CN109694907B - 一种无创产前筛查三体综合征的试剂盒及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种无创产前筛查三体综合征的试剂盒及其应用。本发明的试剂盒包括用于产前筛查13三体综合征的引物对和探针、用于产前筛查18三体综合征的引物对和探针与用于产前筛查21三体综合征的引物对和探针。本发明还公开了一种无创产前筛查三体综合征的方法，与二代测序方法相比，本发明的筛查方法成本低、检测周期短，而且检测灵敏度高、方便且绝对定量。

Description

一种无创产前筛查三体综合征的试剂盒及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种基于数字PCR技术产前检测血浆游离DNA中13、18和21三体综合征的引物和探针及其检测方法。

背景技术

自人类基因组计划完成以来，基因组学已经深入研究到了单碱基变异程度。随着二代测序等先进研究技术的加入，越来越多常见疾病可以使用基因组变异进行解释。其中染色体异常相关疾病(染色体病)病因学已经研究的非常深入，非常适合进行临床检测技术的应用。染色体异常包括染色体数目异常和结构异常(包括染色体融合、拷贝数变异以及小片段缺失)。染色体结构变异是多种疾病(新生儿疾病、肿瘤等)的原因或者在其中的疾病进展中发挥重要作用。

常见的染色体数目异常为三体综合征，我国21三体综合征的发病率约为10.4/10000。传统的三体综合征的检测方法为羊水穿刺检查，自从90年代后，无创产前技术逐步开始应用，目前三体综合征的无创产前筛查已经在我国广泛开展，主要针对13号、18号和21号三体综合征进行筛查，其检出率分别为97.5％(T13)，97.7％(T18)和99.8％(T21)。

染色体结构异常则情况更为复杂，染色体融合常见有BCR-ABL融合基因、AML1/ET0、CBFβ/MYH11、PML/RARα和EML4-ALK等，染色体融合主要导致血液肿瘤，也有可能会导致肿瘤治疗过程中对药物耐受。染色体大片段缺失常见有22q11微缺失综合征、骨髓增生异常综合征。22q11微缺失综合征是少数已明确病因的先天性疾病之一，其发病率占活产儿的1/6000-1/4000，临床表现复杂多样。骨髓增生异常综合征(myelodysplastic syndromes，MDS)是起源于造血干细胞的一组异质性髓系克隆性疾病，特点是髓系细胞分化及发育异常，表现为无效造血、难治性血细胞减少、造血功能衰竭，高风险向急性髓系白血病(AML)转化。中国内地骨髓增生异常综合征的发病率已达到十万分之三，且患者发病年龄比西方国家年轻十岁左右。该病有多种细胞遗传学异常，其主要包括：缺失(3q/5q/7/11/12p/20q)、单体5/7和三倍体8/19。常见的基因扩增有MET和HER2等基因，HER2的扩增预示着乳腺癌治疗效果的受益，而MET的扩增则可以作为多种癌症的靶向用药靶点。

针对染色体异常的检测技术有FISH方法、荧光定量PCR技术、二代测序等检测方法。虽然二代测序技术检测灵敏度及准确度高，其能够对所有染色体异常进行一次检测，且已经形成了著名的无创产前检测方法、染色体异常检测方法。但二代测序技术存在费用高、检测流程长等问题。染色体异常的临床症状不一，需要检测的目标也各不相同，虽然FISH方法和荧光定量技术能够有选择的对不同的目标进行检测，但是这两种方法存在检测灵敏度低，对于样本的要求高等问题。

重复序列是人类染色体中存在的大量重复序列，在真核生物中重复序列则广泛分布。它不仅在顺式调控元件如启动子、增强子、终止子处被大量发现，而且很多rRNA基因和组蛋白基因本身就呈重复排列。包括有轻度重复序列(low repetitive sequences)是指重复2-10次的一些序列，例如tRNA基因和一些组蛋白基因；中度重复序列(moderatelyrepetitive sequences)是通常重复10-几百次，一般不编码，占到基因组的25％-40％。例如人类的ALU家族约有30万种类型，哺乳动物的基因组中约有10％-15％的高度重复序列(highly repetitive sequences)，它们重复几百次-几百万次，它们构成了染色体的着丝粒、端粒、rRNA基因和tRNA基因。这提示可以将重复序列作为生物标记，用来评估染色体变异的可能。

