CN110241187B - 一种基于飞行时间质谱多基因检测系统的性能验证方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物技术领域，涉及一种基于飞行时间质谱多基因检测系统的性能验证方法。该方法可以针对该系统进入临床进行性能评价，确定整个系统是否满足临床需求。

Description

一种基于飞行时间质谱多基因检测系统的性能验证方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种基于飞行时间质谱多基因检测系统的性能验证方法。基于飞行时间质谱多基因检测系统包括使用人类11基因联合检测试剂盒和DP-TOF飞行时间质谱仪，经过DNA加样、多重PCR反应、SAP消化反应、单碱基延伸反应、转板撕膜和芯片点样的操作步骤，通过检测人类DNA中与心血管药物代谢相关的碱基序列，从而达到SNP基因分型的目的，进而为临床医生合理化用药提供依据。具体涉及该系统的验证方法，以评价其是否能满足临床需求。
背景技术
心血管疾病严重威胁着中国人的健康，具有患者基数大，死亡率高的特点。根据《中国心血管病报告2017》数据，我国心血管疾病患者约有2.9亿人，其中脑卒中1300万人，冠心病1100万人，心力衰竭450万人，先天性心脏病200万人，高血压2.7亿人。心血管疾病是居民因病死亡的首要因素，占居民疾病死亡总数的40％以上，高于肿瘤及其他疾病致死人数。而在心血管临床治疗过程中发现，不同的心血管疾病患者对于药物治疗存在明显差异。导致个体差异的原因有很多，而遗传因素是引起个体差异的重要原因。
临床用药经历了经验用药阶段，询证用药阶段，到现在逐渐发展为个性化用药阶段。药物基因组学正是通过研究药物代谢酶基因、药物受体基因、药物转运蛋白基因等影响药物作用的遗传因素，阐明不同基因型对药物药效和毒性的不同反应，进而为携带不同基因型的个体临床用药提供指导。通过差异化的用药指导，可以降低患者不良心血管事件发生的风险，以期达到“精准医疗”、“个性化用药”、“合理用药”的目标。
心血管疾病药物基因组学是当前热点领域。一些主要的基因变异对华法林、氯吡格雷、硝酸甘油、高血压治疗相关、他汀类等药物的代谢、药动学、药效学有重要影响。许多基因变异由全基因组关联性研究发现，并经大型临床队列研究或随机对照研究验证，具有比较明确的循证医学证据。目前，在医院心血管病用药相关基因检测为六个单项检测，包括氯吡格雷、法华林、他汀类、叶酸、硝酸甘油和降压类基因检测。
在心血管药物相关基因分型检测方面，目前国内市场主要针对FDA明确规定的基因、CIPC指南中的基因以及国家卫计委指南中的部分基因进行的检测，主要包括CYP2C19、CYP2C9、VKORC1、APOE、SLCO1B1等基因。而用药相关基因分型检测的技术手段，目前有很多，如直接测序法、荧光定量PCR法、基因芯片法、高通量测序等。这些检测方法均存在各种不同程度的缺陷，如操作过程繁琐、重复性差、结果不易判读、检测位点少、检测通量低、检测周期长、检测费用高等。因此，急需一种快速、稳定、通量合适、价格低廉且操作简便的检测方法，方便检测技术人员使用，免除患者多次重复检测的经济和精神负担。
MALDI-TOF(基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱)是近年来发展起来的一种新型的软电离生物质谱，原理是将样品分散在基质分子中并形成晶体。当用激光照射晶体时，基质从激光中吸收能量，样品解吸附，基质-样品之间发生电荷转移使得样品分子电离，电离的样品在电场作用下飞过真空的飞行管，根据到达检测器的飞行时间不同而被检测，即通过离子的质量电荷之比(M/Z)与离子的飞行时间成正比来分析离子，并测得样品分子的分子量。
