JP2014503553A - 新血管新生と関連する疾患及び状態を治療するためのｍｉＲＮＡ - Google Patents

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Abstract

本発明は、新血管新生と関連する疾患及び状態における、ｍｉＲＮＡ分子、その等価物又は供給源の診断的及び治療的使用に関する。
【選択図】なし

Description

本発明は、新血管新生と関連する疾患及び状態における、ｍｉＲＮＡ分子、その等価物又は供給源の診断的使用、及びｍｉＲＮＡ分子、その等価物又は供給源の治療的使用に関する。
血管新生は、既存の毛細管からの新しい微小血管の成長と定義される。血管新生は、胚性成長中の新脈管形成のことをいう脈管新生（脈管新生では、より大きい血管が形成され、内皮前駆細胞（ＥＰＣ）が脈管新生に参加する）とは区別されることがある。しかし、ＥＰＣは、腫瘍血管新生においても（軽微な）役割を演じ得るという証拠がある。血管新生は、側副血管の成熟及び成長に主に関与する動脈新生とも区別できる（Ａｓａｈａｒａ Ｓ．ら１９９９、Ｃａｒｍｅｌｉｅｔ Ｐ．２０００及びＨｅｌｉｓｃｈ Ａ．ら２００３）。血管新生は、創傷治癒、炎症及び女性の生殖周期のような生理的プロセス中に新しい血管を形成する主要な機構である。さらに、血管新生は、加齢黄斑変性、関節リウマチ、子宮内膜症及びがんを含む様々な障害に関与する（Ｃａｒｍｅｌｉｅｔ Ｐ．ら２００５及びＧｒｉｆｆｉｏｅｎ Ａ．Ｗ．ら２０００）。１世紀前に、血管新生が腫瘍の周囲に発生することが観察され、さらなる研究により、腫瘍が血管新生促進因子を生成して新脈管形成を刺激するとの仮説が導かれた（Ｃａｒｍｅｌｉｅｔ Ｐ．ら２０００、Ｆｏｌｋｍａｎ Ｊ．ら１９７１）。腫瘍成長における血管新生の重要性は、１９７１年に最初に仮説が立てられ、この時に、Ｊｕｄａｈ Ｆｏｌｋｍａｎは、固形腫瘍は、限られた資源を有しており、これについて多くの活発に増殖しているがん細胞が争っているという理論を立てた。それ以来、腫瘍血管新生研究は、腫瘍細胞が新しい血管の成長を促進するプロセスについて理解し、それに干渉することに焦点を当ててきた（Ｆｏｌｋｍａｎ Ｊ．ら２００７及びＲｉｂａｔｔｉ Ｄ．ら２０００）。腫瘍血管新生のプロセスは、成長している腫瘍量が、酸素及び栄養分の拡散により維持できる最大体積を超えた場合に主に活性化される（Ｃａｒｍｅｌｉｅｔ Ｐ．２０００）。低酸素環境により、腫瘍細胞は、血管新生スイッチを経て、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）のような血管新生促進タンパク質の生成の増加を導く（Ｆｏｌｋｍａｎ Ｊ．ら１９９５、Ｆｏｌｋｍａｎ Ｊ．ら２００２及びＨａｎａｈａｎ Ｄ．ら１９９６）。これらの血管新生促進タンパク質は、近くの血管中の内皮細胞を活性化する。同時に、異なるタンパク質分解酵素の活性の増加により、基底膜の分解及び細胞間接触の解離がもたらされ、これらのことにより、ＥＣ（内皮細胞）が周囲の基質中及び腫瘍に向かって遊走及び侵入することが容易になる（Ｃａｒｍｅｌｉｅｔ Ｐ．２０００及びＧｒｉｆｆｉｏｅｎ Ａ．Ｗ．ら２０００）。細胞外基質のタンパク質分解切断は、活性化内皮細胞が、腫瘍細胞を起源とする走化性シグナルに向かって遊走することも可能にする。これらのシグナルは、内皮細胞により感知され、内皮細胞のその後の遊走及び増殖は、血管様構造の形成をもたらす（Ａｄａｍｓ Ｒ．Ｈ．ら２００７及びＣａｒｍｅｌｉｅｔ Ｐ．２０００）。不規則で組織化されていない構造にもかかわらず、このネットワークは、成長している腫瘍量に対して全ての必要な代謝産物を与えることができる。さらに、血管床は、腫瘍細胞に対して、循環に入り、遠隔転移を形成する機会を与える（Ｆｏｌｋｍａｎ Ｊ．ら、２００２）。異なる細胞型が新脈管形成に貢献するが、内皮細胞は、血管新生プロセスにおける中心的な役割を有すると一般的に認められている。異なるトリガーに応答して、これらの細胞は、細胞外基質リモデリング、増殖及び遊走を含む様々な機能を示す。これらの機能は全て、特定の分子の発現を必要とし、この複雑なプロセスが正しく行われることは、機能的要求に応じるようにトランスクリプトーム及びプロテオームを直ちに調整する内皮細胞の柔軟性に依拠する。遺伝子プロモーター活性の制御及びタンパク質代謝回転の改変のようなより古典的な機構の他に、細胞が、遺伝子発現を支配するために小型の非コードＲＮＡ分子も用いることが現在明らかになっている。これらのＲＮＡ分子の１つのクラスであるマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、細胞の発現プロファイルの向きを変えることができる分子スイッチとして作用する。これらのｍｉＲＮＡが、腫瘍血管新生中の内皮遺伝子発現制御において重要な役割を果たすという証拠が増えてきている（Ｈｅｕｓｓｃｈｅｎ Ｒら２０１０）。
多くのｍｉＲＮＡは、細胞型特異的機能を示唆する器官特異的発現パターンを示す（Ｃｈｅｎ Ｃ．Ｚ．ら２００４、Ｐｏｙ Ｍ．Ｎ．ら２００４及びｖａｎ Ｒｏｏｉｊ Ｅ．ら２００７）。その結果、ｍｉＲＮＡ発現及び機能の調節解除は、ヒト疾患を導くことがある（Ｃｈａｎｇ Ｔ．Ｃ．ら２００７）。内皮細胞（ＥＣ）におけるｍｉＲＮＡ発現の最初の大規模分析は、ＨＵＶＥＣ（ヒト臍帯静脈内皮細胞）において行われ、予測アルゴリズムに従って、推定ｍＲＮＡ標的が血管新生因子の受容体である１５の高発現ｍｉＲＮＡ（例えばＦｌｔ−１、Ｎｒｐ−２、Ｆｇｆ−Ｒ、ｃ−Ｍｅｔ及びｃ−ｋｉｔ）が同定された（Ｐｏｌｉｓｅｎｏｌ Ｌ．ら２００６）。さらなる研究は、また、ＥＣにおけるｍｉＲＮＡの発現をプロファイリングした（Ｋｕｅｈｂａｃｈｅｒ Ａ．ら２００７及びＳｕａｒｅｚ Ｙ．ら２００７）。３つの研究のうちの少なくとも２つで共通する高発現ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲＮＡ−１５ｂ、−１６、−２０、−２１、−２３ａ、−２３ｂ、−２４、−２９ａ及び−ｂ、−３１、−９９ａ、−１００、−１０３、−１０６、−１２５ａ、−１２５ｂ、−１２６、−１３０ａ、−１８１ａ、−１９１、−２２１、−２２２、−３２０、ｌｅｔ−７、ｌｅｔ−７ｂ、ｌｅｔ−７ｃ並びにｌｅｔ−７ｄを含んでいた（Ｋｕｅｈｂａｃｈｅｒ Ａ．ら２００７、Ｐｏｌｉｓｅｎｏｌ Ｌ．ら２００６及びＳｕａｒｅｚ Ｙ．ら２００７）。しかし、ＥＣにおける血管新生に関するそれらの具体的な標的及び機能は、それらのうちのいくつかについてのみ特徴付けられている。
ある研究は、ｍｉＲＮＡ−２２１／２２２でのＨＵＶＥＣのトランスフェクションは、管形成、遊走及び幹細胞因子に応答した創傷治癒を阻害することを示す（Ｐｏｌｉｓｅｎｏｌ Ｌ．ら２００６）。この研究及びその他の研究は、これらのｍｉＲＮＡについての抗血管新生作用を示唆し、これらのｍｉＲＮＡは、血管新生を遮断するための可能性のあるツールになり得る。しかし、ｍｉＲ２２１／２２２は、がん細胞増殖を、ｐ２７（Ｋｉｐ１）腫瘍抑制因子の調節により促進することもできることに注目することが重要であり（Ｌｅ Ｓａｇｅ Ｃ．ら２００７）、このことは、これらのｍｉＲＮＡによる増殖の調節が、細胞型特異的であるように見えることを示す。よって、ｍｉＲＮＡを用いる細胞特異的標的化は、開発されるべき重要な調査の領域である。
ＥＣにおいて発現されるその他のｍｉＲＮＡであるｌｅｔ−７ｆ及びｍｉＲＮＡ−２７ｂは、２’−Ｏ−メチルオリゴヌクレオチド阻害剤を用いるｉｎ ｖｉｔｒｏ血管新生の遮断により明らかにされるように、血管新生促進効果を奏することが示されている（Ｋｕｅｈｂａｃｈｅｒ Ａ．ら２００７）が、ＥＣにおけるそれらの標的は、まだ特徴付けられていない。
最もよく特徴付けられたＥＣ特異的ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲＮＡ−１２６である（Ｆｉｓｈ Ｊ．Ｅ．ら２００８、Ｈａｒｒｉｓ Ｔ．Ａ．ら２００８及びＷａｎｇ Ｓ．ら２００８）。ｍｉＲＮＡ−１２６は、ＥＣ内の増殖因子の内因性リプレッサーを阻害することにより、増殖因子（ＶＥＧＦ／ＦＧＦ血管内皮増殖因子／線維芽細胞増殖因子）シグナル伝達、血管新生及び脈管完全性を促進する（Ｆｉｓｈ Ｊ．Ｅ．ら２００８及びＷａｎｇ Ｓ．ら２００８）。これらの知見は、単一ｍｉＲＮＡが脈管完全性及び血管新生を調節でき、血管新生促進又は抗血管新生のいずれかの治療についての新しい標的を提供することを示す。
極めて最近の研究（Ａｎａｎｄ Ｓ．ら２０１０）は、ｍｉＲＮＡ−１３２が、Ｒａｓ活性化及び新脈管形成の誘導を導く内皮ｐ１２０ＲａｓＧＡＰ（ｐ１２０Ｒａｓ ＧＴＰアーゼ活性化タンパク質）発現を抑制することにより血管新生スイッチとして作用し、抗ｍｉＲＮＡ−１３２を用いることが、血管を静止状態に維持することにより新脈管形成を阻害すると結論付けている。
さらに、本明細書に記載していないいくつかのその他の知見は、ｍｉＲＮＡが、強力で高度に特異的な抗血管新生治療様式であることの概念を証明する。
現在、いくつかの血管新生抑制化合物が市場に出ており、多くのものが臨床試験の中期〜後期にある。抗血管新生に基づく薬物療法（例えばアバスチン（Ａｖａｓｔｉｎ））が臨床承認されてからおよそ５年が経過している。より最近では、小分子ＲＴＫＩ（受容体チロシンキナーゼ阻害剤）、例えばスニチニブが用いられている。しかし、本質的に腫瘍により主導されるプロセスを標的にするそれらの性質により、これらの薬物療法は臨床耐性を誘起する。いくつかの型のがんの患者コホートにおいて生存のいくらかの延長が確かに存在するが、利益は中程度であるとみなすことができる。がんの治療に加えて、滲出型加齢黄斑変性（ＡＭＤ）のような眼疾患の患者の治療のために３つの抗血管新生治療：ペガプタニブ（マクゲン（Ｍａｃｕｇｅｎ）、Ｐｆｉｚｅｒ）、ラニビズマブ（ルセンチス（Ｌｕｃｅｎｔｉｓ）、Ｎｏｖａｒｔｉｓ）及びベバシズマブ（アバスチン、Ｒｏｃｈｅ）が現在用いられている。ここでもまた、視力のいくらかの改善が確かにあるものの、利益は、限定的であるとみなされる。
よって、新血管新生についてのよりよい診断マーカー及び治療のための血管新生阻害のよりよい方策についての明確な必要性が存在する。
内皮細胞におけるｍｉＲＮＡの血管新生能を評価するために、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）及びＲＦ２４細胞（不死化内皮株化細胞）における完全レンチウイルスｍｉＲＮＡライブラリーの形質導入により機能的スクリーニングを行った。以下のパラメータを、緑色蛍光タンパク質を有する対照レンチウイルス（ｌｅｎｔｉ−ｃｏｐＧＦＰ）を用いて最適アッセイ性能について最適化した：細胞数、レンチウイルス粒子量（ＭＯＩ、効率的及び最適なｍｉＲＮＡ発現のため）、レンチウイルス形質導入とＭＴＳアッセイの読出しとの間の時間。ＭＯＩ及びレンチウイルス形質導入後の時間の関数としての形質導入効率の代表的な例を、８μｇ／ｍｌポリブレンを用いるＨＵＶＥＣ細胞（図１ａ）及び６μｇ／ｍｌポリブレンを用いるＲＦ２４細胞（図１ｂ）について示す。これらの例は、ＨＵＶＥＣ及びＲＦ２４細胞がともに、ｌｅｎｔｉ−ｃｏｐＧＦＰを高度に形質導入可能である（＞９５％）ことを示す。 内皮細胞におけるｍｉＲＮＡの血管新生能を評価するために、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）及びＲＦ２４細胞（不死化内皮株化細胞）における完全レンチウイルスｍｉＲＮＡライブラリーの形質導入により機能的スクリーニングを行った。以下のパラメータを、緑色蛍光タンパク質を有する対照レンチウイルス（ｌｅｎｔｉ−ｃｏｐＧＦＰ）を用いて最適アッセイ性能について最適化した：細胞数、レンチウイルス粒子量（ＭＯＩ、効率的及び最適なｍｉＲＮＡ発現のため）、レンチウイルス形質導入とＭＴＳアッセイの読出しとの間の時間。ＭＯＩ及びレンチウイルス形質導入後の時間の関数としての形質導入効率の代表的な例を、８μｇ／ｍｌポリブレンを用いるＨＵＶＥＣ細胞（図１ａ）及び６μｇ／ｍｌポリブレンを用いるＲＦ２４細胞（図１ｂ）について示す。これらの例は、ＨＵＶＥＣ及びＲＦ２４細胞がともに、ｌｅｎｔｉ−ｃｏｐＧＦＰを高度に形質導入可能である（＞９５％）ことを示す。 最適アッセイ条件（アッセイウィンドウ；Ｚ’因子）を、ｍｉＲ−９２ａを発現するｐＣＤＨ−ＣＭＶ−ＭＣＳ−ＥＦ１−Ｐｕｒｏベクター（増殖／生存）を陽性対照とし、空のｐＣＤＨ−ＣＭＶ−ＭＣＳ−ＥＦ１−Ｐｕｒｏベクターを陰性対照として用いて確立した。図２は、陽性対照と陰性対照との間の最大のウィンドウが、ＲＦ２４細胞（図２ｂ）及びＨＵＶＥＣ（図２ａ）の両方について３０と１００の間のＭＯＩで観察されることを示す。 最適アッセイ条件（アッセイウィンドウ；Ｚ’因子）を、ｍｉＲ−９２ａを発現するｐＣＤＨ−ＣＭＶ−ＭＣＳ−ＥＦ１−Ｐｕｒｏベクター（増殖／生存）を陽性対照とし、空のｐＣＤＨ−ＣＭＶ−ＭＣＳ−ＥＦ１−Ｐｕｒｏベクターを陰性対照として用いて確立した。図２は、陽性対照と陰性対照との間の最大のウィンドウが、ＲＦ２４細胞（図２ｂ）及びＨＵＶＥＣ（図２ａ）の両方について３０と１００の間のＭＯＩで観察されることを示す。 プレート７からの平均ＭＴＳ吸光度データを示すことにより、スクリーニングの結果の例を示す。図３ａは、ＲＦ２４細胞を用いたプレート７の平均吸光度データを示し、図３ｂは、ＨＵＶＥＣ細胞を用いた平均吸光度データを示す。ヒット確認のために選択されたヒットは、球で示す。 プレート７からの平均ＭＴＳ吸光度データを示すことにより、スクリーニングの結果の例を示す。図３ａは、ＲＦ２４細胞を用いたプレート７の平均吸光度データを示し、図３ｂは、ＨＵＶＥＣ細胞を用いた平均吸光度データを示す。ヒット確認のために選択されたヒットは、球で示す。 ｍｉＲＮＡ−７（ｍｉＲ−７）及びｍｉＲＮＡ−５７４（ｍｉＲ−５７４−５ｐ）の模倣物でのＨＵＶＥＣのトランスフェクションは、ＭＴＳ読出しにおいて吸光度の減少（条件当たりｎ＝３；＋／−ｓｄ）により示されるように、細胞生存性の用量依存的減少を示す。陽性対照は、ｓｉＲＮＡ ＰＬＫ１（ＰＬＫ１は、抗増殖活性を有するキナーゼである）である。陰性対照は、模倣物対照、スクランブルにしたヌクレオチド配列を有するｍｉＲＮＡにより示される。 ｍｉＲＮＡ−１９０ｂの模倣物（ｍｉＲ−１９０ｂ）でのＨＵＶＥＣのトランスフェクションは、ＭＴＳ読出しにおいて吸光度の減少（条件当たりｎ＝３；＋／−ｓｄ）により示されるように、細胞生存性の用量依存的減少を示す。陽性対照は、ｓｉＲＮＡ ＰＬＫ１（ＰＬＫ１は、抗増殖活性を有するキナーゼである）である。陰性対照は、模倣物対照、スクランブルにしたヌクレオチド配列を有するｍｉＲＮＡにより示される。 ｍｉＲＮＡ−１４２−３ｐ及びｍｉＲ−１４２−５ｐの模倣物でのＨＵＶＥＣのトランスフェクションは、ＭＴＳ読出しにおいて吸光度の減少（条件当たりｎ＝３；＋／−ｓｄ）により示されるように、ｍｉＲ−１４２−３ｐが、ｍｉＲ−１４２−５ｐと比較して、より強い細胞生存性の用量依存的減少を有することを示す。陽性対照は、ｓｉＲＮＡ ＰＬＫ１（ＰＬＫ１は、抗増殖活性を有するキナーゼである）である。陰性対照は、模倣物対照、スクランブルにしたヌクレオチド配列を有するｍｉＲＮＡにより示される。 マトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）（商標）を３次元細胞外基質として採用するｉｎ ｖｉｔｒｏ内皮管形成アッセイ。完全成長培地中のＨＵＶＥＣ（７．５×１０４）を、マトリゲル（商標）（５ｍｇ／ｍｌ）を含有する９６ウェルプレートに播種した。完全成長培地に播種したナイーブＨＵＶＥＣは、リポフェクタミン及びスクランブルにしたｓｉＲＮＡで処理した細胞と同様に、堅固な管形成を示す。ｓｉＲＮＡ−ＶＥＧＦＲ２及びｍｉＲＮＡ−１９０ｂをトランスフェクトした細胞は、完全成長培地に播種したＨＵＶＥＣの著しく妨げられた自発的管形成を示す。 マトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）（商標）を３次元細胞外基質として採用するｉｎ ｖｉｔｒｏ内皮管形成アッセイ。完全成長培地中のＨＵＶＥＣ（７．５×１０４）を、マトリゲル（商標）（５ｍｇ／ｍｌ）を含有する９６ウェルプレートに播種した。完全成長培地に播種したナイーブＨＵＶＥＣは、リポフェクタミン及びスクランブルにしたｓｉＲＮＡで処理した細胞と同様に、堅固な管形成を示す。ｓｉＲＮＡ−ＶＥＧＦＲ２、ｍｉＲ−１４２−３ｐをトランスフェクトした細胞は、完全成長培地に播種したＨＵＶＥＣの明らかに妨げられた自発的管形成を示す。ｍｉＲ−１４２−３ｐのトランスフェクション後の管形成の阻害は、ｍｉＲ−１４２−５ｐと比較して、かなりより強い表現型の影響を示す。 マトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）（商標）を３次元細胞外基質として採用するｉｎ ｖｉｔｒｏ内皮管形成アッセイ。完全成長培地中のＨＵＶＥＣ（７．５×１０４）を、マトリゲル（商標）（５ｍｇ／ｍｌ）を含有する９６ウェルプレートに播種した。完全成長培地に播種したナイーブＨＵＶＥＣは、Ｘ−ｔｒｅｍｅＧｅｎｅ及びスクランブルにしたｓｉＲＮＡで処理した細胞と同様に、堅固な管形成を示す。ｍｉＲ−９＊をトランスフェクトした細胞は、Ｘ−ｔｒｅｍｅＧｅｎｅのみで処理した細胞と比較して、完全成長培地に播種したＨＵＶＥＣの著しく妨げられた自発的管形成を示す。ｍｉＲ−９＊による自発的管形成の妨げは、ｓｉＲＮＡ−ＶＥＧＦＲ２による管形成の妨げよりも強い。バーは、４００μｍである。 ｍｉＲＮＡ−９＊の模倣物（ｍｉＲ−９＊）でのＨＵＶＥＣのトランスフェクションは、ＭＴＳ読出しにおいて吸光度の減少（条件当たりｎ＝３；＋／−ｓｄ）により示されるように、細胞生存性の用量依存的減少を示す。陽性対照は、ｓｉＲＮＡ ＰＬＫ１（ＰＬＫ１は、抗増殖活性を有するキナーゼである）である。陰性対照は、模倣物対照、スクランブルにしたヌクレオチド配列を有するｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ−スクランブル）及びｓｉＲＮＡ対照、スクランブルにしたヌクレオチド配列を有するｓｉＲＮＡプールにより示される。 未処理又は模倣物をトランスフェクトしたＨＵＶＥＣの球状体を用いて行ったｂＦＧＦ誘導ｉｎ−ｖｉｔｒｏ発芽血管新生アッセイ。ａ）左から右及び上から下に：非トランスフェクションＨＵＶＥＣの球状体；ｂＦＧＦで刺激した非トランスフェクションＨＵＶＥＣ；Ｘｔｒｅｍｅｇｅｎｅ及びｂＦＧＦで処理した非トランスフェクションＨＵＶＥＣ；ｂＦＧＦで処理した、ｍｉＲ−スクランブルをトランスフェクトしたＨＵＶＥＣ；ｂＦＧＦで処理したｍｉＲ−７ ＨＵＶＥＣ；ｂＦＧＦで処理した、ｍｉＲ−２７ａをトランスフェクトしたＨＵＶＥＣ；及びｂＦＧＦで処理した、ｍｉＲ−５７４−５ｐをトランスフェクトしたＨＵＶＥＣの位相差画像。ｂ）（ａ）に列挙する処理群当たり１０の球状体からの、球状体当たりの累積新芽長さ。ｃ）（ａ）に列挙する処理群当たり１０の球状体からの、球状体当たりの新芽の平均数。誤差バー、ＳＤ；（＊）Ｐ＜０．００１、ＡＮＯＶＡ検定。 未処理又は模倣物をトランスフェクトしたＨＵＶＥＣの球状体を用いて行ったｂＦＧＦ誘導ｉｎ−ｖｉｔｒｏ発芽血管新生アッセイ。ａ）左から右及び上から下に：非トランスフェクションＨＵＶＥＣの球状体；ｂＦＧＦで刺激した非トランスフェクションＨＵＶＥＣ；Ｘｔｒｅｍｅｇｅｎｅ及びｂＦＧＦで処理した非トランスフェクションＨＵＶＥＣ；ｂＦＧＦで処理した、ｍｉＲ−スクランブルをトランスフェクトしたＨＵＶＥＣ；ｂＦＧＦで処理したｍｉＲ−７ ＨＵＶＥＣ；ｂＦＧＦで処理した、ｍｉＲ−２７ａをトランスフェクトしたＨＵＶＥＣ；及びｂＦＧＦで処理した、ｍｉＲ−５７４−５ｐをトランスフェクトしたＨＵＶＥＣの位相差画像。ｂ）（ａ）に列挙する処理群当たり１０の球状体からの、球状体当たりの累積新芽長さ。ｃ）（ａ）に列挙する処理群当たり１０の球状体からの、球状体当たりの新芽の平均数。誤差バー、ＳＤ；（＊）Ｐ＜０．００１、ＡＮＯＶＡ検定。 未処理又は模倣物をトランスフェクトしたＨＵＶＥＣの球状体を用いて行ったｂＦＧＦ誘導ｉｎ−ｖｉｔｒｏ発芽血管新生アッセイ。ａ）左から右及び上から下に：非トランスフェクションＨＵＶＥＣの球状体；ｂＦＧＦで刺激した非トランスフェクションＨＵＶＥＣ；Ｘｔｒｅｍｅｇｅｎｅ及びｂＦＧＦで処理した非トランスフェクションＨＵＶＥＣ；ｂＦＧＦで処理した、ｍｉＲ−スクランブルをトランスフェクトしたＨＵＶＥＣ；ｂＦＧＦで処理したｍｉＲ−７ ＨＵＶＥＣ；ｂＦＧＦで処理した、ｍｉＲ−２７ａをトランスフェクトしたＨＵＶＥＣ；及びｂＦＧＦで処理した、ｍｉＲ−５７４−５ｐをトランスフェクトしたＨＵＶＥＣの位相差画像。ｂ）（ａ）に列挙する処理群当たり１０の球状体からの、球状体当たりの累積新芽長さ。ｃ）（ａ）に列挙する処理群当たり１０の球状体からの、球状体当たりの新芽の平均数。誤差バー、ＳＤ；（＊）Ｐ＜０．００１、ＡＮＯＶＡ検定。 ＰＢＳ（ｎ＝６）又はｍｉＲ−スクランブル（ｎ＝６）又は合成抗血管新生ｍｉＲＮＡ又はｓｉＶＥＧＦＲ２で局所的に処理したＮｅｕｒｏ２Ａ腫瘍保持マウスの腫瘍成長曲線。ａ）ｍｉＲ−７で処理した腫瘍（ｎ＝７）。ｂ）ｍｉＲ−５７４−５ｐで処理した腫瘍（ｎ＝７）。ｃ）ｍｉＲ−２７ａで局所的に処理した腫瘍（ｎ＝７）。ｄ）陽性対照ｓｉＶＥＧＦＲ−２で処理した腫瘍（ｎ＝７）。ｅ）ｍｉＲ−９＊で処理した腫瘍（ｎ＝８）。図１２ｅに示す結果は、図１２ａ〜ｄに示す結果とは異なるマウスコホートを起源とする。ＰＢＳ腫瘍成長曲線は、ｎ＝８匹のマウスを用いて作製し、ｍｉＲ−スクランブル腫瘍成長曲線は、ｎ＝１０匹のマウスを用いて作製した。腫瘍体積は、平均±ＳＴＤＥＶとして示す。 ＰＢＳ（ｎ＝６）又はｍｉＲ−スクランブル（ｎ＝６）又は合成抗血管新生ｍｉＲＮＡ又はｓｉＶＥＧＦＲ２で局所的に処理したＮｅｕｒｏ２Ａ腫瘍保持マウスの腫瘍成長曲線。ａ）ｍｉＲ−７で処理した腫瘍（ｎ＝７）。ｂ）ｍｉＲ−５７４−５ｐで処理した腫瘍（ｎ＝７）。ｃ）ｍｉＲ−２７ａで局所的に処理した腫瘍（ｎ＝７）。ｄ）陽性対照ｓｉＶＥＧＦＲ−２で処理した腫瘍（ｎ＝７）。ｅ）ｍｉＲ−９＊で処理した腫瘍（ｎ＝８）。図１２ｅに示す結果は、図１２ａ〜ｄに示す結果とは異なるマウスコホートを起源とする。ＰＢＳ腫瘍成長曲線は、ｎ＝８匹のマウスを用いて作製し、ｍｉＲ−スクランブル腫瘍成長曲線は、ｎ＝１０匹のマウスを用いて作製した。腫瘍体積は、平均±ＳＴＤＥＶとして示す。 ＰＢＳ（ｎ＝６）又はｍｉＲ−スクランブル（ｎ＝６）又は合成抗血管新生ｍｉＲＮＡ又はｓｉＶＥＧＦＲ２で局所的に処理したＮｅｕｒｏ２Ａ腫瘍保持マウスの腫瘍成長曲線。ａ）ｍｉＲ−７で処理した腫瘍（ｎ＝７）。ｂ）ｍｉＲ−５７４−５ｐで処理した腫瘍（ｎ＝７）。ｃ）ｍｉＲ−２７ａで局所的に処理した腫瘍（ｎ＝７）。ｄ）陽性対照ｓｉＶＥＧＦＲ−２で処理した腫瘍（ｎ＝７）。ｅ）ｍｉＲ−９＊で処理した腫瘍（ｎ＝８）。図１２ｅに示す結果は、図１２ａ〜ｄに示す結果とは異なるマウスコホートを起源とする。ＰＢＳ腫瘍成長曲線は、ｎ＝８匹のマウスを用いて作製し、ｍｉＲ−スクランブル腫瘍成長曲線は、ｎ＝１０匹のマウスを用いて作製した。腫瘍体積は、平均±ＳＴＤＥＶとして示す。 ＰＢＳ（ｎ＝６）又はｍｉＲ−スクランブル（ｎ＝６）又は合成抗血管新生ｍｉＲＮＡ又はｓｉＶＥＧＦＲ２で局所的に処理したＮｅｕｒｏ２Ａ腫瘍保持マウスの腫瘍成長曲線。ａ）ｍｉＲ−７で処理した腫瘍（ｎ＝７）。ｂ）ｍｉＲ−５７４−５ｐで処理した腫瘍（ｎ＝７）。ｃ）ｍｉＲ−２７ａで局所的に処理した腫瘍（ｎ＝７）。ｄ）陽性対照ｓｉＶＥＧＦＲ−２で処理した腫瘍（ｎ＝７）。ｅ）ｍｉＲ−９＊で処理した腫瘍（ｎ＝８）。図１２ｅに示す結果は、図１２ａ〜ｄに示す結果とは異なるマウスコホートを起源とする。ＰＢＳ腫瘍成長曲線は、ｎ＝８匹のマウスを用いて作製し、ｍｉＲ−スクランブル腫瘍成長曲線は、ｎ＝１０匹のマウスを用いて作製した。腫瘍体積は、平均±ＳＴＤＥＶとして示す。 ＰＢＳ（ｎ＝６）又はｍｉＲ−スクランブル（ｎ＝６）又は合成抗血管新生ｍｉＲＮＡ又はｓｉＶＥＧＦＲ２で局所的に処理したＮｅｕｒｏ２Ａ腫瘍保持マウスの腫瘍成長曲線。ａ）ｍｉＲ−７で処理した腫瘍（ｎ＝７）。ｂ）ｍｉＲ−５７４−５ｐで処理した腫瘍（ｎ＝７）。ｃ）ｍｉＲ−２７ａで局所的に処理した腫瘍（ｎ＝７）。ｄ）陽性対照ｓｉＶＥＧＦＲ−２で処理した腫瘍（ｎ＝７）。ｅ）ｍｉＲ−９＊で処理した腫瘍（ｎ＝８）。図１２ｅに示す結果は、図１２ａ〜ｄに示す結果とは異なるマウスコホートを起源とする。ＰＢＳ腫瘍成長曲線は、ｎ＝８匹のマウスを用いて作製し、ｍｉＲ−スクランブル腫瘍成長曲線は、ｎ＝１０匹のマウスを用いて作製した。腫瘍体積は、平均±ＳＴＤＥＶとして示す。 ＰＢＳ、ｍｉＲ−スクランブル、ｍｉＲ−５７４−５ｐ、ｍｉＲ−７、ｍｉＲ−２７ａ又はｓｉＶＥＧＦＲ２で処理したＣＤ３１染色Ｎｅｕｒｏ２Ａ腫瘍の微小血管密度（ＭＶＤ）の定量。データは、平均±ＳＴＤＥＶとして示す。＊＊ｍｉＲ−スクランブルに対してＰ＜０．０１。１元配置ＡＮＯＶＡ検定。
本発明は、本明細書で同定されるようなｍｉＲＮＡ分子、等価物、模倣物、イソｍｉＲ若しくはアンタゴｍｉｒ又はその供給源のいくつかの使用を包含する。本発明は、新しく同定されたｍｉＲＮＡ分子等価物、模倣物、イソｍｉＲ又はアンタゴｍｉｒ自体のそれぞれも包含する。
第１の態様では、新血管新生又は新血管新生と関連する疾患若しくは状態を予防、治療、回復、治癒及び／或いは遅延するための医薬品として好ましくは用いるための、ｍｉＲＮＡ−９、ｍｉＲＮＡ−５７４、ｍｉＲＮＡ−７、ｍｉＲＮＡ−１９０ｂ及び／若しくはｍｉＲＮＡ−１４２分子、その等価物、模倣物、イソｍｉＲ又は供給源或いは前記ｍｉＲＮＡ分子ｍｉＲＮＡ−９、ｍｉＲＮＡ−５７４、ｍｉＲＮＡ−７、ｍｉＲＮＡ−１９０ｂ及び／若しくはｍｉＲＮＡ−１４２、その前記等価物又は前記供給源を含む組成物が提供される。
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、１７〜２５ヌクレオチドの小型ＲＮＡであり、真核生物における遺伝子発現の調節物質として機能する。ｍｉＲＮＡは１次ｍｉＲＮＡ（ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ）とよばれる長い１次転写産物の一部分として核内で最初に発現される。核の内部では、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡは、酵素ドローシャにより部分的に消化されて、６５〜１２０ヌクレオチド長のヘアピン前駆ｍｉＲＮＡ（ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ）を形成し、これらのｐｒｅ−ｍｉＲＮＡは、細胞質に輸送されてダイサーによって活性分子であるより短い成熟ｍｉＲＮＡにさらにプロセシングされる。動物において、これらの短いＲＮＡは、５’近位「シード」領域（ヌクレオチド２〜８）を含み、この領域は、標的ｍＲＮＡの３’非翻訳領域（３’−ＵＴＲ）とのｍｉＲＮＡの対形成特異性についての主な決定因子であると見られる。より詳細な説明は、一般的な定義についての部に示す。
ｍｉＲＮＡ分子、ｍｉＲＮＡ等価物、ｍｉＲＮＡ模倣物若しくはｍｉＲＮＡイソｍｉＲ、又は模倣物若しくはイソｍｉＲ若しくはｍｉＲＮＡ供給源についての以下に示す定義のそれぞれは、本出願の同定されたｍｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡ等価物又はｍｉＲＮＡ供給源：ｍｉＲＮＡ−５７４、ｍｉＲＮＡ−７、ｍｉＲＮＡ−２６ｂ、ｍｉＲＮＡ−２７ａ、ｍｉＲＮＡ−９２ａ、ｍｉＲＮＡ−２２１、ｍｉＲＮＡ−２２２、ｍｉＲＮＡ−１４５、ｌｅｔ７ａ１、ｍｉＲＮＡ−１９０ｂ、ｍｉＲＮＡ−１４２、ｍｉＲＮＡ−９及びそれらの供給源のそれぞれのために用いる。前記ｍｉＲＮＡ分子又はその等価物の好ましい成熟若しくは模倣配列（表５において配列番号２２〜５２として同定される）、シード配列（表５及び７において配列番号３４８〜３７８、６１〜１１５及び３７９〜３８１として同定される）、イソｍｉＲ配列（表７において配列番号１１６〜３０４及び３８２〜３９６として同定される）又は供給源配列（表４（配列番号１〜２１のようなＲＮＡ前駆体）又は６（配列番号５３〜６０のようなＲＮＡ前駆体をコードするＤＮＡ）において同定される）はそれぞれ、対応する表において同定される。
本出願の本文全体において、そうでないと示さない限り、ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲＮＡ分子、ｍｉＲ又はその等価物又は供給源又はその前駆体と称することもある。好ましい等価物は、イソｍｉＲ又は模倣物である。本明細書で同定される各配列は、本出願の本文において用いる配列番号又は配列表における対応する配列番号として同定することがある。
本発明において、ｍｉＲＮＡ−１３２、ｍｉＲＮＡ−１２６及びｍｉＲＮＡ−２１にも言及する。活性が上方制御／過剰発現／増加せず、及び／又は本明細書で同定される治療用途において用いるために活性が増加しないｍｉＲＮＡ分子は、本発明においてこれらだけである。対照的に、これらのｍｉＲＮＡ分子の内因性発現は、下方制御／減少する必要があり、及び／又はこのようなｍｉＲＮＡ分子の活性は、治療上望ましい効果を得るために減少若しくは低減若しくは阻害される必要がある。このことは、本明細書において後で説明するようにアンタゴｍｉｒを用いて行うことが好ましい。よって、本発明において、治療的使用においてこれらのｍｉＲＮＡ分子のいずれかに言及する場合、ｍｉＲＮＡ−１３２、ｍｉＲＮＡ−１２６若しくはｍｉＲＮＡ−２１分子のアンタゴｍｉｒ又はこれらのｍｉＲＮＡのアンタゴｍｉｒの等価物又はこれらのｍｉＲＮＡのアンタゴｍｉｒの供給源の使用に常に言及する。したがって、アンタゴｍｉｒに言及する場合、本明細書で示すｍｉＲＮＡ−１３２、ｍｉＲＮＡ−１２６及びｍｉＲＮＡ−２１分子又はその等価物若しくは供給源のアンタゴｍｉｒの使用に常に言及する。ｍｉＲＮＡ分子又はｍｉＲＮＡ等価物又はｍｉＲＮＡ供給源に関して本明細書に示す定義のそれぞれは、本段落において同定するアンタゴｍｉｒとして用いる任意のｍｉＲＮＡ分子についても当てはまる。ｍｉＲＮＡ分子の所定のアンタゴｍｉｒに関して本明細書に示す定義のそれぞれも、それぞれ本明細書で定義するように、異なるｍｉＲＮＡ分子の他のアンタゴｍｉｒに当てはまる。
本発明の関係において、ｍｉＲＮＡ分子又はその等価物若しくは模倣物若しくはアンタゴｍｉｒ若しくはイソｍｉＲは、一般的な定義についての部分でさらに定義するように、合成若しくは天然若しくは組換え若しくは成熟又は成熟ｍｉＲＮＡの一部又はヒトｍｉＲＮＡであってもよいか、或いはヒトｍｉＲＮＡに由来できる。ヒトｍｉＲＮＡ分子は、ヒト細胞、組織、器官又は体液において見出されるｍｉＲＮＡ分子（すなわち内因性ヒトｍｉＲＮＡ分子）である。ヒトｍｉＲＮＡ分子は、内因性ヒトｍｉＲＮＡ分子から、ヌクレオチドの置換、欠失及び／又は付加により誘導したヒトｍｉＲＮＡ分子であってもよい。ｍｉＲＮＡ分子又はその等価物若しくは模倣物若しくはアンタゴｍｉｒは、１本鎖又は２本鎖ＲＮＡ分子であってもよい。
好ましくは、ｍｉＲＮＡ分子又はその等価物若しくは模倣物は、６〜３０ヌクレオチド長、好ましくは１２〜３０ヌクレオチド長、好ましくは１５〜２８ヌクレオチド長であり、より好ましくは、前記分子は、少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０ヌクレオチド以上の長さを有する。
好ましくは、ｍｉＲＮＡ分子のアンタゴｍｉｒは、８〜３０ヌクレオチド長、好ましくは１０〜３０ヌクレオチド長、好ましくは１２〜２８ヌクレオチド長であり、より好ましくは、前記分子は、少なくとも８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０ヌクレオチド以上の長さを有する。
好ましい実施形態では、ｍｉＲＮＡ分子又はその等価物若しくは模倣物若しくはイソｍｉＲは、前記ｍｉＲＮＡ分子又はその等価物若しくは模倣物若しくはイソｍｉＲのシード配列に存在する７ヌクレオチドのうち少なくとも６ヌクレオチドを含む（表５及び７は、配列番号３４８〜３７８、６１〜１１５及び３７９〜３８１として本明細書で同定されるｍｉＲＮＡ分子のそれぞれの好ましいシード配列を示す）。好ましくは本実施形態において、ｍｉＲＮＡ分子又はその等価物若しくは模倣物若しくはイソｍｉＲは、６〜３０ヌクレオチド長であり、より好ましくは、前記ｍｉＲＮＡ分子又はその等価物のシード配列に存在する７ヌクレオチドのうち少なくとも６ヌクレオチドを含む。さらにより好ましくは、ｍｉＲＮＡ分子又はその等価物若しくは模倣物若しくはイソｍｉＲは、１５〜２８ヌクレオチド長であり、より好ましくは、シード配列に存在する７ヌクレオチドのうち少なくとも６ヌクレオチドを含み、さらにより好ましくは、ｍｉＲＮＡ分子は、少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０ヌクレオチド以上の長さを有する。
したがって、好ましいｍｉＲＮＡ−５７４分子又はその等価物若しくは模倣物若しくはイソｍｉＲは、配列番号３５３、３５４、７８、７９、８０、８２、８３及び／又は８４として同定されるシード配列に存在する７ヌクレオチドのうち少なくとも６ヌクレオチドを含み、より好ましくは、少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０ヌクレオチド以上の長さを有する。
したがって、好ましいｍｉＲＮＡ−７分子又はその等価物若しくは模倣物若しくはイソｍｉＲは、配列番号３４８、３４９、３５０、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７１、７２、７３及び／又は７４として同定されるシード配列に存在する７ヌクレオチドのうち少なくとも６ヌクレオチドを含み、より好ましくは、少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０ヌクレオチド以上の長さを有する。
したがって、好ましいｍｉＲＮＡ−１９０ｂ分子又はその等価物若しくは模倣物若しくはイソｍｉＲは、配列番号３７４及び／又は９６として同定されるシード配列に存在する７ヌクレオチドのうち少なくとも６ヌクレオチドを含み、より好ましくは、少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０ヌクレオチド以上の長さを有する。
したがって、好ましいｍｉＲＮＡ−１４２分子又はその等価物若しくは模倣物若しくはイソｍｉＲは、配列番号３７５、３７６、９７、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９及び／又は１１０として同定されるシード配列に存在する７ヌクレオチドのうち少なくとも６ヌクレオチドを含み、より好ましくは、少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０ヌクレオチド以上の長さを有する。
したがって、好ましいｍｉＲＮＡ−９分子又はその等価物若しくは模倣物若しくはイソｍｉＲは、配列番号３７７、３７８、１１４、１１５、３７９、３８０及び／又は３８１として同定されるシード配列に存在する７ヌクレオチドのうち少なくとも６ヌクレオチドを含み、より好ましくは、少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０ヌクレオチド以上の長さを有する。
より好ましい実施形態では、ｍｉＲＮＡ−９分子又はその等価物若しくは模倣物若しくはイソｍｉＲは、ｍｉＲＮＡ−９＊分子又はその等価物若しくは模倣物若しくはイソｍｉＲとして同定され、配列番号３７８、１１４及び／又は１１５として同定されるシード配列に存在する７ヌクレオチドのうち少なくとも６ヌクレオチドを含み、より好ましくは、少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０ヌクレオチド以上の長さを有する。
別の好ましい実施形態では、ｍｉＲＮＡ分子又はその等価物若しくは模倣物若しくはイソｍｉＲは、表５及び７において配列番号３４８〜３７８、６１〜１１５及び３７９〜３８１として同定される所定のシード配列に存在する７ヌクレオチドのうち少なくとも６ヌクレオチドを含み、表５において同定される成熟配列全体にわたって少なくとも７０％の同一性を有する（表５は、本明細書において配列番号２２〜５２として同定されるｍｉＲＮＡのそれぞれの好ましい成熟又は模倣配列を示す）。好ましくは、同一性は、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％又は１００％である。
したがって、好ましいｍｉＲＮＡ−５７４分子又はその等価物若しくは模倣物若しくはイソｍｉＲは、配列番号３５３、３５４、７８、７９、８０、８２、８３及び／若しくは８４として同定されるシード配列に存在する７ヌクレオチドのうち少なくとも６ヌクレオチドを含み、並びに／又は配列番号２７、２８、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４及び／若しくは２０５にわたって少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％の同一性を有する。
したがって、好ましいｍｉＲＮＡ−７分子又はその等価物若しくは模倣物若しくはイソｍｉＲは、配列番号３４８、３４９、３５０、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７１、７２、７３及び／若しくは７４として同定されるシード配列に存在する７ヌクレオチドのうち少なくとも６ヌクレオチドを含み、並びに／又は配列番号２２、２３、２４、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７，１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６及び／若しくは１７７にわたって少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％の同一性を有する。
したがって、好ましいｍｉＲＮＡ−１９０ｂ分子又はその等価物若しくは模倣物若しくはイソｍｉＲは、配列番号３７４及び／若しくは９６として同定されるシード配列に存在する７ヌクレオチドのうち少なくとも６ヌクレオチドを含み、並びに／又は配列番号４８、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９及び／若しくは２４０にわたって少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％の同一性を有する。
