CN110679548B - 一种自闭症小鼠模型的构建方法 - Google Patents
一种自闭症小鼠模型的构建方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN110679548B CN110679548B CN201911016844.4A CN201911016844A CN110679548B CN 110679548 B CN110679548 B CN 110679548B CN 201911016844 A CN201911016844 A CN 201911016844A CN 110679548 B CN110679548 B CN 110679548B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- mouse
- gabrb1
- gene
- autism
- mice
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 206010003805 Autism Diseases 0.000 title claims abstract description 46
- 208000020706 Autistic disease Diseases 0.000 title claims abstract description 46
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 title claims abstract description 14
- 238000010276 construction Methods 0.000 title claims description 9
- 101150048319 Gabrb1 gene Proteins 0.000 claims abstract description 44
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 24
- 206010015037 epilepsy Diseases 0.000 claims abstract description 19
- 238000010459 TALEN Methods 0.000 claims abstract description 15
- 238000011813 knockout mouse model Methods 0.000 claims abstract description 15
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 13
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims abstract description 9
- 108010043645 Transcription Activator-Like Effector Nucleases Proteins 0.000 claims abstract 4
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 claims description 33
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 claims description 28
- 230000015654 memory Effects 0.000 claims description 13
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 claims description 12
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 claims description 7
- 238000011740 C57BL/6 mouse Methods 0.000 claims description 6
- 108090001041 N-Methyl-D-Aspartate Receptors Proteins 0.000 claims description 6
- 238000003209 gene knockout Methods 0.000 claims description 6
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 claims description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 238000003766 bioinformatics method Methods 0.000 claims description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 4
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 4
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 4
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims description 4
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims description 4
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims description 3
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 claims description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 abstract description 3
- 238000012217 deletion Methods 0.000 abstract description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 abstract description 2