DP-TOF飞行时间质谱仪是迪谱诊断与全球唯一获得FDA认可的核酸质谱技术开发及生产厂商美国Agena Bioscience公司合作，专注于建立质谱专业化科研转化生产平台，实现国际先进基因检测技术在国内的落地转化，引领行业发展。其核酸质谱系统基于MALDI-TOF，是全球独创核酸质谱高精度DNA检测分析平台，该系统推出后，很快成为国际业界公认的SNP基因型分析的黄金标准，是目前唯一应用飞行质谱对痕量核酸进行全方位研究的技术平台。
基于DP-TOF飞行时间质谱平台，迪谱诊断开发的人类11基因联合检测试剂盒(飞行时间质谱法)，能同时检测目前心血管疾病相关所有一线药物的11个基因17个位点，解决联合用药问题。所述11种基因17个突变位点为VKORC1基因c.1173C>T和c.-1639G>A位点，CYP2C9基因c.430C>T和c.1075A>C位点；CYP2D6基因c.100C>T位点，ADRB1基因c.1165G>C位点，ACE基因I/D位点，AGTR1基因c.1166A>C位点，MTHFR基因C677T位点，SLCO1B1基因c.388A>G和c.521T>C位点，APOE基因c.388T>C和c.526C>T位点，CYP2C19基因c.681G>A、c.636G>A和c.-806C>T位点，ALDH2基因c.1510G>A位点。所述试剂盒还包括PCR扩增试剂，所述PCR扩增试剂包含10×PCR Buffer with 20mM，25mM MgCl2，25mM dNTP Mix，0.5μM Primer Mix和5U/μl PCR Enzyme。所述试剂盒还包括SAP酶消化处理试剂，所述SAP酶消化处理包括SAPBuffer和SAP Enzyme。所述试剂盒还包括单碱基延伸反应试剂，所述单碱基延伸反应试剂包括iPLEX Buffer、iPLEX Termination mix、Extend Primer Mix和iPLEX Enzyme。
根据ISO15189认可要求，需要对进入临床诊断的试剂盒进行性能验证，以确认试剂盒能够满足临床检测需求。多重基因检测具有反应体系复杂，产物种类多样化和易导致交叉污染等特点，使用DP-TOF飞行时间质谱仪进行基因检测，需要进行加样、多重PCR、SAP消化、单碱基延伸、转板撕膜和芯片点样后上机检测的步骤，每一步都可能被气溶胶污染导致结果受影响，而影响大小尚不清楚。CNAS-CL02-A009中仅规定性能验证内容至少应包括测定下限、特异性、准确度、抗干扰能力等，没有具体可操作的方法。文献中仅见到单个基因检测试剂盒性能验证方法，且是基于其他平台，未见到基于DP-TOF飞行时间质谱的多位点基因检测性能验证方法的报道。
飞行时间质谱多基因检测系统包括使用人类11基因联合检测试剂盒和DP-TOF飞行时间质谱仪，经过DNA加样、多重PCR反应、SAP消化反应、单碱基延伸反应、转板撕膜和芯片点样的操作步骤，通过检测人类DNA中与心血管药物代谢相关的碱基序列，从而达到SNP基因分型的目的，进而为临床医生合理化用药提供依据。飞行时间质谱多基因检测系统的各个部分缺一不可，均会对检测结果产生影响。因此，需要对整个检测系统进行性能验证，以评价检测系统是否能满足临床需求。
Sanger法测序是根据核苷酸在某一固定的点开始，随机在某一个特定的碱基处终止，并且在每个碱基后面进行荧光标记，产生以A、T、C、G结束的四组不同长度的一系列核苷酸，然后在尿素变性的PAGE胶电泳进行检测，从而获得可见DNA碱基序列的一种方法。
Nanodrop 2000超微量分光光度计应用液体的表面张力特性，在检测台上，经上下臂的接触拉出固定的光径达到快速、微量、高浓度、免石英管、免毛细管等耗材检测吸收值的优点，对核酸、探针、蛋白质等进行检测。
发明内容
有鉴于此，本发明提供一种基于飞行时间质谱多基因检测系统的性能验证方法。基于飞行时间质谱多基因检测系统包括使用人类11基因联合检测试剂盒和DP-TOF飞行时间质谱仪，经过DNA加样、多重PCR反应、SAP消化反应、单碱基延伸反应、转版撕膜和芯片点样的操作步骤，通过检测人类DNA中与心血管药物代谢相关的碱基序列，从而达到SNP基因分型的目的，进而为临床医生合理化用药提供依据。具体涉及该系统的验证方法，以评价其是否能满足临床需求。
