CN106544415A - 一种检测cyp2c19*3多态位点基因型的方法及试剂盒 - Google Patents

一种检测cyp2c19*3多态位点基因型的方法及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种检测CYP2C19*3多态位点基因型的方法及试剂盒。本发明在检测CYP2C19*3多态位点基因型的过程中引入了特有的“内部质控”机制，即在PCR产物中引入内对照酶切位点，可根据酶切图谱识别酶切不完全的情形，并且在酶切不完全的情况下依旧可以准确判断基因型，极大地提高了检测结果的准确性。

Description

一种检测CYP2C19*3多态位点基因型的方法及试剂盒
技术领域
本发明属于分子检测领域，具体涉及一种检测CYP2C19*3多态位点基因型的方法及试剂盒。
背景技术
CYP2C19是细胞色素P450(CytochromeP450,CYP)酶系的重要一员，是机体重要的药物代谢酶，最先由Wrighton等于1993年从人类肝脏中分离获得，其cDNA全长1940bp，其中编码区为1473bp，编码490个氨基酸残基。CYP2C19参与代谢的药物谱较为广泛，有质子泵抑制剂(奥美拉唑，兰索拉唑，泮托拉唑)、抗抑郁药(氟西汀，西酞普兰，艾司西酞普兰，阿米替林，氯米帕明，丙咪嗪，吗氯贝胺，曲米帕明，依替唑仑)、抗癫痫药(安定，氯巴占，苯妥英钠，苯巴比妥，丙戊酸)、血小板聚集抑制剂(氯吡格雷)、抗疟疾药(氯胍)、抗真菌药(伏立康唑)以及一些抗癌药物(环磷酰胺)等。
CYP2C19具有显著的个体差异及种族差异，原因在于其编码基因存在多态性，目前已发现30余种等位基因(http://www.cypalleles.ki.se/cyp2c19.htm)。通过CYP2C19代谢的药物随患者基因型不同，其疗效和副作用也有明显不同。在中国人群中，CYP2C19等位基因主要为*1、*2、*3。CYP2C19*1为野生型等位基因，编码的酶具有正常活性，CYP2C19*2、*3皆为突变型等位基因,编码的酶缺乏活性。其中CYP2C19*3系CYP2C19基因的外显子4中对应于开放阅读框(参考GenBank中登录号为NM_000769.1的序列)第636位的碱基发生G→A突变(dbSNP中编号为rs4986893)，原本编码色氨酸的导致蛋白质的合成提前终止，使CYP2C19酶丧失活性。
CYP2C19*3突变等位基因在亚洲人群的频率为5％～10％，检测患者是否携带CYP2C19*3突变等位基因，可以帮助医生正确选择药物并合理调整药物剂量，提高药物使用有效性，降低毒副作用。目前，检测CYP2C19*3位点基因型的方法有PCR-PFLP、Sanger测序、焦磷酸测序、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOFMS)、基因芯片、荧光定量PCR、高分辨率熔解曲线(high-resolution melting，HRM)等，除PCR-RFLP法外，其他方法均需昂贵设备，操作相对繁琐，检测周期长，检测成本高，部分方法的实验条件优化较为复杂、结果不稳定，临床应用受限。相反，用PCR-RFLP法进行基因分型具有以下优点：操作方法以及检测设备简便，成本低，分型周期短，在小型的普通分子生物学实验室即可开展，尤其适用于临床实验室。但PCR-RFLP涉及酶切，传统的不带内对照酶切位点的实验设计在酶切不完全的情况下将难以避免结果的误判。以文献报道的下述引物对为例：
上游引物F：5'-AAATTGTTTCCAATCATTTAGCT-3'(SEQ ID NO.1)；
下游引物R：5'-ACTTCAGGGCTTGGTCAATA-3'(SEQ ID NO.2).
文献来源：
(1)周家彬.广西壮汉族CYP2C19等位基因多态性研究[D].广西:广西医科大学,2013.
(2)陈东燕,吴子刚,林煜光,等.CYP2C19基因多态性对埃索美拉唑三联疗法根除幽门螺杆菌疗效的影响[J].国际消化病杂志，2011，31(3)：177-180.
(3)Barbara GS,Joanna W,Teresa S,et al.Effect of CYP2C19 andMDR1polymorphisms on cure rate in patients with acid related disorders withHelicobacter.pylori infection[J].Eur J Clin Pharmacol,2005,61(5-6):375-379.
(4)Chaudhry AS,Kochhar R,Kohli KK，et al.Importance of CYP2C19 geneticpolymorphism in the eradicationofHelicobacter pylori in north Indians[J].Indian J Med Res,2009,130(4):437-43.