重复序列作为染色体变异的优点有：1)基因组比例高，重复序列的比例变化与基因组变异程度相关。2)重复序列在型别内部相对保守，因此可以作为PCR的目标区域，从而可以有效减少多重PCR扩增引物重数。3)由于重复序列在目标片段内拷贝数高(大于3个拷贝)，因此保证了检测的灵敏度，同时减少了样本的需求量。

微滴式数字PCR(Droplet digital PCR，DDPCR)是一种通量较高、成本较低的绝对定量技术，可作为基因检测的初筛技术。DDPCR技术基于单分子PCR方法来进行计数，主要采用当前分析化学热门研究领域的微流控或微滴化方法，将大量稀释后的核酸溶液分散至芯片的微反应器或微滴中，每个反应器的核酸模板数少于或者等于1个。这样经过PCR循环之后，对微滴的荧光信号逐个分析统计。根据相对比例和反应器的体积，就可以推算出原始溶液的核酸浓度，不再依赖ct值或内参基因即可确定低至单拷贝待检靶分子的绝对数目。这种绝对定量的技术提供了使用重复序列的检测基础。通过数字PCR技术能够在一个反应内进行两个目的区域的重复序列的比例检测，一旦超过了正常染色体的比例，即可认为存在染色体异常，通过比例的上升或下降进行基因区域扩增或缺失的评估。DDPCR技术拥有操作快速、简便、无需复杂的生物信息学分析等优点，而且成本相应减少，每次反应可以只需要1天时间。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种用于产前筛查三体综合征的特异性重复序列。

本发明提供的用于产前筛查三体综合征的特异性重复序列由用于产前筛查13三体综合征的特异性重复序列、用于产前筛查18三体综合征的特异性重复序列和用于产前筛查21三体综合征的特异性重复序列组成；

所述用于产前筛查13三体综合征的特异性重复序列为序列1；

所述用于产前筛查18三体综合征的特异性重复序列为序列2；

所述用于产前筛查21三体综合征的特异性重复序列为序列3。

本发明的第二个目的是提供一种用于产前筛查三体综合征的成套引物和探针。

本发明提供的用于产前筛查三体综合征的成套引物和探针由用于产前筛查13三体综合征的引物对和探针、用于产前筛查18三体综合征的引物对和探针与用于产前筛查21三体综合征的引物对和探针组成；

所述用于产前筛查13三体综合征的引物对由引物PRIMAX-F和引物PRIMAX-R组成；

所述用于产前筛查18三体综合征的引物对由引物TAR-F和引物TAR-R组成；

所述用于产前筛查21三体综合征的引物对由引物THE1D-F和引物THE1D-R组成；

所述引物PRIMAX-F为如下(a1)或(a2)：

(a1)序列表中序列4所示的单链DNA分子；

(a2)将序列4经过1个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同功能的DNA分子；

所述引物PRIMAX-R为如下(a3)或(a4)：

(a3)序列表中序列5所示的单链DNA分子；

(a4)将序列5经过1个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列5具有相同功能的DNA分子；

所述引物TAR-F为如下(a5)或(a6)：

(a5)序列表中序列6所示的单链DNA分子；

(a6)将序列6经过1个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列6具有相同功能的DNA分子；

所述引物TAR-R为如下(a7)或(a8)：

(a7)序列表中序列7所示的单链DNA分子；

(a8)将序列7经过1个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列7具有相同功能的DNA分子；

所述引物THE1D-F为如下(a9)或(a10)：

(a9)序列表中序列8所示的单链DNA分子；

(a10)将序列8经过1个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列8具有相同功能的DNA分子；

所述引物THE1D-R为如下(a11)或(a12)：

(a11)序列表中序列9所示的单链DNA分子；

(a12)将序列9经过1个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列9具有相同功能的DNA分子；

所述用于产前筛查13三体综合征的探针为如下(a13)或(a14)：

(a13)序列表中序列10所示的单链DNA分子；

(a14)将序列10经过1个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列10具有相同功能的DNA分子；

所述用于产前筛查18三体综合征的探针为如下(a15)或(a16)：

(a15)序列表中序列11所示的单链DNA分子；

(a16)将序列11经过1个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列11具有相同功能的DNA分子；

所述用于产前筛查21三体综合征的探针为如下(a17)或(a18)：

(a17)序列表中序列12所示的单链DNA分子；

(a18)将序列12经过1个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列12具有相同功能的DNA分子。

