CN113088570A - 一种maldi-tof质谱平台检测麻醉药物和镇痛药物用药相关的基因位点的试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种MALDI‑TOF质谱平台检测麻醉药物和镇痛药物用药相关的基因位点的试剂盒，其无需添加其它标记，仅需合成普通引物，检测成本低，适合大规模人群分子筛查和常规基因诊断；反应体系为非杂交依赖性，不存在潜在的杂交错配干扰，具有良好的准确性；检测通量大；只需最低2ng的DNA样本，就能进行分型，分析灵敏度高；具有极高的精确度和极快的速度，人力成本与检测成本低，适合大规模人群分子筛查和常规基因诊断。本发明实现了在同一试剂盒中检测麻醉药物及镇痛药物用药相关(恶性高热)的60基因位点，能有效解决因遗传多态性造成醉药物效果差异甚至致死等问题，可帮助医生调整麻醉方案，以取得高效、安全、经济的最佳治疗效果。
Description
技术领域
本发明涉及基因检测技术领域，具体地，涉及一种MALDI-TOF质谱平台检测麻醉药物和镇痛药物用药相关的基因位点的试剂盒。
背景技术
麻醉是指用药物或非药物方法使机体或机体一部分暂时失去感觉，以达到无痛的目的，多用于手术或某些疾病的治疗。麻醉用药一般分为麻醉药物和麻醉辅助药物两大类，其中麻醉药物被国家高度监管。麻醉药物通常兼具镇静、镇痛、肌松等多种功能，如七氟烷、丙泊酚等；麻醉辅助药物常常只具有某一方面功效，如镇静催眠、麻醉镇痛、肌松、拮抗、降压、止呕等。现代麻醉学开始于1846年，在麻醉药物的临床应用中，不同病人使用同一剂量的麻醉药物时，意识消失的时间、苏醒时间、麻醉深度、用药的发生率存在较大的个体差异。多年的研究发现，遗传因素是造成个体间药代动力学、药效学反应差异的重要原因。麻醉药物基因组学研究能够为麻醉药物的个体化用药和预防用药提供重要依据，准确预测病人对麻醉药物的反应，提高手术麻醉的安全性。基础研究提高了麻醉学专业性，实现临床和基础的相互转化，更好实现个体用药，实现麻醉药应用的安全和有效。
恶性高热(Malignant hyperthermia，简称MH)是一种严重的骨骼肌肉代谢亢进综合征，其为常染色体显性遗传性疾病。临床上挥发性吸入麻醉剂、去极化肌松药的使用及其他刺激(热、压力)均可能诱发恶性高热的发生。恶性高热易感者的骨骼肌细胞膜发育缺陷，在诱发药物作用下，使肌细胞浆内钙离子浓度迅速增高，使肌肉挛缩，产热急剧增加，体温迅速升高，同时产生大量乳酸和二氧化碳，出现酸中毒、低氧血症、高血钾、心律失常等一系列变化，严重者可致患者死亡。其发病过程凶险，在没有特效药物的情况下，病死率可高达70％以上，但是其特效药物丹曲林钠目前尚未在我国正式上市。恶性高热的诊断，对指导麻醉用药和早期确诊恶性高热具有重要的临床意义。
药物基因组学从基因水平阐述了基因多态性与药物效应的关系，进一步指导临床个体化给药。临床实践发现麻醉药物适用存在个体差异，随着人类基因组计划等基因研究深度的逐渐增加，一些基因位点的多态性已被发现与镇痛、镇静和肌松等麻醉效应相关，遗传多态性是造成个体对药物反应差异的重要因素之一。通过分析麻醉和镇痛药物相关的基因位点，能够帮助医生预测病人对麻醉及镇痛药物的反应，并根据病人的不同基因组学特性合理用药，达到提高药效，降低毒性，避免不良反应。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术的上述不足，提供一组MALDI-TOF质谱平台检测麻醉药物和镇痛药物用药相关的基因位点的多重PCR扩增引物及单碱基延伸引物。本发明检测的对象包括了麻醉药物及镇痛药物(恶性高热)等方面相关的60个基因位点的基因型。其建立的检测试剂盒灵活性与可扩展性兼备，操作简单且高通量自动化，高通量且低成本，能有效解决因遗传多态性造成醉药物及镇痛药物效果差异甚至致死等问题，可帮助医生调整用药方案，以取得高效、安全、经济的最佳治疗效果。
本发明的第一个目的是提供一组MALDI-TOF质谱平台检测麻醉药物和/或镇痛药物用药相关的基因位点的多重PCR扩增引物。
本发明的第二个目的是提供一组MALDI-TOF质谱平台检测麻醉药物和/或镇痛药物用药相关的基因位点的单碱基延伸引物。
本发明的第三个目的是提供所述的多重PCR扩增引物中的一条或几条，和/或所述的单碱基延伸引物中的一条或几条在制备检测麻醉药物和/或镇痛药物用药相关的基因位点的基因型的试剂盒中的应用。
本发明的第四个目的是提供一种检测麻醉药物和/或镇痛药物用药相关的基因位点的基因型的试剂盒。
为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：
发明基于与麻醉药物及镇痛药物相关的60个基因位点，公开了每个基因位点的两条PCR扩增引物和一条单碱基延伸引物，PCR引物用于扩增目标基因位点的模板序列，单碱基延伸引物用于扩增目标基因位点的靶区域。PCR反应扩增人体的基因位点序列，特异延伸引物在靶区域结合，样本经特定处理后与芯片基质共结晶，瞬时纳秒(10-9s)强激光激发，基质将吸收的激光脉冲能量转移给待分析样品，按荷质比加以分离。离子捕获仪收集并储存脉冲信号，并对其进行质谱分析，通过比较A、T、G和C的信号强度及毗邻信号间质量的差异(ddATP＝271.2，ddCTP＝247.2，ddGTP＝287.2，ddTTP＝327.1)可得出模板序列的信息，从而实现检测人体的基因多态性。
本发明要求保护一组MALDI-TOF质谱平台检测麻醉药物和/或镇痛药物用药相关(恶性高热)的基因位点的多重PCR扩增引物，其特征在于，所述引物的核苷酸序列如SEQ IDNO：1～58所示。
多重PCR扩增引物详细见表1：
本发明还要求保护一组MALDI-TOF质谱平台检测麻醉药物和/或镇痛药物用药相关(恶性高热)的基因位点的单碱基延伸引物，包括单碱基延伸引物组1和单碱基延伸引物组2；其中，单碱基延伸引物组1的核苷酸序列如SEQ ID NO：59～86所示，单碱基延伸引物组2的苷酸序列如SEQ ID NO：87～114所示。
延伸引物详细见下表2。
表2：
单碱基延伸引物组1和单碱基延伸引物组2分别单独使用，在两个体系内进行单碱基延伸反应，以检测60个与麻醉药物及镇痛药物用药(恶性高热)相关的基因位点。
进一步，所述的多重PCR扩增引物中的一条或几条，和/或所述的单碱基延伸引物中的一条或几条在制备检测麻醉药物和/或镇痛药物用药相关的基因位点的基因型的试剂盒中的应用，也属于本发明的保护范围。
本发明还要求保护一种检测麻醉药物和/或镇痛药物用药相关的基因位点的基因型的试剂盒，含有所述的多重PCR扩增引物中的一条或几条，和/或所述的单碱基延伸引物中的一条或几条。
优选地，含有所述的多重PCR扩增引物和所述的单碱基延伸。
更优选地，还含有阴性质控品、阳性质控品、多重PCR反应试剂、去dNTPs反应试剂、单碱基延伸反应试剂、脱盐树脂、和质谱芯片中的一种或几种。
进一步优选地，多重PCR反应试剂包括多重PCR反应混合液和多重PCR酶。
进一步更优选地，多重PCR反应混合液包括核糖核苷酸、Mg2+、Cl-、水、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐和氯化钾。
进一步更优选地，多重PCR酶包括聚合酶和甘油。
进一步优选地，去dNTPs反应试剂包括SAP反应混合液和SAP酶
进一步更优选地，SAP反应混合液包括氯化镁缓冲液和三羟甲基氨基甲烷盐酸盐，
进一步更优选地，SAP酶包括虾碱性磷酸酶和甘油。
进一步优选地，单碱基延伸反应试剂包括单碱基延伸反应混合液和单碱基延伸酶。
进一步更优选地，单碱基延伸反应混合液包括硫酸铵、氯化钾、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐和乙酰化核糖核苷酸。
进一步优选地，单碱基延伸酶包括水、丙三醇、氯化钾、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、乙二胺四乙酸、二硫苏糖醇和高特异性聚合酶。
进一步优选地，所述试剂盒含有单碱基延伸引物混合液1和单碱基延伸引物混合液2，其中，单碱基延伸引物混合液1含有核苷酸序列如SEQ ID NO：59～86所示单碱基延伸引物，单碱基延伸引物混合液2含有核苷酸序列如SEQ ID NO：87～58所示单碱基延伸引物；
