JP2019528695A - 非ヒト哺乳動物の肥満症またはその関連疾患の動物モデルの構築方法およびその使用 - Google Patents

非ヒト哺乳動物の肥満症またはその関連疾患の動物モデルの構築方法およびその使用 Download PDF

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Abstract

非ヒト哺乳動物の肥満症またはその関連疾患の動物モデルの構築方法であって、（a）非ヒト哺乳動物の細胞を提供し、前記細胞におけるGlce遺伝子を不活性化させ、Glce遺伝子が不活性化した非ヒト哺乳動物細胞を得る工程と、（b）工程（a）で得られたGlce遺伝子が不活性化した細胞を利用し、Glce遺伝子が不活性化した肥満症またはその関連疾患の動物モデルを製造する工程と含む方法。当該動物モデルは、有効な肥満症またはその関連疾患の動物モデルで、肥満症、高脂血症、高血圧、糖尿病などの疾患の研究に有用で、そして特定の薬物の選別および試験にも有用である。

Description

本発明は、生物技術の分野に関し、具体的に、非ヒト哺乳動物の肥満症またはその関連疾患の動物モデルの構築方法およびその使用に関する。
肥満症は、よく見られる、古くからの代謝症候群である。人体の摂取するエネルギーが消耗するエネルギーよりも多い場合、余ったエネルギーが脂肪の形で体内に蓄積し、その量が正常の生理的需要量を超え、そして一定の値に達すると、肥満症になる。正常の成人男性では、脂肪組織の重量が体重の15〜18％を占め、女性では、約20〜25％を占める。年齢の増加につれ、体脂肪が占める比率が相応的に増加する。体脂肪の増加によって体重が標準体重よりも20％高いか、ボディマス指数（BMI=体重（kg）/（身長）2（m2））が24よりも多い場合、肥満症と呼ぶ。顕著な病因が見つからないものを単純性肥満症と、明確な病因があるものを二次性肥満症と呼ぶ。世界保険機関の予測では、人類が現在直面する最も軽視されやすいが、発症率が急激に上昇する疾患である。
現在、肥満症の発症機序はまだ明らかではなく、安全で有効な治療手段が欠けているため、その発症機序に対する鋭意な検討は肥満症治療の重要な基礎である。マウス疾患モデルは人類の疾患の発症機序の研究および薬物の選別において非常に重要な作用を果たす。人類の認知機能、神経変性疾患、代謝性疾患、消化系疾患などの面において、マウスモデルは大きな優勢を有する。
遺伝子ノックアウトは前世紀80年代から発展してきた複雑な分子生物学技術で、マウス胚性幹細胞のDNA相同組換えの原理に基づいたもので、「遺伝子ターゲティング」技術とも呼ばれる。その後、この技術によって数千種類の遺伝子突然変異マウスが構築され、これらの遺伝子工学的マウスは生物科学および医学の研究において突破をもたらすのみならず、新薬の研究・開発においても非常に重要な作用を果たす。
現在のマウス肥満症モデルの構築方法は主に食物性、下垂体性および内分泌性の肥満モデルなどがあるが、肥満モデルの製作は時間がかかり、条件が煩雑で、成功率が高くなく、肥満のメカニズムおよび異なる種類のダイエット薬の研究の需要に満足できるものとは言えない。
そのため、本分野では、好適に臨床における肥満症をシミュレートすることができ、個体差が小さく、遺伝的背景が高度に一致し、肥満症の発病機序の研究および新薬の選別の有力なツールとして有用な動物モデルの開発が切望されている。
本発明の目的は、好適に臨床における肥満症をシミュレートすることができ、個体差が小さく、遺伝的背景が高度に一致し、肥満症の発病機序の研究および新薬の選別の有力なツールとして有用な動物モデルを提供することにある。
本発明の第一の側面では、非ヒト哺乳動物の肥満症またはその関連疾患の動物モデルの構築方法であって、
（a）非ヒト哺乳動物の細胞を提供し、前記細胞におけるGlce遺伝子を不活性化させ、Glce遺伝子が不活性化した非ヒト哺乳動物細胞を得る工程と、