本研究从样本选择，位点选择，测序验证引物设计、以及抗干扰实验方案的设计，建立了基于飞行时间质谱多基因多位点检测系统的性能验证方法，包括准确度、灵敏度、重复性(批内、批间)、基因组交叉污染、PCR产物交叉污染、UNG酶降解气溶胶能力、SAP产物交叉污染、延伸产物交叉污染、转板撕膜交叉污染和芯片基质间交叉污染，从而确定试剂盒能否满足临床需求。
本发明首次在临床上进行UNG酶降解气溶胶能力评价，且首次基于DP-TOF平台评价气溶胶污染(过程携带污染)对检测结果的影响，其中包含基因组气溶胶，中间产物气溶胶和最终检测体系。
为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
本发明的目的在于提供一种基于飞行时间质谱多基因检测系统的性能验证方法，包括准确度评价、灵敏度评价、重复性评价和抗干扰评价。
鉴于迪谱诊断开发的人类11基因联合检测试剂盒(飞行时间质谱法)检测11基因17位点，因此需要对待测11基因17位点三种基因型(野生型、杂合型和纯合突变型)全部进行准确度评价，确保所有位点检测结果准确可靠，并且，为了减少成本，尽量选择较少样本进行实验。对已知基因型样本按照野生数量、杂合数量和纯合突变数量分别从多到少排序，优先选取最多的样本，再根据缺少的基因型选取其它包含该基因型样本。
优选的，所述准确度评价的方法为，选取包含17位点三种基因型样本14例，用DP-TOF的默认参数和配套试剂盒进行检测；同时，针对17个检测位点设计PCR引物，对14例样本进行PCR扩增后Sanger测序验证。以Sanger测序为标准，评价检测系统的准确度。所述配套检测试剂盒指迪谱诊断开发的人类11基因联合检测试剂盒(飞行时间质谱法)。
鉴于杂合型样本质谱峰图包含两个峰，可以覆盖野生型和纯合突变型单峰结果峰图，因此灵敏度评价仅选择杂合型样本即可代表所有基因型检测情况。计算每个样本杂合基因型数量，按照从多到少排序，优先选取最多的样本，再根据缺少的基因型选取其它包含该基因型样本。
优选的，所述灵敏度评价的方法为，选择包含所有杂合型样本4例，分别进行梯度稀释。各浓度梯度重复3次，评估每个梯度的基因位点检出情况。
鉴于配套试剂盒检测11基因17位点，因此需要对待测11基因17位点三种基因型(野生型、杂合型和纯合突变型)全部进行重复性评价，确保所有位点检测结果重复性良好，并且，为了减少成本，尽量选择较少样本进行实验。对已知基因型样本按照野生数量、杂合数量和纯合突变数量分别从多到少排序，优先选取数量较多的样本，再根据缺少的基因型选取其它包含该基因型样本。
优选的，所述重复性评价的方法为，选择包含所有位点基因型样本进行检测，添加空白对照，每个样本重复两次。连续测定5次，评价每个标本位点的批间重复性；同一批样本重复测定10次，评价每个标本位点的批内重复性。
整个检测过程包括：DNA加样、PCR扩增、SAP消化、单碱基延伸反应、转板和质谱检测，每个步骤污染都可能对结果产生影响。本实验主要考虑模拟气溶胶污染，将纯合突变基因型样本梯度稀释，混到野生型中，根据结果杂合情况评价污染情况。如附图3，鉴于杂合峰图有正常峰形和高低峰区别，因此选择包含杂合型代表性峰形进行抗干扰评价，可以得到更全面完整的结果。
所述抗干扰评价包括分析基因组交叉污染，PCR产物交叉污染，UNG酶降解气溶胶能力，SAP产物交叉污染，延伸产物交叉污染，转板、撕膜交叉污染，芯片基质交叉污染等因素对检测结果的影响。
优选的，所述抗干扰评价中分析基因组交叉污染的影响(模拟DNA加样交叉污染)，在于考察反应体系对于已知基因型不同浓度起始DNA梯度是否存在异常的检测结果，其具体方法为，将纯合突变型和野生型样本按照不同质量比混合，分别取混合DNA进行后续检测，以此评价基因组交叉污染对检测结果的影响。
优选的，所述抗干扰评价中分析PCR产物交叉污染的影响，在于考察不同浓度梯度扩增产物(模拟气溶胶)是否存在异常的检测结果，其具体方法为，将纯合突变型样本PCR产物梯度稀释后，与等量的野生型样本DNA进行混合，分别取混合DNA进行后续检测，以此评价PCR产物交叉污染对结果影响。
优选的，所述抗干扰评价中分析UNG酶降解气溶胶能力的影响，在于考察UNG酶对PCR产物降解能力大小的评价，其具体方法为，将纯合突变型样本PCR产物梯度稀释后，与等量的UNG酶混合或加入到有UNG酶的反应体系中，进行后续检测，以此评价UNG酶降解气溶胶能力。
优选的，所述抗干扰评价中分析SAP产物交叉污染的影响，在于考察不同浓度梯度SAP消化产物(模拟气溶胶)是否存在异常的检测结果，其具体方法为，将纯合突变型样本SAP产物梯度稀释后，与等量的野生型样本DNA进行混合，分别取混合DNA进行后续检测，以此评价SAP产物交叉污染对结果影响。
优选的，所述抗干扰评价中分析延伸产物交叉污染的影响，在于考察不同浓度梯度延伸产物(模拟气溶胶)是否存在异常的检测结果，其具体方法为，将纯合突变型样本延伸产物梯度稀释后，与等量的野生型样本DNA进行混合，分别取混合DNA进行后续检测，以此评价延伸产物交叉污染对结果影响。
优选的，所述抗干扰评价中分析转板、撕膜交叉污染的影响，在于考察最终检测体系交叉污染是否存在异常检测结果，其具体方法为，将纯合突变型和野生型最终检测体系按照不同质量比混合，分别取混合体系进行后续检测，以此评价转板、撕膜交叉污染对检测结果的影响。
优选的，所述抗干扰评价中分析芯片基质间交叉污染的影响，在于考察384孔芯片相邻基质间有无交叉污染的可能，其具体方法为，按下图，将纯合突变型K2和野生型K1最终检测体系排布于384孔PCR板上(左图)，质谱检测时则会从384孔PCR板上将样本按位置顺序转移到芯片上，且纯合突变型和野生型样本会排在相邻的基质点处，再进行飞行时间质谱检测，以此评价芯片相邻基质间有无交叉污染。
Figure BDA0002101930140000061
本发明的有益效果在于：本发明相对于CNAS-CL02-A009，该性能验证方法给出了详细的可操作的研究步骤，可以帮助临床诊断研究人员快速建立基于DP-TOF的多基因多位点基因检测试剂盒性能验证方法，快速、全面评估试剂盒的临床可行性。
该基于DP-TOF飞行时间质谱的多基因多位点检测系统的性能验证方法是第一个多位点基因检测性能验证方法。且该方法首次在临床上进行UNG酶降解气溶胶能力评价，且首次基于DP-TOF平台评价气溶胶污染(过程携带污染)对检测结果影响。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：
图1为17个位点测序峰图(示例)
图2为最低灵敏度时候的质谱图(所有杂合位点)
图3为选取的两个抗干扰评价的代表性的位点的峰图
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
基于大量研究和实验，最终选择了11个基因的17个变异位点：VKORC1(c.1173C>T、c.-1639G>A)，CYP2C9(c.430C＞T、c.1075A＞C)，CYP2C19(c.681G>A、c.636G>A、c.-806C>T)，ALDH2(c.1510G＞A)，CYP2D6(c.100C>T)，ADRB1(c.1165G>C)，AGTR1(c.1166A>C)，ACE(289bp deletion)，MTHFR(c.665C>T)，APOE(c.388T＞C、c.526C>T)，SLCO1B1(c.388A>G、c.521T>C)。这些位点覆盖了对华法林、氯吡格雷、高血压治疗药物、硝酸甘油、他汀类五大类一线心血管用药基因的常见变异位点。
对待测11基因17位点三种基因型(野生型、杂合型和纯合突变型)全部进行准确度评价，确保所有位点检测结果准确可靠，并且，为了减少成本，尽量选择较少样本进行实验。对已知基因型样本按照野生数量、杂合数量和纯合突变数量分别从多到少排序，优先选取最多的样本，再根据缺少的基因型选取其它包含该基因型样本。最终选取了包含17位点三种基因型样本14例，用DP-TOF的默认参数和配套检测试剂盒进行检测；同时，针对17个检测位点设计PCR引物，对14例样本进行PCR扩增后Sanger测序验证。以Sanger测序为标准，评价检测系统的准确度。
测序验证方法：
1)PCR扩增试剂使用：Promega的Go Taq Hot Start Polymerase
2)引物制备
A)针对每一个位点设计相应的特异性引物
B)17对引物合成自上海百力格生物技术有限公司，每管5OD。
C)每管引物稀释至10μM
3)针对每个位点分别进行PCR扩增
Figure BDA0002101930140000071
4)PCR扩增的条件为95℃预变性2min；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，40个循环；72℃后延伸5min。
5)将PCR产物送去生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序
表1、PCR测序引物
Figure BDA0002101930140000072
Figure BDA0002101930140000081
鉴于杂合型样本质谱峰图包含两个峰，可以覆盖野生型和纯合突变型单峰结果峰图，因此灵敏度评价仅选择杂合型样本即可代表所有基因型检测情况。计算每个样本杂合基因型数量，按照从多到少排序，优先选取最多的样本，再根据缺少的基因型选取其它包含该基因型样本。最终选择包含所有杂合型样本4例，分别进行梯度稀释。各浓度梯度重复3次，评估每个梯度的基因位点检出情况。
对待测11基因17位点三种基因型(野生型、杂合型和纯合突变型)全部进行精密度评价，确保所有位点检测结果重复性良好，并且，为了减少成本，尽量选择较少样本进行实验。对已知基因型样本按照野生数量、杂合数量和纯合突变数量分别从多到少排序，优先选取数量较多的样本，再根据缺少的基因型选取其它包含该基因型样本。选择包含所有位点基因型样本进行检测，添加空白对照，每个样本重复两次。连续测定5次，评价每个标本位点的批间重复性；同一批样本重复测定10次，评价每个标本位点的批内重复性。
抗干扰评价整个检测过程包括：DNA加样、PCR扩增、SAP消化、单碱基延伸反应、转板和质谱检测，每个步骤污染都可能对结果产生影响。本实验主要考虑模拟气溶胶污染，将纯合突变基因型样本梯度稀释，混到野生型中，根据结果杂合情况评价污染情况。如附图3，鉴于杂合峰图有正常峰形和高低峰区别，因此选择包含杂合型代表性峰形进行抗干扰评价，可以得到更全面完整的结果。
实施例1、本实施例基于飞行时间质谱对多基因多位点基因检系统的准确度进行验证。
选取14例阜外医院提供的部分基因位点已知DNA样本，用Nanodrop 2000进行浓度检测，稀释至10ng/μL，用DP-TOF的默认参数和配套心血管病检测试剂进行检测。同时将14例样本进行Sanger测序验证。测序结果统计如表2所示；飞行时间质谱检测结果与Sanger测序一致的位点数为237个，其中C11样本c.388T>C位点质谱结果为T，与测序结果不一致，因此准确度为237/238＝99.58％(准确度＝两种方法一致的位点数/Sanger测序位点数)。
表2、Sanger测序结果
Figure BDA0002101930140000091
实施例2、本实施例基于飞行时间质谱对多基因多位点基因检系统的灵敏度进行评价。
选择杂合型样本4例(覆盖17位点)，用Nanodrop 2000进行浓度检测。分别稀释至0.1ng/μL、0.2ng/μL、0.5ng/μL、1ng/μL、2.5ng/μL、5ng/μL、10ng/μL、25ng/μL、50ng/μL、100ng/μL。各梯度重复3次，评估每个梯度的基因位点检出情况。
当浓度为0.1ng/μL时，c.388A>G有两样本未检出，c.1165G>C和c.-806C>T各有一个样本检测错误，c.526C>T有一个样本未检出，其它浓度检测正常；当浓度为0.2ng/μL时，4个样本所有位点均能正确检出。因此我们确定该试剂盒可检出的最低DNA浓度为0.2ng/μL。