上述引物对靶向扩增的PCR产物为271bp，使用限制性核酸内切酶BamHI(识别位点为GGATCC)酶切PCR产物进行基因分型，3种基因型的判断依据为：
野生型纯合子GG：175bp、96bp
杂合子GA：271bp、175bp、96bp
突变型纯合子AA：271bp
假如在实验中发生酶切不完全即残留PCR产物(长度为271bp)的情况，GG基因型的样品将呈现2711bp、175bp、96bp的条带，很可能会被当作GA型对待，如表1所示。
表1不带内对照酶切位点的实验设计可能出现的基因型误判
如图2所示：其中1号样品为突变型纯合子AA，3、4、6号样品为杂合子GA，2号样品在图中可判为野生型纯合子GG，但依稀可见它还残留有271bp的条带，如果该条带浓度再大些，将与3号样品的图谱近似，从而被误判成杂合子GA。
发明内容
为了解决现有技术中所存在的不足，本发明的目的旨在提供一种简便、快捷、准确性高的检测CYP2C19*3多态位点基因型的方法及试剂盒。
本发明所采取的技术方案是：
一种检测CYP2C19*3多态位点(c.G636A，rs4986893)基因型的方法，包括如下步骤：
(1)提取待检样品基因组DNA；
(2)针对特定的限制性内切酶，设计PCR引物对，所述PCR引物对扩增得到的产物在CYP2C19*3多态位点之外引进一个内对照酶切位点，该内对照酶切位点能够被所述的限制性内切酶识别、切割；
(3)利用步骤(2)所设计的PCR引物对对待检样品基因组DNA进行PCR扩增；
(4)用所述特定的限制性内切酶对PCR产物进行酶切；
(5)根据酶切产物的电泳图谱确定CYP2C19*3位点的基因型。
所述内对照酶切位点与多态位点之间的距离以其酶切产物能够被区分为准。
所述内对照酶切位点的碱基序列符合下列序列模式中的任何一种：GANTC(其中N＝A、T、C、G四种碱基中的任何一种)、GAATTC、CCWGG(W＝碱基A或T)、CCNGG(其中N＝A、T、C、G四种碱基中的任何一种)、CCNNGG(其中N＝A、T、C、G四种碱基中的任何一种)。
作为优选的，用于识别GANTC序列模式的限制性内切酶为HinfI，用于识别GAATTC序列模式的限制性内切酶为EcoRI，用于识别CCWGG序列模式的限制性内切酶为MvaI及其同裂酶AjnI、BseBI、Bst2UI、BstNI、BstOI、Psp6I、PspGI、EcoR II、BciT130I中的任一种，用于识别CCNGG序列模式的限制性内切酶为Bme1390I及其同裂酶ScrFI、BmrFI、BssKI、BstSCI、MspR9I、StyD4I中的任一种，用于识别CCNNGG序列模式的限制性内切酶为BseDI及其同裂酶BsaJI、BssECI中的任一种。
作为优选的，所述PCR引物对中的正向引物位于CYP2C19基因的第21948～22947位碱基之间，反向引物位于CYP2C19基因第22949～23948位碱基之间，所述CYP2C19基因在GenBank上的登录号为NG_008384.2。
作为优选的，所述PCR引物对为下列任一组：
引物对1
F1：5′-CTCTCTACTGGTTCAATACATGGTTC-3′(SEQ ID NO.3)，
R1：5′-GCCTGATCTATATTGGGATATTC-3′(SEQ ID NO.4)；
引物对2
F2：5′-AGCTTTGAAATCCCCAACTATTCTCACC-3′(SEQ ID NO.5)，
R2：5′-GGAGCTAATGGGCTTAGAAGCCTGAT-3′(SEQ ID NO.6)；
引物对3
F3：5′-GTGCTCCCTGCAATGTGATCTG-3′(SEQ ID NO.7)，
R3：5′-GCTTCTGTGGTTCCAAATATTCTCTG-3′(SEQ ID NO.8)；
引物对4
F4：5′-CAGGAAACAGCTATGACCAGCTAGGCTGTAATTGTTAATTCGA-3′(SEQ ID NO.9)，
R4：5′-ATGGACTATCATATGCTTACCGTACAAAAAACTTGGCCTTACCTGAAT-3′(SEQ IDNO.10)。
上述用于检测CYP2C19*3多态位点(c.G636A，rs4986893)基因型的方法不用于疾病的诊断。
一种用于检测CYP2C19*3多态位点基因型的引物对，其扩增得到的产物在CYP2C19*3多态位点之外引进一个内对照酶切位点，该内对照酶切位点能够被特定的限制性内切酶识别、切割；所述内对照酶切位点与多态位点之间的距离以其酶切产物能够被区分为准。
所述内对照酶切位点的序列符合下列序列模式中的任何一种：GANTC(其中N＝A、T、C、G四种碱基中的任何一种)、GAATTC、CCWGG(W＝碱基A或T)、CCNGG(其中N＝A、T、C、G四种碱基中的任何一种)、CCNNGG(其中N＝A、T、C、G四种碱基中的任何一种)。