（b）工程（a）で得られたGlce遺伝子が不活性化した細胞を利用し、Glce遺伝子が不活性化した肥満症またはその関連疾患の動物モデルを製造する工程と、
を含む方法を提供する。
もう一つの好適な例において、工程（a）には、さらに、
（a1）DNA相同組換え技術によって、前記Glce遺伝子におけるエクソン3〜エクソン5のうちの1つまたは複数のエクソンを削除または破壊し、選別マーカーで置換し、Glce遺伝子が不活性化した非ヒト哺乳動物細胞を得る工程を含む。
もう一つの好適な例において、工程（b）には、さらに、
（b1）工程（a）で得られたGlce遺伝子が不活性化した非ヒト哺乳動物細胞を利用し、キメラ非ヒト哺乳動物を製造する工程と、
（b2）工程（b1）で得られたキメラ非ヒト哺乳動物を正常の野生型非ヒト哺乳動物と交尾・繁殖させ、子孫からGlce遺伝子が不活性化したヘテロ接合体の非ヒト哺乳動物を選別する工程と、
（b3）工程（b2）で得られたヘテロ接合体の非ヒト哺乳動物を互いに交尾させてGlce遺伝子が不活性化したホモ接合体の非ヒト哺乳動物を得ることによって、Glce遺伝子が不活性化した非ヒト哺乳動物の動物モデルを得る工程と、を含む。
もう一つの好適な例において、工程（b3）には、さらに、Glce遺伝子が不活性化したホモ接合体の非ヒト哺乳動物を同じ種のニューロン特異的ノックアウトのツールとしての非ヒト哺乳動物と交雑させることによって、ニューロン特異的なGlce遺伝子が不活性化した非ヒト哺乳動物の動物モデルを得る工程（b4）を含む。
もう一つの好適な例において、前記Glce遺伝子の不活性化は、遺伝子ノックアウト、遺伝子破壊または遺伝子挿入を含む。
もう一つの好適な例において、前記遺伝子の不活性化は、Glce遺伝子が発現しないこと、または活性がないGlceタンパク質を発現することを含む。
もう一つの好適な例において、前記Glce遺伝子の不活性化は、Glceのエクソン3の欠失またはノックアウトによるものである。
もう一つの好適な例において、前記Glce遺伝子の不活性化は、ニューロン特異的なGlce遺伝子の不活性化である。
もう一つの好適な例において、前記非ヒト哺乳動物は齧歯動物または霊長目動物で、好ましくはマウス、ラット、ウサギおよび/またはサルを含む。
もう一つの好適な例において、前記非ヒト哺乳動物はマウスで、かつ工程（b4）では、Glce Loxp/LoxpマウスをツールマウスNSE（neuron-specific enolase）-Creと交尾させ、ニューロン細胞特異的なGlce遺伝子ノックアウトマウス（すなわち、ニューロン特異的なGlce不活性化マウス）を得、cKOマウスと略する。
もう一つの好適な例において、前記選別マーカーは、耐性遺伝子、蛍光タンパク質遺伝子、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。
もう一つの好適な例において、前記選別マーカーは、neo遺伝子を含む。
もう一つの好適な例において、前記工程（b）で得られたGlce遺伝子が不活性化した非ヒト哺乳動物の動物モデルでは、野生型の対照動物と比べ、以下の群から選ばれる1つまたは複数の特徴を有する：
（t1）体型の肥満度が増加する；
（t2）肥満症状の発生率が増加する；
（t3）脂肪組織の湿重量が増加する；
（t4）オープンフィールド行動レベルが低下する；
（t5）新規環境を探索する欲望が低下する；
（t6）抑うつ様行動が増加する；
（t7）抑うつ度が増加する；
（t8）不安様行動が増加する；
（t9）不安度が増加する；
（t10）恐怖様行動が増加する；
（t11）恐怖度が増加する；
（t12）認知障害が増加する；
（t13）卒中の発生率が増加する。
もう一つの好適な例において、前記脂肪組織の湿重量は、内臓脂肪組織の湿重量、皮下脂肪組織の湿重量、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。
