CN110951707A - 丙酮酸激酶m2突变体及其在心血管疾病中的应用 - Google Patents

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Abstract

丙酮酸激酶M2突变体及其在心血管疾病中的应用，其核酸序列如SEQ ID NO.2所示。利用特异性的PKM2激动剂，或向心肌细胞内转染修饰位点突变质粒，恢复细胞内PKM2的活性，可有效抑制心肌纤维化及心衰的发生。

Description

丙酮酸激酶M2突变体及其在心血管疾病中的应用
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及丙酮酸激酶M2突变体及其在心血管疾病中的应用。
背景技术
心血管疾病是全球的头号死因，据统计从1990到2010年间，心血管疾病死亡率上升1/3，截至2015年，心血管疾病死亡人数占全球总死亡人数的31％。而心肌纤维化是各类心脏疾病共同的病理基础。心肌纤维化的过程就是心肌成纤维细胞增殖并且向肌成纤维细胞表型转化，其中包括胶原合成的增多及细胞外基质(ECM)中胶原异常沉积的过程，包括平滑肌肌动蛋白(a-SMA)，纤粘蛋白(Fibronectin)升高及I型胶原(Collagen I)分泌增多。光镜下常见广泛性、多灶性纤维化，伴邻近心肌纤维萎缩和肥大，常有部分心肌细胞肌浆空泡化。目前对心肌纤维化的机制并不十分明确，这也导致抗心肌纤维化药物研发进展缓慢。因此，研究心肌纤维化发生的分子机制并找到相应的干预靶点，能够为心肌纤维化的药物开发提供理论依据，对于心肌纤维化的预防和治疗具有重要意义。
目前认为其肾素-血管紧张素-醛固酮系统，血流状态、心血管组织自分泌/旁分泌细胞因子、氧化应激、非编码RNA、遗传等多种因素的共同调控心肌纤维化。近年来，越来越多的证据表明，心肌细胞能量代谢参与多种心脏疾病的发生和发展。丙酮酸激酶(pyruvatekinase，PK)是糖酵解关键酶之一，在细胞能量代谢中居于中心地位。在哺乳动物中已发现四种PK亚型(PKM1,PKM2,PKR,PKL),其分布具有组织特异性。PKL主要分布于肝、肾及大肠组织中，PKR分布在红细胞中，这两种对其底物磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)亲和力较低；PKM1主要在成熟组织中表达，如脑组织、肌肉，对底物PEP高亲和力，且其活性不受磷酸化和变构调节；PKM2则分布较广泛，且其活性受结合模式(二聚体或四聚体)，底物浓度，氨基酸残基修饰及蛋白-蛋白相互作用等多个层面的广泛调控。
发明内容
解决的技术问题：本发明提供一种丙酮酸激酶M2突变体及其在心血管疾病中的应用，通过干预心肌细胞内PKM2第49和第326位半胱氨酸巯基亚硝基修饰，有效抑制心肌纤维化及心衰的发生。该方法包含利用C49/326S-PKM2质粒转染原代乳大鼠和成年小鼠心肌成纤维细胞，抑制PKM2的巯基亚硝基修饰；利用PKM2激动剂恢复原代乳大鼠和成年小鼠心肌成纤维细胞中PKM2的活性。
技术方案：一种丙酮酸激酶M2突变体，其特征在于其核酸序列如SEQ ID NO.2所示。
含有所述核酸的突变质粒。
上述核酸翻译的氨基酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
上述氨基酸序列在制备治疗心肌纤维化药物中的应用。
上述氨基酸序列在制备诊断心肌纤维化试剂盒中的应用。
上述氨基酸序列在制备筛选治疗心肌纤维化药物试剂盒中的应用。
治疗心肌纤维化或心衰的药物，含有上述氨基酸序列。
上述药物，还含有TEPP-46和DASA-58中的至少一种。
有益效果：利用特异性的PKM2激动剂，或向心肌细胞内转染修饰位点突变质粒，恢复细胞内PKM2的活性，可有效抑制心肌纤维化及心衰的发生。
附图说明
图1:利用WT小鼠行假手术和TAC(主动脉缩窄)手术，构建小鼠的心肌纤维化模型。术后4周，收取两组小鼠的心肌组织，利用Western Blot检测两组小鼠心肌组织中PKM2的蛋白表达水平。利用Biotin-Switch法检测两组小鼠心肌组织中PKM2的巯基亚硝基修饰水平*P<0.05。
图2:在原代乳鼠心肌成纤维细胞中，利用DMSO或AngII刺激12h,通过Biotin-Switch法检测两组细胞中PKM2的巯基亚硝基修饰(SNO-PKM2)程度,*P<0.05。
图3:在原代乳鼠心肌成纤维细胞中，利用DMSO或AngII刺激12h,通过吸光度法检测两组细胞中PKM2的活性，*P<0.05。
图4:在原代乳鼠心肌成纤维细胞中，利用DMSO或AngII刺激24h,通过RT-PCR法检测两组细胞中纤维化相关指标a-SMA和Collagen I的表达水平，*P<0.05，**P<0.01。
图5:在原代乳鼠心肌成纤维细胞中，利用DMSO或AngII刺激24h,通过WesternBlot法检测两组细胞中纤维化相关指标a-SMA的表达水平，***P<0.001。