作为优选的，用于识别GANTC序列模式的限制性内切酶为HinfI，用于识别GAATTC序列模式的限制性内切酶为EcoRI，用于识别CCWGG序列模式的限制性内切酶为MvaI及其同裂酶AjnI、BseBI、Bst2UI、BstNI、BstOI、Psp6I、PspGI、EcoR II、BciT130I中的任一种，用于识别CCNGG序列模式的限制性内切酶为Bme1390I及其同裂酶ScrFI、BmrFI、BssKI、BstSCI、MspR9I、StyD4I中的任一种，用于识别CCNNGG序列模式的限制性内切酶为BseDI及其同裂酶BsaJI、BssECI中的任一种。
作为优选的，所述引物对的正向引物位于GenBank中CYP2C19基因的第21948～22947位碱基之间，反向引物位于CYP2C19基因第22949～23948位碱基之间，所述CYP2C19基因在GenBank上的登录号为NG_008384.2。
作为优选的，所述PCR引物对为下列任一组：
引物对1
F1：5′-CTCTCTACTGGTTCAATACATGGTTC-3′(SEQ ID NO.3)，
R1：5′-GCCTGATCTATATTGGGATATTC-3′(SEQ ID NO.4)；
引物对2
F2：5′-AGCTTTGAAATCCCCAACTATTCTCACC-3′(SEQ ID NO.5)，
R2：5′-GGAGCTAATGGGCTTAGAAGCCTGAT-3′(SEQ ID NO.6)；
引物对3
F3：5′-GTGCTCCCTGCAATGTGATCTG-3′(SEQ ID NO.7)，
R3：5′-GCTTCTGTGGTTCCAAATATTCTCTG-3′(SEQ ID NO.8)；
引物对4
F4：5′-CAGGAAACAGCTATGACCAGCTAGGCTGTAATTGTTAATTCGA-3′(SEQ ID NO.9)，
R4：5′-ATGGACTATCATATGCTTACCGTACAAAAAACTTGGCCTTACCTGAAT-3′(SEQ IDNO.10)。
一种用于检测CYP2C19*3多态位点基因型的试剂盒，其包括以上任一项所述的用于检测CYP2C19*3多态位点基因型的引物对及限制性内切酶，所述限制性内切酶的识别序列符合下列序列模式中的任何一种。相应的序列模式为GANTC(其中N＝A、T、C、G四种碱基中的任何一种)、GAATTC、CCWGG(W＝碱基A或T)、CCNGG(其中N＝A、T、C、G四种碱基中的任何一种)、CCNNGG(其中N＝A、T、C、G四种碱基中的任何一种)。
本发明的有益效果是：
本发明在检测CYP2C19*3多态位点基因型的过程中引入了特有的“内部质控”机制，即在PCR产物中引入内对照酶切位点，可根据酶切图谱识别酶切不完全的情形，并且在酶切不完全的情况下依旧可以准确判断基因型，极大地提高了检测结果的准确性。如图3、4、5、6、7、8所示，由于有内对照酶切位点，只要发生切割，切出来的片段必然小于原有的PCR产物，当PCR产物酶切不完全时，即PCR产物有残留的情况下，也不会影响基因型的判断，因为用以判断基因型的条带均应小于PCR产物。
附图说明
图1为dbSNP数据库中CYP2C19*3多态位点(rs4986893)的序列数据。
图2为现有文献引物对CYP2C19*3位点的基因分型图谱，引自：周家彬.广西壮汉族CYP2C19等位基因多态性研究[D].广西:广西医科大学,2013.【详见论文第15页图2-3】。
图3为跨越CYP2C19*3多态位点的PCR产物中含有一个位于多态位点上游的HinfI内对照酶切位点之示意图，F1、R1及F2、R2引物对符合这种设计。
图4为跨越CYP2C19*3多态位点的PCR产物中含有一个位于多态位点下游的HinfI内对照酶切位点之示意图，F3、R3引物对符合这种设计。
图5为CYP2C19*3多态位点基因分型引物F1、R1，F2、R2，F3、R3与模板对应关系图(模板序列参考http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NG_008384.2，其中SNP位于第22948位)。
图6为跨越CYP2C19*3多态位点的PCR产物中含EcoRI内对照酶切位点示意图，F4、R4引物对符合这种设计。在该设计中，R4 3′端倒数第3位碱基A不与模板互补配对，使得原序列gRatcc在PCR后变为gRattc，以达到用EcoRI甄别多态位点的目的。PCR产物在多态位点的上游含有固有的EcoRI识别序列gaattc。另R4的5′端附加了一段与模板无关的序列(ATGGACTATCATATGCTTACCGTA，来源于通用测序引物U6-F)，旨在增加多态位点被酶切开和未被酶切开的片段之间的长度差异，提高电泳的分辨率。而F4的5′端也附加了一段与模板无关的序列(CAGGAAACAGCTATGACC，来源于通用测序引物M13R)，旨在与R4保持较为接近的退火温度，以提高PCR效率。
图7为跨越CYP2C19*3多态位点的PCR产物中含MvaI【同裂酶有AjnI、BseBI、Bst2UI、BstNI、BstOI、Psp6I、PspGI、EcoR II、BciT130I等】及Bme1390I【同裂酶有ScrFI、BmrFI、BssKI、BstSCI、MspR9I、StyD4I等】之内对照酶切位点示意图，前述的F4、R4引物对同时还符合这种设计。
图8为跨越CYP2C19*3多态位点的PCR产物中含BseDI【同裂酶有BsaJI、BssECI等】之内对照酶切位点示意图，前述的F4、R4引物对同时还符合这种设计。
图9为引物对1扩增的PCR产物之琼脂糖凝胶电泳图【M：DNA分子量标记DL2501，上海捷瑞生物工程有限公司；1-7：PCR产物(809bp)】。
图10为引物对1扩增的PCR产物经HinfI酶切用于鉴定CYP2C19*3位点基因型的电泳图谱【所有样品均酶切完全。M：DNA分子量标记DL2501，上海捷瑞生物工程有限公司；P：PCR产物(809bp)；1、2、3、4、5、7：野生型纯合子GG；6：突变型纯合子AA；8：杂合子GA】。
图11为引物对1扩增的PCR产物经HinfI酶切用于鉴定CYP2C19*3位点基因型的电泳图谱【个别样品酶切不完全，如5号样品有PCR产物残留；M：DNA分子量标记Low ladder，东盛生物科技有限公司；P：PCR产物(809bp)；1、2、4、5：野生型纯合子GG；3：杂合子GA】。
图12为引物对2扩增的PCR产物经HinfI酶切用于鉴定CYP2C19*3位点基因型的电泳图谱【所有样品均酶切完全。M：DNA分子量标记DS2000，东盛生物科技有限公司；P：PCR产物(776bp)；1：野生型纯合子GG；2：杂合子GA；3：突变型纯合子AA】
图13为引物对3扩增的PCR产物经HinfI酶切用于鉴定CYP2C19*3位点基因型的电泳图谱【所有样品均有少量PCR产物残留。M：DNA分子量标记Marker1，东盛生物科技有限公司；1：PCR产物(581bp)；1、2、3、4、6、8、9：野生型纯合子GG；5、7：杂合子GA】。
图14为引物对4扩增的PCR产物经EcoRI酶切用于鉴定CYP2C19*3位点基因型的电泳图谱【样品有微量PCR产物残留。M：DNA分子量标记DNA MarkerⅠ，北京庄盟国际生物基因科技有限公司；P：PCR产物(422bp)；1：突变型纯合子AA；2：杂合子GA；3：野生型纯合子GG】。
图15为引物对4扩增的PCR产物经EcoRI酶切用于鉴定CYP2C19*3位点基因型的电泳图谱【所有均样品有少量PCR产物残留。M：DNA分子量标记Marker1，东盛生物科技有限公司；P：PCR产物(422bp)；1、2、3、4、5、6、7、9：野生型纯合子GG；8：杂合子GA】。
图16为引物对4扩增的PCR产物经MvaI酶切用于鉴定CYP2C19*3位点基因型的电泳图谱【所有样品均酶切完全。M：DNA分子量标记DNA MarkerⅠ，北京庄盟国际生物基因科技有限公司；P：PCR产物(422bp)；1：突变型纯合子AA；2：杂合子GA；3：野生型纯合子GG】。
图17为CYP2C19*3位点3种基因型样品之PCR产物(引物对1扩增)测序峰图，从上至下依次为GG、GA、AA基因型样品，图中箭头所指为多态位点碱基，加框的序列GATTC为PCR产物中成功引入的内对照酶切位点序列(HinfI识别序列)。
图18为CYP2C19*3位点3种基因型样品之PCR产物(引物对2扩增)测序峰图，从上至下依次为GG、GA、AA基因型样品，图中箭头所指为多态位点碱基，加框的序列GATTC为PCR产物中成功引入的内对照酶切位点序列(HinfI识别序列)。
图19为CYP2C19*3位点3种基因型样品之PCR产物(引物对3扩增)测序峰图，从上至下依次为GG、GA、AA基因型样品，图中箭头所指为多态位点碱基，加框的序列GAGTC为PCR产物中成功引入的内对照酶切位点序列(HinfI识别序列)。
图20为CYP2C19*3位点3种基因型样品之PCR产物(引物对4扩增)测序峰图，从上至下依次为GG、GA、AA基因型样品，图中箭头所指为多态位点碱基，加框的序列GAATTC为PCR产物中成功引入的内对照酶切位点序列(EcoRI识别序列)。用椭圆圈圈起来的碱基T由错配引物引入，以便使用EcoRI来甄别多态位点。
图21为CYP2C19*3位点3种基因型样品之PCR产物(引物对4扩增)测序峰图，从上至下依次为GG、GA、AA基因型样品，图中箭头所指为多态位点碱基，加框的序列CCTGG为PCR产物中成功引入的内对照酶切位点序列(可为MvaI、Bme1390I及它们的同裂酶识别)。加下划线的碱基T由错配引物引入，以便消除多态位点附近一个冗余的MvaI、Bme1390I及它们的同裂酶识别序列CCAGG。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。
实施例1
本实施例针对限制性内切酶HinfI设计3对用于检测CYP2C19*3多态位点基因型的引物对，并建立了CYP2C19*3多态位点基因型的检测方法，具体如下：
1、基因组DNA提取
采用口腔拭子基因组DNA提取试剂盒或血液基因组DNA提取试剂盒，按说明书的操作步骤提取基因组DNA。DNA来源不限于此，任何体细胞来源的DNA均可。
2、引物设计
调取CYP2C19*3多态位点前后各1000bp的序列，分析其与CYP2C亚家族其它基因即CYP2C9、CYP2C18、CYP2C8的同源性后，利用Primer Premier 5.0软件设计针对该位点的特异性分型引物。其中，内对照酶切位点分别为多态位点上游的GATTC或下游的GAGTC，见图3、4、5。
根据上述引物设计方案得到以下3组分型引物对：
引物对1
F1：5′-CTCTCTACTGGTTCAATACATGGTTC-3′(SEQ ID NO.3)，
R1：5′-GCCTGATCTATATTGGGATATTC-3′(SEQ ID NO.4)；
PCR产物的大小为809bp。
酶切完全时：
CYP2C19*3多态位点的基因型为GG时，酶切产物的大小分别为679.5bp、129.5bp；
CYP2C19*3多态位点的基因型为AA时，酶切产物的大小分别为472bp、207.5bp、129.5bp；
CYP2C19*3多态位点的基因型为GA时，酶切产物的大小分别为679.5bp、472bp、207.5bp、129.5bp。
酶切不完全时，将会残留和PCR产物一样大小的809bp的片段，但它不会影响基因型的判断，即实验人员可根据679.5bp、472bp、207.5bp、129.5bp片段的组合情况来分辨基因型，实际上仅凭679.5bp、472bp二种特征条带的有无就可甄别3种基因型。
引物对2
F2：5′-AGCTTTGAAATCCCCAACTATTCTCACC-3′(SEQ ID NO.5)，
R2：5′-GGAGCTAATGGGCTTAGAAGCCTGAT-3′(SEQ ID NO.6)；
PCR产物的大小为776bp。
酶切完全时：
CYP2C19*3多态位点的基因型为GG时，酶切产物的大小分别为698.5bp、77.5bp；
CYP2C19*3多态位点的基因型为AA时，酶切产物的大小分别为472bp、226.5bp、77.5bp；
CYP2C19*3多态位点的基因型为GA时，酶切产物的大小分别为698.5bp、472bp、226.5bp、77.5bp。
酶切不完全时，将会残留和PCR产物一样大小的776bp的片段，但它不会影响基因型的判断，即实验人员可根据698.5bp、472bp、226.5bp、77.5bp片段的组合情况来分辨基因型，实际上仅凭698.5bp、472bp二种特征条带的有无就可甄别3种基因型。
引物对3
F3：5′-GTGCTCCCTGCAATGTGATCTG-3′(SEQ ID NO.7)，
R3：5′-GCTTCTGTGGTTCCAAATATTCTCTG-3′(SEQ ID NO.8)。
PCR产物的大小为581bp。
酶切完全时：
CYP2C19*3多态位点的基因型为GG时，酶切产物的大小分别为458.5bp、122.5bp；
CYP2C19*3多态位点的基因型为AA时，酶切产物的大小分别为336bp、122.5bp；
CYP2C19*3多态位点的基因型为GA时，酶切产物的大小分别为458.5bp、336bp、122.5bp。
酶切不完全时，将会残留和PCR产物一样大小的581bp的片段，但它不会影响基因型的判断，即实验人员可根据458.5bp、336bp、122.5bp片段的组合情况来分辨基因型，实际上仅凭458.5bp、336bp二种特征条带的有无就可甄别3种基因型。
3、目的片段的PCR扩增及鉴定
PCR反应体系：
PCR反应条件：
注：延伸时间根据PCR产物的长度来设定，1min/1kb。
PCR产物用1.5％的琼脂糖凝胶电泳鉴定。
4、PCR产物的酶切分型
本实施例所采用的限制性核酸内切酶为Thermo Scientific的快速限制性核酸内切酶HinfI。
酶切体系总体积为30μL，具体配方如下：
其中PCR产物的量可以视PCR产物的浓度加以调整，通常为10～26μL，相应的ddH2O随之加以改变。
酶切在37℃水浴锅中进行，时间为15min。然后在65℃水浴保温20min以灭活酶。酶切产物行3％琼脂糖凝胶电泳，通过观察电泳条带的大小和数目以确定基因型。
5、测序验证本方法的准确性