したがって、好ましいｍｉＲＮＡ−１４２分子又はその等価物若しくは模倣物若しくはイソｍｉＲは、配列番号３７５、３７６、９７、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９及び／若しくは１１０として同定されるシード配列に存在する７ヌクレオチドのうち少なくとも６ヌクレオチドを含み、並びに／又は配列番号４９、５０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８及び／若しくは２８９にわたって少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％の同一性を有する。
したがって、好ましいｍｉＲＮＡ−９分子又はその等価物若しくは模倣物若しくはイソｍｉＲは、配列番号３７７、３７８、１１４、１１５、３７９、３８０及び／又は３８１として同定されるシード配列に存在する７ヌクレオチドのうち少なくとも６ヌクレオチドを含み、配列番号５１、５２、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３８２、３８３、３８４、３８５、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５及び／又は３９６にわたって少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有する。
より好ましい実施形態では、ｍｉＲＮＡ−９分子又はその等価物若しくは模倣物若しくはイソｍｉＲは、ｍｉＲＮＡ−９＊分子又はその等価物若しくは模倣物若しくはイソｍｉＲとして同定され、配列番号３７８、１１４及び／又は１１５として同定されるシード配列に存在する７ヌクレオチドのうち少なくとも６ヌクレオチドを含み、配列番号５２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３及び／又は３０４にわたって少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有する。
好ましくは本実施形態では、ｍｉＲＮＡ分子又はその等価物若しくは模倣物若しくはイソｍｉＲは、少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０ヌクレオチド以上の長さを有し、表５及び７で配列番号３４８〜３７８、６１〜１１５及び３７９〜３８１として同定されるシード配列に存在する７ヌクレオチドのうち少なくとも６ヌクレオチドを含み、表５で配列番号２２〜５２として同定される成熟配列全体にわたって少なくとも７０％の同一性を有する。好ましくは、同一性は、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％又は１００％である。
代わりに、好ましくは本実施形態では、ｍｉＲＮＡ分子又はその等価物若しくは模倣物若しくはイソｍｉＲは、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７，１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０以下のヌクレオチドの長さを有し、表５及び７で配列番号３４８〜３７８、６１〜１１５及び３７９〜３８１として同定される所定のシード配列に存在する７ヌクレオチドのうち少なくとも６ヌクレオチドを含み、表５で配列番号２２〜５２として同定される成熟配列全体にわたって少なくとも７０％の同一性を有する。好ましくは、同一性は、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％又は１００％である。
別の好ましい実施形態では、ｍｉＲＮＡ分子のイソｍｉＲは、イソｍｉＲ配列全体にわたって少なくとも７０％の同一性を有する（表７は、配列番号１１６〜３０４及び３８２〜３９６として同定される成熟ｍｉＲＮＡのそれぞれの好ましいイソｍｉＲを示す）。好ましくは、同一性は、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％以上である。好ましくは本実施形態では、ｍｉＲＮＡ分子のイソｍｉＲ又はその等価物又は模倣物は、少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０ヌクレオチド以上の長さを有する。
したがって、好ましいｍｉＲＮＡ−５７４分子又はその等価物若しくは模倣物若しくはイソｍｉＲは、配列番号３５３、３５４、７８、７９、８０、８２、８３及び／若しくは８４として同定されるシード配列に存在する７ヌクレオチドのうち少なくとも６ヌクレオチドを含み、並びに／又は配列番号２７、２８、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４及び／若しくは２０５にわたって少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％の同一性を有し、並びに／又は少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０ヌクレオチド以上の長さを有する。
したがって、好ましいｍｉＲＮＡ−７分子又はその等価物若しくは模倣物若しくはイソｍｉＲは、配列番号３４８、３４９、３５０、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７１、７２、７３及び／若しくは７４として同定されるシード配列に存在する７ヌクレオチドのうち少なくとも６ヌクレオチドを含み、並びに／又は配列番号２２、２３、２４、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６及び／若しくは１７７にわたって少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％の同一性を有し、並びに／又は少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０ヌクレオチド以上の長さを有する。
したがって、好ましいｍｉＲＮＡ−１９０ｂ分子又はその等価物若しくは模倣物若しくはイソｍｉＲは、配列番号３７４及び／若しくは９６として同定されるシード配列に存在する７ヌクレオチドのうち少なくとも６ヌクレオチドを含み、並びに／又は配列番号４８、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９及び／若しくは２４０にわたって少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％の同一性を有し、並びに／又は少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０ヌクレオチド以上の長さを有する。
したがって、好ましいｍｉＲＮＡ−１４２分子又はその等価物若しくは模倣物若しくはイソｍｉＲは、配列番号３７５、３７６、９７、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９及び／若しくは１１０として同定されるシード配列に存在する７ヌクレオチドのうち少なくとも６ヌクレオチドを含み、並びに／又は配列番号４９、５０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８及び／若しくは２８９にわたって少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％の同一性を有し、並びに／又は少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０ヌクレオチド以上の長さを有する。
したがって、好ましいｍｉＲＮＡ−９分子又はその等価物若しくは模倣物若しくはイソｍｉＲは、配列番号３７７、３７８、１１４、１１５、３７９、３８０及び／若しくは３８１として同定されるシード配列に存在する７ヌクレオチドのうち少なくとも６ヌクレオチドを含み、配列番号５１、５２、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３８２、３８３、３８４、３８５、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５及び／若しくは３９６にわたって少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％の同一性を有し、並びに／又は少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０ヌクレオチド以上の長さを有する。
より好ましい実施形態では、ｍｉＲＮＡ−９分子又はその等価物若しくは模倣物若しくはイソｍｉＲは、ｍｉＲＮＡ−９＊分子又はその等価物若しくは模倣物若しくはイソｍｉＲとして同定され、配列番号３７８、１１４及び／若しくは１１５として同定されるシード配列に存在する７ヌクレオチドのうち少なくとも６ヌクレオチドを含み、配列番号５２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３及び／若しくは３０４にわたって少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％の同一性を有し、並びに／又は少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０ヌクレオチド以上の長さを有する。
別の好ましいｍｉＲＮＡ分子又はその等価物若しくは模倣物若しくはイソｍｉＲは、シード配列（表５及び７で配列番号３４８〜３７８、６１〜１１５及び３７９〜３８１として同定される）又は成熟配列（表５で配列番号２２〜５２として同定される）又は前駆配列（表４で配列番号１〜２１として同定される）又はＲＮＡ前駆体をコードするＤＮＡ（表６で配列番号５３〜６０として同定される）又はイソｍｉＲ配列（表７で配列番号１１６〜３０４及び３８２〜３９６として同定される）と少なくとも６０％の同一性を有する。同一性は、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％又は１００％であってもよい。同一性は、好ましくは、所定の表で同定される配列番号全体において評価する。しかし、同一性は、所定の配列番号の一部分において評価してもよい。一部分とは、配列番号の長さの少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％又は１００％を意味し得る。
ｍｉＲＮＡ分子の等価物は、イソｍｉＲ又は模倣物であってもよい。前駆配列は、成熟プロセスに依存して、１より多いイソｍｉＲ配列をもたらすことがある（例えばあるいくつかの組織において多重のイソｍｉＲが同定されているｍｉＲＮＡ−２６ｂ、ｍｉＲＮＡ−１３２、ｍｉＲＮＡ−１２６又はｍｉＲＮＡ−１４２を参照されたい（表７））。模倣物は、ｍｉＲＮＡ分子と同様又は同一の活性を有する分子である。この関係において、同様の活性は、許容されるレベルの活性と同じ意味である。模倣物は、機能の決定において、アンタゴｍｉｒに対向する。ｍｉＲＮＡ分子又はその等価物若しくは供給源のアンタゴｍｉｒは、よって、それが由来する対応するｍｉＲＮＡ分子の１つに対向するか又は逆である活性を有する分子である。ｍｉＲＮＡ分子又はその等価物のアンタゴｍｉｒは、よって、前記ｍｉＲＮＡ分子又はその等価物の活性を拮抗させるか又はサイレンシングするか又は減少させることができる分子として定義することもできる。それが由来する対応するｍｉＲＮＡ分子の１つに対向するか若しくは逆である活性、又はそれが由来する前記ｍｉＲＮＡ分子の活性を拮抗できる活性は、好ましくは、前記ｍｉＲＮＡ分子、その等価物又は供給源の活性を減少できる活性である。この関係において、減少は、前記ｍｉＲＮＡ分子又はその等価物若しくは供給源の活性の少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％又は１００％減少を意味する。
ｍｉＲＮＡ分子又はその等価物若しくは供給源のアンタゴｍｉｒは、対応するｍｉＲＮＡ分子又はその等価物の一部分に対して相補的である核酸、好ましくはＲＮＡであってもよい。好ましいアンタゴｍｉｒは、表５で配列番号２２〜５２として又は表７で配列番号１１６〜３０４及び３８２〜３９６として同定される成熟ｍｉＲＮＡ又はイソｍｉＲの配列の一部分に対して相補的である。一部分とは、配列番号の長さの少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％又は１００％を意味し得る。好ましい実施形態では、アンタゴｍｉｒ又はその等価物は、ｍｉＲＮＡ分子若しくはその等価物のシード配列又は前記シード配列の一部分に対して相補的である。一部分とは、シード配列の長さの少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％又は１００％を意味し得る。
好ましくは、アンタゴｍｉｒは、８〜３０ヌクレオチド長、好ましくは１０〜３０ヌクレオチド長、好ましくは１２〜２８ヌクレオチド長であり、より好ましくは、前記分子は、少なくとも８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０ヌクレオチド以上の長さを有し、表５（配列番号２２〜５２として）又は表７（配列番号１１６〜３０４及び３８２〜３９６として）で同定される成熟ｍｉＲＮＡ又はイソｍｉＲの配列の一部分に対して相補的である。一部分とは、所定の配列の長さの少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％又は１００％を意味し得る。
好ましくは、アンタゴｍｉｒは、８〜３０ヌクレオチド長、好ましくは１０〜３０ヌクレオチド長、好ましくは１２〜２８ヌクレオチド長であり、より好ましくは、前記分子は、少なくとも８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０ヌクレオチド以上の長さを有し、シード配列（表５及び７で配列番号３４８〜３７８、６１〜１１５及び３７９〜３８１として同定される）の一部分に対して相補的である。一部分とは、シード配列の長さの少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％又は１００％を意味し得る．
好ましくは、アンタゴｍｉｒ又はその等価物は、アンタゴｍｉｒ配列（表８で配列番号３０５〜３１０として同定される）と少なくとも６０％の同一性を有する。同一性は、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％又は１００％であってもよい。同一性は、好ましくは、表８で同定される配列番号全体において評価する。しかし、同一性は、所定の配列番号の一部分において評価してもよい。一部分とは、配列番号の長さの少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％又は１００％を意味し得る。
好ましくは、アンタゴｍｉｒは、８〜３０ヌクレオチド長、好ましくは１２〜２８ヌクレオチド長であり、より好ましくは、前記分子は、少なくとも８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０ヌクレオチド以上の長さを有し、アンタゴｍｉｒ配列（表８で配列番号３０５〜３１０として同定される）と少なくとも６０％の同一性を有する。同一性は、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％又は１００％であってもよい。同一性は、好ましくは、表８で同定される配列番号全体において評価する。しかし、同一性は、所定の配列番号の一部分において評価してもよい。一部分とは、配列番号の長さの少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％又は１００％を意味し得る。
ｍｉＲＮＡ分子又はその等価物若しくは供給源のアンタゴｍｉｒのヌクレオチドの化学構造は、安定性、結合親和性及び／又は特異性を増加させるために修飾してもよい。前記アンタゴｍｉｒは、ＲＮＡ分子若しくは好ましくは修飾ＲＮＡ分子を含むか又はそれからなることができる。好ましい修飾ＲＮＡ分子は、修飾糖を含む。このような修飾の一例は、２’−Ｏ−メチル若しくは２’−Ｏ−メトキシエチル基又は２’フッ化物基を核酸に導入して、ヌクレアーゼ耐性及びＲＮＡに対する結合親和性を改善することである。このような修飾の別の例は、核酸の２’−Ｏ原子と４’−Ｃ原子とを接続するメチレンブリッジを導入して立体構造を固定し（ロックド核酸（ＬＮＡ））、相補的１本鎖ＲＮＡに対する親和性を改善することである。第３の例は、ホスホロチオエート基を、ＲＮＡ鎖中の核酸の間にリンカーとして導入して、ヌクレアーゼ攻撃に対する安定性を改善することである。第４の修飾は、分子の３’端にコレステロールのような親油性部分をコンジュゲートして、安定性及び細胞性送達を改善することである。好ましい実施形態では、ｍｉＲＮＡ分子のアンタゴｍｉｒは、Ｏｂａｄらに記載されるように極小ＬＮＡと命名された完全にＬＮＡで修飾されたホスホロチオエートオリゴヌクレオチドからなる。本明細書で定義するアンタゴｍｉｒは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上の糖修飾を含んでもよい。本発明は、１つのアンタゴｍｉｒ中に１より多い異なる糖修飾を導入することも包含する。
本明細書で同定されるｍｉＲＮＡ分子又はその等価物若しくは模倣物若しくはイソｍｉＲのそれぞれは、それらが由来する所定のｍｉＲＮＡの許容されるレベルの活性を有する。許容されるレベルの活性は、好ましくは、前記ｍｉＲＮＡ又はその等価物若しくは模倣物若しくはイソｍｉＲが、前記ｍｉＲＮＡの許容されるレベルの前記活性をまだ示すことができることである。所定のｍｉＲＮＡ又はその等価物の活性は、例えば、本明細書において後で定義するように、検出可能な抗血管新生活性を示し、及び／又は新血管新生の減少を誘導する能力である。許容されるレベルの活性は、好ましくは、それらが由来するｍｉＲＮＡの活性の少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％又は１００％である。
本明細書で同定されるｍｉＲＮＡ分子又はその等価物若しくはイソｍｉＲ若しくは模倣物（すなわちｍｉＲＮＡ−５７４、ｍｉＲＮＡ−７、ｍｉＲＮＡ−２６ｂ、ｍｉＲＮＡ−２７ａ、ｍｉＲＮＡ−９２ａ、ｍｉＲＮＡ−２２１、ｍｉＲＮＡ−２２２、ｍｉＲＮＡ−１４５、ｌｅｔ７ａ１、ｍｉＲＮＡ−１９０ｂ、ｍｉＲＮＡ−１４２、ｍｉＲＮＡ−９）のいずれかの好ましい活性は、本明細書において後で定義するように、対象において検出可能な抗血管新生活性を示すこと及び／又は新血管新生の減少を誘導することである。
本明細書で同定されるアンタゴｍｉｒ ｍｉＲＮＡ分子又はその等価物若しくは供給源（すなわちｍｉＲＮＡ−１３２、ｍｉＲＮＡ−１２６及びｍｉＲＮＡ−２１のアンタゴｍｉｒ）のいずれかの好ましい活性は、本明細書において後で定義するように、対象において検出可能な抗血管新生活性を示すこと及び／又は新血管新生の減少を誘導することである。
ｍｉＲＮＡ分子の供給源又はｍｉＲＮＡ分子の等価物、模倣物、イソｍｉＲの供給源は、本明細書で同定されるｍｉＲＮＡ分子又は模倣物又はイソｍｉＲなどの等価物の生成を誘導でき、ヘアピン様構造及び／又は２本鎖核酸分子を含む任意の分子であってもよい。ヘアピン様構造の存在は、８０、１００及び１２０ｎｔ以上のスライディングウィンドウを用いるＲＮＡｓｈａｐｅｓプログラム（Ｓｔｅｆｆｅｎ Ｐ．ら２００６）を用いて評価できる。ヘアピン様構造は、通常、ｍｉＲＮＡ分子の自然又は内因性の供給源に存在し、ここでは、２本鎖核酸分子が、通常、ｍｉＲＮＡ分子若しくはその等価物の組換え又は合成の供給源中に存在する。
ｍｉＲＮＡ分子のアンタゴｍｉｒの供給源又はｍｉＲＮＡ分子のアンタゴｍｉｒの等価物の供給源は、前記アンタゴｍｉｒの生成を誘導できる任意の分子であってもよい。
ｍｉＲＮＡ分子の供給源又はその等価物若しくは模倣物若しくはイソｍｉＲ若しくはアンタゴｍｉｒの供給源は、１本鎖、２本鎖ＲＮＡ若しくは部分的２本鎖ＲＮＡであってもよいか、又は３本鎖（その例は、国際公開第２００８／１０５５８号パンフレットに記載される）を含んでもよい。本明細書で用いる場合、部分的２本鎖とは、５’及び／又は３’端にて１本鎖構造も含む２本鎖構造のことをいう。部分本鎖は、ｍｉＲＮＡ分子の各鎖が同じ長さを有さない場合に生じることがある。一般的に、このような部分的２本鎖ｍｉＲＮＡ分子は、７５％未満の２本鎖構造と、２５％を超える１本鎖構造、又は５０％未満の２本鎖構造と、５０％を超える１本鎖構造、又はより好ましくは２５％、２０％若しくは１５％未満の２本鎖構造と、７５％、８０％、８５％を超える１本鎖構造とを有することがある。
代わりに、ｍｉＲＮＡ分子の供給源又はその等価物若しくは模倣物若しくはイソｍｉＲの供給源は、ｍｉＲＮＡ分子の前駆体又はその等価物若しくは模倣物若しくはイソｍｉＲの前駆体をコードするＤＮＡ分子である。この関係における好ましいＤＮＡ分子は、表６で配列番号５３〜６０として同定される。本発明は、表６で同定される前記配列と少なくとも７０％の同一性を有するｍｉＲＮＡ分子の前駆体をコードするＤＮＡ分子の使用を包含する。好ましくは、同一性は、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％又は１００％である。好ましくは本実施形態では、ＤＮＡ分子は、少なくとも５０、５５、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１３０、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００ヌクレオチド以上の長さを有し、表６で配列番号５３〜６０として同定されるＤＮＡ配列と少なくとも７０％の同一性を有する。
所定のｍｉＲＮＡ分子又はその等価物又は模倣物若しくはイソｍｉＲ又はそのアンタゴｍｉｒの生成の誘導は、好ましくは、前記供給源が、以下で定義するあるアッセイを用いて細胞に導入される場合に得られる。本発明に包含される細胞は、後で定義する。
ｍｉＲＮＡ分子又はその等価物又はその模倣物若しくはイソｍｉＲの好ましい供給源は、その前駆体、より好ましくは、前記ｍｉＲＮＡ分子又はその等価物又はその模倣物若しくはイソｍｉＲをコードする核酸である。好ましい前駆体は、自然に存在する前駆体である。前駆体は、合成又は組換え前駆体であってもよい。
所定のｍｉＲＮＡ分子の好ましい前駆体は、表４で配列番号１〜２１として同定される。本発明は、前記配列と少なくとも７０％の同一性を有するｍｉＲＮＡ分子又はその等価物の前駆体の使用を包含する。好ましくは、同一性は、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％又は１００％である。好ましくは本実施形態では、ＤＮＡ分子は、少なくとも５０、５５、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１３０、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００ヌクレオチド以上の長さを有し、表４で配列番号１〜２１として同定される配列と少なくとも７０％の同一性を有する。
したがって、ｍｉＲＮＡ−５７４分子の好ましい供給源は、配列番号５及び／若しくは５５と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％の同一性を有し、並びに／又は少なくとも５０、５５、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１３０、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００ヌクレオチド以上の長さを有する。
したがって、ｍｉＲＮＡ−７分子の好ましい供給源は、配列番号１、２、３及び／若しくは５３と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％の同一性を有し、並びに／又は少なくとも５０、５５、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１３０、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００ヌクレオチド以上の長さを有する。
したがって、ｍｉＲＮＡ−１９０ｂ分子の好ましい供給源は、配列番号１７及び／若しくは５８と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％の同一性を有し、並びに／又は少なくとも５０、５５、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１３０、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００ヌクレオチド以上の長さを有する。
したがって、ｍｉＲＮＡ−１４２分子の好ましい供給源は、配列番号１８及び／若しくは５９と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％の同一性を有し、並びに／又は少なくとも５０、５５、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１３０、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００ヌクレオチド以上の長さを有する。
したがって、ｍｉＲＮＡ−９分子の好ましい供給源は、配列番号１９、２０、２１及び／若しくは６０と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％の同一性を有し、並びに／又は少なくとも５０、５５、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１３０、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００ヌクレオチド以上の長さを有する。
この関係において、所定の成熟ｍｉＲＮＡ分子のいくつかの前駆体は、同一のｍｉＲＮＡ分子を導くことがあることが指摘される。例えば、ｍｉＲＮＡ−７は、前駆ｍｉＲＮＡ−７−１、ｍｉ−ＲＮＡ７−２又はｍｉＲＮＡ−７−３（好ましくは配列番号１、２又は３として同定される）を起源とすることがある。好ましい実施形態では、ｍｉＲＮＡ−７−３、又はｍｉＲＮＡ−７−３若しくは配列番号３と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％の同一性を有する分子を、ｍｉＲＮＡ−７分子の前駆体として用いる。
好ましい供給源又は前駆体は、本明細書において後で定義する。好ましい供給源は、前記ｍｉＲＮＡの前記前駆体をコードする核酸、すなわちＤＮＡを含む発現構築物を含み（ｉｎｃｌｕｄｅｓ or ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）、より好ましくは、前記発現構築物は、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス及びレトロウイルスに基づく遺伝子治療ベクターから選択されるウイルス遺伝子治療ベクターである。好ましいウイルス遺伝子治療ベクターは、ＡＡＶ又はレンチウイルスベクターである。その他の好ましいベクターは、腫瘍退縮ウイルスベクターである。このようなベクターを、本明細書において以下にさらに記載する。
代わりに、供給源は、一般的な定義についての部でさらに定義するように、合成ｍｉＲＮＡ分子又は化学模倣物であってもよい。
ｍｉＲＮＡ分子又は模倣物若しくはイソｍｉＲのようなその等価物の存在、或いはｍｉＲＮＡ分子若しくはその等価物のアンタゴｍｉｒの存在の検出は、当業者に知られる任意の技術を用いて行うことができる。そのような分子の発現レベル又は存在の評価は、好ましくは、（リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応）ｑＰＣＲ、マイクロアレイ、ビーズアレイ、ＲＮアーゼプロテクション分析若しくはノザンブロット分析又はクローニング及び配列決定のような古典的な分子生物学的技術を用いて行う。当業者は、ｍｉＲＮＡ分子又はその等価物の定量の代わりに又は該定量と組み合わせて、対応するｍｉＲＮＡ分子若しくはその等価物の機能と関連することが知られている任意の化合物の前記ｍｉＲＮＡ分子若しくは前記等価物の基質の定量、又は特異的アッセイを用いる前記ｍｉＲＮＡ分子若しくは前記等価物の機能又は活性の定量が、本発明の範囲内に包含されることを理解している。同じことが、ｍｉＲＮＡ分子のアンタゴｍｉｒについても当てはまる。
好ましい組成物及び製剤は全て、本明細書において後で定義する。ｍｉＲＮＡ分子又はその等価物又はその模倣物若しくはイソｍｉＲ若しくはアンタゴｍｉｒは、ネイキッド分子などとして、化学修飾あり若しくはなしで、又は粒子中に被包して若しくはある部分とコンジュゲートして用いてもよい。好ましい組成物は、ナノ粒子又はリポソーム構造中に被包されたｍｉＲＮＡ分子又はその等価物又はその模倣物若しくはイソｍｉＲ若しくはアンタゴｍｉｒを含む。ｍｉＲＮＡ分子又はその等価物又はその模倣物若しくはイソｍｉＲ若しくはアンタゴｍｉｒは、アプタマー−ｍｉＲＮＡハイブリッドであってもよい。アプタマー−ｍｉＲＮＡは、ＲＮＡ（又はＤＮＡ）オリゴヌクレオチド（アプタマー−ｍｉＲＮＡハイブリッド分子を細胞表面タンパク質（例えば環状ＲＧＤペプチド（環状アルギニン（Ｒ）−グリシン（Ｇ）−アスパラギン酸（Ｄ）ペプチド）に向ける高次構造を採用する）と連結されたｍｉＲＮＡと定義される。アプタマータグ付加されたｍｉＲＮＡは、例えばポリエチレングリコール（キメラの循環半減期を増加させる）と連結させることができる（Ｄａｓｓｉｅ，Ｊ．Ｐ．ら２００９）。
全て本明細書で定義する所定のｍｉＲＮＡ又は模倣物、イソｍｉＲのようなその等価物又はその対応する供給源の活性、或いはｍｉＲＮＡ分子若しくはその等価物の所定のアンタゴｍｉｒ又はその対応する供給源の活性は、好ましくは、検出可能な抗血管新生活性を示し、及び／又は新血管新生の減少を誘導する能力である。本発明の関係のうちで、抗血管新生活性は、以下の少なくとも１つ：
新血管新生の低減又は減少、
血管の正常化、及び
患部での血管数の低減
を含むことがあるか、又は含む(may comprise or comprises)。
このような検出可能な抗血管新生活性を示すこと及び／又は新血管新生のこのような低減若しくは減少を誘導することは、新血管新生及び／又は新血管新生と関連する任意の疾患若しくは状態を予防、遅延、治癒及び／又は治療できるために、本発明において重要である。新血管新生が関与若しくは関連する任意の疾患又は状態は、本明細書で定義する分子を用いて予防、遅延、治癒及び／又は治療できる。本発明の疾患又は状態において、新血管新生は、疾患又は状態の発症前、すなわち前記疾患又は状態の症状の出現前に検出できる。本発明は、新血管新生が、前記疾患又は状態が進展する間、すなわち前記疾患又は状態の症状の出現後に検出可能であることをさらに包含する。
血管新生は、現存する毛細管からの新しい微小血管の成長と定義される。血管新生は、胚性成長中の新脈管形成のことをいう脈管新生（脈管新生では、より大きい血管が形成され、ＥＰＣ細胞が脈管新生に参加する）とは区別されることがある。しかし、ＥＰＣは、腫瘍血管新生においても役割を演じ得るという証拠がある。血管新生は、側副血管の成熟及び成長に主に関与する動脈新生とも区別できる（Ａｓａｈａｒａ Ｓ．ら１９９９、Ｃａｒｍｅｌｉｅｔ Ｐ．２０００及びＨｅｌｉｓｃｈ Ａ．ら２００３）。血管新生は、創傷治癒、炎症及び女性の生殖周期のような生理的プロセス中に新しい血管を形成する主要な機構である。本発明の関係において、新血管新生は、これが生理的でないか若しくは病原的である疾患又は状態に関与する場合に、血管新生と定義する。
新血管新生は、当業者に公知の任意の技術を用いて検出できる。
新血管新生は、患者においてｉｎ ｓｉｔｕで、又は腫瘍において、ＰＥＴ（陽電子放射型断層撮影法）、ＭＲＩ（核磁気共鳴画像法）（ダイナミック造影、ＤＣＥ−ＭＲＩ）又はＣＴ（コンピュータ断層撮影）画像法のような非侵襲性の技術により評価できる。これらの技術は、腫瘍における脈管構造の漏出の増加に基づいて腫瘍量を監視するために用いることができる。ＭＲＩ又はＰＥＴを用いて、α５β３−インテグリン、血漿ＶＥＧＦ又はｂＦＧＦのような血管新生マーカーの存在を追跡できる。
代わりに、新血管新生は、腫瘍生検又は切片と、その後の内皮細胞についての免疫組織化学的分析とを用いて、それらの活性を評価し、該活性を、健常対象からの正常内皮細胞又は前記患者からであるが体の異なる場所にて単離された内皮細胞の活性と比較することにより評価できる。このような免疫組織化学的分析は、抗ＣＤ３１及び抗ＣＤ３４のような内皮細胞共通抗体を用いて行って、微小血管密度を評価できる。組織切片は、増殖マーカーと組み合わせて内皮細胞についてのマーカーを用いて染色して、組織における腫瘍内皮細胞と腫瘍増殖細胞との間の比率を調べることができる。内皮マーカーの例は、ＣＤ３１又はＣＤ３４である。増殖マーカーの例は、Ｋｉ６７である。Ｋｉ−６７は、所定の細胞集団における成長画分を決定するための優れたマーカーである。
Ｋｉ−６７陽性腫瘍細胞の画分（Ｋｉ−６７標識インデックス）は、がんの臨床経過としばしば相関する。微小血管密度（ＭＶＤ）は、好ましくは、実施例１３（図１３）のような抗ＣＤ３１を用いて染色した腫瘍切片において、ＭＶＤを定量するために染色の強度を用いて評価する。
ＭＶＤの定量は、好ましくは、腫瘍切片当たり４〜５の代表的な画像において陽性に染色された管腔構造を計数することにより行う。腫瘍切片当たり少なくとも４〜５の代表的な画像において評価されたＭＶＤの減少、好ましくは著しい減少が、好ましくは、投与された分子が抗血管新生活性を有するか又は新血管新生の減少を誘導できることの表れとして観察される。
新血管新生は、細胞、好ましくは腫瘍、健常対象又は内皮株化細胞からの内皮細胞を用いて評価することもできる。腫瘍からの内皮細胞は、好ましくは、腫瘍内皮と称する。腫瘍内皮は、内皮マーカーとしてＣＤ３１を用いる、腫瘍組織のＦＡＣＳ（蛍光標示式細胞分取）により単離できる。単離は、ｖａｎ Ｂｅｉｊｎｕｍら２００８に記載されるようにして行うことができる。ｉｎ ｖｉｔｒｏでの新血管新生を評価するための好ましい内皮細胞は、実験部で用いるように、ＨＵＶＥＣ及びＲＦ２４である。ｉｎ ｖｉｔｒｏでの新血管新生活性の評価は、内皮細胞の増殖活性の評価であるＭＴＳ（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム）アッセイを用いて行うことができる。好ましくは、ＭＴＳアッセイを行い、このＭＴＳアッセイの結果を、実験部に記載するようにして分析する。しかし、ＭＴＴ（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド）、クリスタルバイオレット及びＷＳＴ−１（水溶性テトラゾリウム）のような当業者に知られるその他の生存性アッセイを用いてもよい。
さらに、球状体発芽アッセイ及びマトリゲル管形成アッセイのようなその他の型のアッセイを、第２選択(second line)活性アッセイとして用いることができる。マトリゲル管形成アッセイにおいて、細胞、特に内皮細胞を、合成の半自然ゲル基質（例えばＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓｏｒコラーゲンゲルからのマトリゲル、フィブリンゲルの場合もある）上に播種する。両方のアッセイでは、内皮細胞、好ましくはＨＵＶＥＣを用いる。ある期間の後に、細胞培養物の状態に依存して、細胞は、管状構造を形成し始める。管状構造の形成は、新しい血管の発生に向かう第１ステップとみなされる。読出しパラメータは、単位面積当たりの血管節の数である。球状体発芽アッセイについて、細胞球状体（例えば内皮細胞）を、ゲル（例えばマトリゲル及びコラーゲンゲル）上に置く。ある期間の後に、新芽形成が観察できる。発芽の程度は、細胞の血管新生能の評価のための基準とみなされる。読出しパラメータは、球状体当たりの新芽の数である。単位面積当たりの血管節の数、球状体当たりのそれぞれの新芽の数が、単位面積当たりの血管節の対応する数、処理細胞での球状体当たりの新芽の数に対する未処理細胞での球状体当たりのそれぞれの新芽の数と比較して、所定の期間にわたって低減又は減少する場合に、抗血管新生活性が存在し得る。減少又は低減は、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％の減少であってよい。好ましくは、所定の期間内に、単位面積当たりに血管節が検出できず、球状体当たりそれぞれ新芽が検出できない。
血管の正常化が可視化され、及び／又は患部での血管の数が低減する場合にも、腫瘍組織での抗血管新生活性が存在し得る。
好ましい実施形態では、処理の着手時の血管の数と比較して患部での血管の数が減少していることが見出されることにより直ちに、抗血管新生活性が検出可能である。減少は、患部での血管の数の検出可能な減少、又は患部での血管の５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％の減少であってもよい。患部は、腫瘍領域に近接している周囲組織を含む腫瘍の領域である。この関係における近接とは、数センチメートルまでを意味し得る。血管の正常化は、好ましくは、血管又は微小血管の３次元構造の変化である。例えば、腫瘍内皮での新血管新生活性と関連する病的血管又は微小血管は、対照血管又は微小血管よりも規則性が低く、及び／又はより蛇行しているように見え、及び／又はより漏出性であるように見えることがある。対照血管は、健常個体からの血管又は患者からであるが、前記患者からの患部にあるものではない血管であってもよい。好ましい実施形態では、血管の３次元構造が、対照血管よりも規則性が高く、あまり蛇行しておらず、及び／又は漏出性が低いと観察されることにより直ちに、抗血管新生活性が検出されたという。好ましくは、処理の着手時よりも不規則性、蛇行性、及び／又は漏出性が低い血管が患部で検出される。より好ましくは、より低いとは、５％低い、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％低いことを意味する。最も好ましくは、不規則性、蛇行性、及び／又は漏出性の血管は、患部で観察されない。患部での血管及び／又は血管の数の正常化は、ＰＥＴ、ＭＲＩ又はＣＴ画像法のような非侵襲性画像技術を用いて評価してもよい。