もう一つの好適な例において、前記内臓脂肪組織の湿重量は、両側の性腺周囲脂肪組織の湿重量、両側の腎臓周囲脂肪組織の湿重量、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。
もう一つの好適な例において、前記皮下脂肪組織の湿重量は、両側の鼠径部脂肪組織の湿重量を含む。
もう一つの好適な例において、前記オープンフィールド行動レベルは、オープンフィールド行動の距離、行動時間、行動速度、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。
もう一つの好適な例において、前記抑うつ様行動は、オープンフィールド実験で中央領域を探索する時間の減少、新規環境を探索する欲望の低下、強制水泳実験における無動時間の増加、絶望行動、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。
本発明の第二の側面では、本発明の第一の側面に記載の方法によって製造された非ヒト哺乳動物モデルの使用であって、肥満症またはその関連疾患を研究する動物モデルとしての使用を提供する。
もう一つの好適な例において、前記肥満症またはその関連疾患は、肥満症、高脂血症、高血圧、糖尿病、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。
本発明の第三の側面では、本発明の第一の側面に記載の方法によって製造された非ヒト哺乳動物モデルの使用であって、肥満症またはその関連疾患を軽減または治療することができる物質（治療剤）を選別または同定するための使用を提供する。
もう一つの好適な例において、前記肥満症またはその関連疾患は、肥満症、高脂血症、高血圧、糖尿病、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。
本発明の第四の側面では、肥満症またはその関連疾患を治療または緩和する潜在的な治療剤を選別または同定する方法であって、以下の工程を含む方法を提供する：
（a）試験群では、被験化合物の存在下において、被験化合物を本発明の第一の側面に記載の方法によって製造された非ヒト哺乳動物モデルに施用し、試験群における前記動物モデルの肥満症またはその関連疾患の重篤度Q1を検出し、かつ前記被験化合物を施用せずにほかの条件が同様の対照群では、対照群における前記動物モデルの肥満症またはその関連疾患の重篤度Q2を検出する工程；
（b）前の工程で検出された重篤度Q1と重篤度Q2を比較することによって、前記被験化合物が肥満症またはその関連疾患を治療または緩和する潜在的な治療剤であるか、確認する工程；
ここで、重篤度Q1が重篤度Q2よりも顕著に低い場合、前記被験化合物が肥満症またはその関連疾患を治療または緩和する潜在的な治療剤であることを示す。
もう一つの好適な例において、前記の肥満症またはその関連疾患の重篤度の検出は、体型の変化、肥満症状の発生率の変化、脂肪組織の湿重量の変化からなる群から選ばれる1つまたは複数の指標の変化の検出を含む。
もう一つの好適な例において、前記体型の変化は、体型の肥満度の増加を含む。
もう一つの好適な例において、前記脂肪組織の湿重量は、内臓脂肪組織の湿重量、皮下脂肪組織の湿重量、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。
もう一つの好適な例において、前記内臓脂肪組織の湿重量は、両側の性腺周囲脂肪組織の湿重量、両側の腎臓周囲脂肪組織の湿重量、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。
もう一つの好適な例において、前記皮下脂肪組織の湿重量は、両側の鼠径部脂肪組織の湿重量を含む。