选取上述PCR-RFLP法检出的3种基因型样品各1例，PCR扩增相应的靶片段进行Sanger法测序(测序峰图见图17、18、19)，结果表明，本发明所设计的上述3组分型引物，均可以对CYP2C19*3多态位点的基因型进行准确的检测。
6、实际检测案例
针对引物对1，图9、10、11依次为PCR产物电泳图、PCR产物完全酶切电泳图谱、个别PCR产物不完全酶切电泳图谱。从图11可以看出，在PCR产物没有被酶完全消化且有明显残留(如5号样品)的情况下，依然可以根据特征条带非常明确地分辨样品的基因型。
针对引物对2，如图12所示，所有样品的PCR产物均被酶完全消化，通过酶切产物的电泳图谱可以明确分辨3种基因型。
针对引物对3，如图13所示，所有PCR产物酶切后均有少量残留，但不影响基因型的正常判断。
图17、18、19显示使用引物对1、2、3通过本发明的PCR-RFLP法分型获得的3种基因型结果与测序结果完全一致。
实施例2
本实施例针对限制性内切酶EcoRI、MvaI【同裂酶有AjnI、BseBI、Bst2UI、BstNI、BstOI、Psp6I、PspGI、EcoR II、BciT130I等】、Bme1390I【同裂酶有ScrFI、BmrFI、BssKI、BstSCI、MspR9I、StyD4I等】、BseDI【同裂酶有BsaJI、BssECI等】设计1对用于检测CYP2C19*3多态位点基因型的引物对，并建立了CYP2C19*3多态位点基因型的检测方法，具体如下：
1、基因组DNA提取
采用口腔拭子基因组DNA提取试剂盒或血液基因组DNA提取试剂盒，按说明书的操作步骤提取基因组DNA。DNA来源不限于此，任何体细胞来源的DNA均可。
2、引物设计
调取CYP2C19*3多态位点前后各1000bp的序列，分析其与CYP2C亚家族其它基因即CYP2C9、CYP2C18、CYP2C8的同源性后，利用Primer Premier 5.0软件设计针对该位点的特异性分型引物。其中，内对照酶切位点分别为多态位点上游的GAATTC(EcoRI识别序列)、CCTGG(MvaI、Bme1390I及它们的同裂酶的识别序列)或CCTGGG(BseDI及同裂酶的识别序列)，具体理念及思路见图6、7、8，最终获得1对引物F4、R4，它们的PCR产物既可用EcoRI又可用MvaI、Bme1390I及它们的同裂酶来酶切鉴别基因型，还可用BseDI及同裂酶来酶切鉴别基因型。
F4：5′-CAGGAAACAGCTATGACCAGCTAGGCTGTAATTGTTAATTCGA-3′(SEQ ID NO.9)，
R4：5′-ATGGACTATCATATGCTTACCGTACAAAAAACTTGGCCTTACCTGAAT-3′(SEQ IDNO.10)。
PCR产物的大小为422bp。
若使用EcoRI进行酶切，酶切切完全时：
CYP2C19*3多态位点的基因型为GG时，酶切产物的大小分别为316bp、106bp；
CYP2C19*3多态位点的基因型为AA时，酶切产物的大小分别为269bp、106bp、47bp；
CYP2C19*3多态位点的基因型为GA时，酶切产物的大小分别为316bp、269bp、106bp、47bp。
酶切不完全时，将会残留和PCR产物一样大小的422bp的片段，但它不会影响基因型的判断，即实验人员可根据316bp、269bp、106bp、47bp。片段的组合情况来分辨基因型，实际上仅凭316bp、269bp二种特征条带的有无就可甄别3种基因型。
若使用MvaI、Bme1390I及它们的同裂酶进行酶切，酶切切完全时：
CYP2C19*3多态位点的基因型为GG时，酶切产物的大小分别为246.5bp、125bp、50.5bp；
CYP2C19*3多态位点的基因型为AA时，酶切产物的大小分别为246.5bp、175.5bp；
CYP2C19*3多态位点的基因型为GA时，酶切产物的大小分别为246.5bp、175.5bp、125bp、50.5bp。
酶切不完全时，将会残留和PCR产物一样大小的422bp的片段，但它不会影响基因型的判断，即实验人员可根据246.5bp、175.5bp、125bp、50.5bp片段的组合情况来分辨基因型，实际上仅凭175.5bp、125bp二种特征条带的有无就可甄别3种基因型。
若使用BseDI及其同裂酶进行酶切，酶切切完全时：
CYP2C19*3多态位点的基因型为GG时，酶切产物的大小分别为247bp、124bp、51bp；
CYP2C19*3多态位点的基因型为AA时，酶切产物的大小分别为247bp、175bp；
CYP2C19*3多态位点的基因型为GA时，酶切产物的大小分别为247bp、175bp、124bp、51bp。
酶切不完全时，将会残留和PCR产物一样大小的422bp的片段，但它不会影响基因型的判断，即实验人员可根据247bp、175bp、124bp、51bp片段的组合情况来分辨基因型，实际上仅凭175bp、124bp二种特征条带的有无就可甄别3种基因型。