单碱基延伸引物混合液1中，核苷酸序列如SEQ ID NO:59所示的单核苷酸延伸引物的浓度为10.90pmol/μl、核苷酸序列如SEQ ID NO:60所示的单核苷酸延伸引物的浓度为11.25pmol/μl、核苷酸序列如SEQ ID NO:61所示的单核苷酸延伸引物的浓度为11.82pmol/μl、核苷酸序列如SEQ ID NO:62所示的单核苷酸延伸引物的浓度为12.56pmol/μl、核苷酸序列如SEQ ID NO:63所示的单核苷酸延伸引物的浓度为13.07pmol/μl、核苷酸序列如SEQID NO:64所示的单核苷酸延伸引物的浓度为13.37pmol/μl、核苷酸序列如SEQ ID NO:65所示的单核苷酸延伸引物的浓度为13.55pmol/μl、核苷酸序列如SEQ ID NO:66所示的单核苷酸延伸引物的浓度为13.84pmol/μl、核苷酸序列如SEQ ID NO:67所示的单核苷酸延伸引物的浓度为14.28pmol/μl、核苷酸序列如SEQ ID NO:68所示的单核苷酸延伸引物的浓度为14.69pmol/μl、核苷酸序列如SEQ ID NO:69所示的单核苷酸延伸引物的浓度为15.40pmol/μl、核苷酸序列如SEQ ID NO:70所示的单核苷酸延伸引物的浓度为15.45pmol/μl、核苷酸序列如SEQ ID NO:71所示的单核苷酸延伸引物的浓度为15.51pmol/μl、核苷酸序列如SEQID NO:72所示的单核苷酸延伸引物的浓度为15.90pmol/μl、核苷酸序列如SEQ ID NO:73所示的单核苷酸延伸引物的浓度为16.18pmol/μl、核苷酸序列如SEQ ID NO:74所示的单核苷酸延伸引物的浓度为16.42pmol/μl、核苷酸序列如SEQ ID NO:75所示的单核苷酸延伸引物的浓度为16.65pmol/μl、核苷酸序列如SEQ ID NO:76所示的单核苷酸延伸引物的浓度为17.20pmol/μl、核苷酸序列如SEQ ID NO:77所示的单核苷酸延伸引物的浓度为17.44pmol/μl、核苷酸序列如SEQ ID NO:78所示的单核苷酸延伸引物的浓度为17.78pmol/μl、核苷酸序列如SEQ ID NO:79所示的单核苷酸延伸引物的浓度为18.07pmol/μl、核苷酸序列如SEQID NO:80所示的单核苷酸延伸引物的浓度为18.69pmol/μl、核苷酸序列如SEQ ID NO:81所示的单核苷酸延伸引物的浓度为19.19pmol/μl、核苷酸序列如SEQ ID NO:82所示的单核苷酸延伸引物的浓度为19.78pmol/μl、核苷酸序列如SEQ ID NO:83所示的单核苷酸延伸引物的浓度为20.18pmol/μl、核苷酸序列如SEQ ID NO:84所示的单核苷酸延伸引物的浓度为20.74pmol/μl、核苷酸序列如SEQ ID NO:85所示的单核苷酸延伸引物的浓度为21.12pmol/μl、核苷酸序列如SEQ ID NO:86所示的单核苷酸延伸引物的浓度为21.86pmol/μl。
单碱基延伸引物混合液2中，核苷酸序列如SEQ ID NO:87所示的单核苷酸延伸引物的浓度为11.11pmol/μl、核苷酸序列如SEQ ID NO:88所示的单核苷酸延伸引物的浓度为11.59pmol/μl、核苷酸序列如SEQ ID NO:89所示的单核苷酸延伸引物的浓度为12.32pmol/μl、核苷酸序列如SEQ ID NO:90所示的单核苷酸延伸引物的浓度为12.80pmol/μl、核苷酸序列如SEQ ID NO:91所示的单核苷酸延伸引物的浓度为12.98pmol/μl、核苷酸序列如SEQID NO:92所示的单核苷酸延伸引物的浓度为13.05pmol/μl、核苷酸序列如SEQ ID NO:93所示的单核苷酸延伸引物的浓度为13.53pmol/μl、核苷酸序列如SEQ ID NO:94所示的单核苷酸延伸引物的浓度为13.61pmol/μl、核苷酸序列如SEQ ID NO:95所示的单核苷酸延伸引物的浓度为14.39pmol/μl、核苷酸序列如SEQ ID NO:96所示的单核苷酸延伸引物的浓度为14.98pmol/μl、核苷酸序列如SEQ ID NO:97所示的单核苷酸延伸引物的浓度为15.06pmol/μl、核苷酸序列如SEQ ID NO:98所示的单核苷酸延伸引物的浓度为15.43pmol/μl、核苷酸序列如SEQ ID NO:99所示的单核苷酸延伸引物的浓度为15.50pmol/μl、核苷酸序列如SEQID NO:100所示的单核苷酸延伸引物的浓度为15.75pmol/μl、核苷酸序列如SEQ ID NO:101所示的单核苷酸延伸引物的浓度为16.21pmol/μl、核苷酸序列如SEQ ID NO:102所示的单核苷酸延伸引物的浓度为16.77pmol/μl、核苷酸序列如SEQ ID NO:103所示的单核苷酸延伸引物的浓度为17.32pmol/μl、核苷酸序列如SEQ ID NO:104所示的单核苷酸延伸引物的浓度为17.39pmol/μl、核苷酸序列如SEQ ID NO:105所示的单核苷酸延伸引物的浓度为17.80pmol/μl、核苷酸序列如SEQ ID NO:106所示的单核苷酸延伸引物的浓度为18.02pmol/μl、核苷酸序列如SEQ ID NO:107所示的单核苷酸延伸引物的浓度为18.45pmol/μl、核苷酸序列如SEQ ID NO:108所示的单核苷酸延伸引物的浓度为18.51pmol/μl、核苷酸序列如SEQ ID NO:109所示的单核苷酸延伸引物的浓度为19.04pmol/μl、核苷酸序列如SEQ ID NO:110所示的单核苷酸延伸引物的浓度为19.08pmol/μl、核苷酸序列如SEQ ID NO:111所示的单核苷酸延伸引物的浓度为19.64pmol/μl、核苷酸序列如SEQ ID NO:112所示的单核苷酸延伸引物的浓度为20.27pmol/μl、核苷酸序列如SEQ ID NO:113所示的单核苷酸延伸引物的浓度为20.61pmol/μl、核苷酸序列如SEQ ID NO:114所示的单核苷酸延伸引物的浓度为20.67pmol/μl；
所述试剂盒含有多重PCR反应引物混合液中核苷酸序列如SEQ ID NO：1～58所示多重PCR扩增引物均为0.5pmol/μl。
最优选地，一种检测麻醉药物和/或镇痛药物用药相关的基因位点的基因型的试剂盒，包含：含有核苷酸序列如SEQ ID NO：1～58所示多重PCR扩增引物的多重PCR反应引物混合液、含有核苷酸序列如SEQ ID NO：59～86所示单碱基延伸引物的单碱基延伸引物混合液1、含有核苷酸序列如SEQ ID NO：87～58所示单碱基延伸引物的单碱基延伸引物混合液2、以及，多重PCR反应混合液、多重PCR酶、SAP反应混合液、SAP酶混合单碱基延伸反应混合液、单碱基延伸酶、脱盐树脂、和质谱芯片；
单碱基延伸引物混合液1中，核苷酸序列如SEQ ID NO:59所示的单核苷酸延伸引物的浓度为10.90pmol/μl、核苷酸序列如SEQ ID NO:60所示的单核苷酸延伸引物的浓度为11.25pmol/μl、核苷酸序列如SEQ ID NO:61所示的单核苷酸延伸引物的浓度为11.82pmol/μl、核苷酸序列如SEQ ID NO:62所示的单核苷酸延伸引物的浓度为12.56pmol/μl、核苷酸序列如SEQ ID NO:63所示的单核苷酸延伸引物的浓度为13.07pmol/μl、核苷酸序列如SEQID NO:64所示的单核苷酸延伸引物的浓度为13.37pmol/μl、核苷酸序列如SEQ ID NO:65所示的单核苷酸延伸引物的浓度为13.55pmol/μl、核苷酸序列如SEQ ID NO:66所示的单核苷酸延伸引物的浓度为13.84pmol/μl、核苷酸序列如SEQ ID NO:67所示的单核苷酸延伸引物的浓度为14.28pmol/μl、核苷酸序列如SEQ ID NO:68所示的单核苷酸延伸引物的浓度为14.69pmol/μl、核苷酸序列如SEQ ID NO:69所示的单核苷酸延伸引物的浓度为15.40pmol/μl、核苷酸序列如SEQ ID NO:70所示的单核苷酸延伸引物的浓度为15.45pmol/μl、核苷酸序列如SEQ ID NO:71所示的单核苷酸延伸引物的浓度为15.51pmol/μl、核苷酸序列如SEQID NO:72所示的单核苷酸延伸引物的浓度为15.90pmol/μl、核苷酸序列如SEQ ID NO:73所示的单核苷酸延伸引物的浓度为16.18pmol/μl、核苷酸序列如SEQ ID NO:74所示的单核苷酸延伸引物的浓度为16.42pmol/μl、核苷酸序列如SEQ ID NO:75所示的单核苷酸延伸引物的浓度为16.65pmol/μl、核苷酸序列如SEQ ID NO:76所示的单核苷酸延伸引物的浓度为17.20pmol/μl、核苷酸序列如SEQ ID NO:77所示的单核苷酸延伸引物的浓度为17.44pmol/μl、核苷酸序列如SEQ ID NO:78所示的单核苷酸延伸引物的浓度为17.78pmol/μl、核苷酸序列如SEQ ID NO:79所示的单核苷酸延伸引物的浓度为18.07pmol/μl、核苷酸序列如SEQID NO:80所示的单核苷酸延伸引物的浓度为18.69pmol/μl、核苷酸序列如SEQ ID NO:81所示的单核苷酸延伸引物的浓度为19.19pmol/μl、核苷酸序列如SEQ ID NO:82所示的单核苷酸延伸引物的浓度为19.78pmol/μl、核苷酸序列如SEQ ID NO:83所示的单核苷酸延伸引物的浓度为20.18pmol/μl、核苷酸序列如SEQ ID NO:84所示的单核苷酸延伸引物的浓度为20.74pmol/μl、核苷酸序列如SEQ ID NO:85所示的单核苷酸延伸引物的浓度为21.12pmol/μl、核苷酸序列如SEQ ID NO:86所示的单核苷酸延伸引物的浓度为21.86pmol/μl。