- 238000010362 genome editing Methods 0.000 abstract description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 16
- 230000000971 hippocampal effect Effects 0.000 description 9
- 230000001242 postsynaptic effect Effects 0.000 description 8
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 8
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 7
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 7
- HCZHHEIFKROPDY-UHFFFAOYSA-N kynurenic acid Chemical compound C1=CC=C2NC(C(=O)O)=CC(=O)C2=C1 HCZHHEIFKROPDY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 102000017690 GABRB1 Human genes 0.000 description 5
- 101001001362 Homo sapiens Gamma-aminobutyric acid receptor subunit beta-1 Proteins 0.000 description 5
- CWRVKFFCRWGWCS-UHFFFAOYSA-N Pentrazole Chemical compound C1CCCCC2=NN=NN21 CWRVKFFCRWGWCS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 5
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 5
- 230000006916 protein interaction Effects 0.000 description 5
- 230000002146 bilateral effect Effects 0.000 description 4
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- MGRVRXRGTBOSHW-UHFFFAOYSA-N (aminomethyl)phosphonic acid Chemical compound NCP(O)(O)=O MGRVRXRGTBOSHW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- IYGYMKDQCDOMRE-QRWMCTBCSA-N Bicculine Chemical compound O([C@H]1C2C3=CC=4OCOC=4C=C3CCN2C)C(=O)C2=C1C=CC1=C2OCO1 IYGYMKDQCDOMRE-QRWMCTBCSA-N 0.000 description 3
- 102000004868 N-Methyl-D-Aspartate Receptors Human genes 0.000 description 3
- 230000006399 behavior Effects 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 230000002964 excitative effect Effects 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- CFMYXEVWODSLAX-QOZOJKKESA-N tetrodotoxin Chemical compound O([C@@]([C@H]1O)(O)O[C@H]2[C@@]3(O)CO)[C@H]3[C@@H](O)[C@]11[C@H]2[C@@H](O)N=C(N)N1 CFMYXEVWODSLAX-QOZOJKKESA-N 0.000 description 3
- 229950010357 tetrodotoxin Drugs 0.000 description 3
- CFMYXEVWODSLAX-UHFFFAOYSA-N tetrodotoxin Natural products C12C(O)NC(=N)NC2(C2O)C(O)C3C(CO)(O)C1OC2(O)O3 CFMYXEVWODSLAX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 2
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 2
- 108090000839 GABA-A Receptors Proteins 0.000 description 2
- 102000004300 GABA-A Receptors Human genes 0.000 description 2
- HOKKHZGPKSLGJE-GSVOUGTGSA-N N-Methyl-D-aspartic acid Chemical compound CN[C@@H](C(O)=O)CC(O)=O HOKKHZGPKSLGJE-GSVOUGTGSA-N 0.000 description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 2
- 230000003542 behavioural effect Effects 0.000 description 2
- AACMFFIUYXGCOC-UHFFFAOYSA-N bicuculline Natural products CN1CCc2cc3OCOc3cc2C1C4OCc5c6OCOc6ccc45 AACMFFIUYXGCOC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- IYGYMKDQCDOMRE-UHFFFAOYSA-N d-Bicucullin Natural products CN1CCC2=CC=3OCOC=3C=C2C1C1OC(=O)C2=C1C=CC1=C2OCO1 IYGYMKDQCDOMRE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001037 epileptic effect Effects 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 230000000946 synaptic effect Effects 0.000 description 2