もう一つの好適な例において、前記の肥満症またはその関連疾患の重篤度の低下の所見は、体型の肥満度の軽減、肥満症状の発生率の低下、および/または脂肪組織の湿重量の低下。
もう一つの好適な例において、前記「顕著に低い」とは、生物学的に繰り返した試験群における、被験化合物を施用した後の重篤度Q1が生物学的に繰り返した対照群における、被験化合物を施用した後の重篤度Q2よりも低く、かつt検定では、そのP値が0.05未満である。
もう一つの好適な例において、前記「顕著に低い」とは重篤度Q1/重篤度Q2の比は≦1/2、好ましくは≦1/3、より好ましくは≦1/4である。
もう一つの好適な例において、前記の方法は非診断的で非治療的なものである。
もう一つの好適な例において、前記方法は、工程（b）で選別または同定された潜在的な治療剤を本発明の第一の側面に記載の方法によって製造された非ヒト哺乳動物モデルに施用することによって、その前記動物モデルの肥満症またはその関連疾患の重篤度に対する影響を測定する、工程（c）を含む。
本発明の第五の側面では、グルクロニルC5-エピメラーゼ（Glucuronyl C5-epimerase、Glce）遺伝子が不活性化または下方調節した細胞の使用であって、非ヒト哺乳動物の肥満症またはその関連疾患の動物モデルを構築する生物製剤を製造するための使用を提供する。
もう一つの好適な例において、前記生物製剤は液体製剤である。
本発明の第六の側面では、Glce遺伝子またはそのタンパク質の不活性化剤の使用であって、非ヒト哺乳動物の肥満症またはその関連疾患の動物モデルを構築する生物製剤を製造するための使用を提供する。
もう一つの好適な例において、前記不活性化剤は阻害剤を含む。
もう一つの好適な例において、前記不活性化剤は、抗体、小分子化合物、核酸、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。
本発明の第七では、本発明の第一の側面に記載の方法によって製造された非ヒト哺乳動物モデルを提供する。
もう一つの好適な例において、Glce遺伝子の不活性化に関して、前記の非ヒト哺乳動物モデルは、ヘテロ接合体またはホモ接合体である。
もう一つの好適な例において、前記Glce遺伝子の不活性化は、ニューロン特異的なGlce遺伝子の不活性化である。
もちろん、本発明の範囲内において、本発明の上記の各技術特徴および下記（たとえば実施例）の具体的に記述された各技術特徴は互いに組み合わせ、新しい、または好適な技術方案を構成できることが理解される。紙数に限りがあるため、ここで逐一説明しない。
図1は、Glce遺伝子の突然変異配列の設計案を示す。 図2は、Glce遺伝子ノックアウトターゲティングベクターのプラスミドマップを示す。 図3は、Glce遺伝子ノックアウトターゲティングベクターのプラスミドDNAの酵素切断同定の結果を示す。 図4は、ESクローンのゲノムDNAの5'末端PCR産物の電気泳動結果を示す。 図5は、ESクローンのゲノムDNAの3'末端PCR産物の電気泳動結果を示す。 図6は、Glce遺伝子組み換えマウス（Loxp/+）の配列突然変異部位のPCR結果を示す。 図7は、Glce突然変異ホモ接合体（Loxp/Loxp Cre）、突然変異ヘテロ接合体（Loxp/+ Cre）および野生型（+/+ Cre）の配列突然変異部位のPCR結果を示す。 図8は、Glce突然変異ホモ接合体マウスとC57マウスの体型の比較を示す。ここで、左の図では、上はC57雌マウスで、下はGlce突然変異ホモ接合体の雌マウスで、右の図では、上はC57雄マウスで、下はGlce突然変異ホモ接合体の雄マウスである。 図9は、Glce突然変異ホモ接合体マウスとC57マウスの体重の比較の状況を示す。 図10は、Glce突然変異ホモ接合体マウスとC57マウスの体脂肪の湿重量の比較の状況を示す。 図11は、Glce突然変異ホモ接合体マウスとC57マウスの両側の性腺周囲脂肪組織の湿重量の比較の状況を示す。 