新血管新生と関連する眼疾患又は状態の場合では、試験される薬物により誘導される検出可能な抗血管新生活性及び／又は新血管新生の低減若しくは減少を評価するためのいくつかのアッセイが開発されている。これらの異なる疾患モデルでは、血管新生は、機械的刺激（ブルッフ膜のレーザ誘発破裂）のような異なる刺激により（Ｓｈｅｎら、２００６ Ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ．１３、２２５〜２３４頁）又はトランスジェニックマウスにおけるｖＥＧＦのような特異的血管成長因子の過剰発現により（Ｍｉｋｉら、２００９、Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ．２００９年９月１１６（９）：１７４８〜１７５４頁）誘発できる。検出可能な抗血管新生活性及び／又は血管新生の低減若しくは減少を、本明細書で同定されるｍｉＲＮＡ分子、その等価物又は供給源を用いて評価するならば、そのようなｍｉＲＮＡ分子、その等価物若しくは供給源は、新血管新生又は新血管新生と関連する疾患若しくは状態を予防、治療、回復、治癒及び／又は遅延するための医薬品として用いられるという。
新血管新生及び／又は抗血管新生活性の評価は、周期的、例えば毎週、毎月行ってもよい。新血管新生及び／又は抗血管新生活性の存在の増加／減少は、よって、周期的、例えば毎週、毎月評価してもよい。この評価は、好ましくは、所定の対象についていくつかの時点にて、又は所定の対象及び健常対象について１回若しくはいくつかの時点にて行う。評価は、規則的な時間間隔にて、例えば毎週、毎月行ってもよい。評価は、よって、規則的に、例えば毎週、毎月行ってもよい。新血管新生又は血管新生活性の１回の評価が、新血管新生の減少又は抗血管新生活性の存在の発見を導く場合、ｍｉＲＮＡ分子、等価物、模倣物、そのイソｍｉＲ若しくはその供給源或いはそのアンタゴｍｉｒ又は等価物若しくは供給源は、検出可能な抗血管新生活性を示し、及び／又は新血管新生の低減若しくは減少を誘導するという。
新血管新生活性の検出可能な減少及び／又は抗血管新生活性の存在は、好ましくは、少なくとも１つの時点で、新血管新生の減少及び／又は抗血管新生活性の存在が検出された場合に検出される。好ましくは、新血管新生の減少及び／又は抗血管新生活性の存在は、少なくとも２、３、４、５つの時点で検出される。
本発明は、新血管新生又は新血管新生と関連する疾患若しくは状態を予防、治療、回復、治癒及び／又は遅延するための医薬品として好ましくは用いるための、ｍｉＲＮＡ−９、ｍｉＲＮＡ−５７４、ｍｉＲＮＡ−７、ｍｉＲＮＡ−１９０ｂ及び／若しくはｍｉＲＮＡ−１４２分子、その等価物又は供給源、或いは前記ｍｉＲＮＡ−９、ｍｉＲＮＡ−５７４、ｍｉＲＮＡ−７、ｍｉＲＮＡ−１９０ｂ及び／若しくはｍｉＲＮＡ−１４２分子、その前記等価物又は前記供給源を含む組成物を提供する。
ｍｉＲＮＡ−１９０ｂ分子又はその等価物若しくは模倣物若しくはイソｍｉＲが、検出可能な抗血管新生活性を示し、及び／又は新血管新生の減少を誘導できることが、実施例７及び実施例８で証明するように、驚くべきことに見出された。
ｍｉＲＮＡ−１４２分子又はその等価物若しくは模倣物若しくはイソｍｉＲが、検出可能な抗血管新生活性を示し、及び／又は新血管新生の減少を誘導できることが、実施例７及び実施例８で証明するように、驚くべきことに見出された。
ｍｉＲＮＡ−９＊分子又はその等価物若しくは模倣物若しくはイソｍｉＲが、検出可能な抗血管新生活性を示し、及び／又は新血管新生の減少を誘導できることが、実施例９、実施例１０及び実施例１２で証明するように、驚くべきことに見出された。
ｍｉＲＮＡ−７分子又はその等価物若しくは模倣物若しくはイソｍｉＲが、検出可能な抗血管新生活性を示し、及び／又は新血管新生の減少を誘導できることが、実施例７、実施例１１及び実施例１２で証明するように、驚くべきことに見出された。
ｍｉＲＮＡ−５７４分子又はその等価物若しくは模倣物若しくはイソｍｉＲが、検出可能な抗血管新生活性を示し、及び／又は新血管新生の減少を誘導できることが、実施例７、実施例１１及び実施例１２で証明するように、驚くべきことに見出された。
好ましくは、ｍｉＲＮＡ−９、ｍｉＲＮＡ−５７４、ｍｉＲＮＡ−７、ｍｉＲＮＡ−１９０ｂ及び／若しくはｍｉＲＮＡ−１４２分子又はその等価物若しくは供給源は、前記分子が検出可能な抗血管新生活性を示すか又は新血管新生の減少を誘導する場合に、新血管新生又は新血管新生と関連する疾患若しくは状態を予防、治療、回復、治癒及び／又は遅延できる。本発明全体を通して、検出可能な抗血管新生活性を示す分子は、新血管新生の減少を誘導する分子と同義である。好ましくは、新血管新生の減少は、著しい減少、好ましくは新血管新生の少なくとも５％の減少を意味する。新血管新生の減少は、本明細書において早くに述べたアッセイのいずれを用いて評価してもよい。対象での新血管新生活性の存在は、腫瘍、健常対象からの内皮細胞で評価してもよい。腫瘍からの内皮細胞は、腫瘍内皮と称することもある。活性の評価は、本明細書において早くに定義したように、微小血管密度を評価するための、抗ＣＤ３１及び抗ＣＤ３４のような内皮細胞共通抗体を用いる免疫組織化学的分析により行ってもよい。
新血管新生活性のこのような減少は、処理の開始後の所定の時点での対象からの内皮細胞での前記新血管新生活性を、処理の着手前の同じ対象からの内皮細胞からの対応する活性と比較することにより測定してもよい。
より好ましくは、減少は、少なくとも１０％、さらにより好ましくは少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも７０％、少なくとも９０％又は１００％の減少を意味する。
この場合、新血管新生活性は検出可能でない。
新血管新生、或いは新血管新生が関与するか若しくは新血管新生と関連する疾患又は状態は、異常又は過剰又は不要な新脈管形成が生じる任意の疾患又は状態である。例えば、異常又は過剰な新血管新生は、様々な眼疾患において生じ、ここでは、新血管新生が、出血及び眼の機能的障害をもたらすことがあり、未熟児網膜症、糖尿病網膜症、網膜静脈閉塞症、加齢黄斑変性及びその他の眼疾患と関連する視力の喪失に寄与する（例えばＹｏｓｈｉｄａら、１９９９、Ｈｉｓｔｏｌ Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌ．１４（４）：１２８７〜９４頁を参照されたい）。これらの状態は、失明の主な原因である（Ａｉｅｌｌｏ、１９９７、Ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ Ｒｅｓ．２９（５）：３５４〜６２頁）。過剰血管新生も、関節リウマチ及び乾癬のような他の疾患状態において役割を演じる。
さらに、新血管新生は、腫瘍の成長及び転移において重要な役割を演じる。実際に、いくつかの血管新生阻害剤が、がんの治療において臨床的に用いられる。よって、新血管新生が関与するか若しくは新血管新生と関連する状態又は疾患は、がんであってもよい。
好ましい実施形態では、新血管新生が関与するか若しくは新血管新生と関連する疾患又は状態は、がん（例えば悪性、転移性）、加齢黄斑変性、糖尿病網膜症、網膜静脈閉塞症を含む障害のような眼疾患、又は関節リウマチ、乾癬、子宮内膜症又は炎症が存在するその他の疾患若しくは状態である（Ｃａｒｍｅｌｉｅｔ Ｐ．ら２００５及びＧｒｉｆｆｉｏｅｎ Ａ．Ｗ．ら、２０００）。本発明の好ましい実施形態のがんは、上皮起源若しくは神経起源のがん、又は癌、又は固形腫瘍、又は肉腫、又は白血病若しくはリンパ腫のような液性腫瘍を含む。がん細胞は、膀胱、脳、乳房、結腸、食道、胃腸、頭部、腎臓、肝臓、肺、上咽頭、頸部、卵巣、前立腺、皮膚、胃、精巣、舌、神経細胞又は子宮からであってもよい。さらに、がんは、それらに限定されないが、具体的に、以下の組織学的な型のものであってもよい：新生物、悪性、癌、未分化癌、巨細胞及び紡錘細胞癌、小細胞癌、毛母基質癌、移行上皮癌、乳頭移行上皮癌、腺癌、ガストリノーマ、悪性、胆管細胞癌、肝細胞癌、肝細胞癌と胆管細胞癌の複合、小柱性腺癌、腺様嚢胞癌、腺腫性ポリープ内の腺癌、腺癌、家族性大腸腺腫症、固形癌、カルチノイド腫瘍、悪性、細気管支肺胞癌、乳頭癌、有棘細胞癌、基底腺癌、乳頭腺癌、嫌色素性癌、酸親和性癌、好酸性腺癌、好塩基性癌、明細胞腺癌、顆粒細胞癌、濾胞性腺癌、乳頭及び濾胞性腺癌、非被包性硬化性癌、副腎皮質癌、類内膜癌；皮膚付属器癌、アポクリン腺癌、皮脂腺癌、耳道腺癌、粘表皮癌、嚢胞腺癌、乳頭嚢胞腺癌、乳頭漿液性嚢胞腺癌、粘液性嚢胞腺癌、粘液性腺癌、印環細胞癌、浸潤性乳管癌、髄様癌、小葉癌、炎症性癌、乳房パジェット病、腺房細胞癌、腺扁平上皮癌、扁平上皮化生を伴う腺癌、悪性卵巣間質腫瘍、及び悪性神経芽腫、セルトリ細胞癌。がんは、神経芽腫であってもよい。
この関係において、白血病は、Ｂ前駆細胞急性リンパ芽球性白血病、Ｔ前駆細胞急性リンパ芽球性白血病、バーキット白血病及び急性混合型白血病のような急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、Ｂ細胞前リンパ球性白血病のような慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、悪性度がより高い疾患、急性前骨髄球性白血病、急性骨髄芽球性白血病及び急性巨核芽球性白血病のような急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性単球性白血病、ヘアリーセル白血病（ＨＣＬ）、Ｔ細胞性前リンパ球性白血病（Ｔ−ＰＬＬ）、大顆粒リンパ球性白血病及び成人Ｔ細胞性白血病のような慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）のいずれかを含む。
この関係において、リンパ腫は、小リンパ球性リンパ腫、リンパ形質細胞性リンパ腫（例えばワルデンストレーム高ガンマグロブリン血症）、脾臓周辺帯リンパ腫、形質細胞骨髄腫、形質細胞腫、節外周辺帯Ｂ細胞リンパ腫（ＭＡＬＴリンパ腫）、節性周辺帯Ｂ細胞リンパ腫（ＮＭＺＬ）、濾胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、縦隔（胸腺）大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、脈管内大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、原発性体液性リンパ腫、バーキットリンパ腫／白血病、Ｔ細胞前リンパ球性白血病、Ｔ細胞大顆粒リンパ球性白血病、中悪性度ＮＫ細胞白血病、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫、鼻型節外ＮＫ／Ｔ細胞リンパ腫、腸症型Ｔ細胞リンパ腫、肝脾Ｔ細胞リンパ腫、芽球型ＮＫ細胞リンパ腫、菌状息肉症／セザリー症候群、原発性皮膚ＣＤ３０陽性Ｔ細胞リンパ増殖性障害、原発性皮膚未分化大細胞リンパ腫、リンパ腫様丘疹症、血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫、末梢性Ｔ細胞リンパ腫、未特定未分化大細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、免疫不全関連リンパ増殖性障害のいずれかを含む。
血管新生抑制化合物を用いて治療されることが既に知られている任意のがんは、本発明の範囲内に包含される。この関係において好ましいがんは、癌、肉腫、白血病及びリンパ腫である。この関係においてより好ましいがんは、結腸、乳房、肺癌並びに腎癌及び神経膠腫である。
対象での新血管新生、又は新血管新生と関連する疾患若しくは症状を特異的に予防、治療、回復、治癒及び／又は遅延するために用いることができる既知の医薬品（血管新生抑制化合物）が、現在、存在する。しかし、これらの処置のそれぞれは、患者において用いるために十分でなく、及び／又は耐性を誘導する治療活性を示す見込みがある。このような治療活性は、好ましくは、このような既知の医薬品（血管新生抑制化合物）が、検出可能な抗血管新生活性を示すことができず、及び／又は新血管新生の減少を誘導できない場合に、患者において用いるために十分でない。これらの特徴のそれぞれは、本明細書で早くに定義した。本発明は、このような欠点を有さないと期待される新しい医薬品を提供する。本発明は、ｍｉＲＮＡ−９、ｍｉＲＮＡ−５７４、ｍｉＲＮＡ−７、ｍｉＲＮＡ−１９０ｂ及び／若しくはｍｉＲＮＡ−１４２分子、その等価物又は供給源、或いは前記ｍｉＲＮＡ−９、ｍｉＲＮＡ−５７４、ｍｉＲＮＡ−７、ｍｉＲＮＡ−１９０ｂ及び／若しくはｍｉＲＮＡ−１４２分子又はその等価物又はその供給源を含む組成物を用いること包含する。この使用は、対象、前記対象の細胞、前記対象の組織又は前記対象の体液における前記ｍｉＲＮＡ−９、ｍｉＲＮＡ−５７４、ｍｉＲＮＡ−７、ｍｉＲＮＡ−１９０ｂ及び／若しくはｍｉＲＮＡ−１４２又はその等価物又はその供給源の活性又は定常状態レベルを、増加、好ましくは薬理学的に増加させることを含む。
本発明の関係のうちで、「アンタゴｍｉｒ又はその等価物又はその前記供給源の活性又は定常状態レベルを増加させる」ことは、「ｍｉＲＮＡ分子又はその等価物の活性又は定常状態レベルを減少させる」ことで置き換えることができる。同じことが、本明細書で同定される他のアンタゴｍｉｒについて当てはまる。
この使用において、前記ｍｉＲＮＡ−９、ｍｉＲＮＡ−５７４、ｍｉＲＮＡ−７、ｍｉＲＮＡ−１９０ｂ及び／若しくはｍｉＲＮＡ−１４２又はその等価物又はその供給源の活性又は定常状態レベルは、検出可能な抗血管新生活性を示し、及び／又は新血管新生の検出可能な減少を誘導するために増加させる。対象での抗血管新生活性及び新血管新生の評価は、本明細書で早くに定義した。
前記ｍｉＲＮＡ−９、ｍｉＲＮＡ−５７４、ｍｉＲＮＡ−７、ｍｉＲＮＡ−１９０ｂ及び／若しくはｍｉＲＮＡ−１４２分子、その模倣物若しくはイソｍｉＲのようなその等価物、又はその供給源の活性又は定常状態レベルは、例えば前記ｍｉＲＮＡ分子又はその等価物を、対象、好ましくは対象の細胞、又は前記対象の組織、又は前記対象の器官、又は前記ｍｉＲＮＡ分子若しくはその等価物が外因性の供給源からである前記対象に与えることにより、前記ｍｉＲＮＡ分子（又はその等価物）自体のレベルにて増加させてもよい。外因性の供給源からのｍｉＲＮＡ分子又はその等価物を与えるために、前記ｍｉＲＮＡ分子又はその等価物は、前記ｍｉＲＮＡ分子若しくはその等価物をコードするか、又は前記ｍｉＲＮＡ分子若しくはその等価物の供給源をコードする核酸を、以下に記載する適切な宿主細胞において発現させるか、又は化学合成により分子を完全に合成することにより簡便に生成できる。
好ましくは、しかし、ｍｉＲＮＡ分子又はその等価物の活性又は定常状態レベルは、前記ｍｉＲＮＡ分子若しくはその等価物をコードするか、又は前記ｍｉＲＮＡ分子若しくはその等価物の供給源をコードするヌクレオチド配列の発現レベルを調節することにより増加させる。好ましくは、ヌクレオチド配列の発現レベルは、前記対象の細胞内又は前記対象の組織内又は前記対象体内において調節する。ｍｉＲＮＡ分子若しくはその等価物又は前記ｍｉＲＮＡ分子若しくはその等価物の供給源の発現レベルは、ｍｉＲＮＡ、及びその等価物又は供給源、又は発現構築物（又はベクター）を、前記対象の細胞、組織、器官若しくは体液に、又は対象に導入して、そのことにより発現ベクターがｍｉＲＮＡ分子若しくはその等価物を含むか又は前記ｍｉＲＮＡ分子若しくはその等価物の供給源を含み、ヌクレオチド配列が前記細胞、組織、器官、対象においてヌクレオチド配列の発現を駆動できるプロモーターの制御下にあるようにすることにより増加させてもよい。ｍｉＲＮＡ分子又はその等価物又はその供給源の発現レベルは、細胞、組織、器官、対象に発現構築物を導入して、そのことにより構築物がｍｉＲＮＡ分子又はその等価物をコードする内因性ヌクレオチド配列のトランス活性化ができる因子をコードするヌクレオチド配列を含むようにすることにより増加させてもよい。
本発明の使用は、好ましくは、本明細書で定義するｍｉＲＮＡ−９、ｍｉＲＮＡ−５７４、ｍｉＲＮＡ−７、ｍｉＲＮＡ−１９０ｂ及び／若しくはｍｉＲＮＡ−１４２分子又は等価物の活性又は定常状態レベルを増加させるための核酸構築物を含む治療有効量の医薬組成物を対象に投与するステップを含む。核酸構築物は、本明細書でさらに具体的に記載するような発現構築物であってもよい。好ましくは、発現構築物は、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、腫瘍退縮ウイルスベクター及びレトロウイルスに基づく遺伝子治療ベクターから選択されるウイルス遺伝子治療ベクターである。好ましいウイルス遺伝子治療ベクターは、ＡＡＶ又はレンチウイルスベクターである。代わりに、本発明の使用は、好ましくは、本明細書で定義するｍｉＲＮＡ−９分子、その等価物又は供給源を含む治療有効量の医薬組成物を対象に投与するステップを含む。
本発明の使用では、細胞、組織、器官又は体液は、好ましくは、新血管新生を示すか、或いは例えばその年齢若しくはその遺伝的背景若しくはその食餌により新血管新生と関連する疾患又は状態を有する高いリスクを有することが疑われる対象からである。代わりに、別の好ましい実施形態では、本発明の使用は、新血管新生と関連する疾患又は状態に後で進展することについての予測されるリスクを有すると診断された対象からの細胞、組織、器官又は体液に対して用いられる。用いられる診断法は、好ましくは、本明細書で記載する本発明のうちの１つである。代わりに、処理される細胞、組織又は器官は、新血管新生と関連する疾患又は状態の増悪のリスクに基づいて選択してもよい。このような増悪のリスクは、当業者に知られる古典的な臨床病理学的基準又はバイオマーカーに基づく予後予測を用いて評価してもよい。本発明は、ｍｉＲＮＡ−９、ｍｉＲＮＡ−５７４、ｍｉＲＮＡ−７、ｍｉＲＮＡ−１９０ｂ及び／若しくはｍｉＲＮＡ−１４２分子又はその等価物又はその前駆体、或いは前記ｍｉＲＮＡ−９、ｍｉＲＮＡ−５７４、ｍｉＲＮＡ−７、ｍｉＲＮＡ−１９０ｂ及び／若しくはｍｉＲＮＡ−１４２分子又はその等価物又はその供給源を含む組成物を、前記対象の組織又は器官に投与することも包含する。器官又は組織は、新血管新生、又は新血管新生と関連する疾患若しくは状態が診断された器官或いは組織に相当することがある。本発明では、好ましい組織は、腫瘍内皮を含むか、又は含有するか、又はそれからなる組織である。本発明では、好ましい器官は、結腸、乳房、肺若しくは腎癌又は神経膠腫の場合に結腸、乳房、肺、腎臓又は脳、或いは上述の前記器官に由来する任意の腫瘍内皮である。腫瘍内皮は、腫瘍組織の境界若しくはその近傍内のいずれかにある腫瘍細胞と関連し、増殖因子、サイトカイン及び／又はホルモンのような腫瘍由来分子シグナルの作用により活性化される内皮細胞を含むか又はそれからなる組織である。この関係において、腫瘍の近傍とは、数センチメートルまでを意味し得る。腫瘍内では、通常、０．１〜５％の細胞が内皮起源である。内皮腫、血管腫及びカポジ肉腫のようないくつかの腫瘍は、内皮細胞を起源とし、起源となる内皮細胞の数は、９９％ほど高くなることができる。
腫瘍内皮は、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％内皮細胞を含む組織であり、好ましくは、これらの細胞は、本明細書で早くに定義したようにして活性化され、前記細胞は、腫瘍組織の境界内又はその近傍のいずれかにある腫瘍組織と関連する。内皮細胞のアイデンティティの評価は、好ましくは、生検から得られた腫瘍組織に対してＣＤ３１及びＣＤ３４のような内皮マーカーを用いるＦＡＣＳ染色細胞を用いて行う。内皮細胞の活性化の評価は、好ましくは、生検から得られた腫瘍組織に対してＫｉ−６７のようなマーカーを用いるＦＡＣＳ染色細胞を用いて行う。好ましい組織は、結腸、乳房、肺癌又は腎癌又は神経膠腫の場合に、結腸、乳房、肺又は腎臓を含む。本発明では、好ましい細胞は、結腸、乳房、肺癌又は腎癌又は神経膠腫の場合に、結腸、乳房、肺又は腎臓に由来する細胞である。この細胞は、腫瘍細胞若しくは内皮細胞であってもよいか、又はそれを含んでもよい。それぞれの場合では、ｍｉＲＮＡ−９、ｍｉＲＮＡ−５７４、ｍｉＲＮＡ−７、ｍｉＲＮＡ−１９０ｂ及び／若しくはｍｉＲＮＡ−１４２分子又はその等価物若しくは供給源は、好ましくは、前記器官、組織に存在する内皮細胞に施用される。前記ｍｉＲＮＡ−９、ｍｉＲＮＡ−５７４、ｍｉＲＮＡ−７、ｍｉＲＮＡ−１９０ｂ及び／若しくはｍｉＲＮＡ−１４２分子又はその等価物若しくは供給源は、好ましくは、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％内皮細胞を含む組織に投与される。前記ｍｉＲＮＡ−９、ｍｉＲＮＡ−５７４、ｍｉＲＮＡ−７、ｍｉＲＮＡ−１９０ｂ及び／若しくはｍｉＲＮＡ−１４２分子又はその等価物若しくは供給源は、内皮細胞を標的にしてもよい。新血管新生と関連する疾患又は状態の治療は、まだ転移していない腫瘍細胞を含有する腫瘍組織において新血管新生を予防するか、又は転移を既に形成し、及び／若しくは原発性腫瘍から体内の遠隔部位に遊走している腫瘍細胞の周囲の新血管新生を減少させる治療を含むことがある。代わりに、又は好ましい定義と組み合わせて、新血管新生と関連する疾患又は状態の治療は、内皮細胞を含有する腫瘍組織において新血管新生を予防する治療を含んでもよい。この好ましい実施形態では、内皮細胞は、前記ｍｉＲＮＡ−９、ｍｉＲＮＡ−５７４、ｍｉＲＮＡ−７、ｍｉＲＮＡ−１９０ｂ及び／若しくはｍｉＲＮＡ−１４２又はその等価物若しくは供給源を、標的化部分と連結又はコンジュゲートすることにより、特異的に標的になる。好ましい標的化部分は、本明細書で同定されるｃＲＧＤ又は内皮細胞上で発現する分子を認識若しくは結合することが知られている任意の分子である。内皮細胞上で発現する好ましい分子は、ＣＤ３１及びＣＤ３４である。
別の使用では、本明細書で言及する本発明は、化学治療、放射線治療又は手術のような、新血管新生と関連する疾患又は状態の標準的な治療と組み合わせてもよい。化学治療剤の例は、本明細書で後に同定される。
遺伝子治療は、新血管新生、又は新血管新生と関連する疾患若しくは状態を予防、治療、回復及び／又は遅延するための可能性であるが、その他の可能性のある治療も構想することがある。例えば、あるいくつかの分子経路を所望の方向に進める「小分子」薬物による治療も好ましい。これらの小分子は、好ましくは、本明細書で後に定義する本発明のスクリーニング方法により同定される。
本発明の関係において、新血管新生と関連する疾患又は状態を予防、治療、回復、治癒及び／又は遅延することは、以下のことを意味することがある:
この疾患又は状態の少なくとも１つの症状の重篤度が低減される、及び／又は
この疾患又は状態と関連する少なくとも１つのパラメータが改善され、好ましくは、このようなパラメータは、新血管新生及び／又は血管新生活性と関連する。
症状は、内皮発芽であってもよい。内皮発芽の存在は、患者においてｉｎ ｓｉｔｕで、又は腫瘍において、新血管新生を評価するためのＰＥＴ、ＭＲＩ（ダイナミック造影、ＤＣＥ−ＭＲＩ）又はＣＴ画像法のような非侵襲性技術により評価できる。腫瘍を起源とする内皮発芽の数が少なくとも１％、５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％又は７５％以上減少する場合に、症状である内皮発芽の重篤度が、好ましくは、低減されたという。内皮発芽は、対象での処置の少なくとも１週間、２週間、３週間、４週間、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月以上後で評価又は検出され、処置の着手時の内皮発芽の数と比較される。
パラメータは、本明細書で早くに説明したように、新血管新生及び／又は抗血管新生活性の評価であってもよい。本発明の関係において、新血管新生、又は新血管新生と関連する疾患若しくは状態を予防、治療、回復、治癒及び／又は遅延することは、抗腫瘍効果を達成することで置き換えることができる。そうでないと示さない限り、抗腫瘍効果は、好ましくは、処置された対象において少なくとも１週間、２週間、３週間、４週間、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月以上後で評価又は検出される。抗腫瘍効果は、好ましくは、対象において：
腫瘍細胞の増殖の阻害、並びに／或いは
腫瘍細胞死の誘導若しくは誘導の増加、並びに／或いは
転移の出現及び／若しくは腫瘍細胞遊走の遅延、並びに／或いは
腫瘍重量若しくは成長の増加の阻害又は予防又は遅延、並びに／或いは
少なくとも１ヶ月、数ヶ月以上の患者生存の延長（処置されていないか若しくは対照で処置された患者と比較して、又は処置の着手時の対象と比較して）並びに／或いは
生活の質の改善及び観察される疼痛緩和
として同定される。
本発明の関係において、患者は、生存し、及び／又は無病であるとみなされることがある。代わりに、疾患又は状態は、停止又は遅延されることがある。本発明の関係において、生活の質の改善及び観察される疼痛緩和とは、患者が、処置の着手時よりも少ない疼痛緩和薬を必要とすることを意味することがある。代わりに、又はより少ない疼痛緩和薬の消費と組み合わせて、患者は、処置の着手時よりも便秘がより少ないことがある。この関係において「より少ない」とは、５％少ない、１０％少ない、２０％少ない、３０％少ない、４０％少ない、５０％少ない、６０％少ない、７０％少ない、８０％少ない、９０％少ないことを意味し得る。患者は、いずれの疼痛緩和薬ももはや必要としないことがある。生活の質の改善及び観察される疼痛緩和は、患者での処置の少なくとも１週間、２週間、３週間、４週間、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月以上後に観察、検出又は評価され、前記患者の処置の着手時の生活の質の改善及び観察される疼痛緩和と比較される。
腫瘍細胞、好ましくは腫瘍内皮からの内皮細胞の増殖の阻害は、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％又は７５％以上であってもよい。細胞の増殖は、既知の技術を用いて評価してもよい。
腫瘍細胞死の誘導は、少なくとも１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％以上であってもよい。腫瘍成長は、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％又は７５％以上阻害されてもよい。腫瘍細胞死は、当業者に知られる技術を用いて評価してもよい。腫瘍細胞死は、ＭＲＩ又はＣＴを用いて評価してもよい。
あるいくつかの実施形態では、腫瘍重量が増加するか、又は腫瘍成長が、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％又は７５％以上阻害されることがある。腫瘍重量又は腫瘍成長は、当業者に知られる技術を用いて評価してもよい。
腫瘍成長の検出又は腫瘍細胞の増殖の検出は、グルコース類似体である２−［１８Ｆ］−フルオロ−２−デオキシ−Ｄ−グルコースを用いる陽電子放射型断層撮影法（ＦＤＧ−ＰＥＴ）又は［１８Ｆ］−’３−フルオロ−’３−デオキシ−Ｌ−チミジンＰＥＴによりグルコース利用の変化を測定することにより、ｉｎ ｖｉｖｏで評価してもよい。ｅｘ ｖｉｖｏでの代替法は、腫瘍生検をＫｉ６７で染色することであってもよい。
動物モデルにおいてｉｎ ｖｉｖｏで腫瘍成長に対するｍｉＲＮＡ分子の影響を試験するために、実施例１２に記載する実験系を用いてもよい。
転移の出現及び／又は腫瘍細胞遊走の遅延は、少なくとも１週間、１ヶ月、数ヶ月、１年間以上の遅延であってもよい。転移の存在は、ＭＲＩ、ＣＴ又は超音波検査又は循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）の検出を可能にする技術を用いて評価してもよい。後者の検査の例は、セルサーチＣＴＣ検査（Ｖｅｒｉｄｅｘ）、末梢血からのＣＴＣのＥｐＣａｍに基づく磁性選別である。
あるいくつかの実施形態では、腫瘍成長は、少なくとも１週間、１ヶ月、２ヶ月以上遅延することがある。あるいくつかの実施形態では、転移の出現は、少なくとも１週間、２週間、３週間、４週間、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月以上遅延する。
さらなる好ましい実施形態では、
ａ）ｍｉＲＮＡ−９、ｍｉＲＮＡ−１９０ｂ、ｍｉＲＮＡ−７、ｍｉＲＮＡ−５７４及び／若しくはｍｉＲＮＡ−１４２分子、模倣物及び／若しくはイソｍｉＲなどの等価物並びに／又はその供給源、
ｂ）場合によって、ｍｉＲＮＡ−２６ｂ、ｍｉＲＮＡ−２７ａ、ｍｉＲＮＡ−９２ａ、ｍｉＲＮＡ−２２１、ｍｉＲＮＡ−２２２、ｍｉＲＮＡ−１４５及びｌｅｔ７ａ１分子の少なくとも１つ、模倣物若しくはイソｍｉＲなどの等価物又はその供給源、
ｃ）並びに場合によってｍｉＲＮＡ−１３２、ｍｉＲＮＡ−１２６及びｍｉＲＮＡ−２１の少なくとも１つのアンタゴｍｉｒ又はその等価物若しくは供給源
から選択される別のｍｉＲＮＡ分子及び／又はｍｉＲＮＡ分子のアンタゴｍｉｒをさらに含む組成物が提供される。
同定されるｍｉＲＮＡ分子又はその等価物のそれぞれは、同じ標的遺伝子を有することが期待されないので、上のａ）及び／若しくはｂ）の下で同定されるｍｉＲＮＡ分子の少なくとも１つ又はその等価物又はその供給源、並びに／或いは上のｃ）の下で同定される少なくとも１つのアンタゴｍｉｒ又はその等価物若しくは供給源と場合によって組み合わせた、ｍｉＲＮＡ−９、ｍｉＲＮＡ−５７４、ｍｉＲＮＡ−７、ｍｉＲＮＡ−１９０ｂ及び／若しくはｍｉＲＮＡ−１４２分子又はその等価物又はその供給源の使用は、新血管新生と関連する疾患又は状態のより効果的な治療を可能にすると想定される。少なくともｍｉＲＮＡ−９、ｍｉＲＮＡ−５７４、ｍｉＲＮＡ−７、ｍｉＲＮＡ−１９０ｂ及び／若しくはｍｉＲＮＡ−１４２分子又はその等価物若しくは供給源の組成物又はカクテルにより治療された腫瘍は、前記治療を逃避するか又は前記治療に対して抵抗する可能性がより少ないと期待される。さらに好ましい実施形態では、本明細書で同定されるｍｉＲＮＡ分子のそれぞれ又はそれらの標的遺伝子の発現を診断し、結果に応じて、どのｍｉＲＮＡ分子を治療に用いるかを適合させることが包含される。
本発明が、１より多いｍｉＲＮＡ分子又はその等価物又はその供給源又はそのアンタゴｍｉｒを含む組成物に関する場合、それぞれのｍｉＲＮＡ分子又はその等価物又はその供給源又はそのアンタゴｍｉｒは、別々の組成物にそれぞれ存在し、各組成物が、対象に逐次的又は同時に投与されることが包含される。代わりに、１より多いｍｉＲＮＡ分子又はその等価物又はその供給源又はそのアンタゴｍｉｒは、本明細書で定義する組成物中に存在することも包含される。
よって、本発明は、ｍｉＲＮＡ分子、その等価物若しくは供給源、又はａ）及び／若しくはｂ）の下で同定されるｍｉＲＮＡ分子又はその等価物又はその供給源、並びに／或いはｃ）で同定されるｍｉＲＮＡ分子のさらなるアンタゴｍｉｒ又はその等価物を含む組成物の使用をさらに包含する。
この好ましい使用は、
対象、前記対象の細胞、前記対象の組織若しくは前記対象の体液における、ａ）及び／若しくはｂ）の下で同定される前記ｍｉＲＮＡ分子又はその等価物又はその供給源の活性又は定常状態レベルを増加させること、好ましくは薬理学的に増加させることを含み、並びに／或いは
対象、前記対象の細胞、前記対象の組織若しくは前記対象の体液における、ｃ）の下で同定される前記ｍｉＲＮＡ分子又はその等価物又はその供給源の活性又は定常状態レベルを減少させる、好ましくは薬理学的に減少させることを含む。
この好ましい使用では、
ａ）及び／又はｂ）の下で同定されるｍｉＲＮＡ分子の活性又は定常状態レベルは、検出可能な抗血管新生活性を示し、及び／又は新血管新生の検出可能な減少を誘導するために、増加させてもよく、並びに／或いは
ｃ）の下で同定されるアンタゴｍｉｒの活性又は定常状態レベルは、検出可能な抗血管新生活性を示し、及び／又は新血管新生の検出可能な減少を誘導するために、増加させてもよい。
アンタゴｍｉｒの活性又は定常状態レベルを増加させる方式は、本明細書で早くに既に定義した。対象での抗血管新生活性及び新血管新生の評価は、本明細書で早くに定義した。
さらなる態様では、好ましくは、新血管新生又は新血管新生と関連する疾患若しくは状態を予防、治療、回復、治癒及び／又は遅延するための医薬品の製造のための、ｍｉＲＮＡ−９、ｍｉＲＮＡ−５７４、ｍｉＲＮＡ−７、ｍｉＲＮＡ−１９０ｂ及び／若しくはｍｉＲＮＡ−１４２分子、その等価物又は供給源、或いは前記ｍｉＲＮＡ−９、ｍｉＲＮＡ−５７４、ｍｉＲＮＡ−７、ｍｉＲＮＡ−１９０ｂ及び／又はｍｉＲＮＡ−１４２、その等価物又は供給源を含む組成物の使用が提供される。このさらなる態様のそれぞれの特徴は、本明細書で既に記載した。
さらなる態様では、本明細書で早くに定義したｍｉＲＮＡ分子又はその等価物又はその供給源又はそのアンタゴｍｉｒ又は組成物を、必要とする対象に投与することにより、新血管新生、又は新血管新生と関連する疾患若しくは状態を予防、治療、回復、治癒及び／又は遅延するための方法が提供される。このさらなる態様のそれぞれの特徴は、本明細書で既に記載した。
さらなる態様では、対象における新血管新生又は新血管新生と関連する疾患若しくは状態を診断する方法であって、
（ａ）ｍｉＲＮＡ−９、ｍｉＲＮＡ−５７４、ｍｉＲＮＡ−７、ｍｉＲＮＡ−１９０ｂ及び／若しくはｍｉＲＮＡ−１４２分子、その等価物又は供給源の発現レベルを対象において決定するステップと、場合によって、
（ｂ）（ａ）で定義する前記分子又はその等価物又はその供給源の発現レベルを、前記分子、その等価物又は供給源の発現レベルについての参照値と比較するステップであり、参照値が、好ましくは、健常対象における前記分子、その等価物又は供給源の発現レベルの平均値であるステップと
を含む方法が提供される。
本発明の関係において、診断とは、新血管新生に進展するか又は新血管新生と関連する疾患若しくは状態に進展する対象の予測的リスク評価のいずれかを意味する。本発明の関係において、対象は、動物又はヒトであってもよい。好ましくは、対象は、ヒトである。本発明の関係において、（ｂ）で評価される参照値、並びに（ａ）で評価されるｍｉＲＮＡ−９、ｍｉＲＮＡ−５７４、ｍｉＲＮＡ−７、ｍｉＲＮＡ−１９０ｂ及び／若しくはｍｉＲＮＡ−１４２分子、その等価物又は供給源の発現レベルは、両方の対象における対応する又は同様の組織で評価される。
これらのヌクレオチド配列の発現レベル及び／又は対応するｍｉＲＮＡ分子若しくはその等価物若しくはその供給源の量は、対象において測定することが困難であり得るので、対象からの試料が好ましく用いられる。別の好ましい実施形態によると、（ヌクレオチド配列又はｍｉＲＮＡ分子又はその等価物若しくは供給源の）発現レベルは、対象から得られた試料においてｅｘ ｖｉｖｏで決定される。試料は、好ましくは、対象の体液を含む。試料は、対象の上皮起源の組織生検又は腫瘍生検又はがん組織であってもよい。好ましい組織は、原発腫瘍組織又は転移組織のいずれかである。体液は、血液、血清、痰、血漿、ＣＳＦ（脳脊髄液）、便、尿を含むか又はこれらに由来してもよい。本発明を、前がんとがんの間、又は原発腫瘍と転移腫瘍の間のような、新血管新生と関連する疾患又は状態の段階の間の差を評価又は診断するために用いることが具体的に企図される。
ヌクレオチド配列の発現レベル（或いは対応するコードされるｍｉＲＮＡ分子又はその等価物若しくは供給源の定常状態レベル）の増加又は減少は、好ましくは、健常対象における対応するヌクレオチド配列の発現レベル（又は対応するコードされるｍｉＲＮＡ分子又はその等価物若しくは供給源の定常状態レベル）と比較する早くに定義した方法を用いて、ヌクレオチドの発現レベルの検出可能な変化（或いはコードされるｍｉＲＮＡ分子又はその等価物若しくは供給源の定常状態レベル、或いはｍｉＲＮＡ分子又はその等価物若しくは供給源の生物活性の任意の検出可能な変化）として定義される。好ましいヌクレオチド配列は、ｍｉＲＮＡ分子又はその等価物の前駆体をコードする配列である。好ましい実施形態によると、ｍｉＲＮＡ活性の増加又は減少は、ｍｉＲＮＡ活性についての特異的アッセイを用いて定量される。好ましいアッセイは、本明細書で早くに定義した新血管新生の評価である。
好ましくは、ヌクレオチド配列の発現レベルの減少は、アレイを用いるヌクレオチド配列の発現レベルの少なくとも１０％の減少を意味する。より好ましくは、ヌクレオチド配列の発現レベルの減少は、少なくとも１５％、さらにより好ましくは少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも７０％、少なくとも９０％又は１００％の減少を意味する。この場合、検出可能な発現はない。
好ましくは、ｍｉＲＮＡ分子又はその等価物若しくは供給源の発現レベルの減少は、ｑＰＣＲ、マイクロアレイ又はノザンブロット分析を用いるｍｉＲＮＡの発現レベルの少なくとも１０％の減少を意味する。好ましくは、ｑＰＣＲは、ステム−ループＲＴ ｑＰＣＲである。より好ましくは、ｍｉＲＮＡ分子又はその等価物若しくは供給源の発現レベルの減少は、少なくとも１５％、さらにより好ましくは少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも７０％、少なくとも９０％又は１００％の減少を意味する。この場合、検出可能な発現はない。
好ましくは、ｍｉＲＮＡ活性の減少は、適切なアッセイを用いるｍｉＲＮＡ活性の少なくとも５％の減少を意味する。より好ましくは、ｍｉＲＮＡ活性の減少は、少なくとも１０％、さらにより好ましくは少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも７０％、少なくとも９０％又は１００％の減少を意味する。この場合、検出可能な活性はない。
好ましくは、ヌクレオチド配列の発現レベルの増加は、本明細書で言及する任意の技術を用いるヌクレオチド配列の発現レベルの少なくとも１０％の増加を意味する。より好ましくは、ヌクレオチド配列の発現レベルの増加は、少なくとも１５％、さらにより好ましくは少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも７０％、少なくとも９０％、少なくとも１５０％以上の増加を意味する。
好ましくは、ｍｉＲＮＡ分子又はその等価物若しくは供給源の発現レベルの増加は、ＲＴ−ｑＰＣＲ、好ましくはステム−ループＲＴ ｑＰＣＲを用いるｍｉＲＮＡ分子又はその等価物若しくは供給源の発現レベルの少なくとも１０％の増加を意味する。より好ましくは、ｍｉＲＮＡ分子又はその等価物若しくは供給源の発現レベルの増加は、少なくとも１５％、さらにより好ましくは少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも７０％、少なくとも９０％、少なくとも１５０％以上の増加を意味する。
好ましくは、ｍｉＲＮＡ活性の増加は、適切なアッセイを用いるｍｉＲＮＡ活性の少なくとも５％の増加を意味する。より好ましくは、ｍｉＲＮＡ活性の増加は、少なくとも１０％、さらにより好ましくは少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも７０％、少なくとも９０％、少なくとも１５０％以上の増加を意味する。