图6:通过转染过表达质粒的方式上调乳大鼠原代心肌成纤维细胞内的野生型PKM2和突变型C49/326S-PKM2的蛋白表达水平，通过Western blot检测PKM2上调情况，通过Biotin-Switch方法检测PKM2的巯基亚硝基修饰情况，**P<0.01。
图7：通过转染过表达质粒的方式上调乳大鼠原代心肌成纤维细胞内的野生型PKM2和C49/326S突变型PKM2的蛋白表达水平后，给以Ang II刺激12小时后，通过RT-PCR检测细胞内纤维化基因a-SMA，ctgh的表达情况，*P<0.05，**P<0.01，**P<0.001。
图8：在原代乳鼠心肌成纤维细胞中预先给予PKM2激动剂TEPP-46，DASA-58或DMSO，之后给予Ang II刺激12h后检测两组细胞中PKM2活性，*P<0.05，**P<0.01。
图9:在原代乳鼠心肌成纤维细胞中预先给予PKM2激动剂TEPP-46，DASA-58或DMSO，之后给予Ang II刺激24h后检测两组细胞中纤维化相关指标a-SMA的表达情况，**P<0.05，##P<0.05，&&P<0.05。
具体实施方式
下面的实施例可使本专业技术人员可全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
实施例1
1.RT-PCR
(1)去除原代乳大鼠细胞培养基，用PBS洗涤细胞3次。
(2)加入1mL Trizol，吹下细胞，吸取至去RNA酶(RNAase Free)的离心管中(细胞样品)，裂解5min。。
(3)每个EP管内加入200μL的氯仿，剧烈振荡，斡旋数秒后，置于冰上裂解10min。
(4)离心，4℃，12000rpm，15min，小心吸取上层清液(500μL)转移至新的EP管中。
(5)加入等体积的异丙醇，上下颠倒混匀，4℃静置10min。
(6)离心，4℃，12000rpm，15min，弃上清，加75％乙醇洗涤。
(7)离心，4℃，12000rpm，5min，弃上清，风干，加入DEPC水(20～50μL)，检测RNA浓度。
(8)RNA的逆转录反应体系程序如下：
Figure BDA0002351729860000031
(9)引物设计：使用Primer Premier 5软件辅助设计引物，所有引物均由金唯智生物科技有限公司合成。
3.质粒转染原代心肌成纤维细胞
(1)提取乳大鼠原代心肌成纤维细胞，细胞种板培养于含10％胎牛血清的DMEM培养液中。
(2)细胞融合至约75％时，弃培养液，用预热的PBS洗涤细胞2次以除去培养基中剩余的血清，然后每孔加入800μL opti-MEM。采用脂质体LipofectAMINETM 3000进行转染。
(3)吸取5μL/孔的lipo3000(使用前轻轻摇匀)加入100μL opti-MEM。轻轻混匀后在室温下孵育5min。吸取2500ng质粒加入100μL opti-MEM稀释，再加入10μL P3000，轻轻混合均匀。将上述所得液体等体积混合，轻轻混匀。将200μL的质粒-转染试剂混合液滴加至每孔中，轻轻摇匀。
(4)将细胞置于标准培养条件下，8小时后更换新鲜正常培养基继续培养。
野生型PKM2基因序列如SEQ ID NO.1所示；
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_001206796.2；
半胱氨酸49和326位点突变型PKM2基因序列如SEQ ID NO.2所示。
4.Western-Blot
(1)SDS-PAGE(聚丙烯酰氨凝胶)电泳：配制12％的分离胶和3％的浓缩胶。取15μL样品液和3μL 6×加样缓冲液，混匀。煮沸5min使蛋白变性后上样，每孔上样量约为30μg。110V恒压电泳约90min，至溴酚蓝完全消失。
SDS-PAGE的配制：
Figure BDA0002351729860000041
Figure BDA0002351729860000051
(2)转膜：电泳完毕后，切去浓缩胶，将胶浸于蛋白转移缓冲液(3.6g/L Tris，300mL/L甲醇，17.3g/L甘氨酸)中平衡10～20min。用湿转的方法将蛋白条带转移至PVDF膜上(SDS-凝胶位于负极，PVDF膜位于正极)，0.3A恒流电泳80min。
(3)封闭：转膜结束后，取下PVDF膜，PBS浸泡5min后将膜浸于含5％脱脂奶粉的PBS(MPBS)中1h。
(4)一抗孵育：封闭结束后将膜置于杂交袋内，加入抗体，4℃摇动下过夜。
(5)二抗结合：PBS-T(PBS中加入Tween-20，浓度为0.05％)快速洗膜一遍后，PBS-T洗膜10min×3遍。加入辣根过氧化物酶标记的兔抗羊第二抗体(1％MPBS 1:2000稀释)，室温下孵育1h。PBS-T快速洗膜一遍，再洗膜10min×3遍。
(6)ECL显色：临用前将ECL显色液A与B混和，均匀滴加至膜表面，避光曝片，观察结果。
5.PKM2活性测定
(1)丙酮酸浓度的标准曲线上样情况见下表，其中丙酮酸标准品的浓度是1nmol/μL。