单碱基延伸引物混合液2中，核苷酸序列如SEQ ID NO:87所示的单核苷酸延伸引物的浓度为11.11pmol/μl、核苷酸序列如SEQ ID NO:88所示的单核苷酸延伸引物的浓度为11.59pmol/μl、核苷酸序列如SEQ ID NO:89所示的单核苷酸延伸引物的浓度为12.32pmol/μl、核苷酸序列如SEQ ID NO:90所示的单核苷酸延伸引物的浓度为12.80pmol/μl、核苷酸序列如SEQ ID NO:91所示的单核苷酸延伸引物的浓度为12.98pmol/μl、核苷酸序列如SEQID NO:92所示的单核苷酸延伸引物的浓度为13.05pmol/μl、核苷酸序列如SEQ ID NO:93所示的单核苷酸延伸引物的浓度为13.53pmol/μl、核苷酸序列如SEQ ID NO:94所示的单核苷酸延伸引物的浓度为13.61pmol/μl、核苷酸序列如SEQ ID NO:95所示的单核苷酸延伸引物的浓度为14.39pmol/μl、核苷酸序列如SEQ ID NO:96所示的单核苷酸延伸引物的浓度为14.98pmol/μl、核苷酸序列如SEQ ID NO:97所示的单核苷酸延伸引物的浓度为15.06pmol/μl、核苷酸序列如SEQ ID NO:98所示的单核苷酸延伸引物的浓度为15.43pmol/μl、核苷酸序列如SEQ ID NO:99所示的单核苷酸延伸引物的浓度为15.50pmol/μl、核苷酸序列如SEQID NO:100所示的单核苷酸延伸引物的浓度为15.75pmol/μl、核苷酸序列如SEQ ID NO:101所示的单核苷酸延伸引物的浓度为16.21pmol/μl、核苷酸序列如SEQ ID NO:102所示的单核苷酸延伸引物的浓度为16.77pmol/μl、核苷酸序列如SEQ ID NO:103所示的单核苷酸延伸引物的浓度为17.32pmol/μl、核苷酸序列如SEQ ID NO:104所示的单核苷酸延伸引物的浓度为17.39pmol/μl、核苷酸序列如SEQ ID NO:105所示的单核苷酸延伸引物的浓度为17.80pmol/μl、核苷酸序列如SEQ ID NO:106所示的单核苷酸延伸引物的浓度为18.02pmol/μl、核苷酸序列如SEQ ID NO:107所示的单核苷酸延伸引物的浓度为18.45pmol/μl、核苷酸序列如SEQ ID NO:108所示的单核苷酸延伸引物的浓度为18.51pmol/μl、核苷酸序列如SEQ ID NO:109所示的单核苷酸延伸引物的浓度为19.04pmol/μl、核苷酸序列如SEQ ID NO:110所示的单核苷酸延伸引物的浓度为19.08pmol/μl、核苷酸序列如SEQ ID NO:111所示的单核苷酸延伸引物的浓度为19.64pmol/μl、核苷酸序列如SEQ ID NO:112所示的单核苷酸延伸引物的浓度为20.27pmol/μl、核苷酸序列如SEQ ID NO:113所示的单核苷酸延伸引物的浓度为20.61pmol/μl、核苷酸序列如SEQ ID NO:114所示的单核苷酸延伸引物的浓度为20.67pmol/μl；
所述试剂盒含有多重PCR反应引物混合液中核苷酸序列如SEQ ID NO：1～58所示多重PCR扩增引物均为0.5pmol/μl。
二、使用方法
1、进行多重PCR反应
提取待测样本的总DNA后，进行多重PCR反应扩增。
每次根据所需检测的标本量，先配制PCR反应扩增引物混合液，震荡混匀后瞬时离心，然后依次按照多重PCR反应体系加入各组成分(除了模板DNA以外)，震荡混匀10秒后瞬时离心，并分装于96孔板相应的孔中，最后加入模板DNA。并用封口膜将96孔板封住，震荡混匀后瞬时离心，放入PCR扩增仪。
多重PCR反应体系为：无核酸酶水0.8μL、多重PCR反应混合液1μL、多重PCR反应引物混合液1μL、多重PCR酶0.2μL、和DNA模板2μL。其中，多重PCR反应扩增引物混合液的中各多重PCR反应引物的浓度为0.5pmol/μl；
多重PCR反应程序为：95℃预变性2min；95℃30sec，56℃30sec，72℃1min，45个循环；72℃5min；4℃保存。
2、去dNTPs反应
扩增完成后，每个反应管加入去dNTPs混合物反应体系，换新的膜将96孔板封住，震荡混匀后瞬时离心，并按反应条件于ABI2720 PCR仪上去除残留的dNTP混合物，
去dNTPs混合物反应体系为：无核酸酶水1.53μL、SAP反应混合液0.17μL、SAP酶0.30μL；
反应程序为：37℃40min；85℃5min；4℃保存。
3、单碱基延伸反应
先分别配制单碱基延伸引物混合液1和单碱基延伸引物混合液2，震荡混匀后瞬时离心，然后依次分别加入各组成分，配制成延伸反应混合液。每个反应管中加入单碱基延伸反应体系试剂，用新的膜将96孔板封住，震荡混匀后瞬时离心，按反应条件于ABI2720 PCR仪上进行延伸，
分别使用单碱基延伸引物混合液1和单碱基延伸引物混合液2配制单碱基延伸反应体系，进行单碱基延伸反应。
单碱基延伸引物混合液1中，核苷酸序列如SEQ ID NO:59所示的单核苷酸延伸引物的浓度为10.90pmol/μl、核苷酸序列如SEQ ID NO:60所示的单核苷酸延伸引物的浓度为11.25pmol/μl、核苷酸序列如SEQ ID NO:61所示的单核苷酸延伸引物的浓度为11.82pmol/μl、核苷酸序列如SEQ ID NO:62所示的单核苷酸延伸引物的浓度为12.56pmol/μl、核苷酸序列如SEQ ID NO:63所示的单核苷酸延伸引物的浓度为13.07pmol/μl、核苷酸序列如SEQID NO:64所示的单核苷酸延伸引物的浓度为13.37pmol/μl、核苷酸序列如SEQ ID NO:65所示的单核苷酸延伸引物的浓度为13.55pmol/μl、核苷酸序列如SEQ ID NO:66所示的单核苷酸延伸引物的浓度为13.84pmol/μl、核苷酸序列如SEQ ID NO:67所示的单核苷酸延伸引物的浓度为14.28pmol/μl、核苷酸序列如SEQ ID NO:68所示的单核苷酸延伸引物的浓度为14.69pmol/μl、核苷酸序列如SEQ ID NO:69所示的单核苷酸延伸引物的浓度为15.40pmol/μl、核苷酸序列如SEQ ID NO:70所示的单核苷酸延伸引物的浓度为15.45pmol/μl、核苷酸序列如SEQ ID NO:71所示的单核苷酸延伸引物的浓度为15.51pmol/μl、核苷酸序列如SEQID NO:72所示的单核苷酸延伸引物的浓度为15.90pmol/μl、核苷酸序列如SEQ ID NO:73所示的单核苷酸延伸引物的浓度为16.18pmol/μl、核苷酸序列如SEQ ID NO:74所示的单核苷酸延伸引物的浓度为16.42pmol/μl、核苷酸序列如SEQ ID NO:75所示的单核苷酸延伸引物的浓度为16.65pmol/μl、核苷酸序列如SEQ ID NO:76所示的单核苷酸延伸引物的浓度为17.20pmol/μl、核苷酸序列如SEQ ID NO:77所示的单核苷酸延伸引物的浓度为17.44pmol/μl、核苷酸序列如SEQ ID NO:78所示的单核苷酸延伸引物的浓度为17.78pmol/μl、核苷酸序列如SEQ ID NO:79所示的单核苷酸延伸引物的浓度为18.07pmol/μl、核苷酸序列如SEQID NO:80所示的单核苷酸延伸引物的浓度为18.69pmol/μl、核苷酸序列如SEQ ID NO:81所示的单核苷酸延伸引物的浓度为19.19pmol/μl、核苷酸序列如SEQ ID NO:82所示的单核苷酸延伸引物的浓度为19.78pmol/μl、核苷酸序列如SEQ ID NO:83所示的单核苷酸延伸引物的浓度为20.18pmol/μl、核苷酸序列如SEQ ID NO:84所示的单核苷酸延伸引物的浓度为20.74pmol/μl、核苷酸序列如SEQ ID NO:85所示的单核苷酸延伸引物的浓度为21.12pmol/μl、核苷酸序列如SEQ ID NO:86所示的单核苷酸延伸引物的浓度为21.86pmol/μl。
单碱基延伸引物混合液2中，核苷酸序列如SEQ ID NO:87所示的单核苷酸延伸引物的浓度为11.11pmol/μl、核苷酸序列如SEQ ID NO:88所示的单核苷酸延伸引物的浓度为11.59pmol/μl、核苷酸序列如SEQ ID NO:89所示的单核苷酸延伸引物的浓度为12.32pmol/μl、核苷酸序列如SEQ ID NO:90所示的单核苷酸延伸引物的浓度为12.80pmol/μl、核苷酸序列如SEQ ID NO:91所示的单核苷酸延伸引物的浓度为12.98pmol/μl、核苷酸序列如SEQID NO:92所示的单核苷酸延伸引物的浓度为13.05pmol/μl、核苷酸序列如SEQ ID NO:93所示的单核苷酸延伸引物的浓度为13.53pmol/μl、核苷酸序列如SEQ ID NO:94所示的单核苷酸延伸引物的浓度为13.61pmol/μl、核苷酸序列如SEQ ID NO:95所示的单核苷酸延伸引物的浓度为14.39pmol/μl、核苷酸序列如SEQ ID NO:96所示的单核苷酸延伸引物的浓度为14.98pmol/μl、核苷酸序列如SEQ ID NO:97所示的单核苷酸延伸引物的浓度为15.06pmol/μl、核苷酸序列如SEQ ID NO:98所示的单核苷酸延伸引物的浓度为15.43pmol/μl、核苷酸序列如SEQ ID NO:99所示的单核苷酸延伸引物的浓度为15.50pmol/μl、核苷酸序列如SEQID