図12は、Glce突然変異ホモ接合体マウスとC57マウスの両側の腎臓周囲脂肪組織の湿重量の比較の状況を示す。 図13は、Glce突然変異ホモ接合体マウスとC57マウスの内臓脂肪組織の湿重量の比較の状況を示す。 図14は、Glce突然変異ホモ接合体マウスとC57マウスの両側の鼠径部脂肪組織の湿重量の比較の状況を示す。 図15は、Glce突然変異ホモ接合体マウスの自発的行動の距離、時間および速度を示す。 図16は、Glce突然変異ホモ接合体マウスのオープンフィールド実験における行動の合計距離、時間および速度を示す。 図17は、Glce突然変異ホモ接合体マウスのオープンフィールドの中央領域における行動の距離、時間および速度を示す。 図18は、Glce突然変異ホモ接合体マウスのオープンフィールドの周辺領域における行動の距離、時間および速度を示す。 図19は、Glce突然変異ホモ接合体マウスの強制水泳実験における無動時間を示す。 図20は、卒中の行動学的評価実験を示す。 図21は、TTC染色によって検出された卒中マウスの脳組織の梗塞の状況を示す。 図22は、Glce突然変異ホモ接合体マウスの自発的行動の距離、時間および速度を示す。 図23は、Glce突然変異ホモ接合体マウスのオープンフィールドの中央領域における行動の距離、時間および速度を示す。 図24は、Glce突然変異ホモ接合体マウスの高架式十字迷路実験における、それぞれオープンアーム、中央領域およびクローズアームを探索した時間を示す。
具体的な実施形態
本発明者は幅広く深く研究したところ、遺伝的に安定し、表現型が安定した肥満症モデルを構築したが、当該モデルはGlce遺伝子がノックアウトまたは不活性化されたマウスまたはほかの非ヒト哺乳動物であつ。本発明の動物モデルは、有効な肥満症またはその関連疾患の動物モデルで、肥満の関連疾患（たとえば高脂血症）の研究に有用で、そして特定の薬物の選別および試験にも有用である。これに基づき、本発明を完成させた。
また、本発明で、意外に、Glce遺伝子をノックアウトまたは不活性化した動物モデルは同時に卒中、抑うつ、不安などの疾患の研究にも有用である。これに基づき、本発明を完成させた。
Glce遺伝子
ヘパラン硫酸は、細胞表面および細胞質基質に幅広く存在する多糖で、負に帯電する線状大分子として、多くのサイトカイン、成長因子、ケモカインおよびインターロイキンと特異的に結合することによって、胚の発育、細胞の生長、炎症反応、凝血、腫瘍転移やウイルスの侵入などの生理過程において作用を発揮する。
グルクロニルC5-エピメラーゼ（Glce）は、ヘパラン硫酸のプロテオグリカン糖鎖の合成過程における重要な酵素で、糖鎖におけるD-グルクロン酸をL-イズロン酸に異性化させ2、ヘパラン硫酸の複雑度を上げ、そして糖鎖により高い柔軟性を与え、L-イズロン酸はヘパラン硫酸が多くのタンパク質分子を認識するに不可欠な部位である3。
21例の正常の乳腺組織および74例の乳腺腫瘍組織に対する研究では、82％〜84％のヒト乳腺腫瘍組織においてGlceのmRNAレベルとタンパク質レベルにおける発現が顕著に低下したか、または完全になくなったことが見出された。また、乳癌および肺癌の細胞系においてGlceの過剰発現は小細胞肺癌および乳癌の細胞増殖を抑制することができることは、Glceが潜在的な癌抑制遺伝子であることを示唆する5,6。
Glce遺伝子はマウスのゲノムの9番染色体に位置し、全長は618である（EnsemblGene ID : ENSMUSG00000032252、Genebank登録番号: 93683）。Glceゲノム配列は4つのイントロンおよび5つのエクソンを含み、Glce遺伝子の発現タンパク質に3つの転写物があり、転写物1は3つのエクソン、2つのイントロンを、転写物2は5つのエクソン、4つのイントロンを、転写物3は2つのエクソン、1つのイントロンを有する。これらの配列の情報は文献またはEnsemblGene、Genebankなどの公共データベースを参照する。