Figure BDA0002351729860000052
(2)洗贴壁细胞：细胞经过处理后，去除培养基，用预冷的PBS洗3遍，再加100μL PKAssay Buffer刮下，并转移至1.5ml EP管内；
(3)12000rpm，4℃离心10min后，取上清，BCA法测蛋白浓度；
(4)定量后按每孔1ug蛋白所需体积加入96孔板中，再用PK Assay Buffer补体积至每孔50μL。
(5)反应液的配制
Figure BDA0002351729860000053
(6)各孔加入现配现用的反应液50μL,T1时放入酶标仪570nm波长处读取吸光度值A1，绘制标准曲线，25℃避光孵育10-20分钟后T2时再次读取吸光度值A2，吸光度值的上升是由于PKM2催化生成的丙酮酸含量的增加，ΔA＝A2–A1。根据标准曲线换算出PKM2催化生成的丙酮酸含量，记为B。
Figure BDA0002351729860000061
V是加入反应液中的样本体积
6.Biotin-Switch法检测巯基亚硝基化修饰蛋白(Cayman Chemical公司S-nitrosylation Protein Detection Kit，货号10006518)
(1)洗贴壁细胞：细胞经过处理后，去除培养基，用预冷的wash buffer洗3遍，再加500μL wash buffer刮下，并转移至1.5mL离心管里。
(2)500rpm，4℃离心，5min，弃上清。
(3)细胞置于冰上，配制blocking buffer，具体配制方法如下：
100μL DMF和900μL buffer A加入新的blocking reagent配成blocking buffer原液，混匀后，将这1mL液体加入9ml buffer A中，即为最终blocking buffer。
(4)每管加入500μL blocking buffer重悬上述离心所得细胞沉淀，4℃旋转30min。
(5)12,000rpm，4℃离心，10min后，取上清，转移至15mL离心管中。
(6)加入4倍体积-20℃预冷的丙酮，轻轻翻转，颠倒混匀，-20℃静置1h以充分沉淀蛋白。
(7)配制reducing&labeling buffer，具体配制方法如下：
1mL buffer B加入新的reducing reagent瓶中配成新的reducing buffer原液，100μL DMF和900μL buffer B加入新的labeling reagent中配成新的labeling buffer原液，根据所需要的量，将reducing buffer原液、labeling buffer原液和buffer B按照1:1:8的比例配制成最终reducing&labeling buffer。
(8)将上述-20℃沉淀的蛋白取出3000rpm，4℃离心，10min，弃丙酮，加入500μL上述reducing&labeling buffer，枪轻吹散，室温静置1h。
(9)加入4倍体积-20℃预冷的丙酮，轻轻翻转，混匀颠倒，-20℃静置1h。
(10)3000rpm，4℃离心，10min，弃丙酮。
(11)500μL wash buffer溶蛋白沉淀，测蛋白浓度。
(12)根据所测蛋白浓度留取大于50μg蛋白做input，另取500μg蛋白，加入biotin亲和素珠子，4℃旋转过夜。
(上述步骤均为避光操作)
(13)洗珠子4℃旋转5min，0.5rpm，4℃离心，5min，去上清，加入新鲜IP洗液4℃旋转5min，重复以上操作5遍，最后一遍吸干上清加入与珠子等体积的2×loading buffer，震荡离心，煮蛋白100℃，5min。
(14)western blot检测GNAI2巯基亚硝基化修饰水平(Anti-GNAI2抗体：Abcam公司，货号ab102032、Anti-GAPDH抗体：巴傲德公司，货号AP0063、Anti-β-actin抗体：嘉暄生物公司，货号JX2001)。
实验结果：
1.为了探索PKM2蛋白及其巯基亚硝基修饰是否参与心肌纤维化和心衰，利用WT小鼠行假手术以及TAC手术，分别提取了两组小鼠术后4周的心肌组织的总蛋白。通过westernblot以及Biotin-Switch技术检测了两组小鼠心肌组织中的PKM2的蛋白表达及巯基亚硝基修饰情况。发现与对照组相比，TAC手术组小鼠心肌组织中的PKM2的蛋白表达水平没有明显变化，但PKM2的巯基亚硝基修饰水平显著升高(图1)。以上实验结果提示：PKM2的巯基亚硝基修饰参与心肌纤维化和心衰。
2.为了探索PKM2巯基亚硝基修饰对PKM2活性的影响，利用Ang II刺激原代乳鼠心肌成纤维细胞12h，之后检测PKM2的巯基亚硝基修饰及活性，发现PKM2的巯基亚硝基修饰水平显著升高，而其活性明显降低(图2，3)。以上结果提示：PKM2的巯基亚硝基修饰抑制其活性。
3.为了研究PKM2活性是否参与成纤维细胞活化，利用Ang II刺激原代乳鼠心肌成纤维细胞24h，诱导心肌纤维化模型，之后检测a-SMA及Collagen I的mRNA水平，并检测a-SMA的蛋白表达水平(图4，5)