NO:100所示的单核苷酸延伸引物的浓度为15.75pmol/μl、核苷酸序列如SEQ ID NO:101所示的单核苷酸延伸引物的浓度为16.21pmol/μl、核苷酸序列如SEQ ID NO:102所示的单核苷酸延伸引物的浓度为16.77pmol/μl、核苷酸序列如SEQ ID NO:103所示的单核苷酸延伸引物的浓度为17.32pmol/μl、核苷酸序列如SEQ ID NO:104所示的单核苷酸延伸引物的浓度为17.39pmol/μl、核苷酸序列如SEQ ID NO:105所示的单核苷酸延伸引物的浓度为17.80pmol/μl、核苷酸序列如SEQ ID NO:106所示的单核苷酸延伸引物的浓度为18.02pmol/μl、核苷酸序列如SEQ ID NO:107所示的单核苷酸延伸引物的浓度为18.45pmol/μl、核苷酸序列如SEQ ID NO:108所示的单核苷酸延伸引物的浓度为18.51pmol/μl、核苷酸序列如SEQ ID NO:109所示的单核苷酸延伸引物的浓度为19.04pmol/μl、核苷酸序列如SEQ ID NO:110所示的单核苷酸延伸引物的浓度为19.08pmol/μl、核苷酸序列如SEQ ID NO:111所示的单核苷酸延伸引物的浓度为19.64pmol/μl、核苷酸序列如SEQ ID NO:112所示的单核苷酸延伸引物的浓度为20.27pmol/μl、核苷酸序列如SEQ ID NO:113所示的单核苷酸延伸引物的浓度为20.61pmol/μl、核苷酸序列如SEQ ID NO:114所示的单核苷酸延伸引物的浓度为20.67pmol/μl。
单碱基延伸反应体系：无核酸酶水0.619μL、延伸反应混合液0.400μL、延伸酶混合液0.041μL、单碱基延伸引物混合液1或2 0.94μL。
反应程序为：95℃预变性30sec；[95℃5sec，(52℃5sec，80℃5sec，5个循环)，40个循环]；72℃3min；4℃保存。
4、反应结束后，2000rpm瞬时离心，每孔加入41μL的灭菌双蒸水(此时每孔内的总体积为50μL)，换新的膜将96孔板封住，震荡混匀后，瞬时离心。
于达瑞生物飞行时间质谱检测系统上，用脱盐树脂去除体系中的盐离子，后将延伸产物点样至质谱芯片，进行质谱检测。
三、结果判断
(1)飞行时间质谱检测系统通过离子捕获仪收集并储存脉冲信号，并对其进行质谱分析，通过比较A、T、G和C的信号强度及毗邻信号间质量的差异(ddATP＝271.2，ddCTP＝247.2，ddGTP＝287.2，ddTTP＝327.1)可得出模板序列的信息，从而实现基因位点的检测结果。
(2)由于飞行时间质谱检测是通过比较A、T、G和C的信号强度及毗邻信号间质量的差异来对基因位点进行分型，当分析的基因位点结果为野生型或者纯合型时，模板序列的质量差异为0，因此显示的质谱锋图只出现单一的锋，若分析的基因位点结果为杂合型时，模板序列的质量有差异，因此显示的质谱锋图出现两个锋。
各位点基因型结果建议如表3所示。
表3：
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明提供的引物组无需添加荧光素、生物素等其它标记，仅需合成普通引物，检测成本低，适合大规模人群分子筛查和常规基因诊断。
(2)本发明提供的反应体系为非杂交依赖性，不存在潜在的杂交错配干扰，具有良好的准确性。
(3)本发明提供的检测范围能检测检麻醉药及镇痛药物用药相关(恶性高热)的60个基因位点，检测通量大。
(4)本发明采用MALDI-TOF质谱平台，运用智能光栅激光定位技术收集质谱，只需最低2ng的DNA样本，就能进行分型，分析灵敏度高。
(5)本发明采用MALDI-TOF质谱平台，具有极高的精确度和极快的速度，上样检测与结果分析均可自动化，人力成本与检测成本低，适合大规模人群分子筛查和常规基因诊断。
(6)本发明实现了在同一试剂盒中检麻醉药及镇痛药物用药相关(恶性高热)的60基因位点，能有效解决因遗传多态性造成醉药物效果差异甚至致死等问题，可帮助医生调整麻醉方案，以取得高效、安全、经济的最佳治疗效果。
附图说明
图1为阴性样本RYR1 c.6487C>T质谱图。
图2为阴性样本RYR1 c.7373G>A质谱图。
图3为阴性样本RYR1 c.103T>C质谱图。
图4为阴性样本COMT c.472G>A质谱图。
图5为阴性样本CYP2C9 c.1075A>C质谱图。
图6为阳性质控品COMT c.472G>A质谱图。
具体实施方式
下面结合说明书附图及具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
材料及试剂说明
96孔板购于美国Axgen公司；封口膜购于美国Thermo公司；MALDI-TOF DNA质谱分析仪为广州达瑞生物技术股份有限公司生产的飞行时间质谱检测系统，其分析范围4000-10000Daltons。多重反应、去dNTP反应、延伸反应所用PCR仪器为ABI2720或Bio-Rad C1000，其余试剂由广州市达瑞生物技术股份有限公司提供。
实施例1一种MALDI-TOF质谱平台检测麻醉药物效应基因的检测试剂盒
一、组成
含有核苷酸序列如SEQ ID NO：1～58所示多重PCR扩增引物，核苷酸序列如SEQ IDNO：59～114所示单碱基延伸引物，阴性质控品和阳性质控品，多重PCR反应试剂(包括：多重PCR反应混合液、多重PCR反应酶混合液)，去dNTPs反应试剂(包括：SAP反应混合液、SAP酶)和单碱基延伸反应试剂(包括：延伸反应混合液、延伸酶混合液)，脱盐树脂、和质谱芯片。
二、使用方法
1、进行多重PCR反应
提取待测样本的总DNA后，进行多重PCR反应扩增，多重PCR反应体系为如表4所示。
表4：
每次根据所需检测的标本量，先配制PCR反应扩增引物混合液，震荡混匀后瞬时离心，然后依次按照多重PCR反应体系顺序分别加入各组成分(除了模板DNA以外)，震荡混匀10秒后瞬时离心，并分装于96孔板相应的孔中，最后加入模板DNA。并用封口膜将96孔板封住，震荡混匀后瞬时离心，放入PCR扩增仪。反应所用的96孔板购于美国Axgen有限公司，封口膜购于美国Thermo公司。
多重PCR反应程序为：
2、去dNTPs反应
扩增完成后，每个反应管加入去dNTPs混合物反应体系并按反应条件于ABI2720PCR仪上去除残留的dNTP混合物，去dNTPs混合物反应体系如表5所示：
表5：
| 组分 | 反应体积1×(μL) |
| 无核酸酶水(自备) | 1.53 |
| SAP反应混合液 | 0.17 |
| SAP酶 | 0.30 |
| 反应体系总量 | 2.00 |
向每孔PCR产物中加入上述2.00μl去dNTPs混合物反应体系，换新的膜将96孔板封住，震荡混匀后瞬时离心，进行去dNTPs反应，
反应程序为：37℃40min；85℃5min；4℃保存。
3、单碱基延伸反应
每个反应管中加入单碱基延伸反应体系试剂，按反应条件于ABI2720 PCR仪上进行延伸，延伸反应体系如表6所示。
表6：
| 组分 | 反应体积1×(μL) |
| 无核酸酶水(自备) | 0.619 |
| 延伸反应混合液 | 0.400 |
| 延伸酶混合液 | 0.041 |
| 单碱基延伸引物混合液1或2 | 0.94 |
| 反应体系总量 | 2 |
其中，单碱基延伸引物混合液1和单碱基延伸引物混合液2的组成如表7和表8所示。
表7：
表8：
先分别配制单碱基延伸引物混合液1和单碱基延伸引物混合液2，震荡混匀后瞬时离心，然后依次分别加入各组成分，配制成延伸反应混合液。向去dNTP混合物反应后的每孔产物中加入上述2.00μl延伸反应混合液，用新的膜将96孔板封住，震荡混匀后瞬时离心。
反应程序为：
4、质谱检测
反应结束后，2000rpm瞬时离心，每孔加入41μl的灭菌双蒸水(此时每孔内的总体积为50μl)，换新的膜将96孔板封住，震荡混匀后，瞬时离心。
于达瑞生物飞行时间质谱检测系统上，用脱盐树脂去除体系中的盐离子，后将延伸产物点样至质谱芯片，进行质谱检测。
三、结果判断
(1)飞行时间质谱检测系统通过离子捕获仪收集并储存脉冲信号，并对其进行质谱分析，通过比较A、T、G和C的信号强度及毗邻信号间质量的差异(ddATP＝271.2，ddCTP＝247.2，ddGTP＝287.2，ddTTP＝327.1)可得出模板序列的信息，从而实现基因位点的检测结果。
(2)由于飞行时间质谱检测是通过比较A、T、G和C的信号强度及毗邻信号间质量的差异来对基因位点进行分型，当分析的基因位点结果为野生型或者纯合型时，模板序列的质量差异为0，因此显示的质谱锋图只出现单一的锋，若分析的基因位点结果为杂合型时，模板序列的质量有差异，因此显示的质谱锋图出现两个锋。
(3)当阴性质控品和阳性质控品均为检测位点对应基因型别时，认为该批次结果可靠；否则，该批次样本的检测结果无效，应查找并排除原因，进行重复实验。
(4)阴性样本质谱锋图如1到图5所示；阴性质控品质谱锋图如4所示；阳性质控品质谱锋图如6所示。
(5)各位点基因型结果建议如表9所示。
表9：
实施例2正常人样本的检测
一、实验方法
使用实施例1的试剂盒检测正常人的样本。检测过程中所用的试剂还包括：广州达瑞生物技术股份有限公司的核酸提取或纯化试剂盒、灭菌双蒸水、无水乙醇。
1、标本采集、运送和保存。
标本采集：干血片、外周全血。
保存和运送：干血片样本自然晾干后，室温防尘、防潮运送，样本可于-20±5℃储存；外周血样本可于-20±5℃储存，样本运送采用冰壶加冰或泡沫箱加冰密封进行运输。
提取干血片样本和外周全血样本的基因组DNA：按照试剂盒说明书的标准操作流程进行。
2、样本检测
按照实施例1的记载进行检测。
二、实验结果
根据质谱仪检测到的信号值分析SNP位点的基因型，其正常人样本检测结果见表10.：
表10：
实施例3试剂盒准确性与稳定性样本评价
一、实验方法
1、样本选择
样本来源：选取试剂盒的阴性质控品和阳性质控品，其中阳性质控品的COMTc.472G>A基因结果为GA，其它基因型结果与阴性质控品一致。
2、样本检测
按照实施例1的方法使用实施例1的试剂盒检测以上样本，每个阴阳质控品各设置3个副孔，阴性质控品编号为1-3，阳性质控品编号为4-6，每天测一次，连续测3天。
二、实验结果
结果如表11和表12所示，结果显示，18个质控品批内准确性评价检测结果中每个样本3次准确性试验结果均一致，表明实施例1的试剂盒的检测体系具有良好的准确性。18个质控品批间稳定性评价检测结果中每个样本3次检测结果均一致，表明本试剂盒的检测体系具有良好的稳定性。
表11：
表12：
实施例4试剂盒灵敏度样本评价
一、实验方法
1、样本选择
样本来源及类型：选取试剂盒的阴性质控品和阳性质控品，用灭菌双蒸水将阴阳质控品稀释5个梯度(1ng/uL、2.5ng/uL、5ng/uL、7.5ng/uL、10ng/uL)备用。
2、样本检测
按照实施例1的方法使用实施例1的试剂盒检测以上样本。
二、实验结果
表13：
结果如表13所示，结果显示，按照实施例1的方法使用实施例1的试剂盒检测阴性质控品、阳性质控品的检测结果对应的基因型结果一致，浓度在1ng/uL时均可检出相应的基因型别，因此实施例1的试剂盒准确性良好，灵敏度可达1ng/uL。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。
序列表
<110> 广州市达瑞生物技术股份有限公司
中国医学科学院北京协和医院
<120> 一种MALDI-TOF质谱平台检测麻醉药物和镇痛药物用药相关的基因位点的试剂盒
<160> 114
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
acgttggatg tccttggcgg acttcttttg 30
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
acgttggatg agtcccagag tgtacgtaga 30
<210> 3
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
acgttggatg agtcccagag tgtacgtaga 30
<210> 4
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
acgttggatg tccttggcgg acttcttttg 30
<210> 5
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
acgttggatg agtcccagag tgtacgtaga 30
<210> 6
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
acgttggatg tccttggcgg acttcttttg 30
<210> 7
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
acgttggatg gactaccacc gagtactctg 30
<210> 8
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
acgttggatg ttcgtgagtc cgaaggccta 30
<210> 9
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
acgttggatg gactaccacc gagtactctg 30
<210> 10
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
acgttggatg ttcgtgagtc cgaaggccta 30
<210> 11
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
acgttggatg accttctgtg gtactcggac 30
<210> 12
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
acgttggatg acgagaccta gtactccaag 30
<210> 13
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
acgttggatg acgagaccta gtactccaag 30
<210> 14
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
acgttggatg accttctgtg gtactcggac 30
<210> 15
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
acgttggatg tatcctctcc gaacgaccac 30
<210> 16
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
acgttggatg tcctctgtga ctgttcctac 30
<210> 17
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
acgttggatg ggataaccta gactgtggag 30
<210> 18
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
acgttggatg tggtcggtca ggttcaaaca 30
<210> 19
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
acgttggatg tggtcggtca ggttcaaaca 30
<210> 20
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
acgttggatg ggataaccta gactgtggag 30
<210> 21
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
acgttggatg gctcaggacc tttctctaac 30
<210> 22
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
acgttggatg gggcccaaga ggatggtct 29
<210> 23
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
acgttggatg cacatgtcca tctgctggtg 30
<210> 24
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
acgttggatg atctcggtgt ccctgacttg 30
<210> 25
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
acgttggatg tctcacgagg agcacacag 29
<210> 26
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
acgttggatg acaacatcac agggttctcc 30
<210> 27
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
acgttggatg tctggacgcg caacgatcac 30
<210> 28
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
acgttggatg acgagttcct cgtcgagttc 30
<210> 29
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
acgttggatg tgtctggacg cgcaacgat 29
<210> 30
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
