CN110865195A - Camsap1蛋白及其基因作为癫痫药物靶点的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了CAMSAP1蛋白及其基因作为癫痫药物靶点的用途。选定CAMSAP1的第13个外显子作为靶标位点,通过同源重组的方法对野生型小鼠进行敲除,得到敲除鼠。实验证明,与野生型小鼠相比,敲除鼠的个头偏小、体重偏轻、死亡率提高;敲除CAMSAP1蛋白改变神经元的极性;敲降CAMSAP1蛋白会影响神经元由多极细胞向双极细胞的转变、导致神经元沿放射状胶质细胞的迁移出现异常(即影响神经元的迁移),还使神经元在大脑皮层的分层排布出现异常,敲除CAMSAP1蛋白还会出现癫痫病症。因此,CAMSAP1蛋白可以维持神经元正常生长,预防和/治疗癫痫。本发明具有重要的应用价值。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,具体涉及CAMSAP1蛋白及其基因作为癫痫药物靶点的用途。
背景技术
微管作为一种细胞骨架,参与了诸多的生命活动如细胞分裂、细胞极性建立、细胞迁移以及胞内运输等等。在结构上,微管由带有负电的α-微管蛋白和β-微管蛋白首尾相连形成的异源二聚体纵向组装成线性的原纤丝,再由10-15根原纤丝通过侧壁联系排列形成直径为24nm的中空管状结构。微管是一个具有高度动态的结构,其两端一直处于聚合与解聚的动态过程中,其中,拥有β-微管蛋白并且组装速度更快的一端称为正端,而拥有α-微管蛋白且组装速度相对较慢的一端则称为负端,因此微管天然就是一个具有极性的细胞骨架。微管形成中一个重要的过程是成核,通常大多数细胞在间期都是以中心体为成核中心并将负端锚定在中心体,而正端则以辐射状延伸到细胞的边缘,这一类微管被称之为中心体微管。与此同时,在一些终末分化细胞如肌细胞、神经元细胞、上皮细胞以及植物细胞中,还存在一类微管负端并未锚定于中心体的微管,即非中心体微管。虽然非中心体微管的负端没有中心体来锚定并稳定其结构,但是却存在着微管负端结合蛋白如CAMSAP/Nezha来稳定并调控微管的动态。虽然非中心体微管在细胞活动中具有许多重要的功能,但是目前对于非中心体微管形成机制、动态功能等研究的并不是很清楚。因此,以非中心体微管负端结合蛋白功能研究为切入点研究非中心体微管功能已成为目前研究非中心体微管功能的一种重要方法。
细胞内不对称的蛋白或其它分子的分布形成了细胞极性以参与调控众多的生物过程,包括上皮细胞的形态,细胞迁移以及细胞的趋化性等等。神经元作为一种重要的极性细胞会形成两种完全不同类型的突起:轴突和树突,通常一个神经元会形成一个轴突和多个树突。轴突是一个细长的有着均一直径的突起,其上面的分支多为直角。轴突中包含有突触小泡,当胞体在给出电信号之后,突触小泡会释放出神经递质,传递信号到其他的神经元。与轴突不同,树突则是相对粗短呈锥形的突起,其上分支多为Y-状,树突(尤其是树突棘)上的受体负责收集从其他细胞传递过来的神经递质等完成信号传导,因此,神经元同时具有着形态和功能上的极性。
在关于神经元极性的研究中,体外培养的大鼠海马神经元通常作为重要研究体系。早在1988年Dotti等人通过研究体外培养的海马神经元发现,体外培养的神经元的极性建立分为五个步骤。在神经元极性建立的五个步骤中,第二阶段向第三阶段的转变-即突起转变为轴突或者是树突是最为重要的过程,这个过程决定了神经元突起的将来命运,通过对神经元所有突起的诞生时间以及命运的分析证实最先出现的两个突起更有可能成为将来的轴突。
相较于体外培养的神经元,体内神经元的极化通常可以分为“极性继承”模式和“极性建立”模式。“极性继承”模式最好的例子则是脊椎动物视网膜神经节细胞,这类细胞由神经上皮细胞产生,并继承极性神经上皮细胞的顶端—底端极性,即顶端突起直接发育成为树突,底端突起直接发育成轴突。对于大脑皮层的锥体神经元而言,其发生经历了由脑室区的神经干细胞产生亚脑室区中间前体细胞,再由中间前体细胞分化产生神经元的过程。由于前体细胞会形成具有多个突起的多极细胞,伴随着突起动态的延伸或回缩,多极细胞可以向多个方向随机移动。多极细胞在短暂的存在之后会伴随着形态变化转变为双极形态,一个突起沿切线方向延伸形成尾随突起并最终形成神经元的轴突,而另一个朝向软膜表层的突起则会形成一个前导突起,并最终形成神经元的树突,此过程即为“极性建立”模式。在“极性建立”模式中,由多极向双极的转变是最为关键的步骤,多极细胞不能转变为双极细胞则会影响神经元极性的建立。
在神经元的极化过程中,胞外信号分子通过与膜上受体结合,激活胞内蛋白从而建立起神经元极化的信号通路。对胞外信号分子进行分类,可以将神经元极化的信号通路大致分为如下几类:第一类是神经营养因子所参与的信号通路;第二类是TGF-β超家族所参与的信号通路;第三类则是细胞粘附因子所参与的信号通路。
CAMSAP家族是一个新型的微管负端结合蛋白家族,在哺乳类中有CAMSAP1、CAMSAP2/CAMSAP1-L1/KIAA1078和CAMSAP3/Nezha/KIAA1543三个家族成员。CAMSAP3/Nezha和CAMSAP2都位于非中心体微管的负端,并且都具有稳定非中心体微管的功能。除了稳定微管的功能,CAMSAP2和CAMSAP3参与了上皮细胞微管的极性排列、非中心体微管在中心体上的释放、微管微丝的协同运动、高尔基体的正确组装以及细胞内的囊泡运输等功能。相较于CAMSAP2和CAMSAP3稳定非中心体微管负端的功能,CAMSAP1虽然可以定位于非中心体微管的负端,但是其抵抗MCAK对微管的解聚的能力较弱,同时CAMSAP1也不能很好的稳定微管负端抑制负端的聚合和解聚,CAMSAP1在功能上与CAMSAP2和CAMSAP3存在着较大的差异。
发明内容
本发明的目的是如何维持神经元的正常生长。
本发明首先保护将CAMSAP1蛋白作为药物靶点的物质在制备产品中的应用;所述产品的功能可为如下C1)至C9)中的至少一种:C1)增加体重;C2)降低死亡率;C3)延长寿命;C4)建立神经元极性;C5)促进多极神经元向双极神经元的转变;C6)增加神经元沿放射状胶质细胞的迁移;C7)维持皮层神经元的排布;C8)预防癫痫;C9)治疗癫痫。
上述应用中,所述药物可为癫痫药物。
本发明还保护CAMSAP1蛋白在制备产品中的应用;所述产品的功能可为如下C1)至C9)中的至少一种:C1)增加体重;C2)降低死亡率;C3)延长寿命;C4)建立神经元极性;C5)促进多极神经元向双极神经元的转变;C6)增加神经元沿放射状胶质细胞的迁移;C7)维持皮层神经元的排布;C8)预防癫痫;C9)治疗癫痫。
本发明还保护CAMSAP1蛋白的应用,可为如下C1)至C9)中的至少一种:C1)增加体重;C2)降低死亡率;C3)延长寿命;C4)建立神经元极性;C5)促进多极神经元向双极神经元的转变;C6)增加神经元沿放射状胶质细胞的迁移;C7)维持皮层神经元的排布;C8)预防癫痫;C9)治疗癫痫。
本发明还保护抑制CAMSAP1蛋白活性和/或表达量的物质在制备产品中的应用;所述产品的功能可为如下A1)至A7)中的至少一种:A1)减轻体重;A2)提高死亡率;A3)缩短寿命;A4)改变神经元极性;A5)抑制多极神经元向双极神经元的转变;A6)减缓神经元沿放射状胶质细胞的迁移;A7)扰乱皮层神经元的排布。
本发明还保护抑制CAMSAP1蛋白活性和/或表达量的物质的应用,可为如下A1)至A7)中的至少一种:A1)减轻体重;A2)提高死亡率;A3)缩短寿命;A4)改变神经元极性;A5)抑制多极神经元向双极神经元的转变;A6)减缓神经元沿放射状胶质细胞的迁移;A7)扰乱皮层神经元的排布。