- 101150028074 2 gene Proteins 0.000 description 1
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 1
- 208000014644 Brain disease Diseases 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 206010010904 Convulsion Diseases 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 108090000862 Ion Channels Proteins 0.000 description 1
- 102000004310 Ion Channels Human genes 0.000 description 1
- PIWKPBJCKXDKJR-UHFFFAOYSA-N Isoflurane Chemical compound FC(F)OC(Cl)C(F)(F)F PIWKPBJCKXDKJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000581650 Ivesia Species 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 101100068012 Mus musculus Gabrb1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108700005081 Overlapping Genes Proteins 0.000 description 1
- 101100068013 Rattus norvegicus Gabrb1 gene Proteins 0.000 description 1
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 230000003556 anti-epileptic effect Effects 0.000 description 1
- 239000001961 anticonvulsive agent Substances 0.000 description 1
- 208000029560 autism spectrum disease Diseases 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 230000001149 cognitive effect Effects 0.000 description 1
- 208000013577 complex neurodevelopmental disease Diseases 0.000 description 1
- 238000005336 cracking Methods 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 230000007831 electrophysiology Effects 0.000 description 1
- 238000002001 electrophysiology Methods 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 239000005457 ice water Substances 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 229960002725 isoflurane Drugs 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 230000006993 memory improvement Effects 0.000 description 1
- 210000002418 meninge Anatomy 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 210000000653 nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 230000036407 pain Effects 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 1
- 239000002987 primer (paints) Substances 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 1
- 210000003625 skull Anatomy 0.000 description 1
- 229940125794 sodium channel blocker Drugs 0.000 description 1
- 239000003195 sodium channel blocking agent Substances 0.000 description 1
- 230000006886 spatial memory Effects 0.000 description 1
- 230000004006 stereotypic behavior Effects 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 210000001103 thalamus Anatomy 0.000 description 1
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 1
- 238000003260 vortexing Methods 0.000 description 1
- 238000011816 wild-type C57Bl6 mouse Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
- A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