3、目的片段的PCR扩增及鉴定
PCR反应体系：
PCR反应条件：
PCR产物用1.5％的琼脂糖凝胶电泳鉴定。
4、PCR产物的酶切分型
本实施例所采用的限制性核酸内切酶为Thermo Scientific的快速限制性核酸内切酶EcoRI、MvaI。
酶切体系总体积为30μL，具体配方如下：
其中PCR产物的量可以视PCR产物的浓度加以调整，通常为10～26μL，相应的ddH2O随之加以改变。
酶切在37℃水浴锅中进行，时间为15min，然后在65℃水浴保温20min【MvaI无须此步骤】。酶切产物行3％琼脂糖凝胶电泳，通过观察电泳条带的大小和数目以确定基因型。
5、测序验证本方法的准确性
选取上述PCR-RFLP法检出的3种基因型样品各1例，PCR扩增相应的靶片段进行Sanger法测序(测序峰图见图20、21)，结果表明，本发明所设计的分型引物，可对CYP2C19*3多态位点的基因型进行准确的检测。
6、实际检测案例
使用引物对4，以提纯的口腔上皮细胞来源的DNA为模板，可获得特异性的PCR产物，该PCR产物带有内对照酶切位点(GAATTC或CCTGG，前者为EcoRI识别位点，后者为MvaI、Bme1390I及它们的同裂酶的识别位点，见测序峰图20、21)。PCR产物酶切后制作的电泳图谱即便有PCR产物残留(比如图14中的3个样品有微量PCR产物残留，图15中的9个样品均有少量的PCR产物残留)仍可被察觉，且可正确地判断基因型。至于图16，所有样品均酶切完全，基因型的判断非常明确，1：突变型纯合子AA；2：杂合子GA；3：野生型纯合子GG。
以上实施例仅为介绍本发明的优选案例，对于本领域技术人员来说，在不背离本发明精神的范围内所进行的任何显而易见的变化和改进，都应被视为本发明的一部分。
<110> 广东药科大学
<120> 一种检测CYP2C19*3多态位点基因型的方法及试剂盒
<130>
<160> 10
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
aaattgtttc caatcattta gct 23
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
acttcagggc ttggtcaata 20
<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ctctctactg gttcaataca tggttc 26
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
gcctgatcta tattgggata ttc 23
<210> 5
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
agctttgaaa tccccaacta ttctcacc 28
<210> 6
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
ggagctaatg ggcttagaag cctgat 26
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
gtgctccctg caatgtgatc tg 22
<210> 8
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
gcttctgtgg ttccaaatat tctctg 26
<210> 9
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
caggaaacag ctatgaccag ctaggctgta attgttaatt cga 43
<210> 10
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
atggactatc atatgcttac cgtacaaaaa acttggcctt acctgaat 48

Claims (10)

1.一种检测CYP2C19*3多态位点（c.G636A；rs4986893）基因型的方法，包括如下步骤：
（1）提取待检样品基因组DNA；
（2）针对特定的限制性内切酶，设计PCR引物对，所述PCR引物对扩增得到的产物在CYP2C19*3多态位点之外引进一个内对照酶切位点，该内对照酶切位点能够被所述的限制性内切酶识别、切割，所述内对照酶切位点与多态位点之间的距离以其酶切产物能够被区分为准；
（3）利用步骤（2）所设计的PCR引物对对待检样品基因组DNA进行PCR扩增；