上述成套引物和探针中，所述探针的5'端均标记荧光基团。在本发明的具体实施例中，所述用于产前筛查13三体综合征的探针标记荧光基团FAM；所述用于产前筛查18三体综合征的探针标记荧光基团VIC；所述用于产前筛查21三体综合征的探针标记荧光基团VIC。

本发明的第三个目的是提供一种用于产前筛查三体综合征的试剂盒。

本发明提供的用于产前筛查三体综合征的试剂盒包括用于检测上述用于产前筛查13三体综合征的特异性重复序列的试剂、用于检测上述用于产前筛查18三体综合征的特异性重复序列的试剂和用于检测上述用于产前筛查21三体综合征的特异性重复序列的试剂。

上述试剂盒中，所述用于检测上述用于产前筛查13三体综合征的特异性重复序列的试剂可为上述用于产前筛查13三体综合征的引物对和探针；

所述用于检测上述用于产前筛查18三体综合征的特异性重复序列的试剂可为上述用于产前筛查18三体综合征的引物对和探针；

所述用于检测上述用于产前筛查21三体综合征的特异性重复序列的试剂可为上述用于产前筛查21三体综合征的引物对和探针。

本发明的第四个目的是提供一种用于产前筛查三体综合征的成套试剂。

本发明提供的用于产前筛查三体综合征的成套试剂包括用于产前筛查18三体综合征的成套试剂和用于产前筛查21三体综合征的成套试剂；

所述用于产前筛查18三体综合征的成套试剂包括上述引物PRIMAX-F、引物PRIMAX-R、引物TAR-F、引物TAR-R、用于产前筛查13三体综合征的探针与用于产前筛查18三体综合征的探针；

所述用于产前筛查21三体综合征的成套试剂包括上述引物PRIMAX-F、引物PRIMAX-R、引物THE1D-F、引物THE1D-R、用于产前筛查13三体综合征的探针、用于产前筛查21三体综合征的探针。

上述成套试剂中，所述用于产前筛查18三体综合征的成套试剂由引物PRIMAX-F、引物PRIMAX-R、引物TAR-F、引物TAR-R、用于产前筛查13三体综合征的探针、用于产前筛查18三体综合征的探针、ddPCRsupermix、DNA模板和水组成；

用于产前筛查21三体综合征的成套试剂由引物PRIMAX-F、引物PRIMAX-R、引物THE1D-F、引物THE1D-R、用于产前筛查13三体综合征的探针、用于产前筛查21三体综合征的探针、ddPCRsupermix、DNA模板和水组成。

上述成套试剂中，各条引物的摩尔量相同；各条探针的摩尔量相同；各条引物在成套试剂中的终浓度均为1uM，各条探针在成套试剂中的终浓度均为0.25uM。

本发明的第五个目的是提供上述特异性重复序列或上述成套引物和探针或上述成套试剂或上述试剂盒的新用途。

本发明提供了上述特异性重复序列或上述成套引物和探针或上述成套试剂或上述试剂盒在产前筛查三体综合征中的应用。

本发明还提供了上述特异性重复序列或上述成套引物和探针或上述成套试剂或上述试剂盒在制备产前筛查三体综合征的产品中的应用。

本发明还提供了上述特异性重复序列或上述成套引物和探针或上述成套试剂或上述试剂盒在诊断或辅助诊断三体综合征中的应用。

本发明还提供了上述特异性重复序列或上述成套引物和探针或上述成套试剂或上述试剂盒在制备诊断或辅助诊断三体综合征的产品中的应用。

上述特异性重复序列或上述成套引物和探针或上述成套试剂或上述试剂盒或上述应用中，所述三体综合征为18三体综合征或21三体综合征。

上述试剂盒或上述应用中，所述试剂盒还包含数据处理装置；所述数据处理装置具有如下(c1)和(c2)所示的功能：

(c1)取待检孕妇外周血游离DNA作为待测样本，采用上述用于产前筛查18三体综合征的引物对和探针与用于产前筛查13三体综合征的引物对和探针进行微滴式数字PCR，得到待测样本中的18染色体拷贝数和13染色体拷贝数，计算待测样本中18染色体拷贝数和13染色体拷贝数的比值；