- A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
- A01K67/0276—Knock-out vertebrates
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K49/00—Preparations for testing in vivo
- A61K49/0004—Screening or testing of compounds for diagnosis of disorders, assessment of conditions, e.g. renal clearance, gastric emptying, testing for diabetes, allergy, rheuma, pancreas functions
- A61K49/0008—Screening agents using (non-human) animal models or transgenic animal models or chimeric hosts, e.g. Alzheimer disease animal model, transgenic model for heart failure
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
- C12N15/89—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation using microinjection
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
- A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
- A01K2217/075—Animals genetically altered by homologous recombination inducing loss of function, i.e. knock out
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2227/00—Animals characterised by species
- A01K2227/10—Mammal
- A01K2227/105—Murine
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2267/00—Animals characterised by purpose
- A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2800/00—Nucleic acids vectors
- C12N2800/30—Vector systems comprising sequences for excision in presence of a recombinase, e.g. loxP or FRT
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Animal Husbandry (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明提供一种自闭症小鼠模型，所述自闭症小鼠模型通过TALEN基因编辑方法敲除小鼠的Gabrb1基因的第一个外显子上的序列。本发明的Gabrb1‑/‑小鼠作为模型，可用于研究Gabrb1基因与自闭症疾病的关系，同时可用于Gabrb1基因与癫痫易发性的研究，通过对Gabrb1基因敲除小鼠进行行为学的筛查，进而研究该基因的缺失对自闭症疾病及癫痫易感性的影响，方法有效、易行。
Description
技术领域
本发明涉及一种自闭症小鼠模型的构建方法，属于医疗检测技术领域。
背景技术
儿童自闭症又称为孤独症，最早由美国的卡勒(Kanner.L)教授于1943年提出，以后世界各国相继报道。自闭症患儿给家庭带来了巨大的痛苦和不幸。自闭症被认为是一种复杂的神经发育疾病，尽管目前对其病因有各种各样的假说，但其确切的发病原因尚不明确。近年来，随着自闭症关注度的逐渐升高，动物模型已成为国内外研究者研究自闭症发病机制和临床特征的重要手段和工具。因此建立和选择一种成功的自闭症模型是破解神经系统与自闭症疾病关系的重要手段。
GABRB1编码GABA-A受体的β1亚基，其涉及抑制性神经突触中氯离子的转运。构建GABA门控离子通道的最低要求是包含α和β亚基。最常见的GABA-A受体是包含两个α亚基，两个β亚基和一个γ亚基的五聚体。据报道GABRB1突变可以导致自闭症疾病易感性的增加，并且在自闭症患者脑中发现GABRB1蛋白减少。在癫痫患者脑中出现海马区GABRB1亚型的表达水平改变，GABRB1基因的F246S突变发生在癫痫性脑病患儿中。这些研究表明GABRB1基因是自闭症谱系疾病和癫痫易感性的疾病候选基因。此外，有研究发现，GABRB1的单核苷酸多态性(SNP)rs7435958与丘脑体积和智力有着较强的相关性。
然而，如今在基因敲除小鼠库中尚未发现有Gabrb1基因敲除小鼠，在国内外尚无对Gabrb1基因与自闭症及癫痫疾病的相关研究。
发明内容
本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种自闭症小鼠模型以及构建方法。本发明Gabrb1-/-模式动物的构建采用了TALEN(转录激活因子样效应核酸酶)基因敲除小鼠技术，因为C57BL/6小鼠具有行为学的稳定性，常用来作为研究自闭症的小鼠品系，所以我们选择了在C57BL/6品系小鼠中敲除Gabrb1基因。Gabrb1基因位于小鼠5号染色体上(GenBank编号：NM_008069.4；Ensembl编号:ENSMUSG00000029212)，共有11个外显子，我们选用第一个外显子作为TALEN敲除靶点。将体外转录产生的TALEN mRNAs注射到受精卵中用于Gabrb1敲除鼠的产生。
本发明的第一个目的在于提供一种自闭症小鼠模型，所述自闭症小鼠模型通过TALEN基因编辑方法敲除小鼠的Gabrb1基因。
进一步地，所述敲除小鼠的Gabrb1基因，具体的是敲除Gabrb1基因的第一个外显子上的序列。
进一步地，所述敲除Gabrb1基因的第一个外显子上的5个碱基，所述Gabrb1基因的第一个外显子上的5个碱基序列为5’-gttgc-3’(SEQ ID NO:1)。