acgttggatg atggcacgag ttcctcgtc 29
<210> 31
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
acgttggatg gtgtacgacg tgcttcgtgt 30
<210> 32
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
acgttggatg acatcctctt cgacctacac 30
<210> 33
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
acgttggatg gtgtacgacg tgcttcgtgt 30
<210> 34
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
acgttggatg acatcctctt cgacctacac 30
<210> 35
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
acgttggatg accttcaggt gtacgtcgtc 30
<210> 36
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
acgttggatg acgaggacca cctggactac 30
<210> 37
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
acgttggatg tacgttctgt cctcggtgta 30
<210> 38
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
acgttggatg acagtgtcca gtgacgtacc 30
<210> 39
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
acgttggatg cgttattaaa agggtgatag 30
<210> 40
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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acgttggatg aggtagctaa gaaccacaag 30
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<211> 30
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acgttggatg tccctgtgac ggtgggtgat 30
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acgttggatg ttactcgtcg tttcctcggc 30
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
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acgttggatg cgacatgaca catcaatctc 30
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acgttggatg tgtcactgag gggcatgaac 30
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<211> 30
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acgttggatg acatcctctt cgacctacac 30
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acgttggatg caccacatcc actccaagac 30
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acgttggatg aagaagctct cacggagcct 30
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acgttggatg tcgtgcacgt cgttcttcag 30
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acgttggatg tctacagtcg taggaagcac 30
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acgttggatg tcgtgcacgt cgttcttcag 30
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acgttggatg tctacagtcg taggaagcac 30
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<211> 30
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acgttggatg atgaggggtc gattaggttc 30
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acgttggatg actactacgg gtgttccagg 30
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acgttggatg actactacgg gtgttccagg 30
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<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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acgttggatg atgaggggtc gattaggttc 30
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gtggaaggag aaggt 15
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<211> 15
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gcgagcgacg agtag 15
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cggtaaccac gacac 15
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tggacaaagg gtaaca 16
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cacgacacct agtacg 16
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ctgtctcctg tcctac 16
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ctacgggagg tgtaggg 17
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gggatggatc ctcaagt 17
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accacctaaa gcgaccg 17
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taggaaacga cgggagtg 18
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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taccagtcgt tcgaccta 18
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ttgcggttac accaccac 18
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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agacttcctc ttttccag 18
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cccctcgcct cctaccgc 18