实施例3、本实施例基于飞行时间质谱对多基因多位点基因检系统的重复性进行评价。
选择包含所有位点49种基因型14个样本(覆盖中国人群所有基因型别)进行检测，添加空白对照，每个样本重复两次。连续测定5次，评价每个标本位点的批间重复性；同一批样本重复测定10次，评价每个标本位点的批内重复性。
检测结果显示批内重复性和批间重复性均为100％，仪器和试剂盒检测性能稳定。
实施例4、本实施例基于飞行时间质谱对多基因多位点基因检系统的抗干扰能力进行评价。
选择包含杂合型代表性峰形，APOE基因c.388T>C位点(高低峰)和MTHFR基因C677T位点(正常峰形)的野生和纯合突变样本各1个，将纯合突变样本DNA或中间产物梯度稀释后，混入到野生DNA中，检测结果污染情况。具体包括以下：
a.基因组交叉污染：分别将纯合突变型和野生型样本按照1:1、1:4、1:9、1:19、1:49、1:99、1：199的质量比混合(PCR体系总DNA质量20ng)，取2μL加入反应体系上机扩增，重复3次，评价基因组交叉污染对结果的影响。
b.PCR产物交叉污染：将纯合突变型样本PCR产物(45循环后的产物大约1015拷贝)梯度稀释至101、103、105、107、109、1011、1013、101拷贝，取2μL野生型样本和0.5μL梯度稀释好的突变型样本的PCR产物加入反应体系，重复3次，评价PCR产物交叉污染对结果影响。
c.UNG酶降解能力：将纯合突变型样本PCR产物(45循环后的产物大约1015拷贝)梯度稀释至101、103、105、107、109、1011、1013、101拷贝，取2μL梯度稀释好的突变型样本的扩增产物进行PCR扩增，评价UNG酶降解PCR产物能力。
d.SAP产物交叉污染：将纯合突变型样本SAP产物(45循环后的产物大约1015拷贝)梯度稀释至101、103、105、107、109、1011、1013、101拷贝，取2μL野生型样本和0.5μL梯度稀释好的突变型样本的SAP产物加入反应体系，重复3次，评价SAP产物交叉污染对结果影响。
e.延伸产物交叉污染：将纯合突变型样本延伸产物(45循环后的产物大约1015拷贝)梯度稀释至101、103、105、107、109、1011、1013、101拷贝，取2μL野生型样本和0.5μL梯度稀释好的突变型样本的延伸产物加入反应体系，重复3次，评价延伸产物交叉污染对结果影响。
f.转板、撕膜交叉污染：分别将纯合突变型和野生型样本最终反应体系按照1:1、1:4、1:9、1:19、1:49、1:99、1：199的质量比混合，加入到384孔板中，重复3次，评价转板、撕膜交叉污染对结果的影响。
g.芯片基质间交叉污染：将纯合突变型和野生型样本排布于芯片相邻的基质点处，重复10次，评价芯片相邻基质间有无交叉污染。
反应体系对基因组和各中间产物气溶胶有很强的抗干扰能力，UNG酶的降解能力为105拷贝的气溶胶，芯片不同基质间无交叉污染，可以保证检测结果准确可靠。结果详见表3。
表3、抗干扰评价结果
Figure BDA0002101930140000111
注：以表中最后一行为例进行说明。DNA-1-199代表纯合突变型DNA:野生型DNA质量比为1:199；p-10-1代表PCR产物拷贝数为101；pmix-10-1代表2μL野生型DNA中混入101拷贝纯合突变型PCR产物；smix-10-1代表2μL野生型DNA中混入101拷贝纯合突变型SAP产物；exmix-10-1代表2μL野生型DNA中混入101拷贝纯合突变型延伸产物；F-1-199代表纯合突变型最终反应体系:野生型最终反应体系质量比为1:199；
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

Claims (4)

1.一种基于飞行时间质谱多基因检测系统的性能验证方法，其特征在于，包括如下步骤：
1）准确度评价，确保所有位点检测结果准确可靠；
2）灵敏度评价，评估不同梯度浓度基因位点检出情况；
