CN111073855A - 诱导星形胶质细胞转分化为五羟色胺能神经元的方法及应用 - Google Patents
诱导星形胶质细胞转分化为五羟色胺能神经元的方法及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及诱导星形胶质细胞转分化为五羟色胺能神经元的方法及应用。本发明揭示了利用不同转录因子组合在体外诱导星形胶质细胞直接重编程产生有功能的五羟色胺能神经元的方法，将得到的这些神经元移植到脑内能够存活。在应用转录因子的基础上加入化学小分子可以进一步提高产生五羟色胺能神经元的效率和成熟程度。利用本发明的方法产生的五羟色胺能神经元，可以用于神经再生，以及多种神经系统疾病的模拟和药物筛选。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，更具体地，本发明涉及诱导星形胶质细胞转分化为五羟色胺能神经元的方法及应用。
背景技术
五羟色胺能神经元作为一类调制神经元，通过释放神经递质五羟色胺(5-Hydroxytryptamine，5-HT)，作用到多个不同的脑区，在中枢神经系统中发挥重要的调节功能。大量的研究表明，五羟色胺(5-HT)能神经元的功能与多种行为具有相关性，疼痛感觉、性取向、睡眠及周期节律、摄食以及多种情绪行为都涉及到五羟色胺能神经系统的功能。并且，一系列精神类疾病与五羟色胺能神经元功能异常有密切的联系，包括抑郁、焦虑、强迫症、精神分裂、孤独症和药物成瘾等。
五羟色胺能神经元的功能与精神疾病的关系比较流行的假说指出，在发育关键期这些五羟色胺能神经元分泌的5-HT过多或过少造成递质失衡，进而影响了中枢神经系统环路的形成，最终导致其对于精神异常敏感性增强。
人为地对Sert、Tph2或Htr1a基因进行改造改变其表达水平能够在小鼠上引起非正常情绪及压力相关行为。很多与精神类疾病相关的变异影响了突触前五羟色胺信号，从而改变了全脑5-HT的水平。如Sert突变通过影响Sert蛋白的转运和活性影响5-HT能神经元，因此选择性五羟色胺再摄取抑制剂(SSRIs)常作为抑郁相关疾病的临床药物，增加患者脑内5-HT的递质水平。
5-HT在孤独症(autism spectrum disorder，ASD)中的作用可以通过脑成像和生物标志分子方法进行检测。成像结果显示，正常儿童在两岁时脑内5-HT合成能力处于顶峰，而同龄的孤独症儿童脑内的5-HT合成水平却检测不到。药理实验中，化合物作用到5-HT2受体或使用SSRIs可以减少ASD儿童的攻击行为和重复刻板行为，从而有效地改善社交意识增加接触。
5-HT能神经元参与多种情绪行为的调节，比如焦虑和恐惧行为。恐惧相关的通路通过传入和传出杏仁核的通路传递信息，而从丘脑和皮层投射到杏仁核的通路，输入信息在杏仁核内部环路中进行处理，最后直接输出到海马、脑干、下丘脑等区域。研究表明通过光遗传和化学遗传方法激活DRN的5-HT能神经元，会引起小鼠的焦虑和恐惧行为。5-HT能够促进杏仁核相关脑区环路。另外，5-HT的输入主要是通过受体的行为进行精确调控。对焦虑的影响涉及从背侧中缝核5-HT能神经元到终纹床核(BNST)的投射。将BNST的5-HT2C受体急性暴露于SSRIs会增加腹侧被盖区VTA和下丘脑外侧区LH的抑制作用，引起厌恶行为。这就解释了为什么在抑郁症患者服用SSRIs药物早期会产生更加焦虑的症状，病情加重。与5-HT能神经元递质失衡相关的精神类疾病较多，致病原因复杂，目前的临床药物作用有限且常有副作用。因此，以细胞重编程或在体转分化技术进行细胞治疗将成为未来可能的选择。
2010年Vierbuchen和同事使用三个转录因子ABM(Ascl1、Brn2、Myt1l)诱导成纤维细胞重编程产生神经元(iNs)。早期一系列的研究表明，重编程可以产生多种类型的神经元，包括谷氨酸能神经元、γ-氨基丁酸能神经元、多巴胺能神经元、胆碱能神经元等。最近的研究也从人的成纤维细胞诱导得到五羟色胺能神经元。但是在体外诱导得到的五羟色胺能神经元是否具有正常的生理功能，能否形成神经网络仍不清楚。
星形胶质细胞与神经元谱系相近，并且在全脑中广泛存在。因此，以星形胶质细胞作为起始细胞在体诱导产生功能性的五羟色胺能神经元，对于研究五羟色胺能神经元在相关疾病与神经调节系统中的作用具有潜在的意义。然而，本领域技术人员至今尚未成功地以星形胶质细胞为起始细胞，诱导产生功能性的五羟色胺能神经元。
发明内容
本发明的目的在于提供诱导星形胶质细胞转分化为五羟色胺能神经元的方法及应用。
在本发明的第一方面，提供一种诱导星形胶质细胞转分化为五羟色胺能神经元的方法，包括：在星形胶质细胞中表达(包括重组表达或过表达)选自下组的转录因子：(a)Ascl1/Mash1，Gata2，Foxa2，Lmx1b和Nkx2.2；或(b)Ascl1/Mash1，Gata2，Foxa2和Lmx1b；培养该细胞，从而所述星形胶质细胞转分化为五羟色胺能神经元。
在本发明的第二方面，提供一种诱导星形胶质细胞转分化为五羟色胺能神经元的方法，包括：(1)在星形胶质细胞中表达(包括重组表达或过表达)以下转录因子：Ascl1/Mash1，Gata2，以及选自Foxa2、Lmx1b和Nkx2.2中的任意两种或三种(最优选地为三种)；(2)在添加化合物的条件下诱导培养(1)的细胞，从而所述星形胶质细胞转分化为五羟色胺能神经元；其中，所述化合物包括：Y27632，PD0332991，神经营养因子GDNF，神经营养因子BDNF，Dorsomorphin，SB431542。
在一个优选例中，所述的Dorsomorphin，SB431542在诱导培养的前9±2天，较佳地前9±1天添加。
在另一优选例中，所述的化合物的终浓度为：Y27632：10±5μM，较佳地10±2μM；PD0332991：1±0.5μM，较佳地1±0.2μM；神经营养因子GDNF：20±10ng/ml，较佳地20±5ng/ml；神经营养因子BDNF：20±10ng/ml，较佳地20±5ng/ml；Dorsomorphin：0.5±0.25μM，较佳地0.5±0.15μM；SB431542：5±2.5μM，较佳地5±1.5μM。
在另一优选例中，诱导培养的培养基中，还包括：B27添加物、血清、上皮生长因子EGF、成纤维细胞生长因子FGF2。较佳地，各组分的终浓度为：血清：按照体积10±5％；较佳地10±2％；上皮生长因子EGF：10±5ng/ml；较佳地10±2ng/ml；成纤维细胞生长因子FGF2：10±5ng/ml；较佳地10±2ng/ml；B27添加物：1±0.5倍量(X)。
在另一优选例中，所述的细胞培养基中，以选自下组的培养基作为基础培养基：DMEM、MEM、RPMI(如RPMI1640)、Neuronal basal或Fischer；较佳地，所述的DMEM选自：DMEM/F12，Advanced DMEM/F12。
在本发明的第三方面，提供由前面任一所述的方法获得的五羟色胺能神经元培养物或从该五羟色胺能神经元培养物中分离纯化的五羟色胺能神经元。
在一个优选例中，所述的五羟色胺能神经元通过在星形胶质细胞中表达前述(b)组的转录因子而获得，其具有下组的性能或特征：呈现不成熟的电生理特性；或所述的五羟色胺能神经元通过在星形胶质细胞中表达前述(a)组的转录因子而获得，其具有下组的性能或特征：呈现成熟的电生理特性，产生复杂的神经元形态和电生理特性；或所述的五羟色胺能神经元通过前述第二方面所述的方法获得，其具有下组的性能或特征：呈现成熟的电生理特性，产生复杂的神经元形态和电生理特性。
在本发明的第四方面，提供所述的五羟色胺能神经元培养物或分离纯化的五羟色胺能神经元的用途，用于：制备预防、改善或治疗神经系统疾病(包括精神类疾病和神经退行性疾病，如神经损伤、孤独症、抑郁症、精神分裂症、恐惧症、帕金森氏症、阿尔兹海默症和脊髓损伤等)的药物；或用于作为体外模型，进行神经系统疾病的模拟及其药物的筛选；或用于制备体内细胞移植的组合物。
在一个优选例中，所述的神经系统疾病及其药物的研究包括：研究药物运输、药物代谢、神经系统形成；或神经元毒性测试、筛选神经元毒性物质、筛选调节神经元功能的物质。
在本发明的第五方面，提供一种药物组合物，其中含有所述的五羟色胺能神经元培养物或分离纯化的五羟色胺能神经元；以及药学上可接受的载体。
在本发明的第六方面，提供一种药盒，其中含有所述的五羟色胺能神经元培养物或分离纯化的五羟色胺能神经元；或含有所述的药物组合物。
在本发明的第七方面，提供用于诱导星形胶质细胞转分化为五羟色胺能神经元的培养基，其包括：Y27632，PD0332991，神经营养因子GDNF，神经营养因子BDNF；较佳地还包括Dorsomorphin，SB431542；更佳地还包括B27添加物，血清，上皮生长因子EGF，成纤维细胞生长因子FGF2。
在一个优选例中，所述组分在培养基中的浓度为：Y27632：10±5μM，较佳地10±2μM；PD0332991：1±0.5μM，较佳地1±0.2μM；神经营养因子GDNF：20±10ng/ml，较佳地20±5ng/ml；神经营养因子BDNF：20±10ng/ml，较佳地20±5ng/ml；Dorsomorphin：0.5±0.25μM，较佳地0.5±0.15μM；SB431542：5±2.5μM，较佳地5±1.5μM；血清：按照体积10±5％；较佳地10±2％；上皮生长因子EGF：10±5ng/ml；较佳地10±2ng/ml；成纤维细胞生长因子FGF2：10±5ng/ml；较佳地10±2ng/ml；或B27添加物：1±0.5倍量(X)。
在另一优选例中，所述的培养基中，以选自下组的培养基作为基础培养基：DMEM、MEM、RPMI(如RPMI1640)、Neuronal basal或Fischers；较佳地，所述的DMEM选自：DMEM/F12，Advanced DMEM/F12。
在本发明的第八方面，提供前面任一所述的培养基的用途，用于诱导星形胶质细胞转分化为五羟色胺能神经元。
在本发明的第九方面，提供用于诱导星形胶质细胞转分化为五羟色胺能神经元的试剂盒，其中含有所述的培养基。
在本发明的第十方面，提供一种试剂盒，其中包括选自下组的转录因子的编码基因、表达盒或表达载体：(a)Ascl1/Mash1，Gata2，Foxa2，Lmx1b和Nkx2.2；或(b)Ascl1/Mash1，Gata2，Foxa2和Lmx1b。
在本发明的第十一方面，提供一种试剂盒，其中包括：Ascl1/Mash1，Gata2，以及选自Foxa2、Lmx1b和Nkx2.2中的任意两种或三种(最优选地为三种)；以及化合物，所述化合物包括：Y27632，PD0332991，神经营养因子GDNF，神经营养因子BDNF，Dorsomorphin，SB431542。
在一个优选例中，所述试剂盒中还包括：B27添加物，血清，上皮生长因子EGF，成纤维细胞生长因子FGF2，基础培养基。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1、星形胶质细胞纯度鉴定。将星形胶质细胞分离纯化并在体外培养，通过不同细胞类型的标志分子染色对其进行鉴定。左图显示，细胞表达星形胶质细胞的标志分子GFAP(上图，绿色)和S100β(下图，红色)，并表现出星形胶质细胞的形态。中图显示，细胞不表达神经元特异性的标志分子Tuj1(上图，红色)和成熟神经元的标志分子Map2(下图，红色)，表明细胞中没有神经元。注：有极少非神经元形态的细胞表达Tuj1。右图显示，细胞不表达少突胶质细胞特异性的标志分子CNPase(上图，红色)和O4(下图，红色)。比例尺＝100μm。
图2、四个转录因子组合MNGF诱导星形胶质细胞转变为神经元。(A，B)GFP(绿色)和Tuj1(红色)双标免疫染色实验显示，感染表达GFP的慢病毒(FUGW)10天后，细胞不表达Tuj1，并显示出胶质细胞的形态(A)；感染表达四个转录因子(Ascl1、Nkx2.2、Gata2、Foxa2)和GFP的慢病毒(MNGF)10天后，细胞表达Tuj1，并显示出神经元的形态(B)。(C，D)GFP(绿色)和Tuj1(红色)双标免疫染色实验显示，感染表达GFP的慢病毒(FUGW)10天后，细胞不表达成熟神经元的标志分子Map2(C)；感染表达四个转录因子(Ascl1、Nkx2.2、Gata2、Foxa2)和GFP的慢病毒(MNGF)10天后，细胞表达Map2蛋白(D)。比例尺＝100μm。
图3、四个转录因子组合MNGF诱导星形胶质细胞转变为五羟色胺能神经元。(A，B)GFP(绿色)和Serotonin(红色)双标免疫染色实验显示，感染表达GFP的慢病毒(FUGW)24天后，细胞不表达Serotonin(A)；感染表达四个转录因子(Ascl1、Nkx2.2、Gata2、Foxa2)和GFP的慢病毒(MNGF)24天后，细胞能够表达Serotonin(B)。箭头指示GFP+，Serotonin+细胞。(C，D)GFP(绿色)和Serotonin(红色)双标免疫染色实验显示，感染表达GFP的慢病毒(FUGW)24天后，细胞不表达TPH(C)；感染表达四个转录因子(Ascl1、Nkx2.2、Gata2、Foxa2)和GFP的慢病毒(MNGF)24天后，细胞能够表达TPH(D)。箭头指示GFP+，TPH+细胞。比例尺＝50μm。
图4、不同转录因子组合诱导星形胶质细胞转变为五羟色胺能神经元。(A)感染表达四个转录因子(Ascl1、Nkx2.2、Gata2、Foxa2)和GFP(绿色)的慢病毒(MNGF)14天后，细胞表达5-HT(红色，A)的典型图(A’)。(B)感染表达三个转录因子(Ascl1、Gata2、Foxa2)和GFP(绿色)的慢病毒(MGF)14天后，细胞表达5-HT(红色，B)的典型图(B’)。(C)感染表达三个转录因子(Ascl1、Nkx2.2、Gata2)和GFP(绿色)的慢病毒(MNG)14天后，细胞表达5-HT(红色，C)的典型图(C’)。(D)感染表达三个转录因子(Nkx2.2、Gata2、Foxa2)和GFP(绿色)的慢病毒(NGF)14天后，细胞表达5-HT(红色，D)的典型图(D’)。(E)感染表达三个转录因子(Ascl1、Nkx2.2、Foxa2)和GFP(绿色)的慢病毒(MNF)14天后，细胞表达5-HT(红色，E)的典型图(E’)。(F)不同组合诱导星形胶质细胞14天产生5-HT能神经元的比例统计。FUGW、MNGF、MGF、MNG、NGF和MNF组，N＝4次独立实验。MN、MG、MF、NG、NF、GF、Mash1、Nkx2.2、Gata2和Foxa2组，N＝3次独立实验。使用单因素方差分析和Dunnett’s后多重比较检验与MNGF组的差异，MGF组与MNGF组相比P<0.05，其他各组与MNGF组相比P<0.0001。比例尺＝50μm。
图5、五羟色胺能神经元报告小鼠的特异性。(A)TPH2-iCreERT2-tdTomato敲入小鼠的构建示意图。将2A-iCreERT2-2A-tdTomato序列插入到小鼠基因组TPH2基因最后一个外显子(E11)之后，3’UTR之前，使得iCreER和tdTomato与TPH2基因构成多顺反子，共同受到TPH2启动子的驱动，三者共标在相同的细胞中。与Flp小鼠杂交实现同源重组，通过Flippase酶去掉Neo筛选基因，得到目的小鼠。(B)原代培养E13.5小鼠神经元10天后，tdT(红色)和TPH(绿色)共标。(C)原代培养E13.5小鼠神经元10天后，tdT(红色)和5-HT(绿色)共标。(D)分析TPH2成年小鼠的特异性。免疫双标实验验证TPH(绿色)和tdT(红色)在中缝核脑片共标。TPH(绿色，D’)、tdT(红色，D”)和合并图(黄色，D”’)是D图白色框中的放大图。(E)分析TPH2成年小鼠的特异性。免疫双标实验验证5-HT(绿色)和tdT(红色)在中缝核脑片共标。5-HT(绿色，E’)、tdT(红色，E”)和合并图(黄色，E”’)是E图白色框中的放大图。(F)定量统计数据显示tdT和Tph共标细胞的百分比(n＝3只小鼠，每只计数330-558个tdT+细胞；n＝3只小鼠，每只计数326-555个Tph+细胞)。(G)定量统计数据显示tdT和5-HT共标细胞的百分比(n＝3只小鼠，每只计数582-813个tdT+细胞；n＝3只小鼠，每只计数564-729个5-HT+细胞)。Aq，导水管；tdT，tdTomato；Hst，Hoechst 33342。在B图和C图中，比例尺＝20μm。在D图和E图中，比例尺＝50μm。
图6、鉴定TPH2小鼠中iCreER在5-HT能神经元中特异性表达。(A)遗传方法跟踪iCreER的表达。在成年TPH2-iCreER-tdT；Rosa-YFP小鼠腹腔注射5天它莫西芬(Tam)，2天后进行免疫组化染色。(B，C，D)在背侧中缝核(DRN)、正中缝核(MRN)和尾端(Caudal)tdT(红色)和YFP(绿色)均能够共标(n＝2只小鼠，每只计数308-351个tdT+细胞)。比例尺＝100μm。
图7、MNGF或SAMNGF诱导产生的5-HT能神经元的电生理特性。(A)TPH2-iCreERT2-tdTomato小鼠的星形胶质细胞在体外感染MNGF转录因子24天后产生tdT+(红色)细胞。箭头指示tdT+的五羟色胺能神经元。(B)SAM(S-A Mash1)是Mash1的磷酸化突变，是一种磷酸化状态的M。SAMNGF代表四个转录因子S-A Mash1、Nkx2.2、Gata2和Foxa2的组合。SAMNGF也能够诱导TPH2-iCreERT2-tdTomato小鼠的星形胶质细胞产生tdT+细胞。记录SAMNGF诱导产生的tdT+细胞的被动膜性质，包括静息膜电位(RMP)、输入膜阻抗(Rm)和细胞膜电容(Cm)(n＝11个tdT+细胞)。误差棒代表平均值±标准误。(C)在电流钳模式下，向SAMNGF体外诱导35天产生的tdT+细胞中，注入500ms去极化电流阶跃，记录细胞的电压反应。注意在35天为单个动作电位(左图，n＝2/11个细胞产生单个动作电位；n＝9/11个细胞无反应活性)，培养44天细胞仍为不成熟的神经元(右图)。比例尺＝50μm。
图8、Lmx1b促进诱导产生的5-HT能神经元的电生理特性的成熟。(A)TPH2-iCreERT2-tdTomato小鼠的星形胶质细胞体外诱导30天后产生tdT+(红色)细胞。(B)在电流钳下，记录MNGF+Lmx1b诱导TPH2-iCreER-tdT小鼠星形胶质细胞30天产生的tdT+细胞，该细胞在给予去极化电流刺激后发放多个动作电位的典型图。(C-E)记录M4、+L和+L+P组诱导的tdT细胞的静息膜电位(RMP)、输入膜阻抗(Rm)和细胞膜电容(Cm)。(F)记录的M4、+L和+L+P组诱导的tdT细胞中不发放、发放单个和发放多个动作电位的细胞个数百分比(M4、+L和+L+P组中分别记录n＝15，47和24个细胞)。(G)在电流钳下注入0-90pA去极化电流阶跃刺激，记录并分析F图每一组中发放多个动作电位细胞的动作电位频率(Spike frequency)曲线(M4、+L和+L+P组中分别记录n＝2，37和9个细胞)。(H)记录的M4、+L和+L+P组诱导的tdT细胞中产生(Spon AP)和不产生(no AP)自发动作电位(Spontaneous AP)的细胞个数百分比(M4、+L和+L+P组中分别记录n＝15，47和24个细胞)。(I)记录的M4、+L和+L+P组诱导的tdT细胞中产生(EPSC)和不产生(no EPSC)兴奋性突触后电流的细胞个数百分比(M4、+L和+L+P组中分别记录n＝15，47和24个细胞)。C-E图中误差棒代表最小值和最大值，盒图代表平均值±标准差。对+L和+L+P组分别与M4组进行双尾t-检验计算显著性，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。M4代表MNGF或S-A Mash1、Nkx2.2、Gata2、Foxa2；+L代表S-A Mash1、Nkx2.2、Gata2、Foxa2、Lmx1b；+L+P代表S-A Mash1、Nkx2.2、Gata2、Foxa2、Lmx1b、Pet1。
图9、转录因子诱导得到的5-HT能神经元与脑内中缝核5-HT能神经元的电生理性质比较。(A)在电流钳下给予500ms去极化电流刺激，记录到的P28-32天TPH2小鼠中缝核脑片中tdT+五羟色胺能神经元的动作电位典型图。右图框显示计算Native组动作电位频率适应性(f-initial/f-final)方法。(B)在电流钳下给予500ms去极化电流刺激，记录到的SAMNGFL五个转录因子诱导41天的tdT+五羟色胺能神经元的动作电位典型图。右图框显示计算iSNs动作电位频率适应性(f-initial/f-final)方法。(C)记录的iSNs组和Native组诱导的tdT细胞中发放单个和发放多个动作电位的细胞个数百分比(iSNs组和Native组分别记录n＝7和11个细胞)。(D)iSNs组和Native组动作电位频率适应性(SFA)比较。(E)iSNs组和Native组细胞静息膜电位(RMP)、输入膜阻抗(Rm)和细胞膜电容(Cm)比较。误差棒代表最小值和最大值，盒图代表平均值±标准差。N.S.代表无显著差异。
图10、诱导得到5-HT能神经元有主动膜特性并能接受周围神经元的输入。(A-B)在电圧钳下给予500ms、10mV电压阶跃刺激，记录到的P28-32天TPH2小鼠中缝核脑片中tdT+五羟色胺能神经元(Native)和五个转录因子SAMNGFL诱导41天的tdT+五羟色胺能神经元(iSNs)的钠电流典型图。(C-D)iSNs发放自发的动作电位(C)和自发的EPSCs(D)的典型图。
图11、化学小分子优化转分化成为5-HT能神经元的培养条件。(A)M5组和M5+SM组三标染色显示GFP(绿色)、tdT(红色)和Tuj1(白色)共标细胞。(B)M5组和M5+SM组tdT+细胞与起始细胞比例统计图。(C)M5组和M5+SM组动作电位频率(Spike frequency)曲线(分别记录n＝47和56个细胞)。(D-F)M5组、M5+SM组和Native组细胞静息膜电位(RMP)、输入膜阻抗(Rm)和细胞膜电容(Cm)的比较。(G-I)M5组、M5+SM组和Native组细胞动作电位复杂度(G，分别记录n＝47、56和11个细胞)、自发动作电位(H，分别记录n＝47、56和21个细胞)和兴奋性突触后电流(I，分别记录n＝47、56和11个细胞)的细胞个数百分比。D-F图中误差棒代表最小值和最大值，盒图代表平均值±标准差。使用双因素方差分析检验计算显著性，N.S.表示差异不显著。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。比例尺＝100μm。
图12、诱导的5-HT能神经元表达成熟神经元和5-HT能神经元特异性的标志分子。(A-D)M5+SM诱导tdT+细胞(红色)与神经元的标志分子Tuj1(A，白色)、成熟神经元的标志分子Map2(白色，B)、NeuN(白色，C)和突触的标志分子Synapsin I(白色，D)共标。(E-F)M5+SM诱导tdT+细胞与5-HT合成的限速酶TPH(白色，E)和神经递质5-HT(白色，F)共标。比例尺＝20μm。
图13、不同因子对诱导的5-HT能神经元效率的影响。(A)六种组合(M5、-Nkx2.2、-Lmx1b、-Foxa2、-Gata2、-SAM)在体外诱导30天产生的tdT+(红色)、Tuj1+(白色)细胞典型图。(B)六种组合和对照组诱导的tdT+细胞与起始细胞比例统计图。(C)六种组合和对照组诱导的tdT或Tuj1与GFP的比例统计图。比例尺＝20μm。
图14、不同因子对诱导得到的5-HT能神经元的电生理性质的影响。(A-C)比较M5组、-N组、-F组、-L组和Native组细胞静息膜电位(RMP，A)、输入膜阻抗(Rm，B)和细胞膜电容(Cm，C)。(D-F)比较M5组、-N组、-F组、-L组和Native组细胞动作电位复杂度(D，分别记录n＝46、30、10、18和11个细胞)、自发动作电位(E，分别记录n＝47、30、10、18和21个细胞)和兴奋性突触后电流(F，分别记录n＝43、30、10、18和11个细胞)的细胞个数百分比。(G)比较M5组、-N组、-F组和-L组细胞动作电位频率(Spike frequency)曲线(分别记录n＝37、19、7和2个细胞)。(H)比较M5组、-N组、-F组和-L组细胞的I-V曲线(分别记录n＝46、30、10和18个细胞)。(I-L)G图中各组细胞动作电位频率曲线的分离表示图。(M-P)H图中各组细胞的I-V曲线分离表示图。误差棒表示平均值±标准误。使用双因素方差分析检验计算显著性，N.S.表示差异不显著。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
图15、诱导过程没有经过前体细胞阶段。(A)BrdU掺入实验示意图。(B)诱导的tdT+细胞中与BrdU共标统计图。(C-D)BrdU在0-24天(C)或3-24天(D)掺入，体外培养24天后检测tdT(红色)与BrdU(白色)的共标情况。(E)体外诱导24天的tdT+(红色)细胞与Ki67(白色)不共标。比例尺＝50μm。
图16、在含有小分子培养条件下，不同因子对5-HT能神经元诱导效率的影响。(A)在含有小分子培养条件下，六种组合(M5+SM、-Nkx2.2、-SAM、-Gata2、-Foxa2、-Lmx1b)在体外诱导30天产生的tdT+(红色)、Tuj1+(白色)细胞典型图。(B)在含有小分子培养条件下，六种组合和对照组诱导的tdT+细胞与起始细胞的比例统计图。(C)在含有小分子培养条件下，六种组合和对照组诱导的tdT或Tuj1与GFP的比例统计图。比例尺＝20μm。
图17、在含有小分子培养条件下，不同因子对诱导得到的5-HT能神经元的电生理性质的影响。(A-C)在含有小分子培养条件下，比较Ctrl(M5+SM)组、-N组、-F组、-L组和Native组细胞的静息膜电位(RMP，A)、输入膜阻抗(Rm，B)和细胞膜电容(Cm，C)。(D-F)在含有小分子培养条件下，比较Ctrl(M5+SM)组、-N组、-F组、-L组和Native组细胞动作电位复杂度(D，分别记录n＝56、11、8、12和11个细胞)、自发动作电位(E，分别记录n＝56、11、8、12和21个细胞)和兴奋性突触后电流(F，分别记录n＝55、11、8、12和11个细胞)的细胞个数百分比。(G)在含有小分子培养条件下，比较M5组、-N组、-F组和-L组细胞动作电位频率(Spikefrequency)曲线(分别记录n＝49、11、7和12个细胞)。(H)比较M5组、-N组、-F组和-L组细胞的I-V曲线(分别记录n＝49、11、7和12个细胞)。(I-L)G图中各组细胞动作电位频率曲线的分离表示图。(M-P)H图中各组细胞的I-V曲线分离表示图。误差棒表示平均值±标准误。使用双因素方差分析检验计算显著性，N.S.表示差异不显著。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
图18、比较不同转录因子组合诱导得到的5-HT能神经元的效率和电生理特性。(A)M5+SM组、Gage’s(MNGLP+Ngn2)组和MFLP+SM组体外诱导30天产生的tdT+(红色，上图)和Merge(tdT/Tuj1/GFP/Hoechst，下图)细胞典型图。(B)比较M5+SM组、Gage’s(MNGLP+Ngn2)组和MFLP+SM组诱导的tdT+细胞与起始细胞比例统计图。(C-E)比较M5+SM组、Gage’s(MNGLP+Ngn2)组和Native组诱导的tdT+细胞的静息膜电位(RMP，C)、输入膜阻抗(Rm，D)和细胞膜电容(Cm，E)。(F)比较M5+SM组、Gage’s(MNGLP+Ngn2)组和Native组诱导的tdT+细胞的动作电位复杂度(分别记录n＝56、15和11个细胞)。(G)比较M5+SM组、Gage’s(MNGLP+Ngn2)组诱导的tdT+细胞的动作电位频率(Spike frequency)曲线。(H-I)比较M5+SM组、Gage’s(MNGLP+Ngn2)组和Native组诱导的tdT+细胞的自发动作电位(H，分别记录n＝56、15和21个细胞)和兴奋性突触后电流(I，分别记录n＝55、15和11个细胞)的细胞个数百分比。误差棒表示平均值±标准误。
图19、诱导得到的5-HT能神经元能够释放5-HT。HBSS或高钾(56mM)刺激诱导的5-HT能神经元20分钟后胞外5-HT(左图)和5-HIAA(中图)的浓度(n＝3次独立实验)。不刺激(No light)或蓝光刺激(Blue light)诱导的5-HT能神经元30分钟后胞外5-HT(右图)的浓度(n＝1次独立实验)。诱导的5-HT能神经元表达hChR2，因此蓝光特异性激活诱导的5-HT能神经元。误差棒表示平均值±标准误。使用双尾t-检验计算p值。**P<0.01。
图20、光刺激特异性激活诱导得到的5-HT能神经元能够使其释放5-HT。(A)TPH2-iCreER-tdT小鼠与Ai32(Rosa-Loxp-Stop-Loxp-hChR2(H134R)/EYFP)小鼠交配得到TPH2-hChR2(H134R)/EYFP-tdT后代(TPH2；Ai32)小鼠。(B)检测5-HT释放的刺激方式示意图。诱导的5-HT能神经元表达ChR2/EYFP和tdT，作为突触前神经元，能够被蓝光刺激激活。来源于Htr3a-GFP转基因小鼠的原代神经元作为突触后神经元，具有5-HT受体，能够接收5-HT的输入。(C)五个转录因子加小分子(F5+SM)诱导TPH2；Ai32小鼠的星形胶质细胞产生5-HT能神经元。培养体系中加入4-羟基它莫西芬(OHT)诱导iCre入核，使诱导的5-HT能神经元特异性标记ChR2(H134R)/EYFP。原代Htr3a-GFP神经元与诱导的5-HT能神经元进行共培养。(D-E)在电流钳模式下，蓝光(470nm)脉冲激活ChR2(H134R)/EYFP+(绿色)、tdT+(红色)双阳性的5-HT能神经元(E)，产生动作电位(n＝19/19个细胞)。(F-G)在电压钳模式下，钳制电位-70mV，蓝光(470nm)脉冲激活GFP+(绿色)、tdT-(红色)细胞(G)，产生光诱导的突触后电流(Light-evoked PSCs)，加入5-HT3a受体拮抗剂Ondansetron后电流减小。
图21、移植到成年小鼠皮层的5-HT能神经元少量能够在体内存活。(A)TPH2小鼠的星形胶质细胞感染表达S-A Mash1、Nkx2.2、Gata2、Foxa2、Lmx1b和GFP的慢病毒，诱导的神经元移植到NOD-SCID成年小鼠皮层。移植21天后能够检测到GFP(绿色)和tdT(红色)共标的细胞，表明移植的5-HT能神经元能够存活。(B)A图中箭头所指的放大图，箭头指示GFP(绿色)和tdT(红色)共标的细胞。(C)大部分移植细胞死亡，但仍能找到GFP(绿色)、5-HT(白色)和tdT(红色)共标细胞存在。
图22、移植到脑室的神经元能够在体内存活。星形胶质细胞感染表达S-A Mash1、Nkx2.2、Gata2、Foxa2、Lmx1b和GFP的慢病毒，诱导的神经元移植到P1小鼠脑室。移植7天后能够在脑室(A)、远离脑室区(B)和移植14天后在脑室周围(C)检测到GFP(绿色)和NeuN(红色)共标的细胞，表明移植的神经元能够存活。在A-C图中，比例尺＝50μm。在A’-A”’中，比例尺＝20μm。
图23、移植到脑室的神经元表达5-HT特异性标志分子。星形胶质细胞感染表达S-AMash1、Nkx2.2、Gata2、Foxa2、Lmx1b和GFP的慢病毒，诱导的神经元移植到P1小鼠脑室。(A-C)移植14天后能够在脑室周围(A)和远离脑室区(B)检测到GFP(绿色)、5-HT(白色)和NeuN(红色)共标的细胞，以及能够检测到GFP+(绿色)、5-HT+(白色)和NeuN-(红色)的细胞(C)。(D)移植14天后能够在脑室周围检测到GFP(绿色)、TPH(白色)和NeuN(红色)共标的细胞，表明移植的5-HT能神经元能够存活。Aq指导水管；LV指侧脑室。
图24、移植到脑室的iSNs具有成熟的神经元活性。(A)移植到脑室内2个月的GFP阳性细胞能够存活并且与TPH(红)和NeuN(白)共标。箭头指示共标的细胞。(B)移植到脑室内2个月的GFP阳性细胞能够与5-HT(红)共标。箭头指示共标的细胞。(C)细胞注射到脑内2个月后以GFP与起始细胞的比率作为存活率，得到统计图。(D)统计数据显示移植2个月后TPH与GFP的比率。(E)在移植后5周和7周分别统计发放多个(红)、单个(灰)或没有(黑)动作电位的细胞个数。(F)移植2个月后注入电流阶跃刺激移植细胞产生动作电位。(G)移植2个月后在小鼠脑片中记录到移植细胞产生的钠电流。
具体实施方式
本发明揭示了一种利用不同转录因子组合在体外诱导星形胶质细胞直接重编程产生有功能的五羟色胺能神经元的方法，将得到的这些神经元移植到脑内能够存活。使用的转录因子组合包括Ascl1、Nkx2.2、Gata2、Foxa2、Lmx1b的组合以及在此基础上减一的转录因子组合。加入化学小分子可以进一步提高产生五羟色胺能神经元的效率和成熟程度。利用本发明的方法产生的五羟色胺能神经元，可以用于细胞再生，并可用于开发多种神经系统疾病的预防、改善或治疗药物。
如本发明所用，术语“含有”或“包括”包括了“包含”、“主要由……构成(制成)”、“基本上由……构成”和“由……构成”。
除非另外说明，本发明中培养或诱导的对象为星形胶质细胞。
培养方法
神经细胞的定向分化的难点在于：①定向分化效率低；②分化的目的细胞纯度低，难于富集；③分化的细胞的真实性。本发明人针对这些难题，对星形胶质细胞向五羟色胺能神经元的转分化进行了深入探索和优化，成功获得含高比例的五羟色胺能神经元的群体，并通过分析确证了所获得的神经元细胞的真实性。
本发明公开了诱导星形胶质细胞转分化为五羟色胺能神经元的方法，包括：在星形胶质细胞中表达选自下组的转录因子：(a)Ascl1/Mash1，Gata2，Foxa2，Lmx1b和Nkx2.2；或(b)Ascl1/Mash1，Gata2，Foxa2和Lmx1b；培养该细胞，从而所述星形胶质细胞转分化为五羟色胺能神经元。
本发明还公开了在上段方法基础上部分因子变化的另一种诱导星形胶质细胞转分化为五羟色胺能神经元的方法，包括：(1)在星形胶质细胞中表达(包括重组表达或过表达)以下转录因子：Ascl1/Mash1，Gata2，以及选自Foxa2、Lmx1b和Nkx2.2中的任意两种或三种；(2)在添加化合物的条件下诱导培养(1)的细胞，从而所述星形胶质细胞转分化为五羟色胺能神经元；其中，所述化合物包括：Y27632，PD0332991，神经营养因子GDNF，神经营养因子BDNF，Dorsomorphin，SB431542。
作为本发明的优选方式，所述的Dorsomorphin，SB431542在诱导培养的前9±2天，较佳地前9±1天添加。
本发明人发现，五个转录因子的组合(Ascl1/Mash1，Gata2，Foxa2，Lmx1b和Nkx2.2)能够诱导星形胶质细胞重编程产生功能性的五羟色胺能神经元。诱导产生的五羟色胺能神经元表达特异性的标志分子，能够产生动作电位和自发的突触后电流，具有与体内中缝核五羟色胺能神经元类似的电生理特性。这些细胞能够释放五羟色胺(5-HT)并作用到突触后神经元，整合到神经环路中发挥功能。化学小分子能够促进诱导得到的五羟色胺能神经元的成熟。移植到小鼠体内的五羟色胺能神经元可以存活，同时表达五羟色胺能神经元特有的标志分子。从星形胶质细胞直接重编程产生五羟色胺能神经元对于研究神经元的发育及转分化获得特定亚型神经元的机制具有重要意义，并且为精神类疾病模型的建立以及临床药物的筛选打下了良好的基础。
本发明人发现，四个转录因子的组合(Ascl1/Mash1，Gata2，Foxa2和Lmx1b)可以诱导小鼠星形胶质细胞产生五羟色胺能神经元，而其在复杂程度、成熟程度不同于五个转录因子的组合的诱导结果。
本发明所述的转录因子(或其编码基因)的突变体或衍生物也可被用于本发明中，只要所述突变体或衍生物保留了所述转录因子的相同的生物学功能或活性。在本发明的提示下，所述的转录因子或其编码基因的突变体或衍生物是本领域人员易于获得和应用的。
使细胞过表达外源基因(在本发明中为转录因子)的方法是本领域技术人员所熟知的。编码转录因子的多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的病毒(如慢病毒、腺病毒、逆转录病毒)、细菌质粒、噬菌体、酵母质粒或其他载体。只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。包含编码转录因子的多核苷酸序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化细胞，以使其能够表达所述的转录因子。
如前所述，可将所述的转录因子的编码基因引入到细胞中，使得细胞内过表达所述的转录因子。另外，也可将转录因子蛋白外源表达后，与细胞共培养而使得转录因子蛋白进入到细胞内。一种可选择的方式例如：将转录因子蛋白与细胞穿透肽融合，由细胞穿透肽介导进入到细胞中。所述的“细胞穿透肽”是指一类具有细胞穿透作用的多肽，其自身或其与其它蛋白的融合蛋白可通过细胞膜进入到细胞内。所述的细胞穿透肽包括：反式激活蛋白(TAT)、Penetratin、基于信号序列的肽、pVEC、Transportan、Amphiphilic modelpeptide和Arg9等。
在本发明的具体实施方式中，本发明制备了TPH2-iCreERT2-tdTomato基因敲入小鼠，为诱导产生特异性的五羟色胺能神经元的研究提供了便利。红色荧光tdTomato能够特异性地记录诱导产生的五羟色胺能神经元的电生理特性，而iCreERT2元件的敲入便于将其与Ai32光遗传工具鼠杂交，通过光遗传的手段特异性激活这些五羟色胺能神经元，来详细分析该细胞的特性以及在神经环路中可能发挥的功能。
一系列结果表明，诱导星形胶质细胞产生的五羟色胺能神经元表达5-HT特异的标志分子，具有成熟的电生理特性，与体内中缝核五羟色胺能神经元的电生理性质一致。同时，这些神经元能够释放5-HT，它们作用到突触后神经元的受体上与其形成神经联系。进一步的研究显示，转分化得到的五羟色胺能神经元移植到动物体内能够存活。
运用本发明的培养方法，可以通过二维或三维培养体系培养和诱导，使得星形胶质细胞转分化为五羟色胺能神经元。
本发明的方法所获得的五羟色胺能神经元可冻存、复苏、传代、长时间维持培养。此外，还应理解，本发明中作为起始细胞的星形胶质细胞，可以为生物体分离的原代细胞，或者可以为建系的星形胶质细胞。
本发明的方法，与传统使用干细胞或iPS细胞诱导得到五羟色胺能神经元的方法相比，所需时间更短，与使用成纤维细胞诱导的方法相比，在体使用当地星形胶质细胞进行诱导也会更加方便、高效。
培养基
本发明人提供了用于诱导星形胶质细胞转分化为五羟色胺能神经元的培养基，其包括：Y27632，PD0332991，神经营养因子GDNF，神经营养因子BDNF；较佳地还包括Dorsomorphin，SB431542；更佳地还包括B27添加物，血清，上皮生长因子EGF，成纤维细胞生长因子FGF2。
上述具体列举的成分的类似物、同功能蛋白(如生长因子的同功能蛋白)或化合物、诱导相同靶点的等效化合物、类似物、衍生物和/或它们的盐、水合物或前体，也可用于替换上述具体列举的成分，以实现同样的技术效果。这些类似物、同功能蛋白或化合物也应被包含在本发明中。化合物的类似物包括但不限于：化合物的异构体、外消旋体。所述的“盐”包括但不限于：(1)与如下无机酸形成的盐：如盐酸、硫酸、硝酸、磷酸等；(2)与如下有机酸形成的盐，如乙酸、草酸、丁二酸、酒石酸、甲磺酸、马来酸、或精氨酸等。其它的盐包括与碱金属或碱土金属(如钠、钾、钙或镁)形成的盐等。所述的“化合物的前体”指当用适当的方法施用或处理后，该化合物的前体在培养基中可转变成上述任一化合物的一种化合物，或上述任一化合物的一种化合物所组成的盐或溶液。
作为本发明的可选方式，所述的培养基中还加入用于预防细胞培养的细菌污染，特别是革兰氏阳性和阴性细菌污染的成分，例如加入青链霉素。
所述的基础细胞培养基可以是但不限于：DMEM/F12、MEM、DMEM、RPMI1640、Neuronal basal或Fischers等。应理解，本领域技术人员熟悉所述的基础细胞培养基的配制或购买途径，因此，基础细胞培养基并不限于本发明中所举例的这些。
本发明还提供了一种试剂盒，其中含有本发明所述的培养基。较佳地，所述试剂盒中还包含使用说明书，从而便于本领域人员在研究中或在临床上应用。
培养的五羟色胺能神经元及组合物
基于本发明的新发现，提供了一种由本发明所述的方法获得的五羟色胺能神经元培养物或从该五羟色胺能神经元培养物中分离纯化的五羟色胺能神经元。
从细胞培养物中富集或分离纯化细胞的方法也是本领域人员熟知的，例如可基于五羟色胺能神经元的特定形态特征来进行富集；或基于五羟色胺能神经元所表达的特殊蛋白或分子标记来选择收集(例如采用特异性抗体或配体)。
本发明培养的五羟色胺能神经元有着多方面的用途。包括但不限于：用于制备预防、改善或治疗神经系统疾病(包括精神类疾病和神经退行性疾病，如神经损伤、孤独症、抑郁症、精神分裂症、恐惧症、帕金森氏症、阿尔兹海默症和脊髓损伤等)的药物；用于作为体外模型，进行神经系统疾病及其药物的研究；用于制备体内细胞移植的组合物。其中，所述的神经系统疾病及其药物的研究包括单不限于：研究药物运输、药物代谢、神经系统形成；或神经元毒性测试、筛选神经元毒性物质、筛选调节神经元功能的物质。
在需要的情况下，本发明培养的五羟色胺能神经元还可进一步被应用于基因工程重组，形成重组的细胞，例如为了赋予细胞进一步的功能或特征，在细胞中转入外源的基因表达盒，或对细胞的基因组进行基因敲除或基因编辑等。
本发明还提供了一种组合物(药物)，所述组合物含有：有效量的所述的五羟色胺能神经元(如1×104-1×1012个；较佳的1×105-1×1010个)；以及药学上可接受的载体。其含有有效量的所述的五羟色胺能神经元以及药学上可接受的载体。所述的组合物对于动物没有可见的毒性和副作用。
所述“有效量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。所述“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。该术语指这样一些药剂载体：它们本身并不是必要的活性成分，且施用后没有过分的毒性。合适的载体是本领域普通技术人员所熟知的。在组合物中药学上可接受的载体可含有液体，如水、盐水、缓冲液。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如填充剂、润滑剂、助流剂、润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。所述的载体中还可以含有细胞转染试剂。
本发明还提供了一种药盒，其中含有本发明培养的五羟色胺能神经元或含有该五羟色胺能神经元的组合物或培养物。较佳地，所述药盒中还包含使用说明书，从而便于本领域人员在研究中或在临床上应用。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
I.材料和方法
1、实验动物
Tph2-iCreERT2-tdTomato基因敲入小鼠由北京百奥赛图基因生物技术有限公司制备。在Tph2基因的最后一个外显子(Exon 11)之后、终止密码子(Stop codon)之前，插入2A-iCreERT2-2A-tdTomato片段，构建TPH2-iCreERT2-tdTomato定点基因敲入小鼠。诱导iCreERT2(improved CreER)可以对药物它莫西芬(Tamoxifen，Tam)或4-羟基它莫西芬(4-Hydroxytamoxifen，4-OHT或OHT)响应。该小鼠基因组中带有新霉素抗性基因Neo用于构建过程中的筛选。通过和Flp工具鼠交配，去掉Neo基因，获得实验所用TPH2-iCreERT2-tdTomato基因敲入小鼠，即TPH2小鼠。TPH2小鼠与Ai32小鼠杂交，取材后的细胞用于诱导实验。在诱导细胞中给予4-OHT诱导iCre酶入核发挥作用，使光敏感蛋白表达，用于光遗传学实验。Flp小鼠为已知工具鼠。实验所用YFP小鼠(Jackson Stock No:006148；R26R-Stop-YFP mice)、DTA小鼠(Jackson Stock No:009669；ROSA-DTA mice)和Ai32小鼠(JacksonStock No:024109；RCL-ChR2(H134R)/EYFP mice)购自Jackson实验室，基因型鉴定所用PCR引物和反应体系参考Jackson实验室提供的方法。转基因小鼠Htr3a-GFP来自美国MMRRC公司(StockNo:000273-UNC)，该小鼠用于诱导得到的五羟色胺能神经元与原代胚胎期Htr3a-GFP小鼠神经元的共培养实验。野生型C57/BL6小鼠购自上海斯莱克或灵畅动物有限公司。免疫缺陷型(non-obese diabetic severe combined immunodeficiency，NOD-SCID)小鼠用于细胞移植实验，购自上海斯莱克或灵畅动物有限公司。
2、质粒构建
(1)慢病毒(Lentivirus)质粒
将每个目的基因从质粒或小鼠cDNA中用PCR扩增出来，通过酶切位点EcoRI和BamHI装载到pIRES-EGFP载体上，再通过XbaI和NheI将Gene-IRES-EGFP装载到FUGW载体中。使用FUGW空载体病毒作为阴性对照。将IRES-EGFP从构建的Gene-IRES-FUGW载体中切去，得到不包含GFP的慢病毒载体Gene-FUW。
(2)腺相关病毒(AAV)质粒
使用酶切位点BamHI和AgeI将目的基因装载到星形胶质细胞启动子驱动的hGFAP-mCherry-AAV载体或截短的hGFAP启动子ABC1D-mCherry-AAV载体上。
(3)光遗传质粒
将hChR2(H134R)-EYFP从pAAV-hChR2(H134R)-EYFP载体中克隆下来，装载到不包含GFP的慢病毒载体FUW中，得到hChR2(H134R)-FUYW。
表1、转录因子
慢病毒包装纯化根据现有技术的方法。
重组AAV血清型8型，由SBO医疗生物公司包装。
3、星形胶质细胞分离与培养
星形胶质细胞的分离和原代培养如下：取出生后5到7天(P5-7)的小鼠中脑背侧组织，分离后使用0.25％的胰蛋白酶消化20分钟。吹打离心并使用含有10％胎牛血清(FBS)的DMEM/F12培养基重悬，种到25cm2的培养瓶中放入37℃培养箱培养。第二天换液，后续每3天换液。7到9天后，220rmp，37℃摇晃过夜去除少突胶质细胞。将留下的星形胶质细胞换上胶质培养基培养，胶质培养基的成分：DMEM/F12+10％FBS+青霉素/链霉素+B27(商品B27为50x，使用时工作浓度为1x)+10ng/ml上皮生长因子EGF+10ng/ml成纤维细胞生长因子FGF2。在合适的密度将星形胶质细胞细胞冻存到液氮中备用。重新铺板前神经元标志物Tuj1不会被检测出的星形胶质细胞用于后续诱导实验。
4、诱导星形胶质细胞成为五羟色胺能神经元
将冻存的星形胶质细胞从液氮中取出，使用上述胶质培养基复苏培养。在24孔板中铺玻片并使用多聚赖氨酸PDL处理过夜，加入laminin处理2-4小时。将星形胶质细胞种到24孔板2-4小时后，加入带有不同转录因子的慢病毒FUGW进行感染。第二天和第四天换成诱导培养基(DMEM/F12+B27+PS)培养。每三天半量换液，在诱导培养基中加入20ng/mL BDNF用于之后的培养。
5、全细胞膜片钳记录
记录时使用充灌内液的硼硅酸盐玻璃微电极钳制带有红色荧光tdTomato的细胞，内液成分为(单位mM)：130K-gluconate，20KCl，10HEPES，0.2EGTA，4Mg2ATP，0.3Na2GTP，10Na2-phosphocreatine。使用KOH调节pH至7.3，渗透压调节在290-310mOsm范围内。外液使用标准人工脑脊液(aCSF)，成分为(单位mM)：125NaCl，3KCl,2CaCl2，2MgSO4，1.25NaH2PO4，1.3Na-ascorbate，0.6Na-pyruvate，26NaHCO3，11glucose。调节pH至7.4。电极电阻在3-6MΩ。在电压钳模式下，给予细胞从-110mV到+60mV，每次10mV的电压阶跃刺激，刺激时长500ms，记录电流信号。在电流钳模式下，给予细胞时长为500ms的电流阶跃刺激，记录电压变化。在电压钳模式下钳制在-70mV记录自发的兴奋性突触后电流(sEPSC)。使用药物CNQX(10μM)和D-APV(50μM)阻断sEPSC。电信号通过放大器Axon MultiClamp 700A(MolecularDevices)进行放大，滤波2-10kHz(低通滤波)，通过数模转换器(Digidata 1322A；Molecular Devices)转换为20-100kHz的数字信号，通过安装在电脑上的数据采集软件pClamp 9.2(Molecular Devices)采集数据。数据分析使用Clampfit 10.3、Excel、MATLAB(MathWorks)、Graphpad Prism 6软件进行。
6、细胞移植
将诱导培养的神经元吸去培养基，用PBS洗一次，加入Accutase消化酶(Invitrogen，#A1110501)，37℃消化，每5分钟轻轻拍打孔板或皿壁。轻轻吹打消化好的细胞，可用PBS洗一遍孔板，将细胞转移到15ml管中，1100g离心3分钟弃上清，使用培养基重悬。重悬的细胞置于冰上，用于细胞移植。
7、小鼠脑立体定位
使用腹腔注射氯胺酮(100mg/kg)/赛拉嗪(10mg/kg)或水合氯醛麻醉C57BL/6小鼠或NOD-SCID免疫缺陷型小鼠。使用硼硅酸盐玻璃管拉制注射电极，尖端开口直径在18-20μm范围。根据小鼠脑图谱注射细胞，移植到小鼠皮层、纹状体、中脑。皮层坐标为：AP，-1.25mm；ML，1.4mm；DV，-1.25mm，与冠状切平面的中线呈90度夹角。纹状体坐标为：AP，1.0mm；ML，±2.0mm；DV，-3.0mm。中脑坐标为：AP，-3.3和-4.1mm；ML，0.5mm；DV，-1.0mm。每次注射后，电极在组织中停留10分钟，然后再缓慢拔出组织。P1小鼠脑室位置根据Kim，J.Y.，et al.，Eur JNeurosci，2013.37(8):p.1203-20中的坐标进行细胞注射。
8、小鼠灌流及包埋
腹腔注射戊巴比妥钠，待小鼠昏迷后进行心脏灌流：
a.注射器针筒吸入4％PFA，套上蝴蝶针胶管，轻弹并排尽气泡；
b.大头针固定小鼠四肢于泡沫板上，显微镜下剪开胸腔，并暴露心脏；
c.右手持蝴蝶针，插入左心室；左手持尖头镊，夹破右心房后，左手推动注射器活塞。血液经体循环后，可见血液被PFA置换出来；
d.灌流完毕，以躯干四肢僵硬、全身(除肝脏)发白为最佳效果。可取全脑，或截取出目的器官，置于4％PFA中4℃后固定。
固定结束后，用PBS清洗三次，3×10分钟。用PBS配20％蔗糖溶液4℃脱水。将脑放入包埋模具中，吸去残余的蔗糖溶液，倒入OCT胶至脑被覆盖完全，平衡10-30分钟后，将模具放在干冰上，待包埋块完全冻上后，从模具中敲出。包埋块于-80℃中保存。冰冻切片将脑片贴在处理好的玻片上，进行脑片免疫组化或于-20℃中保存备用。
9、脑片免疫组化染色
脑片免疫组化方法除一抗过夜孵育外严格按照Huang，T.，et al.，J Mol CellBiol，2010.2(3):p.152-63的方法。
实施例1、筛选转录因子诱导产生五羟色胺能神经元
1、分离纯化星形胶质细胞
为了诱导星形胶质细胞重编程产生五羟色胺能神经元，本发明人将一系列与中枢神经系统中五羟色胺能神经元发育相关的转录因子(Ascl1、Nkx2.2、Gata2、Gata3、Foxa2、Lmx1b、Pet1、Insm1、Sim1)作为候选基因克隆到慢病毒载体上。转录因子均通过FUGW慢病毒载体上的广泛启动子Ubiquitin启动子驱动表达。单独表达报告基因EGFP的FUGW载体作为对照组。取材出生后5天(Postnatal day 5，P5)小鼠中脑背侧的星形胶质细胞，进行分离纯化，用作转录因子诱导产生5-HT能神经元的起始细胞。通过星形胶质细胞特异性的标志分子GFAP和S100β的免疫荧光染色检测起始细胞的纯度(图1)。这些细胞中分别有约85％和97％的细胞表达GFAP和S100β(表2)。针对神经元的标志分子Tuj1(βIII-Tubulin)和成熟神经元标志分子Map2的免疫染色结果显示，起始细胞中二者均不表达(图1和表2)。这表明分离纯化的起始细胞是不含神经元的星形胶质细胞。同时，在起始细胞中没有检测到神经前体细胞的标志分子Sox2、少突胶质细胞的标志分子O4、CNPase，以及小胶质细胞的标志分子IbaI的表达(图1和表2)。这些结果显示，该起始细胞为较高纯度的星形胶质细胞，这些细胞可以用于五羟色胺能神经元的诱导实验。
表2、鉴定星形胶质细胞的纯度特性
| 细胞型 | 蛋白染色 | 星形细胞鉴定 |
| 星形胶质细胞 | GFAP | ～85％ |
| S100β | ～97％ | |
| 神经元 | Tuj1 | <0.1％非神经元形态 |
| Map2 | / | |
| 前体 | Sox2 | / |
| 少突细胞 | O4 | / |
| CNPase | / | |
| 小胶质细胞 | IbaI | / |
2、四个转录因子诱导产生五羟色胺能神经元
本发明人将带有不同转录因子的慢病毒混合，感染星形胶质细胞，换成无血清的神经元培养基进行诱导。在感染后10-30天，通过对神经元和5-HT特异性蛋白的抗体染色，筛选能够诱导产生5-HT能神经元的因子组合。首先本发明人发现，四个转录因子的组合MNGF(Ascl1/Mash1、Nkx2.2、Gata2、Foxa2)能够将小鼠中脑背侧的星形胶质细胞转分化成为五羟色胺能神经元。感染MNGF慢病毒的星形胶质细胞在体外培养10天能够表达神经元标志分子Tuj1(图2B)和成熟的神经元标志分子Map2(图2D)，而感染FUGW的对照组细胞不表达Tuj1(图2A)和Map2(图2C)，并仍保留星形胶质细胞的形态。本发明人发现，单独Ascl1诱导的细胞能够表达神经元的标志分子Tuj1，而FUGW对照组中Tuj1的表达为阴性，同时Ascl1/Mash1诱导得到的神经元能够表达成熟神经元的标志分子Map2(Ascl1单独诱导不产生5-HT)，FUGW对照组中不表达Map2。而本发明人使用四个转录因子MNGF(其中含有Ascl1/Mash1)诱导星形胶质细胞，发现在体外诱导10天，能够得到神经元的标志分子Tuj1+、Map2+的细胞(图2)，表明四个转录因子的组合MNGF能够成功诱导星形胶质细胞产生神经元。
接下来本发明人进行5-HT特异性标志分子的染色。结果发现，四个转录因子MNGF能够诱导得到5-HT阳性的神经元(图3B)。同时，诱导得到的神经元也能够表达五羟色胺能神经元特异性的标志分子色氨酸羟化酶TPH(图3D)。TPH是体内5-HT合成的限速酶，表明诱导的细胞具备合成5-HT神经递质的基本条件。在感染FUGW的对照组中则未检测到5-HT或TPH的信号(图3A，C)。因此，通过体外细胞免疫荧光染色对不同转录因子组合进行筛选，本发明人发现了四个转录因子Ascl1、Nkx2.2、Gata2、Foxa2的组合(MNGF)能够诱导星形胶质细胞产生五羟色胺能神经元。
3、分析四个转录因子是否为诱导所必需
四个转录因子Mash1、Nkx2.2、Gata2、Foxa2的组合能够诱导星形胶质细胞转分化为5-HT能神经元。为了研究诱导过程中是否每个转录因子都为必需，本发明人在四个因子的基础上依次减去不同的转录因子，得到多种组合。在体外培养14天后，对不同组合诱导的细胞进行免疫荧光染色。通过统计5-HT阳性细胞与GFP阳性细胞的比例，得到5-HT能神经元的诱导效率。MNGF组感染病毒的细胞中有6.01±3.00％的细胞为5-HT阳性细胞(图4A，F)。在MNGF的基础上减掉因子能够不同程度地降低5-HT能神经元的诱导效率(图4B-F)。其中减去Nkx2.2的MGF组合5-HT的诱导效率显著降低，为3.26±1.63％，但降低的程度最小(图4B，F)；减去Foxa2的MNG组合5-HT的诱导效率极显著降低，为1.51±0.75％(图4C，F)。MGF和MNG组合中诱导得到的5-HT细胞效率降低，但仍为神经元形态(图4B，C)，而减去Mash1的NGF组合中，不仅5-HT细胞效率降低至1.44±0.72％，并且这些5-HT细胞并无神经元形态(图4D，F)；减去Gata2的MNF组合中，5-HT细胞效率在这四组(MGF、MNG、NGF、MNF)中降低的最为显著，仅为0.49±0.24％(图4E，F)，这显示了Gata2对于5-HT特异性分子诱导的重要性。进一步减因子的实验结果显示，在剩余的所有组合中(MN、MG、MF、NG、NF、GF、Mash1、Nkx2.2、Gata2、Foxa2)，仅在含有Gata2因子的MG、GF、Gata3三个组合中，检测到5-HT阳性细胞的出现，这进一步提示在细胞命运转变过程中，Gata2对于特定递质5-HT诱导的关键作用。
以上结果表明，在诱导过程中，Mash1作为促神经基因，对于神经元的诱导发挥决定性作用，Gata2对于特定递质5-HT亚型的诱导至关重要，减去Foxa2会导致5-HT能神经元的诱导效率极显著地降低，Nkx2.2在四个转录因子中对5-HT能神经元的诱导效率相对影响最小。
4、制备五羟色胺能神经元特异性的报告小鼠
为了方便记录诱导得到的5-HT能神经元的电生理特性，制备了TPH2-iCreERT2-tdTomato基因敲入小鼠，该小鼠的特异性鉴定如图5。TPH是合成5-HT的限速酶，其中TPH2主要在神经系统中存在，外周系统中TPH以TPH1的形式存在。因此，利用TPH2基因特异性表达在5-HT能神经元中的特性，将iCreERT2与tdTomato(tdT)通过2A序列连接，插入到小鼠基因组中TPH2基因开放阅读框之后，3’UTR之前，使得iCreER和tdTomato的表达接受TPH2基因调控序列的调控，同时不影响内源TPH2基因的表达(图5A)。将该小鼠与Flp小鼠杂交，得到子代为去掉Neo筛选基因的TPH2-iCreERT2-tdTomato基因敲入小鼠，简称为TPH2小鼠。通过原代培养胚胎期13.5天(embryonic day 13.5，E13.5)TPH2小鼠中缝核神经元，在培养10天进行染色。本发明人发现，在该小鼠原代培养的神经元中，tdTomato(tdT)能够与TPH和5-HT共标(图5B，C)。并且，通过成年小鼠脑片免疫组化染色，发现该小鼠在5-HT能神经元胞体所在的体内中缝核团中，tdT也能够与TPH共标(图5D)，并且二者的共标比例tdT+Tph+/tdT+为98.30±0.86％(N＝3只小鼠，每只计数330-558个tdT+细胞)，tdT+Tph+/Tph+为98.9±0.63％(N＝3只小鼠，每只计数326-555个Tph+细胞)，说明tdT就代表了TPH阳性的神经元(图5F)。并且，在中缝核团tdT与5-HT同样具有较高的共标比例，tdT+5-HT+/tdT+为87.22±0.49％(N＝3只小鼠，每只计数582-813个tdT+细胞)，tdT+5-HT+/5-HT+为93.96±1.67％(N＝3只小鼠，每只计数564-729个5-HT+细胞)，表明tdT阳性细胞能够代表5-HT特异性的神经元(图5G)。
以上结果显示，在体外原代培养的细胞和体内中缝核团的神经元中，红色荧光tdT都能够代表特异性的五羟色胺能神经元。因此，使用TPH2-iCreERT2-tdTomato基因敲入小鼠来源的不带有红色荧光的星形胶质细胞进行诱导时，得到的红色荧光tdT阳性细胞能够直接在显微镜下观察到，这将方便进行特异性五羟色胺能神经元的电生理记录。
同时，为了验证iCreER能够特异性表达在5-HT能神经元中，本发明人将TPH2-iCreERT2-tdTomato基因敲入小鼠与YFP(R26R-Loxp-Stop-Loxp-YFP)小鼠杂交，在其后代中进行验证(图6A)。对成年小鼠腹腔注射药物它莫西芬(Tamoxifen，Tam)5天，诱导iCre入核，2天后通过脑片免疫组化染色(图6A)。发现无论在喙端的背侧中缝核(Dorsal raphenuclei，DRN)和正中缝核(Median raphe nuclei，MRN)，还是在尾端(Caudal)部分，tdT都能够和YFP共标(图6B，C，D)，统计tdT+YFP+/tdT+的比例为91.37±0.64％(N＝2只小鼠，每只计数308-315个tdT+细胞)，表明iCreER能够特异性表达在五羟色胺能神经元中。
以上结果显示，本发明人制备的TPH2-iCreERT2-tdTomato基因敲入小鼠中，五羟色胺能神经元能够特异性表达iCreER和红色荧光tdTomato，并且iCreER能够在药物它莫西芬的诱导下发挥功能。
5、四个因子诱导的五羟色胺能神经元的电生理特性
使用出生后5天的TPH2-iCreERT2-tdTomato敲入小鼠来源的星形胶质细胞，通过加入分别装载有四个转录因子MNGF(Mash1、Nkx2.2、Gata2、Foxa2)的慢病毒组合进行感染。在体外培养24天后，结果发现能够成功得到tdTomato阳性的细胞(图7A)。记录诱导得到的tdTomato阳性细胞的电生理特性发现，在电流钳模式下给予500ms，10mV的去极化电流的阶跃刺激时，诱导的五羟色胺能神经元并不成熟。为进一步提高诱导效率，本发明人使用Ascl1/Mash1的磷酸化突变形式S-A Mash1(SAM)代替Ascl1/Mash1进行四个转录因子的诱导实验。同样地，SAMNGF也能够诱导出tdTomato阳性的细胞。记录其电生理性质发现，在体外35天后，这些细胞的膜特性也并不成熟，和神经元的被动膜特性并不相似(图7B)。并且这些细胞仅能够产生单个动作电位(图7C)。在诱导44天仅少数细胞(N＝2/11个细胞)能够产生2个或以上的动作电位(图7C)。
因此，四个转录因子能够诱导星形胶质细胞转分化产生五羟色胺能神经元，但其电生理特性并不成熟。
6、五个转录因子诱导产生五羟色胺能神经元
上述研究说明，四个转录因子MNGF(Ascl1、Nkx2.2、Gata2、Foxa2；M4)主要在五羟色胺能神经元产生和发育的上游发挥作用。本发明人也检验了Lmx1b及Pet1在诱导得到五羟色胺能神经元中的作用。结果发现，Lmx1b的加入显著提高了tdTomato阳性的五羟色胺能神经元产生的效率。并且与四因子组合相比，诱导的五羟色胺能神经元也具有更加复杂的形态特征。在新的五因子的基础上加入Pet1没有能够进一步提高诱导的五羟色胺能神经元的效率和复杂程度(图8A)。
本发明人记录并分析了加入Lmx1b后即五个转录因子(S-A Mash1、Nkx2.2、Gata2、Foxa2、Lmx1b；M5)诱导得到的tdT阳性的五羟色胺能神经元的被动电生理特性，包括静息膜电位(RMP)、膜电容(Cm)、输入膜阻抗(Rm)；计算了能够产生动作电位的细胞占全部记录细胞的比例作为诱导五羟色胺能神经元的动作电位复杂程度，同时计算了能够产生自发的动作电位和自发的突触后电位的细胞占全部记录细胞的比例。结果发现，加入Lmx1b后，诱导产生的五羟色胺能神经元能够发放多个动作电位(图8B)，这些细胞与四个转录因子(MNGF或M4)诱导的细胞显著不同。在M4的基础上加入Lmx1b后神经元的被动膜性质包括静息膜电位(RMP)、膜电容(Cm)、输入膜阻抗(Rm)发生显著变化，比M4组更加接近神经元的膜特性(图8C-E)。诱导细胞具有主动膜特性的细胞比例与M4组相比也有显著提高(图8F-I)。电生理结果表明，Lmx1b能够显著提高诱导产生的五羟色胺能神经元的膜特性，提示五个转录因子诱导出的五羟色胺能神经元更加成熟(图8B-I)。本发明人进一步在五因子的组合中加入Pet1，没有发现诱导效率和电生理特性的显著提高(图8C-I)。
以上结果表明，五因子的组合能够高效地诱导出tdTomato阳性的五羟色胺能神经元，产生更加复杂的神经元形态和电生理特性，是诱导星形胶质细胞转分化成为五羟色胺能神经元的最优组合。
实施例2、诱导的五羟色胺能神经元与体内五羟色胺能神经元电生理特性比较
本发明人制备了急性解离的出生后28-32天的TPH2-iCreERT2-tdTomato敲入小鼠中缝核的脑片，并记录了tdTomato阳性的五羟色胺能神经元的电生理特性(图9A)。结果发现，通过给予500ms的去极化电流阶跃刺激，五个转录因子(M5)诱导41天后产生的五羟色胺能神经元(iSNs)能够和中缝核脑片中记录到的五羟色胺能神经元(Native)产生类似的动作电位(图9A，B)。统计动作电位复杂程度发现，二者能够产生多个动作电位的细胞比例没有显著差别(图9C)。通过计算诱发产生的第一个动作电位的瞬时频率(f-initial)和最后两个动作电位的瞬时频率的平均值(f-final)之比，计算出动作电位的频率适应性(spikefrequency accommodation，SFA)。脑片中记录到的和五因子诱导得到的五羟色胺能神经元的SFA值没有显著差异(图9A，B，D)，且二者的SFA值均大于1，表明本发明人记录到的五羟色胺能神经元具有动作电位频率适应性。通过分析被动膜特性，发现五个转录因子M5诱导产生的五羟色胺能神经元的静息膜电位、输入膜阻抗、细胞膜电容等都与急性解离的中缝核脑片中的五羟色胺能神经元的性质一致(图9E)。
进一步分析表明，在电压钳模式下，诱导的五羟色胺能神经元能够在阶跃的去极化电压刺激下产生内向电流(图10A，B)。并且，诱导的五羟色胺能神经元能够产生和体内五羟色胺能神经元相似的自发的动作电位(图10C)和自发兴奋性突触后电流EPSC(图10D)。
以上实验结果表明，诱导的五羟色胺能神经元的被动膜特性、动作电位发放复杂程度、发放模式、内向电流，均与体内五羟色胺能神经元类似。并且这些神经元能够产生突触后电流，提示它们可能能够接收周围细胞的输入，和周围细胞建立神经网络。因此，M5诱导的五羟色胺能神经元具有基本的电生理功能，是成熟的神经元。
实施例3、优化培养条件提高诱导效率和成熟度
1、添加小分子优化培养条件
在体外培养皿中获得足够的五羟色胺能神经元对于研究其功能具有重要的作用，并且有潜力改善由于五羟色胺能神经元的功能紊乱引起的疾病。本发明人尝试在诱导培养基中加入小分子(Small molecules，SM)，检验添加小分子是否能提高诱导得到五羟色胺能神经元的效率。在转分化得到五羟色胺能神经元的诱导系统中，本发明人在包含DMEM/F12、B-27添加剂、青霉素/链霉素(PS)的诱导培养基中加入了神经营养因子BDNF(20ng/ml)。小分子培养基是在诱导培养基的基础上在整个诱导过程中加入Y27632(10μM)、PD0332991(1μM)、神经营养因子GDNF(20ng/ml)和BDNF(20ng/ml)，在诱导第1到9天加入小分子Dorsomorphin(0.5μM)和SB431542(5μM)。Y27632是Rock的一种抑制剂，PD0332991是CDK4/6的抑制剂，而Dorsomorphin和SB431542是SMAD信号通路的抑制剂。使用M5在小分子培养基条件(M5+SM)下诱导五羟色胺能神经元，通过免疫荧光染色发现，M5+SM组的诱导效率与单独M5组的相比，在统计学上并不显著(图11A，B)。但通过观察本发明人注意到，M5+SM组诱导出的五羟色胺能神经元形态更为复杂(图11A)。电生理实验表明，添加小分子后诱导的五羟色胺能神经元的被动膜特性没有显著改变(图11D-F)。通过分析主动膜特性以及统计细胞比例，本发明人发现，M5+SM组相对更加成熟，但能够发放复杂动作电位、产生自发动作电位和自发EPSC的细胞比例以及动作电位频率与M5组相比并无显著变化(图11C，G-I)。
因此，通过添加化学小分子能够优化培养条件，但对于五羟色胺能神经元的诱导效率和电生理性质的影响与不添加小分子组相比差异并不显著，说明本发明发现的五个转录因子组合已经能够成功地使星形胶质细胞诱导成为成熟的5-HT能神经元，小分子在五个转录因子的作用下并不能显著提高诱导效率和神经元的成熟程度。
2、添加小分子诱导的五羟色胺能神经元表达特异性标志分子
本发明人检测了五个转录因子在添加小分子的条件下，诱导的五羟色胺细胞是否能够表达神经元的标志分子。结果发现，这些细胞能够表达神经元的标志分子Tuj1(图12A)，成熟神经元的标志分子Map2、NeuN以及突触标志分子Synapsin I(图12B-D)。同时，诱导得到的神经元表达五羟色胺能神经元特异性的标志物5-HT及其合成限速酶TPH(图12E，F)。
五羟色胺转运体Sert，芳香族氨基酸脱羧酶AADC和单胺类囊泡转运体Vmat2也能够检测到与tdTomato阳性的细胞共标。这表明这些诱导出的细胞能够表达成熟神经元以及五羟色胺能神经元特异性的标志分子。使用M5+SM对TPH2-iCreERT2-tdToamto基因敲入小鼠来源的星形胶质细胞进行诱导，在诱导33天时对tdTomato阳性的细胞与五羟色胺能神经元特异性标志分子TPH的共标率进行统计，发现tdTomato阳性细胞中TPH2阳性细胞比例为93.1％，TPH2阳性细胞中tdTomato阳性细胞比例为82.2％。表明在诱导体系中tdTomato阳性的红色tdT细胞能够代表特异性的五羟色胺能神经元。
综上所述，五个转录因子在添加小分子的条件下诱导得到的细胞的确是特异性的五羟色胺能神经元。
实施例4、转录因子对于五羟色胺能神经元的诱导是否必需
1、五羟色胺能神经元的诱导效率
为了进一步检测五个转录因子中每个因子对于五羟色胺能神经元的诱导是否都为必需，本发明人使用了“减一”的实验策略，即分别减去一个转录因子分析诱导情况。Ascl1对于神经元的诱导为必需，本发明人使用了SAM代替Ascl1进行“减一”实验。通过免疫荧光实验，对五个转录因子及其减一的组合进行了系统的分析(图13)。五因子分别减去SAM或Gata2时，对五羟色胺能神经元标志分子5-HT和神经元标志分子Tuj1的免疫染色显示，Ascl1(或SAM)为诱导产生神经元必需，而Gata2为诱导产生五羟色胺能神经元必需(图13)。从五个因子中减去Foxa2或Lmx1b会使诱导得到五羟色胺能神经元的效率显著降低，而从五因子组合中减去Nkx2.2时，诱导效率并没有显著降低(图13)。
由此可见，五个转录因子在转分化产生五羟色胺能神经元的效率上具有不同的作用。
2、五羟色胺能神经元的诱导成熟度
通过记录tdTomato阳性细胞的电生理特性，本发明人也对五个转录因子及其减一组合得到的五羟色胺能神经元在膜性质进行了系统的分析。由于Ascl1(或SAM)和Gata2对于诱导得到五羟色胺能神经元是必需的转录因子，分别减去此两种转录因子时诱导得到的五羟色胺能神经元数目极少，因此本发明人对减去另外3个转录因子的组合进行了记录和分析。实验结果显示，从五个因子减去Lmx1b，相应神经元的静息膜电位显著降低，更趋于去极化电位(RMP，图14A)；同时输入膜阻抗增大，提示神经元表达的离子通道显著减少(Rm，图14B)；细胞膜电容也有显著降低(Cm，图14C)。减去Nkx2.2，神经元的被动膜特性没有显著变化(图14A-C)，而动作电位复杂程度有所降低(图14D)。从五个因子中，减去Nkx2.2、Foxa2或Lmx1b，动作电位复杂度(图14D)、产生自发动作电位(图14E)或自发EPSCs(图14F)的细胞个数百分比分别有不同程度的降低。通过分析产生多个动作电位的细胞，计算其动作电位频率，本发明人发现，在相同强度的电流刺激下，从五个因子中，减去Nkx2.2、Foxa2或Lmx1b，相应神经元的动作电位频率依次降低(图14G，I-L)，这些细胞的电流-电压曲线也有不同程度的变化(图14H，M-P)。
以上结果表明，Lmx1b能够使诱导的五羟色胺能神经元在被动和主动膜特性上均发生极为显著的变化(图14A-P)，促进神经元的功能成熟；Foxa2主要影响诱导五羟色胺能神经元的电流-电压曲线(图14H，M，O)、动作电位复杂度(图14D)、动作电位频率(图14G，I，K)以及被动膜特性(图14A-C)，表明Foxa2对诱导五羟色胺能神经元电生理相关性质具有广泛的影响。而当从五因子组合中减去Nkx2.2时，虽然诱导效率降低得并不显著，但tdTomato阳性的五羟色胺能神经元发放多个动作电位的细胞比例与五因子诱导组相比有所降低(图14D)，表明Nkx2.2同样影响五羟色胺能神经元的基本电生理性质。因此可见，五个因子在转分化得到的五羟色胺能神经元的电生理成熟度上发挥不同的作用。
实施例5、诱导过程没有经过前体细胞阶段
1、诱导过程没有经过增殖时期
为了检测五个转录因子诱导得到五羟色胺能神经元的过程中有没有经过增殖阶段，本发明人进行了BrdU掺入实验。在病毒感染星形胶质细胞第0到24天加入BrdU(10μmol/L)，检测发现诱导得到的tdTomato阳性细胞与Brdu能够共标(图15)。而在第3到24天加入BrdU，tdTomato阳性细胞与Brdu不共标(图15)。Brud掺入实验结果表明，转录因子诱导得到五羟色胺能神经元的过程中，没有经过类似于前体细胞的增殖阶段。
2、诱导的五羟色胺能神经元没有处于增殖状态
同时，本发明人使用五个转录因子诱导得到tdTomato阳性的五羟色胺能神经元，在第24天时检测了细胞增殖的标志分子Ki67与tdTomato的共标比例，结果显示几乎没有tdTomato阳性的细胞表达Ki67(图15)。因此，诱导得到的五羟色胺能神经元并不处于增殖的状态。
综上所述，诱导星形胶质细胞产生五羟色胺能神经元的过程没有经过前体细胞阶段。也就是说，该诱导不是类似产生iPSCs的过程，而是细胞直接重编程即转分化的过程。
实施例6、化学小分子可以代替部分转录因子的功能
1、化学小分子对不同组合诱导效率的影响
本发明人使用小分子培养基优化条件进行“减一”实验，即在M5+SM的基础上通过分别减去5个不同的转录因子检测了诱导的五羟色胺能神经元的诱导效率。免疫荧光染色实验结果显示，在含有小分子的培养条件下，减去不同转录因子的组合的诱导效率与单独使用五因子不加小分子组进行“减一”实验诱导的效率没有显著差别(图13，图16)。简而言之，SAM和Gata2对于tdTomato阳性的特异性五羟色胺能神经元的诱导为必需，减去Lmx1b和Foxa2会导致诱导效率的显著下降，而减去Nkx2.2对于诱导效率的影响最小(图13，图16)。
2、化学小分子对不同组合诱导成熟度的影响
在使用小分子培养基的条件下，分别记录减去Nkx2.2、Foxa2或Lmx1b组诱导出的tdTomato阳性的细胞的电生理特性。有趣的是，每一组(包括正常脑片中记录的tdTomato阳性的五羟色胺能神经元)都具有相同水平的包括RMP、Cm、Rm的被动膜特性(图17A-C)以及相同水平的包括能够产生多个动作电位(图17D)、自发的动作电位(图17E)、自发的突触后电流(图17F)等主动膜特性的细胞比例。并且，在添加小分子的条件下，不同转录因子对于神经元的动作电位频率(图17G，I-L)和电流-电压曲线(图17H，M-P)的影响较小。这些结果与不添加小分子组五因子“减一”实验中的结果不同。也就是说，在添加小分子条件下，减去不同转录因子Nkx2.2、Foxa2或Lmx1b不会影响诱导的五羟色胺能神经元的成熟程度。
因此，小分子的加入可以替代部分转录因子发挥功能，尤其是可以替代对于五羟色胺能神经元成熟具有重要作用的转录因子的作用，从而促进其成熟。
实施例7、比较成纤维细胞诱导五羟色胺能神经元的组合与五个转录因子组合的诱导效率和成熟度
设置不同的转录因子组合：M5+SM组、Gage’s(MNGLP+Ngn2)组和MFLP+SM组。通过免疫组织化学和电生理方法比较了五因子加小分子(M5+SM)组合与文献报道的两种组合诱导出的五羟色胺能神经元的特性，结果显示M5+SM组合具有更高的诱导效率(图18A-B)。记录M5+SM组和Gage’s组并分析了两种组合诱导产生的五羟色胺能神经元的电生理性质。结果表明，在以星形胶质细胞作为起始细胞的诱导体系中，M5+SM组是能够诱导产生五羟色胺能神经元的最优组合(图18C-I)。
实施例8、诱导的五羟色胺能神经元能够进行突触传递
1、高钾刺激诱导细胞释放5-HT
为了检测诱导出的五羟色胺能神经元是否能够进行突触联系发挥功能，首先，将诱导得到的5-HT细胞与HBSS或高浓度KCl(56mM)培养20分钟，使用高效液相色谱(HPLC)检测诱导细胞能否释放5-HT。
检测结果发现，HBSS组的细胞能够自发地释放5-HT，而高钾刺激能够显著提高释放的5-HT浓度。而5-HT的代谢物在两组中没有检测到有明显差别。因此，五因子诱导产生的神经元在高钾刺激下能够释放神经递质5-HT，具备进行突触传递的基本条件(图19)。
2、光照特异性刺激诱导细胞释放5-HT
由于高钾刺激细胞释放神经递质的方式没有细胞类型特异性，为了能够特异性检测诱导出的五羟色胺能神经元亚型能否释放5-HT，本发明人特异性地在转分化得到的五羟色胺能神经元中表达光敏感蛋白ChR2，来实现特异性光照激活5-HT的目的。
首先，将TPH2-iCreERT2-tdTomato基因敲入小鼠与光遗传工具鼠Ai32(RCL-hChR2(H134R)/EYFP)小鼠进行交配，通过基因组鉴定小鼠基因型，得到双阳性后代小鼠。之前使用YFP小鼠已验证过iCreER可发挥重组酶的功能，这些小鼠在腹腔注射它莫西芬时可以诱导hChR2(H134R)/EYFP特异性表达在五羟色胺能神经元中。同时，在五羟色胺能神经元中也会表达红色荧光tdTomato。而在星形胶质细胞中，hChR2、EYFP和tdTomato均不会表达。
本发明人构建了不带有GFP荧光的载体，装载上五个转录因子，包装成慢病毒进行诱导。以TPH2-iCreERT2-tdTomato与Ai32小鼠双阳性后代的P5小鼠中脑背侧星形胶质细胞作为起始细胞，加入不带有荧光的五个转录因子的慢病毒组合感染细胞。当在培养基中加入药物4-OHT诱导iCre入核时，实验结果表明，诱导产生的tdTomato阳性细胞能够表达光敏感蛋白ChR2和EYFP。因此，本发明人在转分化得到的tdTomato阳性的五羟色胺能神经元上特异地表达了ChR2(H134R)/EYFP。
使用不照光组作为对照，将诱导细胞照射470nm蓝光30分钟，检测培养基上清中5-HT浓度。结果表明，照射蓝光组能够产生5-HT。也就是说，蓝光特异性激活带有ChR2的五羟色胺能神经元，可使其释放5-HT到细胞外。这样就可通过光遗传学的方法激活转分化得到的五羟色能神经元释放神经递质5-HT(图19)。
3、诱导细胞与突触后神经元形成突触联系
为了进一步鉴定诱导的五羟色胺能神经元能够释放5-HT，并作用到突触后神经元上形成联系，本发明人进行了与带有5-HT受体的神经元共培养的实验。利用Htr3a-GFP转基因小鼠，取其胚胎期神经元与诱导产生的神经元进行原代共培养。
取TPH2-iCreERT2-tdTomato与Ai32小鼠双阳性后代的P5小鼠中脑背侧星形胶质细胞作为起始细胞，加入不带有绿色荧光的五个转录因子的慢病毒组合感染细胞，同时加入小分子优化培养条件。当在培养基中加入药物4-OHT诱导iCre入核后，诱导产生的tdTomato阳性细胞能够表达光敏感蛋白ChR2和EYFP。随后，加入Htr3a-GFP转基因小鼠来源的胚胎期原代皮层神经元进行共培养。使用光遗传结合电生理记录的方法，检测两类神经元(诱导产生的五羟色胺能神经元和Htr3a-GFP来源的皮层神经元)是否能够产生突触联系(图20A-C)。
首先，记录EYFP阳性、tdTomato阳性的细胞，这些细胞是诱导产生的五羟色胺能神经元，并且带有光敏感蛋白ChR2。当使用不同频率的470nm光照刺激时，在电流钳和电压钳模式下，本发明人记录的19个细胞中均观察到了跟随光刺激的动作电位和光敏感电流反应(图20D，E)。
接下来，记录了GFP阳性的细胞，这些细胞是皮层Htr3a阳性的神经元，即带有5-HT能神经元的离子型受体Htr3a。当使用不同频率的470nm蓝光刺激时，在电压钳模式下记录Htr3a阳性细胞的电流反应。结果显示，记录到的112个细胞中，3个细胞能够对蓝光反应，表明它们能够接收到诱导五羟色胺能神经元释放的神经递质，从而产生受体电流。对其中一个细胞使用5-HT3a受体拮抗剂Ondansetron时，该细胞对于光照的反应减弱。表明产生的电流确实是5-HT3a受体介导的(图20F，G)。
以上实验结果表明，本发明诱导得到的五羟色胺能神经元能够释放5-HT，它们可通过突触后神经元上的5-HT受体与其形成神经联系，进而整合到神经环路中。
实施例9、细胞移植
1、移植到大脑皮层的五羟色胺能神经元能够存活
在体外培养条件下，能够从小鼠星形胶质细胞诱导得到五羟色胺能神经元，本实施例研究这些细胞能否在体内存活以及有没有最终应用于临床细胞治疗的潜力。使用五个转录因子的慢病毒组合在体外感染来源于TPH2-iCreERT2-tdTomato基因敲入小鼠的P5星形胶质细胞，3天后将细胞使用accutase酶消化并移植到成年免疫缺陷型NOD-SCID小鼠体内。本发明人将诱导的细胞移植到大脑皮层(Cortex)(图21)，21天后进行免疫组化染色，结果发现部分移植细胞能够在体内存活(图21A，B)，表达病毒报告基因GFP和五羟色胺能神经元标志分子tdTomato(图21C)。
2、移植到出生后小鼠脑室的五羟色胺能神经元能够存活
将诱导细胞移植到出生后小鼠的脑室中，发现GFP细胞能够与神经元的标志分子NeuN共标，表明神经元在体内能够存活(图22A-C)。同时发现GFP细胞和tdTomato有共标，即有一小部分5-HT能神经元细胞能够在体内存活。同时，本发明人检测到tdTomato阳性细胞与TPH以及和5-HT的共标(图23)。由此可见，移植到出生后小鼠脑室的五羟色胺能神经元能够在体内存活。
3、移植到出生后小鼠脑室的五羟色胺能神经元具有成熟的电生理特性
本发明人进一步检测星形胶质细胞转变的五羟色胺能神经元能否在小鼠脑内存活。已知Bcl-2促进细胞命运转变和存活(Gascon et al.,2016)。本发明人分离了TPH2-iCreERT2-tdTomato基因敲入小鼠的星形胶质细胞，在含有小分子的培养条件(同实施例3“1”中的添加和培养方法)下感染M5+Bcl-2。移植到新生小鼠脑室2个月后，检测发现移植的GFP阳性细胞能够表达TPH(图24A)或5-HT(图24B)，表明它们是五羟色胺能神经元。虽然GFP阳性细胞的存活率相对较低(图24C)，但诱导的五羟色胺能神经元在体内仍有8.57±1.29％的细胞能够存活(图24D)。本发明人记录了移植5周和7周后细胞的电生理特性，结果显示，动作电位的复杂程度逐渐提高(图24E)。移植的细胞在体内能够发放多个动作电位(图24F)并产生钠电流(图24G)。这些移植实验表明，星形胶质细胞转变而来的五羟色胺能神经元能够在体内存活并且具有神经元成熟的电生理活性。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (18)
1.一种诱导星形胶质细胞转分化为五羟色胺能神经元的方法，包括：在星形胶质细胞中表达选自下组的转录因子：(a)Ascl1/Mash1，Gata2，Foxa2，Lmx1b和Nkx2.2；或(b)Ascl1/Mash1，Gata2，Foxa2和Lmx1b；培养该细胞，从而所述星形胶质细胞转分化为五羟色胺能神经元。
2.一种诱导星形胶质细胞转分化为五羟色胺能神经元的方法，包括：
(1)在星形胶质细胞中表达以下转录因子：Ascl1/Mash1，Gata2，以及选自Foxa2、Lmx1b和Nkx2.2中的任意两种或三种；
(2)在添加化合物的条件下诱导培养(1)的细胞，从而所述星形胶质细胞转分化为五羟色胺能神经元；其中，所述化合物包括：Y27632，PD0332991，神经营养因子GDNF，神经营养因子BDNF，Dorsomorphin，SB431542。
3.如权利要求2的方法，其特征在于，所述的Dorsomorphin，SB431542在诱导培养的前9±2天，较佳地前9±1天添加。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的化合物的终浓度为：
Y27632：10±5μM，较佳地10±2μM；
PD0332991：1±0.5μM，较佳地1±0.2μM；
神经营养因子GDNF：20±10ng/ml，较佳地20±5ng/ml；
神经营养因子BDNF：20±10ng/ml，较佳地20±5ng/ml；
Dorsomorphin：0.5±0.25μM，较佳地0.5±0.15μM；
SB431542：5±2.5μM，较佳地5±1.5μM。
5.如权利要求2所述的方法，其特征在于，诱导培养的培养基中，还包括：B27添加物、血清、上皮生长因子EGF、成纤维细胞生长因子FGF2。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，各组分的终浓度为：
血清：按照体积10±5％；较佳地10±2％；
上皮生长因子EGF：10±5ng/ml；较佳地10±2ng/ml；
成纤维细胞生长因子FGF2：10±5ng/ml；较佳地10±2ng/ml；
B27添加物：1±0.5倍量。
7.如权利要求2～6任一所述的方法，其特征在于，所述的细胞培养基中，以选自下组的培养基作为基础培养基：DMEM、MEM、RPMI、Neuronal basal或Fischer；较佳地，所述的DMEM选自：DMEM/F12，Advanced DMEM/F12。
8.由权利要求1～7任一所述的方法获得的五羟色胺能神经元培养物或从该五羟色胺能神经元培养物中分离纯化的五羟色胺能神经元。
9.如权利要求8所述的五羟色胺能神经元培养物或分离纯化的五羟色胺能神经元，其特征在于，所述的五羟色胺能神经元通过在星形胶质细胞中表达权利要求1的(b)组的转录因子而获得，其具有下组的性能或特征：呈现不成熟的电生理特性；或
所述的五羟色胺能神经元通过在星形胶质细胞中表达权利要求1的(a)组的转录因子而获得，其具有下组的性能或特征：呈现成熟的电生理特性，产生复杂的神经元形态和电生理特性；或
所述的五羟色胺能神经元通过权利要求2所述的方法获得，其具有下组的性能或特征：呈现成熟的电生理特性，产生复杂的神经元形态和电生理特性。
10.权利要求8或9所述的五羟色胺能神经元培养物或分离纯化的五羟色胺能神经元的用途，用于：
制备预防、改善或治疗神经系统疾病的药物；或
用于作为体外模型，进行神经系统疾病的模拟及其药物的筛选；或
用于制备体内细胞移植的组合物。
11.一种药物组合物，其特征在于，其中含有权利要求8或9所述的五羟色胺能神经元培养物或分离纯化的五羟色胺能神经元；以及药学上可接受的载体。
12.用于诱导星形胶质细胞转分化为五羟色胺能神经元的培养基，其特征在于，其包括：Y27632，PD0332991，神经营养因子GDNF，神经营养因子BDNF；较佳地还包括Dorsomorphin，SB431542；更佳地还包括B27添加物，血清，上皮生长因子EGF，成纤维细胞生长因子FGF2。
13.如权利要求12所述的培养基，其特征在于，所述组分在培养基中的浓度为：
Y27632：10±5μM，较佳地10±2μM；
PD0332991：1±0.5μM，较佳地1±0.2μM；
神经营养因子GDNF：20±10ng/ml，较佳地20±5ng/ml；
神经营养因子BDNF：20±10ng/ml，较佳地20±5ng/ml；
Dorsomorphin：0.5±0.25μM，较佳地0.5±0.15μM；
SB431542：5±2.5μM，较佳地5±1.5μM；
血清：按照体积10±5％；较佳地10±2％；
上皮生长因子EGF：10±5ng/ml；较佳地10±2ng/ml；
成纤维细胞生长因子FGF2：10±5ng/ml；较佳地10±2ng/ml；或
B27添加物：1±0.5倍量。
14.如权利要求12或13所述的培养基，其特征在于，其特征在于，所述的培养基中，以选自下组的培养基作为基础培养基：DMEM、MEM、RPMI、Neuronal basal或Fischers；较佳地，所述的DMEM选自：DMEM/F12，Advanced DMEM/F12。
15.权利要求12～14任一所述的培养基的用途，用于诱导星形胶质细胞转分化为五羟色胺能神经元。
16.一种试剂盒，其中包括选自下组的转录因子的编码基因、表达盒或表达载体：(a)Ascl1/Mash1，Gata2，Foxa2，Lmx1b和Nkx2.2；或(b)Ascl1/Mash1，Gata2，Foxa2和Lmx1b。
17.一种试剂盒，其中包括：Ascl1/Mash1，Gata2，以及选自Foxa2、Lmx1b和Nkx2.2中的任意两种或三种；以及化合物，所述化合物包括：Y27632，PD0332991，神经营养因子GDNF，神经营养因子BDNF，Dorsomorphin，SB431542。
18.如权利要求17所述的试剂盒，其特征在于，其中还包括：B27添加物，血清，上皮生长因子EGF，成纤维细胞生长因子FGF2，基础培养基。
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