若比值＞0.94，则该待测孕妇胎儿为或候选为18三体综合征患儿；

若比值≤0.94，则该待测孕妇胎儿不为或候选不为18三体综合征患儿；

(c2)取待检孕妇外周血游离DNA作为待测样本，采用上述用于产前筛查21三体综合征的引物对和探针与用于产前筛查13三体综合征的引物对和探针进行微滴式数字PCR，得到待测样本中的21染色体拷贝数和13染色体拷贝数，计算待测样本中21染色体拷贝数和13染色体拷贝数的比值；

若比值＞0.46，则该待测孕妇胎儿为或候选为21三体综合征患儿；

若比值≤0.46，则该待测孕妇胎儿不为或候选不为21三体综合征患儿。

上述方法中，根据泊松分布计算得到待测样本中的13、18或21染色体拷贝数。

本发明提供了一种无创产前筛查三体综合征的试剂盒，本发明的试剂盒包括用于产前筛查13三体综合征的引物对和探针、用于产前筛查18三体综合征的引物对和探针与用于产前筛查21三体综合征的引物对和探针。本发明还提供了一种无创产前筛查三体综合征的方法，与二代测序方法相比，本发明的筛查方法成本低、检测周期短(本发明方法的成本为100元，检测时间为1天，而二代测序的检测方法成本为300-500，检测时间为3-5天)，而且检测灵敏度高、方便且绝对定量。

附图说明

图1为18三体综合征DNA的突变频率的曲线图。

图2为21三体综合征DNA的突变频率的曲线图。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

下述实施例中的YH细胞系是华大基因研究院研发的细胞系，具体源自2008年发表在自然杂志的首个中国人，同时也是首个亚洲人的基因组图谱“炎黄一号”细胞系。

下述实施例中的正常人细胞DNA均指YH细胞系DNA。

实施例1、三体特异性重复序列的筛选及其检测引物和探针

一、三体特异性重复序列的筛选

1、数据库规范化

自repeatmaster软件中下载到关于人基因组序列hg38中所有重复序列，并根据其特有格式，提取出包括有染色体、染色体起始和终止位置、重复序列名称、重复序列起始和终止位置、重复序列类型以及重复序列的碱基序列，整合成fasta格式，得到规范后数据库并保存。

2、特征序列的筛选

在规范后数据库中，分别查找两区域内50bp以上特异重复序列，需要拷贝数>5,且不存在变异及多态性，将这些重复序列依次在区域外进行检索，如存在相同序列，则删除该序列。最后使用blastn对所有获得序列再次检验，要求所有序列在指定区域内匹配分数>90％，且至少匹配>5次，在指定区域外匹配分数<80％。

最终针对13号染色体、18号染色体和21号染色体筛选得到的特异性重复序列及其在各自染色体上的拷贝数如表1所示，每个染色体对应的特异性序列仅存在于自身染色体中，在其他染色体则不存在拷贝数。

表1为三体综合征的特异性重复序列及其拷贝数

二、三体特异性重复序列的检测引物和探针的设计

采用oligo7软件对筛选得到的13号染色体、18号染色体和21号染色体的特异性重复序列进行引物及探针的设计，尽可能满足重要原则的基础上，要求上下引物扩增产物小于100bp，探针退火温度比引物高出5℃。

最终针对13号染色体、18号染色体和21号染色体筛选得到的特异性重复序列设计的引物和探针序列分别如表2和表3所示。探针5'端均标记荧光基团。

表2为三体综合征的特异性重复序列的检测引物

表3为三体综合征的特异性重复序列的检测探针

	探针	5'->3'
			13染色体	PRIMAX-Probe(FAM)	TGGGGCTGCACTCTGGC(序列10)
18染色体	TAR-Probe(VIC)	CCCGGCCGCCAGCAG(序列11)
			21染色体	THE1D-probe(VIC)	GGACCACCCCATCATCCA(序列12)

实施例2、18和21三体综合征的检测方法

一、待测样本的制备

1、实验组样本

(1)分别以18三体DNA(经临床诊断为18三体综合征患者的DNA)、YH细胞系DNA、18三体DNA与YH细胞系DNA的混合样本作为待测样本。18三体DNA与YH细胞系DNA的混合样本是分别按照如下比例：50％、25％、10％、5％、2.5％、1％和0.5％混匀得到的具有不同突变频率的18三体混合样本。每个待测样本中的DNA浓度均为2ng/ul。