（4）利用所述特定的限制性内切酶对PCR产物进行酶切；
（5）根据酶切产物的电泳图谱确定CYP2C19*3位点的基因型。
2.根据权利要求1所述的检测CYP2C19*3位点基因型的方法，其特征在于，所述内对照酶切位点的识别序列符合下列序列模式中的任何一种：GANTC、GAATTC、CCWGG、CCNGG、CCNNGG，其中N=A、T、C、G四种碱基中的任何一种，W=A或T碱基。
3.根据权利要求2所述的检测CYP2C19*3位点基因型的方法，其特征在于，用于识别GANTC序列模式的限制性内切酶为HinfI，用于识别GAATTC序列模式的限制性内切酶为EcoRI，用于识别CCWGG 序列模式的限制性内切酶为MvaI及其同裂酶AjnI、BseBI、Bst2UI、BstNI、BstOI、Psp6I、 PspGI、EcoR II、BciT130 I中的任一种 ，用于识别CCNGG序列模式的限制性内切酶为Bme1390I及其同裂酶ScrFI、BmrFI、BssKI、BstSCI、MspR9I、StyD4I中的任一种，用于识别CCNNGG序列模式的限制性内切酶为BseDI及其同裂酶BsaJI、BssECI中的任一种。
4.根据权利要求1-3任一项所述的检测CYP2C19*3位点基因型的方法，其特征在于，所述PCR引物对中的正向引物位于CYP2C19基因的第 21948～22947位碱基之间，反向引物位于CYP2C19基因第22949～23948位碱基之间，所述CYP2C19基因在GenBank上的登录号为NG_008384.2。
5.一种用于检测CYP2C19*3多态位点基因型的引物对，其特征在于，所述PCR引物对扩增得到的产物在CYP2C19*3多态位点之外引进一个内对照酶切位点，该内对照酶切位点能够被特定的限制性内切酶识别、切割；所述内对照酶切位点与多态位点之间的距离以其酶切产物能够被区分为准。
6.根据权利要求5所述的用于检测CYP2C19*3多态位点基因型的引物对，其特征在于，所述内对照酶切位点的识别序列符合下列序列模式中的任何一种： GANTC、GAATTC、CCWGG、CCNGG、CCNNGG，其中N=A、T、C、G四种碱基中的任何一种，W=A或T碱基。
7.根据权利要求5或6所述的用于检测CYP2C19*3多态位点基因型的引物对，用于识别GANTC序列模式的限制性内切酶为HinfI，用于识别GAATTC序列模式的限制性内切酶为EcoRI，用于识别CCWGG 序列模式的限制性内切酶为MvaI及其同裂酶AjnI、BseBI、Bst2UI、BstNI、BstOI、Psp6I、PspGI、EcoR II、BciT130 I中的任一种 ，用于识别CCNGG序列模式的限制性内切酶为Bme1390I及其同裂酶ScrFI、BmrFI、BssKI、BstSCI、MspR9I、StyD4I中的任一种，用于识别CCNNGG序列模式的限制性内切酶为BseDI及其同裂酶BsaJI、BssECI中的任一种。
8.根据权利要求5或6所述的用于检测CYP2C19*3多态位点基因型的引物对，其特征在于，所述引物对的正向引物位于GenBank中CYP2C19基因的第21948～22947位碱基之间，反向引物位于CYP2C19基因第22949～23948位碱基之间，所述CYP2C19基因在GenBank上的登录号为NG_008384.2。
9.根据权利要求8所述的用于检测CYP2C19*3多态位点基因型的引物对，其特征在于，所述PCR引物对为下列任一组：
引物对1
F1：5´-CTCTCTACTGGTTCAATACATGGTTC-3´，
R1：5´-GCCTGATCTATATTGGGATATTC-3´；
引物对2
F2：5´-AGCTTTGAAATCCCCAACTATTCTCACC-3´，
R2：5´-GGAGCTAATGGGCTTAGAAGCCTGAT-3´；
引物对3
F3：5´-GTGCTCCCTGCAATGTGATCTG-3´，
R3：5´-GCTTCTGTGGTTCCAAATATTCTCTG-3´；
引物对4
F4：5´-CAGGAAACAGCTATGACCAGCTAGGCTGTAATTGTTAATTCGA-3´，
R4：5´-ATGGACTATCATATGCTTACCGTACAAAAAACTTGGCCTTACCTGAAT-3´。
10.一种用于检测CYP2C19*3多态位点基因型的试剂盒，其包括权利要求5-9任一项所述的用于检测CYP2C19*3多态位点基因型的引物对及限制性内切酶，所述限制性内切酶的识别序列符合下列序列模式中的任何一种： GANTC、GAATTC、CCWGG、CCNGG、CCNNGG，其中N=A、T、C、G四种碱基中的任何一种，W=A或T碱基。
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