进一步地，敲除Gabrb1基因的第一个外显子上的序列后，其第一个外显子的核苷酸序列为5’-tttggggcttctctcttttcccgtgatgtatggtttgttgtgcacacaggtgagctgcctg-3’(SEQ ID NO:2)。
进一步地，所述小鼠为C57BL/6小鼠。
本发明的第二个目的在于提供上述自闭症小鼠模型的构建方法，所述方法采用以下方法实现：
(1)选用Gabrb1基因的第一个外显子作为TALEN敲除靶点，将体外转录产生的TALEN mRNAs注射到小鼠受精卵中；
(2)通过PCR鉴定方法对初代小鼠(F0)进行目的基因的扩增，然后进行DNA测序分析基因型；
(3)将产生的F0敲除小鼠与野生型C57BL/6杂交，繁育出F1代Gabrb1杂合子；
(4)对F1代目标基因型小鼠进行配种繁殖，通过PCR和Sanger DNA测序对F2代小鼠进行基因型分析；
进一步地，所述TALEN敲除靶点为敲除Gabrb1基因的第一个外显子上的5个碱基，所述Gabrb1基因的第一个外显子上的5个碱基序列为5’-gttgc-3’(SEQ ID NO:1)。
进一步地，敲除Gabrb1基因的第一个外显子上的序列后，其第一个外显子的核苷酸序列为5’-tttggggcttctctcttttcccgtgatgtatggtttgttgtgcacacaggtgagctgcctg-3’(SEQ ID NO:2)。
进一步地，所述注射的mRNA编号为：Mouse Gabrb1-1-L(VB150316-10026)/R(VB150316-10027)。
进一步地，用于对所述F2代小鼠进行PCR鉴定所使用的引物为：正向引物5’-AGGTCCATTCGGGAATTACTGCC-3’(SEQ ID NO:3)和反向引物5’-GGCACACCTACCCCCAAATAACA-3’(SEQ ID NO:4)；用于对所述F2代小鼠进行Sanger DNA测序所使用的引物为：5’-AGGTCCATTCGGGAATTACTGCC-3’(SEQ ID NO:5)。
本发明的第三个目的在于提供一种评估Gabrb1基因与自闭症疾病关系的方法，包括以下步骤：
(1)制备上述Gabrb1基因敲除小鼠；
(2)通过三厢实验、自我修饰验室、水迷宫实验、PTZ敏感实验对上述基因敲除小鼠的进行行为学检测；
(3)通过生物信息学方法分析发现自闭症、癫痫以及学习记忆基因的差异表达基因富集，获得分子信号网络；
(4)通过生物信息学方法分析得到自闭症、癫痫以及学习记忆的子网络，分析这三个子网络得到三个子网络的中心介数；
(5)通过步骤(4)的三个子网络的中心介数得到Gabrb1基因敲除小鼠与N-甲基-D-天冬氨酸受体基因(NMDARs)的关系。
本发明的有益效果：本发明提供的自闭症小鼠模型通过TALEN技术敲除了Gabrb1基因的第一个外显子上的5个碱基。本发明的Gabrb1-/-小鼠作为模型，可用于研究Gabrb1基因与自闭症疾病的关系，同时可用于Gabrb1基因与癫痫易发性的研究，通过对Gabrb1基因敲除小鼠进行行为学的筛查，进而研究该基因的缺失对自闭症疾病及癫痫易感性的影响，方法有效、易行。
附图说明
图1为小鼠基因型测序图谱。
图2为Gabrb-/-小鼠表现出自闭症样行为、增强的学习/记忆力和降低的癫痫发作敏感性示意图(从图A看出Gabrb1-/-小鼠对新型小鼠没有明显的偏好；从图B看出Gabrb1-/-小鼠比野生型对照花费更多的时间理毛；从图C看出Gabrb1-/-小鼠表现出对玻璃珠掩埋行为的兴趣降低；从图D看出Gabrb1-/-小鼠在30分钟内运动的总距离相似；从图E看出Gabrb1-/-小鼠与野生型小鼠相比在中心区域花费的时间更长；从图F看出Gabrb1-/-小鼠与野生型小鼠相比表现出更深的学习曲线；从图G看出小鼠在40mg/kg和50mg/kg的剂量下对戊四唑的敏感性)。
图3为差异表达基因的蛋白质相互作用网络富集了自闭症、癫痫和高功能自闭症的候选基因示意图(A为差异表达子网络图；B表示差异表达子网络在自闭症候选基因中富集；C表示差异表达子网络在癫痫候选基因中富集；D表示差异表达子网络在学习/记忆(LM)相关的基因中富集；E表示差异表达子网络的十大KEGG集群)。
图4为自闭症、癫痫和学习/记忆的蛋白质相互作用子网络示意图(A为自闭症的蛋白质相互作用子网络；B表示自闭症子网络中基因的网络中心性；C为癫痫的蛋白质相互作用子网络；D表示癫痫子网络中基因的网络中心性；E为学习/记忆的蛋白相互作用子网络；F表示学习/记忆子网络中基因的网络中心性；G为三个子网之间的重叠基因数；H为所有三个子网中的重叠基因模块)。
图5为Gabrb1-/-小鼠海马区的抑制性突触电流和NMDA/AMPA电流比的膜片钳记录示意图(A为在野生型小鼠(上)和Gabrb1-/-小鼠(下)中记录的自发性突触后突触电流(sIPSC)的示例；从B可以看出Gabrb1-/-小鼠的sIPSCs频率显着小于野生型小鼠；从C可以看出Gabrb1-/-小鼠的sIPSCs幅度明显小于野生型小鼠；D为在野生型小鼠(上)和Gabrb1-/-小鼠(下)中记录的微型抑制突触后电流(mIPSC)的实例；从E可以看出Gabrb1-/-小鼠的mIPSCs频率明显小于野生型小鼠；从F可以看出Gabrb1-/-小鼠的mIPSC幅度明显小于野生型小鼠；G为在野生型小鼠(左)和Gabrb1-/-小鼠(右)中记录的NMDA/AMPA电流比迹线的实例；H为Gabrb1-/-和野生型小鼠之间的NMDA/AMPA电流比)。
具体实施方式
为了更加简洁明了的展示本发明的技术方案、目的和优点，下面结合具体实施例及其附图对本发明做进一步的详细描述。
实施例1构建Gabrb1-/-小鼠模型
Gabrb1基因位于小鼠5号染色体上(GenBank编号：NM_008069.4；Ensembl编号:ENSMUSG00000029212)，共有11个外显子，发明人选用第一个外显子作为TALEN敲除靶点。将体外转录产生的TALEN mRNAs注射到受精卵中用于Gabrb1敲除鼠的产生。注射的mRNA编号为：Mouse Gabrb1-1-L(VB150316-10026)/R(VB150316-10027)。ES细胞注射及筛选带有靶基因小鼠委托赛业生物科技有限公司完成。
带有靶基因小鼠组织DNA的提取：收集样品时，剪取2-3周龄C57BL/6小鼠尾巴尖或脚趾置于已高压蒸汽灭菌的1.5mlEP管内，样品组织长度2-3mm。使用Easy Pure GenomicDNA Kit提取组织DNA，具体步骤如下：
①裂解：加入100μl LB2和20μl Proteinase K溶液，金属浴55℃孵育过夜；