好ましくは、発現レベルは、対象から得られた試料においてｅｘ ｖｉｖｏで決定される。より好ましくは、試料は、本明細書で早くに定義したとおりであり、ここではその後、所定のヌクレオチド配列及び／或いはｍｉＲＮＡ分子又はその等価物若しくは供給源が、当業者に知られる方法を用いて抽出及び精製される。より好ましくは、試料は、腫瘍生検、血液、痰、便若しくは尿であるか、又はそれを含むか、又はそれに由来する。
本発明の診断方法では、好ましくは、１より多い、より好ましくは少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５のｍｉＲＮＡ分子又はその等価物若しくは供給源の発現レベル並びに／或いは対応するｍｉＲＮＡ分子又はその等価物若しくは供給源の定常状態レベルが決定される。
したがって、好ましい方法では、ステップ（ａ）において、
ａ）ｍｉＲＮＡ−９、ｍｉＲＮＡ−１９０ｂ、ｍｉＲＮＡ−７、ｍｉＲＮＡ−５７４及び／若しくはｍｉＲＮＡ−１４２分子、その等価物並びに／又は供給源、
ｂ）場合によって、ｍｉＲＮＡ−２６ｂ、ｍｉＲＮＡ−２７ａ、ｍｉＲＮＡ−９２ａ、ｍｉＲＮＡ−２２１、ｍｉＲＮＡ−２２２、ｍｉＲＮＡ−１４５、ｌｅｔ７ａ１、ｍｉＲＮＡ−１３２、ｍｉＲＮＡ−１２６及びｍｉＲＮＡ−２１分子の少なくとも１つ、その等価物又は供給源
から選択される別のｍｉＲＮＡ分子又はその等価物若しくは供給源の発現レベルを決定する。
さらに好ましい方法では、比較が前記ｍｉＲＮＡ−９、ｍｉＲＮＡ−５７４、ｍｉＲＮＡ−７、ｍｉＲＮＡ−１９０ｂ及び／若しくはｍｉＲＮＡ−１４２分子、その等価物又は供給源の発現レベルの減少の発見を導く場合に、新血管新生又は新血管新生と関連する疾患若しくは状態が診断される。
さらに好ましい方法では、比較が前記ｍｉＲＮＡ−９、ｍｉＲＮＡ−５７４、ｍｉＲＮＡ−７、ｍｉＲＮＡ−１９０ｂ及び／若しくはｍｉＲＮＡ−１４２分子、その等価物又は供給源の発現レベルの減少と、
ａ）ｍｉＲＮＡ−９、ｍｉＲＮＡ−１９０ｂ、ｍｉＲＮＡ−７、ｍｉＲＮＡ−５７４及び／若しくはｍｉＲＮＡ−１４２分子、並びに／又はその等価物並びに／又は供給源、
ｂ）場合によって、ｍｉＲＮＡ−２６ｂ、ｍｉＲＮＡ−２７ａ、ｍｉＲＮＡ−９２ａ、ｍｉＲＮＡ−２２１、ｍｉＲＮＡ−２２２、ｍｉＲＮＡ−１４５及びｌｅｔ７ａ１分子の少なくとも１つ、その等価物又は供給源
から選択される別のｍｉＲＮＡの少なくとも１つの発現レベルの減少の発見とを導く場合に、新血管新生又は新血管新生と関連する疾患若しくは状態が診断される。
さらに好ましい実施形態では、比較が前記ｍｉＲＮＡ−９、ｍｉＲＮＡ−５７４、ｍｉＲＮＡ−７、ｍｉＲＮＡ−１９０ｂ及び／若しくはｍｉＲＮＡ−１４２分子、その等価物又はその供給源の発現レベルの減少、並びに／或いは上記で同定される別のｍｉＲＮＡの少なくとも１つの発現レベルの増加での発現レベルの減少、並びに／或いは
ａ）ｍｉＲＮＡ−１３２、ｍｉＲＮＡ−１２６及び／若しくはｍｉＲＮＡ−２１又はその等価物若しくは供給源
から選択される別のｍｉＲＮＡの少なくとも１つの発現レベルの増加の発見を導く場合に、新血管新生又は新血管新生と関連する疾患若しくは状態が診断される。
さらなる態様では、対象における新血管新生又は新血管新生と関連する疾患若しくは状態を予防、治療、回復、治癒及び／又は遅延できる物質又は分子を同定するための方法であって、
（ａ）ｍｉＲＮＡ−９、ｍｉＲＮＡ−５７４、ｍｉＲＮＡ−７、ｍｉＲＮＡ−１９０ｂ及び／若しくはｍｉＲＮＡ−１４２分子又はその等価物又はその供給源を発現できる試験細胞集団を用意するステップであり、好ましくは、試験集団が、がん細胞を含み、及び／又は試験細胞集団が、哺乳動物細胞を含み、及び／又は試験細胞集団が、ヒト細胞を含むステップと、
（ｂ）試験細胞集団を、前記物質と接触させるステップと、
（ｃ）前記ｍｉＲＮＡ−９、ｍｉＲＮＡ−５７４、ｍｉＲＮＡ−７、ｍｉＲＮＡ−１９０ｂ及び／若しくはｍｉＲＮＡ−１４２分子又はその等価物又はその供給源の発現レベル、或いは前記ｍｉＲＮＡ−９、ｍｉＲＮＡ−５７４、ｍｉＲＮＡ−７、ｍｉＲＮＡ−１９０ｂ及び／若しくはｍｉＲＮＡ−１４２分子又はその等価物又はその供給源の活性又は定常状態レベルを、前記物質と接触させた試験細胞集団において決定するステップと、
（ｄ）（ｃ）で決定した前記発現、活性又は定常状態レベルを、前記物質と接触させていない試験細胞集団における前記ｍｉＲＮＡ−９、ｍｉＲＮＡ−５７４、ｍｉＲＮＡ−７、ｍｉＲＮＡ−１９０ｂ及び／若しくはｍｉＲＮＡ−１４２分子又はその等価物又はその供給源の発現、活性又は定常状態レベルと比較するステップと、
（ｅ）前記物質と接触させた試験細胞集団と、前記物質と接触させていない試験細胞集団との間で、前記ｍｉＲＮＡ−９、ｍｉＲＮＡ−５７４、ｍｉＲＮＡ−７、ｍｉＲＮＡ−１９０ｂ及び／若しくはｍｉＲＮＡ−１４２分子又はその等価物又はその供給源の発現レベル、活性又は定常状態レベルの差を生みだす物質を同定するステップと、
を含む方法が提供される。
好ましくは、ステップａ）において、試験細胞は、本明細書で早くに定義したｍｉＲＮＡ−９、ｍｉＲＮＡ−５７４、ｍｉＲＮＡ−７、ｍｉＲＮＡ−１９０ｂ及び／若しくはｍｉＲＮＡ−１４２分子又はその等価物の供給源又は前駆体、或いは前記ｍｉＲＮＡの前駆体を含む核酸構築物を含む。好ましくは、方法において、１より多いヌクレオチド配列又は１より多いｍｉＲＮＡ分子、その等価物若しくは供給源の発現レベル、活性又は定常状態レベルが比較される。好ましくは、方法において、試験細胞集団は、哺乳動物細胞、より好ましくはヒト細胞を含む。より好ましくは、試験細胞は、内皮細胞である。ＲＦ２４のような株化細胞も用いてもよい。ＨＵＶＥＣ細胞も用いてもよい。好ましい試験細胞集団は、ｍｉＲＮＡ−９、ｍｉＲＮＡ−５７４、ｍｉＲＮＡ−７、ｍｉＲＮＡ−１９０ｂ及び／若しくはｍｉＲＮＡ−１４２分子又はその等価物又はその供給源を発現しないか、或いは正常対応物と比較して発現が低減している。より好ましくは、試験細胞集団は、内皮細胞を含む。より好ましくは、試験細胞集団は、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％の内皮細胞を含む。内皮細胞は、ＣＤ３１及びＣＤ３４マーカーの発現により同定できる。代わりに、又は以前に言及した細胞に加えて、一態様では、本発明は、上記の方法で同定された物質にも関係する。
好ましい方法では、少なくとも別の１つのｍｉＲＮＡ分子又はその等価物若しくは供給源の発現レベル、活性又は定常状態レベルが比較され、好ましくは、ここでは、他のｍｉＲＮＡ分子又はその等価物若しくは供給源は、
ａ）ｍｉＲＮＡ−９、ｍｉＲＮＡ−１９０ｂ、ｍｉＲＮＡ−７、ｍｉＲＮＡ−５７４及び／若しくはｍｉＲＮＡ−１４２分子、並びに／若しくは等価物並びに／又はその供給源、
ｂ）場合によって、ｍｉＲＮＡ−２６ｂ、ｍｉＲＮＡ−２７ａ、ｍｉＲＮＡ−９２ａ、ｍｉＲＮＡ−２２１、ｍｉＲＮＡ−２２２、ｍｉＲＮＡ−１４５、ｌｅｔ７ａ１、ｍｉＲＮＡ−１３２、ｍｉＲＮＡ−１２６及びｍｉＲＮＡ−２１分子の少なくとも１つ、その等価物又はその供給源
から選択される。
一般的な定義及び本明細書で言及する一般的な技術
マイクロＲＮＡ分子（「ｍｉＲＮＡ」）は、一般的に２１〜２２ヌクレオチド長であるが、１７及び２５ヌクレオチドまでの長さが報告されている。１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５のいずれの長さも、よって、本発明に包含される。ｍｉＲＮＡは、より長い前駆ＲＮＡ分子（「前駆ｍｉＲＮＡ」）からそれぞれプロセシングされる。前駆ｍｉＲＮＡは、タンパク質非コード遺伝子から転写される。前駆体は、少なくとも５０、７０、７５、８０、８５、１００、１５０、２００ヌクレオチド以上の長さを有することがある。前駆ｍｉＲＮＡは、２つの相補性領域を有し、これらの領域によりステム−ループ様又は折り返し様構造を形成でき、該構造は、動物においてダイサー及びドローシャとよばれる酵素により切断される。ダイサー及びドローシャは、リボヌクレアーゼＩＩＩ様ヌクレアーゼである。プロセシングされたｍｉＲＮＡは、典型的に、ステムの一部分である。
プロセシングされたｍｉＲＮＡ（「成熟ｍｉＲＮＡ」ともよばれる）は、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）として知られる大きい複合体の一部分になり、特定の標的遺伝子を（下方）制御する。動物ｍｉＲＮＡの例は、ｍＲＮＡ標的と完全又は非完全に塩基対形成して、それぞれｍＲＮＡ分解又は翻訳の阻害をもたらすものを含む（Ｏｌｓｅｎら、１９９９；Ｓｅｇｇｅｒｓｏｎら、２００２）。ＳｉＲＮＡ分子もダイサーによりプロセシングされるが、長い２本鎖ＲＮＡ分子からである。ＳｉＲＮＡは、動物細胞において自然に見出されないが、このような細胞においてＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）中で機能して、ｍＲＮＡ標的の配列特異的切断を指図できる（Ｄｅｎｌｉら、２００３）。
内因性ｍｉＲＮＡ分子の研究は、米国特許出願公開第６０／５７５，７４３号（これは、本明細書にその全体が参照により組み込まれている）に記載されている。ｍｉＲＮＡは、成熟１本鎖ＲＮＡが、ｍｉＲＮＡとハイブリダイズするｍＲＮＡの翻訳を調節するタンパク質複合体と結合している場合に、細胞において明らかに活性である。内因的に発現されたｍｉＲＮＡと同じ方式で細胞に影響する外因性ＲＮＡ分子を導入するためには、内因性成熟ｍｉＲＮＡと同じ配列の１本鎖ＲＮＡ分子が、翻訳制御を容易にするタンパク質複合体により取り込まれることが必要である。様々なＲＮＡ分子設計が評価されている。ｍｉＲＮＡ経路による所望の１本鎖ｍｉＲＮＡの取り込みを最大限にする３つの一般的な設計が同定されている。この３つの設計のうちの少なくとも１つを有するｍｉＲＮＡ配列を有するＲＮＡ分子は、合成ｍｉＲＮＡということがある。
本発明のｍｉＲＮＡ分子は、内因性ｍｉＲＮＡの遺伝子サイレンシング活性を置き換え又は補充できる。このような分子の例、このような分子及びこのような分子を含む組成物の好ましい特徴及び修飾は、国際公開第２００９／０９１９８２号パンフレット（これは、本明細書にその全体が参照により組み込まれている）に記載されている。
本発明のｍｉＲＮＡ分子又はその等価物若しくは供給源は、いくつかの実施形態では、２つのＲＮＡ分子を含み、一方のＲＮＡは、自然に存在する成熟ｍｉＲＮＡと同一である。成熟ｍｉＲＮＡと同一であるＲＮＡ分子は、活性鎖という。相補鎖という第２のＲＮＡ分子は、活性鎖と少なくとも部分的に相補的である。活性及び相補鎖は、ハイブリダイズして２本鎖ＲＮＡを形成し、該２本鎖ＲＮＡは、細胞においてｍｉＲＮＡ活性化の直前にタンパク質複合体が結合する、自然に存在するｍｉＲＮＡ前駆体に類似している。前記ｍｉＲＮＡの活性を最大限にするためには、翻訳レベルにて遺伝子発現を調節するｍｉＲＮＡタンパク質複合体による活性鎖の取り込みを最大限にし、相補鎖の取り込みを最小限にすることが必要である。最適ｍｉＲＮＡ活性をもたらす分子設計は、相補鎖の修飾を含む。
２つの設計は、相補鎖の化学修飾を組み込んでいる。
第１の修飾は、５’末端にてホスフェート又はヒドロキシル以外の基を用いて相補ＲＮＡを創出することを含む。５’修飾の存在は、相補鎖の取り込みを明らかに排除し、その後、ｍｉＲＮＡタンパク質複合体による活性鎖の取り込みに有利になる。５’修飾は、ＮＨ２、ＮＨＣＯＣＨ３、ビオチンなどを含む様々な分子のいずれによることもできる。
ｍｉＲＮＡ経路による相補鎖の取り込みを著しく低減する第２の化学修飾方策は、相補鎖の最初の２〜６ヌクレオチドにおいて糖修飾を有するヌクレオチドを組み込むことである。第２の設計方策に調和する糖修飾は、第１の設計方策に調和する５’末端修飾と組み合わせて、ｍｉＲＮＡ活性をさらに増強できることに注目すべきである。
第３のｍｉＲＮＡ設計は、活性鎖と相補的でない相補鎖の３’端にヌクレオチドを組む込むことを含む。
得られる活性及び相補ＲＮＡのハイブリッドは、活性鎖の３’端にて非常に安定であるが、活性鎖の５’端にて比較的不安定である。ｓｉＲＮＡを用いた研究は、５’ハイブリッド安定性は、ＲＮＡ干渉を支持するタンパク質複合体によるＲＮＡ取り込みの重要な指標であり、該取り込みは、細胞におけるｍｉＲＮＡ経路に少なくとも関係する。本発明者らは、相補ＲＮＡ鎖におけるミスマッチの賢明な使用が、前記ｍｉＲＮＡの活性を著しく増強することを見出した。
ＭｉＲＮＡライブラリー
本明細書で同定されるｍｉＲＮＡについての重要な応用は、試料における１つの個別の又は群のｍｉＲＮＡの存在の評価又は診断である。異なるｍｉＲＮＡのそれぞれを有する細胞集団を、次いで、アッセイして、その存在が細胞表現型（すなわち新血管新生）に影響するｍｉＲＮＡを同定できる。ライブラリー中の異なるｍｉＲＮＡの数は変動可能である。少なくとも、又は多くても１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０以上又はその中の導き出せる任意の範囲の異なるｍｉＲＮＡ特異的分子がライブラリー中にあることが企図される。具体的な実施形態では、ライブラリーは、１〜２０の異なるｍｉＲＮＡ特異的分子、又は５〜２０の異なるｍｉＲＮＡ特異的分子を有する。「異なる」ｍｉＲＮＡ特異的分子とは、異なる配列のｍｉＲＮＡを特異的にコードする核酸のことをいう。
ｍｉＲＮＡは、ＲＮＡで主に作られることが企図されるが、いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡは、ＲＮＡ、ロックド核酸（ＬＮＡ）若しくはアンロックド核酸（ＵＮＡ）のようなヌクレオチド類似体、ＤＮＡ、又はＤＮＡ、ＲＮＡ、ヌクレオチド類似体及びＰＮＡ（ペプチド核酸）の任意の組み合わせであってもよい。したがって、ライブラリーは、これらの異なるｍｉＲＮＡについての１つ又は複数の核酸を含有すると理解される。具体的な実施形態では、ライブラリーはヒトｍｉＲＮＡに特異的であるが、複数の生物についてのライブラリーも企図される。
本発明のＲＮＡ分子は、ｍｉＲＮＡ領域を有するか、又は含むか、又はそれからなる。具体的な実施形態では、ｍｉＲＮＡ分子又はその等価物は、配列番号２２〜５２（表５）のいずれかに由来する配列を有する。本発明の核酸分子は、配列番号２２〜５２の成熟ｍｉＲＮＡ配列のいずれかに由来し得ることが特に企図される。
ｍｉＲＮＡ分子又はその等価物は、予測ｍｉＲＮＡ配列の上流及び／又は下流にコード配列を少なくとも１〜５ヌクレオチド拡張した配列を含む。いくつかの実施形態では、分子は、優勢なプロセシングされたｍｉＲＮＡをコードする配列の一方又は両方の側（５’及び／又は３’端）に接する１、２、３、４、５、６、７以上まで、又はその中の導き出せる任意の範囲の連続ヌクレオチドを有する。
本発明のライブラリーは、それらに限定されないが、ヒト、非ヒト霊長類、ラット及びマウスのような哺乳動物を具体的に含む、ｍｉＲＮＡを有する任意の生物からのｍｉＲＮＡ配列を含有できる。少なくとも、又は多くても１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０以上の異なるｍｉＲＮＡ（すなわち、異なるｍｉＲＮＡ遺伝子に由来する異なる配列を有するｍｉＲＮＡ特異的分子）を有するライブラリーが具体的に企図される。配列番号２２〜５２のいずれか、特にｍｉＲＮＡ配列（成熟配列）に相当するものに関して、以前の文章に記載するライブラリーが具体的に企図される。
核酸
本発明は、ｍｉＲＮＡを培養細胞又は対象に導入できるｍｉＲＮＡの供給源又は前駆体ともよばれる核酸分子に関する。核酸は、細胞において又は精製酵素によりｉｎ ｖｉｔｒｏで生成できるが、化学合成により、優先的に生成される。核酸は、粗製又は精製されていてもよい。用語「ｍｉＲＮＡ」は、そうでないと示さない限り、その前駆体から切断された後のプロセシングされたｍｉＲＮＡのことをいう。表４は、どの配列番号がｍｉＲＮＡの特定の前駆配列に相当するか（配列番号１〜２１）を示し、表５は、どの配列番号が、ｍｉＲＮＡの成熟又は模倣配列に相当するか（配列番号２２〜５２）を示す。表６は、実施例に記載する機能的スクリーニングで用いた、レンチウイルスベクターにクローニングされたＤＮＡ配列（配列番号５３〜６０）を同定する。表５及び７は、表５の成熟ｍｉＲＮＡのぞれぞれの好ましいシード配列（配列番号３４８〜３７８、６１〜１１５及び３７９〜３８１）を同定する。ｍｉＲＮＡの名称は、しばしば略記され、接頭辞なしで示され、状況に応じてそのまま理解される。そうでないと記載しない限り、本出願において言及するｍｉＲＮＡは、ｍｉｒ−Ｘ又はｌｅｔ−Ｘ（ここで、Ｘは、数及び／又は文字である）として同定されるヒト配列である。
ｍｉＲＮＡは、ゲノム配列又は非コード遺伝子に由来すると理解される。このことに関して、用語「遺伝子」は、所定のｍｉＲＮＡについて前駆ｍｉＲＮＡをコードするゲノム配列のことをいうために単純化のために用いられる。しかし、本発明の実施形態は、プロモーター又はその他の調節配列のような発現に関与するｍｉＲＮＡのゲノム配列を含むことがある。
用語「組換え」を用いることがあり、この用語は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで操作された分子又はそのような分子の複製若しくは発現生成物のことを一般的にいう。
用語「核酸」は、当該技術において公知である。「核酸」は、本明細書で用いる場合、一般的に、ヌクレオ塩基を含むＤＮＡ、ＲＮＡ又はその誘導体若しくは類似体の分子（１つ又は複数の鎖）のことをいう。ヌクレオ塩基は、例えば、ＤＮＡ（例えばアデニン「Ａ」、グアニン「Ｇ」、チミン「Ｔ」又はシトシン「Ｃ」）又はＲＮＡ（例えばＡ、Ｇ、ウラシル「Ｕ」又はＣ）で見出される、自然に存在するプリン又はピリミジン塩基を含む。用語「核酸」は、用語「オリゴヌクレオチド」及び「ポリヌクレオチド」を包含し、これらの用語はそれぞれ用語「核酸」の亜属である。
用語「ｍｉＲＮＡ」は、一般的に１本鎖分子のことをいうが、具体的な実施形態では、本発明に組み込まれる分子は、同じ１本鎖分子の別の領域若しくは別の核酸と部分的（鎖の長さにわたって１０〜５０％相補的）、実質的（鎖の長さにわたって５０％より大きいが１００％未満相補的）又は完全に相補的である領域又は付加的な鎖も包含する。よって、核酸は、分子を含む特定の配列の１つ若しくは複数の相補又は自己相補鎖（複数可）或いは「相補体（複数可）」を含む分子を包含することがある。例えば、前駆ｍｉＲＮＡは、１００％まで相補的である自己相補性領域を有することがある。
本明細書で用いる場合、「ハイブリダイゼーション」、「ハイブリダイズする」又は「ハイブリダイズできる」は、サザンブロッティング手順のような当業者に知られる技術を用いる、２本鎖若しくは３本鎖分子又は部分的２本鎖若しくは３本鎖の性質を有する分子の形成を意味すると理解される。用語「アニールする」は、本明細書で用いる場合、「ハイブリダイズする」と同義である。用語「ハイブリダイゼーション」、「ハイブリダイズする」又は「ハイブリダイズできる」は、以下で定義する「低」、「中」又は「高」ハイブリダイゼーション条件を意味することがある。
低〜中〜高ストリンジェンシー条件は、４２℃にて、５×ＳＳＰＥ、０．３％ＳＤＳ、２００ｐｇ／ｍｌせん断変性サケ精子ＤＮＡ、及び低〜中〜高ストリンジェンシーについてそれぞれ２５％、３５％又は５０％のいずれかのホルムアミド中での予備ハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションを意味する。その後に、ハイブリダイゼーション反応は、３０分間にわたって３回、それぞれ２×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳ及び低〜中〜高ストリンジェンシーについて５５℃、６５℃又は７５℃のいずれかで洗浄される。
本発明の核酸又はその誘導体は、いくつかの実施形態では、配列番号２２〜５２に記載される任意のｍｉＲＮＡのｍｉＲＮＡ配列を含むか、又は配列番号１１６〜３０４及び３８２〜３９６に記載される。配列番号２２〜５２及び／又は１１６〜３０４及び／又は３８２〜３９６に由来する本発明の核酸配列は、配列番号２２〜５２又は１１６〜３０４又は３８２〜３９６からの少なくとも又は多くても５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３連続ヌクレオチド（又はその中の導き出せる任意の範囲）を有することができる。他の実施形態では、核酸は、配列番号２２〜５２若しくは１１６〜３０４若しくは３８２〜３９６のｍｉＲＮＡ配列又は配列番号１〜２１若しくは５３〜６０のいずれかの前駆配列と少なくとも又は多くても８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００％（又はその中の導き出せる任意の組み合わせ若しくは範囲）同一である。
ヌクレオ塩基
本明細書で用いる場合、「ヌクレオ塩基」は、例えば少なくとも１つの自然に存在する核酸（すなわちＤＮＡ及びＲＮＡ）で見出される、自然に存在するヌクレオ塩基（すなわちＡ、Ｔ、Ｇ、Ｃ又はＵ）並びにそのようなヌクレオ塩基の自然に存在する又は自然に存在しない誘導体（複数可）及び類似体のような複素環塩基のことをいう。ヌクレオ塩基は、少なくとも１つの自然に存在するヌクレオ塩基と、自然に存在するヌクレオ塩基対形成（例えばＡとＴ、ＧとＣ、及びＡとＵの間の水素結合）を置換し得る様式で、１つ又は複数の水素結合を一般的に形成できる（「アニールする」又は「ハイブリダイズする」）。
「プリン」及び／又は「ピリミジン」ヌクレオ塩基（複数可）は、自然に存在するプリン及び／又はピリミジンヌクレオ塩基、並びにそれらに限定されないが、アルキル、カルボキシアルキル、アミノ、ヒドロキシル、ハロゲン（すなわちフルオロ、クロロ、ブロモ又はヨード）、チオール又はアルキルチオール部分の１つ又は複数で置換されたプリン又はピリミジンを含むその誘導体（複数可）及び類似体（複数可）も包含する。好ましいアルキル（例えばアルキル、カルボキシアルキルなど）部分は、約１、約２、約３、約４、約５〜約６の炭素原子を含む。プリン又はピリミジンのその他の非限定的な例は、デアザプリン、２，６−ジアミノプリン、５−フルオロウラシル、キサンチン、ヒポキサンチン、８−ブロモグアニン、８−クロログアニン、ブロモチミン、８−アミノグアニン、８−ヒドロキシグアニン、８−メチルグアニン、８−チオグアニン、アザグアニン、２−アミノプリン、５−エチルシトシン、５−メチルシトシン、５−ブロモウラシル、５−エチルウラシル、５−ヨードウラシル、５−クロロウラシル、５−プロピルウラシル、チオウラシル、２−メチルアデニン、メチルチオアデニン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアデニン、アザアデニン、８−ブロモアデニン、８−ヒドロキシアデニン、６−ヒドロキシアミノプリン、６−チオプリン、４−（６−アミノヘキシル／シトシン）などを含む。その他の例は、当業者に公知である。
ヌクレオ塩基は、本明細書で記載するか又は当業者に知られる任意の化学又は自然合成法を用いて、ヌクレオシド又はヌクレオチドに含めることができる。このようなヌクレオ塩基は、標識してもよいか、又は標識され、ヌクレオ塩基を含有する分子の一部であってもよい。
ヌクレオシド
本明細書で用いる場合、「ヌクレオシド」は、ヌクレオ塩基リンカー部分に共有的に付着したヌクレオ塩基を含む個別の化学単位のことをいう。「ヌクレオ塩基リンカー部分」の非限定的な例は、それらに限定されないが、デオキシリボース、リボース、アラビノース又は５炭糖の誘導体若しくは類似体を含む５炭素原子を含む糖（すなわち「５炭糖」）である。５炭糖の誘導体又は類似体の非限定的な例は、２’−フルオロ−２’−デオキシリボース又は糖の環の中の炭素が酸素原子で置換された炭素環式糖を含む。
ヌクレオ塩基とヌクレオ塩基リンカー部分との異なる型の共有的付着（複数可）が当該技術において知られている。非限定的な例として、プリン（すなわちＡ又はＧ）又は７−デアザプリンヌクレオ塩基を含むヌクレオシドは、典型的に、プリン又は７−デアザプリンの９位を、５炭糖の１’位に共有的に付着させる。別の非限定的な例では、ピリミジンヌクレオ塩基（すなわちＣ、Ｔ又はＵ）を含むヌクレオシドは、典型的に、ピリミジンの１位を、５炭糖の１’位に共有的に付着させる（Ｋｏｒｎｂｅｒｇ及びＢａｋｅｒ、１９９２）。
ヌクレオチド
本明細書で用いる場合、「ヌクレオチド」は、「主鎖部分」をさらに含むヌクレオシドのことをいう。主鎖部分は、一般的に、ヌクレオチドとヌクレオチドを含む別の分子、又は別のヌクレオチドとを共有的に付着させて、核酸を形成する。自然に存在するヌクレオチドにおける「主鎖部分」は、典型的に、５炭糖に共有的に付着しているリン部分を含む。主鎖部分の付着は、５炭糖の３’又は５’位のいずれかで典型的に生じる。しかし、特に、ヌクレオチドが自然に存在する５炭糖の誘導体若しくは類似体又はリン部分を含む場合に、他の型の付着が当該技術において知られている。
核酸類似体
核酸は、自然に存在する核酸に存在するヌクレオ塩基の誘導体若しくは類似体、ヌクレオ塩基リンカー部分及び／又は主鎖部分を含むか、或いはそれらだけで構成されてもよい。核酸類似体を有するＲＮＡは、本発明の方法に従って標識されてもよい。本明細書で用いる場合、「誘導体」は、自然に存在する分子の化学的に修飾又は改変された形のことをいい、用語「模倣物」又は「類似体」は、自然に存在する分子若しくは部分と構造的に似ているか又は似ていないが、同様の機能を有する分子のことをいう。本明細書で用いる場合、「部分」は、一般的に、より大きい化学的又は分子的構造のうちのより小さい化学的又は分子的構成成分のことをいう。ヌクレオ塩基、ヌクレオシド及びヌクレオチド類似体又は誘導体は、当該技術において公知であり、記載されている（例えばＳｃｈｅｉｔ、１９８０（本明細書に参照により組み込まれている）を参照されたい）。
５炭糖及び／若しくは主鎖部分誘導体又は類似体を含むヌクレオシド、ヌクレオチド或いは核酸のさらなる非限定的な例は、米国特許第５，６８１，９４７号（これは、ｄｓＤＮＡと３重らせんを形成し、及び／又はｄｓＤＮＡの発現を妨げるプリン誘導体を含むオリゴヌクレオチドについて記載している）、米国特許第５，６５２，０９９号及び米国特許第５，７６３，１６７号（これらは、特に蛍光核酸プローブとして用いるための、ＤＮＡ又はＲＮＡで見出されるヌクレオシドの蛍光類似体を組み込んだ核酸について記載している）、米国特許第５，６１４，６１７号（これは、ヌクレアーゼ安定性が増強されたピリミジン環上の置換を有するオリゴヌクレオチド類似体について記載している）、米国特許第５，６７０，６６３号、米国特許第５，８７２，２３２号及び米国特許第５，８５９，２２１号（これらは、核酸検出において用いられる、修飾５炭糖（すなわち、修飾Ｔ−デオキシフラノシル部分）を有するオリゴヌクレオチド類似体について記載している）、米国特許第５，４４６，１３７号（これは、ハイブリダイゼーションアッセイにおいて用いることができる、４’位にて水素以外の置換基で置換された少なくとも１つの５炭糖部分を含むオリゴヌクレオチドについて記載している）、米国特許第５，８８６，１６５号（これは、３’−５’ヌクレオチド間連結を有するデオキシリボヌクレオチドと２’−５’ヌクレオチド間連結を有するリボヌクレオチドとを両方有するオリゴヌクレオチドについて記載している）、米国特許第５，７１４，６０６号（これは、ヌクレオチド間連結の３’位の酸素が炭素で置き換えられて、核酸のヌクレアーゼ耐性が増強された修飾ヌクレオチド間連結について記載している）、米国特許第５，６７２，６９７号（これは、ヌクレアーゼ耐性を増強する１つ又は複数の５’メチレンホスフェートヌクレオチド間連結を含有するオリゴヌクレオチドについて記載している）、米国特許第５，４６６，７８６号及び米国特許第５，７９２，８４７号（これらは、ヌクレアーゼ安定性の増強及び薬物又は検出部分を送達する能力をもたらすために、薬物又はオリゴヌクレオチドの２’炭素への標識を含み得る置換部分の連結について記載している）、米国特許第５，２２３，６１８号（これは、細胞取り込みの増強、ヌクレアーゼに対する耐性及びＲＮＡを標的にするためのハイブリダイゼーションのための、隣接５炭糖部分の４’位と３’位とを付着させる２’又は３’炭素主鎖連結を有するオリゴヌクレオチド類似体について記載している）、米国特許第５，４７０，９６７号（これは、核酸ハイブリダイゼーションプローブとして有用な、少なくとも１つのスルファメート又はスルファミドヌクレオチド間連結を含むオリゴヌクレオチドについて記載している）、米国特許第５，３７８，８２５号、米国特許第５，７７７，０９２号、米国特許第５，６２３，０７０号、米国特許第５，６１０，２８９号及び米国特許第５，６０２，２４０号（これらは、ヌクレアーゼ耐性、細胞取り込み及びＲＮＡ発現の調節の改善のために用いられる、ホスホジエステル主鎖部分を置き換える３又は４原子リンカー部分を有するオリゴヌクレオチドについて記載している）、米国特許第５，８５８，９８８号（これは、膜透過性及び安定性を増強するために、オリゴヌクレオチドの２’−Ｏ位に付着した疎水性担体物質について記載している）、米国特許第５，２１４，１３６号（これは、ＤＮＡ若しくはＲＮＡに対するハイブリダイゼーションの増強、ヌクレアーゼに対する安定性の増強を有する、５’末端にてアントラキノンとコンジュゲートしたオリゴヌクレオチドについて記載している）、米国特許第５，７００，９２２号（これは、ヌクレアーゼ耐性、結合親和性及びＲＮアーゼＨを活性化する能力の増強のためにＤＮＡが２’−デオキシ−エリスロ−ペントフラノシルヌクレオチドを含むＰＮＡ−ＤＮＡ−ＰＮＡキメラについて記載している）、並びに国際公開第９８／３９３５２号パンフレット、国際公開第９９／１４２２６号パンフレット、国際公開第２００３／９５４６７号パンフレット及び国際公開第２００７／０８５４８５号パンフレット（これらは、リボース部分が、２’酸素と４’炭素とを接続する余剰ブリッジを用いて修飾されている修飾ＲＮＡヌクレオチドについて記載している）に記載されるものを含む。ロックドリボースは、結合親和性及び特異性を著しく増加させる、国際公開第２００８／１４７８２４号パンフレット（これは、ＵＮＡ（アンロックド核酸）と命名された修飾ＲＮＡヌクレオチドについて記載している）。ＵＮＡは、Ｃ２’原子とＣ３’原子との間の結合が切断され、相補鎖に対する結合親和性が減少したＲＮＡの非環状類似体である。ＵＮＡは、ＲＮアーゼＨ認識及びＲＮＡ切断に影響せず、ｓｉＲＮＡにより媒介される遺伝子サイレンシングを改善する、国際公開第２００８／０３６１２７号パンフレット（これは、非荷電及びカチオン性のサブユニット間連結をともに含有するモルホリノ核酸類似体について記載している）、国際公開第２００７／０６９０９２号パンフレット及びＥＰ２０７５３４２（これらは、オリゴヌクレオチドに対してコンジュゲートするカチオン性部分（Ｚ単位）としてスペルミン誘導体を含有するＺｉｐ核酸（ＺＮＡ）について記載している）、米国特許第５，７０８，１５４号（これは、ＤＮＡに連結されてＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを形成するＲＮＡについて記載している）、米国特許第５，７２８，５２５号（これは、ユニバーサル蛍光標識を用いるヌクレオシド類似体の標識化について記載している）。
ヌクレオシド類似体及び核酸類似体についてのさらなる教示は、米国特許第５，７２８，５２５号（これは、端が標識されたヌクレオシド類似体について記載している）、米国特許第５，６３７，６８３号、米国特許第６，２５１，６６６号（Ｌ−ヌクレオチド置換）及び米国特許第５，４８０，９８０号（７−デアザ−２’−デオキシグアノシンヌクレオチド及びその核酸類似体）である。
その他の類似体の使用は、本発明の関係において用いるために具体的に企図される。このような類似体は、本発明の合成核酸分子において、分子全体にわたって又は選択されたヌクレオチドにてともに用いることができる。これらは、それらに限定されないが、
１）リボース修飾（例えば２’Ｆ、２’ＮＨ２、２’Ｎ３，４’チオ又は２’Ｏ−ＣＨ３）及び
２）ホスフェート修飾（例えばホスホロチオエート、メチルホスホネート及びホスホロボレートで見出されるもの）
を含む。
このような類似体を創出して、リボヌクレアーゼにより切断されるＲＮＡの能力を低減又は排除することにより、ＲＮＡに安定性を与える。これらのヌクレオチド類似体がＲＮＡに存在する場合、これらの類似体は、動物におけるＲＮＡの安定性に対して著しく正の影響を与えることができる。ヌクレオチド類似体の使用は、単独で、又は本発明の任意の核酸についての合成ｍｉＲＮＡの任意の設計改変とともに用いることができることが企図される。
修飾ヌクレオチド
本発明のｍｉＲＮＡは、それらの活性を増強するために修飾されたヌクレオチドの使用を特に企図する。このようなヌクレオチドは、ＲＮＡの５’又は３’末端にあるもの及び分子の内部にあるものを含む。前記ｍｉＲＮＡの相補鎖において用いられる修飾ヌクレオチドは、ＲＮＡの５’ＯＨ若しくはホスフェートを遮断するか、又はｍｉＲＮＡの活性鎖の取り込みを増強する内部糖修飾を導入する。ｍｉＲＮＡについての修飾は、ハイブリダイゼーションを増強するとともに細胞において分子を安定化する内部糖修飾、及び細胞において核酸をさらに安定化する末端修飾を含む。顕微鏡観察又はその他の方法により検出して、合成ｍｉＲＮＡを含有する細胞を同定できる修飾がさらに企図される。
核酸の調製
核酸は、例えば化学合成、酵素による生成又は生物学的生成のような当業者に知られる任意の技術により作製できる。本発明によるｍｉＲＮＡは、組換え法を用いて生成できるが、化学合成又は酵素生成によりｍｉＲＮＡを生成することが好ましい。ｍｉＲＮＡは、組換えＤＮＡ技術を含む方法を含むいくつかの方法により生成できる。
核酸合成は、標準的な方法に従って行われる。例えばＩｔａｋｕｒａ及びＲｉｇｇｓ（１９８０）を参照されたい。さらに、米国特許第４，７０４，３６２号、米国特許第５，２２１，６１９号及び米国特許第５，５８３，０１３号はそれぞれ、核酸を調製する様々な方法について記載している。核酸（例えばオリゴヌクレオチド）の非限定的な例は、ホスホトリエステル、ホスファイト若しくはホスホロアミダイト化学を用いるｉｎ ｖｉｔｒｏ化学合成及びＥＰ２６６，０３２（本明細書に参照により組み込まれている）に記載されるような固相技術により、又はＦｒｏｅｈｌｅｒら、１９８６及び米国特許第５，７０５，６２９号（それぞれ本明細書に参照により組み込まれている）に記載されるようなデオキシヌクレオシドＨ−ホスホネート中間体を介して作製された核酸を含む。本発明の方法では、１つ又は複数のオリゴヌクレオチドを用いることができる。オリゴヌクレオチド合成の様々な異なる機構が、例えば米国特許第４，６５９，７７４号、米国特許第４，８１６，５７１号、米国特許第５，１４１，８１３号、米国特許第５，２６４，５６６号、米国特許第４，９５９，４６３号、米国特許第５，４２８，１４８号、米国特許第５，５５４，７４４号、米国特許第５，５７４，１４６号、米国特許第５，６０２，２４４号（それぞれ本明細書に参照により組み込まれている）に開示されている。
酵素により生成された核酸の非限定的な例は、ＰＣＲ（商標）のような増幅反応において酵素により生成されるもの（例えば米国特許第４，６８３，２０２号及び米国特許第４，６８２，１９５号（それぞれ本明細書に参照により組み込まれている）を参照されたい）、又は米国特許第５，６４５，８９７号（本明細書に参照により組み込まれている）に記載されるオリゴヌクレオチドの合成を含む。
オリゴヌクレオチド合成は、当業者に公知である。オリゴヌクレオチド合成の様々な異なる機構が、例えば米国特許第４，６５９，７７４号、米国特許第４，８１６，５７１号、米国特許第５，１４１，８１３号、米国特許第５，２６４，５６６号、米国特許第４，９５９，４６３号、米国特許第５，４２８，１４８号、米国特許第５，５５４，７４４号、米国特許第５，５７４，１４６号、米国特許第５，６０２，２４４号（それぞれ本明細書に参照により組み込まれている）に開示されている。
基本的に、化学合成は、ジエステル法、トリエステル法、ポリヌクレオチドホスホリラーゼ法及び固相化学により達成できる。これらの方法は、以下でさらに詳細に論じる。
ジエステル法
ジエステル法は、元々、Ｋｈｏｒａｎａら（Ｋｈｏｒａｎａ、１９７９）により使用可能な状態まで最初に開発された。基本的なステップは、２つの適切に保護されたデオキシヌクレオチドをつないで、ホスホジエステル結合を含有するジデオキシヌクレオチドを形成することである。ジエステル法は十分に確立され、ＤＮＡ分子を合成するために用いられている（Ｋｈｏｒａｎａ、１９７９）。
トリエステル法
ジエステル法とトリエステル法との間の主な違いは、反応物と生成物のホスフェート原子上に余分の保護基が後者において存在することである（Ｉｔａｋｕｒａら、１９７５）。ホスフェート保護基は、通常、クロロフェニル基であり、これは、ヌクレオチド及びポリヌクレオチド中間体を有機溶媒に可溶性にする。よって、精製は、クロロホルム溶液において行われる。この方法におけるその他の改善点は、（ｉ）トリマー及びそれより大きいオリゴマーのブロックカップリング、（ｉｉ）中間体及び最終生成物の両方の精製のための高性能液体クロマトグラフィーの広範な使用、並びに（ｉｉｉ）固相合成を含む。
ポリヌクレオチドホスホリラーゼ法。
これは、多くの有用なオリゴヌクレオチドを合成するために用いることができるＤＮＡ合成の酵素による方法である（Ｇｉｌｌａｍら、１９７８；Ｇｉｌｌａｍら、１９７９）。制御された条件下で、ポリヌクレオチドホスホリラーゼは、主に、単一ヌクレオチドを短いオリゴヌクレオチドに付加する。
クロマトグラフィー精製は、所望の単一付加物を得ることを可能にする。手順を開始するために少なくともトリマーが必要であり、このプライマーは何か他の方法により得なければならない。ポリヌクレオチドホスホリラーゼ法は機能し、ほとんどの生化学者が、関与する手順を熟知しているという利点を有する。
固相法。
ポリペプチドの固相合成のために開発された技術を利用して、最初のヌクレオチドを固相支持体物質に付着させ、ヌクレオチドの段階的付加を進めることが可能である。全ての混合及び洗浄ステップは単純化され、手順は、自動化しやすくなっている。これらの合成は、現在、自動化核酸合成機を用いて日常的に行われている。
ホスホロアミダイト化学（Ｂｅａｕｃａｇｅ及びＬｙｅｒ、１９９２）は、断然、オリゴヌクレオチドの合成のために最も広く用いられるカップリング化学になっている。当業者に公知であるように、オリゴヌクレオチドのホスホロアミダイト合成は、活性化剤を用いる反応によりヌクレオシドホスホロアミダイトモノマー前駆体を活性化して、活性化中間体を形成した後に、活性化中間体を、成長しているオリゴヌクレオチド鎖（一般的に、一方の端にて適切な固体支持体に繋留されている）に逐次的に付加し、オリゴヌクレオチド生成物を形成することを含む。
組換え法。