(2)分别以21三体DNA(经临床诊断为21三体综合征患者的DNA)、YH细胞系DNA、21三体DNA与YH细胞系DNA的混合样本作为待测样本。21三体DNA与YH细胞系DNA的混合样本是分别按照如下比例：50％、25％、10％、5％、2.5％、1％和0.5％混匀得到的具有不同突变频率的21三体混合样本。每个待测样本中的DNA浓度均为2ng/ul。

2、对照组样本

以正常人血浆游离DNA(cfDNA)为对照组样本(真阴性样本)。

二、DDPCR

1、反应体系的配制

将引物、探针、DNA模板(待测样本)、ddPCRsupermix(BIORAD，1863024)和水混匀，分别按照表4和表5中的各试剂组分的用量配制得到25ul的18/13号染色体检测反应体系和21/13号染色体检测反应体系，并分别将其加入到微滴发生卡上。每条引物在反应体系中的终浓度均为1uM；每条探针在反应体系中的终浓度均为0.25uM。

表4为18/13号染色体检测反应体系

试剂组分	体积(ul)
		ddPCRsupermix	12.5
PRIMAX-F/PRIMAX-R	2.5
		TAR-F/TAR-R	2.5
PRIMAX-Probe(FAM)	0.625
		TAR-Probe(VIC)	0.625
Sample(DNA模板)	2.0
		H<sub>2</sub>0	4.25
合计	25

表5为21/13号染色体检测反应体系

2、微滴的制备

将微滴发生卡放入微滴生成器内，在2.5分钟内将每个22微升反应液分成20000个液滴。

3、PCR扩增

将微滴转移到96孔板上，于PCR仪上按照表6所示的反应程序进行扩增。

表6为PCR反应程序

4、微滴的检测

将96孔板放入微滴分析仪，顺序吸取每个样品的微滴并随载液流逐一通过双色检测器。

5、数据的分析

有荧光信号的微滴为阳性，无荧光信号的微滴为阴性，软件记录每个样品里阳性微滴的比例，并使用数字PCR的Quantsoft2.0软件自动分析数据，根据泊松分布计算得到待测样本中的13、18或21染色体拷贝数，并计算待测样本中的18/13突变频率(待测样本中的18染色体拷贝数/13染色体拷贝数)及21/13突变频率(待测样本中的21染色体拷贝数/13染色体拷贝数)。以18/13突变频率或21/13突变频率为纵坐标，待测样本中18三体综合征DNA或21三体综合征DNA的突变频率为横坐标绘制曲线。

18/13号染色体检测反应体系的检测结果如图1和表7所示。从图1中可以看出：18/13号染色体的比例随着18三体综合征DNA比例的逐渐增高而逐渐增高，这是由于该患者DNA中含有额外的一份18号染色体，因此导致了每增加1份该患者DNA，就额外增加一份18号染色体。而1ng DNA中约含有200多拷贝人基因组，由于采用了重复序列的方法，将这种差别大大增加，最后导致能够至少检测到混合了10％及以上的18三体综合征患者DNA的样本。

21/13号染色体检测反应体系的检测结果如图2和表9所示。从表中可以看出：从图2中可以看出：21/13号染色体的比例随着21三体综合征DNA比例的逐渐增高而逐渐增高，这是由于该患者DNA中含有额外的一份21号染色体，因此导致了每增加1份该患者DNA，就额外增加一份21号染色体。而1ng DNA中约含有200多拷贝人基因组，由于采用了重复序列的方法，将这种差别大大增加，最后导致能够至少检测到混合了10％及以上的21三体综合征患者DNA的样本。

上述结果表明：本发明的方法可以用于无创产前中18和21三体综合征的检测。且本发明针对三体特异性重复序列设计的引物和探针具有良好的灵敏度和特异性。

表7为18三体与YH混合后的DDPCR检测结果

表8为正常人血浆游离DNA的DDPCR检测结果

表9为21三体与YH混合后的DDPCR检测结果

在实际应用中可以按照如下方法对待检孕妇进行产前18和21三体综合征的筛查：

(1)18三体综合征筛查

取待检孕妇外周血游离DNA作为待测样本，按照表4配制反应体系，采用微滴式数字PCR进行扩增，经数据分析，得到待测样本中的18染色体拷贝数和13染色体拷贝数，计算待测样本中的18染色体拷贝数和待测样本中的13染色体拷贝数的比值；