②提取DNA：12000g离心5分钟，上清转移到新的已高压蒸汽灭菌的1.5ml EP管中，加入500μl BB2，立即涡旋5秒，在室温下孵育10分钟，取出吸附柱，将全部溶液加入吸附柱中，12000g离心30秒，弃去集液管中液体；
③提纯DNA：向吸附柱中加入500μl CB2，12000g离心30秒，弃去集液管中液体，重复此步骤一次，向吸附柱中加入500μl WB2，12000g离心30秒，弃去集液管中液体，重复此步骤一次，然后12000g离心2分钟，彻底去除残留的液体；
④洗脱DNA：将吸附柱置于洁净EP管中，在吸附柱中央加入100μl EB，静置5分钟，12000g离心2分钟，弃吸附柱，DNA保存于-20℃冰箱中备用。
PCR反应：PCR采用TSINGKE公司生产的2×T5super PCR Mix(货号：TSE005)进行实验，该产品含T5DNA聚合酶、dNTPs和PCR反应缓冲液，浓度为2×。实验时，首先配置含有引物、水、Mix的混合体系，分装到各管后加入模板DNA。离心机离心后进行PCR。
PCR反应体系，如表1所示：
表1：
| 试剂 | 使用量 |
| T5super PCR Mix(2×) | 7.5μL |
| PCR Forward Primer(10μM) | 1μL |
| PCR Reverse Primer(10μM) | 1μL |
| DNA模板 | 2μL |
| dH<sub>2</sub>O(高压灭菌水) | 3.5μL |
小鼠鉴定引物订购于生工生物公司，采用ABI StepOnePlus PCR仪进行PCR反应。具体引物序列和反应条件如下：
引物序列：
Mouse Gabrb1-F:5’-AGGTCCATTCGGGAATTACTGCC-3’(SEQ ID NO:3)
Mouse Gabrb1-R:5’-GGCACACCTACCCCCAAATAACA-3’(SEQ ID NO:4)
反应条件：
95℃ 3min
95℃ 30sec
59℃ 30sec 35cycles
72℃ 45sec
4℃ Hold
上述引物PCR扩增产物条带为294bp，将所得DNA送生工生物公司Sanger DNA测序。经赛业生物科技公司进行F0及F1代基因型鉴定的结果为：
野生型：5’-tttggggcttctctcttttcccgtgatggttgctatggtttgttgtgcacacaggtgagctgcctg-3’
Gabrb1-/-：5’-tttggggcttctctcttttcccgtgatg-----tatggtttgttgtgcacacaggtgagctgcctg-3’
发明人用F1代Gabrb1+/-小鼠与野生型C57BL/6小鼠杂交，繁殖出来的F2小崽取组织，提取DNA经PCR扩增目的片段后进行Sanger DNA测序(其中所使用的引物为SEQ ID NO:3～5)，结果图1所示，获得的Gabrb1-/-小鼠在其第一个外显子上缺少与野生型小鼠相同位置的5’-gttgc-3’序列。
实施例2基因敲除小鼠验证
(1)Gabrb1基因敲除小鼠的行为学检测，年龄均为8-10周的雄鼠(F2代以后的小鼠)，其中腹腔注射戊四唑(PTZ)的浓度为40-50mg/Kg，结果如图2所示，发现Gabrb1基因敲除小鼠相对于对照组而言，社交新颖性退缩(三厢实验)，刻板样行为增加(自我修饰验室)，认知和空间记忆能力增强(水迷宫实验)，抗癫痫能力增加(PTZ敏感实验)，其中*表示p<0.05，**表示p<0.01,***表示p<0.001。由此表示，小鼠Gabrb1基因敲除导致自闭症样行为。
(2)将8周大的雄鼠每3只分为一组，取每只雄鼠的双侧海马组织，3只雄鼠的双侧海马混合一起，敲除组和对照组分别三组提取RNA并进行转录组测序；将差异表达基因映射到自闭症、癫痫以及学习记忆基因中，发现差异表达基因在自闭症、癫痫以及学习记忆基因中富集，如图3所示。这与图2的结果相吻合。
(3)将8周大的雄鼠每3只分为一组，取每只雄鼠的双侧海马组织，3只雄鼠的双侧海马混合一起，敲除组和对照组分别三组提取RNA并进行转录组测序；我们用检测到的16403个表达基因与来自BioGRID的全小鼠相互作用组(Biological General Repositoryfor Interaction Datasets，http：//thebiogrid.org，截止日期2017年2月2日)进行比较，构建了海马相互作用组。将自闭症、癫痫以及学习记忆相关基因分别映射到小鼠海马相互作用组，并提取它们共表达的基因，得到自闭症、癫痫以及学习记忆的子网络，进一步分析这三个子网络得到三个子网络的中心介数(betweenness centrality)，发现betweennesscentrality靠前的基本是N-甲基-D-天冬氨酸受体基因(NMDARs)(图4)，因此，发明人认为Gabrb1基因敲除小鼠表现为学习记忆增强可能与NMDARs增加或者是AMPARs减弱有关(图5)。小鼠海马区膜片钳检测突触电生理实验具体操作方法如下：
(1)使用异氟烷对8-12周龄大的雄性小鼠进行麻醉，以减少应激对小鼠的影响。
(2)麻醉后迅速用剪刀进行断头，去除皮肤、颅骨及脑膜，将大脑小心转移至0℃冰水混合物状态的高糖成分人造脑脊液(ACSF)中冷冻1分钟。
①电生理记录时，人工脑脊髓液(与孵育液成分相同)不断通入混合气体(95％O2,5％CO2)，脑片放置在记录浴槽中。使用红外相差正置显微镜(Nikon Eclipse FN1)进行实验。
(3)记录自发的抑制性突触后电流(spontaneous inhibitory postsynapticpotential，sIPSC)时，需要加入1mM犬尿喹啉酸(Kynurenic acid)来阻断兴奋性系统。
(4)在记录微小抑制性突触后电流(miniature inhibitory postsynapticpotential，mIPSC)时，除了需要加入1mM犬尿喹啉酸(Kynurenic acid)外还需要加入1μM钠通道阻断剂河豚毒素(TTX)。
(5)在记录自发的兴奋性突触后电流(spontaneous excitatory postsynapticpotential，sEPSC)时，加入20μM荷包牡丹碱(BMI)阻断抑制性系统。
(6)在记录微小兴奋性突触后电流(miniature excitatory postsynapticpotential，mEPSC)时，在存在TTX(1μM)和荷包牡丹碱(20μM)的人造脑脊髓液中进行。
(7)使用Multiclamp 700B放大器和1440A数模转换器(Molecular Device)。分析时使用分析软件为pClamp 10.2software(Molecular Devices)。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 南方医科大学南方医院