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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caacagggtg aatctaccg 19
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gcccgaagac cgccaccag 19
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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aataccctgc gtcaccacc 19
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gcgagaacaa catcttgaac 20
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tctcccggag cctcctgtag 20
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ttcaggagct agagcagggg t 21
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tgttaccacg agaaggacct g 21
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gggtcgatgg acctgaagga cg 22
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ttcccgtatg acatgtgtaa cc 22
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 82
ggggggcgac ccgtacgtgc tct 23
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gtcattattc tagaaccaac ctc 23
<210> 84
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 84
ggggtcccac tccgggacgc ctag 24
<210> 85
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 85
ccaaacacat taccacaccg acat 24
<210> 86
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 86
agggccgccc cactcccacc gagtc 25
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<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 87
taggcgcggt aggag 15
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<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 88
ctcgtcgagt tcgag 15
<210> 89
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 89
aggtaggacg ggggtc 16
<210> 90
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 90
cacggagccg gtctag 16
<210> 91
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 91
cggacctttt gaaact 16
<210> 92
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 92
actcccgaag ccgttg 16
<210> 93
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 93
aaaggtgagg gtaagac 17
<210> 94
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 94
ggcacgagtc tggggag 17
<210> 95
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 95
ggttcccgtg ttccctc 17
<210> 96
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 96
tactacagta ggggttgc 18
<210> 97
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 97
cctacgagaa ggacctgg 18
<210> 98
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 98
acgtgctact cgtcgctc 18
<210> 99
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 99
gaccatctag aacttccc 18
<210> 100
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 100
accacccctc ttccagtt 18
<210> 101
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 101
tacgtagaga ccacgtgtc 19
<210> 102
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 102
ggtagtacag gaagatacgg 20
<210> 103
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 103
tcattaaaca atacccaagg 20
<210> 104
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 104
cctccaacga tgctaacggt 20
<210> 105
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 105
aggatgaact agctggacga g 21
<210> 106
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 106
gggtctgaac agatgatact c 21
<210> 107
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 107
ataccgttcc cactccggga c 21
<210> 108
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 108
gggggggcgt ggtggtgtaa cc 22
<210> 109
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 109
ttttgcgacc cgacgtgcga tg 22
<210> 110
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 110
ccccggggga ctctagttca tg 22
<210> 111
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 111
tctggtggtg taaccgcaag agg 23
<210> 112
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 112
acctcttctc ccgtgtcaac gat 23
<210> 113
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 113
ctgcgaagag attaggcacc gtta 24
<210> 114
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 114
