子中或5’和3’非转录区中的多态性。如果分离ADRB2基因片段，它必须含有待进行基因分型的多态性位点。
如以下进一步描述，本发明人已发现患者对长效β2激动剂的支气管扩张反应可以通过鉴定单倍型C的存在而预测。这可以通过对ADRB2基因中仅三个多态性位点即位点-47(T)、46(G)和79(C)进行基因分型而测定。
因此，本发明还提供用于预测对长效beta-激动剂的个体反应的诊断试剂盒。在一个实施方案中，所述试剂盒包含一组包装在容器中的基因分型寡核苷酸，其用于对ADRB2基因中的单倍型C进行基因分型。所述试剂盒还可以含有其它成分例如杂交缓冲液，其中所述寡核苷酸将用作等位基因特异性探针，或双脱氧核苷酸三磷酸(ddNTPs)，其中将通过引物延伸检测多态性位点。所述试剂盒还可以含有聚合酶和反应缓冲液，其经优化用于由所述聚合酶介导的引物延伸。优选的试剂盒还可以包括检测试剂，例如生物素或荧光标记的寡核苷酸或ddNTPs和/或酶标记的抗体和一种或多种底物，所述底物在被酶作用时产生可检测的信号。在优选实施方案中，试剂盒中的每种基因分型寡核苷酸和所有其它试剂已对用于检测单倍型C的基因分型测试中的最佳性能作了品质检测，并且所述试剂盒还包含用于实施所述测试并由结果指定ADRB2单倍型对的说明。熟练技术人员将会理解，适当地为了保持生物学或化学活性并使之能够适当地用于所述测试中，可将用于实施基因分型测试的一组基因分型寡核苷酸和试剂在独立的贮器(receptacle)中提供，所述贮器置于合适的容器中。
在作为不同单倍型特征的多态性位点检测多态性的同时，将会认识到特定的其它多态性位点高度预示着上游或下游的其它多态性的存在，即它们在个体中是连锁的(linked)；它们总是一起遗传。因此，通过在不同位点鉴定另一个连锁的多态性来检测特定单倍型的存在包括于本发明的范围之内。这意味着除了在特定单倍型内与感兴趣的等位基因特异性结合的探针之外，本发明还包括检测连锁的多态性。
在另一实施方案中，可以通过使用特异性结合到蛋白质形式的抗体来测定单倍型C的存在，所述蛋白质形式由具有氨基酸改变Gly16Arg和Gln27Glu的单倍型C的相应cDNA表达。用于产生合适的抗体和用于检测它们与样品的结合的方法是本领域技术人员所熟知的。
检测单倍型的存在的用途
如下面更详细公开的，至少一个拷贝的ADRB2C单倍型的存在预示对于长效β2激动剂的临床上显著的支气管扩张反应。因此，本发明在开β2激动剂的处方用于支气管痉挛(bronchospasm)的长期治疗中是有用的。单倍型信息可用于确定合适的药物治疗方案。如本文所公开的，与在那些“非C”个体中观测到的相比，单倍型C的存在导致对于用长效beta激动剂治疗更长期的反应。如本文所公开的，C单倍型的存在与气促、咳嗽和多痰(sputum)症状的临床上显著减轻相关。C单倍型组中患者之间BCSS反应的差异在统计学上好于非C单倍型亚组中那些患者的反应。因此，医生可以使用单倍型信息以确定待使用的恰当药物、最佳治疗的剂量和所应施用的药物治疗的频率等等。
单倍型状态也可用于预测药物配置、功效、耐受性和安全性。提供这种信息允许个性化的药品。将遗传药理学引入到临床试验中增加了对特定患者组进行更安全和更有效治疗的前景。
现在将进一步以举例方式描述本发明，所述例子意在帮助一个本领域普通技术人员实施本发明，并不意图以任何方式限制本发明的范围。
实施例
实施例1
用于基因分型的样品取自四个ViozanTMIII期临床试验即SC-397-5097、SC-397-5098、SC-397-5099和SC-397-5163中招募的2450个患者。患者群体包括男性和女性患者，年龄40至80岁，患有稳定的COPD，症状≥2年，并且有至少15年(pack years)的抽烟史。所述研究包括表现出支气管扩张前和支气管扩张后的FEV1/FVC(用力肺活量)小于(预测的正常水平的)65％，和预测的正常水平的20-70％的支气管扩张前和支气管扩张后FEV1的患者。有关患者群体的更多细节和研究设计描述于Laursen等.Respiratory Medicine(2003)，Vol 97，Suppl A，S23-S33中。参与遗传学子研究是自愿的。患者对于遗传分析给出独立的书面告知同意书。患者均同意提供DNA用于在研究对ViozanTM的反应。ViozanTM是双重激动剂(dual agonist)，靶向β2-肾上腺素能受体和多巴胺D2受体基因，被开发用于COPD的治疗(Rennard，2003，RespiratoryMedicine，Vol 97，Suppl A，S1-S2)。
ADRB2基因分型的方法
使用TaqMan或SNaPshot(由Applied Biosystems支持的基因分型方法学)确定肾上腺素能受体中的14个SNPs的基因型，其位于编码区和5’启动子区中(图1)。基因分型的SNPs的位置概括于表1。SNP位置是基于cDNA参照序列M15169，其序列列于SEQ.ID NO：1，其中核苷酸位置与ATG相关并且A＝+1，而负数表示相对于翻译起始密码子的5’位置。等位基因频率是以临床试验群体为基础，所述群体98％是白种人。
TaqMan基因分型在标准条件下使用在边测试边设计(assays-by-design)的服务下自ABI获得的试剂来实施。用于通过TaqMan进行基因分型的12个ADRB2SNPs的PCR引物和等位基因特异性探针概括于表2。SNaPshot基因分型用于对另外两个SNPs(az0003873和az0003875)进行基因分型，用于该基因分型的PCR引物和引物延伸探针概括于表3(两个PCR正向，SEQ.IDNOs：50，51；两个PCR反向，SEQ.ID Nos：52，53；两个SnaPshot引物反向，SEQ.ID Nos：54，55)。没有优化用于SNP az0003873的测试，并且所述基因分型数据未用于任何进一步分析。先前已报导过SNP az0003873频率为1％(参见，例如，Am J Respir Cell Mol Biol.1993 Mar；8(3)：334-9)。
连锁不平衡分析(linkage disequilibrium analysis)的方法
使用修订版的EH(Xie，Ott，Am J Hum Genet，suppl，53，1107(1993))对于ADRB2中14个SNPs的12个计算成对连锁不平衡测量值。SNP IDs az0003873和az0003875未用于所述分析。未获得az0003873的基因分型数据。基于在该临床试验群体中的低等位基因频率将SNP az0003875排除。在所述基因的大部分都存在高度的连锁不平衡，然而该连锁不平衡确实在基因的3’端内中止。因此将SNP Ids az0003877和az0003878，二者均为同义SNPs，从任何进一步的分析中排除。
单倍型分析方法和指定单倍型对
所分析的14个ADRB2SNPs中，将10个SNPs的基因型数据用于指定ADRB2单倍型。基于低等位基因频率将SNP IDs az0003873和az0003875的数据排除。SNP IDs az0003877和az0003878，二者均为同义SNPs，从单倍型分析中排除，因为基因3’端的连锁不平衡较不强烈。这两个3’SNPs的包括具有增加预测的稀有单倍型数目的影响。
程序包SNPHAP( http://www-gene.cimr.cam.ac.uk/clayton/software/)用于预测超过0.3％水平的单倍型。选择0.3％的截止(cut off)以优化具有预测单倍型的个体的数目并减少稀有单倍型的数目。对于2412个受试者，这导致5种具有0.3％以上频率的常见单倍型和预测的单倍型对。
在被基因分型的2450个患者中，发现5种常见单倍型占临床试验群体(98％的白种人)中单倍型多样性的99％。将5种最常见单倍型的单倍型频率，以及这些单倍型中在每个SNP的核苷酸变体概括于表4。
将单倍型对指定给每个受试者。除了38个受试者之外的所有受试者均基于5种最常见单倍型指定了单倍型对。其余受试者具有至少一种稀有单倍型(＜0.3％)。将每种单倍型对的观测到的频率概括于表5。
ADRB2基因型与对VIOZANTM的反应的关联
在两种非同义SNPs az0003871和az0003872的每一种，以及在5’前导顺反子(beta-上游肽，BUP)中的SNP az0003869的氨基酸变体在ADRB2单倍型之间有所不同，如表6所概括。对β2-激动剂药物ViozanTM的反应与ADRB2基因中的单个SNPs、与单倍型对和与“装箱的(binned)”单倍型组相关连。例如，将包含一个或多个拷贝的“C”单倍型的受试者分在一组(C单倍型组)，并将所述反应与不含“C”单倍型拷贝的受试者(非C单倍型组)相比较。
实施例2-单倍型-肺功能分析
剂量给药前(pre-dose)和剂量给药后(post-dose)的FEV1(1秒钟用力呼气量)，即FVC操纵(manoeuvre)中在第一秒内呼出空气的体积(以升表示)，对于所有患者在每次研究就诊时获取其测量值，如临床研究方案中所述。在每个中心使用标准技术实施肺活量测定。有关所用的肺活量计和校准记录的详情由每个中心提供。休息15分钟后，测定缓慢肺活量(SVC；slow vital capacity)、用力肺活量(FVC)和FEV1，进行至少三个独立的操纵(manoeuvre)。记录每个参数的最大值。
在患者亚组中(其中的所有患者响应吸入SABA柳丁氨醇(salbutamol)400μg，显示≥5％的FEV1可逆性)，在8hr期间获取系列FEV1测量值(于5、15、30、45、60、90和120分钟时，并在此后每小时一次，直至给药后(post-dosing)8小时)。在第1天(研究SC-397-5097和SC-397-5098)、第8和12周(SC-397-5098)以及第14和26周(SC-397-5097)进行系列测量。计算AUC0-8、8小时的平均FEV1和与给药前(FEV1最大值)的平均最大变化(mean maximum change)。这些测量用于研究长效β2-激动剂ViozanTM的支气管扩张特性。
图2显示在SC-397-5097和SC-397-5098试验中，通过ADRB2单倍型对分层的患者中的系列FEV1反应。所述单倍型对为：AA(N＝21)；AC(N＝15)；BA(N＝35)；BB(N＝13)；BC(N＝21)。将CC组从分析中排除。如上所述于第一次暴露于ViozanTM时分析系列FEV1。治疗后5分钟观测对ViozanTM的反应。FEV1持续增加直至治疗后2小时。最大增加处于研究药物后一到两个小时。8小时的FEV1显示用ViozanTM治疗的作用持续时间。在通过ADRB2单倍型对分层的亚组之间观测到大约100cc的差异。由于COPD中肺功能的微弱可逆性，50cc的改变被认为是临床上显著的。在具有特定ADRB2单倍型的受试者中，已表明对LABA反应的强度(FEV1最大值)和作用持续时间(8小时的FEV1)二者均更大。AUC(曲线下的面积)分析与FEV1最大值和8小时的FEV1反应相关。具有更高的FEV1最大值和8小时FEV1的患者也具有更高的AUC0-8值。在具有BC单倍型的患者中获得最强反应。具有BB单倍型对的患者确实对LABA作出反应，但与具有其它单倍型对的受试者相比反应“较小”。这与由Drysdale等PNAS，97，2000公开的研究广泛一致，其中单倍型4/6和4/4分别相应于BC和BB。
由于只有少数受试者的系列FEV1测量值可以获得，并且为了提高分析的能力，随后在基于每个患者的单倍型对的两个亚组(“装箱的(binning)”)中分析数据；“C”单倍型(即患者具有至少一个拷贝的“C”单倍型)和“非C”单倍型(即患者不具有“C”单倍型)。“C”单倍型组包括具有单倍型AC、BC和CC的患者，而非C单倍型组包括具有单倍型AA、BB和AB的受试者。为了“装箱的”单倍型分析，不包括具有一个或多个拷贝的单倍型D和E的受试者，因为几乎没有患者具有这些单倍型对。
通过比较治疗前(pre-treatment)和给药前的基线，完成对ADRB2单倍型和长期FEV1反应之间关系的评估。“治疗前”FEV1基线是用于先前没有暴露于研究药物，并且于第1天(第2次就诊)用ViozanTM治疗前立即测定。“给药前”FEV1基线是于后续就诊那天在施用药物前，在试验过程中测定的，即在第8和12周(SC-397-5098)以及第14和26周(SC-397-5097)。在这些试验过程中分析在系列FEV1患者中基线(波谷)FEV1的变化，显示C-单倍型亚组中基线的上升趋势，并且在缺乏单拷贝C-单倍型的那些受试者中轻微下降。在3个月和6个月的治疗期间，在2个独立试验中均观测到这样的结果。观测结果与C单倍型亚组中延长的支气管扩张趋势和响应用ViozanTM和长效β2-激动剂定期治疗的更好的整体长期肺功能一致。
通过从第2次就诊(第1天)时收集的绝对FEV1测量值和第12周(SC-397-5098)以及第14周(SC-397-5097)的组合数据中减去治疗前的基线值(第2次就诊)，测定了第一次治疗和之后3个月的ViozanTM治疗之间系列FEV1反应的分析结果。图4显示组合的系列FEV1数据，自治疗前的变化，用于SC-397-5098和SC-397-5087研究，其中通过单倍型组(初诊-C hap：N＝36；初诊-非C：N＝65；3个月-C hap：N＝29；3个月-非C hap：N＝54)分层反应。图4表明3个月后具有非C单倍型的患者可能具有较弱的反应。对于“C”单倍型亚组中的患者，第1天(第2次就诊)的系列FEV1反应与治疗后3个月时的反应重叠。对于非C单倍型组在第1天(第2次就诊)观测到类似的反应。然而，在非C单倍型组中，治疗3个月后系列FEV1反应出现减小。该观测结果是在“C”单倍型和“非C”单倍型亚组之间观测到的差异FEV1基线的反映。通过ADRB2单倍型对的肺功能反应分层(stratification)表明在具有“C”单倍型的COPD患者中，对β2激动剂的反应更强，并在长期治疗期间得以保持。在具有至少一个拷贝ADRB2“C”单倍型的COPD患者中，借助于延长的作用持续时间，LABA药物可以提供更强的支气管保护。
概括地说，这些数据表明对于所有携带至少一个“C”单倍型的个体，具有一致的对于ViozanTM更好的临床反应的趋势。具有“C”单倍型的受试者具有对于ViozanTM的最佳的初始反应。发现单倍型对BC在首次暴露于所述药物时获得的FEV1的最大值最高。在“C”对比“非C”单倍型组中，通过评估两个独立功效试验中用ViozanTM治疗的受试者的给药前FEV1测量值来表明延长的作用持续时间(残余支气管扩张(residual bronchodilation))。
实施例3-单倍型-症状分数关联
使用BCSS(气促、咳嗽和多痰分数)，也称为TSS(整体症状分数)评估COPD症状的变化。每天由患者评估每种症状，即气促、咳嗽和多痰，并使用5分Likert评分(Likert scale)(范围从0到4，越高的分值表示越严重的症状)记录在日志中。合计三个项目分数以计算BCSS总分，得到介于0和12之间的数值。Leidy等，2003，Respiratory Medicine，Vol 97，SupplA，S59-S70中讨论了用于评估COPD中症状的BCSS的可靠性和有效性。BCSS总分上±1分的平均改变代表患有中度至严重COPD的患者症状严重程度的实质性改善(Celliet al.Respiratory Medicine，(2003)Vol 97，SupplA，S35-43)。
图5显示对于通过ADRB2单倍型对分层的患者亚组自基线BCSS的改变。将患者用ViozanTM治疗。所述单倍型对为：AA(N＝61)；AC(N＝35)；BA(N＝100)；BB(N＝40)；BC(N＝41)；CC(N＝8)。在12周试验(SC-397-5163)中显示患者自基线的改变，其中对于每种单倍型对显示每2周间隔的平均BCSS分数，(F-up指治疗后的4周跟踪期)。观测到依赖于单倍型对的广泛的反应分层。于第1-2周观测到BCSS反应的分层，并在整个治疗过程中保持。BCSS中0.3单位的差异被认为是临床上显著的。因此显示最好反应的亚组(BC、CC和AC)与反应不太好的那些患者(亚组AA和BA)之间的差异在临床上是相关的。由于具有至少一个拷贝C单倍型的受试者看起来表现出最大的症状减轻，如先前(实施例2)所述使用“装箱的”单倍型组分析数据。
图6显示SC-397-5163研究中对于用ViozanTM治疗的患者，BCSS自基线的平均改变，该研究中将患者分层到亚组。可以将C Haps(N＝84)和非CHaps(N＝201)亚组中的BCSS反应与未分层的患者群体(所有Haps，N＝285)中的平均反应相比较。图6显示具有至少一个“C”单倍型的患者对ViozanTM的反应更好。C单倍型亚组中的BCSS反应比总体平均反应(所有患者)更好，并且显著好于非C单倍型亚组中的BCSS反应。用ViozanTM治疗时，具有“C”单倍型的患者经历更大的症状分数减小。
在一个独立的3个月功效试验SC-397-5098中重复BCSS反应的分层，但不在6个月功效试验SC-397-5097中重复。图7显示其中组合了两个3个月功效研究数据的BCSS反应(在ViozanTM研究SC-397-5163和SC-397-5098中的患者的BCSS自基线的平均改变，其中将患者分层到亚组中)。可以将CHaps和非C Haps亚组中的BCSS反应与未分层的患者群体中的平均反应相比。图7A显示用ViozanTM治疗的所有受试者的平均反应，和基于ADRB2“C”单倍型的存在或缺失而分层患者后的BCSS反应。图7A显示C Haps(N＝167)、非C Haps(N＝370)、所有Haps(N＝537)的数据。与“非C”Haps(AA、BB、BA)相比，具有“C”Haps(AC、BC、CC)的ViozanTM患者在平均BCSS中具有多达0.6的减小。图7B显示对用安慰剂处理的患者的相同分析，并且显示几乎没有安慰剂反应的分层的迹象(evidence)。图7B显示C Haps(N＝141)、非C Haps(N＝265)、所有Haps(N＝406)的数据。通过ADRB2单倍型分层显示具有至少一个拷贝C单倍型的患者倾向于具有更好的症状分数，并且这在整个治疗过程中得以保持。C-单倍型组代表该临床试验群体的大约30％。因此，与平均安慰剂反应相比时，大约30％的患者对ViozanTM具有临床上显著的BCSS反应。
用ViozanTM进行大规模临床研究的其中一个主要终点是自基线到治疗期最后4周的平均BCSS的改变。在未分层的患者群体中，ViozanTM和安慰剂治疗组之间，自基线到治疗期最后4周的变化的差异既在统计学上不显著，也不被认为具有临床的重要性。分析相同的数据，显示具有至少一个拷贝C单倍型的受试者对ViozanTM反应良好，在所述数据中基于ADRB2C单倍型的存在或缺失将患者分层。在C单倍型亚组中，对ViozanTM的反应显著好于非C单倍型组中的反应，并显著好于对安慰剂的反应。图8显示C单倍型和非C单倍型亚组之间以及ViozanTM和安慰剂治疗之间BCSS反应的统计比较。图8显示ViozanTMC Haps(N＝167)、ViozanTM非C Haps(N＝369)、安慰剂C Haps(N＝141)和安慰剂非C Haps(N＝265)的数据。ViozanTM C和非C haps之间的差异是非常显著的(p＝0.0023)。
总结
对于临床结果的肺功能和BCSS测量值来说，与非C Hap个体相比，具有一个或多个“C”单倍型的患者均对ViozanTM反应较好。我们已显示ADRB2单倍型与用ViozanTM治疗的COPD患者中症状减轻之间的统计学上的显著关联。C单倍型组中COPD症状的改善显著大于ViozanTM非C单倍型组和安慰剂C单倍型组中的情况。
BCSS分数与COPD治疗中的其它干预有效性的测量值包括FEV1和SGRQ(Leidy et al，2003，Respiratory Medicine，Vol 97，SupplA，S59-S70)有很好的关联。因此高达30％的具有限定的ADRB2单倍型的COPD受试者具有临床上显著的对于β2-激动剂的BCSS反应的观测结果是显著的。支气管扩张持续时间增加的趋势与定期暴露于LABA后C单倍型亚组中长期肺功能改善的观测结果一致。
本研究中，起反应的亚组代表30％的患者。“反应者组”中受试者的比例与98％的临床试验群体为白种人来源相符。在C单倍型具有更高频率的群体中，预期反应者组的大小将更大。例如，在非洲裔美国人中C单倍型是最常见的ADRB2单倍型(Drysdale et al.)。
Drysdale等报导了哮喘中ADRB2单倍型和对于短效β2激动剂舒喘灵的反应之间的关联，这通过肺功能进行评估。在所述研究中，用4/6单倍型观测到最好的反应。这与本文提供的对于长效β2激动剂ViozanTM结果一致，其中BC单倍型显示最好的反应。类似地，用4/4单倍型观测到最低反应对应于用BB单倍型获得的ViozanTM结果，并且用2/2单倍型观测到中度反应，对应于用AA单倍型获得的ViozanTM结果。
因此，这是在COPD群体中，有关长期维持治疗的对于β2-激动剂反应的首个遗传药理学分层的实例。数据显示可以使用基因分型手段鉴定COPD患者群体，其对用有定期预定的(regularly scheduled)β2-激动剂的长期治疗反应最佳。与C单倍型组相比，C单倍型亚组看起来明显表现出对于b2-激动剂的延长的反应持续时间。患者ADRB2单倍型的知悉可用于优化对于单个患者的b2-激动剂剂量和治疗方案，因此对具有一个或多个拷贝C单倍型的那些个体减少总的药物负载(load)和暴露(exposure)。
表
现在提供本文以上提到的表1至6。
表1
  SNP   mutDB ID   M15169cDNA中的位点   相对于ATGM15169的位点   位置   密码子编号   氨基酸   变体等位基因频率(n＝2450)   主要等位基因频率(n＝2450)
  T/AG/AG/AT/CT/CT/CG/AC/GG/AG/AC/TC/AG/CG/A   AZ0003859AZ0003861AZ0003863AZ0003868AZ0003869AZ0003870AZ0003871AZ0003872AZ0003873AZ0003874AZ0003875AZ0003876AZ0003877AZ0003878   15956593412211541156816331666168718392078211026402826   -1429-1023-654-367-47-20467910025249152310531239   5′UTR5′UTR5′UTR5′UTR5′UTR5′UTRcdscdscdscdscdscdscdscds   ------16273484164175351413    ----Cys/Arg BUP-Arg＞GlyGln＞GluVal＞MetLeuThr＞IleArgGlyLeu   0.200.420.380.420.430.430.380.42nd0.190.020.160.300.34   0.800.580.620.580.570.570.620.58nd0.810.980.840.700.66
注
基于cDNA参照序列M15169的SNP位点
注意ADRB2是单一外显子基因，此表中的SNPs聚集在3.2kb区域
基于对2450个受试者的临床试验群体进行基因分型的等位基因频率
表2：用于对ADRB2 SNPs进行基因分型的TaqMan引物和等位基因特异性探针
  MutDb Id   位点  等位基因1   等位基因2  VIC探针序列   6FAM探针序列   正向引物序列   反向引物序列
  az0003859   ADRB2-1429   T   A   TGTCTTAACATTAAGAACAT   AAGAATGTCTTAACTTTAAG   GCCAGGATCTTTTGCTTTCTATAGC   ATGGCAAATTCATATGGTTCAGAGT
  az0003861   ADRB2-1023   G   A   ACAGCTGCCGATTT   AGCTGCTGATTTC   GGAGGGCACCTAAAGTACTTGACA   GCAAGAGCACAGGAGGTGACTT
  az0003863   ADRB2-654   G   A   AGTCTGAGCATGTCT   AAGTCTAAGCATGTCTG   TGTCTATGGCTGTGGTTCGGTAT   CGCACATACAGGCACAAATACAC
  az0003868   ADRB2-367   T   C   CAGCCTCAGGAGAA   CAGCCCCAGGAGA   GCCCTCCAGGGAGCAGTT   AGGCACTCCTCCCCTTTCC
  az0003869   ADRB2-47   T   C   TCAGCAGGCGGAC   TCAGCGGGCGGAC   CCGCTGAATGAGGCTTCCA   CCATGGCGCGCAGTCT
  az0003870   ADRB2-20   T   C   AGTGCGCTTACCTG   AGTGCGCTCACCTG   CCGCTGAATGAGGCTTCCA   CCATGGCGCGCAGTCT
  az0003871   ADRB246   A   G   CCCAATGGAAGCCA   CCCAATAGAAGCCATG   GGCAGCGCCTTCTTGCT   ACCCACACCTCGTCCCTTT
  az0003872   ADRB279   C   G   TCACGCAGCAAAG   TCACGCAGGAAAG   GCGCCGGACCACGAC   AGGACGATGAGAGACATGACGAT
  az0003874   ADRB2252   G   A   ATGGGCCTGGCAGT   ATGGGCCTAGCAGTG   CACTGGCCTGTGCTGATCTG   GGCGGCCCCAAAGG
  MutDb Id   位点  等位基因1   等位基因2  VIC探针序列   6FAM探针序列   正向引物序列   反向引物序列
  az0003876   ADRB2523   C   A   TGGTACCGGGCCAC   TGGTACAGGGCCACC   TTCTTGCCCATTCAGATGCA   GCATAGCAGTTGATGGCTTCCT
  az0003877   ADRB21053   G   C   AGGCCTATGGGAATG   CTATGGCAATGGC   CCTGCGCAGGTCTTCTTTG   GTGTTGCCGTTGCTGGAGTA
  az0003878   ADRB21239   G   A   CACTGCTGTAAAGC   ACTCACTGCTATAAAG   ATAACATTGATTCACAAGGGAGGAA   GTTAAATAGTCTGTTTAGTGTTCTGTTGGG
表3：用于对ADR B2SNPs进行基因分型的SNaPshot PCR和引物延伸引物。
  MutdbID   位点   等位基因1   等位基因2  PCR正向  PCR反向   SnaPshot引物REVERSE
  az0003873   ADRB2100   G   A  CACAGCCGCTGAATGAGG  AACTTGGCAATGGCTGTGAT   TGACGATGCCCATGCCCA
  az0003875   ADRB2491   C   T  AGTACCAGAGCCTGCTGACC  GACACGATGGAAGAGGCAAT   (T×13)GCATCTGAATGGGCAAGAAGGAG
表4：在占优势的白种人临床试验群体中最常见的ADRB2单倍型的频率
 位点SNP ID(AZ000)   -14293859   -10233861   -6543863   -3673868   -473869   -203870   463871   793872   2523874   5233876   单倍型AZ ID   频率n＝2450
  碱基碱基碱基碱基碱基   TTAAT   AGGGA   GAGGG   CTTTT   CTTTT   CTTTT   GAGGA   GCCCC   GGAAG   CCACC   ABCDE   42.10％38.00％16.60％2.90％0.40％
自2450个受试者的基因型数据测得
表中没有显示稀有单倍型(频率＜0.3)
表5：ADRB2单倍型对的频率，其中单倍型对是单倍型A、B、C、D和E的组合
  单倍型   A   B   C   D   E
  ABCDE   17.59％////   31.84％14.33％///   13.27％12.16％2.98％//   2.41％2.12％0.98％0.08％/   0.20％0.20％0.16％0.00％0.12％
表6：由最常见的ADRB2单倍型编码的氨基酸变体
  单倍型ID   BUPCys＞Arg   16Gly＞Arg   27Gln＞Glu
  ABCDE   ArgCysCysCysCys   GlyArgGlyGlyArg   GluGlnGlnGlnGln
序列
SEQ.ID NO：1
ADRB2 cDNA序列(M15169)；长度：3451
1    CCCGGGTTCA AGAGATTCTC CTGTCTCAGC CTCCCGAGTA GCTGGGACTA CAGGTACGTG
61   CCACCACACC TGGCTAATTT TTGTATTTTT AGTAGAGACA AGAGTTACAC CATATTGGCC
121  AGGATCTTTT GCTTTCTATA GCTTCAAAAT GTTCTTAATG TTAAGACATT CTTAATACTC
181  TGAACCATAT GAATTTGCCA TTTTGGTAAG TCACAGACGC CAGATGGTGG CAATTTCACA
241  TGGCACAACC CGAAAGATTA ACAAACTATC CAGCAGATGA AAGGATTTTT TTTAGTTTCA
301  TTGGGTTTAC TGAAGAAATT GTTTGAATTC TCATTGCATC TCCAGTTCAA CAGATAATGA
361  GTGAGTGATG CCACACTCTC AAGAGTTAAA AACAAAACAA CAAAAAAATT AAAACAAAAG
421  CACACAACTT TCTCTCTCTG TCCCAAAATA CATACTTGCA TACCCCCGCT CCAGATAAAA
481  TCCAAAGGGT AAAACTGTCT TCATGCCTGC AAATTCCTAA GGAGGGCACC TAAAGTACTT
541  GACAGCGAGT GTGCTGAGGA AATCGGCAGC TGTTGAAGTC ACCTCCTGTG CTCTTGCCAA
601  ATGTTTGAAA GGGAATACAC TGGGTTACCG GGTGTATGTT GGGAGGGGAG CATTATCAGT
661  GCTCGGGTGA GGCAAGTTCG GAGTACCCAG ATGGAGACAT CCGTGTCTGT GTCGCTCTGG
721  ATGCCTCCAA GCCAGCGTGT GTTTACTTTC TGTGTGTGTC ACCATGTCTT TGTGCTTCTG
781  GGTGCTTCTG TGTTTGTTTC TGGCCGCGTT TCTGTGTTGG ACAGGGGTGA CTTTGTGCCG
841  GATGGCTTCT GTGTGAGAGC GCGCGCGAGT GTGCATGTCG GTGAGCTGGG AGGGTGTGTC
901  TCAGTGTCTA TGGCTGTGGT TCGGTATAAG TCTGAGCATG TCTGCCAGGG TGTATTTGTG
961  CCTGTATGTG CGTGCCTCGG TGGGCACTCT CGTTTCCTTC CGAATGTGGG GCAGTGCCGG
1021 TGTGCTGCCC TCTGCCTTGA GACCTCAAGC CGCGCAGGCG CCCAGGGCAG GCAGGTAGCG
1081 GCCACAGAAG AGCCAAAAGC TCCCGGGTTG GCTGGTAAGG ACACCACCTC CAGCTTTAGC
1141 CCTCTGGGGC CAGCCAGGGT AGCCGGGAAG CAGTGGTGGC CCGCCCTCCA GGGAGCAGTT
1201 GGGCCCCGCC CGGGCCAGCC CCAGGAGAAG GAGGGCGAGG GGAGGGGAGG GAAAGGGGAG
1261 GAGTGCCTCG CCCCTTCGCG GCTGCCGGCG TGCCATTGGC CGAAAGTTCC CGTACGTCAC
1321 GGCGAGGGCA GTTCCCCTAA AGTCCTGTGC ACATAACGGG CAGAACGCAC TGCGAAGCGG
1381 CTTCTTCAGA GCACGGGCTG GAACTGGCAG GCACCGCGAG CCCCTAGCAC CCGACAAGCT
1441 GAGTGTGCAG GACGAGTCCC CACCACACCC ACACCACAGC CGCTGAATGA GGCTTCCAGG
1501 CGTCCGCTCG CGGCCCGCAG AGCCCCGCCG TGGGTCCGCC CGCTGAGGCG CCCCCAGCCA
1561 GTGCGCTTAC CTGCCAGACT GCGCGCCATG GGGCAACCCG GGAACGGCAG CGCCTTCTTG
1621 CTGGCACCCA ATAGAAGCCA TGCGCCGGAC CACGACGTCA CGCAGCAAAG GGACGAGGTG
1681 TGGGTGGTGG GCATGGGCAT CGTCATGTCT CTCATCGTCC TGGCCATCGT GTTTGGCAAT
1741 GTGCTGGTCA TCACAGCCAT TGCCAAGTTC GAGCGTCTGC AGACGGTCAC CAACTACTTC
1801 ATCACTTCAC TGGCCTGTGC TGATCTGGTC ATGGGCCTGG CAGTGGTGCC CTTTGGGGCC
1861 GCCCATATTC TTATGAAAAT GTGGACTTTT GGCAACTTCT GGTGCGAGTT TTGGACTTCC
1921 ATTGATGTGC TGTGCGTCAC GGCCAGCATT GAGACCCTGT GCGTGATCGC AGTGGATCGC
1981 TACTTTGCCA TTACTTCACC TTTCAAGTAC CAGAGCCTGC TGACCAAGAA TAAGGCCCGG
2041 GTGATCATTC TGATGGTGTG GATTGTGTCA GGCCTTACCT CCTTCTTGCC CATTCAGATG
2101 CACTGGTACC GGGCCACCCA CCAGGAAGCC ATCAACTGCT ATGCCAATGA GACCTGCTGT
2161 GACTTCTTCA CGAACCAAGC CTATGCCATT GCCTCTTCCA TCGTGTCCTT CTACGTTCCC
2221 CTGGTGATCA TGGTCTTCGT CTACTCCAGG GTCTTTCAGG AGGCCAAAAG GCAGCTCCAG
2281 AAGATTGACA AATCTGAGGG CCGCTTCCAT GTCCAGAACC TTAGCCAGGT GGAGCAGGAT
2341 GGGCGGACGG GGCATGGACT CCGCAGATCT TCCAAGTTCT GCTTGAAGGA GCACAAAGCC
2401 CTCAAGACGT TAGGCATCAT CATGGGCACT TTCACCCTCT GCTGGCTGCC CTTCTTCATC
2461 GTTAACATTG TGCATGTGAT CCAGGATAAC CTCATCCGTA AGGAAGTTTA CATCCTCCTA
2521 AATTGGATAG GCTATGTCAA TTCTGGTTTC AATCCCCTTA TCTACTGCCG GAGCCCAGAT
2581 TTCAGGATTG CCTTCCAGGA GCTTCTGTGC CTGCGCAGGT CTTCTTTGAA GGCCTATGGG
2641 AATGGCTACT CCAGCAACGG CAACACAGGG GAGCAGAGTG GATATCACGT GGAACAGGAG
2701 AAAGAAAATA AACTGCTGTG TGAAGACCTC CCAGGCACGG AAGACTTTGT GGGCCATCAA
2761 GGTACTGTGC CTAGCGATAA CATTGATTCA CAAGGGAGGA ATTGTAGTAC AAATGACTCA
2821 CTGCTGTAAA GCAGTTTTTC TACTTTTAAA GACCCCCCCC CCCCCAACAG AACACTAAAC
2881 AGACTATTTA ACTTGAGGGT AATAAACTTA GAATAAAATT GTAAAAATTG TATAGAGATA
2941 TGCAGAAGGA AGGGCATCCT TCTGCCTTTT TTATTTTTTT AAGCTGTAAA AAGAGAGAAA
3001 ACTTATTTGA GTGATTATTT GTTATTTGTA CAGTTCAGTT CCTCTTTGCA TGGAATTTGT
3061 AAGTTTATGT CTAAAGAGCT TTAGTCCTAG AGGACCTGAG TCTGCTATAT TTTCATGACT
3121 TTTCCATGTA TCTACCTCAC TATTCAAGTA TTAGGGGTAA TATATTGCTG CTGGTAATTT
3181 GTATCTGAAG GAGATTTTCC TTCCTACACC CTTGGACTTG AGGATTTTGA GTATCTCGGA
3241 CCTTTCAGCT GTGAACATGG ACTCTTCCCC CACTCCTCTT ATTTGCTCAC ACGGGGTATT
3301 TTAGGCAGGG ATTTGAGGAG CAGCTTCAGT TGTTTTCCCG AGCAAAGGTC TAAAGTTTAC
3361 AGTAAATAAA ATGTTTGACC ATGCCTTCAT TGCACCTGTT TGTCCAAAAC CCCTTGACTG
3421 GAGTGCTGTT GCCTCCCCCA CTGGAAACCG C
SEQ.ID NO：2至SEQ.ID NO：13
表2：VIC探针序列
2
tgtcttaaca ttaagaacat                                                20
3
acagctgccg attt                                                      14
4
agtctgagca tgtct                                                     15
5
cagcctcagg agaa                                                      14
6
tcagcaggcg gac                                                       13
7
agtgcgctta cctg                                                      14
8
cccaatggaa gcca                                                      14
9
tcacgcagca aag                                                       13
10
atgggcctgg cagt                                                      14
11
tggtaccggg ccac                                                      14
12
aggcctatgg gaatg                                                     15
13
cactgctgta aagc                                                      14
SEQ.ID NO：14至SEQ.ID NO：25
表2：6FAM探针序列
14
aagaatgtct taactttaag                                                20
15
agctgctgat ttc                                                       13
16
aagtctaagc atgtctg                                                   17
17
cagccccagg aga                                                       13
18
tcagcgggcg gac                                                       13
19
agtgcgctca cctg                                                      14
20
cccaatagaa gccatg                                                    16
21
tcacgcagga aag                                                       13
22
atgggcctag cagtg                                                     15
23
tggtacaggg ccacc                                                     15
24
ctatggcaat ggc                                                       13
25
actcactgct ataaag                                                    16
SEQ.ID NO：25至SEQ.ID NO：37
表2：正向引物序列
26
gccaggatct tttgctttct atagc                                          25
27
ggagggcacc taaagtactt gaca                                           24
28
tgtctatggc tgtggttcgg tat                                            23
29
gccctccagg gagcagtt                                                  18
30
ccgctgaatg aggcttcca                                                 19
31
ccgctgaatg aggcttcca                                                 19
32
ggcagcgcct tcttgct                                                   17
33
gcgccggacc acgac                                                     15
34
cactggcctg tgctgatctg                                                20
35
ttcttgccca ttcagatgca                                                20
36
cctgcgcagg tcttctttg                                                 19
37
ataacattga ttcacaaggg aggaa                                          25
SEQ.ID NO：38至SEQ.ID NO：49
表2：反向引物序列
38
atggcaaatt catatggttc agagt                                          25
39
gcaagagcac aggaggtgac tt                                             22
40
cgcacataca ggcacaaata cac                                            23
41
aggcactcct cccctttcc                                                 19
42
ccatggcgcg cagtct                                                    16
43
ccatggcgcg cagtct                                                    16
44
acccacacct cgtcccttt                                                 19
45
aggacgatga gagacatgac gat                                            23
46
ggcggcccca aagg                                                      14
47
gcatagcagt tgatggcttc ct                                             22
48
gtgttgccgt tgctggagta                                                20
49
gttaaatagt ctgtttagtg ttctgttggg                                     30
SEQ.ID NO：50至SEQ.ID NO：51
表3：PCR正向序列
50
cacagccgct gaatgagg                                                  18
51
agtaccagag cctgctgacc                                                20
SEQ.ID NO：52至SEQ.ID NO：53
表3：PCR反向序列
52
aacttggcaa tggctgtgat                                                20
53
gacacgatgg aagaggcaat                                                20
SEQ.ID NO：54至SEQ.ID NO：55
表3：SnaPshot引物反向序列
54
tgacgatgcc catgccca                                                  18
55
gcatctgaat gggcaagaag gag                                            23
                                  序列表
<110>阿斯利康(瑞典)有限公司(AstraZeneca AB)
<120>将患者鉴定为用长效beta激动剂治疗的候选者并用于通过分析beta2肾上腺素能受体基因中的多态性来预测患者对长效beta2激动剂治疗的反应的方法
<130>101178
<160>55
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>3451
<212>DNA
<213>人
<400>1
cccgggttca agagattctc ctgtctcagc ctcccgagta gctgggacta caggtacgtg    60
ccaccacacc tggctaattt ttgtattttt agtagagaca agagttacac catattggcc    120
aggatctttt gctttctata gcttcaaaat gttcttaatg ttaagacatt cttaatactc    180
tgaaccatat gaatttgcca ttttggtaag tcacagacgc cagatggtgg caatttcaca    240
tggcacaacc cgaaagatta acaaactatc cagcagatga aaggattttt tttagtttca    300
ttgggtttac tgaagaaatt gtttgaattc tcattgcatc tccagttcaa cagataatga    360
gtgagtgatg ccacactctc aagagttaaa aacaaaacaa caaaaaaatt aaaacaaaag    420
cacacaactt tctctctctg tcccaaaata catacttgca tacccccgct ccagataaaa    480
tccaaagggt aaaactgtct tcatgcctgc aaattcctaa ggagggcacc taaagtactt    540
gacagcgagt gtgctgagga aatcggcagc tgttgaagtc acctcctgtg ctcttgccaa    600
atgtttgaaa gggaatacac tgggttaccg ggtgtatgtt gggaggggag cattatcagt    660
gctcgggtga ggcaagttcg gagtacccag atggagacat ccgtgtctgt gtcgctctgg    720
atgcctccaa gccagcgtgt gtttactttc tgtgtgtgtc accatgtctt tgtgcttctg    780
ggtgcttctg tgtttgtttc tggccgcgtt tctgtgttgg acaggggtga ctttgtgccg    840
gatggcttct gtgtgagagc gcgcgcgagt gtgcatgtcg gtgagctggg agggtgtgtc    900
tcagtgtcta tggctgtggt tcggtataag tctgagcatg tctgccaggg tgtatttgtg    960
cctgtatgtg cgtgcctcgg tgggcactct cgtttccttc cgaatgtggg gcagtgccgg    1020
tgtgctgccc tctgccttga gacctcaagc cgcgcaggcg cccagggcag gcaggtagcg    1080
gccacagaag agccaaaagc tcccgggttg gctggtaagg acaccacctc cagctttagc    1140
cctctggggc cagccagggt agccgggaag cagtggtggc ccgccctcca gggagcagtt    1200
gggccccgcc cgggccagcc ccaggagaag gagggcgagg ggaggggagg gaaaggggag    1260
gagtgcctcg ccccttcgcg gctgccggcg tgccattggc cgaaagttcc cgtacgtcac    1320
ggcgagggca gttcccctaa agtcctgtgc acataacggg cagaacgcac tgcgaagcgg    1380
cttcttcaga gcacgggctg gaactggcag gcaccgcgag cccctagcac ccgacaagct    1440
gagtgtgcag gacgagtccc caccacaccc acaccacagc cgctgaatga ggcttccagg    1500
cgtccgctcg cggcccgcag agccccgccg tgggtccgcc cgctgaggcg cccccagcca    1560
gtgcgcttac ctgccagact gcgcgccatg gggcaacccg ggaacggcag cgccttcttg    1620
ctggcaccca atagaagcca tgcgccggac cacgacgtca cgcagcaaag ggacgaggtg    1680
tgggtggtgg gcatgggcat cgtcatgtct ctcatcgtcc tggccatcgt gtttggcaat    1740
gtgctggtca tcacagccat tgccaagttc gagcgtctgc agacggtcac caactacttc    1800
atcacttcac tggcctgtgc tgatctggtc atgggcctgg cagtggtgcc ctttggggcc    1860
gcccatattc ttatgaaaat gtggactttt ggcaacttct ggtgcgagtt ttggacttcc    1920
attgatgtgc tgtgcgtcac ggccagcatt gagaccctgt gcgtgatcgc agtggatcgc    1980
tactttgcca ttacttcacc tttcaagtac cagagcctgc tgaccaagaa taaggcccgg    2040
gtgatcattc tgatggtgtg gattgtgtca ggccttacct ccttcttgcc cattcagatg    2100
cactggtacc gggccaccca ccaggaagcc atcaactgct atgccaatga gacctgctgt    2160
gacttcttca cgaaccaagc ctatgccatt gcctcttcca tcgtgtcctt ctacgttccc    2220
ctggtgatca tggtcttcgt ctactccagg gtctttcagg aggccaaaag gcagctccag    2280
aagattgaca aatctgaggg ccgcttccat gtccagaacc ttagccaggt ggagcaggat    2340
gggcggacgg ggcatggact ccgcagatct tccaagttct gcttgaagga gcacaaagcc    2400
ctcaagacgt taggcatcat catgggcact ttcaccctct gctggctgcc cttcttcatc    2460
gttaacattg tgcatgtgat ccaggataac ctcatccgta aggaagttta catcctccta    2520
aattggatag gctatgtcaa ttctggtttc aatcccctta tctactgccg gagcccagat    2580
ttcaggattg ccttccagga gcttctgtgc ctgcgcaggt cttctttgaa ggcctatggg    2640
aatggctact ccagcaacgg caacacaggg gagcagagtg gatatcacgt ggaacaggag    2700
aaagaaaata aactgctgtg tgaagacctc ccaggcacgg aagactttgt gggccatcaa    2760
ggtactgtgc ctagcgataa cattgattca caagggagga attgtagtac aaatgactca    2820
ctgctgtaaa gcagtttttc tacttttaaa gacccccccc cccccaacag aacactaaac    2880
agactattta acttgagggt aataaactta gaataaaatt gtaaaaattg tatagagata    2940
tgcagaagga agggcatcct tctgcctttt ttattttttt aagctgtaaa aagagagaaa    3000
acttatttga gtgattattt gttatttgta cagttcagtt cctctttgca tggaatttgt    3060
aagtttatgt ctaaagagct ttagtcctag aggacctgag tctgctatat tttcatgact    3120
tttccatgta tctacctcac tattcaagta ttaggggtaa tatattgctg ctggtaattt    3180
gtatctgaag gagattttcc ttcctacacc cttggacttg aggattttga gtatctcgga    3240
cctttcagct gtgaacatgg actcttcccc cactcctctt atttgctcac acggggtatt    3300
ttaggcaggg atttgaggag cagcttcagt tgttttcccg agcaaaggtc taaagtttac    3360
agtaaataaa atgtttgacc atgccttcat tgcacctgtt tgtccaaaac cccttgactg    3420
gagtgctgtt gcctccccca ctggaaaccg c                                   3451
<210>2
<211>20
<212>DNA
<213>人
<400>2
tgtcttaaca ttaagaacat                                                20
<210>3
<211>14
<212>DNA
<213>人
<400>3
acagctgccg attt                                                      14
<210>4
<211>15
<212>DNA
<213>人
<400>4
agtctgagca tgtct                                                     15
<210>5
<211>14
<212>DNA
<213>人
<400>5
cagcctcagg agaa                                                      14
<210>6
<211>13
<212>DNA
<213>人
<400>6
tcagcaggcg gac                                                       13
<210>7
<211>14
<212>DNA
<213>人
<400>7
agtgcgctta cctg                                                      14
<210>8
<211>14
<212>DNA
<213>人
<400>8
cccaatggaa gcca                                                      14
<210>9
<211>13
<212>DNA
<213>人
<400>9
tcacgcagca aag                                                       13
<210>10
<211>14
<212>DNA
<213>人
<400>10
atgggcctgg cagt                                                      14
<210>11
<211>14
<212>DNA
<213>人
<400>11
tggtaccggg ccac                                                      14
<210>12
<211>15
<212>DNA
<213>人
<400>12
aggcctatgg gaatg                                                     15
<210>13
<211>14
<212>DNA
<213>人
<400>13
cactgctgta aagc                                                      14
<210>14
<211>20
<212>DNA
<213>人
<400>14
aagaatgtct taactttaag                                                20
<210>15
<211>13
<212>DNA
<213>人
<400>15
agctgctgat ttc                                                       13
<210>16
<211>17
<212>DNA
<213>人
<400>16
aagtctaagc atgtctg                                                   17
<210>17
<211>13
<212>DNA
<213>人
<400>17
cagccccagg aga                                                       13
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<211>13
<212>DNA
<213>人
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<212>DNA
<213>人
<400>19
agtgcgctca cctg                                                      14
<210>20
<211>16
<212>DNA
<213>人
<400>20
cccaatagaa gccatg                                                    16
<210>21
<211>13
<212>DNA
<213>人
<400>21
tcacgcagga aag                                                       13
<210>22
<211>15
<212>DNA
<213>人
<400>22
atgggcctag cagtg                                                     15
<210>23
<211>15
<212>DNA
<213>人
<400>23
tggtacaggg ccacc                                                     15
<210>24
<211>13
<212>DNA
<213>人
<400>24
ctatggcaat ggc                                                       13
<210>25
<211>16
<212>DNA
<213>人
<400>25
actcactgct ataaag                                                    16
<210>26
<211>25
<212>DNA
<213>人
<400>26
gccaggatct tttgctttct atagc                                          25
<210>27
<211>24
<212>DNA
<213>人
<400>27
ggagggcacc taaagtactt gaca                                           24
<210>28
<211>23
<212>DNA
<213>人
<400>28
tgtctatggc tgtggttcgg tat                                            23
<210>29
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<212>DNA
<213>人
<400>29
gccctccagg gagcagtt                                                  18
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<212>DNA
<213>人
<400>30
ccgctgaatg aggcttcca                                                 19
<210>31
<211>19
<212>DNA
<213>人
<400>31
ccgctgaatg aggcttcca                                                 19
<210>32
<211>17
<212>DNA
<213>人
<400>32
ggcagcgcct tcttgct                                                   17
<210>33
<211>15
<212>DNA
<213>人
<400>33
gcgccggacc acgac                                                     15
<210>34
<211>20
<212>DNA
<213>人
<400>34
cactggcctg tgctgatctg                                                20
<210>35
<211>20
<212>DNA
<213>人
<400>35
ttcttgccca ttcagatgca                                                20
<210>36
<211>19
<212>DNA
<213>人
<400>36
cctgcgcagg tcttctttg                                                 19
<210>37
<211>25
<212>DNA
<213>人
<400>37
ataacattga ttcacaaggg aggaa                                          25
<210>38
<211>25
<212>DNA
<213>人
<400>38
atggcaaatt catatggttc agagt                                          25
<210>39
<211>22
<212>DNA
<213>人
<400>39
gcaagagcac aggaggtgac tt                                             22
<210>40
<211>23
<212>DNA
<213>人
<400>40
cgcacataca ggcacaaata cac                                            23
<210>41
<211>19
<212>DNA
<213>人
<400>41
aggcactcct cccctttcc                                                 19
<210>42
<211>16
<212>DNA
<213>人
<400>42
ccatggcgcg cagtct                                                    16
<210>43
<211>16
<212>DNA
<213>人
<400>43
ccatggcgcg cagtct                                                    16
<210>44
<211>19
<212>DNA
<213>人
<400>44
acccacacct cgtcccttt                                                 19
<210>45
<211>23
<212>DNA
<213>人
<400>45
aggacgatga gagacatgac gat                                            23
<210>46
<211>14
<212>DNA
<213>人
<400>46
ggcggcccca aagg                                                      14
<210>47
<211>22
<212>DNA
<213>人
<400>47
gcatagcagt tgatggcttc ct                                             22
<210>48
<211>20
<212>DNA
<213>人
<400>48
gtgttgccgt tgctggagta                                                20
<210>49
<211>30
<212>DNA
<213>人
<400>49
gttaaatagt ctgtttagtg ttctgttggg                                     30
<210>50
<211>18
<212>DNA
<213>人
<400>50
cacagccgct gaatgagg                                                  18
<210>51
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<212>DNA
<213>人
<400>51
agtaccagag cctgctgacc                                                20
<210>52
<211>20
<212>DNA
<213>人
<400>52
aacttggcaa tggctgtgat                                                20
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<212>DNA
<213>人
<400>53
gacacgatgg aagaggcaat                                                20
<210>54
<211>18
<212>DNA
<213>人
<400>54
tgacgatgcc catgccca                                                  18
<210>55
<211>23
<212>DNA
<213>人
<400>55
gcatctgaat gggcaagaag gag                                            23

Claims (9)

1.将患者鉴定为用长效beta激动剂治疗的候选者的方法，其包括：
a)从患者分离生物样品；
b)鉴定在所述样品中存在或缺失至少一个单倍型C；其中在患者样品中存在至少一个单倍型C表明所述患者是良好的治疗候选者。
2.如权利要求1所述的方法，其中用于鉴定存在或缺失至少一个单倍型C的方法包括：
a)由已从患者去除的生物样品中分离核酸；和
b)在ADRB2基因组DNA的一个等位基因中检测存在于下述位点的下述核苷酸(参见表4)：
位点        核苷酸
-47         T
46          G
79          C
3.如权利要求1或权利要求2所述的方法，其中用于鉴定存在或缺失至少一个单倍型C的方法包括：
a)由已从患者去除的生物样品中分离核酸；和
b)在ADRB2 cDNA的一个等位基因中检测存在于下述位点的下述核苷酸：
位点        核苷酸
-1429       A
-1023       G
-654        G
-367        T
-47         T
-20         T
46          G
79          C
252         A
523         A
4.如权利要求1所述的方法，其中用于鉴定存在或缺失至少一个单倍型C的方法包括：
a)由已从患者去除的生物样品中分离蛋白质；和
b)检测ADRB2蛋白的存在，所述ADRB2蛋白在氨基酸位点16具有Gly，在氨基酸位点27具有Gln。
5.如权利要求1至4任一项所述的方法，其中所述患者患有呼吸道疾病，优选阻塞性气管疾病，并最优选COPD或哮喘。
6.如权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述长效beta2激动剂是ViozanTM。
7.用于预测哮喘患者对长效β2激动剂治疗的反应的方法，其包括在ADRB2的编码序列的核苷酸BUP、16和27检测患者的基因型，其中如果所述患者具有Cys(BUP)、Gly 16和Gln 27，则该患者可能对标准剂量的长效β2激动剂显示良好的反应。
8.分离的核酸分子，其包含表2所列任一寡核苷酸探针的序列。
9.用于预测个体对长效β2激动剂的反应的诊断试剂盒，其包含至少一种如权利要求8所述的分离的核酸分子。
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