4.为了进一步验证PKM2的49位点和326位点巯基亚硝基修饰促进心肌纤维化中作用，我们利用转染野生型和位点突变型质粒方式过表达乳大鼠原代心肌细胞中的WT-PKM2和C49S-PKM2，C326S-PKM2以及C49/326S-PKM2表达水平以后，巯基亚硝基修饰水平降低，且双位点突变降低最为明显(图6)，利用Ang II诱导心肌纤维化模型，通过RT-PCR检测了细胞内纤维化相关基因a-SMA和ctgh的表达水平。结果显示：与对照组相比，在同时突变了PKM2半胱氨酸49和326位点以后，细胞内纤维化相关基因a-SMA和ctgh的表达水平明显降低(图7)。以上实验结果证明：PKM2的巯基亚硝基修饰参与促进心肌纤维化的发生。
5.为了验证PKM2激动剂是否能够缓解心肌纤维化的发生，利用PKM2激动剂TEPP-46或DASA-58预先处理原代乳鼠心肌成纤维细胞，之后给予Ang II刺激，诱导心肌纤维化模型，检测细胞内PKM2的活性以及纤维化相关指标。结果显示，相比于对照组，TEPP-46预处理的细胞中PKM2的活性水平显著升高(图8)，细胞内纤维化相关基因a-SMA的表达水平显著降低(图9)。
以上的实验结果充分证明，心肌成纤维细胞中PKM2蛋白表达水平的升高，能够促进心肌纤维化和心衰的进程。降低PKM2表达水平的siRNA能够缓解心肌纤维化的发生。此外，PKM2的49和326位点巯基亚硝基修饰能够降低PKM2活性，促进纤维化的发生。利用过表达位点突变质粒抑制PKM2的巯基亚硝基修饰，或通过PKM2激动剂提高PKM2活性，能够有效提高心肌成纤维细胞中PKM2的活性，抑制心肌心肌纤维化和心衰的发生。因此，我们认为PKM2和其巯基亚硝基修饰可以作为临床上治疗纤维化和心衰的一个新的重要靶标，在心肌纤维化和心衰的防治中具有潜在的临床应用价值。
上述实例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人是能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所做的等效变换或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 南京医科大学
<120> 丙酮酸激酶M2突变体及其在心血管疾病中的应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1623
<212> DNA
<213> 野生型PKM2基因(Pyruvate kinase M2)
<400> 1
atgtcgaagc cccatagtga agccgggact gccttcattc agacccagca gctgcacgca 60
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acagcccgga acactggcat catctgtacc attggcccag cttcccgatc agtggagacg 180
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<400> 2
atgtcgaagc cccatagtga agccgggact gccttcattc agacccagca gctgcacgca 60
gccatggctg acacattcct ggagcacatg tgccgcctgg acattgattc accacccatc 120
acagcccgga acactggcat catcagcacc attggcccag cttcccgatc agtggagacg 180
ttgaaggaga tgattaagtc tggaatgaat gtggctcgtc tgaacttctc tcatggaact 240
catgagtacc atgcggagac catcaagaat gtgcgcacag ccacggaaag ctttgcttct 300
gaccccatcc tctaccggcc cgttgctgtg gctctagaca ctaaaggacc tgagatccga 360
actgggctca tcaagggcag cggcactgca gaggtggagc tgaagaaggg agccactctc 420
aaaatcacgc tggataacgc ctacatggaa aagtgtgacg agaacatcct gtggctggac 480
tacaagaaca tctgcaaggt ggtggaagtg ggcagcaaga tctacgtgga tgatgggctt 540
atttctctcc aggtgaagca gaaaggtgcc gacttcctgg tgacggaggt ggaaaatggt 600
ggctccttgg gcagcaagaa gggtgtgaac cttcctgggg ctgctgtgga cttgcctgct 660
gtgtcggaga aggacatcca ggatctgaag tttggggtcg agcaggatgt tgatatggtg 720
tttgcgtcat tcatccgcaa ggcatctgat gtccatgaag ttaggaaggt cctgggagag 780
aagggaaaga acatcaagat tatcagcaaa atcgagaatc atgagggggt tcggaggttt 840
gatgaaatcc tggaggccag tgatgggatc atggtggctc gtggtgatct aggcattgag 900
attcctgcag agaaggtctt ccttgctcag aagatgatga ttggacggtg caaccgagct 960
gggaagcctg tcatcagcgc tactcagatg ctggagagca tgatcaagaa gccccgcccc 1020
actcgggctg aaggcagtga tgtggccaat gcagtcctgg atggagccga ctgcatcatg 1080
ctgtctggag aaacagccaa aggggactat cctctggagg ctgtgcgcat gcagcacctg 1140
attgcccgtg aggcagaggc tgccatctac cacttgcaat tatttgagga actccgccgc 1200
ctggcgccca ttaccagcga ccccacagaa gccaccgccg tgggtgccgt ggaggcctcc 1260
ttcaagtgct gcagtggggc cataatcgtc ctcaccaagt ctggcaggtc tgctcaccag 1320
gtggccagat accgcccacg tgcccccatc attgctgtga cccggaatcc ccagacagct 1380
cgtcaggccc acctgtaccg tggcatcttc cctgtgctgt gcaaggaccc agtccaggag 1440
gcctgggctg aggacgtgga cctccgggtg aactttgcca tgaatgttgg caaggcccga 1500
ggcttcttca agaagggaga tgtggtcatt gtgctgaccg gatggcgccc tggctccggc 1560
ttcaccaaca ccatgcgtgt tgttcctgtg ccgtacccat acgacgtccc agactacgct 1620
tga 1623
<210> 3
<211> 540
<212> PRT
<213> 丙酮酸激酶M2突变体(Pyruvate kinase M2)
<400> 3
Met Ser Lys Pro His Ser Glu Ala Gly Thr Ala Phe Ile Gln Thr Gln
1 5 10 15
Gln Leu His Ala Ala Met Ala Asp Thr Phe Leu Glu His Met Cys Arg
20 25 30
Leu Asp Ile Asp Ser Pro Pro Ile Thr Ala Arg Asn Thr Gly Ile Ile
35 40 45
Ser Thr Ile Gly Pro Ala Ser Arg Ser Val Glu Thr Leu Lys Glu Met
50 55 60
Ile Lys Ser Gly Met Asn Val Ala Arg Leu Asn Phe Ser His Gly Thr
65 70 75 80
His Glu Tyr His Ala Glu Thr Ile Lys Asn Val Arg Thr Ala Thr Glu
85 90 95
Ser Phe Ala Ser Asp Pro Ile Leu Tyr Arg Pro Val Ala Val Ala Leu
100 105 110
Asp Thr Lys Gly Pro Glu Ile Arg Thr Gly Leu Ile Lys Gly Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Glu Val Glu Leu Lys Lys Gly Ala Thr Leu Lys Ile Thr Leu
130 135 140
Asp Asn Ala Tyr Met Glu Lys Cys Asp Glu Asn Ile Leu Trp Leu Asp
145 150 155 160
Tyr Lys Asn Ile Cys Lys Val Val Glu Val Gly Ser Lys Ile Tyr Val
165 170 175
Asp Asp Gly Leu Ile Ser Leu Gln Val Lys Gln Lys Gly Ala Asp Phe
180 185 190
Leu Val Thr Glu Val Glu Asn Gly Gly Ser Leu Gly Ser Lys Lys Gly
195 200 205
Val Asn Leu Pro Gly Ala Ala Val Asp Leu Pro Ala Val Ser Glu Lys
210 215 220
Asp Ile Gln Asp Leu Lys Phe Gly Val Glu Gln Asp Val Asp Met Val
225 230 235 240
Phe Ala Ser Phe Ile Arg Lys Ala Ser Asp Val His Glu Val Arg Lys
245 250 255
Val Leu Gly Glu Lys Gly Lys Asn Ile Lys Ile Ile Ser Lys Ile Glu
260 265 270
Asn His Glu Gly Val Arg Arg Phe Asp Glu Ile Leu Glu Ala Ser Asp
275 280 285
Gly Ile Met Val Ala Arg Gly Asp Leu Gly Ile Glu Ile Pro Ala Glu
290 295 300
Lys Val Phe Leu Ala Gln Lys Met Met Ile Gly Arg Cys Asn Arg Ala
305 310 315 320
Gly Lys Pro Val Ile Ser Ala Thr Gln Met Leu Glu Ser Met Ile Lys
325 330 335
Lys Pro Arg Pro Thr Arg Ala Glu Gly Ser Asp Val Ala Asn Ala Val
340 345 350
Leu Asp Gly Ala Asp Cys Ile Met Leu Ser Gly Glu Thr Ala Lys Gly
355 360 365
Asp Tyr Pro Leu Glu Ala Val Arg Met Gln His Leu Ile Ala Arg Glu
370 375 380
Ala Glu Ala Ala Ile Tyr His Leu Gln Leu Phe Glu Glu Leu Arg Arg
385 390 395 400
Leu Ala Pro Ile Thr Ser Asp Pro Thr Glu Ala Thr Ala Val Gly Ala
405 410 415
Val Glu Ala Ser Phe Lys Cys Cys Ser Gly Ala Ile Ile Val Leu Thr
420 425 430
Lys Ser Gly Arg Ser Ala His Gln Val Ala Arg Tyr Arg Pro Arg Ala
435 440 445
Pro Ile Ile Ala Val Thr Arg Asn Pro Gln Thr Ala Arg Gln Ala His
450 455 460
Leu Tyr Arg Gly Ile Phe Pro Val Leu Cys Lys Asp Pro Val Gln Glu
465 470 475 480
Ala Trp Ala Glu Asp Val Asp Leu Arg Val Asn Phe Ala Met Asn Val
485 490 495
Gly Lys Ala Arg Gly Phe Phe Lys Lys Gly Asp Val Val Ile Val Leu
500 505 510
Thr Gly Trp Arg Pro Gly Ser Gly Phe Thr Asn Thr Met Arg Val Val
515 520 525
Pro Val Pro Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala
530 535 540

Claims (8)

1.一种丙酮酸激酶M2突变体，其特征在于其核酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.含有权利要求1所述核酸的突变质粒。
3.权利要求1所述核酸翻译的氨基酸，其特征在于其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
4.权利要求3所示的氨基酸序列在制备治疗心肌纤维化药物中的应用。
5.权利要求3所示的氨基酸序列在制备诊断心肌纤维化试剂盒中的应用。
6.权利要求3所示的氨基酸序列在制备筛选治疗心肌纤维化药物试剂盒中的应用。
7.治疗心肌纤维化或心衰的药物，其特征在于含有权利要求3所述的氨基酸序列。
8.根据权利要求7所述的药物，其特征在于还含有TEPP-46和DASA-58中的至少一种。
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