若比值＞0.94，则该孕妇胎儿为或候选为18三体综合征患儿；

若比值≤0.94，则该孕妇胎儿不为或候选不为18三体综合征患儿；

(2)21三体综合征筛查

取待检孕妇外周血游离DNA作为待测样本，按照表5配制反应体系，采用微滴式数字PCR进行扩增，经数据分析，得到待测样本中的21染色体拷贝数和13染色体拷贝数，计算待测样本中的21染色体拷贝数和待测样本中的13染色体拷贝数的比值；

若比值＞0.46，则该孕妇胎儿为或候选为21三体综合征患儿；

若比值≤0.46，则该孕妇胎儿不为或候选不为21三体综合征患儿。

实施例3、引物和探针的特异性检测

(一)引物的特异性检测

1、以正常人细胞DNA为模板，采用实施例1中设计的PRIMAX-F和PRIMAX-R引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

琼脂糖凝胶电泳检测上述PCR扩增产物。结果表明：PCR扩增得到大小约为60bp的条带，与预期一致且条带单一，说明PRIMAX-F和PRIMAX-R引物特异性好。

2、以正常人细胞DNA为模板，采用实施例1中设计的TAR-F和TAR-R引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

琼脂糖凝胶电泳检测上述PCR扩增产物。结果表明：PCR扩增得到大小约为60bp的条带，与预期一致且条带单一，说明TAR-F和TAR-R引物特异性好。

3、以正常人细胞DNA为模板，采用实施例1中设计的THE1D-F和THE1D-F引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

琼脂糖凝胶电泳检测上述PCR扩增产物。结果表明：PCR扩增得到大小约为70bp的条带，与预期一致且条带单一，说明THE1D-F和THE1D-F引物特异性好。

(二)探针的特异性检测

1、分别以正常人细胞DNA和水为模板，采用实施例1中设计的引物PRIMAX-F、引物PRIMAX-R、引物TAR-F、引物TAR-R、TAR-probe和PRIMAX-probe进行DDPCR检测，得到DDPCR检测结果。

数字PCR检测结果表明：可以明显区分正常人细胞DNA(阳性)和水(阴性)，二者结果差异显著，说明TAR-probe和PRIMAX-probe探针特异性好。

2、分别以正常人细胞DNA和水为模板，采用实施例1中设计的引物PRIMAX-F、引物PRIMAX-R、引物THE1D-F、引物THE1D-R、THE1D-probe和PRIMAX-probe进行DDPCR检测，得到DDPCR检测结果。

数字PCR检测结果表明：可以明显区分正常人细胞DNA(阳性)和水(阴性)，二者结果差异显著，说明THE1D-probe和PRIMAX-probe探针特异性好。

序列表

<110>深圳华大生命科学研究院

<120>一种无创产前筛查三体综合征的试剂盒及其应用

<160>12

<210>1

<211>119bp

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>1

agctgaacta gtagcttaga tttggggctg cactctggca aagatgaaag attaaatatt 60

aatatggatg gtagatttgc tttttgagtg gtttatgatt tgtggaattt attaaaaca 119

<210>2

<211>60bp

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>2

caagagggcc ctgcagtgcc ctggccgcca gcagggggcg caaggccatg acaccgtgag 60

<210>3

<211>70bp

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>3

ttcccatgca cgggagagac caggtggagg tgactggatg atggggtggt ccccccatgc 60

tgttcccatg 70

<210>4

<211>20bp

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>4

gctgaactag tagcttagat 20

<210>5

<211>21bp

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>5

ttaatctttc atctttgcca g 21

<210>6

<211>18bp

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>6

Caagagggcc ctgcagtg 18

<210>7

<211>18bp

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>7

cggtgtcatg gccttgcg 18

<210>8

<211>21bp

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>8

ggagagacca ggtggaggtg a 21

<210>9

<211>21bp

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>9

attacatggg aacagcatgg g 21

<210>10

<211>17bp

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>10

tggggctgca ctctggc 17

<210>11

<211>15bp

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>11

cccggccgcc agcag 15

<210>12

<211>18bp

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>12

ggaccacccc atcatcca 18

Claims (10)

1.一种用于产前筛查18三体综合征或21三体综合征的分子标记，所述分子标记由用于产前筛查13三体综合征的特异性重复序列、用于产前筛查18三体综合征的特异性重复序列和用于产前筛查21三体综合征的特异性重复序列组成；