ヒトなどのほかの種のGlce遺伝子も文献またはEnsemblGene、Genebankなどの公共データベースを参照する。
もちろん、用語「Glce」は天然に存在する様々なGlce遺伝子の変異形態も含む。代表的な例は、コドンの縮重性によって野生型と同様のGlceタンパク質をコードするヌクレオチド配列、野生型Glceタンパク質の保存的変異ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。また、マウス以外のほかの哺乳動物について、当該用語はGlce遺伝子の当該哺乳動物におけるホモログを指す。たとえば、ヒトの場合、当該用語はヒトのGlceを指す（マウスGlce遺伝子とヒトGlce遺伝子はcDNAの相同性が91.4％で、アミノ酸配列の相同性が97.4％であることが知られている）。
Glce遺伝子またはそのタンパク質の不活性化剤
本発明において、前記Glceの不活性化剤は全部を不活性化させるものまたは一部を不活性化させるものを含む。
本発明のGlceタンパク質の不活性化剤は、（a）阻害剤、（b）Glce遺伝子のノックアウト剤を含み、前記阻害剤の例は、小分子化合物、抗体、アンチセンス核酸、miRNA、siRNA、またはこれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。
肥満症またはその関連疾患
肥満症は、よく見られる、古くからの代謝症候群である。人体の摂取するエネルギーが消耗するエネルギーよりも多い場合、余ったエネルギーが脂肪の形で体内に蓄積し、その量が正常の生理的需要量を超え、そして一定の値に達すると、肥満症になる。正常の成人男性では、脂肪組織の重量が体重の15〜18％を占め、女性では、約20〜25％を占める。年齢の増加につれ、体脂肪が占める比率が相応的に増加する。体脂肪の増加によって体重が標準体重よりも20％高いか、ボディマス指数（BMI=体重（kg）/（身長）2（m2））が24よりも多い場合、肥満症と呼ぶ。顕著な病因が見つからないものを単純性肥満症と、明確な病因があるものを二次性肥満症と呼ぶ。世界保険機関の予測では、人類が現在直面する最も軽視されやすいが、発症率が急激に上昇する疾患である。
統計によると、肥満者は脳梗塞や心不全が併発する発症率が正常体重者よりも1倍高く、冠動脈性心疾患の罹患が正常体重者よりも2倍多く、高血圧の発症率が正常体重者よりも2〜6倍多く、糖尿病が合併する患者が正常体重者よりも約4倍高く、胆石症が合併する患者が正常体重者よりも4〜6倍高く、より重篤な場合、肥満者の寿命は顕著に短くなる。体重が10％オーバーする45歳の男性は、寿命が正常体重者よりも4年も短くなることが報告され、日本の統計資料では、標準化死亡率は100％で、肥満者の死亡率は127.9％であることが示された。
本発明において、肥満症またはその関連疾患は、肥満症、高脂血症、高血圧および/または糖尿病を含むが、これらに限定されない。
遺伝子の不活性化
機能が未知の遺伝子に対する研究は多くの方法が用いられるが、たとえば、研究される遺伝子を不活性化させ、得られた遺伝修飾の表現型の変化を分析することによって、当該遺伝子の機能の情報を得ることができる。この研究方法のもう一つの利点は、遺伝子の機能を疾患と関連付けることによって、遺伝子の機能を解明すると同時に、当該遺伝子を潜在的な薬物または薬物標的として治療可能な疾患の情報および疾患の動物モデルを得ることができる。遺伝子を不活性化させる方法は、遺伝子ノックアウト、遺伝子破壊または遺伝子挿入の手段によって実現することができる。中でも、遺伝子ノックアウト技術は、ヒト遺伝子の全体における機能の研究に非常に有力な手段である。
動物モデル
本発明において、非常に有効な肥満症またはその関連疾患の非ヒト哺乳動物モデルを提供する。
本発明において、非ヒト哺乳動物の例は、マウス、ラット、ウサギ、サルなどを含むが、これらに限定されず、ラットおよびマウスが好ましい。
本明細書で使用されるように、用語「Glce遺伝子が不活性化した」は、1つまたは2つのGlce遺伝子が不活性化した場合含み、すなわち、Glce遺伝子がヘテロ的に不活性化した場合およびホモ的に不活性化した場合を含む。たとえば、Glce遺伝子が不活性化したマウスはヘテロ接合のマウスでもホモ接合のマウスでもよい。
本発明において、遺伝子をノックアウトすること、または外因性遺伝子（または断片）を導入することによってGlce遺伝子を不活性化させる方法などでGlce遺伝子が不活性化した非ヒト哺乳動物（たとえばマウス）を製造することができる。本分野において、遺伝子をノックアウトすること、または外因性遺伝子を導入することによって標的遺伝子を不活性化させる技術は既知のもので、これらの通常の技術はいずれも本発明に使用することができる。
本発明のもう一つの好適な例において、Glce遺伝子の不活性化は遺伝子をノックアウトすることによって実現するものである。
本発明のもう一つの好適な例において、Glce遺伝子の不活性化はGlce遺伝子に外因性遺伝子（または断片）を導入することによって実現するものである。
本発明の一つの具体的な実例において、外因性挿入断片を含有する構築物を構築し、当該構築物は標的遺伝子（Glce）の挿入部位の両側のフランキング配列と相同性を有するホモロジーアームを含有することで、相同組換えによって高頻度で外因性挿入断片（または）遺伝子をGlceゲノム配列（特にエクソン領域）に挿入し、マウスGlce遺伝子のフレームシフト、途中終止、またはノックアウトをさせ、Glceの欠失または不活性化に至ることが可能である。
本発明の方法によって得られるホモ接合またはヘテロ接合のマウスは生育可能で、発育が正常である。不活性化したGlce遺伝子はメンデルの法則に従って後代に遺伝することが可能である。
一つの好適な例において、本発明は、Glce遺伝子が欠失したホモ接合マウスのモデル動物を提供する。
候補薬物または治療剤
本発明において、本発明の動物モデルを利用し、肥満症またはその関連疾患を治療する候補薬物または治療剤を選別する方法を提供する。
本発明において、候補薬物または治療剤とは、ある薬理学的活性を有することが知られた物質または検証されている、ある薬理学的活性を有する可能性がある物質で、核酸、タンパク質、化学合成された小分子または大分子化合物、細胞などを含むが、これらに限定されない。候補薬物または治療剤の投与形態は、経口投与、静脈内注射、腹腔内注射、皮下注射、脊椎内投与または直接脳内注射でもよい。
本発明の主な利点は以下の通りである。
（1）本発明は好適に臨床における原発性の肥満症をシミュレートすることができる。
（2）個体の間に手術の操作または薬物の投与量による差が存在せず、その遺伝背景が高度に一致する。
（3）肥満症の発病機序の研究および新薬の選別の有力なツールとして有用である。
（4）本発明の肥満症モデルは遺伝も、表現型も安定している。
（5）本発明の方法によって得られるホモ接合またはヘテロ接合の動物モデルは生育可能で、発育が正常である。遺伝子組み換えのヘテロ接合の雄マウスは生殖能力を有し、不活性化したGlce遺伝子はメンデルの法則に従って後代に遺伝することが可能である。
（6）本発明の肥満症またはその関連疾患の動物モデルは肥満、高脂血、高血圧などの症状を示すため、幅広く肥満に関連する疾患の薬物の選別と試験に使用することができる。
（7）本発明は、初めて、Glce遺伝子をノックアウトまたは不活性化した動物モデルは同時に卒中、抑うつ、不安などの疾患の研究にも有用であることを開示した。