<120> 一种自闭症小鼠模型的构建方法
<130> 10.24
<160> 5
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 5
<212> DNA
<213> mouse
<400> 1
gttgc 5
<210> 2
<211> 60
<212> DNA
<213> mouse
<400> 2
tttggggctt ctctcttttc ccgtgatgta tggtttgttg tgcacacagg tgagctgcct 60
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 3
aggtccattc gggaatta 18
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 4
ggcacaccta cccccaaata aca 23
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 5
aggtccattc gggaattact gcc 23
Claims (5)
1.一种自闭症小鼠模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)选用Gabrb1基因的第一个外显子作为TALEN敲除靶点，将体外转录产生的TALENmRNAs注射到小鼠受精卵中；
(2)通过PCR鉴定方法对初代小鼠F0进行目的基因的扩增，然后进行DNA测序分析基因型；
(3)将产生的F0敲除小鼠与野生型C57BL/6杂交，繁育出F1代Gabrb1杂合子；
(4)对F1代目标基因型小鼠进行配种繁殖，通过PCR和Sanger DNA测序对F2代小鼠进行基因型分析。
2.如权利要求1所述的自闭症小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述TALEN敲除靶点为敲除Gabrb1基因的第一个外显子上的5个碱基，所述Gabrb1基因的第一个外显子上的5个碱基序列如SEQ ID NO:1所示。
3.如权利要求1所述的自闭症小鼠模型的构建方法，其特征在于，敲除Gabrb1基因的第一个外显子上的序列后，其第一个外显子的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
4.如权利要求1所述的自闭症小鼠模型的构建方法，其特征在于，用于对所述F2代小鼠进行PCR鉴定所使用的引物为：正向引物序列如SEQ ID NO:3所示和反向引物序列如SEQ IDNO:4所示；用于对所述F2代小鼠进行Sanger DNA测序所使用的引物序列如SEQ ID NO:5所示。
5.一种评估Gabrb1基因与自闭症疾病关系的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)采用权利要求1-4任一项所述的构建方法制备Gabrb1基因敲除小鼠；
(2)通过三厢实验、自我修饰验室、水迷宫实验、PTZ敏感实验对Gabrb1基因敲除小鼠的进行行为学检测；
(3)通过生物信息学方法分析发现自闭症、癫痫以及学习记忆基因的差异表达基因富集，获得分子信号网络；
(4)通过生物信息学方法分析得到自闭症、癫痫以及学习记忆的子网络，分析这三个子网络得到三个子网络的中心介数；
(5)通过步骤(4)的三个子网络的中心介数得到Gabrb1基因敲除小鼠与N-甲基-D-天冬氨酸受体基因的关系。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201911016844.4A CN110679548B (zh) | 2019-10-24 | 2019-10-24 | 一种自闭症小鼠模型的构建方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201911016844.4A CN110679548B (zh) | 2019-10-24 | 2019-10-24 | 一种自闭症小鼠模型的构建方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN110679548A CN110679548A (zh) | 2020-01-14 |
| CN110679548B true CN110679548B (zh) | 2021-11-30 |
Family
ID=69114376
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201911016844.4A Active CN110679548B (zh) | 2019-10-24 | 2019-10-24 | 一种自闭症小鼠模型的构建方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN110679548B (zh) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111500699B (zh) * | 2020-04-15 | 2022-04-22 | 南方医科大学 | Tresk钾通道作为抗癫痫药物作用靶点的用途 |
| CN111631190B (zh) * | 2020-08-03 | 2021-01-29 | 江苏集萃药康生物科技有限公司 | 小鼠模型在评估智力水平中的应用 |
| CN113005142B (zh) * | 2021-02-07 | 2021-11-16 | 南方医科大学南方医院 | doc2α和doc2β基因缺失斑马鱼突变体的制备及斑马鱼自闭症模型的构建方法 |
| CN113528650B (zh) * | 2021-08-03 | 2022-03-08 | 长沙艾克曼生物科技有限公司 | Tmp21基因的表达可以作为自闭症早期筛查、早期识别和症状严重程度预测的客观指标 |
| CN116179601B (zh) * | 2023-03-22 | 2023-12-15 | 四川大学华西第二医院 | 一种构建具有社交障碍的自闭症疾病动物模型的方法及应用 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20070292962A1 (en) * | 2006-04-10 | 2007-12-20 | Duke University | Methods and compositions for genetic markers for autism |