細胞において核酸を生成するための組換え法は、当業者に公知である。これらの方法は、標的細胞又は単純に宿主細胞（大量の所望のＲＮＡ分子を生成するため）であり得る細胞に核酸を送達するためのベクター、プラスミド、コスミド及びその他の媒体の使用を含む。代わりに、このような媒体は、ＲＮＡ分子を作製するための試薬が存在する限り、無細胞系の状況において用いることができる。このような方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、２００３、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、２００１及びＳａｍｂｒｏｏｋ、１９８９（これらは、本明細書に参照により組み込まれている）に記載されるものを含む。あるいくつかの実施形態では、本発明は、合成でない核酸分子に関する。いくつかの実施形態では、核酸分子は、自然に存在する核酸の化学構造、及び１本鎖１次ｍｉＲＮＡ（Ｌｅｅ ２００２を参照されたい）、１本鎖前駆ｍｉＲＮＡ又は１本鎖成熟ｍｉＲＮＡの正確な全体の配列のような自然に存在する核酸の配列を有する。組換え技術の使用に加えて、このような非合成核酸は、オリゴヌクレオチドを創出するために用いられる技術を用いることによるように化学的に作製できる。
ｍｉＲＮＡの設計
ｍｉＲＮＡは、２つの鎖、すなわち研究している成熟ｍｉＲＮＡと配列が同一である活性鎖と、活性鎖と少なくとも部分的に相補的である相補鎖とを典型的に含む。活性鎖は、生物学的に適切な分子であり、ｍＲＮＡ分解又は翻訳制御のいずれかにより翻訳をモジュレートする複合体により細胞において優先的に取り込まれる。活性鎖の優先的な取り込みは、２つの著しい結果を有する：（１）前記ｍｉＲＮＡの観察される活性が劇的に増加し、（２）相補鎖の取り込み及び活性化により誘導される意図しない影響が本質的に排除される。本発明によると、いくつかのｍｉＲＮＡ設計を用いて、活性鎖の優先的な取り込みを確実にできる。
５’遮断剤
相補鎖の５’端にホスフェート又はヒドロキシル以外の安定部分を導入することにより、ｍｉＲＮＡ経路におけるその活性が損なわれる。このことにより、確実に、ｍｉＲＮＡの活性鎖だけが、細胞において翻訳を調節するために用いられる。５’修飾は、それらに限定されないが、ＮＨ２、ビオチン、アミン基、低級アルキルアミン基、アセチル基、２’Ｏ−Ｍｅ、ＤＭＴＯ、フルオレセイン、チオール若しくはアクリジン又はこの型の官能性を有する任意のその他の基を含む。
その他のセンス鎖修飾。２’−Ｏ Ｍｅ、２’−デオキシ、Ｔ−デオキシ−２’−フルオロ、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−メトキシエチル（２’−Ｏ−ＭＯＥ）、２’−Ｏ−アミノプロピル（２’−Ｏ−ＡＰ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＯＥ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノプロピル（２’−Ｏ−ＤＭＡＰ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＥＯＥ）若しくは２’−Ｏ−Ｎ−メチルアセトアミド（２’−Ｏ−ＮＭＡ）、ＮＨ２、ビオチン、アミン基、低級アルキルアミン基、アセチル基、ＤＭＴＯ、フルオレセイン、チオール若しくはアクリジン又はこの型の官能性を有する任意のその他の基のようなヌクレオチド修飾をｍｉＲＮＡの相補鎖に導入することにより、相補鎖の活性を排除し、ｍｉＲＮＡの活性鎖の取り込みを増強できる。
センス鎖における塩基ミスマッチ。ｓｉＲＮＡを用いる場合（Ｓｃｈｗａｒｚ ２００３）と同様に、ｍｉＲＮＡの活性鎖の５’及び３’端の相対的安定性は、ｍｉＲＮＡ経路による活性鎖の取り込み及び活性化を明らかに決定する。ｍｉＲＮＡの活性鎖の不安定な５’端を、合成ｍｉＲＮＡの相補鎖の３’端に塩基ミスマッチを戦略的に配置することにより安定化することにより、活性鎖の活性が増強され、相補鎖の活性が本質的に排除される。
宿主細胞及び標的細胞
ｍｉＲＮＡ若しくはその供給源を導入するか、又はｍｉＲＮＡの存在が評価される細胞は、任意の生物に由来又は含有されることができる。好ましくは、細胞は、脊椎動物細胞である。より好ましくは、細胞は、哺乳動物細胞である。さらにより好ましくは、細胞は、ヒト細胞である。
哺乳動物細胞は、生殖系列又は体細胞から、全能性又は多能性、分裂性又は非分裂性、上皮、不死化又は形質転換されているなどであってもよい。細胞は、幹細胞のような未分化細胞、又は器官若しくは組織の細胞からのように分化細胞であってもよい。代わりに、細胞は、上皮若しくは内皮細胞、間質細胞、脳、乳房、子宮頸部、結腸、胃腸管、心臓、腎臓、大腸、肝臓、肺、卵巣、膵臓、心臓、前立腺、膀胱、小腸、胃、精巣又は子宮になっていてもよい。
本明細書で用いる場合、用語「細胞」、「株化細胞」及び「細胞培養物」は、交換可能に用いることができる。これらの用語は全て、それらの子孫（細胞分裂により形成される任意の及び全ての後続の世代）も含む。計画的又は偶発性の変異により、全ての子孫は同一でないことがあることが理解される。宿主細胞は、「トランスフェクション」又は「形質転換」されることがあり、これは、外因性核酸が宿主細胞に移入又は導入されるプロセスのことをいう。形質転換細胞は、初代対象細胞及びその子孫を含む。本明細書で用いる場合、用語「工学的修飾」及び「組換え」細胞又は宿主細胞は、例えば小型干渉ＲＮＡ又はレポーター遺伝子をコードする鋳型構築物のような外因性核酸配列が導入された細胞のことをいうことを意図する。よって、組換え細胞は、組換えにより導入された核酸を含有しない自然に存在する細胞から区別可能である。
組織は、核酸送達組成物及び／若しくはさらなる物質で形質転換されるか又はそれと接触させる１つ又は複数の宿主細胞を含むことがある。組織は、生物の一部分であるか、又は生物から分離されていてもよい。あるいくつかの実施形態では、組織及びそれを構成する細胞は、それらに限定されないが、脳、幹細胞、肝臓、肺、骨、乳房、子宮頸部、結腸、子宮内膜、上皮、食道、杯細胞、腎臓、卵巣、膵臓、前立腺、膀胱、皮膚、小腸、胃、精巣、心臓、血管を含むことがある。
あるいくつかの実施形態では、宿主細胞又は組織は、少なくとも１つの生物に含まれていてもよい。あるいくつかの実施形態では、生物は、哺乳動物、ヒト、霊長類又はマウスであってもよい。当業者は、上記の宿主細胞の全てをインキュベートして維持し、子孫を形成するためにそれらの分裂を可能にする条件についてさらに理解している。
送達方法
本発明は、いくつかの実施形態では、細胞に核酸を送達することを含む。このことは、スクリーニング法の一部として行うことができるか、又は治療若しくは診断への応用と関係していてもよい。
ＲＮＡ分子は、ベクターに含まれる核酸分子によりコードされることがある。用語「ベクター」は、核酸配列を複製できる細胞に核酸配列を導入するために核酸配列を挿入できる担体核酸分子のことをいうために用いられる。核酸配列は「外因性」であり得、これは、核酸配列が、ベクターが導入される細胞にとって外来であるか、又は配列が細胞内の配列と相同であるが、配列が通常見出されない宿主細胞核酸内の位置にあることを意味する。ベクターは、プラスミド、コスミド、ウイルス（バクテリオファージ、動物ウイルス、レンチウイルス及び植物ウイルス）、及び人工染色体（例えばＹＡＣ）を含む。当業者は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９及びＡｕｓｕｂｅｌら、１９９６（ともに本明細書に参照により組み込まれている）に記載されている標準的な組換え技術によりベクターを構築するための準備が十分にできている。修飾ゲロニンのような修飾ポリペプチドをコードすることに加えて、ベクターは、タグ又は標的化分子のような非修飾ポリペプチド配列をコードしてもよい。標的化分子は、所望の核酸を、対象の体内の特定の器官、組織、細胞又はその他の部位に向けるものである。
用語「発現ベクター」は、転写され得る遺伝子生成物の少なくとも一部分をコードする核酸配列を含有するベクターのことをいう。発現ベクターは、様々な「制御配列」（特定の宿主生物において作動可能に連結したコード配列の転写及びおそらく翻訳のために必要な核酸配列のことをいう）を含有できる。転写及び翻訳を支配する制御配列に加えて、ベクター及び発現ベクターは、他の機能も奏し、記載されている核酸配列を含有してもよい。
発現ベクターを細胞に導入できるいくつかの方式がある。本発明のあるいくつかの実施形態では、発現ベクターは、ウイルスベクター、又はウイルスゲノムに由来する工学改変ベクターを含む。受容体媒介エンドサイトーシスにより細胞に侵入し、宿主細胞ゲノムに組み込まれ、ウイルス遺伝子を安定的及び効果的に発現するあるいくつかのウイルスの能力により、ウイルスは、哺乳動物細胞への外来遺伝子の移入のために魅力的な候補になっている（Ｒｉｄｇｅｗａｙ、１９８８；Ｎｉｃｏｌａｓ及びＲｕｂｅｎｓｔｅｉｎ、１９８８；Ｂａｉｃｈｗａｌ及びＳｕｇｄｅｎ、１９８６；Ｔｅｍｉｎ、１９８６）。遺伝子ベクターとして用いられた最初のウイルスは、パポバウイルス（サルウイルス４０、ウシパピローマウイルス、及びポリオーマ）（Ｒｉｄｇｅｗａｙ、１９８８；Ｂａｉｃｈｗａｌ及びＳｕｇｄｅｎ、１９８６）及びアデノウイルス（Ｒｉｄｇｅｗａｙ、１９８８；Ｂａｉｃｈｗａｌ及びＳｕｇｄｅｎ、１９８６）を含むＤＮＡウイルスであった。これらは、外来ＤＮＡ配列についての容量が比較的低く、宿主スペクトルが制限される。さらに、許容細胞におけるそれらの発癌能及び細胞変性効果は、安全性の懸念を高める。これらは、８ｋｂまでの外来遺伝物質しか収容できないが、様々な株化細胞及び実験動物に容易に導入できる（Ｎｉｃｏｌａｓ及びＲｕｂｅｎｓｔｅｉｎ、１９８８；Ｔｅｍｉｎ、１９８６）。発現ベクターは、１つのプロモーターと、１つ又は複数のスペーサ領域で分離された１つ又は複数のステム−ループ構造とを含むＲＮＡｉ発現カセットを含有できる（国際公開第２００６／０８４２０９号パンフレット）。
アビジン融合タンパク質を用いて細胞に発現ベクターを導入する別の方式は、米国特許第６，２８７，７９２号に記載されている。
レトロウイルスは、感染細胞においてレトロウイルスのＲＮＡを２本鎖ＤＮＡに変換する能力により特徴付けられる１本鎖ＲＮＡウイルスの群である。これらは、ベクターとして用いることもできる。他のウイルスベクターを、本発明において発現構築物として採用できる。ワクシニアウイルス（Ｒｉｄｇｅｗａｙ、１９８８；Ｂａｉｃｈｗａｌ及びＳｕｇｄｅｎ、１９８６；Ｃｏｕｐａｒら、１９８８）、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）（Ｒｉｄｇｅｗａｙ、１９８８；Ｂａｉｃｈｗａｌ及びＳｕｇｄｅｎ、１９８６；Ｈｅｒｍｏｎａｔ及びＭｕｚｙｃｓｋａ、１９８４）、レンチウイルス（国際公開第２００８／０７１９５９号パンフレット、国際公開第２００４／０５４５１２号パンフレット）、センダイウイルス（国際公開第２００４／０３５７７９号パンフレット）、バキュロウイルス（国際公開第２００６／０４８６６２号パンフレット）及びヘルペスウイルスのようなウイルスに由来するベクターを採用してもよい。これらは、様々な哺乳動物細胞についていくつかの魅力的な特徴を提供する（Ｆｒｉｅｄｍａｎｎ、１９８９；Ｒｉｄｇｅｗａｙ、１９８８；Ｂａｉｃｈｗａｌ及びＳｕｇｄｅｎ、１９８６；Ｃｏｕｐａｒら、１９８８；Ｈｏｒｗｉｃｈら、１９９０）。
本発明の組成物の発現に影響する核酸送達のためのその他の適切な方法は、核酸（例えばウイルス及び非ウイルスベクターを含むＤＮＡ）を、細胞小器官、細胞、組織又は生物に導入でき、本明細書に記載するか又は当業者に知られる実質的にいずれの方法も含むと考えられる。このような方法は、それらに限定されないが、微量注入（Ｈａｒｌａｎ及びＷｅｉｎｔｒａｕｂ、１９８５；米国特許第５，７８９，２１５号（本明細書に参照により組み込まれている））を含む注入（米国特許第５，９９４，６２４号、米国特許第５，９８１，２７４号、米国特許第５，９４５，１００号、米国特許第５，７８０，４４８号、米国特許第５，７３６，５２４号、米国特許第５，７０２，９３２号、米国特許第５，６５６，６１０号、米国特許第５，５８９，４６６号及び米国特許第５，５８０，８５９号（それぞれ本明細書に参照により組み込まれている））、エレクトロポレーション（米国特許第５，３８４，２５３号（本明細書に参照により組み込まれている））、リン酸カルシウム沈殿（Ｇｒａｈａｍ及びＶａｎ Ｄｅｒ Ｅｂ、１９７３；Ｃｈｅｎ及びＯｋａｙａｍａ、１９８７；Ｒｉｐｐｅら、１９９０）、ＤＥＡＥ−デキストランとその後のポリエチレングリコールの使用（Ｇｏｐａｌ、１９８５）、直接音波充填（Ｆｅｃｈｈｅｉｍｅｒら、１９８７）、リポソーム媒介トランスフェクション（Ｎｉｃｏｌａｕ及びＳｅｎｅ、１９８２；Ｆｒａｌｅｙら、１９７９；Ｎｉｃｏｌａｕら、１９８７；Ｗｏｎｇら、１９８０；Ｋａｎｅｄａら、１９８９；Ｋａｔｏら、１９９１）、光化学的内部移行（国際公開第２００８／００７０７３号パンフレット）、微粒子銃（ＰＣＴ出願国際公開第９４／０９６９９号パンフレット及び国際公開第９５／０６１２８号パンフレット；米国特許第５，６１０，０４２号、米国特許第５，３２２，７８３号、米国特許第５，５６３，０５５号、米国特許第５，５５０，３１８号、米国特許第５，５３８，８７７号及び米国特許第５，５３８，８８０号（それぞれ本明細書に参照により組み込まれている））、炭化ケイ素繊維を用いるかき混ぜ（Ｋａｅｐｐｌｅｒら、１９９０；米国特許第５，３０２，５２３号及び米国特許第５，４６４，７６５号（それぞれ本明細書に参照により組み込まれている））、アグロバクテリウム媒介形質転換（米国特許第５，５９１，６１６号及び米国特許第５，５６３，０５５号（それぞれ本明細書に参照により組み込まれている））、若しくはプロトプラストのＰＥＧ媒介形質転換（Ｏｍｉｒｕｌｌｅｈら、１９９３；米国特許第４，６８４，６１１号及び米国特許第４，９５２，５００号（それぞれ本明細書に参照により組み込まれている））、乾燥／阻害媒介ＤＮＡ取り込み（Ｐｏｔｒｙｋｕｓら、１９８５）によるようなＤＮＡの直接送達を含む。これらのような技術を用いることにより、細胞小器官（複数可）、細胞（複数可）、組織（複数可）又は生物（複数可）は、安定的又は一過的に形質転換できる。
ある概説は、細胞へのＲＮＡ分子の内部移行を最適化するためにＲＮＡ分子を処方するいくつかの方式を示す（Ｋｉｍ ＳＳ．ら、Ｔｒｅｎｄｓ Ｍｏｌ． Ｍｅｄ．、２００９、１５：４９１〜５００頁）。以下のその他の出版物（それぞれ本明細書に参照により組み込まれている）は、細胞へのＲＮＡ分子の内部移行を改善するためにＲＮＡ分子を処方する代替の方式を開示する：国際公開第２００７／０９５１５２号パンフレット（オリゴヌクレオチドの送達のためのＰＴＤ−ＤＲＢＤ（２本鎖結合ドメインに連結したペプチド導入ドメイン）の使用について記載している）、国際公開第２００９／０８６５５８号パンフレット（細胞取り込み及び粒子に負荷された核酸のエンドソームでの放出を可能にするカチオン性脂質と膜融合性脂質の混合物を含むＳＮＡＬＰ（安定核酸脂質粒子）粒子の使用について記載している）、国際公開第２００９／１４９４１８号パンフレット（中性リン脂質−油−ＲＮＡｉ乳化物について記載している）、国際公開第２００７／１２１９４７号パンフレット（リポプレックスに基づく送達媒体の使用について記載している）、国際公開第２００９／１３２１３１号パンフレット（新規な脂質と、効率的な被包及び被包された核酸の細胞への効率的な送達をもたらす核酸−脂質粒子の使用について記載している）、国際公開第２００４／０９１５７８号パンフレット及び国際公開第２００４／０６４８０５号パンフレット（核酸分子周囲にらせん状になる脂質の交互になった層の渦巻型技術について記載している）、国際公開第２００３／０４７４９４号パンフレット及び国際公開第２００３／０４７４９３号パンフレット（経口及び粘膜送達のための核酸を組み込んだ逆ミセルについて記載している）、国際公開第２００８／１５６７０２号パンフレット（細菌と、細胞への送達媒体としてのためのオリゴヌクレオチドを含む細菌治療粒子（ＢＴＰ）について記載している）。本発明は、これらの出版物で言及又は開示されるそれぞれの処方を包含する。
様々な化合物をオリゴヌクレオチドの端に付着させて、細胞膜を横切るオリゴヌクレオチドの輸送を容易にしている。ＨＩＶ ＴＡＴ、ＨＳＶ ＶＰ２２、ドロソフィラアンテナペディア（Ｄｒｏｓｐｈｉｌａ ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａ）で見出される短いシグナルペプチド及びその他のタンパク質は、膜を横切る生体分子の迅速な移行を可能にすることが見出されている（Ｓｃｈｗａｒｚｅ ２０００による概説）。タンパク質導入ドメイン（ＰＴＤ）とよばれるこれらのシグナルペプチドをオリゴヌクレオチドに付着させて、培養細胞へのオリゴヌクレオチドの送達を容易にしている（Ｅｇｕｃｈｉ Ａ、Ｄｏｗｄｙ ＳＦ、Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｓｃｉ．、２００９、７：３４１〜５頁）。コレステロールをオリゴヌクレオチドにコンジュゲートして、動物において細胞へのオリゴヌクレオチドの取り込みを改善している（ＭａｃＫｅｌｌａｒ １９９２）。末端のコレステロール基は、細胞の表面上の受容体又は脂質と明らかに相互作用して、修飾オリゴヌクレオチドの内部移行を容易にする。同様に、ポリ−Ｌ−リシンをオリゴヌクレオチドにコンジュゲートして、正味の負電荷を減少させ、細胞への取り込みを改善している（Ｌｅｏｎｅｔｔｉ １９９０）。
核酸と複合体を形成し、核酸を細胞表面に送達し、エンドドームへの核酸の取り込み及びエンドソームからの核酸の放出を容易にする様々な化合物が開発されている。これらは、（１）ＤＯＴＡＰ（又はその他のカチオン性脂質）、ＤＤＡＢ、ＤＨＤＥＡＢ及びＤＯＰＥのような様々な脂質、並びに（２）ポリエチレンイミン、ポリアミドアミン並びにこれら及びその他のポリマーのデンドリマーのような非脂質ベースのポリマーを含む。これらの実施形態のあるいくつかでは、ＤＯＴＡＰとコレステロール又はコレステロール誘導体（米国特許第６，７７０，２９１号（これは、本明細書に参照により組み込まれている））のような脂質の組み合わせが採用される。これらの物質のいくつかは、動物において核酸取り込みを容易にすることが示されている。
ｍｉＲＮＡ経路に関与する細胞構成成分がわかってきた。細胞内でｍｉＲＮＡを安定化及び／又は輸送するタンパク質がｍｉＲＮＡの安定性及び活性を増強すると考えられる。なぜなら、これらのタンパク質が、ｍｉＲＮＡが一旦細胞内に入ると、結合しているｍｉＲＮＡ を保護して誘導するからである。ｍｉＲＮＡ輸送体タンパク質とｍｉＲＮＡとの混合物は、ｍｉＲＮＡに基づく治療の効率を増強できた。ＲＮＡは、アニオン性のホスフェート及び糖主鎖のおかげで疎水性分子である。ヌクレオ塩基は疎水性であるが、ホスフェート及び糖残基に起因する広範な水素結合のために親水性が優位を占める。親水性の特徴及びアニオン性の主鎖は、細胞透過性を低減する。コレステロール（Ｍａｎｏｈａｒａｎ、２００２）並びにＣ３２機能性を有するラウリン酸及びリソコール酸誘導体（Ｌｏｒｅｎｚら、２００４）のような親油性基のコンジュゲーションは、細胞取り込みを改善することが示されている。さらに、ステロイドとコンジュゲートしたオリゴヌクレオチドとＬＤＬのような血流中の異なるリポタンパク質との結合は、オリゴヌクレオチドの完全性を保護し、それらの生体分布を支配する（Ｒｕｍｐら、２０００）。アンチセンス分子（Ｂｉｊｓｔｅｒｂｏｓｃｈら、２００１）及びアプタマー（Ｒｕｓｃｏｎｉら、２００４）に付着したコレステロールは、リポタンパク質との結合を可能にすることによりオリゴヌクレオチドを安定化することも示されている。コレステロールは、ｓｉＲＮＡの取り込み及び血清安定性をｉｎ ｖｉｔｒｏ（Ｌｏｒｅｎｚら、２００４）及びｉｎ ｖｉｖｏ（Ｓｏｕｔｓｃｈｅｋら、２００４）で増強することが証明されている。さらに、ＳＢ−４３５４９５（Ｂｌａｃｋｉｅら、（２００２）、イスラジピン（Ｏｒａｖｃｏｖａら、１９９４）、アムロジピン（Ｏｒａｖｃｏｖａら、１９９４）及び２，２’，４，４’，５，５’−ヘキサクロロビフェニル（Ｂｏｒｌａｋｏｇｌｕら、１９９０）のようないくつかの小分子は、細胞取り込みを増強でき、リポタンパク質会合を促進することによりヌクレアーゼ耐性を改善できた。
ｍｉＲＮＡライブラリーを用いるスクリーニング
本特許出願で用いる場合、スクリーニングは、複数のｍｉＲＮＡ特異的試剤を別々に個別の細胞集団又は動物に送達するプロセスである。送達後の１つ又は複数の指定された時間にて、細胞集団又は動物を、１つ又は複数の表現型についてアッセイする。陰性対照群の細胞又は動物よりも著しく異なる表現型を有する細胞又は動物は、陽性として分類する。試料において操作されたｍｉＲＮＡをヒットと定義する。ヒットは、さらなる研究及び可能性のある治療薬開発のための標的である。
いくつかの実施形態では、スクリーニングのための多重ステッププロセスがあり、あるいくつかの実施形態では、４つの一般的なステップがある：
（１）研究する細胞プロセスを監視するための定量アッセイの開発。
細胞サイズ、細胞周期状態又は抗体染色を監視する顕微鏡アッセイから、細胞溶解物中の特定の基質の代謝回転を評価する酵素アッセイ、溶解物中、細胞又は培地中の生体分子又は小分子の直接測定までの範囲の細胞表現型の強度を測定するアッセイ。
スクリーニングの成功のために重要なことは、細胞表現型を真に測定するアッセイを創出し、アッセイのシグナル対ノイズ比を最大限にすることである。シグナル対ノイズ比を最大限にすることは、アッセイ時間、アッセイ成分、細胞型及びトランスフェクションとアッセイとの間の時間の長さのような変数を試験することを含む。陽性表現型と陰性対照表現型との間のアッセイの結果の差が大きいほど、スクリーニング結果の広がりがより大きく、興味のある遺伝子を同定する機会がより増える。バッチ感染を用いる代替スクリーニング法が存在する。
（２）所望の細胞についてのトランスフェクション条件の最適化。
このプロセスの第１ステップは、高い細胞生存性を維持しながら合成ｍｉＲＮＡの取り込みを最大限にするトランスフェクション試薬及び播種条件を同定することである。我々は、株化細胞を用いる場合に２〜５の異なるトランスフェクション試薬、又は初代若しくは懸濁細胞を用いる場合に５〜１０のエレクトロポレーション条件を試験することが有用であることを見出している。トランスフェクションは、試験した条件のうちで最も良好に機能する試薬又はエレクトロポレーション条件について最適化できる。ｍｉＲＮＡ特異的ライブラリーのスクリーニングは、ハイスループットトランスフェクションのための条件を必要とする。この型のスクリーニングでは、トランスフェクションよりもむしろレンチウイルス導入を用いた。レンチウイルス導入は、代替の最適化技術を必要とすることがある。
（３）スクリーニング
アッセイ及びトランスフェクションプロセスが一旦開発されると、合成ｍｉＲＮＡ又はウイルスにより発現されるｍｉＲＮＡのライブラリーを、２４又は９６ウェルプレート中の細胞に逐次導入できる。同じ試剤を２重又は３重にしてトランスフェクションすることにより、妥当な統計分析のために十分なデータが得られる。実験部において行ったＭＴＳアッセイは、このようなスクリーニングの例である。
（４）ヒットの検証
ヒットを検証することは、観察された表現型が、標的にしたｍｉＲＮＡによるものであることを示すことを含む。ヒットは、ヒットとして示されたｍｉＲＮＡ阻害剤又は合成ｍｉＲＮＡの系列希釈を、元来アッセイした細胞に送達することにより、典型的に確認される。確認は、検証とは少し異なる。確認は、ｍｉＲＮＡにより誘導された表現型の反復であり、検証は、ｍｉＲＮＡにより媒介された表現型を拮抗することにより表現型を逆にすることも含み得る。
標識化及び標識化技術
いくつかの実施形態では、本発明は、特定のｍｉＲＮＡ種の治療又は診断における適切さを評価するためのスクリーニングアッセイのためのような、標識されたｍｉＲＮＡに関する。標識の前に、ｍｉＲＮＡをまず単離し（ｍｉＲＮＡが細胞にとって内因性である細胞又はｍｉＲＮＡが細胞にとって外因性である細胞のいずれかから）、及び／又は精製することが企図される。このことにより、標識の前にｍｉＲＮＡが単離又は精製されていない試料中の他のＲＮＡとは反対に、ｍｉＲＮＡをより効率的に標識する反応が達成できる。本発明の多くの実施形態では、標識は、非放射活性である。一般的に、核酸は、標識されたヌクレオチドを加えることにより（１ステッププロセス）、又はヌクレオチドを加え、加えたヌクレオチドを標識することにより（２ステッププロセス）標識できる。
さらに、ｍｉＲＮＡは、米国特許出願第６０／６４９，５８４号（これは、本明細書に参照により組み込まれている）に記載されるようにして標識してもよい。このようなヌクレオチドは、蛍光色素を含む色素又はビオチンのような分子を用いて標識できる。標識されたヌクレオチドは、容易に入手可能である。これらのヌクレオチドは、商業的に獲得できるか、又は当業者に知られる反応により合成できる。
標識化のためのヌクレオチド
標識化のためのヌクレオチドは、自然に存在するヌクレオチドではなく、代わりに、反応性部分を有する調製ヌクレオチドのことをいう。対象の特異的反応性官能基は、アミノ、スルフヒドリル、スルホキシル、アミノスルフヒドリル、アジド、エポキシド、イソチオシアネート、イソシアネート、無水物、モノクロロトリアジン、ジクロロトリアジン、モノ又はジハロゲン置換ピリジン、モノ又はジ置換ジアジン、マレイミド、エポキシド、アジリジン、ハロゲン化スルホニル、ハロゲン化酸、ハロゲン化アルキル、ハロゲン化アリール、アルキルスルホネート、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、イミドエステル、ヒドラジン、アジドニトロフェニル、アジド、３−（２−ピリジルジチオ）−プロピオンアミド、グリオキサール、アルデヒド、ヨードアセチル、シアノメチルエステル、ｐ−ニトロフェニルエステル、ｏ−ニトロフェニルエステル、ヒドロキシピリジンエステル、カルボニルイミダゾール及びその他のこのような化学基を含む。いくつかの実施形態では、反応性官能基は、ヌクレオチドと直接結合できるか、又は連結基を介してヌクレオチドと結合できる。官能基部分及び任意のリンカーは、ｍｉＲＮＡに付加されるか又はｍｉＲＮＡを標識するヌクレオチドの能力を実質的に損なうことはできない。代表的な連結基は、典型的に約２〜１８、通常約２〜８炭素原子の範囲の炭素含有連結基を含み、該炭素含有連結基は、例えばＳ、Ｏ、Ｎなどの１つ又は複数のヘテロ原子を含むか又は含まないことがあり、１つ又は複数の不飽和部位を含むか又は含まないことがある。多くの実施形態において特に興味があるものは、アルキル連結基、典型的に１〜１６、通常１〜４炭素原子の低級アルキル連結基であり、該連結基は、１つ又は複数の不飽和部位を含むことがある。官能化標的作製の上記の方法において用いる官能化ヌクレオチド（又はプライマー）は、既知のプロトコールを用いて製作できるか、又は業者、例えばＳｉｇｍａ、Ｒｏｃｈｅ、Ａｍｂｉｏｎ及びＩＤＴから購入できる。官能基は、米国特許第４，４０４，２８９号、米国特許第４，４０５，７１１号、米国特許第４，３３７，０６３号及び米国特許第５，２６８，４８６号、並びに英国特許第１，５２９，２０２号（これらは全て参照により組み込まれている）で見出される代表的な情報を含む、当業者に知られる方式に従って調製してもよい。
アミン修飾ヌクレオチドは、本発明のいくつかの実施形態において用いられる。アミン修飾ヌクレオチドは、標識の付着のための反応性アミン基を有するヌクレオチドである。任意のリボヌクレオチド（Ｇ、Ａ、Ｕ又はＣ）又はデオキシリボヌクレオチド（Ｇ、Ａ、Ｔ又はＣ）を標識化のために修飾できることが企図される。例は、それらに限定されないが、以下の修飾リボヌクレオチド及びデオキシリボヌクレオチドを含む：５−（３−アミノアリル）−ＵＴＰ；８−［（４−アミノ）ブチル］−アミノ−ＡＴＰ及び８−［（６−アミノ）ブチル］−アミノ−ＡＴＰ；Ｎ６−（４−アミノ）ブチル−ＡＴＰ、Ｎ６−（６−アミノ）ブチル−ＡＴＰ、Ｎ４−［２，２−オキシ−ビス−（エチルアミン）］−ＣＴＰ；Ｎ６−（６−アミノ）ヘキシル−ＡＴＰ；８−［（６−アミノ）ヘキシル］−アミノ−ＡＴＰ；５−プロパルギルアミノ−ＣＴＰ、５−プロパルギルアミノ−ＵＴＰ；５−（３−アミノアリル）−ｄＵＴＰ；８−［（４−アミノ）ブチル］−アミノ−ｄＡＴＰ及び８−［（６−アミノ）ブチル］−アミノ−ｄＡＴＰ；Ｎ−（４−アミノ）ブチル−ｄＡＴＰ、Ｎ６−（６−アミノ）ブチル−ｄＡＴＰ、Ｎ４−［２，２−オキシ−ビス−（エチルアミン）］−ｄＣＴＰ；Ｎ６−（６−アミノ）ヘキシル−ｄＡＴＰ；８−［（６−アミノ）ヘキシル］−アミノ−ｄＡＴＰ；５−プロパルギルアミノ−ｄＣＴＰ、並びに５−プロパルギルアミノ−ｄＵＴＰ。このようなヌクレオチドは、当業者に知られる方法に従って調製できる。さらに、当業者は、５−（３−アミノアリル）−ＵＴＰの代わりに、５−（３−アミノアリル）−ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ又はｄＵＴＰのような同じアミン修飾を有するその他のヌクレオチド体を調製できる。
標識化技術
いくつかの実施形態では、核酸に、１つ又は複数の既に標識されたヌクレオチドを触媒的に付加することにより核酸を標識する。１つ又は複数の標識されたヌクレオチドをｍｉＲＮＡ分子に付加できる。米国特許第６，７２３，５０９号（これは、本明細書に参照により組み込まれている）を参照されたい。
その他の実施形態では、１つ又は複数の未標識ヌクレオチドをｍｉＲＮＡに触媒的に付加し、未標識ヌクレオチドを、後で標識化されることを可能にする化学的部分で修飾し、本発明の実施形態では、化学的部分は、ヌクレオチドがアミン修飾ヌクレオチドであるように反応性アミンである。アミン修飾ヌクレオチドの例は、当業者に公知であり、Ａｍｂｉｏｎ、Ｓｉｇｍａ、Ｊｅｎａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ及びＴｒｉＬｉｎｋからのように多くが商業的に入手可能である。
ｃＤＮＡをその合成中に標識することとは対照的に、ｍｉＲＮＡを標識することについての問題点は、既に存在する分子をどのようにして標識するかということである。このために、我々は、ジ−若しくはトリ−ホスフェートリボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドをｍｉＲＮＡ、小型ＲＮＡ分子に付加するためにそれを基質として用いることができる酵素を用いることがある。さらに、具体的な実施形態では、修飾ジホスフェートリボヌクレオチド又はトリホスフェートリボヌクレオチドを用いることを含み、該リボヌクレオチドをｍｉＲＮＡの３’端に付加する。酵素の供給源は限定されない。酵素の供給源の例は、酵母、イー・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）のようなグラム陰性細菌、ラクトコッカス・ラクチス（ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）及びヒツジポックスウイルスを含む。
このようなヌクレオチドを付加できる酵素は、それらに限定されないが、ポリ（Ａ）ポリメラーゼ、ターミナルトランスフェラーゼ及びポリヌクレオチドホスホリラーゼを含む。本発明の具体的な実施形態では、リガーゼは、標識を付加するために用いる酵素として企図されず、代わりに、非リガーゼ酵素を採用する。
ポリ（Ａ）ポリメラーゼは、植物からヒトまでのいくつかの生物からクローニングされている。該ポリメラーゼは、ホモポリマー領域をＲＮＡに付加することを触媒することが示されている（Ｍａｒｔｉｎら、ＲＮＡ、４（２）：２２６〜３０頁、１９９８）。
ターミナルトランスフェラーゼは、核酸の３’末端へのヌクレオチドの付加を触媒する。
ポリヌクレオチドホスホリラーゼは、プライマーを必要とすることなく、ヌクレオチドジホスフェートを重合できる。
標識及びタグ
ｍｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡプローブは、検出又は単離目的のための陽電子放射（放射活性を含む）、酵素、比色（可視及び蛍光を含むＵＶスペクトルを含む）、ルミネセンス若しくはその他の標識又はタグで標識してもよい。標識は、直接的又は間接的に検出してもよい。放射活性標識は、１２５Ｉ、３２Ｐ、３３Ｐ及び３５Ｓを含む。酵素標識の例は、アルカリホスファターゼ、ルシフェラーゼ、セイヨウワサビペルオキシダーゼ及びβ−ガラクトシダーゼを含む。標識は、ルミネセンス特性を有するタンパク質、例えば緑色蛍光タンパク質及びフィコエリスリンであってもよい。
コンジュゲートとして用いるために企図される比色及び蛍光標識は、それらに限定されないが、ＡＭＣＡ、アレクサフルオール（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ）色素、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ、ＢＯＤＩＰＹ ６３０／６５０、ＢＯＤＩＰＹ ６５０／６６５、ＢＯＤＩＰ Ｙ−Ｒ６Ｇ、ＢＯＤＩＰＹ−ＴＲＸのようなＢＯＤＩＰＹ色素；カスケードブルー；カスケードイエロー；クマリン並びに７−アミノ−４−メチルクマリン、アミノクマリン及びヒドロキシクマリンのようなその誘導体；Ｃｙ３及びＣｙ５のようなシアニン色素；エオシン及びエリスロシン；フルオレセイン及びフルオレセインイソチオシアネートのようなその誘導体；クアンタムダイ（Ｑｕａｎｔｕｍ Ｄｙｅ）（商標）のようなランタニドイオンの大環状キレート；マリーナブルー；オレゴングリーン；ローダミンレッド、テトラメチルローダミン及びローダミン６Ｇのようなローダミン色素；テキサスレッドを含む。
色素の具体例は、それらに限定されないが、上及び以下で同定されるものを含む：アレクサフルオール３５０、アレクサフルオール４０５、アレクサフルオール４３０、アレクサフルオール４８８、アレクサフルオール５００。アレクサフルオール５１４、アレクサフルオール５３２、アレクサフルオール５４６、アレクサフルオール５５５、アレクサフルオール５６８、アレクサフルオール５９４、アレクサフルオール６１０、アレクサフルオール６３３、アレクサフルオール６４７、アレクサフルオール６６０、アレクサフルオール６８０、アレクサフルオール７００及びアレクサフルオール７５０；ＢＯＤＩＰＹ ４９３／５０３、ＢＯＤＩＰＹ ５３０／５５０、ＢＯＤＩＰＹ ５５８／５６８、ＢＯＤＩＰＹ ５６４／５７０、ＢＯＤＩＰＹ ５７６／５８９、ＢＯＤＩＰＹ ５８１／５９１、ＢＯＤＩＰＹ ６３０／６５０、ＢＯＤＩＰＹ ６５０／６５５、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ、ＢＯＤＩＰＹ Ｒ６Ｇ、ＢＯＤＩＰＹ ＴＭＲ及びＢＯＤＩＰＹ−ＴＲのようなアミン反応性ＢＯＤＩＰＹ色素；Ｃｙ３、Ｃｙ５、６−ＦＡＭ、フルオレセインイソチオシアネート、ＨＥＸ、６−ＪＯＥ、オレゴングリーン４８８、オレゴングリーン５００、オレゴングリーン５１４、パシフィックブルー、ＲＥＧ、ローダミングリーン、ローダミンレッド、レノグラフィン、ＲＯＸ、ＳＹＰＲＯ、ＴＡＭＲＡ、２’，４’，５’，７’−テトラブロモスルホンフルオレセイン及びＴＥＴ。
蛍光標識されたリボヌクレオチドの具体例は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓから入手可能であり、これらは、アレクサフルオール４８８−５−ＵＴＰ、フルオレセイン−１２−ＵＴＰ、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ−１４−ＵＴＰ、ＢＯＤＩＰＹ ＴＭＲ−１４−ＵＴＰ、テトラメチルローダミン−６−ＵＴＰ、アレクサフルオール５４６−１４−ＵＴＰ、テキサスレッド−５−ＵＴＰ及びＢＯＤＩＰＹ ＴＲ−１４−ＵＴＰを含む。その他の蛍光リボヌクレオチドは、Ｃｙ３−ＵＴＰ及びＣｙ５−ＵＴＰのようにＡｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから入手可能である。蛍光標識されたデオキシリボヌクレオチドの例は、ジニトロフェニル（ＤＮＰ）−１１−ｄＵＴＰ、カスケードブルー−７−ｄＵＴＰ、アレクサフルオール４８８−５−ｄＵＴＰ、フルオレセイン−１２−ｄＵＴＰ、オレゴングリーン４８８−５−ｄＵＴＰ、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ−１４−ｄＵＴＰ、ローダミングリーン−５−ｄＵＴＰ、アレクサフルオール５３２−５−ｄＵＴＰ、ＢＯＤＩＰＹ ＴＭＲ−１４−ｄＵＴＰ、テトラメチルローダミン−６−ｄＵＴＰ、アレクサフルオール５４６−１４−ｄＵＴＰ、アレクサフルオール５６８−５−ｄＵＴＰ、テキサスレッド−１２−ｄＵＴＰ、テキサスレッド−５−ｄＵＴＰ、ＢＯＤＩＰＹ ＴＲ−１４−ｄＵＴＰ、アレクサフルオール５９４−５−ｄＵＴＰ、ＢＯＤＩＰＹ ６３０／６５０−１４−ｄＵＴＰ、ＢＯＤＩＰＹ ６５０／６６５−１４−ｄＵＴＰ；アレクサフルオール４８８−７−ＯＢＥＡ−ｄＣＴＰ、アレクサフルオール５４６−１６−ＯＢＥＡ−ｄＣＴＰ、アレクサフルオール５９４−７−ＯＢＥＡ−ｄＣＴＰ、アレクサフルオール６４７−１２−ＯＢＥＡ−ｄＣＴＰを含む。核酸を、２つの異なる標識で標識してもよいことが企図される。さらに、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）を本発明の方法において採用してもよい（例えばＫｌｏｓｔｅｒｍｅｉｅｒら、２００２；Ｅｍｐｔａｇｅ、２００１；Ｄｉｄｅｎｋｏ、２００１（それぞれ参照により組み込まれている））。チアゾールオレンジ−エチジウムヘテロダイマー及びＴＯＴＡＢのような蛍光エネルギー転移色素を用いてもよい。
代わりに、標識は、それ自体検出可能でないが、間接的に検出可能であるか又は標的の核酸の単離若しくは分離を可能にするものであってもよい。例えば、標識は、ビオチン、ジゴキシゲニン、多価カチオン、キレート化基及び抗体に対するリガンドを含むその他のリガンドであり得る。
可視化技術
標識された核酸を可視化又は検出するためのいくつかの技術が容易に利用可能である。Ｓｔａｎｌｅｙ Ｔ．Ｃｒｏｏｋｅ、２０００による参考文献は、このような技術について考察している（第６章）（これは、参照により組み込まれている）。このような技術は、顕微鏡観察、アレイ、蛍光分析、ライトサイクラー又はその他のリアルタイムＰＣＲ（商標）機器、ＦＡＣＳ分析、シンチレーションカウンタ、ホスホイメージャー、ガイガーカウンタ、ＭＲＩ、ＣＡＴ、抗体に基づく検出法（ウェスタン、免疫蛍光、免疫組織化学）、組織化学的技術、ＨＰＬＣ（Ｇｒｉｆｆｅｙら、１９９７）、分光法、キャピラリーゲル電気泳動（Ｃｕｍｍｉｎｓら、１９９６）、分光法；質量分析；放射線技術；並びに物質収支技術を含む。代わりに、核酸は、核酸の効率的な単離を可能にするために標識化又はタグ付加されてもよい。本発明のその他の実施形態では、核酸は、ビオチン付加される。
２以上の異なる色の標識を採用する場合、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）技術を採用して、ｄｓＲＮＡを特徴決定できる。さらに、当業者は、標識された核酸を可視化、同定及び特徴決定する方式をよく理解しており、したがって、このようなプロトコールを本発明の一部として用いてもよい。用いることができるツールの例は、蛍光顕微鏡、バイオアナライザ（ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ）、プレートリーダー、ストーム（Ｓｔｏｒｍ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ）、アレイスキャナー、ＦＡＣＳ（蛍光標示式細胞分取器）又は蛍光分子を励起して検出する能力を有する任意の装置（例えばアクメン（Ａｃｕｍｅｎ）［ＴＴＰ Ｌａｂｔｅｃｈ］プレートサイトメータ）も含む。
アレイの調製
本発明は、ｍｉＲＮＡアレイとともに採用することもでき、アレイは、複数のｍｉＲＮＡ分子若しくは前駆ｍｉＲＮＡ分子に完全に若しくはほぼ相補的又は同一であり、支持体材料上に空間的に分離された編制で配置された核酸分子（プローブ）の整列されたマクロアレイ又はマイクロアレイである。マクロアレイは、典型的に、ニトロセルロース又はナイロンのシートであり、その上にプローブがスポットされている。マイクロアレイには、１０，０００までの核酸分子が典型的に１〜４平方センチメートルの領域にはまることができるように、核酸プローブがより密に配置されている。マイクロアレイは、核酸分子、例えば遺伝子、オリゴヌクレオチドなどを基材上にスポットするか、又はオリゴヌクレオチド配列をｉｎ ｓｉｔｕで基材上に組み立てることにより製作できる。スポット又は組み立てられた核酸分子は、１平方センチメートル当たり約３０までの非同一核酸分子又はそれ以上、例えば１平方センチメートル当たり約１００又は１０００さえまでの高密度マトリックスパターンで用いることができる。マイクロアレイは、フィルタアレイのニトロセルロースベースの材料とは対照的に、固体支持体としてコーティングガラスを典型的に用いる。ｍｉＲＮＡ相補核酸試料の整列されたアレイを有することにより、各試料の位置を追跡して、元来の試料と連結させることができる。複数の別個の核酸プローブが固体支持体の表面と安定的に会合した様々な異なるアレイデバイスが、当業者に知られている。アレイ用に有用な基材は、ナイロン、ガラス及びシリコンを含む。このようなアレイは、平均プローブ長さ、プローブの配列又は型、プローブとアレイ表面との間の結合の性質、例えば共有又は非共有などを含むいくつかの異なる方式で変動できる。
マイクロアレイを調製するための代表的な方法及び装置は、例えば米国特許第５，１４３，８５４号、米国特許第５，２０２，２３１号、米国特許第５，２４２，９７４号、米国特許第５，２８８，６４４号、米国特許第５，３２４，６３３号、米国特許第５，３８４，２６１号、米国特許第５，４０５，７８３号、米国特許第５，４１２，０８７号、米国特許第５，４２４，１８６号、米国特許第５，４２９，８０７号、米国特許第５，４３２，０４９号、米国特許第５，４３６，３２７号、米国特許第５，４４５，９３４号、米国特許第５，４６８，６１３号、米国特許第５，４７０，７１０号、米国特許第５，４７２，６７２号、米国特許第８０６号、米国特許第５，５２５，４６４号、米国特許第５，５０３，９８０号、米国特許第５，５１０，２７０号、米国特許第５，５２５，４６４号、米国特許第５，５２７，６８１号、米国特許第５，５２９，７５６号、米国特許第５，５３２，１２８号、米国特許第５，５４５，５３１号、米国特許第５，５４７，８３９号、米国特許第５，５５４，５０１号、米国特許第５，５５６，７５２号、米国特許第５，５６１，０７１号、米国特許第５，５７１，６３９号、米国特許第５，５８０，７２６号、米国特許第５，５８０，７３２号、米国特許第５，５９３，８３９号、米国特許第５，５９９，６９５号、米国特許第５，５９９，６７２号、米国特許第５，６１０，２８７号、米国特許第５，６２４，７１１号、米国特許第５，６３１，１３４号、米国特許第５，６３９，６０３号、米国特許第５，６５４，４１３号、米国特許第５，６５８，７３４号、米国特許第５，６６１，０２８号、米国特許第５，６６５，５４７号、米国特許第５，６６７，９７２号、米国特許第５，６９５，９４０号、米国特許第５，７００，６３７号、米国特許第５，７４４，３０５号、米国特許第５，８００，９９２号、米国特許第５，８０７，５２２号、米国特許第５，８３０，６４５号、米国特許第５，８３７，１９６号、米国特許第５，８７１，９２８号、米国特許第５，８４７，２１９号、米国特許第５，８７６，９３２号、米国特許第５，９１９，６２６号、米国特許第６，００４，７５５号、米国特許第６，０８７，１０２号、米国特許第６，３６８，７９９号、米国特許第６，３８３，７４９号、米国特許第６，６１７，１１２号、米国特許第６，６３８，７１７号、米国特許第６，７２０，１３８並びに国際公開第９３／１７１２６号パンフレット、国際公開第９５／１１９９５号パンフレット、国際公開第９５／２１２６５号パンフレット、国際公開第９５／２１９４４号パンフレット、国際公開第９５／３５５０５号パンフレット、国際公開第９６／３１６２２号パンフレット、国際公開第９７／１０３６５号パンフレット、国際公開第９７／２７３１７号パンフレット、国際公開第９９／３５５０５号パンフレット、国際公開第０９９２３２５６号パンフレット、国際公開第０９９３６７６０号パンフレット、国際公開第０１３８５８０号パンフレット、国際公開第０１６８２５５号パンフレット、国際公開第０３０２０８９８号パンフレット、国際公開第０３０４０４１０号パンフレット、国際公開第０３０５３５８６号パンフレット、国際公開第０３０８７２９７号パンフレット、国際公開第０３０９１４２６号パンフレット、国際公開第０３１０００１２号パンフレット、国際公開第０４０２００８５号パンフレット、国際公開第０４０２７０９３号パンフレット、ＥＰ３７３ ２０３、ＥＰ７８５ ２８０、ＥＰ７９９ ８９７及びＵＫ８ ８０３ ０００（これらの開示は全て本明細書に参照により組み込まれている）に記載されている。アレイは、高密度アレイであって、１００以上の異なるプローブを含有できることが企図される。アレイは、１０００、１６，０００、６５，０００、２５０，０００又は１，０００，０００以上の異なるプローブを含有できることが企図される。プローブは、１つ又は複数の異なる生物における標的に向けることができる。オリゴヌクレオチドプローブは、いくつかの実施形態では５〜５０、５〜４５、１０〜４０又は１５〜４０ヌクレオチド長の範囲であり、あるいくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドプローブは、２０〜２５ヌクレオチド長である。
アレイにおけるそれぞれの異なるプローブ配列の位置及び配列は、一般的にわかっている。さらに、多数の異なるプローブが、比較的小さい面積を占めて、一般的に、ｃｍ２当たり約６０、１００、６００、１０００、５，０００、１０，０００、４０，０００、１００，０００又は４００，０００より多い異なるオリゴヌクレオチドプローブのプローブ密度を有する高密度アレイを提供できる。アレイの表面積は、約１、１．６、２、３、４、５、６、７、８、９若しくは１０ｃｍ２以下であり得る。
さらに、当業者は、アレイを用いて生成されたデータを容易に分析できる。このようなプロトコールは、上に開示され、国際公開第９７４３４５０号パンフレット、国際公開第０３０２３０５８号パンフレット、国際公開第０３０２２４２１号パンフレット、国際公開第０３０２９４８５号パンフレット、国際公開第０３０６７２１７号パンフレット、国際公開第０３０６６９０６号パンフレット、国際公開第０３０７６９２８号パンフレット、国際公開第０３０９３８１０号パンフレット、国際公開第０３１００４４８Ａ１号パンフレット（これらの全ては具体的に参照により組み込まれている）で見出される情報を含む。
最近、溶液ハイブリダイゼーションとその後の固定化及び同定に基づく代替プロファイリング法、例えばイルミナ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）プラットフォームが利用可能になっている。
試料調製
広範囲の試料のｍｉＲＮＡを、本明細書に記載するアッセイを用いて分析できることが企図される。内因性ｍｉＲＮＡをいくつかの実施形態で用いることが企図されるが、内因性ｍｉＲＮＡ又は前駆ｍｉＲＮＡと同一の核酸を含む組換え又は合成ｍｉＲＮＡも、本明細書で記載するようにして取り扱って分析できる。試料は、生体試料であってもよく、その場合、試料は、血液、ＣＳＦ、組織、器官、腫瘍、精液、痰、便、尿、唾液、涙、その他の体液、毛包、皮膚又は生体細胞を含有するか若しくは生体細胞で構成される任意の試料からであり得る。代わりに、試料は、生体試料でないが、無細胞反応混合物（１つ又は複数の生体酵素を含有し得る）のような化学的混合物であってもよい。
疾患とつながりがあるｍｉＲＮＡを同定するための細胞アッセイ
具体的に企図される応用は、新血管新生の減少及び／又は抗血管新生活性の誘導に貢献するｍｉＲＮＡ（それら自体が疾患若しくは状態の一部分であるか又はそうでなければ特定の疾患状況と関連し得る）を同定することを含む。さらに、企図される応用は、新血管新生を減少及び／又は抗血管新生活性を誘導できるｍｉＲＮＡの同定を含む。また、ｍｉＲＮＡ機能は、新血管新生と関連する特定の疾患又は状態に感受性であると考えられる試料と、その疾患若しくは状態に感受性でないか又は耐性であると考えられる試料との間で比較してもよい。本発明のＲＮＡ分子を用いて、前の項で論じた疾患若しくは状態のいずれかを治療するか、又は前の項で論じた細胞経路のいずれかをモジュレートできることが具体的に企図される。具体的に企図される応用は、新血管新生細胞プロセスに貢献し、及び／又は抗血管新生活性を誘導するｍｉＲＮＡ（それら自体が疾患の一部分であるか又はそうでなければ特定の疾患状況と関連し得る）を同定することを含む。また、ｍｉＲＮＡ機能は、新血管新生と関連する特定の疾患又は状態に感受性であると考えられる試料と、その疾患若しくは状態に感受性でないか又は耐性であると考えられる試料との間で比較してもよい。
異なる治療薬の効力は、本発明に従って定義され用いられるｍｉＲＮＡにより改変できる。新血管新生を減少させ及び／又は抗血管新生活性を誘導するｍｉＲＮＡ分子、その等価物又は供給源は、例えば化学治療及び免疫治療に対する感受性を増強できる。このような治療薬は、それらに限定されないが、化学治療薬を含む。「化学治療剤」は、がんの治療において投与される化合物又は組成物を意味するために用いられる。これらの薬剤又は薬物は、細胞内のそれらの活性の様式、例えばそれらが細胞周期に影響するか、及びどの段階で影響するかにより類別される。代わりに、薬剤は、ＤＮＡを直接架橋するか、ＤＮＡにインターカレートするか、又は核酸合成に影響することにより染色体及び有糸分裂異常を誘導する薬剤の能力に基づいて特徴付けることができる。ほとんどの化学治療剤は、以下のカテゴリーに入る：アルキル化剤、代謝拮抗剤、抗腫瘍抗生物質、有糸分裂阻害剤及びニトロソウレア。
化学治療剤の例は、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン；アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジンのようなピリミジン類似体；カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトンのようなアンドロゲン；アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンのような副腎皮質ホルモン合成阻害物質；フォリン酸のような葉酸補充物質；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトレキサート；デフォファミン；デメコルシン；ジアジキノン；エフロルニチン；酢酸エリプチニウム；エポチロン；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシウレア；レンチナン；ロニダミン；マイタンシン及びアンサマイトシンのようなマイタンシノイド；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダンモール；ニトラエリン；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ロソキサントロン；ポドフィリン酸；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ多糖複合体；ラゾキサン；リゾキシン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジクオン；２，２’，２’’−トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン（特にＴ−２トキシン、ベラクリンＡ、ロリジンＡ及びアングイジン）；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド、例えばパクリタキセル及びドセタキセル；クロラムブシル；ゲムシタビン；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキセート；シスプラチン、オキサリプラチン及びカルボプラチンのような白金配位錯体；ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ノバントロン；テニポシド；エダトレキセート；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼローダ；イバンドロネート；イリノテカン（例えばＣＰＴ−Ｉｌ）；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＦＭＯ）；レチノイン酸のようなレチノイド；カペシタビン；並びに上記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸又は誘導体を含む。
この定義には、例えばタモキシフェン、ラロキシフェン、ドロロキシフェン、４−ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、ＬＹｌ １７０１８、オナプリストン及びトレミフェンを含む抗エストロゲン及び選択的エストロゲン受容体調節物質（ＳＥＲＭ）；例えば４（５）−イミダゾール、アミノグルテチミド、酢酸メゲストロール、エキセメスタン、ホルメスタン、ファドロゾール、ボロゾール、レトロゾール及びアナストロゾールのような、副腎におけるエストロゲン生成を調節する酵素であるアロマターゼを阻害するアロマターゼ阻害剤；並びにフルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、リュープロリド及びゴセレリンのような抗アンドロゲン；並びにトロキサシタビン（１，３−ジオキソランヌクレオシドシトシン類似体）；アンチセンスオリゴヌクレオチド、例えばＰＫＣ−α、Ｒａｆ及びＨ−Ｒａｓのような、特に異常細胞増殖に関わるシグナル伝達経路における遺伝子の発現を阻害するもの；ＶＥＧＦ発現阻害剤及びＨＥＲ２発現阻害剤のようなリボザイム；遺伝子治療ワクチンのようなワクチン、並びに上記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸又は誘導体のような腫瘍に対するホルモンの作用を調節又は阻害するように作用する抗ホルモン剤も含まれる。米国ＦＤＡにより承認された腫瘍学薬物と、それらの承認された効能のリストは、ワールドワイドウェブでａｃｃｅｓｓｄａｔａ．ｆｄａ．ｇｏｖ／ｓｃｒｉｐｔｓ／ｃｄｅｒ／ｏｎｃｔｏｏｌｓ／ｄｒｕｇｌｉｓｔ．ｃｆｍ．において見出すことができる。さらに、あるいくつかの経路において異なる活性を有する試料も比較できることが企図される。このような細胞経路は、それらに限定されないが、以下のものを含む：それらに限定されないが、環状ＡＭＰ、プロテインキナーゼＡ、Ｇタンパク質共役受容体、アデニリルシクラーゼ、Ｌ−セレクチン、Ｅ−セレクチン、ＰＥＣＡＭ、ＶＣＡＭ−Ｉ、α−アクチニン、パキシリン、カドヘリン、ＡＫＴ、インテグリン−α、インテグリン−β、ＲＡＦ−Ｉ、ＥＲＫ、ＰＩ−３キナーゼ、ビンクリン、マトリクスメタロプロテイナーゼ、Ｒｈｏ ＧＴＰアーゼ、ｐ８５、トレフォイルファクター、プロフィリン、ＦＡＫ、ＭＡＰキナーゼ、Ｒａｓ、カベオリン、カルパイン−１、カルパイン−２、上皮増殖因子受容体、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２、コフィリン、アクチン、ゲルソリン、ＲｈｏＡ、Ｒａｃ、ミオシン軽鎖キナーゼ、血小板由来増殖因子受容体若しくはエズリンに関与するものを含む任意の接着又は運動性経路；それらに限定されないが、ＡＫＴ、Ｆａｓリガンド、ＮＦＫＢ、カスパーゼ−９、ＰＢキナーゼ、カスパーゼ−３、カスパーゼ−７、ＩＣＡＤ、ＣＡＤ、ＥｎｄｏＧ、グランザイムＢ、Ｂａｄ、Ｂａｘ、Ｂｉｄ、Ｂａｋ、ＡＰＡＦ−Ｉ、チトクロムＣ、ｐ５３、ＡＴＭ、Ｂｃｌ−２、ＰＡＲＰ、Ｃｈｋｌ、Ｃｈｋ２、Ｒｈｏ−２１、ｃ−Ｊｕｎ、Ｒｈｏ７３、Ｒａｄ５１、Ｍｄｍ２、Ｒａｄ５０、ｃ−Ａｂｌ、ＢＲＣＡ−Ｉ、パーフォリン、カスパーゼ−４、カスパーゼ−８、カスパーゼ−６、カスパーゼ−１、カスパーゼ−２、カスパーゼ−１０、Ｒｈｏ、Ｊｕｎキナーゼ、Ｊｕｎキナーゼキナーゼ、Ｒｉｐ２、ラミン−Ａ、ラミン−Ｂｌ、ラミン−Ｂ２、Ｆａｓ受容体、Ｈ２Ｏ２、グランザイムＡ、ＮＡＤＰＨオキシダーゼ、ＨＭＧ２、ＣＤ４、ＣＤ２８、ＣＤ３、ＴＲＡＤＤ、ＩＫＫ、ＦＡＤＤ、ＧＡＤＤ４５、ＤＲ３細胞死受容体、ＤＲ４／５細胞死受容体、ＦＬＩＰｓ、ＡＰＯ−３、ＧＲＢ２、ＳＨＣ、ＥＲＫ、ＭＥＫ、ＲＡＦ−１、環状ＡＭＰ、プロテインキナーゼＡ、Ｅ２Ｆ、網膜芽細胞腫タンパク質、Ｓｍａｃ／Ｄｉａｂｌｏ、ＡＣＨ受容体、１４−３−３、ＦＡＫ、ＳＯＤＤ、ＴＮＦ受容体、ＲＴＰ、サイクリン−Ｄｌ、ＰＣＮＡ、ＢｃＩ−ＸＬ、ＰＩＰ２、ＰＩＰ３、ＰＴＥＮ、ＡＴＭ、Ｃｄｃ２、プロテインキナーゼＣ、カルシニューリン、ＩＫＫα、ＩＫＫβ、ＩＫＫγ、ＳＯＳ−Ｉ、ｃ−ＦＯＳ、Ｔｒａｆ−１、Ｔｒａｆ−２、ＩκＢβ又はプロテアソームに関与するものを含む任意のアポトーシス経路；それらに限定されないが、プロテインキナーゼＡ、一酸化窒素、カベオリン−１、アクチン、カルシウム、プロテインキナーゼＣ、Ｃｄｃ２、サイクリンＢ、Ｃｄｃ２５、ＧＲＢ２、ＳＲＣプロテインキナーゼ、ＡＤＰ−リボシル化因子（ＡＲＦ）、ホスホリパーゼＤ、ＡＫＡＰ９５、ｐ６８、オーロラＢ、ＣＤＫｌ、Ｅｇ７、ヒストンＨ３、ＰＫＡｃ、ＣＤ８０、ＰＩ３キナーゼ、ＷＡＳＰ、Ａｒｐ２、Ａｒｐ３、ｐ３４、ｐ２０、ＰＰ２Ａ、アンジオテンシン、アンジオテンシン変換酵素、プロテアーゼ活性化受容体−１、プロテアーゼ活性化受容体−４、Ｒａｓ、ＲＡＦ−Ｉ、ＰＬＣβ、ＰＬＣγ、ＣＯＸ−Ｉ、Ｇタンパク質共役受容体、ホスホリパーゼＡ２、ＩＰ３、ＳＵＭＯ１、ＳＵＭＯ２／３、ユビキチン、Ｒａｎ、Ｒａｎ−ＧＡＰ、Ｒａｎ−ＧＥＦ、ｐ５３、グルココルチコイド、グルココルチコイド受容体、ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体の構成成分、ＲａｎＢＰｌ、ＲａｎＢＰ２、インポーチン、エクスポーチン、ＲＣＣｌ、ＣＤ４０、ＣＤ４０リガンド、ｐ３８、ＤＣＫα、ＩＫＫβ、ＮＦＫＢ、ＴＲＡＦ２、ＴＲＡＦ３、ＴＲＡＦ５、ＴＲＡＦ６、ＩＬ−４、ＩＬ−４受容体、ＣＤＫ５、ＡＰ−Ｉ転写因子、ＣＤ４５、ＣＤ４、Ｔ細胞受容体、ＭＡＰキナーゼ、神経増殖因子、神経増殖因子受容体、ｃ−Ｊｕｎ、ｃ−Ｆｏｓ、Ｊｕｎキナーゼ、ＧＲＢ２、ＳＯＳ−Ｉ、ＥＲＫ−Ｉ、ＥＲＫ、ＪＡＫ２、ＳＴＡＴ４、ＩＬ−１２、ＩＬ−１２受容体、一酸化窒素合成酵素、ＴＹＫ２、ＩＦＮγ、エラスターゼ、ＩＬ−８、エピセリン、ＩＬ−２、ＩＬ−２受容体、ＣＤ２８、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ４、ＴＧＦβ若しくはＴＧＦβ受容体に関与するものを含む任意の細胞活性化経路；それらに限定されないが、ＴＮＦ、ＳＲＣプロテインキナーゼ、Ｃｄｃ２、サイクリンＢ、Ｇｒｂ２、Ｓｏｓ−１、ＳＨＣ、ｐ６８、オーロラキナーゼ、プロテインキナーゼＡ、プロテインキナーゼＣ、Ｅｇ７、ｐ５３、サイクリン、サイクリン依存性キナーゼ、神経増殖因子、上皮増殖因子、網膜芽細胞腫タンパク質、ＡＴＦ−２、ＡＴＭ、ＡＴＲ、ＡＫＴ、ＣＨＫｌ、ＣＨＫ２、１４−３−３、ＷＥＥｌ、ＣＤＣ２５ ＣＤＣ６、複製開始点認識複合体タンパク質、ｐｌ５、ｐｌ６、ｐ２７、ｐ２１、ＡＢＬ、ｃ−ＡＢＬ、ＳＭＡＤ、ユビキチン、ＳＵＭＯ、熱ショックタンパク質、Ｗｎｔ、ＧＳＫ−３、アンジオテンシン、ｐ７３任意のＰＰＡＲ、ＴＧＦα、ＴＧＦβ、ｐ３００、ＭＤＭ２、ＧＡＤＤ４５、Ｎｏｔｃｈ、ｃｄｃ３４、ＢＲＣＡ−Ｉ、ＢＲＣＡ−２、ＳＫＰｌ、プロテアソーム、ＣＵＬｌ、Ｅ２Ｆ、ｐｉ０７、ステロイドホルモン、ステロイドホルモン受容体、ＩκＢα、ＩκＢβ、Ｓｉｎ３Ａ、熱ショックタンパク質、Ｒａｓ、Ｒｈｏ、ＥＲＫ、ＩＫＫ、ＰＩ３キナーゼ、Ｂｃｌ−２、Ｂａｘ、ＰＣＮＡ、ＭＡＰキナーゼ、ダイニン、ＲｈｏＡ、ＰＫＡｃ、環状ＡＭＰ、ＦＡＫ、ＰＩＰ２、ＰＩＰ３、インテグリン、トロンボポエチン、Ｆａｓ、Ｆａｓリガンド、ＰＬＫ３、ＭＥＫ、ＪＡＫ、ＳＴＡＴ、アセチルコリン、パキシリン、カルシニューリン、ｐ３８、インポーチン、エクスポーチン、Ｒａｎ、Ｒａｄ５０、Ｒａｄ５１、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、Ｒａｎ−ＧＡＰ、Ｒａｎ−ＧＥＦ、ＮｕＭＡ、Ｔｐｘ２、ＲＣＣｌ、ソニックヘッジホッグ、Ｃｒｍｌ、Ｐａｔｃｈｅｄ（Ｐｔｃ−１）、ＭＰＦ、ＣａＭキナーゼ、チューブリン、アクチン、動原体関連タンパク質、セントロメア結合タンパク質、テロメラーゼ、ＴＥＲＴ、ＰＰ２Ａ、ｃ−ＭＹＣ、インスリン、Ｔ細胞受容体、Ｂ細胞受容体、ＣＢＰ、１ＫＢ、ＮＦＫＢ、ＲＡＣｌ、ＲＡＦｌ、ＥＰＯ、ジアシルグリセロール、ｃ−Ｊｕｎ、ｃ−Ｆｏｓ、Ｊｕｎキナーゼ、低酸素誘導因子、ＧＡＴＡ４、β−カテニン、α−カテニン、カルシウム、アレスチン、サバイビン、カスパーゼ、プロカスパーゼ、ＣＲＥＢ、ＣＲＥＭ、カドヘリン、ＰＥＣＡＭ、副腎皮質ステロイド、コロニー刺激因子、カルパイン、アデニリルシクラーゼ、増殖因子、一酸化窒素、膜貫通受容体、レチノイド、Ｇタンパク質、イオンチャネル、転写活性化因子、転写活性化補助因子、転写リプレッサー、インターロイキン、ビタミン、インターフェロン、転写コリプレッサー、核膜孔、窒素、毒素、タンパク質分解若しくはリン酸化に関与するものを含む任意の細胞周期調節、シグナル伝達又は分化経路；或いはそれらに限定されないが、アミノ酸生合成、脂肪酸酸化、神経伝達物質及びその他の細胞シグナル伝達物質の生合成、ポリアミンの生合成、脂質及びスフィンゴ脂質の生合成、アミノ酸及び栄養分の異化、ヌクレオチド合成、エイコサノイド、電子伝達反応、ＥＲ関連分解、解糖、線維素溶解、ケトン体の形成、ファゴソームの形成、コレステロール代謝、食物摂取の制御、エネルギー恒常性、プロトロンビン活性化、ラクトース及びその他の糖の合成、多剤耐性、ホスファチジルコリンの生合成、プロテアソーム、アミロイド前駆体タンパク質、Ｒａｂ ＧＴＰアーゼ、デンプン合成、糖鎖付加、ホスホグリセリドの合成、ビタミン、クエン酸回路、ＩＧＦ−Ｉ受容体、尿素回路、小胞輸送若しくは再利用経路に関与するものを含む任意の代謝経路。本発明の核酸分子は、上記の経路又は因子のいずれかに関する診断及び治療方法において採用できることがさらに企図される。よって、本発明のいくつかの実施形態では、上記の経路若しくは因子の１つ又は複数を阻害、排除、活性化、誘導、増加或いはそうでなければモジュレートするｍｉＲＮＡ分子、その等価物、模倣物又は供給源が、本発明の方法の一部分として企図される。核酸は、そのｍｉＲＮＡと上記の経路のいずれかとの関係に基づいて、疾患又は状態を診断するために用いることができる。
その他のアッセイ
アレイ及びマイクロアレイの使用に加えて、いくつかの異なるアッセイを採用してｍｉＲＮＡ、それらの活性及びそれらの効果を分析できることが企図される。このようなアッセイは、それらに限定されないが、ＲＴ−ＰＣＲ、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーションプロテクションアッセイ（ＨＰＡ）（ＧｅｎＰｒｏｂｅ）、分岐ＤＮＡ（ｂＤＮＡ）アッセイ（Ｃｏｌｌｉｎｓ、Ｍ．Ｌ．ら（１９９７）．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２５：２９７９〜２９８４頁）、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、単分子ハイブリダイゼーション検出（ＵＳ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）、インベーダ（Ｉｎｖａｄｅｒ）アッセイ（ＴｈｉｒｄＷａｖｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）及びブリッジライゲーションアッセイ（Ｑｉａｇｅｎ）を含む。このような方法をアレイの関係において、及び診断アッセイの関係において用い得ることが企図される。
治療及び診断への応用
表現型形質に影響するｍｉＲＮＡは、治療への応用及び（特定のｍｉＲＮＡの存在又は非存在をスクリーニングすることにより）診断への応用のための介入点を提供する。本発明のＲＮＡ分子を用いて、前の項で論じた任意の疾患又は状態を治療できることが具体的に企図される。さらに、上記の方法のいずれも、本発明の治療及び診断の態様に関して採用できる。例えば、ｍｉＲＮＡの検出又はｍｉＲＮＡのスクリーニングに関する方法は、診断の関係においても採用できる。治療への応用では、有効量の本発明のｍｉＲＮＡを、動物であるか又はそうでなくてもよい細胞に投与する。いくつかの実施形態では、治療有効量の本発明のｍｉＲＮＡを、疾患又は状態の治療のために個体に投与する。用語「有効量」は、本明細書で用いる場合、本発明の分子が投与された細胞又は組織において所望の生理的変化をもたらすために必要な本発明の分子の量と定義される。用語「治療有効量」は、本明細書で用いる場合、本明細書で早くに定義した新血管新生と関連する疾患又は状態に関して所望の効果を達成する本発明の分子の量と定義される。当業者は、多くの場合において、分子は治癒をもたらさないが、少なくとも１つの症状の緩和又は改善のような部分的利益をもたらすことがあることを容易に認識する。いくつかの実施形態では、いくらかの利益を有する生理的変化も治療上有益であるとみなす。よって、いくつかの実施形態では、生理的変化をもたらす分子の量は、「有効量」又は「治療有効量」とみなす。
いくつかの実施形態では、分子は、別の動物からとは反対に、特定の動物からのｍｉＲＮＡ配列に相当する配列を有する。よって、いくつかの実施形態では、ヒト配列が本発明のＲＮＡ分子において利用される。ｉｎ ｖｉｖｏ実験では、ｍｉＲＮＡ配列は、ヒト配列と比較して試験動物において異なることがある。この場合、ヒト配列とは異なるｍｉＲＮＡを用いて動物における治療効果を証明できる。動物において試験したこの配列を用いて得られた結果は、対応するｍｉＲＮＡ分子を用いたヒトにおける推定の期待される結果であり得る。
投与の形態及び製剤
本発明の核酸分子は、単独又は医薬組成物の形で、状態又は疾患の治療のために対象に投与してもよい。医薬組成物は、薬学的に用いることができる調製物へのｍｉＲＮＡの加工を容易にする１つ若しくは複数の生理的に許容される担体、希釈剤、賦形剤又は佐剤を用いて従来の様式で処方できる。適切な製剤は、選択される投与経路に依存する。局部投与のために、本発明のｍｉＲＮＡは、当該技術において公知であるように、液剤、ゲル、軟膏剤、クリーム、懸濁剤などとして処方できる。全身製剤は、注射、例えば皮下、静脈内、筋内、髄腔内、又は腹腔内注射による投与のために設計されたもの、及び経皮、経粘膜、吸入、経口又は肺投与のために設計されたものを含む。注射のために、本発明の核酸は、水溶液、好ましくはハンクス液、リンゲル液又は生理食塩緩衝液のような生理的に適合する緩衝液中で処方できる。溶液は、懸濁化剤、安定化剤及び／又は分散剤のような処方剤を含有してもよい。代わりに、核酸分子は、適切な媒体、例えば滅菌無パイロジェン水で使用前に構成するための粉末の形であってもよい。経粘膜投与のために、透過させる関門について適切な浸透剤を製剤において用いる。このような浸透剤は、当該技術において一般的に知られている。経口投与のために、核酸は、分子を、当該技術において公知の薬学的に許容される担体と組み合わせることにより容易に処方できる。このような担体により、本発明の核酸は、治療される患者が経口摂取するための錠剤、丸剤、糖衣錠、カプセル剤、液剤、ゲル、シロップ剤、スラリー、懸濁剤などとして処方できる。例えば散剤、カプセル剤及び錠剤のような経口固体製剤のために、適切な賦形剤は、糖、例えばラクトース、スクロース、マンニトール及びソルビトールのような充填剤；トウモロコシデンプン、コムギデンプン、コメデンプン、バレイショデンプン、ゼラチン、トラガカントガム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、及び／又はポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）のようなセルロース調製物；造粒剤；並びに結合剤を含む。所望により、架橋ポリビニルピロリドン、寒天又はアルギン酸若しくはアルギン酸ナトリウムのようなその塩のような崩壊剤を加えてもよい。所望により、固体剤形は、標準的な技術を用いて糖コーティング又は腸溶コーティングしてもよい。例えば懸濁剤、エリキシル剤及び液剤のような経口液体調製物のために、適切な担体、賦形剤又は希釈剤は、水、グリコール、油、アルコールなどを含む。さらに、香料、保存剤、着色剤などを加えてもよい。頬側投与のために、分子は、従来の様式で処方された錠剤、ロゼンジなどの形をとってもよい。吸入による投与のために、本発明に従って用いるための分子は、適切な噴射剤、例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素又はその他の適切な気体を用いる加圧包装からのエアゾールスプレー又はネブライザーの形で簡便に送達される。加圧エアゾールの場合、投与量単位は、計量された量を送達するための弁を用いることにより決定してもよい。吸入器又は吹き入れ器において用いるためのゼラチンのカプセル及びカートリッジは、核酸とラクトース又はデンプンのような適切な粉末基剤との粉末ミックスを含有して処方してもよい。ＲＮＡ分子は、例えばカカオ脂又はその他のグリセリドのような従来の坐剤基剤を含有する、坐剤又は停留浣腸のような直腸又は膣組成物中で処方してもよい。
前に記載した製剤に加えて、分子は、デポー調製物として処方してもよい。このような長時間作用性製剤は、植え込み（例えば皮下又は筋内）又は筋内注射により投与してもよい。よって、例えば、分子は、適切なポリマー若しくは疎水性材料（例えば許容できる油中の乳剤として）又はイオン交換樹脂とともに、又はやや溶けにくい誘導体、例えばやや溶けにくい塩として処方してもよい。代わりに、その他の薬学的送達系を採用してもよい。
リポソーム及び乳剤は、本発明の核酸を送達するために用い得る送達媒体の公知の例である。
本発明の核酸は、細胞取り込みを増加させるために担体又は脂質と組み合わせて投与してもよい。例えば、オリゴヌクレオチドは、カチオン性脂質と組み合わせて投与してもよい。カチオン性脂質の例は、それらに限定されないが、リポフェクチン、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＰＥ及びＤＯＴＡＰを含む。国際公開第００７１０９６号パンフレット（これは、具体的に参照により組み込まれている）の出版物は、遺伝子治療のために効果的に用いることができるＤＯＴＡＰ；コレステロール又はコレステロール誘導体製剤のような異なる製剤について記載している。その他の開示も、ナノ粒子を含む異なる脂質又はリポソーム製剤及び投与の方法について論じている。これらは、それらに限定されないが、米国特許出願公開第２００３０２０３８６５号、米国特許出願公開第２００２０１５０６２６号、米国特許出願公開第２００３００３２６１５号及び米国特許出願公開第２００４００４８７８７号（これらが製剤並びに核酸の投与及び送達のその他の関連する態様について開示する範囲で、具体的に参照により組み込まれている）を含む。粒子を形成するために用いる方法は、米国特許第５，８４４，１０７号、米国特許第５，８７７，３０２号、米国特許第６，００８，３３６号、米国特許第６，０７７，８３５号、米国特許第５，９７２，９０１号、米国特許第６，２００，８０１号及び米国特許第５，９７２，９００号（これらは、このような態様について参照により組み込まれている）にも開示されている。核酸は、ポリ−Ｌ−リシンのようなカチオン性アミンと組み合わせて投与してもよい。
核酸は、トランスフェリン及びコレステリルのような化学的部分とコンジュゲートしてもよい。さらに、オリゴヌクレオチドは、特異的化学基をオリゴヌクレオチドと連結することにより、あるいくつかの器官又は組織を標的にしてもよい。例えば、オリゴヌクレオチドをマンノース残基の適切なアレイと連結することにより、オリゴヌクレオチドは肝臓を標的にする。その他の標的化リガンドは、Ｌｉｕ Ｂ．、Ｂｒｉｅｆ Ｆｕｎｃｔ．Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ ６：１１２〜１１９頁、２００７に記載されている。さらなる例は、ガラクトース、Ｎ−アセチルガラクトサミン、マンノースのような炭水化物糖；フォレートのようなビタミン；ナプロキセン、イブプロフェン若しくはその他の既知のタンパク質結合分子、トランスフェリン受容体を標的にするトランスフェリン修飾シクロデキストリンともよばれるシクロデキストリン（Ｈｕ−Ｌｉｅｓｋｏｖａｎら、 ２００５）、ＰＥＩ（ＲＧＤ標的化ＰＥＧ−ＰＥＩ、Ｓｃｈｉｆｆｅｌｅｒｓら２００４）、アニスアミド、ＲＧＤ−ペプチド若しくはＲＧＤ模倣物、ポリアルギニン、抗ＴｆＲ単鎖抗体断片／ＴｆＲｓｃＦｖ、アネキシンＡ５（ホスファチジルセリン露出膜を標的にする、Ｇａｒｎｉｅｒ Ｂ．ら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ Ｃｈｅｍ．、２００９、１１：２１１４〜２２頁）、国際公開第２００９／１２６９３３号パンフレット（核酸を標的化リガンド及びエンドソーム溶解性成分と組み合わせることによる核酸の部位特異的送達のための組成物及び方法について記載している）を含む小分子である。優先的に適切な標的化リガンドは、内皮関連細胞表面タンパク質である。核酸の標的化は、国際公開第２００５／１１１２３８号パンフレットに記載されるアプタマー技術を用いることにより達成してもよい。さらに、上記の送達媒体に加えて、ＰＥＧ−脂質、コレステロール、エンドソーム溶解性ヘルパー脂質若しくはペプチド（国際公開第２００９／０４６２２０号パンフレット）のようなさらなる脂質部分、又は作製されるナノ粒子の全体的な形態（電荷及び粒子サイズにより特徴付けられる）は、がん細胞及び／又は腫瘍脈管構造のいずれかへの標的化特異性を与えることができる。
さらに、分子は、治療剤を含有する固体ポリマーの半透過性マトリクスのような持続放出系を用いて送達してもよい。様々な持続放出材料が確立され、当業者に公知である。持続放出カプセル剤は、それらの化学的性質に依存して、分子を数週間から１００日を超えるまでにわたって放出できる。キメラ分子の化学的性質及び生物学的安定性に依存して、分子安定化のためのさらなる方策を採用してもよい。
代わりに、分子は、国際公開第２００７０１１２１７号パンフレット（これは、本明細書に参照により組み込まれている）に記載される錯体化学に基づく送達系を用いて送達してもよい。
上記に加えて、本発明の分子は、局所又は標的化処理のためにエレクトロポレーションを用いて送達してもよい。エレクトロポレーション法は、当業者に知られており、例えばＤａｕｄら（２００８）又はＢｏｄｌｅｓ−Ｂｒａｋｈｏｐ（２００９）に記載されている。これらの出版物はそれぞれ、参照により組み込まれている。
核酸は、遊離の酸若しくは塩基又は薬学的に許容される塩として上記の製剤のいずれに含まれてもよい。薬学的に許容される塩は、遊離塩基の生物活性を実質的に保持し、無機酸との反応により調製される塩である。薬学的な塩は、対応する遊離塩基形よりも水性及びその他のプロトン性溶媒における溶解性がより高い傾向がある。
本発明の医薬組成物は、薬学的に許容される担体に溶解若しくは分散された有効量の１つ又は複数のｍｉＲＮＡ分子を含む。「薬学的又は薬理学的に許容される」との句は、適切であれば例えばヒトのような動物に投与した場合に、有害、アレルギー性又はその他の不適当な反応を生成しないか又は許容されるそのような反応を生成する分子物体及び組成物のことをいう。ある有害な影響が許容されるかは、疾患の重篤度に基づいて決定される。少なくとも１つのキメラポリペプチド又はさらなる活性成分を含有する医薬組成物の調製物は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１８版Ｍａｃｋ Ｐｒｉｎｔｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、１９９０（本明細書に参照により組み込まれている）に例示されるように、本開示に鑑みて当業者に知られている。さらに、動物（例えばヒト）投与のために、調製物は、ＦＤＡ Ｏｆｆｉｃｅ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｔａｎｄａｒｄｓにより要求される滅菌性、発熱性、全体的な安全性及び純度の基準を満たすべきであると理解される。
本明細書で用いる場合、「薬学的に許容される担体」は、当業者に知られるように、任意の及び全ての溶媒、分散媒、コーティング、界面活性剤、抗酸化剤、保存剤（例えば抗菌剤、抗真菌剤）、等張化剤、吸収遅延剤、塩、保存剤、薬物、薬物安定化剤、ゲル、結合剤、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、甘味料、香料、色素などの材料及びそれらの組み合わせを含む（例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１８版Ｍａｃｋ Ｐｒｉｎｔｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、１９９０、１２８９〜１３２９頁（本明細書に参照により組み込まれている）を参照されたい）。任意の従来の担体が活性成分と適合しない場合を除いて、治療又は医薬組成物における該担体の使用が企図される。
ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲＮＡが固体、液体又はエアゾールの形で投与されるか、そしてｍｉＲＮＡが注射のような投与の経路のために滅菌される必要があるかに依存して、異なる型の担体を含むことができる。本発明は、当業者に知られるように、静脈内、皮内、動脈内、腹腔内、病巣内、頭蓋内、関節内、前立腺内、胸膜内、気管内、鼻内、硝子体内、膣内、直腸内、局部、腫瘍内、筋内、腹腔内、皮下、結膜下、小胞内、粘膜、心膜内、臍帯内、眼内、経口、局部、局所、吸入（例えばエアゾール吸入）、注射、注入、持続注入、局所灌流、標的細胞を浴に直接入れること、カテーテルにより、洗浄により、クリーム（ｃｒｅｍｅｓ）で、脂質組成物（例えばリポソーム）で、若しくはその他の方法により、又は上記の任意の組み合わせで投与できる（例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１８版Ｍａｃｋ Ｐｒｉｎｔｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、１９９０（本明細書に参照により組み込まれている）を参照されたい）。
動物又は患者に投与される本発明の組成物の実際の投与量は、体重、状態の重篤度、治療される疾患の型、以前の又は併用される治療的介入、患者の特発性及び投与の経路のような身体的及び生理的因子により決定できる。投与を担当する医師が、とにかく、個別の対象についての組成物中の活性成分（複数可）の濃度及び適切な用量（複数可）を決定する。
あるいくつかの実施形態では、医薬組成物は、例えば、少なくとも約０．１％の活性化合物を含有することがある。その他の実施形態では、活性化合物は、単位の重量の２％〜７５％、又は例えば２５％〜６０％及びその中の導き出せる任意の範囲で含まれることがある。その他の非限定的な例では、用量は、投与当たり１マイクログラム／ｋｇ／体重未満、又は１マイクログラム／ｋｇ／体重、５マイクログラム／ｋｇ／体重、１０マイクログラム／ｋｇ／体重、５０マイクログラム／ｋｇ／体重、１００マイクログラム／ｋｇ／体重、２００マイクログラム／ｋｇ／体重、３５０マイクログラム／ｋｇ／体重、５００マイクログラム／ｋｇ／体重、１ミリグラム／ｋｇ／体重、５ミリグラム／ｋｇ／体重、１０ミリグラム／ｋｇ／体重、５０ミリグラム／ｋｇ／体重、１００ミリグラム／ｋｇ／体重、２００ミリグラム／ｋｇ／体重、３５０ミリグラム／ｋｇ／体重若しくは５００ミリグラム／ｋｇ／体重から１０００ｍｇ／ｋｇ／体重以上まで及びその中の導き出せる任意の範囲を含むこともある。本明細書で列挙する数から導き出せる範囲の非限定的な例では、５ｍｇ／ｋｇ／体重〜１００ｍｇ／ｋｇ／体重、５マイクログラム／ｋｇ／体重〜５００ミリグラム／ｋｇ／体重などの範囲を、上記の数に基づいて、投与できる。
いずれの場合においても、組成物は、１つ又は複数の成分の酸化を遅らせるために、様々な抗酸化剤を含むことができる。さらに、微生物の作用は、それらに限定されないが、パラベン（例えばメチルパラベン、プロピルパラベン）、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール又はそれらの組み合わせを含む様々な抗菌剤及び抗真菌剤のような保存剤により防止できる。
分子は、遊離塩基、中和又は塩の形で組成物中に処方してもよい。薬学的に許容される塩は、酸付加塩、例えばタンパク性組成物の遊離アミノ基と形成されたもの、或いは例えば塩酸若しくはリン酸のような無機酸又は酢酸、シュウ酸、酒石酸若しくはマンデル酸のような有機酸と形成されたものを含む。遊離カルボキシル基と形成された塩も、例えば水酸化ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム若しくは水酸化第二鉄のような無機塩基又はイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン若しくはプロカインのような有機塩基に由来できる。
組成物が液体の形である実施形態では、担体は、それらに限定されないが、水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）、脂質（例えばトリグリセリド、植物油、リポソーム）及びそれらの組み合わせを含む溶媒又は分散媒であり得る。適度な流動性は、例えば、レシチンのようなコーティングを用いることにより、例えば液体ポリオール若しくは脂質のような担体中に分散することによって要求される粒子サイズを維持することにより、例えばヒドロキシプロピルセルロースのような界面活性剤を用いることにより、又はそのような方法の組み合わせにより維持できる。多くの場合、例えば糖、塩化ナトリウム又はそれらの組み合わせのような等張化剤を含むことが好ましい。
その他の実施形態では、本発明において点眼剤、点鼻溶液若しくは点鼻スプレー、エアゾール又は吸入剤を用いることができる。このような組成物は、一般的に、標的組織の型に適合するように設計される。非限定的な例では、点鼻溶液は、通常、液滴又はスプレーで鼻孔に投与するように設計された水溶液である。点鼻溶液は、鼻分泌物と多くの点で類似するように調製して、線毛の通常の作用を維持する。よって、好ましい実施形態では、水性点鼻溶液は、通常、等張であるか又はわずかに緩衝して、ｐＨを約５．５〜約６．５に維持する。さらに、点眼用調製物において用いられるものと同様の抗菌保存剤、薬物、又は適当な薬物安定化剤を必要であれば製剤に含めてもよい。例えば、様々な商業的な点鼻用調製物が知られており、抗生物質及び抗ヒスタミン剤のような薬物を含有する。あるいくつかの実施形態では、分子は、経口摂取のような経路による投与のために調製される。これらの実施形態では、固体組成物は、例えば液剤、懸濁剤、乳剤、錠剤、丸剤、カプセル剤（例えばハード又はソフトゼラチンカプセル剤）、持続放出製剤、頬側組成物、トローチ剤、エリキシル剤、懸濁剤、シロップ剤、ウェーハ剤、又はそれらの組み合わせを含んでもよい。経口組成物は、食餌の食物に直接組み込むことができる。経口投与用の好ましい担体は、不活性希釈剤、同化可能な食用担体又はそれらの組み合わせを含む。本発明のその他の態様では、経口組成物は、シロップ剤又はエリキシル剤として調製してもよい。シロップ剤又はエリキシル剤は、例えば少なくとも１つの活性剤、甘味料、保存剤、香料、色素、保存剤又はそれらの組み合わせを含んでもよい。
あるいくつかの好ましい実施形態では、経口組成物は、１つ又は複数の結合剤、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、香料及びそれらの組み合わせを含んでもよい。あるいくつかの実施形態では、組成物は、以下の１つ又は複数を含んでもよい：例えばトラガカントガム、アカシア、トウモロコシデンプン、ゼラチン若しくはそれらの組み合わせのような結合剤；例えばリン酸二カルシウム、マンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム若しくはそれらの組み合わせのような賦形剤；例えばトウモロコシデンプン、バレイショデンプン、アルギン酸若しくはそれらの組み合わせのような崩壊剤；例えばステアリン酸マグネシウムのような滑沢剤；例えばスクロース、ラクトース、サッカリン若しくはそれらの組み合わせのような甘味料；例えばペパーミント、冬緑油、サクランボ風味、オレンジ風味などのような香料又は上記の組み合わせ。単位剤形がカプセル剤である場合、これは、上記の型の材料に加えて、液体担体のような担体を含有してもよい。コーティングのような様々なその他の材料が存在してもよいか、又はそうでなければ剤形の物理的な形を変更してもよい。例えば、錠剤、丸剤又はカプセル剤は、シェラック（ｓｈｅｌｌａｃ）、糖又はそれら両方でコーティングしてもよい。
組成物は、製造及び貯蔵の条件下で安定でなければならず、細菌及び真菌のような微生物の混入作用に対して保存されなければならない。内毒素混入は、安全なレベル、例えば０．５ｎｇ／ｍｇタンパク質未満にて最小限に保たれるべきであることが認識される。
特定の実施形態では、注射用組成物の吸収の延長を、例えばモノステアリン酸アルミニウム、ゼラチン又はそれらの組み合わせのような吸収を遅延させる物質を組成物中に用いることによりもたらすことができる。
細胞への送達又は輸送に関して上で論じたいずれの実施形態も、この項で論じる医薬化合物の送達を実行することに関して採用できる。
有効投与量
本発明の分子は、一般的に、意図する目的を達成するために有効な量で用いられる。疾患状態を治療又は予防するために用いる場合、本発明の分子又はその医薬組成物は、治療有効量で投与又は施用される。治療有効量は、症状を改善若しくは予防するか、又は治療される患者の生存を延長するために有効な量である。治療有効量の決定は、特に本明細書に示す詳細な開示に鑑みて、十分に当業者の能力の範囲内である。
全身投与のために、治療有効用量は、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイから初期に見積もることができる。例えば、用量を動物モデルにおいて処方して、細胞培養において決定されるＥＣ５０を含む循環濃度範囲を達成できる。このような情報を用いて、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定できる。
初期投与量は、当該技術において公知の技術を用いてｉｎ ｖｉｖｏデータ、例えば動物モデルから見積もることもできる。当業者は、動物データに基づいてヒトへの投与を容易に最適化できる。
投与量及び間隔を個別に調整して、治療効果を維持するために十分な分子の血漿レベルをもたらすことができる。注射による投与についての通常の患者投与量は、０．０１〜０．１ｍｇ／ｋｇ／日又は０．１〜５ｍｇ／ｋｇ／日、好ましくは０．５〜１ｍｇ／ｋｇ／日以上の範囲である。治療有効血清レベルは、各日に複数の用量を投与することにより達成してもよい。
局所投与又は選択的取り込みの場合、タンパク質の有効局所濃度は、血漿濃度と関連しないことがある。当業者は、過度の実験を行うことなく、治療有効局所投与量を最適化できる。
投与される分子の量は、もちろん、治療される対象、対象の体重、病気の重篤度、投与の様式及び指示する医師の判断に依存する。
治療は、症状が検出可能である間に又は症状が検出可能でない場合であっても間欠的に反復してもよい。治療は、単独で、又はその他の薬物若しくは治療（手術を含む）と組み合わせて行ってもよい。
毒性
好ましくは、本明細書で記載する分子の治療有効用量は、実質的な毒性を引き起こすことなく治療利益をもたらす。本明細書で記載する分子の毒性は、細胞培養物又は実験動物における標準的な薬学的手順により、例えばＬＤ５０（集団の５０％にとって致死的な用量）又はＬＤ１００（集団の１００％にとって致死的な用量）を決定することにより決定できる。毒性と治療効果との間の用量比は、治療指数である。高い治療指数を示すタンパク質が好ましい。これらの細胞培養アッセイ及び動物研究から得られるデータは、ヒトで用いるために毒性でない投与量範囲を処方することにおいて用いることができる。本明細書で記載するタンパク質の投与量は、好ましくは、毒性がほとんど又は全くない有効用量を含む循環濃度の範囲内にある。投与量は、用いる剤形及び利用する投与の経路に依存して、この範囲内で変動してもよい。正確な製剤、投与の経路及び投与量は、患者の状態の観点で個別の医師が選択できる（例えばＦｉｎｇｌら、１９７５、Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ中の第１章、１頁を参照されたい）。
ペンダント基
「ペンダント基」を核酸に付着又はコンジュゲートしてもよい。ペンダント基は、核酸の細胞取り込みを増加させることがある。ペンダント基は、核酸のいずれの部分に連結することもできるが、通常、オリゴヌクレオチド鎖の端（複数可）に連結する。ペンダント基の例は、それらに限定されないが、アクリジン誘導体（すなわち２−メトキシ−６−クロロ−９−アミノアクリジン）；ソラレン誘導体、アジドフェナクリル、プロフラビン及びアジドプロフラビンのような架橋剤；人工エンドヌクレアーゼ；ＥＤＴＡ−Ｆｅ（ＩＩ）、ｏ−フェナントロリン−Ｃｕ（Ｉ）及びポルフィリン−Ｆｅ（ＩＩ）のような金属錯体；アルキル化部分；アミノ−１−ヘキサノールブドウ球菌ヌクレアーゼ及びアルカリホスファターゼのようなヌクレアーゼ；ターミナルトランスフェラーゼ；アブザイム；コレステリル部分；親油性担体；ペプチドコンジュゲート；長鎖アルコール；リン酸エステル；アミノ；メルカプト基；放射活性マーカー；色素のような非放射活性マーカー；及びポリリシン又はその他のポリアミンを含む。一例では、核酸は、炭水化物、硫酸化炭水化物又はグリカンにコンジュゲートされる。
キット
本明細書で記載するいずれの組成物も、キットに含まれていてもよい。非限定的な例では、個別のｍｉＲＮＡは、キットに含まれる。キットは、合成ｍｉＲＮＡ送達の効果について制御するために用いることができる１つ又は複数の陰性対照合成ｍｉＲＮＡをさらに含んでもよい。キットは、水及びハイブリダイゼーション緩衝液をさらに含んで、合成ｍｉＲＮＡの２つの鎖のハイブリダイゼーションを容易にしてもよい。キットは、１つ又は複数のトランスフェクション試薬（複数可）も含んで、細胞へのｍｉＲＮＡの送達を容易にしてもよい。
別の非限定的な例では、複数の合成ｍｉＲＮＡがキットに含まれる。キットは、合成ｍｉＲＮＡ送達の効果について制御するために用いることができる１つ又は複数の陰性対照合成ｍｉＲＮＡをさらに含んでもよい。キットは、１つ又は複数のトランスフェクション試薬も含んで、細胞への送達を容易にしてもよい。
キットの成分は、水性媒体中で又は凍結乾燥の形のいずれかで包装してもよい。キットの容器手段は、成分を配置でき、好ましくは適切に分割できる少なくとも１つのバイアル、試験管、フラスコ、瓶、シリンジ又はその他の容器手段を一般的に含む。キット中に１より多い成分がある場合（標識化試薬及び標識は一緒に包装してもよい）、キットは、追加の成分を分けて配置できる第２の、第３の又はその他の追加の容器も一般的に含有する。しかし、成分の様々な組み合わせを１つのバイアルに含めてもよい。本発明のキットは、商業的な販売のために密接に閉じ込められた、核酸を含有するための手段と、任意のその他の試薬容器とを典型的に含む。このような容器は、所望のバイアルを中に保持する射出又はブロー成型プラスチック容器を含んでもよい。
キットの成分を１つ及び／又は複数の液体溶液で提供する場合、液体溶液は、水溶液であり、滅菌水溶液が特に好ましい。
しかし、キットの成分は、乾燥粉末（複数可）として提供してもよい。試薬及び／又は成分を乾燥粉末として提供する場合、粉末は、適切な溶媒を加えることにより再構成できる。溶媒も別の容器手段において提供することが構想される。
容器手段は、核酸製剤を中に配置し、好ましくは適切に配分する少なくとも１つのバイアル、試験管、フラスコ、瓶、シリンジ及び／又はその他の容器手段を一般的に含む。キットは、滅菌の薬学的に許容される緩衝液及び／又はその他の希釈剤を含有するための第２の容器手段も含んでもよい。本発明のキットは、例えば所望のバイアルを中に保持する射出及び／又はブロー成型プラスチック容器のような、商業的な販売のために密接に閉じ込められたバイアルを含有するための手段も典型的に含む。
このようなキットは、ｍｉＲＮＡを保存若しくは維持するか、又はｍｉＲＮＡの分解に対して保護する成分も含んでもよい。このような成分は、ＲＮアーゼフリーであるか、又はＲＮアーゼに対して保護できる。このようなキットは、適切な手段で、それぞれ個別の試薬又は溶液のための別個の容器を一般的に含む。
キットは、キット成分を採用するため及びキットに含まれていない任意のその他の試薬の使用についての使用説明も含む。使用説明は、実行できる変動を含んでもよい。
本発明のキットは、以下の１つ又は複数も含んでもよい：ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡのライブラリー、ｍｉＲＮＡの組み合わせライブラリー、陰性対照ｍｉＲＮＡ、ヌクレアーゼフリー水；１．５ｍｌチューブのようなＲＮアーゼフリー容器；ハイブリダイゼーション緩衝液；及びトランスフェクション試薬（複数可）。
このような試薬は、本発明のキットの実施形態であることが企図される。しかし、このようなキットは、上で同定される特定の項目に限定されず、ｍｉＲＮＡの操作及び特徴決定のために用いられる任意の試薬を含んでもよい。
配列の同一性
「配列の同一性」は、本明細書において、配列を比較することにより決定される２以上の核酸（ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ＲＮＡ、ＤＮＡ）配列間の関係と定義される。当該技術において、「同一性」は、場合によっては、核酸配列の列の間の一致により決定される核酸配列間の配列の関係性の程度も意味する。「同一性」及び「類似性」は、それらに限定されないが、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．編、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８８；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ、Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９３；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ、第Ｉ部、Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．及びＧｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．編、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ、１９９４； Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、ｖｏｎ Ｈｅｉｎｅ，Ｇ．、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、１９８７；並びにＳｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．及びＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．編、Ｍ Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９１；並びにＣａｒｉｌｌｏ，Ｈ．及びＬｉｐｍａｎ，Ｄ．、ＳＩＡＭ Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ．、４８：１０７３頁（１９８８）に記載されるものを含む既知の方法により容易に算出できる。ある実施形態では、同一性は、所定の配列番号の長さ全体にわたって評価される。
同一性を決定する好ましい方法は、試験される配列間に最大の一致をもたらすように設計される。同一性及び類似性を決定する方法は、公共で利用可能なコンピュータプログラムにおいて体系化されている。２つの配列間の同一性及び類似性を決定する好ましいコンピュータプログラム法は、例えばＧＣＧプログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １２（１）：３８７頁（１９８４））、ＢｅｓｔＦｉｔ、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ及びＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０頁（１９９０）を含む。ＢＬＡＳＴ Ｘプログラムは、ＮＣＢＩ及びその他の供給源から公共に利用可能である（ＢＬＡＳＴ Ｍａｎｕａｌ、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．ら、ＮＣＢＩ ＮＬＭ ＮＩＨ Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ ２０８９４；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０頁（１９９０）。公知のスミスウォーターマンアルゴリズムも同一性を決定するために用いてもよい。
核酸比較のための好ましいパラメータは、以下を含む：アルゴリズム：Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３〜４５３頁（１９７０）；比較行列：一致＝＋１０、不一致＝０；ギャップペナルティ：５０；ギャップ長さペナルティ：３。Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．にあるＧｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ ＧｒｏｕｐからＧａｐプログラムとして入手可能。上記は、核酸比較のためのデフォルトパラメータである。
本文書及び請求の範囲において、動詞「含む」及びその活用形は、この語の後に続く項目が含まれるが、具体的に言及されていない項目は排除されないことを意味するために非限定的な意味で用いられる。さらに、動詞「からなる」は、本明細書で定義されるｍｉＲＮＡ、等価物、模倣物若しくは供給源又はそのアンタゴｍｉｒ又は組成物が具体的に同定されるものの他に追加の成分（複数可）を含むことがあり、前記追加の成分（複数可）が、本発明の独特の特徴を改変しないことを意味する「から本質的になる」で置き換えることができる。さらに、不定冠詞「ａ」又は「ａｎ」による要素の言及は、１つ及び１つのみの要素が存在することを文脈が明らかに要求しない限り、１より多い要素が存在する可能性を排除しない。不定冠詞「ａ」又は「ａｎ」は、よって、通常、「少なくとも１」を意味する。
本明細書で引用する全ての特許及び論文の参考文献は、本明細書に参照によりそれらの全体が組み込まれている。
以下の実施例は、例示の目的のためだけに与えられ、いずれの方式でも本発明の範囲を限定することを意図しない。
材料及び方法
細胞培養及び化学試薬
ＥＣ−ＲＦ２４脈管内皮細胞（ＡＢＭ＃Ｔ０００３）
ＨＵＶＥＣ（ヒト臍帯静脈内皮細胞）Ｐ４（Ｌｏｎｚａ＃ｃｃ−２５１９） そうでないと記載しない限り、実施例全体にわたって用いた。
Ｍ１９９培地（Ｇｉｂｃｏ＃２２３４０−０８７）
胎仔ウシ血清（ＦＢＳ）（Ｓｉｇｍａ＃Ｆ７５２４、Ｌｏｔ＃０５９Ｋ３３９５）
ヒト血清（ＨＳ）（Ｓｉｇｍａ＃１１８Ｋ０４９４、Ｌｏｔ＃Ｈ６９１４−１００ｍｌ）
１０．０００Ｕ／ｍｌペニシリン／ストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ）（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ ＡＧ＃Ａ２２１３）
２００ｎＭ Ｌ−グルタミン（Ｓｉｇｍａ＃Ｇ７５１３、Ｌｏｔ＃ＲＮＢＢ０７２２）
１％（ｍ／Ｖ）ゼラチン（Ｓｉｇｍａ）
１０×ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ＃１４２００−０６７）
ＴｒｙｐＬＥエクスプレス（Ｅｘｐｒｅｓｓ）（Ｇｉｂｃｏ＃１２６０５）
０．４％トリパンブルー染色液（Ｌｏｎｚａ＃１７−９４２Ｅ）
１×ＰＢＳ中の１ｍｇ／ｍｌポリブレン（Ｓｉｇｍａ）
レンチウイルスに基づくマイクロＲＮＡ（過剰）発現ライブラリー（１４プレート）
セルタイター９６（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６）（登録商標）ＡＱＵＥＯＵＳワンソリューション細胞増殖アッセイ（ＭＴＳ）（Ｐｒｏｍｅｇａ＃Ｇ３５８０）
マルチフュージＸ３Ｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）
Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ ＦＣ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）
培地
特異的成長培地ＨＵＶＥＣ：Ｍ１９９＋１００Ｕ／ｍｌ Ｐ／Ｓ＋２ｍＭ Ｌ−グルタミン＋１０％ ＦＢＳ＋１０％ ＨＳ。
特異的成長培地ＲＦ２４細胞：Ｍ１９９＋１００Ｕ／ｍｌ Ｐ／Ｓ＋２ｍＭ Ｌ−グルタミン＋１０％ ＦＢＳ。
実施例１．ｍｉＲＮＡをコードするレンチウイルスライブラリーの作製
ヒトｍｉＲＮＡを、公共のｍｉＲＮＡリポジトリ（ｗｗｗ．ｍｉｒｂａｓｅ．ｏｒｇ）及び私有の(proprietary)小型ＲＮＡ大規模配列決定データ（国際公開第２００７／０８１２０４号パンフレットを参照されたい）の両方から選択した。ｍｉＲＮＡ配列を、全長プレｍｉＲＮＡヘアピン及び両側に５０〜１５０塩基対のフランキング配列を含有するアンプリコンを用いて、ｍｉＲＮＡ配列のゲノム位置から増幅した。アンプリコンについてのプライマーは、プライマー３ソフトウェア（ｗｗｗ．ｇｅｎｅｉｏｕｓ．ｃｏｍ）のカスタム実行を用いて設計した。プライマー設計プログラムが、指定した配列中に適当なプライマーを見つけることができないならば、フランキング配列の要件を０〜２００塩基対に調整した。設計したプライマーに、５’ＧＣＧＣ突出及び定方向クローニングのための制限部位を補った。デフォルトとして、ｍｉＲＮＡの上流のプライマーに、ＢａｍＨＩ制限部位（ＧＧＡＴＣＣ）を補い、ｍｉＲＮＡの下流のプライマーに、ＥｃｏＲＩ制限部位（ＧＡＡＴＴＣ）を補った。内部にＢａｍＨＩ又はＥｃｏＲＩ制限部位を有する（すなわちゲノム配列中に出現する）アンプリコンのプライマーに、ＢｇｌＩＩ部位（ＡＧＡＴＣＴ）又はＸｂａＩ部位（ＴＣＴＡＧＡ）をそれぞれ補った。ｍｉＲＮＡを、上記のプライマーを用いて、単一の個体のヒトゲノムＤＮＡから、以下のＰＣＲ反応で増幅した。
構成成分 濃度 容量 供給業者／ｃａｔ＃
緩衝液 １０× １μｌ Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ／６００１５９
ｄＮＴＰ 各１０ｍＭ ０．２μｌ ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ／２７−１８（５８）０−０４
ｆｗｄプライマー １０μＭ ０．２μｌ Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ
ｒｅｖプライマー １０μＭ ０．２μｌ Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ
ｇＤＮＡ １００ｎｇ／μｌ ０．１μｌ 非公開供給源
Ｐｆｕ ＤＮＡ ｐｏｌ ２．５Ｕ／μｌ ０．１μｌ Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ／６００１５９
Ｈ２Ｏ ８．２μｌ
温度（℃） 時間 サイクル
９５ ２分
９５ １５秒 ４０
５９＊ １５秒 ４０ ＊ −０．１℃／サイクル
７２ ９０秒 ４０
７２ １５分
４ ∞
全てのｍｉＲＮＡ遺伝子座は、別々の１０μｌ ＰＣＲ反応において増幅した。生成物を、ＱｉａｇｅｎＰＣＲクリーンアップ緩衝液セット及びＷｈａｔｍａｎユニフィルタＧＦ／Ｃフィルタプレート（ｃａｔ＃７７００−１１０１）を用いて精製した。ＤＮＡを、ウェル当たり１７μｌ Ｈ２Ｏを用いて溶出した。別々の溶出物を、以下の制限反応において用いた。
構成成分 濃度 容量 供給業者／ｃａｔ＃
緩衝液 Ｅ １０× ２μｌ Ｐｒｏｍｅｇａ／Ｒ００５Ａ
ＥｃｏＲＩ＊ １２Ｕ／μｌ ０．１μｌ Ｐｒｏｍｅｇａ／Ｒ６０１７
ＢａｍＨＩ＊ １０Ｕ／μｌ ０．１μｌ Ｐｒｏｍｅｇａ／Ｒ６０２５
溶出物 Ｎ／Ａ １６μｌ Ｎ／Ａ
Ｈ２Ｏ Ｎ／Ａ １．８μｌ Ｎ／Ａ
＊ＥｃｏＲＩ又はＢａｍＨＩについての内部の制限部位を有するアンプリコンは、代わりにＸｂａＩ又はＢｇｌＩＩでそれぞれ切断した。ＥｃｏＲＩ＋ＢｇｌＩＩ反応は、Ｐｒｏｍｅｇａ緩衝液Ｄを用いて行った。ＢａｍＨＩ＋ＸｂａＩ反応は、Ｐｒｏｍｅｇａ緩衝液Ｅを用いて行った。
構成成分 濃度 容量 供給業者／ｃａｔ＃
緩衝液 １０× ２μｌ Ｐｒｏｍｅｇａ／Ｃ１２６３
Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ １〜３Ｕ／μｌ ０．２μｌ Ｐｒｏｍｅｇａ／Ｍ１８０４
制限ｐＣＤＨ＊ １ｎｇ／μｌ ７．８μｌ Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ／ＣＤ５１０Ｂ−１
溶出物 Ｎ／Ａ １０μｌ Ｎ／Ａ
４℃にて１晩のライゲーション。
＊定方向クローニングのために、ｐＣＤＨを、ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩをともに用いて切断した。５’ＢａｍＨＩ及び３’ＥｃｏＲＩを有するアンプリコンが正しい方向にクローニングされるように逆のＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩ制限部位を有する、ｐＣＤＨ−とよばれる代替構築物を作製した。内部のＥｃｏＲＩ部位を有するアンプリコンをＸｂａＩで切断し、ｐＣＤＨベクターにライゲーションし、該ベクターをＸｂａＩ及びＢａｍＨＩで制限した。
得られたライゲーション生成物で、細菌（Ｐｒｏｍｅｇａシングルステップ（ＫＲＸ）コンピテント細胞、ｃａｔ＃Ｌ３００２）を別々に形質転換した。５０μｌのコンピテント細胞を、９５０μｌの形質転換緩衝液ＩＩ（１０ｍＭ ＭＯＰＳ、７５ｍＭ ＣａＣｌ２、１０ｍＭ ＲｂＣｌ、１５％グリセロール、フィルタ滅菌済み）で希釈した。２０μｌのライゲーション生成物当たり、２０μｌの希釈コンピテント細胞を加えた。ミックスを氷上で１５分間インキュベートし、３７℃にて３０秒間熱ショックを与え、氷上に戻した。２分後に、形質転換細菌を、１５０μｌのルリアブロス（ＬＢ）で再構成した。細菌を、３７℃にて２０分間回復させ、その後、アンピシリン含有（５０ｕｇ／ｍＬ）ＬＢ−寒天プレート上に別々に蒔いて、３７℃にて１晩成長させた。
各プレートの単一コロニーを採取し、４００μｌのアンピシリン含有（５０ｕｇ／ｍＬ）ＬＢ中で一晩継代培養する。１μｌの継代培養物を、配列決定の目的のために１００μｌの水に溶解する。細菌溶解物を、以下のＰＣＲ反応において用いる。
構成成分 濃度 容量 供給業者／ｃａｔ＃
緩衝液 ５× １μｌ 非公開供給源
ｄＮＴＰ 各１０ｍＭ ０．１μｌ ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ／２７−１８（５−８）０−０４
ｐＣＤＨ−ｆｗｄ １０ｕＭ ０．１μｌ Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ
ｐＣＤＨ−ｒｅｖ １０ｕＭ ０．１μｌ 「 」
溶解物 １：１００ １μｌ Ｎ／Ａ
Ｔａｑ ＤＮＡ ｐｏｌ 不明 ０．０２μｌ 非公開供給源
Ｈ２Ｏ Ｎ／Ａ ２．６８μｌ Ｎ／Ａ
温度（℃） 時間 サイクル
９５ ２分
９５ １５秒 ４０
５９＊ １５秒 ４０ ＊ −０．１℃／サイクル
７２ ９０秒 ４０
７２ １５分
４ ∞
ｐＣＤＨ−ｆｗｄ ＣＡＣＧＣＴＧＴＴＴＴＧＡＣＣＴＣＣＡＴＡＧＡ
ｐＣＤＨ−ｒｅｖ ＣＡＣＴＧＡＣＧＧＧＣＡＣＣＧＧＡＧ
（配列番号３１１及び３１２）
ＰＣＲ生成物を、２５倍に希釈した。１μｌの希釈ＰＣＲ生成物を、以下のサンガー配列決定反応において用いた。
構成成分 濃度 容量 供給業者／ｃａｔ＃
緩衝液 Ｎ／Ａ １．９μｌ 非公開供給源
ビッグダイｖ３．１ Ｎ／Ａ ０．１μｌ ＡＢＩ／４３３６９２１
ｐＣＤＨ−ｓｅｑ １０ｕＭ ０．１μｌ ＩＤＴ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）
ＰＣＲ生成物 １：２５ １μｌ Ｎ／Ａ
Ｈ２Ｏ Ｎ／Ａ １．９μｌ Ｎ／Ａ
温度（℃） 時間 サイクル
９４ １０秒
５０ ５秒 ４０
６０ ２分 ４０
１０ ∞
ｐＣＤＨ−ｓｅｑ ＧＡＣＣＴＣＣＡＴＡＧＡＡＧＡＴＴＣＴＡＧＡＧＣＴＡＧＣ（配列番号３１３）
３０μｌの沈殿ミックス（８０％エタノール、５０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ５．５）を、各配列決定反応生成物に加えた。ミックスを１０秒間ボルテックスし、５０００ｒｃｆ（相対的遠心力）で４５分間、４℃にてスピンダウンした。上清を吸引し、ＤＮＡペレットを３０μｌの氷冷８０％エタノールで洗浄し、５０００ｒｃｆにて５分間、４℃にてスピンした。上清を吸引し、ＤＮＡペレットをヒートブロック上で１０分間乾燥した。乾燥ＤＮＡペレットを１０μｌ Ｈ２Ｏに溶解した。得られたＤＮＡ溶液を、ＡＢＩ ３７３０ＸＬ ＤＮＡ分析器で配列決定した。配列を、期待されるゲノム配列と比較した。正しいクローンをライブラリーに加えた。正しくないクローンについて、さらに４つの細菌コロニーを採取し、挿入配列について分析した。
ライブラリー構築物を、一晩、５０ｍＬアンピシリン含有（１００ｕｇ／ｍＬ）ＬＢで継代培養し、Ｑｉａｇｅｎエンドフリープラスミド緩衝液セット（ｃａｔ＃１９０４８）を補ったＱｉａｇｅｎ ＱＩＡｆｉｌｔｅｒプラスミドミディキット（ｃａｔ＃１２２４５）を、製造者の使用説明に従って用いて単離した。供給されたＴＥ緩衝液にＤＮＡを溶解し、５００ｎｇ／μｌの最終濃度にした。
我々は、我々でクローニングできなかった構築物を、ミニ遺伝子としてＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓに注文した。これらの場合では、全長ヘアピンプラス各部位に接する２０塩基対を、ＩＤＴによるサービスとして我々のベクターにクローニングした。
パッケージング及びウイルス生成は、Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓにより、ＣＤ−５００Ｂ１−ＣＤ５２３−Ａ１のユーザマニュアルに記載されるとおりに行われた。
実施例２．ウイルス形質導入及びスクリーニング
第−８日：ＲＦ２４細胞及びＨＵＶＥＣの細胞成長をＴ２５培養フラスコ中で開始
細胞型当たり１つのＴ２５培養フラスコを、２ｍｌの１％ゼラチンで３７℃にて１時間コーティングする。
−８０℃の超低温冷凍庫から得た細胞（これらの細胞は、９５％の対応する培地及び５％ＤＭＳＯ中で凍結していた）を３７℃にて水浴中で解凍する。バイアルを７０％エタノールで清浄にし、培養フラスコ中の細胞を５ｍｌの適当な成長培地とともに移し、３７℃、９５％湿度及び５％ＣＯ２に移す。播種の４時間後に、ＤＭＳＯ含有培地を新鮮な暖かい培養培地で置き換えなければならない。細胞は、その後、３７℃、９５％湿度及び５％ＣＯ２にて３日間インキュベートする。
第−５日：Ｔ７５培養フラスコへのＲＦ２４細胞及びＨＵＶＥＣの移動
株化細胞当たり１つのＴ７５培養フラスコを、６ｍｌの１％ゼラチンで３７℃にて１時間コーティングする。
ゼラチンを除去する。
細胞を含むＴ２５培養フラスコを、１×ＰＢＳで１回洗浄する。
０．５ｍｌのＴｒｙｐＬＥエクスプレスを細胞表面上に均一に広げ、余剰分を除去する。
室温にて、全ての細胞が剥離するまでインキュベートする。
細胞を１５ｍｌの細胞特異的成長培地（以前に行ったようにして）に再懸濁し、細胞をＴ７５培養フラスコ中で３７℃、９５％湿度及び５％ＣＯ２でインキュベートする。
第−１日：９６ウェルプレートへのＲＦ２４細胞及びＨＵＶＥＣの播種
プレート当たりのプロトコール（全て、２重で行う）：
９６ウェルプレートを、３０μｌ／ウェルの１％ゼラチンで３７℃にて１時間コーティングする。
細胞を含むＴ７５培養フラスコを、１×ＰＢＳで１回洗浄する。
１．０ｍｌのＴｒｙｐＬＥエクスプレスを細胞表面上に均一に広げ、余剰分を除去する。
室温にて、全ての細胞が剥離するまでインキュベートする。
トリプシンプロセスを、５ｍｌ／Ｔ７５の新鮮な特異的成長培地を加えることにより不活性化する。
２０μｌの０．４％トリパンブルー溶液を、同じ容量の細胞懸濁液に加え、フックス−ローゼンタールチャンバを用いて細胞を計数する。計数は、それぞれ１６の四角からなる１６の四角のうち３つを計数することにより行う。１ｍｌ当たりの細胞の量（ｎ）を算出するために、平均細胞数を、希釈により補正し、５０００を乗じる（ｃ／ｍｌ＝ｎ×２×５０００）。
１枚の９６ウェルプレートにＲＦ２４細胞を１５００細胞／ウェルの濃度で播種するために、１．８Ｅ＋５細胞を、１８ｍｌの終容量に懸濁する必要がある。１５０μｌの懸濁物を各ウェルに加える。
１枚の９６ウェルプレートにＨＵＶＥＣを２０００細胞／ウェルの濃度で播種するために、２．４Ｅ＋５細胞を、１８ｍｌの終容量に懸濁する必要がある。１５０μｌの懸濁物を各ウェルに加える。
蒔いた細胞を、３７℃、９５％湿度及び５％ＣＯ２にて一晩インキュベートする。
注：１枚の播種プレートを、細胞に形質導入することなくスクリーニングに供し、プレートの影響についてよりよい理解を得る。
第０日：午前中にＲＦ２４細胞及びＨＵＶＥＣの形質導入
まず、ポリブレンを９６ウェルプレートに加える。ＨＵＶＥＣは６μｇ／ｍｌ、及びＲＦ２４細胞は８μｇ／ｍｌのＰＢＳ中のポリブレンに曝露する。
プレートごとに：
ＨＵＶＥＣ：１２７０μｌのＰＢＳに、２００μｌのポリブレン（ＰＢＳ中に１ｍｇ／ｍｌ）を加えて、１３６μｇ／ｍｌのポリブレンを得る。１０＊１３６＝１７０＊８。終濃度：１７０μｌ中に８μｇ／ｍｌポリブレン。
ＲＦ２４細胞：１３２０μｌのＰＢＳに、１５０μｌのポリブレン（ＰＢＳ中に１ｍｇ／ｍｌ）を加えて、９６μｇ／ｍｌポリブレンを得る。１０＊１０２＝１７０＊６。終濃度：１７０μｌ中に６μｇ／ｍｌポリブレン。
１４枚のウイルスプレートのそれぞれについて、力価に応じて、特定の容量を細胞に加える。これは、播種濃度の違いにより、株化細胞ごとに異なる。理想的には、加えるウイルスの量は、両方の株化細胞について１００以下で５０以上の感染多重度（ＭＯＩ）付近である（図１及び２を参照されたい）。各プレートは完全に異なる力価のアレイを含有するので、ＭＯＩは、５０以上である。全てのプレートを、１×ＰＢＳで１０倍に希釈した後に添加する。このことは、ピペット操作の誤差を最小限にするために行う。ポリブレン濃度は、１７０μｌの容量に設定しているので、容量は、ウェル当たりわずかに異なり、わずかなポリブレン濃度の違いは回避できない。
ｘμｌのウイルスを細胞（ウイルス当たり２枚のプレート）に加えて、５０以上のＭＯＩに容易になるようにし、３７℃、９５％湿度及び５％ＣＯ２にて２４時間インキュベートする。
形質導入後に、フローキャビネットをＵＶ照射により消毒し、その後、細胞を再び取り扱う。
プレートの影響についての対照として、２枚の未処理プレートを、形質導入プレートと一緒に８日間インキュベートする。
第１日：形質導入の２４時間後のＲＦ２４細胞及びＨＵＶＥＣの培地の更新
全てのウイルス含有培地を、マルチチャネルを用いて除去し、ＭＬＩＩ手順に従って破棄する。
１５０μｌの新鮮な暖かい（３７℃）培地を細胞に加え、３７℃、９５％湿度及び５％ＣＯ２でインキュベートする。非形質導入プレート（複数可）の培地も更新する。
第４日：形質導入の９６時間後のＲＦ２４細胞及びＨＵＶＥＣの培地の更新
１００μｌのウイルス含有培地を、マルチチャネルを用いて除去し、ＭＬＩＩ手順に従って破棄する。
１００μｌの新鮮な暖かい（３７℃）培地を細胞に加え、３７℃、９５％湿度及び５％ＣＯ２でインキュベートする。
非形質導入プレート（複数可）の培地も更新する。
第７日：形質導入の１６８時間後のＲＦ２４細胞及びＨＵＶＥＣの培地の更新
全てのウイルス含有培地を、マルチチャネルを用いて除去し、ＭＬＩＩ手順に従って破棄する。
１５０μｌの新鮮な暖かい（３７℃）培地を細胞に加え、３７℃、９５％湿度及び５％ＣＯ２でインキュベートする。
非形質導入プレート（複数可）の培地も更新する。
第８日：形質導入の８日後のＭＴＳを用いる細胞生存性アッセイ
２０μｌ／ウェルのＭＴＳ溶液を１５０μｌの培地に加える。
３７℃、９５％湿度及び５％ＣＯ２にて４時間インキュベートする。プレートを振とうして、全ての溶解していない結晶を溶解させ、Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ ＦＣを用いて４９２ｎｍにて吸光度を測定する。
実施例３．ヒット選択及び確認
細胞成長に影響するｍｉＲＮＡを選択するために、Ｚスコアを選択した。プレートごと及び組み合わせたプレートの正規分布を評価するために、分布プロットを、算出した中央値及び標準偏差と実際の値とを用いて作成した。
Ｚスコアを算出するためのいくつかの方法は、異なるカットオフを用いて評価した：
方法１：
この方法は、プレート当たりの個別のｍｉＲＮＡ Ｚスコアを算出する。標準Ｚスコアは、ｍｉＲＮＡ集団の平均及びＳＤを用いる。
方法２：
この方法は、プレート当たりの個別のｍｉＲＮＡロバストＺスコアを算出する。ロバストＺスコアは、中央値と、ＳＤの代わりに、正規母集団をシミュレートするために所定の数（１．４８）を乗じた中央絶対偏差（ＭＡＤ）とを用いる（Ｃｈｕｎｇ Ｎ．ら、Ｊ Ｂｉｏｍｏｌ Ｓｃｒｅｅｎ１３：１４９〜５８、２００８）。
上記の方法は、ＭＴＳスクリーニングの著しい阻害物質と著しい刺激物質とを選択するために用いた。プレートごと及び組み合わせたプレートごとの正規分布を評価するために、分布プロットを、算出した中央値及び標準偏差と実際の値とを用いて作成した。２重の試験の個別のＭＴＳの結果間の相関は０．８５であり、ヒット選択は、平均値を用いて行った。
ライブラリーは、およそ１１２０のｍｉＲＮＡを含有する。全てのｍｉＲＮＡを、１４枚の９６ウェルプレートに蒔き、外側の列１及び１２を、陽性（ｍｉＲ−９２ａ−１）と陰性対照としての空のｐＣＤＨ−ＣＭＶ−ＭＣＳ−ＥＦ１−Ｐｕｒｏベクターとのためにあけておいた。ライブラリーを、ＭＯＩ ５０の閾値で、ＨＵＶＥＣ及びＲＦ２４内皮株化細胞を用いて２重でスクリーニングした（図３）。合計で１１０のヒットを選択した。次のステップでは、プレートごとの標準化した力価を用いるヒットの確認を行った。これにより、３９の再確認されたヒットが得られ、そのうち６つが増殖促進性であった。これらのヒットを、ｍｉＲＮＡ当たりの力価（ＭＯＩ １００及び２００）を標準化して、ウイルス毒性又は個別のｍｉＲＮＡの用量依存的影響を排除することにより、再び確認した。この実験では、我々は、異なる空のベクター集団の対照群及び非応答性ｍｉＲＮＡを、プレートにおいて２重及び鏡対称にして用いて、プレートの影響をさらに排除した。このことにより、ＨＵＶＥＣ及びＲＦ２４細胞において増殖を調節する最終的なｍｉＲＮＡヒットが得られた（表１）。
Figure 2014503553
実施例４．トータルＲＮＡ単離
ＨＵＶＥＣ及びＲＦ２４細胞を、２４ウェルプレートに播種し、以前の形質導入プロトコールに従って５０のＭＯＩにて形質導入した。第８日に細胞を氷冷ＰＢＳで洗浄し、１ｍｌのＰＢＳを加え、プレートを氷上に置いた。細胞を、細胞掻きとり器を用いて回収し、エッペンドルフチューブにピペットを用いて入れた。細胞をペレットにし、ＰＢＳを吸引し、細胞を−８０℃にて凍結した。
ＲＮＡ単離のために、細胞を氷上で解凍し、２００μｌのトリゾール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１５５９６−０２６）を加えた後に室温にて５分間インキュベートした。４０μｌのクロロホルムを加え、チューブを振とうし、３分間インキュベートした。試料を１２０００×ｇにて１５分間、４℃で遠心分離し、水性の上層の３分の２を、非接着性ＲＮアーゼフリーチューブに移した。残りの水性層は、予備として別のチューブに移した。
１μｌのグリコブルー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＡＭ９５１０）を全ての試料に１００μｌのＲＮアーゼフリーイソプロパノールと一緒に加え、ＲＮＡを−２０℃にて、最初のバッチについて一晩、及び予備のバッチについて２週間沈殿させた。試料を、最大速度にて最短で４５分間、４℃にて遠心分離し、ペレットを２００μｌの７０％ＲＮアーゼフリーエタノールで洗浄した。試料を７４００×ｇにて５分間、４℃にて遠心分離し、上清を除去した。ペレットを乾燥させ、最初のバッチについて２５μｌのＨ２Ｏ、及び予備のバッチについて１５μｌのヌクレアーゼフリーＨ２Ｏに溶解した。
キュビット（Ｑｕｂｉｔ）のためのＲＮＡキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をプロトコールに従って用いて、最終ＲＮＡ濃度を測定した。
実施例５．ステム−ループＲＴ−ＰＣＲ及びｑＰＣＲ
マイクロＲＮＡ発現を、記載されるようにしてステム−ループＲＴ−ＰＣＲにより決定した（Ｃｈｅｎ、Ｃ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３３：ｅ１７９（２００５））。ステムループＲＴ−ＰＣＲのために、ステムループプライマーを、ｍｉｒＢａｓｅ１５及び１６における成熟配列と、存在するならばそれらのアイソフォームとに従って、各個別のｍｉＲＮＡについて設計した。ｑＰＣＲのために、個別のフォワードプライマーを、これもまたｍｉｒＢａｓｅ１５及び１６における成熟ｍｉＲＮＡ配列に従って設計した（以下を参照されたい）。ユニバーサルリバースプライマーを、ステム−ループ配列について設計した（以下を参照されたい）。ハウスホールド遺伝子としてＵ６を用いた。
ＳＬ−ｈｓａ−ｍｉＲ−７ （配列番号３１４）
ＧＴＣＧＴＡＴＣＣＡＧＴＧＣＡＧＧＧＴＣＣＧＡＧＧＴＡＴＴＣＧＣＡＣＴＧＧＡＴＡＣＧＡＡＣＡＡＣＡ
フォワード＿ｈｓａ−ｍｉＲ−７ （配列番号３１５）
ＧＣＣＣＧＣＴＴＧＧＡＡＧＡＣＴＡＧＴＧＡＴＴＴＴＧ
ＳＬ＿ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ｂ （配列番号３１６）
ＧＴＣＧＴＡＴＣＣＡＧＴＧＣＡＧＧＧＴＣＣＧＡＧＧＴＡＴＴＣＧＣＡＣＴＧＧＡＴＡＣＧＡＣＡＣＣＴＡＴ
フォワード＿ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ｂ （配列番号３１７）
ＴＧＣＣＡＧＴＴＣＡＡＧＴＡＡＴＴＣＡＧＧＡＴ
ＳＬ＿ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ｂ＊ （配列番号３１８）
ＧＴＣＧＴＡＴＣＣＡＧＴＧＣＡＧＧＧＴＣＣＧＡＧＧＴＡＴＴＣＧＣＡＣＴＧＧＡＴＡＣＧＡＣＧＡＧＣＣＡ
フォワード＿ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ｂ＊ （配列番号３１９）
ＴＧＣＣＡＧＣＣＴＧＴＴＣＴＣＣＡＴＴＡＣＴＴＧ
ＳＬ＿ｈｓａ−ｍｉＲ−５７４−５ｐ （配列番号３２０）
ＧＴＣＧＴＡＴＣＣＡＧＴＧＣＡＧＧＧＴＣＣＧＡＧＧＴＡＴＴＣＧＣＡＣＴＧＧＡＴＡＣＧＡＣＡＣＡＣＡＣ
フォワード＿ｈｓａ−ｍｉＲ−５７４−５ｐ （配列番号３２１）
ＴＧＣＣＡＧＴＧＡＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＡＧＴ
ＳＬ＿ｈｓａ−ｍｉＲ−５７４−３ｐ （配列番号３２２）
ＧＴＣＧＴＡＴＣＣＡＧＴＧＣＡＧＧＧＴＣＣＧＡＧＧＴＡＴＴＣＧＣＡＣＴＧＧＡＴＡＣＧＡＣＴＧＴＧＧＧ
フォワード＿ｈｓａ−ｍｉＲ−５７４−３ｐ （配列番号３２３）
ＴＧＣＣＡＧＣＡＣＧＣＴＣＡＴＧＣＡＣＡＣＡＣＣ
ＳＬ＿ｈｓａ−ｍｉＲ−２７ａ （配列番号３２４）
ＧＴＣＧＴＡＴＣＣＡＧＴＧＣＡＧＧＧＴＣＣＧＡＧＧＴＡＴＴＣＧＣＡＣＴＧＧＡＴＡＣＧＡＣＧＣＧＧＡＡ
フォワード＿ｈｓａ−ｍｉＲ−２７ａ （配列番号３２５）
ＴＧＣＣＡＧＴＴＣＡＣＡＧＴＧＧＣＴＡＡＧＴＴ
ＳＬ＿ｈｓａ−ｍｉＲ−２７ａ＊ （配列番号３２６）
ＧＴＣＧＴＡＴＣＣＡＧＴＧＣＡＧＧＧＴＣＣＧＡＧＧＴＡＴＴＣＧＣＡＣＴＧＧＡＴＡＣＧＡＣＴＧＣＴＣＡ
フォワード＿ｈｓａ−ｍｉＲ−２７ａ＊ （配列番号３２７）
ＴＧＣＣＡＧＡＧＧＧＣＴＴＡＧＣＴＧＣＴＴＧＴＧ
ＳＬ＿ｈｓａ−ｍｉＲ−９２ａ−１ （配列番号３２８）
ＧＴＣＧＴＡＴＣＣＡＧＴＧＣＡＧＧＧＴＣＣＧＡＧＧＴＡＴＴＣＧＣＡＣＴＧＧＡＴＡＣＧＡＡＣＡＧＧＣ
フォワード＿ｈｓａ−ｍｉＲ−９２ａ−１ （配列番号３２９）
ＴＧＣＣＡＧＴＡＴＴＧＣＡＣＴＴＧＴＣＣＣＧＧＣ
ＳＬ＿ｈｓａ−ｍｉＲ−１９０ｂ （配列番号３３０）
ＧＴＣＧＴＡＴＣＣＡＧＴＧＣＡＧＧＧＴＣＣＧＡＧＧＴＡＴＴＣＧＣＡＣＴＧＧＡＴＡＣＧＡＡＡＣＣＣＡ
フォワード＿ｈｓａ−ｍｉＲ−１９０ｂ （配列番号３３１）
ＧＣＣＣＧＣＴＡＡＧＣＣＣＴＴＡＣＣＣＣＡＡＡＡＡ
ＳＬ＿ｈｓａ−ｍｉＲ−１４２−５ｐ （配列番号３３２）
ＧＴＣＧＴＡＴＣＣＡＧＴＧＣＡＧＧＧＴＣＣＧＡＧＧＴＡＴＴＣＧＣＡＣＴＧＧＡＴＡＣＧＡＣＡＧＴＡＧＴ
フォワード＿ｈｓａ−ｍｉＲ−１４２−５ｐ （配列番号３３３）
ＧＣＣＣＧＣＣＡＴＡＡＡＧＴＡＧＡＡＡＧＣＡＣ
ＳＬ＿ｈｓａ−ｍｉＲ−１４２−３ｐ （配列番号３３４）
ＧＴＣＧＴＡＴＣＣＡＧＴＧＣＡＧＧＧＴＣＣＧＡＧＧＴＡＴＴＣＧＣＡＣＴＧＧＡＴＡＣＧＡＣＴＣＣＡＴＡ
フォワード＿ｈｓａ−ｍｉＲ−１４２−３ｐ （配列番号３３５）
ＴＧＣＣＡＧＴＧＴＡＧＴＧＴＴＴＣＣＴＡＣＴＴＴＡ
ＳＬ＿ｈｓａ−ｍｉＲ−９ （配列番号３３６）
ＧＴＣＧＴＡＴＣＣＡＧＴＧＣＡＧＧＧＴＣＣＧＡＧＧＴＡＴＴＣＧＣＡＣＴＧＧＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＴＡＣ
フォワード＿ｈｓａ−ｍｉＲ−９ （配列番号３３７）
ＴＧＣＣＡＧＴＣＴＴＴＧＧＴＴＡＴＣＴＡＧＣＴＧＴ
ＳＬ＿ｈｓａ−ｍｉＲ−９＊ （配列番号３３８）
ＧＴＣＧＴＡＴＣＣＡＧＴＧＣＡＧＧＧＴＣＣＧＡＧＧＴＡＴＴＣＧＣＡＣＴＧＧＡＴＡＣＧＡＣＡＣＴＴＴＣ
フォワード＿ｈｓａ−ｍｉＲ−９＊ （配列番号３３９）
ＴＧＣＣＡＧＡＴＡＡＡＧＣＴＡＧＡＴＡＡＣＣＧＡ
ｑＰＣＲリバース （配列番号３４０）
ＧＴＧＣＡＧＧＧＴＣＣＧＡＧＧＴ
Ｕ６ステムループプライマー （配列番号３４１）
ＧＴＣＡＴＣＣＴＴＧＣＧＣＡＧＧ
Ｕ６フォワードプライマー （配列番号３４２）
ＣＧＣＴＴＣＧＧＣＡＧＣＡＣＡＴＡＴＡＣ
Ｕ６リバースプライマー （配列番号３４３）
ＡＧＧＧＧＣＣＡＴＧＣＴＡＡＴＣＴＴＣＴ
ｑＰＣＲのために、１μｌのＲＴ−ＰＣＲ生成物を、２５ｐｍｏｌのフォワード及びリバースプライマー、Ｈ２Ｏ及び２×ｉＱ ＳＹＢＲグリーンスーパーミックス（Ｂｉｏ−ｒａｄ、１７０−８８８０）とともに反応において用いた。ＰＣＲ反応は、ＢｉｏＲａｄ ＣＦＸ９６で、９５℃の最初の５分間のステップ、１０秒９５℃、２０秒６０℃及び１０秒７２℃の４５サイクルを用いて行い、その後、融解曲線分析を行った。相対的ｍｉＲＮＡ発現レベルを算出した。誘導されたｍｉＲＮＡ及び空のベクター試料についてのＣＴ値を得て、対応するＵ６ ＣＴ値を減じた。空のベクターｍｉＲＮＡレベルと形質導入試料におけるｍｉＲＮＡレベルとの間の違いを、過剰発現の尺度として算出した。
ΔＣｔの算出：
１．ΔＣｔ＝ｍｉＲＮＡの平均Ｃｔ−Ｕ６対照遺伝子の平均Ｃｔ。
２．ΔΔＣｔを算出する（ΔΔＣｔ＝ΔＣｔ形質導入−ΔＣｔ非形質導入）
３．これらの算出により負又は正の数が得られる。
４．倍数変化を算出する：ΔΔＣｔが負であるならば、倍数変化は増加し、等式は２＾−［平均ΔΔＣｔ］であり、又はΔΔＣｔが正であるならば、倍数変化は減少し、等式は−（２＾［平均ΔΔＣｔ］）である。
最終ヒットは、ｑＰＣＲにより再確認した。ＨＵＶＥＣに、５０のＭＯＩでレンチウイルスｍｉＲＮＡを形質導入した。ＲＮＡを単離し、ステムループＲＴ及びｑＰＣＲを行った。結果を表２に示す。
Figure 2014503553
実施例６．ＤＮＡ配列分析
ヒットについてレンチウイルスベクターにクローニングしたｍｉＲＮＡの配列を、以下のようにして検証した。プロウイルスＤＮＡを、ＲＮＡ試料中のゲノムＤＮＡの画分について、インプットとしての１μｌのＲＮＡ試料、及びｐＣＤＨ１５レンチウイルスベクター特異的プライマー（フォワード：５’−ＣＡＣＧＣＴＧＴＴＴＴＧＡＣＣＴＣＣＡＴＡＧＡ−３’、リバース：５’−ＣＡＣＴＧＡＣＧＧＧＣＡＣＣＧＧＡＧ−３’（配列番号３４４、３４５））を、５８℃のアニーリング温度にて３０サイクルで用いるＰＣＲにより増幅した。ＤＮＡ配列分析は、０．１〜１μｌのＰＣＲ生成物、０．５ｕｌの１０ｕＭ ｐＣＤＨ特異的プライマー（５’−ＧＡＣＣＴＣＣＡＴＡＧＡＡＧＡＴＴＣＴＡＧＡＧＣＴＡＧＣ−３’（配列番号３１３））、及びビッグダイｖ３．１キット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて行った。生成物を、３７３０ ＤＮＡ分析器（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で分析した。データを、コレクションソフトウェアｖ３．０を用いて収集し、シーケンシングアナリシスｖ５．３．１プログラム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて分析した。このサンガーＤＮＡ配列により、細胞に形質導入されたｍｉＲＮＡの配列を確認した（表３）。
Figure 2014503553
実施例７．合成模倣物トランスフェクション
選択したｍｉＲＮＡを検証するために、合成模倣物を用いるトランスフェクションを、製造者のプロトコール（各９６ウェルについて０．５μｌのＸ−ｔｒｅｍｅＧＥＮＥ）に従ってＸ−ｔｒｅｍｅＧＥＮＥ（Ｒｏｃｈｅ、０４４７６０９３００１）を用いて行った。模倣物（Ｐｒｅ−ｍｉＲ（商標）ｍｉＲＮＡ前駆体）及びｓｉＲＮＡ（ＯＮ−ＴＡＲＧＥＴｐｌｕｓＳＭＡＲＴプール）を、それぞれＡｍｂｉｏｎ及びＤｈａｒｍａｃｏｎに注文し、異なる濃度で試験した。用いた模倣配列は、表５で同定される対応するｍｉＲＮＡ分子の成熟配列である。細胞生存性は、上記のようにしてＭＴＳアッセイを用いて決定した。
材料：
Ａｍｂｉｏｎ（登録商標）Ｐｒｅ−ｍｉＲ（商標）ｍｉＲＮＡ前駆体ｈｓａ−ｍｉＲ−５７４−５ｐ（ＰＭ１３０８１）
Ａｍｂｉｏｎ（登録商標）Ｐｒｅ−ｍｉＲ（商標）ｍｉＲＮＡ前駆体ｈｓａ−ｍｉＲ−７（ＰＭ１００４７）
Ａｍｂｉｏｎ（登録商標）Ｐｒｅ−ｍｉＲ（商標）ｍｉＲＮＡ前駆体ｈｓａ−ｍｉＲ−１９０ｂ（ＰＭ１３０３５）
Ａｍｂｉｏｎ（登録商標）Ｐｒｅ−ｍｉＲ（商標）ｍｉＲＮＡ前駆体ｈｓａ−ｍｉＲ−１４２−３ｐ（ＰＭ１０３９８）
Ａｍｂｉｏｎ（登録商標）Ｐｒｅ−ｍｉＲ（商標）ｍｉＲＮＡ前駆体ｈｓａ−ｍｉＲ−１４２−５ｐ（ＰＭ１０９７９）
Ｐｒｅ−ｍｉＲ（商標）ｍｉＲＮＡ 前駆体陰性対照＃１（ＡＭ１７１１０）
ＰＬＫ１ ＯＮ−ＴＡＲＧＥＴｐｌｕｓＳＭＡＲＴプール（Ｌ−００３２９０−００−０００５）
選択したｍｉＲＮＡの機能をさらに検証するために、ｍｉＲ−７、ｍｉＲ−５７４−５ｐ、ｍｉＲ−１９０ｂ、ｍｉＲ−１４２−３ｐ及びｍｉＲ−１４２−５ｐについての合成模倣分子を用いた。同じＭＴＳアッセイにおいて、合成模倣物及び対照ｍｉＲＮＡ及び陽性対照としてのＰＬＫ１ ｓｉＲＮＡを、漸増濃度でＨＵＶＥＣ細胞に加えた（図４、５及び６）。陰性対照ｍｉＲＮＡは、細胞成長に対して影響を示さなかった。ＰＬＫ１についてのｓｉＲＮＡは、用量依存的様式で細胞生存性の阻害を示した。同様に、ｍｉＲ−７、ｍｉＲ−５７４−５ｐ、ｍｉＲ−１９０ｂ、ｍｉＲ−１４２−３ｐ及びｍｉＲ−１４２−５ｐについての模倣物も、用量依存的様式で細胞成長の低減を示した。さらに、ｍｉＲ−１９０ｂ、ｍｉＲ−１４２−３ｐ及びｍｉＲ−１４２−５ｐについての結果を表９に示す。
Figure 2014503553
実施例８．管形成（マトリゲル）アッセイ
ｍｉＲ−１９０ｂ、ｍｉＲ−１４２−３ｐ及びｍｉＲ−１４２−５ｐの抗血管新生効果を確認するために、我々は、ＨＵＶＥＣを用いて管形成アッセイを行った。なぜなら、ＨＵＶＥＣは、血管様毛細管をマトリゲル上に形成するからである。図７及び８に示すように、ｍｉＲ−１９０ｂ、ｍｉＲ−１４２−３ｐ及びｍｉＲ−１４２−５ｐは、対照群であるリポフェクタミン及びスクランブルにしたｍｉＲＮＡと比較して、ＨＵＶＥＣによる毛細管形成を阻害する。
材料及び方法
ＢＤマトリゲル基質基底膜；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅカタログ番号３５６２３７
ＨＵＶＥＣを１２ウェルプレート（ウェル当たり４５０００細胞）に播種し、次の日にＸｔｒｅｍｅＧｅｎｅ及び対応する模倣物をトランスフェクトした。細胞を４８時間インキュベートした。
マトリゲルコーティングプレートを３７℃にて３０分間インキュベートする間に、トランスフェクトしたＨＵＶＥＣを計数し、完全ＨＵＶＥＣ成長培地中の７５００細胞／１００μｌの細胞懸濁物に調製した。１００μｌの細胞懸濁物を、９６ウェルの各マトリゲルコーティングウェルに加えた。プレートを、湿潤３７℃にて５％ＣＯ２を用いてインキュベートした。
プレートを、３時間後に調べた。培養物を、この時点で毛細管形成について評点し、１６〜２０時間後に再び評点した。図７及び８のデータは、１６〜２０時間後の管形成を示す。
実施例９．合成模倣物をトランスフェクトしたＨＵＶＥＣを用いる管形成（マトリゲル）アッセイ
選択したｍｉＲＮＡを検証するために、合成模倣物を用いるトランスフェクションを、製造者のプロトコール（各１２ウェルについて６μｌのＸ−ｔｒｅｍｅＧＥＮＥ）に従ってＸ−ｔｒｅｍｅＧＥＮＥ（Ｒｏｃｈｅ、０４４７６０９３００１）を用いて行った。模倣物（Ｐｒｅ−ｍｉＲ（商標）ｍｉＲＮＡ前駆体）及びｓｉＲＮＡ（ＯＮ−ＴＡＲＧＥＴ ｐｌｕｓ ＳＭＡＲＴプール）を、それぞれＡｍｂｉｏｎ及びＤｈａｒｍａｃｏｎに注文した。用いた模倣配列は、表５で同定される対応するｍｉＲＮＡ分子の成熟配列である。
ｍｉＲ−９＊のようなｍｉＲ−９の抗血管新生効果を確認するために、我々は、ＨＵＶＥＣを用いて管形成アッセイを行った。なぜなら、ＨＵＶＥＣは、血管様毛細管をマトリゲル上に形成するからである。ＨＵＶＥＣを１２ウェルプレート（ウェル当たり４５０００細胞）に播種し、次の日にＸ−ｔｒｅｍｅＧｅｎｅ及び対応する模倣物又はｓｉＲＮＡをトランスフェクトした。細胞を４８時間インキュベートした。
マトリゲルコーティングプレートを３７℃にて３０分間インキュベートする間に、トランスフェクトしたＨＵＶＥＣを計数し、完全ＨＵＶＥＣ成長培地中の７５００細胞／１００μｌの細胞懸濁物に調製した。１００μｌの細胞懸濁物を、９６ウェルの各マトリゲルコーティングウェルに加えた。プレートを、湿潤３７℃にて５％ＣＯ２を用いてインキュベートし、３時間後に調べた。培養物を、この時点で毛細管形成について評点し、１６〜２０時間後に再び評点した。
図９に示すように、ｍｉＲ−９＊は、対照群であるＸ−ｔｒｅｍｅＧｅｎｅ及びスクランブルにしたｓｉＲＮＡと比較して、ＨＵＶＥＣによる毛細管形成を強く阻害する。このアッセイは、ｍｉＲ−９＊が管形成の強い阻害を示すことを示す。
材料及び方法
ＢＤマトリゲル基質基底膜；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅカタログ番号３５６２３７
Ａｍｂｉｏｎ（登録商標）Ｐｒｅ−ｍｉＲ（商標）ｍｉＲＮＡ前駆体ｈｓａ−ｍｉＲ−９＊（ＰＭ１３０７２）
カスタムメイドｓｉＲＮＡ陰性対照（Ａｍｂｉｏｎ）
センス：ＣＡＵＣＧＵＣＧＡＵＣＧＵＡＧＣＧＣＡｔｔ （配列番号３４６）
アンチセンス：ＵＧＣＧＣＵＡＣＧＡＵＣＧＡＣＧＡＵＧｔｔ （配列番号３４７）
ＰＬＫ１ ＯＮ−ＴＡＲＧＥＴｐｌｕｓ ＳＭＡＲＴプール（Ｌ−００３２９０−００−０００５）
実施例１０．合成模倣物トランスフェクション
ｍｉＲ−９＊が管形成をｉｎ ｖｉｔｒｏで阻害することを示す実施例９に記載する結果をさらに確認するために、ＭＴＳ細胞生存性アッセイを行った。
材料及び方法：
ＥＧＭ−２培地で培養したＨＵＶＥＣに、合成模倣物を、製造者のプロトコール（各９６ウェルについて０．５μｌのＸ−ｔｒｅｍｅＧＥＮＥ）に従ってＸ−ｔｒｅｍｅＧＥＮＥ（Ｒｏｃｈｅ、０４４７６０９３００１）を用いてトランスフェクトした。模倣物（Ｐｒｅ−ｍｉＲ（商標）ｍｉＲＮＡ前駆体）及びｓｉＲＮＡ（ＯＮ−ＴＡＲＧＥＴ ｐｌｕｓ ＳＭＡＲＴプール）を、それぞれＡｍｂｉｏｎ及びＤｈａｒｍａｃｏｎに注文し、異なる濃度で試験した。用いた模倣配列は、表５で同定される対応するｍｉＲＮＡ分子の成熟配列である。細胞生存性は、上記のようなＭＴＳアッセイを用いて決定した。
材料：
Ａｍｂｉｏｎ（登録商標）Ｐｒｅ−ｍｉＲ（商標）ｍｉＲＮＡ前駆体ｈｓａ−ｍｉＲ−９＊ ＰＭ１３０７２）
Ｐｒｅ−ｍｉＲ（商標）ｍｉＲＮＡ前駆体陰性対照＃１（ＡＭ１７１１０）
ｓｉＲＮＡスクランブルＯＮ−ＴＡＲＧＥＴｐｌｕｓ ＳＭＡＲＴプール（Ｄ−００１８１０−１０−０５）
ＰＬＫ１ ＯＮ−ＴＡＲＧＥＴｐｌｕｓ ＳＭＡＲＴプール（Ｌ−００３２９０−００−０００５）
ＥＧＭ−２培地、Ｌｏｎｚａ（ＣＣ−３１６２）
結果：
図１０は、ＨＵＶＥＣの細胞生存性が、ｍｉＲ−９＊により用量依存的に阻害されることを示す。同じＭＴＳアッセイにおいて、合成模倣物、対照ｍｉＲＮＡ及び陽性対照であるＰＬＫ１ ｓｉＲＮＡを、漸増濃度でＨＵＶＥＣ細胞に加えた。陰性対照ｍｉＲＮＡ及びｓｉＲＮＡ対照は、１５ｎＭの濃度まで細胞成長に対する影響を示さなかった。ＰＬＫ１についてのｓｉＲＮＡでの処理は、細胞生存性を用量依存的な様式で阻害する。同様に、ｍｉＲ−９＊についての模倣物での処理は、ｓｉＰＬＫ１による細胞生存性の阻害と同様に細胞生存性の低減を示す。
実施例１１．Ｉｎ ｖｉｔｒｏ血管新生アッセイ：発芽アッセイ
３次元内皮細胞発芽アッセイを、内皮細胞増殖及び遊走におけるｍｉＲ−７及びｍｉＲ−５７４−５ｐの役割を調査するためのモデルとして用いた。我々は、ＨＵＶＥＣに模倣物をトランスフェクトし、細胞をトランスフェクションの４日後に採集して、懸滴法を用いて一晩、球状体を形成した。球状体をゲルに配置し、ｂＦＧＦを用いて刺激して、毛細管新芽を能動的に形成した。
材料及び方法：
ＨＵＶＥＣに、５０ｎＭの模倣物（実施例７を参照されたい）をトランスフェクトし、２０％（ｖ／ｖ）メトセル及び１０％熱不活化ヒト血清を含有する培養培地に、４００００細胞／ｍｌの最終密度で懸濁した。メトセルは、６ｇのカルボキシメチルセルロース（粘度４０００ｃｐ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を５００ｍｌの培地１９９に溶解することにより得たストック溶液から希釈した。
単一球状体を、１０００内皮細胞から調製する。２５μｌの滴を、四角の１２×１２ｃｍペトリ皿の裏向けた蓋の内側にピペットを用いて置く。蓋を、１０ｍｌのＰＢＳを含有する皿の上に蓋の正常な位置で注意深く配置し、３７℃（５％ＣＯ２）のインキュベータに一晩入れる。滴を、マルチチャネルピペットを用いて置いて、等しいサイズの球状体を確実に得て、最大で１００〜１２０の球状体を１枚の皿の内側に配置する。
球状体を、１０％熱不活化ＦＣＳを含有する２×５ｍｌ ＰＢＳで蓋を穏やかにすすぐことにより採集し、１５ｍｌのチューブに回収し、３００ｇで５分間遠心分離した。培地を吸引し、球状体ペレットを、粗い表面上でこすることにより穏やかに緩める。
球状体を包埋するためのコラーゲンゲルは、培地１９９、ｐＨ７．４中のＰｕｒｅＣｏｌウシＩ型コラーゲン（Ｎｕｔａｃｏｎ）から、氷上で終容量の２／３のコラーゲンと終容量の１／１２の１０×Ｍ１９９とを組み合わせることにより調製し、これを氷冷０．２Ｍ ＮａＯＨで中和する（溶液Ａ）。別のチューブ（Ｂ）に、ＮＢＣＳ（１／１０終容量）及びヘパリン（０．１％終容量）を、メトセルストック（終容量の１５％）と混合する。その後、Ａ及びＢを穏やかに混合し、球状体に重層するために用いる。
ＨＵＶＥＣ球状体を、この完全ミックス中に採取した。次いで、４００μｌのゲルを、予め温めたμ−スライド（Ｉｂｉｄｉ、Ｇｅｒｍａｎｙ）に分割し、３７℃（５％ＣＯ２）にて３０分間放置してインキュベートして、ゲルを重合させた。このステップの後に、ｂＦＧＦ（１００ｎｇ／ｍｌ；２０ｎｇ／ｍｌ終濃度）を含有する１００μｌの重層培地を加えて、３７℃（５％ＣＯ２）にて一晩インキュベートした。およそ２０の球状体が１つのウェルに存在するはずである。
位相差画像を、倒立顕微鏡（Ｌｅｉｃａ ＤＭＩ３０００）に連結したカメラ（日立ＧｉＧＥ、１．４ＭＢ）を用いて取得した。Ｉｎ ｖｉｔｒｏでの毛細管発芽を、累積新芽長さ及び球状体当たりの新芽の数を、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いて測定することにより定量した。各処理群について、平均累積新芽長さ及び新芽の平均数を、これらのパラメータを１０の球状体にわたって平均することにより算出した。
結果：
図１１Ａは、ＨＵＶＥＣ球状体の発芽特性を定量するために用いた画像の例を示す。画像は、ｂＦＧＦが新芽形成を誘導したことを示す。画像は、ｍｉＲ−７、ｍｉＲ−５７４−５ｐ及びｍｉＲ−２７ａで処理したＨＵＶＥＣから作製したＨＵＶＥＣ球状体が、Ｘ−ｔｒｅｍｅｇｅｎｅ（模擬）又はｍｉＲ−スクランブルで処理した対照ＨＵＶＥＣと比較して、より少なくそして短い新芽を形成することも示す。
図１１Ｂ及びＣは、処理群当たりの新芽の定量を示し、ｍｉＲ−７、ｍｉＲ−５７４−５ｐ及びｍｉＲ−２７ａが、新芽形成及び新芽の長さを有意に阻害することを示す（ｐ＜０．００１、１元配置Ａｎｏｖａ）。ｍｉＲ−２７ａは、陽性対照として用いた。なぜなら、このｍｉＲＮＡは、血管新生プロセスに関与することが文献に記載されているからである。
実施例１２．Ｎ２Ａ腫瘍モデルにおけるｍｉＲＮＡのｉｎ ｖｉｖｏ試験
材料及び方法：
抗増殖性ｍｉＲＮＡの効力をｉｎ ｖｉｖｏで試験するために、我々は、Ｖａｄｅｒら（Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ．２０１１（４）：４５７〜６６頁）から適合したｉｎ−ｖｉｖｏの機構を用いた。６〜８週齢の正常雄Ａ／Ｊマウス（Ｈａｒｌａｎ、ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）に、１００μｌのＮｅｕｒｏ２Ａ細胞（１×１０７細胞／ｍｌ）を皮下注射した。腫瘍サイズを、デジタルノギスで毎日測定し、腫瘍体積を、以下の式を用いることにより算出した：長さ×幅２×０．５２。処理を、４０〜７０ｍｍ３の腫瘍体積で、第１、３、５、７、９、１１日に１０μｇのｍｉＲＮＡ又はｓｉＲＮＡの腫瘍内注射の後に、垂直の角度にて２×２のパルスを送達するように設定したＥＣＭ８３０エレクトロポレーター（ＢＴＸ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を用いる２００Ｖ／ｃｍの設定のエレクトロポレーションを行うことにより開始した。第１２日にマウスを犠牲にし、腫瘍を切除した。ｍｉＲＮＡ模倣物は、Ａｍｂｉｏｎから、表５に列挙する配列に基づいて注文した。ｍｉＲ−スクランブルは、Ａｍｂｉｏｎから、実施例７に記載するようにして注文した。ｓｉＶＥＧＦＲ２は、Ａｍｂｉｏｎから注文し、以下の配列を含んだ：
センス：５’−ＣＣＧＧＡＡＡＵＣＵＧＧＡＧＡＡＵＣＡｔｔ−３’（配列番号３９７）
アンチセンス５’−ＵＧＡＵＵＣＵＣＣＡＧＡＵＵＵＣＣＧＧｔｔ−３’（配列番号３９８）
ＭｉＲＮＡ及びｓｉＲＮＡは、リン酸塩緩衝液（ＰＢＳ）に溶解した。
結果：
図１２は、リン酸塩緩衝液（ＰＢＳ）、ｍｉＲ−スクランブル、ｍｉＲ−７、ｍｉＲ−５７４−５ｐ、ｍｉＲ−９＊、ｍｉＲ−２７ａ又はｓｉＶＥＧＦＲ−２で処理した動物群の腫瘍成長曲線を示す。曲線は、ｍｉＲ−スクランブル（ｎ＝６）処理動物の腫瘍成長曲線が、ＰＢＳ処理動物（ｎ＝６）のものと同様であることを示し、このことは、非機能的ｍｉＲＮＡの低い毒性を示す。曲線は、ｍｉＲ−７で処理した動物（ｎ＝７）が、ｍｉＲ−スクランブル（ｎ＝６）処理群と比較しておよそ５０％の低減された腫瘍成長を示すことも示す（図１２Ａ）。同じ効果が、ｍｉＲ−５７４−５ｐ模倣物で処理したマウス（ｎ＝７）について第６日〜第１０日の間に観察された（図１２Ｂ）。著しいことに、参照抗血管新生ｍｉＲＮＡ ｍｉＲ−２７ａで処理した動物（ｎ＝７、図１２Ｃ）は、ｍｉＲ−７及びｍｉＲ−５７４−５ｐと比較して、腫瘍増殖のより小さい低減を示した。ｉｎ ｖｉｖｏ実験のうちの陽性対照として、動物を、ｓｉＶＥＧＦＲ−２で処理した（ｎ＝７、図１２Ｄ）。この群は、ＰＢＳ（ｎ＝６）及びｍｉＲ−スクランブル（ｎ＝６）群と比較して、第７日から実験の終了まで著しい腫瘍成長阻止を示した。
図１２Ｅの腫瘍成長曲線は、マウスの異なるコホートを用いて作成した。模倣ｍｉＲ−９＊で処理した腫瘍（ｎ＝８）は、ＰＢＳ（ｎ＝８）及びｍｉＲ−スクランブル（ｎ＝１０）処理マウスと比較して、第７日から実験の終了まで著しい腫瘍成長阻止を示した。
実施例１３．免疫組織化学：ＣＤ３１抗体染色
腫瘍成長の阻害（実施例１２を参照されたい）が、腫瘍脈管構造の減少の原因となり得るかを調べるために、腫瘍を、内皮細胞マーカーＣＤ３１で染色した。微小脈管密度（ＭＶＤ）を、ＣＤ３１染色の定量により算出した。
材料及び方法：
６μｍのパラフィン包埋腫瘍切片を、ＣＤ−３１について免疫染色した。パラフィン包埋腫瘍切片を、キシレン中で脱パラフィンし、一連の勾配アルコール浴中で水和した。切片を脱イオン水で洗浄した後に、切片を１５分間、１０ｍＭクエン酸塩緩衝液（ｐＨ６）中で煮沸した。室温に到達した後に、切片を１×ＰＢＳで洗浄し、その後、切片を、１％ＢＳＡ／ＰＢＳ中の５％正常ヤギ血清（Ｄａｋｏ ｘ０９０７１０）中で３０分間、ＲＴにてインキュベートした。次いで、組織を１％ＢＳＡ／ＰＢＳ中の１次抗体ウサギ抗マウスＣＤ３１と４℃にて一晩インキュベートした。次の日に、室温に到達した後に、組織をＰＢＳで３回洗浄した。内因性ペルオキシダーゼを不活性化させるために、腫瘍組織を、０．３％Ｈ２Ｏ２／ＰＢＳ（１部の３０％Ｈ２Ｏ２及び９部のＰＢＳ）中で３０分間、ＲＴにてインキュベートした。ＰＢＳで３回洗浄した後に、切片を、ブライトビジョンポリＨＲＰヤギ抗ウサギ（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ）と３０分間、ＲＴにてインキュベートした。スライドを再び洗浄し、その後、ＤＡＢ（３，３’−ジアミノベンジジン）溶液（５００μｇ／ｍｌ）中で１分間インキュベートした後に、脱イオン水で２回洗浄した。スライドを、ヘマトキシリン（Ｍａｙｅｒｓ、Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ、ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）中に１５秒間移し、その後、脱イオン水と、最後に水道水でさらに２回洗浄ステップを行った。スライドをその後７０％、９０％、９５％及び１００％エタノールとキシレンに移すことによりスライドを再び脱水した。切片を乾燥し、その後、スライドにペルテックス（Ｐｅｒｔｅｘ）を３滴加え、さらなる分析のためにカバーガラスで覆った。
微小血管密度（ＭＶＤ）の定量は、動物当たり４〜５の代表的画像における陽性染色された管腔構造を計数することにより行った。処理群当たり４匹の動物を分析した。
結果：
ｍｉＲ−７で処理した腫瘍組織のＣＤ３１染色は、ｍｉＲ−スクランブル処理腫瘍と比較して、ＭＶＤの著しい低減を示す（図１３）。ＭＶＤの低減は、ｓｉＶＥＧＦＲ２で処理した際に観察されるものと同様である。このことは、ｍｉＲＮＡ−７が、微小脈管形成を阻害し、抗血管新生ｍｉＲＮＡとして作用することを示す。
Figure 2014503553
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Claims (13)

  1. 新血管新生又は新血管新生と関連する疾患若しくは状態を予防、治療、回復、治癒及び／又は遅延するための医薬品として用いるための、ｍｉＲＮＡ−９、ｍｉＲＮＡ−５７４、ｍｉＲＮＡ−７、ｍｉＲＮＡ−１９０ｂ及び／若しくはｍｉＲＮＡ−１４２分子、その模倣物、イソｍｉＲなどの等価物又は供給源、或いは前記ｍｉＲＮＡ−９、ｍｉＲＮＡ−５７４、ｍｉＲＮＡ−７、ｍｉＲＮＡ−１９０ｂ及び／若しくはｍｉＲＮＡ−１４２分子、その等価物又は供給源を含む組成物。
  2. 新血管新生と関連する疾患又は状態が、がんである、請求項１に記載のｍｉＲＮＡ−９、ｍｉＲＮＡ−５７４、ｍｉＲＮＡ−７、ｍｉＲＮＡ−１９０ｂ及び／若しくはｍｉＲＮＡ−１４２分子、その模倣物、イソｍｉＲなどの等価物若しくは供給源、或いは前記ｍｉＲＮＡ−９、ｍｉＲＮＡ−５７４、ｍｉＲＮＡ−７、ｍｉＲＮＡ−１９０ｂ及び／若しくはｍｉＲＮＡ−１４２等価物又はその供給源を含む組成物。
  3. ｍｉＲＮＡ−９＊分子、その等価物若しくは供給源又は前記ｍｉＲＮＡ−９＊、その等価物若しくは供給源を含む組成物である、請求項１又は２に記載のｍｉＲＮＡ−９分子、その等価物若しくは供給源又は前記ｍｉＲＮＡ−９、その等価物若しくは供給源を含む組成物。
  4. ａ）ｍｉＲＮＡ−９、ｍｉＲＮＡ−１９０ｂ、ｍｉＲＮＡ−７、ｍｉＲＮＡ−５７４及び／若しくはｍｉＲＮＡ−１４２分子、並びに／又は模倣物若しくはイソｍｉＲなどの等価物、並びに／又はその供給源、
    ｂ）場合によって、ｍｉＲＮＡ−２６ｂ、ｍｉＲＮＡ−２７ａ、ｍｉＲＮＡ−９２ａ、ｍｉＲＮＡ−２２１、ｍｉＲＮＡ−２２２、ｍｉＲＮＡ−１４５及びｌｅｔ７ａ１分子の少なくとも１つ、並びに／又は模倣物若しくはイソｍｉＲなどの等価物、並びに／又はその供給源、
    ｃ）並びに場合によってｍｉＲＮＡ−１３２、ｍｉＲＮＡ−１２６及びｍｉＲＮＡ−２１の少なくとも１つのアンタゴｍｉｒ並びに／又は等価物並びに／又はその供給源
    から選択される別のｍｉＲＮＡ分子、その模倣物、イソｍｉＲなどの等価物若しくは供給源をさらに含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
  5. 請求項１〜４のいずれか一項に記載のｍｉＲＮＡ、その等価物若しくは供給源又は組成物を、それを必要とする対象に投与することにより、新血管新生又は新血管新生と関連する状態若しくは疾患を予防、治療、回復及び／又は遅延するための方法。
  6. 対象における新血管新生又は新血管新生と関連する疾患若しくは状態を診断するための方法であって、
    （ａ）ｍｉＲＮＡ−９、ｍｉＲＮＡ−５７４、ｍｉＲＮＡ−７、ｍｉＲＮＡ−１９０ｂ及び／若しくはｍｉＲＮＡ−１４２分子、その等価物又は供給源の発現レベルを対象において決定するステップと、場合によって、
    （ｂ）（ａ）で定義する前記分子、その等価物又は供給源の発現レベルを、前記分子、その等価物又は供給源の発現レベルについての参照値と比較するステップであり、参照値が、好ましくは、健常対象における前記分子、その等価物又は供給源の発現レベルの平均値であるステップと
    を含む方法。
  7. ステップ（ａ）において、請求項４に記載の別のｍｉＲＮＡ分子、その等価物又は供給源の発現レベルを決定するステップを含む、請求項６に記載の方法。
  8. 比較が前記ｍｉＲＮＡ−９、ｍｉＲＮＡ−５７４、ｍｉＲＮＡ−７、ｍｉＲＮＡ−１９０ｂ及び／若しくはｍｉＲＮＡ−１４２分子、その等価物又は供給源の発現レベルの減少の発見を導く場合に、新血管新生又は新血管新生と関連する疾患若しくは状態が診断される、請求項７に記載の方法。
  9. 比較が前記ｍｉＲＮＡ−９、ｍｉＲＮＡ−５７４、ｍｉＲＮＡ−７、ｍｉＲＮＡ−１９０ｂ及び／若しくはｍｉＲＮＡ−１４２分子、その等価物又は供給源の発現レベルの減少、並びに請求項４のａ）及び／又はｂ）に記載の別のｍｉＲＮＡ分子、その等価物又は供給源の少なくとも１つの発現レベルの減少、並びに／或いは請求項４のｃ）に記載の別のｍｉＲＮＡ分子、その等価物又は供給源の少なくとも１つの発現レベルの増加の発見を導く場合に、新血管新生又は新血管新生と関連する疾患若しくは状態が診断される、請求項７又は８に記載の方法。
  10. 前記ｍｉＲＮＡの発現レベルが、ヌクレオチド配列の量を定量することにより間接的に決定される、請求項６〜９のいずれか一項に記載の方法。
  11. 発現レベルが、対象から得られた試料においてｅｘ ｖｉｖｏで決定される、請求項６〜１０のいずれか一項に記載の方法。
  12. 対象における新血管新生又は新血管新生と関連する疾患若しくは状態を予防、治療、回復及び／又は遅延できる物質を同定するための方法であって、
    （ａ）ｍｉＲＮＡ−９、ｍｉＲＮＡ−５７４、ｍｉＲＮＡ−７、ｍｉＲＮＡ−１９０ｂ及び／若しくはｍｉＲＮＡ−１４２分子又はその等価物を発現できる試験細胞集団を用意するステップであり、好ましくは、試験集団が、膀胱細胞を含み、より好ましくは、試験細胞集団が、哺乳動物細胞、さらにより好ましくは、ヒト細胞を含むステップと、
    （ｂ）試験細胞集団を、前記物質と接触させるか又はインキュベートするステップと、
    （ｃ）前記ｍｉＲＮＡ−９、ｍｉＲＮＡ−５７４、ｍｉＲＮＡ−７、ｍｉＲＮＡ−１９０ｂ及び／若しくはｍｉＲＮＡ−１４２分子又はその等価物の発現レベル、或いは前記ｍｉＲＮＡ−９、ｍｉＲＮＡ−５７４、ｍｉＲＮＡ−７、ｍｉＲＮＡ−１９０ｂ及び／若しくはｍｉＲＮＡ−１４２分子又はその等価物の活性又は定常状態レベルを、前記物質と接触させたか又はインキュベートした試験細胞集団において決定するステップと、
    （ｄ）（ｃ）で決定した発現、活性又は定常状態レベルを、前記物質と接触させていない試験細胞集団における前記ｍｉＲＮＡ−９、ｍｉＲＮＡ−５７４、ｍｉＲＮＡ−７、ｍｉＲＮＡ−１９０ｂ及び／若しくはｍｉＲＮＡ−１４２分子又は等価物の発現、活性又は定常状態レベルと比較するステップと、
    （ｅ）前記物質と接触させた試験細胞集団と、前記物質と接触させていない試験細胞集団との間で、前記ｍｉＲＮＡ−９、ｍｉＲＮＡ−５７４、ｍｉＲＮＡ−７、ｍｉＲＮＡ−１９０ｂ及び／若しくはｍｉＲＮＡ−１４２分子又は等価物の発現レベル、活性又は定常状態レベルの差を生みだす物質を同定するステップと、
    を含む方法。
  13. 少なくとも１つの別のｍｉＲＮＡ分子、その等価物又は供給源の発現レベル、活性又は定常状態レベルが比較され、好ましくは別のｍｉＲＮＡ分子、その等価物又は供給源が請求項４に記載のものである、請求項１２に記載の方法。
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