3）重复性评价，评价每个标本位点的批内重复性和批间重复性；
4）抗干扰评价，评价对于基因组交叉污染，PCR产物交叉污染，UNG酶降解气溶胶能力，SAP产物交叉污染，延伸产物交叉污染，转板、撕膜交叉污染，芯片基质交叉污染因素对检测结果的影响；
所述抗干扰评价中分析基因组交叉污染的影响，在于考察反应体系对于已知基因型不同浓度起始DNA梯度是否存在异常的检测结果，其具体方法为，将纯合突变型和野生型样本按照不同质量比混合，分别取混合DNA进行后续检测，以此评价基因组交叉污染对检测结果的影响；
所述抗干扰评价中分析PCR产物交叉污染的影响，在于考察不同浓度梯度扩增产物是否存在异常的检测结果，其具体方法为，将纯合突变型样本PCR产物梯度稀释后，与等量的野生型样本DNA进行混合，分别取混合DNA进行后续检测，以此评价PCR产物交叉污染对结果影响；
所述抗干扰评价中分析UNG酶降解气溶胶能力的影响，在于考察UNG酶对PCR产物降解能力大小的评价，其具体方法为，将纯合突变型样本PCR产物梯度稀释后，与等量的UNG酶混合或加入到有UNG酶的反应体系中，进行后续检测，以此评价UNG酶降解气溶胶能力；
所述抗干扰评价中分析SAP产物交叉污染的影响，在于考察不同浓度梯度SAP消化产物是否存在异常的检测结果，其具体方法为，将纯合突变型样本SAP产物梯度稀释后，与等量的野生型样本DNA进行混合，分别取混合DNA进行后续检测，以此评价SAP产物交叉污染对结果影响；
所述抗干扰评价中分析延伸产物交叉污染的影响，在于考察不同浓度梯度延伸产物是否存在异常的检测结果，其具体方法为，将纯合突变型样本延伸产物梯度稀释后，与等量的野生型样本DNA进行混合，分别取混合DNA进行后续检测，以此评价延伸产物交叉污染对结果影响；
所述抗干扰评价中分析转板、撕膜交叉污染的影响，在于考察最终检测体系交叉污染是否存在异常检测结果，其具体方法为，将纯合突变型和野生型最终检测体系按照不同质量比混合，分别取混合体系进行后续检测，以此评价转板、撕膜交叉污染对检测结果的影响;
所述基于飞行时间质谱多基因检测系统包括使用迪谱诊断开发的人类11基因联合检测试剂盒（飞行时间质谱法）和DP-TOF飞行时间质谱仪，经过DNA加样、多重PCR反应、SAP消化反应、单碱基延伸反应、转板撕膜和芯片点样的操作步骤，检测人类DNA中与心血管药物代谢相关的碱基序列;
步骤1）中，准确度评价的方法为，选取包含17位点三种基因型样本14例，用DP-TOF的默认参数和配套人类11基因联合检测试剂盒（飞行时间质谱法）进行检测；同时，针对17个检测位点设计PCR引物，对14例样本进行PCR扩增后Sanger测序验证；以Sanger测序为标准，评价检测系统的准确度。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤2）中，灵敏度评价的方法为，选择包含所有杂合型样本4例，分别进行梯度稀释；各浓度梯度重复不少于3次，评估每个梯度的基因位点检出情况。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤3）中，重复性评价的方法为，选择包含所有位点基因型样本进行检测，添加空白对照，每个样本重复两次；连续测定不少于5次，评价每个标本位点的批间重复性；同一批样本重复测定不少于10次，评价每个标本位点的批内重复性。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述抗干扰评价中分析芯片基质间交叉污染的影响，在于考察384孔芯片相邻基质间有无交叉污染的可能，其具体方法为，将纯合突变型K2和野生型K1最终检测体系排布于384孔PCR板上，质谱检测时则会从384孔PCR板上将样本按位置顺序转移到芯片上，且纯合突变型和野生型样本会排在相邻的基质点处，再进行飞行时间质谱检测，以此评价芯片相邻基质间有无交叉污染。
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