所述用于产前筛查13三体综合征的特异性重复序列如SEQ ID No.1所示；

所述用于产前筛查18三体综合征的特异性重复序列如SEQ ID No.2所示；

所述用于产前筛查21三体综合征的特异性重复序列如SEQ ID No.3所示。

2.一种用于产前筛查18三体综合征或21三体综合征的成套引物和探针，所述成套引物和探针由用于产前筛查13三体综合征的引物对和探针、用于产前筛查18三体综合征的引物对和探针与用于产前筛查21三体综合征的引物对和探针组成；

所述用于产前筛查13三体综合征的引物对由引物PRIMAX-F和引物PRIMAX-R组成；

所述用于产前筛查18三体综合征的引物对由引物TAR-F和引物TAR-R组成；

所述用于产前筛查21三体综合征的引物对由引物THE1D-F和引物THE1D-R组成；

所述引物PRIMAX-F为SEQ ID No.4所示的单链DNA分子；

所述引物PRIMAX-R为SEQ ID No.5所示的单链DNA分子；

所述引物TAR-F为SEQ ID No.6所示的单链DNA分子；

所述引物TAR-R为SEQ ID No.7所示的单链DNA分子；

所述引物THE1D-F为SEQ ID No.8所示的单链DNA分子；

所述引物THE1D-R为SEQ ID No.9所示的单链DNA分子；

所述用于产前筛查13三体综合征的探针为SEQ ID No.10所示的单链DNA分子；

所述用于产前筛查18三体综合征的探针为SEQ ID No.11所示的单链DNA分子；

所述用于产前筛查21三体综合征的探针为SEQ ID No.12所示的单链DNA分子。

3.根据权利要求2所述的成套引物和探针，其特征在于：所述探针的5'端均标记荧光基团。

4.根据权利要求3所述的成套引物和探针，其特征在于：

所述用于产前筛查13三体综合征的探针标记荧光基团FAM；

所述用于产前筛查18三体综合征的探针标记荧光基团VIC；

所述用于产前筛查21三体综合征的探针标记荧光基团VIC。

5.一种用于产前筛查18三体综合征或21三体综合征的试剂盒，所述试剂盒包括用于检测权利要求1中所述的用于产前筛查13三体综合征的特异性重复序列的试剂、用于检测权利要求1中所述的用于产前筛查18三体综合征的特异性重复序列的试剂和用于检测权利要求1中所述的用于产前筛查21三体综合征的特异性重复序列的试剂。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：

所述用于检测权利要求1中所述的用于产前筛查13三体综合征的特异性重复序列的试剂为权利要求2中所述的用于产前筛查13三体综合征的引物对和探针；

所述用于检测权利要求1中所述的用于产前筛查18三体综合征的特异性重复序列的试剂为权利要求2中所述的用于产前筛查18三体综合征的引物对和探针；

所述用于检测权利要求1中所述的用于产前筛查21三体综合征的特异性重复序列的试剂为权利要求2中所述的用于产前筛查21三体综合征的引物对和探针。

7.一种用于产前筛查18三体综合征或21三体综合征的成套试剂，其包括用于产前筛查18三体综合征的成套试剂和用于产前筛查21三体综合征的成套试剂；

所述用于产前筛查18三体综合征的成套试剂包括权利要求2中所述的引物PRIMAX-F、引物PRIMAX-R、引物TAR-F、引物TAR-R、用于产前筛查13三体综合征的探针和用于产前筛查18三体综合征的探针；

所述用于产前筛查21三体综合征的成套试剂包括权利要求2中所述的引物PRIMAX-F、引物PRIMAX-R、引物THE1D-F、引物THE1D-R、用于产前筛查13三体综合征的探针和用于产前筛查21三体综合征的探针。

8.根据权利要求7所述的成套试剂，其特征在于：各条引物在成套试剂中的终浓度均为1μM，各条探针在成套试剂中的终浓度均为0.25μM。

9.权利要求2-4任一所述的成套引物和探针或权利要求5或6所述的试剂盒或权利要求7或8所述的成套试剂在制备产前筛查18三体综合征或21三体综合征的产品中的应用。

10.权利要求2-4任一所述的成套引物和探针或权利要求5或6所述的试剂盒或权利要求7或8所述的成套试剂在制备诊断或辅助诊断18三体综合征或21三体综合征的产品中的应用。

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