tcaggaagga catggacccg acca 24
Claims (10)
1.一组MALDI-TOF质谱平台检测麻醉药物和/或镇痛药物用药相关的基因位点的多重PCR扩增引物，其特征在于，所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：1～58所示。
2.一组MALDI-TOF质谱平台检测麻醉药物和/或镇痛药物用药相关的基因位点的单碱基延伸引物，其特征在于，包括单碱基延伸引物组1和单碱基延伸引物组2；其中，单碱基延伸引物组1的苷酸序列如SEQ ID NO：59～86所示，单碱基延伸引物组2的苷酸序列如SEQ IDNO：87～114所示。
3.权利要求1所述的多重PCR扩增引物中的一条或几条，和/或权利要求2所述的单碱基延伸引物中的一条或几条在制备检测麻醉药物和/或镇痛药物用药相关的基因位点的基因型的试剂盒中的应用。
4.一种检测麻醉药物和/或镇痛药物用药相关的基因位点的基因型的试剂盒，其特征在于，含有权利要求1所述的多重PCR扩增引物中的一条或几条，和/或权利要求2所述的单碱基延伸引物中的一条或几条。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，含有权利要求1所述的多重PCR扩增引物和权利要求2所述的单碱基延伸引物。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，还含有多重PCR反应试剂、去dNTPs反应试剂、单碱基延伸反应试剂、脱盐树脂、和质谱芯片中的一种或几种。
7.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，多重PCR反应试剂包括多重PCR反应混合液和多重PCR酶混合液。
8.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，去dNTPs反应试剂包括SAP反应混合液和SAP酶混合液。
9.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，单碱基延伸反应试剂包括单碱基延伸反应混合液和单碱基延伸酶混合液。
10.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有单碱基延伸引物混合液1和单碱基延伸引物混合液2，其中，单碱基延伸引物混合液1含有核苷酸序列如SEQ IDNO：59～86所示单碱基延伸引物，单碱基延伸引物混合液2含有核苷酸序列如SEQ ID NO：87～58所示单碱基延伸引物；
单碱基延伸引物混合液1中，核苷酸序列如SEQ ID NO:59所示的单核苷酸延伸引物的浓度为10.90pmol/μl、核苷酸序列如SEQ ID NO:60所示的单核苷酸延伸引物的浓度为11.25pmol/μl、核苷酸序列如SEQ ID NO:61所示的单核苷酸延伸引物的浓度为11.82pmol/μl、核苷酸序列如SEQ ID NO:62所示的单核苷酸延伸引物的浓度为12.56pmol/μl、核苷酸序列如SEQ ID NO:63所示的单核苷酸延伸引物的浓度为13.07pmol/μl、核苷酸序列如SEQID NO:64所示的单核苷酸延伸引物的浓度为13.37pmol/μl、核苷酸序列如SEQ ID NO:65所示的单核苷酸延伸引物的浓度为13.55pmol/μl、核苷酸序列如SEQ ID NO:66所示的单核苷酸延伸引物的浓度为13.84pmol/μl、核苷酸序列如SEQ ID NO:67所示的单核苷酸延伸引物的浓度为14.28pmol/μl、核苷酸序列如SEQ ID NO:68所示的单核苷酸延伸引物的浓度为14.69pmol/μl、核苷酸序列如SEQ ID NO:69所示的单核苷酸延伸引物的浓度为15.40pmol/μl、核苷酸序列如SEQ ID NO:70所示的单核苷酸延伸引物的浓度为15.45pmol/μl、核苷酸序列如SEQ ID NO:71所示的单核苷酸延伸引物的浓度为15.51pmol/μl、核苷酸序列如SEQID NO:72所示的单核苷酸延伸引物的浓度为15.90pmol/μl、核苷酸序列如SEQ ID NO:73所示的单核苷酸延伸引物的浓度为16.18pmol/μl、核苷酸序列如SEQ ID NO:74所示的单核苷酸延伸引物的浓度为16.42pmol/μl、核苷酸序列如SEQ ID NO:75所示的单核苷酸延伸引物的浓度为16.65pmol/μl、核苷酸序列如SEQ ID NO:76所示的单核苷酸延伸引物的浓度为17.20pmol/μl、核苷酸序列如SEQ ID NO:77所示的单核苷酸延伸引物的浓度为17.44pmol/μl、核苷酸序列如SEQ ID NO:78所示的单核苷酸延伸引物的浓度为17.78pmol/μl、核苷酸序列如SEQ ID NO:79所示的单核苷酸延伸引物的浓度为18.07pmol/μl、核苷酸序列如SEQID NO:80所示的单核苷酸延伸引物的浓度为18.69pmol/μl、核苷酸序列如SEQ ID NO:81所示的单核苷酸延伸引物的浓度为19.19pmol/μl、核苷酸序列如SEQ ID NO:82所示的单核苷酸延伸引物的浓度为19.78pmol/μl、核苷酸序列如SEQ ID NO:83所示的单核苷酸延伸引物的浓度为20.18pmol/μl、核苷酸序列如SEQ ID NO:84所示的单核苷酸延伸引物的浓度为20.74pmol/μl、核苷酸序列如SEQ ID NO:85所示的单核苷酸延伸引物的浓度为21.12pmol/μl、核苷酸序列如SEQ ID NO:86所示的单核苷酸延伸引物的浓度为21.86pmol/μl。
单碱基延伸引物混合液2中，核苷酸序列如SEQ ID NO:87所示的单核苷酸延伸引物的浓度为11.11pmol/μl、核苷酸序列如SEQ ID NO:88所示的单核苷酸延伸引物的浓度为11.59pmol/μl、核苷酸序列如SEQ ID NO:89所示的单核苷酸延伸引物的浓度为12.32pmol/μl、核苷酸序列如SEQ ID NO:90所示的单核苷酸延伸引物的浓度为12.80pmol/μl、核苷酸序列如SEQ ID NO:91所示的单核苷酸延伸引物的浓度为12.98pmol/μl、核苷酸序列如SEQID NO:92所示的单核苷酸延伸引物的浓度为13.05pmol/μl、核苷酸序列如SEQ ID NO:93所示的单核苷酸延伸引物的浓度为13.53pmol/μl、核苷酸序列如SEQ ID NO:94所示的单核苷酸延伸引物的浓度为13.61pmol/μl、核苷酸序列如SEQ ID NO:95所示的单核苷酸延伸引物的浓度为14.39pmol/μl、核苷酸序列如SEQ ID NO:96所示的单核苷酸延伸引物的浓度为14.98pmol/μl、核苷酸序列如SEQ ID NO:97所示的单核苷酸延伸引物的浓度为15.06pmol/μl、核苷酸序列如SEQ ID NO:98所示的单核苷酸延伸引物的浓度为15.43pmol/μl、核苷酸序列如SEQ ID NO:99所示的单核苷酸延伸引物的浓度为15.50pmol/μl、核苷酸序列如SEQID NO:100所示的单核苷酸延伸引物的浓度为15.75pmol/μl、核苷酸序列如SEQ ID NO:101所示的单核苷酸延伸引物的浓度为16.21pmol/μl、核苷酸序列如SEQ ID NO:102所示的单核苷酸延伸引物的浓度为16.77pmol/μl、核苷酸序列如SEQ ID NO:103所示的单核苷酸延伸引物的浓度为17.32pmol/μl、核苷酸序列如SEQ ID NO:104所示的单核苷酸延伸引物的浓度为17.39pmol/μl、核苷酸序列如SEQ ID NO:105所示的单核苷酸延伸引物的浓度为17.80pmol/μl、核苷酸序列如SEQ ID NO:106所示的单核苷酸延伸引物的浓度为18.02pmol/μl、核苷酸序列如SEQ ID NO:107所示的单核苷酸延伸引物的浓度为18.45pmol/μl、核苷酸序列如SEQ ID NO:108所示的单核苷酸延伸引物的浓度为18.51pmol/μl、核苷酸序列如SEQ ID NO:109所示的单核苷酸延伸引物的浓度为19.04pmol/μl、核苷酸序列如SEQ ID NO:110所示的单核苷酸延伸引物的浓度为19.08pmol/μl、核苷酸序列如SEQ ID NO:111所示的单核苷酸延伸引物的浓度为19.64pmol/μl、核苷酸序列如SEQ ID NO:112所示的单核苷酸延伸引物的浓度为20.27pmol/μl、核苷酸序列如SEQ ID NO:113所示的单核苷酸延伸引物的浓度为20.61pmol/μl、核苷酸序列如SEQ ID NO:114所示的单核苷酸延伸引物的浓度为20.67pmol/μl；
所述试剂盒含有多重PCR反应引物混合液中核苷酸序列如SEQ ID NO：1～58所示多重PCR扩增引物均为0.5pmol/μl。
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Applications Claiming Priority (1)
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