| JP2010209040A (ja) * | 2009-03-12 | 2010-09-24 | Tohoku Univ | プリオン病の予防及び／又は治療用薬、並びに異常プリオン蛋白質の発現抑制方法 |
| CA2999279A1 (en) * | 2015-10-01 | 2017-04-06 | Goleini Inc. | Targeted expression of chloride channels and methods of use thereof |
-
2019
- 2019-10-24 CN CN201911016844.4A patent/CN110679548B/zh active Active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN110679548A (zh) | 2020-01-14 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN110679548B (zh) | 一种自闭症小鼠模型的构建方法 | |
| Hitzemann et al. | Genes, behavior and next‐generation RNA sequencing | |
| Chinn et al. | Diagnostic interpretation of genetic studies in patients with primary immunodeficiency diseases: a working group report of the Primary Immunodeficiency Diseases Committee of the American Academy of Allergy, Asthma & Immunology | |
| CN106929533B (zh) | Kars基因点突变小鼠模型的构建方法及其应用 | |
| CN114686597B (zh) | 一种银龙鱼性别鉴定snp分子标记及其应用 | |
| Li et al. | A sheep pangenome reveals the spectrum of structural variations and their effects on tail phenotypes | |
| Zhang et al. | Whole-genome resequencing from bulked-segregant analysis reveals gene set based association analyses for the Vibrio anguillarum resistance of turbot (Scophthalmus maximus) | |
| CN109280701A (zh) | 用于地中海贫血检测的探针、基因芯片及制备方法和应用 | |
| Luo et al. | Detection of four rare thalassemia variants using Single-molecule realtime sequencing | |
| Romagnoli et al. | Resolving complex structural variants via nanopore sequencing | |
| Andrade et al. | Molecular parallelisms between pigmentation in the avian iris and the integument of ectothermic vertebrates | |
| CN112226440B (zh) | 一种遗传性原发不孕的致病突变及其检测试剂 | |
| CN108486230B (zh) | 用于无创检测mitf基因突变的试剂盒及其制备方法 | |
| CN112442503A (zh) | Kcnq1基因突变体及其应用 | |
| Han et al. | Potential loci and candidate genes associated with Vibrio anguillarum resistance in black rockfish (Sebastes schlegelii) revealed by BSA-seq analysis | |
| Bensaid et al. | Multi-hit autism genomic architecture evidenced from consanguineous families with involvement of FEZF2 and mutations in high-risk genes | |
| Sun et al. | Study on sex-linked region and sex determination candidate gene using a high-quality genome assembly in yellow drum | |
| CN114075566B (zh) | 水牛asip基因插入突变及其分子鉴定方法和应用 | |
| CN116463413B (zh) | 猪间性病相关的wwox基因分子标记及其应用 | |
| CN114686596B (zh) | 用于银龙鱼性别鉴定的snp分子标记及其应用 | |
| CN114686594B (zh) | 一种适用于银龙鱼性别鉴定的snp分子标记及其应用 | |
| CN112522312B (zh) | Wkh大鼠模型构建方法 | |
| CN109022444B (zh) | Ttc21b基因突变体及其应用 | |
| Li | Identification and Investigation of Single Nucleotide Polymorphisms Associated with Cognitive-Emotional Phenotypes in Rats | |
| Billingsley | Structural variation in Parkinson’s disease: focusing on the role of Transposable elements in disease predisposition and pathogenesis |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |