CN111304321A - 一种检测儿童安全用药相关基因突变位点的引物组合序列和试剂盒 - Google Patents
一种检测儿童安全用药相关基因突变位点的引物组合序列和试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种检测儿童安全用药相关基因突变位点的引物组合序列和试剂盒。试剂盒包括23对扩增引物,能特异地扩增儿童安全用药相关基因23个常见突变位点区域;23条单碱基延伸引物,用于检测儿童安全用药相关基因23个突变位点基因型;另外包括预处理及检测专用试剂。本发明所述试剂盒可实现1孔检测临床儿童安全用药相关基因23种突变,灵敏度高、特异性强、准确性高,并且操作简便、低成本、高通量,检测快速,结果自动判读,易于临床推广应用。本发明可应用于新生儿或儿童安全用药相关基因的检测,指导临床正确用药,避免用药风险,减少用药伤害,真正地做到精准用药。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物检测技术领域,更具体地,涉及以多重PCR技术结合基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF)技术通过质谱技术与多引物延伸技术和MassARRAY技术结合使用进行儿童安全用药基因检测的引物序列及试剂盒。
技术背景
目前,儿童药物中毒已成为全球公共卫生问题,全球每天有125名儿童因中毒而死亡。在中国,中毒也是儿童伤害死亡的主要原因之一。据国家食药监总局《2016儿童用药安全调查报告白皮书》中数据显示,在儿童群体中,药物中毒占所有中毒就诊儿童的比例从2012年的53%上升到2014年的73%。我国儿童不合理用药高达12%-32%,儿童用药不良反应率为12.9%,其中新生儿高达24.4%。因用药不当,我国每年约7000例儿童死亡,造成肝肾功能、神经系统等损伤的儿童难以计数。据中国聋儿康复研究中心统计,我国7岁以下儿童因不合理使用抗生素造成耳聋的数量多达30万,占总体聋哑儿童比例的30%-40%,50%以上的婴幼儿都在超标用药,每年有30000名儿童,因用药不当致聋,陷入无声世界。可怕的是因用药不当对机体造成的损伤,绝大部分是永久性的。而药物不良反应已经成为人类除了癌症、脑溢血和心血管疾病外的第四大死因。
世界卫生组织发表声明,每年全球约有上千万儿童死亡,其中2/3的儿童死于用药不当,其中新生儿的死亡率占5岁以下儿童死亡率的44%。如何保障大众儿童合理正确使用药物已成为一个亟待解决的重点问题。
我国现有3500多种药品制剂,儿童专用的仅有60多种,所占比例不足2%,大部分药品说明书及相关文献,都缺乏对儿童用药安全性及有效性的资料,90%以上的药品没有适宜儿童的专用剂型;成人药普遍用于儿童,但儿童不是成人的缩小版。很多药品缺少儿童临床试验数据,儿童给药剂量多依据成人剂量,再通过体重换算、体表面积换算、年龄换算等方法来确定,缺乏精准用药的手段。儿童的基因特性决定了机体对药物的代谢能力强弱,直接影响到用药效果。药物在体内代谢慢,将造成药物在体内积聚,严重的便会引起药物中毒。由于每个人体质不同、基因型不同,就算服用相同的药物和剂量,其所产生的效果和副作用也会有所不同。特别是儿童,由于身体各项机能发育尚不完全,对药物的代谢能力本来就很有限,如果弄不清楚孩子体内药物代谢相关基因突变情况的前提下擅自用药,那么带来的伤害将会是难以挽回的。因此,为了避免因治疗时用药不当对儿童造成的危害,需要对儿童的药物基因类型进行检测,选择准确的药物,以适当的方法、剂量、时间指导准确用药。
儿童药物不良反应发生率高,跟多种因素有关。儿童药缺乏、抄说明书使用是首要原因。而另一方面,不良反应的发生跟个体基因也密切相关。研究发现,大部分的药物,是通过肝脏中的细胞色素P450家族酶类(CYP450)实现代谢。而这种酶存在广泛的基因多态性和表型多态性,使其对各种药物的代谢存在个体差异。药物在个体体内的代谢是儿童用药安全性的重要参考因素,例如药物快代谢型的儿童统一正常剂量,服用药物可能会无法获得良好的疗效,而药物慢代谢型的儿童在正常剂量下则可能会引起药物蓄积,损害健康。检测与药物代谢紧密相关的酶的基因型,了解孩子对于三大类常用药物的代谢类型,可避免孩子因用药不当而产生严重不良反应。在美国,规定了新生儿必须进行安全用药的基因检测,以防止因基因问题而导致药物副作用对儿童健康造成伤害。