上述任一所述的应用中,所述产品可为药物。
上述任一所述“抑制CAMSAP1蛋白活性和/或表达量的物质”可为z1)或z2):
z1)以寡聚核酸siRNA3为靶点,由shRNA表达系统合成的shRNA3;寡聚核酸siRNA3的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示;
z2)以寡聚核酸siRNA1为靶点,由shRNA表达系统合成的shRNA1;寡聚核酸siRNA1的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
本发明还保护产品甲,所述产品甲可含有CAMSAP1蛋白或促进CAMSAP1蛋白活性和/或表达量的物质;所述产品甲的功能可为如下C1)至C9)中的至少一种:C1)增加体重;C2)降低死亡率;C3)延长寿命;C4)建立神经元极性;C5)促进多极神经元向双极神经元的转变;C6)增加神经元沿放射状胶质细胞的迁移;C7)维持皮层神经元的排布;C8)预防癫痫;C9)治疗癫痫。
本发明还保护产品乙,所述产品乙可含有抑制CAMSAP1蛋白活性和/或表达量的物质;所述产品乙的功能为如下A1)至A7)中的至少一种:A1)减轻体重;A2)提高死亡率;A3)缩短寿命;A4)改变神经元极性;A5)抑制多极神经元向双极神经元的转变;A6)减缓神经元沿放射状胶质细胞的迁移;A7)扰乱皮层神经元的排布。
所述产品乙中,“抑制CAMSAP1蛋白活性和/或表达量的物质”可为z1)或z2):
z1)以寡聚核酸siRNA3为靶点,由shRNA表达系统合成的shRNA3;寡聚核酸siRNA3的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示;
z2)以寡聚核酸siRNA1为靶点,由shRNA表达系统合成的shRNA1;寡聚核酸siRNA1的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
所述产品甲或产品乙可为药物。
上述任一所述抑制CAMSAP1蛋白活性和/或表达量的物质也属于本发明的保护范围。
本发明还保护CAMSAP1蛋白在开发或筛选试剂中的应用;所述试剂的用途可为如下C1)至C9)中的至少一种:C1)增加体重;C2)降低死亡率;C3)延长寿命;C4)建立神经元极性;C5)促进多极神经元向双极神经元的转变;C6)增加神经元沿放射状胶质细胞的迁移;C7)维持皮层神经元的排布;C8)预防癫痫;C9)治疗癫痫。
所述z1)具体可为实施例提及的重组质粒CAMSAP1 shRNA 3。重组质粒CAMSAP1shRNA 3可为将载体pLentiLox 3.7m的限制性内切酶HpaI和XhoI之间的DNA小片段替换为SEQ ID NO:1所示的DNA分子,得到的重组质粒。
所述z2)具体可为实施例提及的重组质粒CAMSAP1 shRNA 1。重组质粒CAMSAP1shRNA 1可为将载体pLentiLox 3.7m的限制性内切酶HpaI和XhoI之间的DNA小片段替换为SEQ ID NO:2所示的DNA分子,得到的重组质粒。
选定CAMSAP1的第13个外显子作为靶标位点,通过同源重组的方法对C57BL/6J小鼠进行敲除,得到CAMSAP1敲除鼠。将C57BL/6J小鼠和CAMSAP1敲除鼠进行杂交,经过筛选,获得杂合小鼠。实验证明,与杂合小鼠或C57BL/6J小鼠相比,CAMSAP1敲除鼠的个头偏小、体重偏轻,这种差异在出生2周之后尤为明显;出生2天后,与杂合小鼠或C57BL/6J小鼠相比,CAMSAP1敲除鼠的死亡率高出50%;敲除CAMSAP1蛋白改变神经元的极性,但建立极性之后,CAMSAP1蛋白不参与神经元极性的维持;敲降CAMSAP1蛋白会影响神经元由多极细胞向双极细胞的转变、导致神经元沿放射状胶质细胞的迁移出现异常(即影响神经元的迁移),还会使神经元在大脑皮层的分层排布出现异常,敲除CAMSAP1蛋白还会出现癫痫病症。因此,CAMSAP1蛋白可以维持神经元正常生长,预防和/治疗癫痫。本发明具有重要的应用价值。
附图说明
图1为CAMSAP1敲除鼠的构建和检测。其中,A为构建CAMSAP1敲除鼠的策略,B为Southern杂交检测CAMSAP1敲除鼠中CAMSAP1DNA完整性,C为PCR鉴定CAMSAP1敲除鼠的基因型,D为Western Blot检测CAMSAPs的蛋白表达水平。
图2为CAMSAP1敲除鼠体重减轻。
图3为CAMSAP1敲除鼠有更高死亡率。
图4为CAMSAPs在小鼠大脑皮层、海马以及培养的海马神经元中表达水平的变化。
图5为CAMSAP1抗体的制备及特异性检测。
图6为CAMSAP家族蛋白在大脑皮层中的分布模式。A-C为CAMSAP1在E15.5、E17.5和P0小鼠大脑皮层中的分布模式图,其中A中的箭头指示CAMSAP1存在于胞质中而非细胞核中。(D-G)为CAMSAP2(D图和E图)和CAMSAP3(F图和G图)在P0小鼠大脑皮层分布图。A、D-G的比例尺50μm,B和C的比例尺100μm。
图7为CAMSAP1在海马神经元中的分布模式。其中,A为CAMSAP1在第一、二、三阶段的神经元中免疫荧光染色结果;B为CAMSAP1的分布在第二阶段神经元的突起末端和第三阶段神经元轴突末端有积累的神经元百分比的统计分析结果,图中数值为平均值±标准误(Stage II,n=183;Stage III,n=161);C为CAMSAPs在第三阶段神经元中的偏好指数,图中数值为平均值±标准误(CAMSAP1,n=40;CAMSAP2,n=29;CAMSAP3,n=36);D为CAMSAP1在第三阶段神经元中免疫荧光染色结果,Tau-1标记轴突而Map2标记树突;E为CAMSAP1在一个第三阶段神经元轴突和树突中的免疫荧光强度;F为外源CAMSAP1在第三阶段CAMSAP1敲除神经元中分布图。
图8为CAMSAP2和CAMSAP3在海马神经元中的分布模式。其中,A和C分别为CAMSAP2和CAMSAP3在第三阶段神经元中的免疫荧光染色结果,B和D分别为CAMSAP2和CAMSAP3在一个第三阶段神经元轴突和树突中的免疫荧光强度。
图9为CAMSAP1参与调控体外培养海马神经元极性建立。其中A为培养第3天的WT和KO的海马神经元代表图,轴突是Tau-1阳性而树突是Map2阳性;B为单个轴突、多个轴突和没有轴突的神经元的百分比;C-F为量化神经元轴突/树突长度和数目,图中数值为平均值±标准误(WT,n=337;KO,n=449);G为转染不同质粒的海马神经元培养至第3天的代表图;H为转染不同质粒之后单个轴突、多个轴突和没有轴突的神经元的百分比,图中数值为平均值±标准误(WT+GFP,n=168;KO+GFP,n=317;KO+CAMSAP1-GFP,n=155;KO+CAMSAP2-GFP,n=202;KO+CAMSAP3-GFP,n=117);比例尺为20μm。
图10为CAMSAP1 shRNA可有效敲降CAMSAP1的表达。其中A为CAMSAP1示意图以及shRNA的靶标位置,对shRNA敲降具有抵抗能力的CAMSAP1R与shRNA3有错配,但是仍能编码正常的CAMSAP1蛋白;B为免疫印迹分析外源CAMSAP1在HEK293细胞中与对照shRNA或CAMSAP1 shRNA共转之后的的表达量;C为免疫印迹分析外源CAMSAPs在HEK293细胞中与对照shRNA或CAMSAP1shRNA 3共转之后的的表达量;D为培养的神经元在第3天转染shRNA第6天免疫染色,结果表明CAMSAP1的shRNA同源可以有效的敲降内源CAMSAP1。mCherry是由shRNA敲降质粒表达,箭状记号标记的是转染了对照shRNA的神经元中的CAMSAP1而箭头标记的是未转染shRNA的神经元中的CAMSAP1。比例尺为30μm。
图11为CAMSAP1不参与海马神经元极性的维持。其中,A为培养的神经元在第3天转染shRNA第6天进行染色,mCherry是由shRNA敲降质粒表达,箭头标示转染了shRNA的神经元;B为单个轴突神经元和多个轴突神经元的百分比,图中数值为平均值±标准误(control,n=168;shRNA,n=195)。比例尺为20μm。
图12为CAMSAP1的缺失改变神经元的极化。A中左为E17.5天的ICR小鼠胚胎大脑皮层冠状切片染色代表图、神经元被GFP和mCherry染色标记、中为左侧图片的反相图片,右为插图展示皮层神经元的各种形态,MMZ为多极迁移区,RMZ为放射状迁移区;B为GFP阳性mCherry阳性神经元在皮层不同区域的分布,图中数值为平均值±标准误(control,n=11;shRNA,n=10);C为将神经元的形态分成4类;D为不同形态神经元在IZ和CP区的百分比,图中数值为平均值±标准误(control,n=11;shRNA,n=10);E中左为E17.5天胚胎大脑皮层冠状切片染色代表图、神经元被GFP染色标记,右为左侧图片的反相图片;F为不同形态神经元在IZ区的百分比,图中数值为平均值±标准误(WT,n=13;KO,n12);G为高尔基体在MMZ和RMZ边界区域的分布代表图,高尔基体通过GM130进行标记;H中左为MMZ上侧区域电转神经元高尔基体面朝CP层的百分比,右为图片展示一个高尔基体面朝CP层的神经元,图中数值为平均值±标准误(control,n=11;shRNA,n=14)。A图和E图比例尺为50μm,G图比例尺为25μm。
图13为CAMSAP1参与调控皮层神经元的放射状迁移。其中A为E18.5天的ICR小鼠胚胎大脑皮层冠状切片染色代表图,神经元被GFP和mCherry染色标记。左侧面板显示的是对右侧图中方框放大后的单个颜色通道或合并之后的图片。箭头标识的神经元表明迁移到CP层的神经元的CAMSAP1表达量较低。B为GFP阳性mCherry阳性神经元在在皮层不同区域的分布,图中数值为平均值±标准误(control+GFP,n=18;shRNA+GFP,n=22;shRNA+CAMSAP1R-GFP 0.3μg,n=17;0.6μg,n=17;0.9μg,n=19;1.2μg,n=20)。C为E18.5天胚胎大脑皮层冠状切片染色代表图,神经元被GFP染色标记。左侧面板显示的是对右侧图中方框放大之后的图片,箭头标识为神经元。D为GFP阳性神经元在在皮层不同区域的分布,图中数值为平均值±标准误(WT,n=19;KO,n=18)。E为E18.5天胚胎大脑皮层冠状切片染色代表图,神经元被Map2和BrdU抗体染色标记。F为BrdU阳性细胞在大脑皮层不同区域的分布,图中数值为平均值±标准误(WT,n=13;KO,n=12)。A的比例尺为100μm。C和G的比例尺50μm。
图14为CAMSAP1对神经元的增殖分化和凋亡是非必需的。A中,左图为E15.5天小鼠大脑皮层切片代表图,Nestin抗体染色标记放射状胶质细胞而P-H3抗体染色标记增殖中的细胞;右图为在VZ区边界和VZ/SVZ的P-H3阳性细胞的密度,图中数值为平均值±标准误(WT,n=19;KO,n=18)。B中,左图为E14.5天小鼠大脑皮层切片代表图,在BrdU标记2h后通过Pax6抗体染色标记前体细胞而BrdU染色标记增殖中的细胞;右图为Pax6阳性BrdU阳性细胞的百分比,图中数值为平均值±标准误(WT,n=14;KO,n=11)。C中,左图为E15.5天小鼠大脑皮层切片代表图,在BrdU标记1天后通过Ki67抗体染色标记增殖中的细胞;右图为细胞走出细胞周期的指数(Ki67阳性BrdU阴性细胞/BrdU阳性细胞),图中数值为平均值±标准误(WT,n=14;KO,n=15)。D中,左图为E18.5天小鼠大脑皮层切片代表图,在BrdU标记1天后通过Tbr1抗体染色标记第六层和SP层的细胞;右图为Tbr1阳性BrdU阳性的细胞,图中数值为平均值±标准误(WT,n=15;KO,n=12)。E中,左图为P0天小鼠大脑皮层切片代表图,凋亡的细胞通过Act-Caspase3抗体染色标记;右图为皮层中Act-Caspase3阳性细胞的密度,图中数值为平均值±标准误(WT,n=10;KO,n=12)。A、B、C和D的比例尺为50μm,E的比例尺为100μm。
图15为CAMSAP1的缺失导致大脑皮层的片层结构异常,比例尺为50μm。A为P0小鼠大脑切片代表图,DAPI染色标记细胞核,Map2染色标记神经元树突。B为定量皮层不同脑区的荧光信号强度,图中数值为平均值±标准误(n=15)。C为Tbr1阳性细胞在大脑皮层不同区域的分布代表图。D为Tbr1阳性细胞在大脑皮层分布的示意图。E为Cux1阳性细胞在大脑皮层分布代表图。F为Cux1阳性细胞在大脑皮层分布百分比,图中数值为平均值±标准误(n=15)。
图16为Video-EEG记录揭示CAMSAP1敲除小鼠具有癫痫电信号。其中A为来自于WT和KO小鼠的代表性EEG追踪记录电信号,B为来自于A图EEG信号的代表性功率谱。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明,但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料,如无特殊说明,均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验,均设置三次重复实验,结果取平均值。
海马神经元细胞分离自新生C57BL/6J小鼠。
C57BL/6J小鼠和ICR小鼠均为北京维通利华实验动物技术有限公司的产品。除特殊说明外,下述实施例中的小鼠均为C57BL/6J小鼠。所有小鼠均在中国科学院遗传与发育生物学研究所实验动物中心SPF级饲养条件下饲养繁殖。
载体PCR-Blunt为Invitrogen公司的产品。载体PCR-Blunt为卡那霉素抗性。
载体pEGFP-C1为Clontech公司的产品。载体pEGFP-C1为卡那霉素抗性。
载体pCAH-SalI-EGFP记载于如下文献中:Ichii,T.,and Takeichi,M.(2007).p120-catenin regulates microtubule dynamics and cell migration in acadherin-independent manner.Genes Cells 12,827-839.载体pCAH-SalI-EGFP为氨苄抗性。
载体pCMV-Tag 2B为Stratagene公司的产品。载体pCMV-Tag 2B为卡那霉素抗性。
载体pGEX-4T-1为Amersham公司的产品。载体pGEX-4T-1为氨苄抗性。
载体pLentiLox 3.7记载于如下文献中:Xu,D.,Zhang,F.,Wang,Y.,Sun,Y.,andXu,Z.(2014).Microcephaly-associated protein WDR62 regulates neurogenesisthrough JNK1 in the developing neocortex.Cell Rep 6,104-116.
载体pLentiLox 3.7m(即shRNA敲降载体):将载体pLentiLox 3.7中GFP基因替换为mCherry的编码基因(Genebank号为MH325107.1),其它序列均不变,得到的载体。
下述实施例中涉及的重组质粒的名称及其构建方法见表1。酶切位点表示基因片段插入载体中所用的内切酶,“/”代表使用双酶切位点。基因片段和载体使用对应的内切酶处理后,纯化回收,再使用T4-连接酶将基因片段连接插入到载体中。构建过程中使用的内切酶和连接酶均购买自TAKARA或NEB公司,使用方法按照说明书进行。
表1
下述实施例中涉及的shRNA的名称及其靶标序列见表2。
表2
shRNA的名称 | 靶标序列(5’-3’) | 在序列表中的位置 |
Control shRNA | TCATGCCTCTATCTACGTC | 无 |
CAMSAP1 shRNA1 | TTAGCAGTGGTTCACTATTAT | SEQ ID NO:2 |
CAMSAP1 shRNA2 | ATAGCTTGGCATCTAACATTA | 无 |
CAMSAP1 shRNA3 | TGTGATGCCAACCACTATATT | SEQ ID NO:1 |
CAMSAP1 shRNA4 | CTATGGTACGAAAGAAAGTAA | 无 |
下述实施例中涉及的一抗的名称、种属、来源和使用浓度见表3。
表3
下述实施例中涉及引物的名称及其核苷酸序列见表4。
表4
注:引物名称中含有“F”的为正向引物,引物名称中含有“R”的为反向引物。
下述实施例中,蛋白免疫印迹(WB)使用的二抗如下:
Sheep HRP-conjugated anti-mouse IgG(NA931V,GE,1:7000);
Donkey HRP-conjugated anti-rabbit IgG(NA934V,GE,1:10000)。
下述实施例中,免疫荧光(IF/IHC)使用的二抗如下:
Goat anti-mouse,anti-rabbit or anti-rat IgG,Alexa Fluor 488-,555-,647,IF 1:500;
Donkey anti-chicken IgY(IgG),Alexa Fluor 488,IF 1:500。
下述实施例中,免疫共沉淀实验的步骤如下:
1、脂质体转染哺乳动物细胞
细胞转染实验步骤及转染中的溶液配制体系均按照Lipofectamine 2000使用说明进行,详细转染步骤如下(以6cm皿培养的HEK293为例):
(1)铺1.3×106个细胞于培养皿,37℃、5%CO2至60%-80%汇合后给细胞换液;
(2)将2μg DNA稀释于100μL Opti-DMEM中,5μL脂质体稀释于另一份100μL Opti-DMEM中,室温放置时间约5min;
(3)将步骤(2)中的两份Opti-DMEM缓慢混合,室温放置15min,制得DNA脂质体混合液;
(4)将DNA脂质体混合液缓慢加入状态良好的细胞中,37℃、5%CO2细胞培养箱培养;4-6h后换新的含10%FBS的培养液,继续培养,18-24h后收获细胞。
2、免疫共沉淀
(1)HEK293细胞转染24h后加入1×PBS洗涤细胞两遍,随后加入裂解液刮下细胞)小鼠大脑组织直接加入裂解液匀浆),于垂直混合仪4℃作用30min,充分裂解细胞;
(2)将裂解后的细胞13000rpm、离心20min,取50μL上清作为Input;
(3)剩余上清中各加入3μL Protein G Sepharose置于垂直混合仪,4℃反应30min,用于去除背景(Flag Beads不需要去背景),然后在4℃、2000rpm离心5min,取上清;
(4)将其中一管上清中加入5μL(2μg)IgG抗体,另一管上清加入2μg目的蛋白抗体,置于垂直混合仪4℃摇动混合90min;
(5)在两个离心管中各加入10μL Protein G Sepharose,置于垂直混合仪4℃继续摇动1.5h;
(6)4℃、2000rpm离心5min,取上清,用清洗液清洗沉淀3-5次,洗完后将Beads沉淀中加入60μL 1×上样缓冲液,100℃煮样5min;
(7)免疫印迹检测免疫共沉淀结果。
下述实施例中,微管沉淀实验的步骤如下:
(1)37℃预热PBS洗涤细胞2次;
(2)加入稳定微管缓冲液缓冲液于37℃放置15min,期间晃动数次;
(3)刮下细胞于37℃、1000g离心5min;
(4)上清加入上样缓冲液,100℃煮样5min;
(5)沉淀加入等体积RIPA裂解液溶解沉淀,加入上样缓冲液,100℃煮样5min。
下述实施例中,微丝沉淀实验的步骤如下:
(1)37℃预热PBS洗涤细胞2次;
(2)加入稳定微丝缓冲液缓冲液于37℃放置10min,期间晃动数次;
(3)刮下细胞于37℃、100000g超速离心75min;
(4)上清加入上样缓冲液,100℃煮样5min;
(5)沉淀加入等体积RIPA裂解液溶解沉淀,加入上样缓冲液,100℃煮样5min。
下述实施例中,免疫印迹的步骤如下:
(1)配制SDS-PAGE胶(检测磷酸化时需加入phos-tag),取适量样品上样,电泳至适合位置后准备转膜;
(2)PVDF膜用甲醇浸泡15sec后,然后与滤纸、胶浸泡于转移缓冲液中,平衡5min;
(3)组装转移夹层,从负极到正极依次为海绵垫、滤纸、凝胶、PVDF膜、滤纸和海绵垫,注意各层之间勿留气泡;
(4)往电转移槽中加入转膜缓冲液,按正确的极性方向将转移夹层装入电转移槽中,凝胶面对负极,PVDF膜对正极;
(5)4℃,190mA,转膜3h;
(6)转移结束后,拆卸转移装置,取出转移膜,置于TBST中洗3-5min,以置换掉膜上残余的少许转移缓冲液,避免其对后续操作的影响;
(7)用含3%脱脂奶粉的封闭液室温封闭30min后,弃封闭液;
(8)加抗体于抗体稀释液中,稀释比例因抗体而异,室温孵育2h或4℃孵育过夜;
(9)TBST洗膜3次,每次5min;
(10)用抗体稀释液稀释二抗,室温孵育1h;
(11)TBST洗膜3次,每次5min;
(12)利用X-光胶片曝光或化学发光型凝胶成像系统扫描拍照。
下述实施例中,冰冻切片及免疫荧光染色的步骤如下:
1、脑组织固定、包埋及切片
(1)脑组织用4%PFA固定过夜;
(2)弃去PFA,倒入30%蔗糖进行脱水处理;
(3)待脑袋沉降至底部后,将脑袋组织置于加有包埋剂O.C.T compound的包埋盒里;
(4)包埋完毕,马上放到-80℃超低温冰箱中,令其瞬间冷冻;
(5)脑组织于-80℃冰箱冷冻切片切好的脑片置于-20℃冰箱中保存备用。
2、免疫荧光染色
2-1、神经元免疫荧光染色
(1)培养好的神经元弃培养基,加入37℃预热的4%PFA于37℃固定10min;
(2)用PBST洗5min,3次;
(3)吸去PBST,加入350μL封闭液轻摇室温封闭1h;
(4)孵育一抗,室温,1.5h;
(5)PBST洗5min,3次;
(6)加入荧光标记的二抗,37℃避光孵育1.5h;
(7)PBST洗5min,3次;
(8)在载玻片上滴加3μL抗荧光淬灭剂,玻璃圆片倒置(铺细胞的一面朝下)于载玻片上,室温放置30min以上,随后荧光显微镜观察拍摄。
2-2、组织免疫荧光染色(漂片法)
(1)将脑片从防冻液中取出,于24孔板中用PBS洗5min,3次;
(2)加入封闭液(Triton X-100浓度为0.3%),室温封闭1h;
(3)吸去封闭液,加入一抗,在4℃房的摇床上孵育过夜;
(4)回收一抗,用PBST清洗5-10min,3次;
(5)加入荧光标记的二抗,37℃避光孵育1.5h;
(6)用PBST清洗5-10min,3次;
(7)清洗完毕后,将脑片挑到载玻片上,待稍微干燥,滴加防淬灭剂,然后盖上盖玻片进行封片,室温放置30min以上,随后荧光显微镜观察拍摄。
2-3、组织免疫荧光染色(贴片法)
(1)贴有脑片的载玻片于37℃放置30min;
(2)免疫组化笔在脑片周围画圈,加入PBS洗5min,3次;
(3)加入封闭液(Triton X-100浓度为0.3%),室温封闭1h;
(4)吸去封闭液,加入一抗,在4℃房的摇床上孵育过夜;
(5)回收一抗,用PBST清洗5-10min,3次;
(6)加入荧光标记的二抗,37℃避光孵育1.5h;
(7)用PBST清洗5-10min,3次;
(8)清洗完毕后在脑片上滴加防淬灭剂,然后盖上盖玻片进行封片,室温放置30min以上,随后荧光显微镜观察拍摄。
下述实施例中,Brdu标记及染色的步骤如下:
(1)根据小鼠的体重,腹腔注射BrdU,剂量为50μg/g;
(2)标记一定时间后牺牲小鼠,剥取脑组织;
(3)固定、包埋及切片方法同上;
(4)1M HCl冰上浸泡10min;
(5)2M HCl于37℃条件下浸泡15-30min;
(6)0.1M硼酸盐(四硼酸钠)缓冲溶液中室温中和15min;
(7)用PBS清洗5-10min,3次;
(8)免疫荧光染色方法同上。
下述实施例中,海马神经元的分离、培养与转染的步骤如下:
1、海马神经元的分离与培养
(1)神经元分离实验前一天,将用于细胞培养的玻片取出,超净台内吹干,将玻片放入24孔板中,加入0.1mg/mL的poly-L-lysine溶液包被过夜;
(2)实验当天,将有玻片包被的24孔板取出,吸去poly-L-lysine溶液,用水洗玻片3次,超净台内吹干玻片,待用;
(3)冰上麻醉P0小鼠,剪下小鼠脑袋,置于含有HBSS缓冲液中,小心地撕开小鼠脑皮及头盖骨,取出大脑,切下左右两个大脑半球,夹住嗅球,小心地撕去覆盖在大脑上的脑膜,务必去除干净,夹出海马组织,置于含有HBSS的缓冲液;
(4)室温、1000rpm离心1min,吸弃上清,向沉淀中加入2mL 0.25%胰酶溶液,37℃消化15min,加入DNase I再消化5min;
(5)加入2mL含有10%FBS的DMEM完全培养基终止消化,轻轻吸走溶液,再加入DMEM完全培养基清洗一次;
(6)加入DMEM完全培养基用枪头轻轻吹打至组织块被分解;
(7)将上清吸入一新的离心管中,室温、1000rpm离心5min,弃上清;
(8)用DMEM完全培养基重悬细胞,室温、1000rpm离心5min,弃上清;
(9)用DMEM完全培养基重悬细胞并计数,按3-5×104个细胞/孔接种到24孔板中;
(10)培养4h后加入Neurobasal培养基清洗一次,再加入Neurobasal完全培养基进行培养;
(11)将细胞放入37℃细胞培养箱培养并每过两天更换一半新培养基。
2、海马神经元的转染
2-1、DIV(Day in vitro)0转染
DIV0的海马神经元转染使用invitrogen的Neon transfection system进行转染,转染方法按使用说明书进行操作,具体如下:
(1)海马神经元的分离同上;
(2)加入PBS悬浮海马神经元并计数;
(3)室温、1000rpm离心5min,洗尽PBS,按约1.5×105每10μL的量加入buffer R;
(4)加入0.5μg或1μg质粒/10μL神经元进行混合;
(5)将电转枪头正确安装于移液器,吸取10μL的神经元进行电转,电转程序使用neontransfectionsystem内置参数(sample 20);
(6)将电转完的神经元加入37℃预热的培养基中,6-8h后换液。
2-2、DIV(Day in vitro)3转染
DIV3的海马神经元转染按照Lipofectamine 2000使用说明进行,具体如下:
(1)海马神经元的分离同上;
(2)DIV3海马神经元换培养基;
(3)将0.5μg DNA稀释于25μLOpti-DMEM中,1μL脂质体稀释于另一份25μLOpti-DMEM中,室温放置时间约5min;
(4)将以上两稀释液缓慢混合,室温放置15min;
(5)将DNA脂质体混合液缓慢加入状态良好的细胞中,37℃、5%CO2细胞培养箱培养;
(6)2-3h后换新培养液。
下述实施例中,小鼠子宫内胚胎电转的步骤如下:
(1)根据孕鼠体重注射戊巴比妥钠麻醉剂麻醉小鼠;
(2)待小鼠彻底麻醉之后,将小鼠置于操作台面上,腹面朝上,用75%酒精水溶液棉擦拭小鼠的腹部位置进行消毒处理;
(3)将一块有合适大小开口的无菌纱布覆盖小鼠腹部,将开口处对准小鼠腹部中线位置;
(4)用无菌剪刀沿着腹部中线,剪开大约2cm的口子;
(5)用环形镊子轻轻的将一边的子宫拉出,将拉出的子宫置于事先放在腹部的纱布上,滴加预热的生理盐水或者PBS滋润子宫,在之后的时间里,可不断的用胶头滴管吸取预热的生理盐水或者PBS来滋润子宫,以防止子宫壁过于干燥而导致流产;
(6)左手用环形镊子夹住胚胎,根据情况进行适当的旋转和调整,使得胚鼠头部紧贴子宫壁,右手将吸有DNA的玻璃显微注射针扎入小鼠的侧脑室内,通过嘴吹的方式将1μL质粒注射到侧脑室;
(7)将电极用生理盐水微微湿润,轻轻夹住胚鼠头部,正极对准注射过质粒的一侧,负极对准对侧,在电压35V,脉冲时间50ms,间隔时间950ms,脉冲5次;
(8)将子宫放回母鼠腹腔,记录电转胚胎的位置,再用环形镊将另外一侧子宫夹出,步骤同上;
(9)缝合腹部开口,再将小鼠平置于保温垫上,1-2h后,待其完全苏醒再放入笼中并注意观察小鼠的恢复情况;
(10)电转一定时间后处死小鼠,根据记录的胚胎位置,取出电转过的胚胎,在显微镜下观看是否有绿色荧光,如有,则代表电转成功;
(11)后续小鼠大脑固定、染色同上。
下述实施例中,图像处理和数据统计学分析如下:
1、实验结果中免疫印迹图片由ImageJ软件分别测定目的蛋白条带强度以及对照蛋白条带强度,总蛋白含量变化时使用GAPDH或者α-tubulin蛋白作为内参对照。由于SDS-PAGE胶在加入phos-tag之后会导致条带变宽,故文中所展示的添加phos-tag之后的western blot结果已进行适当压缩。免疫荧光染色图片使用ImageJ软件统计细胞数目。
2、实验结果都来自至3次以上独立重复实验,数据分析采用two-tailedStudent’st-test,用“平均数±标准误”表示,当P>0.05时记为“N.S.”;当0.01<P<0.05时记为“*”;当0.001<P<0.01时记为“**”;当P<0.01时记为“***”。所有数据都使用Graphpad Prism软件进行做图。
3、CAMSAP家族蛋白在神经元中的分布偏好性计算:通过ImageJ测定蛋白荧光值,以Tuj1的荧光值作为标准内参,计算出CAMSAPs在树突中的荧光平均值(2-3根树突)Id和轴突中的荧光平均值Ia,再计算出分布偏好性,计算公式为PI=(Id-Ia)/(Id+Ia)。
实施例1、CAMSAP1蛋白对小鼠体重和生存时间的影响
一、构建CAMSAP1敲除鼠
为构建CAMSAP1敲除鼠,选定CAMSAP1的第13个外显子作为靶标位点,通过同源重组的方法进行敲除(图1中A)。
同源重组所使用载体(targeting vector)为:DT-A-pA/loxP/PGK-Neo-pA/loxP,如图1A所示,载体中含有Camsap1基因突变位点两侧的同源序列(5’arm和3’arm),以及插入的loxP-Neo-loxP序列。由于neo的插入,CAMSAP1的表达提前终止。
二、CAMSAP1敲除鼠中CAMSAP1的检测
1、采用Southern杂交分别检测野生型小鼠、CAMSAP1敲除鼠和杂合小鼠中CAMSAP1基因。Southern杂交的探针序列分别如SEQ ID NO:3(5’probe)和SEQ ID NO:4(3’probe)所示。
部分检测结果见图1中B(WT为野生型小鼠,Het为杂合小鼠)。
2、PCR检测CAMSAP1敲除鼠中CAMSAP1基因
1)将C57BL/6J小鼠和CAMSAP1敲除鼠进行杂交,得到F1代小鼠。
2)剪取少量小鼠(野生型小鼠、F1代小鼠或CAMSAP1敲除鼠)尾巴,加入250μL浓度为50mM的NaOH水溶液;
3)100℃加热30min,涡旋振荡至组织破碎后加入25μL 1M Tris-HCl(pH 8.0);
4)加入225μL ddH2O混合均匀,13000rpm离心5min,收集上清;
5)取上清,采用Genotyping F、Genotyping R1和Genotyping R2组成的引物对进行PCR扩增,然后进行如下判断:如果PCR扩增产物中含有大小为559bp的DNA片段且不含有大小为300bp的DNA片段,则相应的小鼠为C57BL/6J小鼠(即野生型小鼠);如果PCR扩增产物中含有大小为300bp的DNA片段且不含有大小为559bp的DNA片段,则相应的小鼠为CAMSAP1敲除鼠;如果PCR扩增产物中含有大小为300bp的DNA片段和大小为559bp的DNA片段,则相应的小鼠为杂合小鼠。
检测结果见图1中C(WT为野生型小鼠,Het为杂合小鼠,KO为CAMSAP1敲除鼠)。
3、采用Western Blot检测CAMSAP1敲除鼠、野生型小鼠或杂合小鼠中CAMSAP1蛋白、CAMSAP2蛋白和CAMSAP3蛋白的表达。
分别使用CAMSAP1抗体、CAMSAP2抗体和CAMSAP3抗体进行检测。检测结果见图1中D(WT为野生型小鼠,Het为杂合小鼠,KO为CAMSAP1敲除鼠)。
结果表明,CAMSAP1敲除鼠中CAMSAP1被成功敲除,且CAMSAP2蛋白和CAMSAP3蛋白的表达量在CAMSAP1敲除之后并没有出现上升。由此可见,CAMSAP2和CAMSAP3并不能直接代偿CAMSAP1的功能。
三、CAMSAP1敲除鼠的体重减轻
取刚出生的待测小鼠(CAMSAP1敲除鼠、野生型小鼠或杂合小鼠),每天观察待测小鼠的个头和体重。
出生第21天,待测小鼠的照片见图2中A(WT为野生型小鼠,Het为杂合小鼠,KO为CAMSAP1敲除鼠)。雄鼠从出生到21天的体重变化曲线见图2中B(数值为平均值±标准误(WT,n=10;Het,n=20;KO,n=11))。雌鼠从出生到21天的体重变化曲线见图2中C(数值为平均值±标准误(WT,n=9;Het,n=25;KO,n=4))。结果表明,与杂合小鼠或野生型小鼠相比,CAMSAP1敲除鼠的个头偏小、体重偏轻,这种差异在出生2周之后尤为明显。
四、CAMSAP1敲除鼠具有更高的死亡率
1、统计F1代小鼠中野生型小鼠、杂合小鼠和CAMSAP1敲除鼠的数量,并计算在F1代小鼠中的比例。
统计结果见图3中A(数值为平均值;WT,n=177;Het,n=380;KO,n=173)。结果表明,野生型小鼠、杂合小鼠和CAMSAP1敲除鼠的比例约为1:2:1,符合孟德尔遗传定律。由此可见,没有出现胚胎死亡的小鼠。
2、F1代小鼠出生2天后,分别统计F1代小鼠中野生型小鼠、杂合小鼠和CAMSAP1敲除鼠的死亡率。
统计结果见图3中B(数值为平均值;WT,n=123;Het,n=213;KO,n=96)。结果表明,与杂合小鼠或野生型小鼠相比,CAMSAP1敲除鼠的死亡率高出50%。
3、取待测小鼠(CAMSAP1敲除鼠、野生型小鼠或杂合小鼠),正常饲养8个月,以饲养时间为横坐标,死亡率为纵坐标,绘制小鼠存活曲线(出生2天内死亡的小鼠未统计在内)。
死亡变化曲线见图3中C(数值为平均值;WT,n=23;Het,n=53;KO,n=42)。结果表明,与杂合小鼠或野生型小鼠相比,CAMSAP1敲除鼠在出生后的21-35天会出现一个死亡高峰期、90%以上的CAMSAP1敲除鼠会在这一时期死亡;CAMSAP1敲除鼠的寿命均不超过6个月。
实施例2、CAMSAP家族蛋白在大脑皮层以及神经元中的分布
一、免疫印迹检测CAMSAP家族蛋白的表达
已有研究表明,CAMSAP家族蛋白在大鼠大脑中均有表达,但主要表达CAMSAP2,CAMSAP1和CAMSAP3的表达量较少,尤其是CAMSAP1的表达量极其微弱,而且CAMSAP1在海马中未检测到表达。因此,首先对CAMSAP1蛋白是否在小鼠中枢神经系统中表达进行检测。
分别提取小鼠不同时期的大脑皮层、不同时期的海马以及培养不同时间的海马神经元细胞的总蛋白,分别使用CAMSAP1抗体、CAMSAP2抗体和CAMSAP3抗体进行免疫印迹检测。
图4中A的上图为大脑皮层的免疫印迹检测结果,下图为与表达量最高处相比、CAMSAPs在大脑皮层中表达量的百分比(数值为平均值±标准误(n=3))。其中,E17.5为胚胎期17.5天,P0为出生当天,P7为出生后7天,P14为出生后14天,P21为出生后21天,P28为出生后28天,Adult为成年。
图4中B的上图为海马的免疫印迹检测结果(从上而下依次为CAMSAP1、CAMSAP2、CAMSAP3和α-tubulin),下图为与表达量最高处相比、CAMSAPs在海马中表达量的百分比(数值为平均值±标准误(n=3))。其中,E17.5为胚胎期17.5天,P0为出生当天,P7为出生后7天,P14为出生后14天,P21为出生后21天,P28为出生后28天,Adult为成年。
图4中C的上图为海马神经元的免疫印迹检测结果(从上而下依次为CAMSAP1、CAMSAP2、CAMSAP3和α-tubulin),下图为与表达量最高处相比、CAMSAPs在海马神经元中表达量的百分比(数值为平均值±标准误(n=3))。其中,DIV1为体外培养1天,DIV4为体外培养4天,DIV7为体外培养7天,DIV14为体外培养14天。
结果表明,CAMSAP1在小鼠大脑皮层、海马以及培养的海马神经元中均有表达,且表达量呈现先上升后下降的趋势。同时,也对CAMSAP2和CAMSAP3的表达进行了检测,结果发现CAMSAP2和CAMSAP3的表达趋势与CAMSAP1相一致,均呈现先上升后下降的趋势。由此可见,CAMSAP家族成员可能在神经发育的早期具有重要功能。
二、制备CAMSAP1抗体
在明确了CAMSAP1在神经系统中的表达之后,本发明的发明人期望通过免疫荧光染色对CAMSAP1在神经系统中的功能进行进一步研究。利用CAMSAP1敲除鼠本发明的发明人发现市面上的商业化CAMSAP1抗体均不能用于免疫荧光染色,因此首先需要制备能用于免疫荧光染色的CAMSAP1抗体。具体步骤如下:
1、通过诱导表达纯化获得可用于免疫的抗原
1)挑取平板上的已转化重组质粒GST-CAMSAP1-N723的大肠杆菌,在LB液体培养基中摇菌过夜,得到菌液;
2)转接菌液于LB液体培养基中,37℃振荡培养至OD600值为0.6-0.7,加入IPTG使其终浓度为0.4mM,30℃诱导4h;
3)离心收集菌体,菌体沉淀用PBS(4℃预冷)重悬。
4)向菌体加入1mM PMSF,冰上超声破碎;然后加入1%Triton X-100,4℃裂解;
5)离心取上清,用0.45μm过滤后加入蛋白纯化柱中;
6)上清流过柱子后,用清洗液洗3次;
7)用洗脱缓冲液洗脱蛋白纯化柱,然后用5倍以上柱体积的洗脱缓冲液彻底洗脱;
8)洗脱的蛋白样品进行SDS-PAGE胶电泳和考马斯亮蓝染色,确定洗脱下来的抗原蛋白浓度和纯度并与PBS缓冲液中透析。
抗原纯化的考马斯亮蓝染色结果见图5中A。
2、将步骤1获得的抗原注射免疫豚鼠,再通过组织免疫荧光染色和细胞免疫荧光染色对免疫所得血清进行抗体筛选,最终获得可用于免疫荧光染色的CAMSAP1抗体。
CAMSAP1在野生型小鼠和CAMSAP1敲除鼠大脑皮层切片中免疫荧光染色结果见图5中B和C(Map2(红色)标记树突,L1(红色)标记轴突,DAPI(蓝色)标记细胞核,比例尺为50μm)。
CAMSAP1在培养的海马神经元中与神经元特异性的微管蛋白Tuj1(绿色)免疫荧光染色结果见图5中D(比例尺为20μm)。
三、CAMSAP家族蛋白在大脑皮层和海马神经元中的分布具有差异
1、将CAMSAP1与脑室区神经前体细胞标记蛋白Pax6共染。
结果表明,CAMSAP1在干细胞中有表达,但是表达主要在胞质中,在细胞核中未检测到明显的荧光信号(图6中A)。
2、对E15.5、E17.5和P0等不同时期的大脑进行染色。
结果表明,在发育早期,CAMSAP1在IZ区有高表达,随着发育的进行,蛋白的表达在IZ区到MZ区开始更加均匀,最后在P0天时,CAMSAP1在SP到MZ有更高的表达,而在IZ区的表达则变少(图6中A-C)。与CAMSAP1在整个大脑皮层均有分布所不同,CAMSAP2主要分布于SP到MZ(图6中D和E),而CAMSAP3的分布则集中在IZ区到皮层板的第六层(图6中F和G)。
3、为了进一步研究CAMSAP1的功能,本发明的发明人通过培养分离出的海马神经元,并对海马神经元进行免疫荧光染色以观察CAMSAP家族蛋白在神经元中的分布。
结果表明,CAMSAP1在培养的神经元的第一阶段就有已经有表达,此时主要集中于细胞体中(图7中A,比例尺为10μm);在随后的第二阶段,CAMSAP1开始进入各个小的突起之中,直到第三阶段,CAMSAP1仍然是在所有的树突和轴突中均有表达(图7中A-D,D的比例尺为20μm)),且CAMSAP1会在第三阶段的轴突末端的生长锥中积累(图7中B)。
4、对CAMSAP1敲除鼠的神经元转入外源的CAMSAP1进行染色,结果发现外源表达的CAMSAP1具有内源表达蛋白相同的分布模式(图7中F,比例尺为20μm)。
5、对CAMSAP2和CAMSAP3进行免疫荧光染色。
结果表明,CAMSAP2和CAMSAP3在培养到第三阶段的神经元中均有分布(图8中A和C,比例尺为20μm)。
通过对细胞免疫荧光的荧光值进行统计发现,CAMSAP家族蛋白在海马神经元中的分布各有不同的偏好,CAMSAP1和CAMSAP2更偏好于分布在树突中,而CAMSAP3则对轴突有更高的偏好(见图7中C、E(比例尺为10μm)和图8中B、D)。
实施例3、CAMSAP1在体外参与调控神经元的极性建立
一、CAMSAP1参与调控体外培养海马神经元的极性建立
1、本发明的发明人通过神经元轴突标记蛋白Tau-1抗体和树突标记蛋白Map2抗体共染发现,与培养的野生型海马神经元相比,敲除CAMSAP1之后的神经元中生长出单个轴突(仅有一个突起是Tau-1阳性)的神经元比例会减少而多个轴突(多个突起是Tau-1阳性)的神经元的比例会增加(图9中A),神经元第一长和第二长突起的比值、最长的突起长度、所有突起的总长度和神经元突起总数目均发生了变化(图9中C、D、E和F)。这表明敲除CAMSAP1的确改变了神经元的极性。
2、本发明的发明人对刚分离的海马神经元转入外源的CAMSAP1、2、3融合GFP的质粒CAMSAP1-GFP、CAMSAP2-GFP、CAMSAP3-GFP,免疫荧光染色。结果表明转入外源的CAMSAP1和CAMSAP3均可以完全拯救CAMSAP1缺失的表型,而转入CAMSAP2却不能拯救CAMSAP1缺失的表型(图9中G和H)。
二、CAMSAP1不参与神经元极性的维持
1、构建CAMSAP1 shRNA
构建敲降CAMSAP1的shRNA质粒CAMSAP1 shRNA1、CAMSAP1 shRNA2、CAMSAP1shRNA3、CAMSAP1 shRNA4及对照质粒Control shRNA,以及可以抵抗shRNA敲降的CAMSAP1同义突变体Flag-CAMSAP1R(见图10中A)。
通过在HEK293细胞内同时转入CAMSAP1外源质粒Flag-CAMSAP1和上述shRNA质粒并利用western blot来检测shRNA的敲降效率。
结果显示,shRNA1和shRNA3均能敲降外源CAMSAP1(图10中B),但是shRNA3的敲降效率更加稳定。因此后续实验均用shRNA3(后续实验均记为shRNA)进行敲降。同时将敲降质粒与CAMSAP2和CAMSAP3共转表明shRNA3并不能敲降CAMSAP2和CAMSAP3(图10中C)。并且还通过培养的海马神经元证实shRNA同样可以有效的敲降内源CAMSAP1(图10中D)。
2、CAMSAP1不参与神经元极性的维持
将神经元培养3天,待其建立极性之后再转入shRNA敲降CAMSAP1,此后再继续培养3天至第6天进行染色以验证神经元的极性。
染色结果证实在神经元建立极性之后敲降CAMSAP1并不能将神经元由单个轴突转变为两个或多个轴突(图11中A和B),这表明CAMSAP1实际上并不参与神经元极性的维持。
实施例4、CAMSAP1在体内参与调控多极神经元向双极神经元的转变
在证实敲除CAMSAP1之后会影响体外培养神经元极性的建立之后,推测敲除CAMSAP1可能同样会影响体内神经元的极性。利用子宫内胚胎电转的方法,首先对小鼠大脑皮层神经元中的CAMSAP1进行了敲降。E14.5天的胎鼠在电转3天之后进行组织免疫荧光染色,并根据神经元的形态将皮层神经元分为4类:单极/双极无分支神经元、单极/双极有分支神经元、多极神经元和没有突起的神经元。在对照小鼠中,皮层神经元的形态大多为单极/双极无分支形式,而在敲降CAMSAP1之后,单极/双极无分支形式皮层神经元减少,与此同时单极/双极分支神经元或是多极神经元增多(图12中A、C和D)。同样的,对敲除了CAMSAP1的E14.5天胎鼠进行电转发现,CAMSAP1 KO小鼠皮层神经元也表现出了相同的形态变化(图12中E和F)。
神经元由脑室区进入中间带会变成多极细胞形态,随机向各个方向延伸或回缩突起,此时细胞也向多个方向随机运动。当细胞运动到中间带的中间区域时会开始生长出尾随突起(即将来的轴突),此时神经元会重新将中心体和高尔基体定位于细胞上方,即朝向皮层板,并开始呈现放射状迁移。因此对E14.5天的胎鼠进行胚胎电转,2天之后待大量细胞开始完成由多极向双极转变后进行组织免疫荧光染色,并对神经元的高尔基体定位进行了统计(图12中G和H)。结果表明,在敲除了CAMSAP1之后会有更多的神经元不能完成高尔基体的重新定位,即高尔基体朝向皮层板的神经元减少,证实敲降CAMSAP1会影响神经元由多极细胞向双极细胞的转变。
实施例5、CAMSAP1敲除或敲降影响神经元的放射状迁移
一、CAMSAP1敲除或敲降影响神经元的放射状迁移
由于神经元的极性和迁移通常相伴发生,而且在检测神经元多极向双极转变的实验中也发现神经元的分布有异常(图12中B),因此推测可能敲除或敲降CAMSAP1会影响神经元的迁移。通过胚胎电转的方法对E14.5天的胎鼠转入对照或敲降质粒,4天之后再进行组织免疫荧光染色,结果显示没有敲降CAMSAP1的神经元,主要分布于CP层,而敲降了CAMSAP1的神经元则会大量的停滞于IZ区(图13中A和B),而且对CAMSAP1的敲除小鼠进行电转之后染色,也得到了相同的结果(图13中C和D),即敲除或敲降CAMSAP1会影响神经元的迁移。为了验证神经元的这种分布差异确为CAMSAP1缺失所引起,在敲降CAMSAP1的同时转入可以抵抗CAMSAP1 shRNA敲降的CAMSAP1R,令人意外的是转入CAMSAP1R并不能很好的对敲降表型进行拯救。但是在拯救实验中却发现迁移到CP层的神经元中CAMSAP1的表达量较低,而停滞在IZ区的神经元中的CAMSAP1的表达量则较高(图13中A)。基于此,推测可能CAMSAP1的表达量对拯救很重要。随后选择了不同浓度的质粒进行拯救实验,结果发现相较于0.3μg和1.2μg的质粒,0.6μg和0.9μg的质粒可以部分拯救敲降表型(图13中B)。
5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)是一种胸腺嘧啶核苷类似物,可以在细胞分裂周期的DNA合成期(S期)代替胸腺嘧啶插入正在复制的DNA分子,而且这些BrdU可以跟随细胞的增殖再次被分配给子代细胞,最后通过抗体检测确定增殖的细胞。因为皮层神经元的增殖主要靠位于VZ/SVZ区的前体细胞,因此可以通过给怀孕母鼠注射BrdU,在4天后检测BrdU阳性细胞的分布来判断神经元的迁移。实验结果发现野生型小鼠大量BrdU阳性细胞分布于CP层,而CAMSAP1敲除小鼠中的BrdU阳性细胞有更多的是分布于IZ区(图13中E和F)。
二、CAMSAP1不影响神经元的增殖分化和凋亡
前面的实验结果证实在敲降或敲除CAMSAP1之后会影响神经元的迁移,准确的说是神经元在皮层上的分布出现异常,因此需要明确在敲降或敲除CAMSAP1之后神经元的异常分布是否完全由神经元的迁移异常所导致。
1、在大脑皮层,神经元的放射状迁移主要是沿放射状胶质细胞向上迁移,首先利用放射状胶质细胞标记蛋白Nestin进行染色,发现放射状胶质细胞由脑室区伸长到边缘带,贯穿整个皮层,证实神经元向上迁移的“支架”并未出现异常(图14中A)。
2、胚胎期大脑皮层的神经干细胞处于活跃的细胞周期之中,通过增殖产生大量的神经元,而磷酸化的组蛋白H3(P-H3)和Ki67标记的正是细胞周期中的细胞,通过与BrdU标记技术相结合可以对细胞的增殖分化进行研究。首先利用细胞增殖标记蛋白P-H3进行染色,统计位于VZ区边界以及VZ/SVZ区的P-H3阳性细胞,随后通过BrdU标记将BrdU与脑室区干细胞标记蛋白Pax6共染检测细胞的增殖,两个实验结果均证实敲除CAMSAP1并不影响神经元的增殖(图14中A和B)。
3、在证实CAMSAP1 KO不影响神经元增殖之后又对神经元的分化进行检测。首先通过对怀孕母鼠注入BrdU,并将BrdU与细胞增殖标记蛋白Ki67共染,检测走出细胞周期进入终末分化神经元的比例(图14中C),结果证实敲除CAMSAP1并不影响神经元的前体细胞走出细胞周期。
4、通过标记BrdU,并将BrdU阳性细胞与第六层神经元标记蛋白Tbr1共染检测神经前体细胞分化形成神经元的比例,结果表明敲除CAMSAP1不影响神经元的分化(图14中D)。
5、通过检测皮层神经元凋亡细胞的数目,证实敲除CAMSAP1并不会影响神经元的凋亡(图14中E)。
因此,基于上述实验结果,证实在敲除或敲降CAMSAP1之后会导致神经元沿放射状胶质细胞的迁移出现异常。
实施例6、敲除CAMSAP1扰乱皮层神经元的排布
1、由于敲除CAMSAP1会导致神经元的迁移出现异常,因此推测可能敲除CAMSAP1后会影响大脑皮层神经元的排布。DAPI和Map2染色可以看到在WT小鼠皮层中出现的强弱相间的荧光信号分布在KO小鼠皮层中消失(图15中A和B),虽然Map2信号异常不能排除细胞极性缺失带来的影响,但是DAPI信号异常却能反映皮层神经元的排布状况。
2、通过第六层神经元标记蛋白Tbr1的抗体来标记第六层神经元,可以看到在敲除CAMSAP1之后,第六层神经元的排布不再整齐有序,部分神经元出现在CP层或是第五层,而有些神经元还停留在IZ区(图15中C和D)。而通过Cux1标记CP层(未来的第二三四层)神经元发现在敲除了CAMSAP1之后,本应迁移至CP板的神经元会有大量停滞于SP层至第五层(图15中E和F)。
上述结果都证实,在敲除了CAMSAP1之后,神经元在大脑皮层的分层排布出现了异常。
实施例7、CAMSAP1缺失导致小鼠出现癫痫病症
1、通过视频录像的方式对CAMSAP1敲除鼠的死亡过程进行拍摄。
结果表明,CAMSAP1敲除鼠出现头部上下晃动、尾巴翘起、强直性痉挛、死亡等与癫痫相吻合的表征。
2、通过电生理的方式Video-EEG记录CAMSAP1敲除鼠或野生型小鼠的神经电生理活动。
结果表明,与野生型小鼠相比,CAMSAP1敲除鼠具有更多的电信号活动和更高功率的电信号(图16)。记录CAMSAP1敲除鼠或野生型小鼠发病过程的电信号,证实小鼠的发病伴随有强烈的电信号的释放,证实该过程即为癫痫发病过程。
上述结果表明,CAMSAP1缺失导致小鼠出现癫痫病症,进而导致小鼠的死亡。
<110> 中国科学院遗传与发育生物学研究所
<120> CAMSAP1蛋白及其基因作为癫痫药物靶点的用途
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 1
tgtgatgcca accactatat t 21
<210> 2
<211> 21
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<400> 2
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<210> 3
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aggtttgaca tcagctggct tcttgccttg gtcacctgca gcaaaaccca cttcttaatg 60
cctccctcta acagtgaagg ggtacccagg tccccctgaa catttgagga aatcccctgg 120
ccataacaaa tactcagaca acagatagag ttcagaatac acagcaccaa gaggccgggg 180
acctagttgc caagaacggt gactggaaag aggcatctta aaaactgtct tcctggtatg 240
tccacgttag gttctgtaga gctctgagga agtaggcatt ttggtatcta aagtgtaaga 300
gtatactaaa gagttagaag gctgagtaga aaaaaaaaaa aaggaatctt ccagaaaata 360
gaacagaaag agcaaaagca tggaagtaaa ggaaaactag aaaaatgaaa tcaatatagg 420
agaatgaaca cagaaaatag agatggttta ccaaaggaaa gtgtagacgc ctcttgggtg 480
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catgaacaca gaattctctg tagggttatg ggagacccca tagaagaaca ggattttgtc 120
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tatatagtag acaagtaccg tgccacccag caacccactt tgtccccaga gtagagtaga 420
tatttttaaa tggcagtgca cttgagacag 450
Claims (10)
1.将CAMSAP1蛋白作为药物靶点的物质在制备产品中的应用;所述产品的功能为如下C1)至C9)中的至少一种:C1)增加体重;C2)降低死亡率;C3)延长寿命;C4)建立神经元极性;C5)促进多极神经元向双极神经元的转变;C6)增加神经元沿放射状胶质细胞的迁移;C7)维持皮层神经元的排布;C8)预防癫痫;C9)治疗癫痫。
2.CAMSAP1蛋白在制备产品中的应用;所述产品的功能为如下C1)至C9)中的至少一种:C1)增加体重;C2)降低死亡率;C3)延长寿命;C4)建立神经元极性;C5)促进多极神经元向双极神经元的转变;C6)增加神经元沿放射状胶质细胞的迁移;C7)维持皮层神经元的排布;C8)预防癫痫;C9)治疗癫痫。
3.CAMSAP1蛋白的应用,为如下C1)至C9)中的至少一种:C1)增加体重;C2)降低死亡率;C3)延长寿命;C4)建立神经元极性;C5)促进多极神经元向双极神经元的转变;C6)增加神经元沿放射状胶质细胞的迁移;C7)维持皮层神经元的排布;C8)预防癫痫;C9)治疗癫痫。
4.抑制CAMSAP1蛋白活性和/或表达量的物质在制备产品中的应用;所述产品的功能为如下A1)至A7)中的至少一种:A1)减轻体重;A2)提高死亡率;A3)缩短寿命;A4)改变神经元极性;A5)抑制多极神经元向双极神经元的转变;A6)减缓神经元沿放射状胶质细胞的迁移;A7)扰乱皮层神经元的排布。
5.抑制CAMSAP1蛋白活性和/或表达量的物质的应用,为如下A1)至A7)中的至少一种:A1)减轻体重;A2)提高死亡率;A3)缩短寿命;A4)改变神经元极性;A5)抑制多极神经元向双极神经元的转变;A6)减缓神经元沿放射状胶质细胞的迁移;A7)扰乱皮层神经元的排布。
6.产品甲,含有CAMSAP1蛋白或促进CAMSAP1蛋白活性和/或表达量的物质;所述产品甲的功能为如下C1)至C9)中的至少一种:C1)增加体重;C2)降低死亡率;C3)延长寿命;C4)建立神经元极性;C5)促进多极神经元向双极神经元的转变;C6)增加神经元沿放射状胶质细胞的迁移;C7)维持皮层神经元的排布;C8)预防癫痫;C9)治疗癫痫。
7.产品乙,含有抑制CAMSAP1蛋白活性和/或表达量的物质;所述产品乙的功能为如下A1)至A7)中的至少一种:A1)减轻体重;A2)提高死亡率;A3)缩短寿命;A4)改变神经元极性;A5)抑制多极神经元向双极神经元的转变;A6)减缓神经元沿放射状胶质细胞的迁移;A7)扰乱皮层神经元的排布。
8.如权利要求4或5所述的应用或权利要求7所述的产品乙,其特征在于:所述“抑制CAMSAP1蛋白活性和/或表达量的物质”为z1)或z2):
z1)以寡聚核酸siRNA3为靶点,由shRNA表达系统合成的shRNA3;寡聚核酸siRNA3的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示;
z2)以寡聚核酸siRNA1为靶点,由shRNA表达系统合成的shRNA1;寡聚核酸siRNA1的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
9.权利要求4、5、8中任一所述抑制CAMSAP1蛋白活性和/或表达量的物质。
10.CAMSAP1蛋白在开发或筛选试剂中的应用;所述试剂的用途为如下C1)至C9)中的至少一种:C1)增加体重;C2)降低死亡率;C3)延长寿命;C4)建立神经元极性;C5)促进多极神经元向双极神经元的转变;C6)增加神经元沿放射状胶质细胞的迁移;C7)维持皮层神经元的排布;C8)预防癫痫;C9)治疗癫痫。
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