儿童安全用药基因检测是以药物基因组为依据,通过检测儿童与药物代谢、疗效和毒副作用相关的基因,为其提供安全用药方案的一项检测。儿童安全用药基因检测使用先进的DNA检测技术对儿童相关用药基因进行多态性位点检测,从而对用药相关位点进行解读,预测个体对药物的代谢情况,给出科学的、安全的用药指导。目前,用于儿童安全用药基因检测的方法和产品主要有荧光定量熔解曲线法、反向点杂交法、Sanger测序法、高通量测序法。荧光定量结合溶解曲线法单孔检测通量有限,只能检测少数位点已知突变,每个位点的每种突变基因型均需设计特异引物;覆盖常见位点需要多孔并且每孔进行多重检测,多重探针设计要求高,技术难度大,检测探针成本高昂,结果判读手工操作,易错判;反向点杂交法体系每个位点每一种基因型均需设计探针,成本高昂,分辨率取决于探针有效性,容易有非特异性,且检测流程长,操作复杂,体系开放,样本间极易污染;Sanger测序法是序列金标准,但是流程长,操作复杂,且需要手工判读每一个位点,覆盖常见位点需要多孔检测,成本高,通量低;高通量测序法虽然可一次检测覆盖儿童安全用药基因的所有相关性位点,但其仪器和检测试剂成本高昂,检测样本数量少的时候会造成浪费,导致成本更高,且体系所需核酸样本量高(50ng以上),新生儿足跟血样本量少,浓度低,经常需要进行多个项目的筛查检测,因此很难获得足够的核酸模板;高通量测序检测流程长达3-5天,操作复杂,且需要专业的生信分析人员分析数据,结果判读困难,因此无法作为筛查项目在全国各级地方中小医院大规模推广应用。
本发明基于大量的实验研究,检测包含儿童最常用的几大类药物相关的多个基因,其中精选了中国人群中与这些药物代谢能力相关联的具有代表性的多种药物代谢基因:G6PD、UGT1A1-10、EPHX1、SLCO2B1、LOC101929163、FLOT1、CYP2D6、NAT2、PLA2G4A、HLA-B*5801tag、CYP1A1、IFNL4、PTGS2等,共检测23个突变位点。
儿童安全用药基因检测通过检测药物代谢相关等基因,对孩子的药物治疗具有很好的指导意义,不仅可以指导选择合适的药物,还可以指导选择适合的药量,最终达到提高药物疗效、降低药物毒副作用、减少盲目的医疗费用支出。因此,儿童安全用药基因检测对于为孩子提供合理、有效、安全、经济的药物治疗十分重要。
基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(Matrix Assisted Laser DesorptionIonization Time-of-flight Mass Spectrometry,MALDI-TOF MS),是近年来发展起来的一种新型的软电离生物质谱技术。该技术结合了多重PCR技术、MassARRAY单碱基延伸技术和质谱技术,使得在一个反应体系中可以同时检测多个突变位点,从而大大减轻了工作量,提高了检测通量,并降低了检测费用。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测儿童常见疾病安全用药相关基因位点的飞行时间质谱核酸分析方法,对儿童常见临床疾病相关13个基因的23个SNP位点进行快速检测,从而预知儿童的基因信息,有效地了解儿童药物敏感性,真正实现依据儿童基因特点、体质特征,找到适合儿童的候选药物及用药剂量,减少用药差错和药物不良反应。真正实现精准用药、安全用药。该方法灵活性与可扩展性兼备,操作简单且高通量自动化,符合大规模人群分子筛查和常规基因诊断的要求。
本发明的第一个目的是提供一种用于检测儿童安全用药相关基因位点的引物组合。
本发明的第二个目的是提供一种儿童安全用药基因检测试剂盒。
为了实现上述目的,本发明采用如下技术方案:
一种用于儿童安全用药相关基因突变位点扩增的引物序列,包括如下表所示引物:
本发明提供的第二种技术方案为:一种用于儿童安全用药相关基因突变位点的单碱基延伸检测的引物序列,包括如下表所示引物:
引物名称 | 引物序列(5'-3') | 检测位点 |
SEQ ID NO:47 | ATACGCCAGGCCTCA | rs72554665 |
SEQ ID NO:48 | TGGCACCTATGAAGCA | rs8330 |
SEQ ID NO:49 | GTGGAGATTCTCAACAGA | rs1051740 |
SEQ ID NO:50 | ggttAGCTTCAGTTTCGGC | rs12422149 |
SEQ ID NO:51 | aAGCAAGGGCTTCGGGGTA | rs2234922 |
SEQ ID NO:52 | cAAGATAGTGGCAATATAAAAG | rs4713518 |
SEQ ID NO:53 | gaacTTGCAGTAGGGGCAGC | rs1042640 |
SEQ ID NO:54 | ttgcTAATCTATTTTTCCCAC | rs3909184 |
SEQ ID NO:55 | agGACCATCTCTATGGCCAAT | rs2844682 |
SEQ ID NO:56 | tctatCAGAGGCGCTTCTCCGT | rs1058164 |
SEQ ID NO:57 | agatCTCAAAATCTTCAATTGTT | rs1799930 |
SEQ ID NO:58 | ccccaCTTCTCCTGCAGGTGACCA | rs1801280 |
SEQ ID NO:59 | tgatCACCCATGATGATGAATATG | rs137852340 |
SEQ ID NO:60 | agaaaTTTAGTTAACATAGTCCAG | rs12746200 |
SEQ ID NO:61 | ccttgTTATTCTAAATAGTAAGGGAT | rs1799931 |
SEQ ID NO:62 | Tgcccaccctgggctggagctgt | rs2306168 |
SEQ ID NO:63 | taaaaCCAGGTTTGCTTgtgg | rs3134792 |
SEQ ID NO:64 | taacaGGTGTCTTTGCTTTCCTGGTGA | rs1135840 |
SEQ ID NO:65 | ATCTGGTGCagcagtggggtgaaaata | rs72554664 |
SEQ ID NO:66 | CAGCtccctgcagttggcaatctgtca | rs2606345 |
SEQ ID NO:67 | ggcctGGTCCTGTGCACGGTGATCGCAG | rs368234815 |
SEQ ID NO:68 | ccctcttgtttcttggaaagagagg | rs20417 |
SEQ ID NO:69 | gctgtGTATTTGTTAACTGGAGGGAT | rs1041983 |
上述69种核酸序列在1孔检测中使用。
本发明提供的第三种技术方案为:一种用于检测儿童安全用药相关基因突变位点的试剂盒,该试剂盒包括如下试剂:
(1)飞行时间质谱检测系统核酸样本预处理试剂:包括如下主要组分
(2)扩增反应引物预混合液:所述权利要求1中的SEQ ID NO:1~46所示的核苷酸序列的混合液,各引物浓度为0.3~3μM;
(3)单碱基延伸反应引物预混合液:所述权利要求2中的SEQ ID NO:47~69所示的核苷酸序列的混合液,各引物浓度介于5~30μM;
(4)除盐树脂:包括去除延伸反应液盐离子的阳离子交换树脂粉末;
(5)检测芯片:包括含384个已预点基质的检测点的硅基芯片;
(6)纯突变对照:包含23个位点突变阳性片段质粒水溶液,浓度大于500拷贝/μL;
(7)杂合对照:包含23个位点突变阳性片段质粒、野生型人基因组(gDNA)的混合水溶液,突变型质粒和野生型人gDNA拷贝浓度相等,浓度大于500拷贝/μL;
(8)纯野生对照:包含野生型人gDNA的水溶液,浓度大于2ng/μL。
作为优选,所述扩增反应引物预混合液具体为,所述权利要求1中的SEQ ID NO:1~46所示的引物的混合液,各引物等比例混合,最终摩尔浓度浓度均为0.5μM;
进一步地,所述单碱基延伸反应引物预混合液具体为,各延伸引物摩尔浓度比值如下:
更进一步地,各延伸引物摩尔浓度比值如下:
与现有技术相比,本发明的有益效果:
(1)本发明提供了一种用于儿童安全用药相关基因突变位点检测的引物组合和试剂盒,优化的体系和试剂灵敏度高,特异性强,可检测低至0.01ng/μL的人gDNA核酸样本(约5-6个拷贝),可节约珍贵的新生儿血样;准确性达100%;配套一体化检测平台,操作简便快速,结果分析容易,通量高,成本低,具有比现有基于QPCR、反向点杂交或NGS方法学的相关产品更优异的性能,实用性也非常突出,尤其适宜在全国范围的各级医院推广应用,方便快速地开展儿童安全用药相关基因的诊断,指导临床正确用药,避免用药风险,减少用药伤害,真正地做到精准用药,从而达到提高药物疗效、降低药物毒副作用、减少医疗费用的目的。
(2)本发明参考全球共享的SNP数据库NCBI dbSNP(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/)、OMIM数据库(http://www.omim.org/)、国际千人基因组SNP数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/variation/tools/1000genomes/)以及中国国内相关指南,选取具有明确临床指导意义和中国人群药物代谢能力相关的代表性药物代谢基因突变位点,经过多次筛选和优化扩增引物和单碱基延伸引物组合后,23个位点可实现1孔检测;经过多次优化完善的预处理试剂,多种组分实现预混配制,并已获得国家医疗器械备案,大大简化了临床应用时操作人员进行体系配制和后续检测的难度,显著提升了微量体系配制和检测的稳定性和重复性,易于操作,有效降低使用门槛和上手难度;一体化仪器自动检测和分析结果,输出文件可直接导入lims报告系统,结果分析和发布简单客观,不易出错;全流程6-7h内完成384个样本检测,检测通量高,易于大规模推广应用。
(3)本发明采用一种基于MALDI-TOF MS技术的核酸质谱分析系统,属于高精度DNA定性分析平台。该技术平台是目前全球唯一可以准确检测核酸的质谱技术平台,完美整合了PCR技术的高灵敏度、芯片技术的高通量、质谱技术的高精确度和计算机智能分析的强大功能,为市场提供了一个具有显著成本优势,简易工作流程和高通量的全自动解决方案。准确性≥99.7%,FDA认可为用于SNP基因分型和突变检测的金标准;除盐、点样、检测一体化整合,自动化程度高,操作简便快速,结果判读简单;一次检测384个样本,检测样本通量高,也可一次检测单个样本,检测通量灵活,可随到随检;位点通量中高,单孔最多可检测超过40个位点,可降低用量珍贵样本,成本低至数十元,节约筛查成本,降低国家医疗支出,适宜全国不同经济水平地区全面推广。
附图说明
图1为纯突变对照品检测结果图。DP-TOF核酸质谱仪检测软件界面,软件依据各孔的23位点延伸后产物峰出峰情况,自动判读各位点基因型,结果框(中下)所示23位点均为纯突变型。
图2为杂合突变对照品检测结果图。DP-TOF核酸质谱仪检测软件界面,软件依据各孔的23位点延伸后产物峰出峰情况,自动判读各位点基因型,结果框(中下)所示23位点均为杂合型。
图3为纯野生型对照品检测结果图。DP-TOF核酸质谱仪检测软件界面,软件依据各孔的23位点延伸后产物峰出峰情况,自动判读各位点基因型,结果框(中下)所示23位点均为野生型。
图4为1例临床样本(1号)检测结果图。DP-TOF核酸质谱仪检测软件界面,软件依据各孔的23位点延伸后产物峰出峰情况,自动判读各位点基因型,结果框(中下)所示。
具体实施方式
根据下述实施例,可以更好地理解本发明。然而,本领域的技术人员容易理解,实施例所描述的内容仅用于说明本发明,而不应当也不会限制本发明。
实施例1:检测儿童安全用药相关基因突变的引物由上海百力格生物技术有限公司合成,其扩增引物序列如下:
单碱基延伸引物:
引物名称 | 引物序列(5'-3') |
SEQ ID NO:47 | ATACGCCAGGCCTCA |
SEQ ID NO:48 | TGGCACCTATGAAGCA |
SEQ ID NO:49 | GTGGAGATTCTCAACAGA |
SEQ ID NO:50 | ggttAGCTTCAGTTTCGGC |
SEQ ID NO:51 | aAGCAAGGGCTTCGGGGTA |
SEQ ID NO:52 | cAAGATAGTGGCAATATAAAAG |
SEQ ID NO:53 | gaacTTGCAGTAGGGGCAGC |
SEQ ID NO:54 | ttgcTAATCTATTTTTCCCAC |
SEQ ID NO:55 | agGACCATCTCTATGGCCAAT |
SEQ ID NO:56 | tctatCAGAGGCGCTTCTCCGT |
SEQ ID NO:57 | agatCTCAAAATCTTCAATTGTT |
SEQ ID NO:58 | ccccaCTTCTCCTGCAGGTGACCA |
SEQ ID NO:59 | tgatCACCCATGATGATGAATATG |
SEQ ID NO:60 | agaaaTTTAGTTAACATAGTCCAG |
SEQ ID NO:61 | ccttgTTATTCTAAATAGTAAGGGAT |
SEQ ID NO:62 | Tgcccaccctgggctggagctgt |
SEQ ID NO:63 | taaaaCCAGGTTTGCTTgtgg |
SEQ ID NO:64 | taacaGGTGTCTTTGCTTTCCTGGTGA |
SEQ ID NO:65 | ATCTGGTGCagcagtggggtgaaaata |
SEQ ID NO:66 | CAGCtccctgcagttggcaatctgtca |
SEQ ID NO:67 | ggcctGGTCCTGTGCACGGTGATCGCAG |
SEQ ID NO:68 | ccctcttgtttcttggaaagagagg |
SEQ ID NO:69 | gctgtGTATTTGTTAACTGGAGGGAT |
实施例2:检测儿童安全用药相关基因突变的突变型质粒由上海生工生物工程有限公司合成。
实施例3:儿童安全用药相关基因突变检测试剂盒的制备。
(1)飞行时间质谱检测系统核酸样本预处理试剂(迪谱诊断,货号:20020100),包括如下主要组分:
(2)扩增反应引物预混合液:所述权利要求1中的SEQ ID NO:1~46所示的核苷酸序列的混合液,各引物浓度0.5μM;
(3)单碱基延伸反应引物预混合液:所述权利要求2中的SEQ ID NO:47~69所示的核苷酸序列的混合液,各延伸引物摩尔浓度优选方案如下:
(4)除盐树脂:包括去除延伸反应液盐离子的阳离子交换树脂粉末;
(5)检测芯片:包括含384个已预点基质的检测点的硅基芯片。
(6)纯突变对照品:包含经酶切片段化、数字PCR绝对定量后稀释的23个位点突变型片段质粒水溶液,浓度大于500拷贝/μL。
(7)杂合对照品:包含经酶切片段化、数字PCR绝对定量后稀释的23个位点突变型片段质粒、野生型人基因组(gDNA)的混合水溶液,突变型质粒和野生型人gDNA拷贝浓度相等,浓度大于500拷贝/μL。
(8)纯野生对照品:包含经酶切片段化、数字PCR绝对定量后稀释的野生型人gDNA的水溶液,浓度大于2ng/μL。
实施例3:儿童安全用药相关基因突变位点检测方法。
仪器:Qubit 2.0荧光计(美国,ThermoFisher公司),Mastercycler X50h 384孔快速定性PCR仪(德国,Eppendorf公司),Mastercycler ProS 96孔快速定性PCR仪(德国,Eppendorf公司),BECKMAN22R台式微量冷冻离心机,WH-866型涡旋振荡器(太仓华利达),低速板式离心机(安徽中佳)、恒温振荡器(杭州奥盛)。
1.人gDNA核酸模板的制备:成人外周血样本采用全血DNA抽提试剂盒(迪谱诊断,货号20020100),新生儿足跟血干血片样本采用微量DNA提取试剂盒(新景生物,货号:3102050),按照试剂盒说明书操作。抽提完成后用Qubit 2.0荧光计测定核酸浓度,立即检测或-20℃保存备用。
2.利用1组优化的扩增引物和1组优化的单碱基延伸引物进行儿童安全用药相关基因位点的检测,具体包括如下步骤;
(1)PCR试剂配制(试剂准备区):
从试剂盒中取出T-PCR反应混合液和PCR酶混合液,分别在室温下融化并振荡混匀后,2000rpm离心10sec。计算需准备反应试剂人份数。
每个测试反应体系配制如下:
试剂 | T-PCR反应混合液 | PCR酶混合液 | PCR扩增引物预混合液 |
用量 | 1.67μL | 0.33μL | 1μL |
计算上述各试剂的使用量,充分混匀后,按3μL量分装到PCR反应管或384孔PCR板中,转移至样本处理区。
(2)上样(样本处理区):
分别加入2μL样品DNA溶液,盖紧反应管或384孔PCR板,转移至检测区。
(3)PCR扩增(核酸扩增区):
将各反应管按一定顺序放入PCR仪上,按以下程序进行PCR扩增:
*注:PCR产物暂时不进行下一步实验操作,可4℃保存过夜。
(4)SAP试剂配制(试剂准备区):
从试剂盒中取出SAP反应混合液和SAP酶混合液,分别在室温下融化并振荡混匀后,2000rpm离心10sec。计算需准备反应试剂人份数。
每个测试反应体系配制如下:
试剂 | SAP反应混合液 | SAP酶混合液 |
用量 | 1.70μL | 0.30μL |
(5)加样(核酸扩增区):
向3的PCR产物中分别加入2μL的上述SAP反应液,盖紧反应管或384孔PCR板。
将各反应管按一定顺序放入PCR仪上,按以下程序进行SAP消化:
*注:SAP产物应立即进行下一步操作,不建议放置4℃过夜。
(6)延伸试剂配制(试剂准备区):
从试剂盒中取出T-延伸反应混合液和延伸酶混合液,在室温下融化并振荡混匀后,2000rpm离心10sec。计算需准备反应试剂人份数。
每个测试反应体系配制如下:
试剂 | T-延伸反应混合液 | 延伸酶混合液 | 单碱基延伸引物预混合液 |
用量 | 0.72μL | 0.34μL | 0.94 |
(7)加样(核酸扩增区):
按一定顺序向6的SAP产物中分别加入2μL的上述延伸反应液,盖紧反应管或384孔PCR板。
将各反应管按一定顺序放入PCR仪上,按以下程序进行延伸扩增:
*注:延伸产物暂不进行下一步实验操作,可4℃保存过夜。
(8)使用DP-TOF飞行时间质谱检测系统进行质谱检测(扩增分析区):
按照DP-TOF核酸质谱仪操作说明书进行标准操作,选择所需检测样本对应芯片及孔号,仪器自动进行样本延伸产物除盐、芯片点样和检测,并自动对结果进行分析。
(9)将质谱仪分析完的结果文件导入样本结果报告系统,发布样本结果报告。
实施例4:用本发明所述试剂盒进行儿童安全用药相关基因突变检测准确性测试
(1)随机抽取12例临床体检人血样,进行全血gDNA抽提,测定浓度;
(2)取试剂盒中的3个对照品(纯突变型对照品、杂合对照品、纯野生型对照品);
(3)根据实施例3进行3个对照品和12例未知结果儿童样本的儿童安全用药相关基因突变位点检测;
(4)采用序列金标准的Sanger测序法验证本发明所述的试剂盒检测儿童安全用药相关基因突变的准确性,结果与质谱检测结果比对。比对结果如下:
结果显示,三个对照品检测结果与预期结果完全一致,准确性100%;12例体检样本检测结果与Sanger测序法结果完全一致,显示本发明所述的试剂盒及检测体系结果准确性为100%。
实施例5:用本发明所述试剂盒进行儿童安全用药相关基因突变检测灵敏度测试
根据实施例3进行儿童安全用药相关基因突变检测灵敏度测试。
采用实施例4中1-3号样本核酸模板进行稀释后,用本发明所述的试剂盒和体系进行儿童安全用药相关基因突变检测,考察灵敏度。检测结果如下表:
结果显示,本发明所述引物组和试剂盒和检测体系能检测低至0.01ng/μL(即3拷贝/μL)的核酸模板,再低一个梯度浓度则部分位点无法检出,显示本发明所述试剂盒具有极高的灵敏度。
综上所述,本发明提供了一种优化的检测儿童安全用药相关基因突变位点的引物组合和试剂盒,优化的体系和试剂和灵敏度高,特异性强,可检测低至0.01ng/μL的人gDNA核酸样本(约5-6个基因拷贝/反应),可节约珍贵的新生儿血样;23个位点可实现1孔检测,准确性达100%;经过多次优化完善的预处理试剂,多种组分实现预混配制,大大简化了临床应用时检测人员体系配制和操作难度,易于操作,有效降低使用门槛和上手难度;配套一体化检测平台,操作简便快速,自动检测和分析结果,结果文件可直接导入lims报告系统,结果分析和发布简单客观,不易出错;通量高,成本低廉,实用性非常突出,临床应用前景广阔,尤其适宜在全国范围大规模推广应用,满足不同经济水平的各级医院方便快速地开展儿童安全用药相关基因的诊断,指导临床正确用药,避免用药风险,减少用药伤害,真正地做到精准用药,从而达到提高药物疗效、降低药物毒副作用、减少医疗费用的目的。
序列表
<110> 浙江迪谱诊断技术有限公司
<120> 一种检测儿童安全用药相关基因突变位点的引物组合序列和试剂盒
<160> 69
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
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<211> 30
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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acgttggatg tggagacgtc tgcaggtatg 30
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<211> 30
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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acgttggatg gacccagcat cgacaatgta 30
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<211> 30
<212> DNA
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acgttggatg tgggagatac tcaccgatgc 30
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acgttggatg gagaaatctc gtgcccaaac 30
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<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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acgttggatg gggtgataca tacacaaggg 30
<210> 31
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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acgttggatg aaccctactg gtcttctctc 30
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acgttggatg ccatggtgtc tttgctttcc 30
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acgttggatg tagggactgg tatttccagc 30
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acgttggatg tgcagaagca gagatgcgg 29
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acgttggatg accacaatcg gttttcagac 30
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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acgttggatg ccatgccagt gctgtatttg 30
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 47
atacgccagg cctca 15
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gtggagattc tcaacaga 18
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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caagatagtg gcaatataaa ag 22
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tctatcagag gcgcttctcc gt 22
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ggcctggtcc tgtgcacggt gatcgcag 28
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ccctcttgtt tcttggaaag agagg 25
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 69
gctgtgtatt tgttaactgg agggat 26
Claims (6)
3.一种用于儿童安全用药相关基因检测的试剂盒,其特征在于,该试剂盒包括如下试剂:
(1)飞行时间质谱检测系统核酸样本预处理试剂:包括如下主要组分
(2)扩增反应引物预混合液:所述权利要求1中的SEQ ID NO:1~46所示的核苷酸序列的混合液,各引物浓度为0.3~3μM;
(3)单碱基延伸反应引物预混合液:所述权利要求2中的SEQ ID NO:47~69所示的核苷酸序列的混合液,各引物浓度介于5~30μM;
(4)除盐树脂:包括去除延伸反应液盐离子的阳离子交换树脂粉末;
(5)检测芯片:包括含384个已预点基质的检测点的硅基芯片;
(6)纯突变对照:包含23个位点突变阳性片段质粒水溶液,浓度大于500拷贝/μL;
(7)杂合对照:包含23个位点突变阳性片段质粒、野生型人基因组(gDNA)的混合水溶液,突变型质粒和野生型人gDNA拷贝浓度相等,浓度大于500拷贝/μL;
(8)纯野生对照:包含野生型人gDNA的水溶液,浓度大于2ng/μL。
4.根据权利要求3所述的用于儿童安全用药相关基因突变检测的试剂盒,其特征在于,所述扩增反应引物预混合液具体为:所述权利要求1中的SEQ ID NO:1~46所示的引物的混合液,各引物等比例混合,最终摩尔浓度浓度均为0.5μM。
5.根据权利要求3所述的用于儿童安全用药相关基因突变检测的试剂盒,其特征在于,所述单碱基延伸反应引物预混合液具体为,各延伸引物摩尔浓度比值如下:
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