以下、具体的な実施例によって、さらに本発明を説明する。これらの実施例は本発明を説明するために用いられるものだけで、本発明の範囲の制限にはならないと理解されるものである。以下の実施例で具体的な条件が示されていない実験方法は、通常、たとえばSambrookら、「モレキュラー・クローニング：研究室マニュアル」(ニューヨーク、コールド・スプリング・ハーバー研究所出版社、1989) に記載の条件などの通常の条件に、あるいは、メーカーのお薦めの条件に従う。特に説明しない限り、百分率および部は重量百分率および重量部である。
特に説明しない限り、実施例で使用された材料はいずれも市販品である。
実施例1 Creレコンビナーゼを持つGlce遺伝子突然変異ホモ接合体マウスの獲得
まず、Glce突然変異遺伝子配列を構築した（図1）。図1に示すようにGlce遺伝子ノックアウトターゲティングベクター配列を設計し、Loxp/Loxp対立遺伝子をGlce遺伝子の3番エクソンの両側に挿入し、3'末端にneo遺伝子を挿入し、5'末端アームは3125 bpで、3'末端アームは3718 bpである。図2は、Glce遺伝子ノックアウトターゲティングベクターのプラスミドマップである。1．標的遺伝子（Glce）の相同性断片を獲得し、そのDNA断片をプラスミドベクターにクローンした。2．組み換えプラスミドから標的遺伝子の大半の相同性DNA配列を切り取り、一部の配列のみを線形プラスミドベクターの両末端に残した。3．neo遺伝子を標的遺伝子の相同性配列を持つ線形プラスミドに、残った標的遺伝子の相同性配列の間に位置するようにクローンした。4．標的遺伝子の相同性配列の外側に線形的にプラスミドベクターを組み換え、hsv-tk遺伝子をその線形ベクターにクローンした。
遺伝子部位は下記表に示す。
注：遺伝子部位の表記は「10kb Up and Down of Glce gene」を参照する。
図3は、Glce遺伝子ノックアウトターゲティングベクターのプラスミドDNAの酵素切断同定で、1 kb DNAラダーを使用した。ターゲティングベクターの直線化：100μg Glce-CKOプラスミドDNA(Biovector NTCCから購入)をNotI（酵素使用量：150U）で直線化させ、酵素切断系は150μlで、37℃で一晩消化し、等体積のフェノール/クロロホルム、クロロホルムで処理した後、無水エタノールで沈殿させ、100μlの無菌PBSで再懸濁させて使用に備えた。ES細胞のターゲティング：ES細胞SCR012は129SV/EV品種の雄マウス（中国科学院上海実験動物センターから購入）由来の胚性幹細胞で、直線化DNA量は35μgで、エレクトロポレーション装置の型番はBio−Rad Gene Pulser（カタログ番号：165-2105）で、エレクトロポレーションの条件は電圧 240 v、 電気容量 500μF、実際通電時間10.5ms、実際電圧 256 vで、クローン・選別の条件は300μg/ml G418および2μM GanCで8日選別した。採集した耐性クローンおよび提供されたDNA標本は合計96例であった。
陽性ES細胞のゲノムの同定方法：
1．5'アームのPCR同定
P1プライマーは5'アームの外に位置し、P2プライマーはneo組み換え領域に位置し、アーム外プライマーと8.2kb離れている。
P1およびP2プライマー配列：
P1:GGCATTTGCACTCACATACACAACCCA (遺伝子部位:15824-15850)（配列番号1）
P2: GTGCCACTCCCACTGTCCTTTCC （配列番号2）
2．3'アームのPCR同定
P4プライマーは3'アームの外に位置し、P3プライマーはneo組み換え領域に位置し、アーム外プライマーと4.7kb離れている。
P4およびP3プライマー配列：
P4: GAGAGGCTTGGAGGCGGTGCTGATCTT (遺伝子部位:29603-29629)（配列番号3）
P3: GATATACTATGCCGATGATTAATTGTC（配列番号4）
ES細胞クローンの同定結果はPCR同定で薬剤耐性ES細胞クローンは96個で、そのうち、19個のESクローンに両アームの相同性組み換えがあった。PCR産物はDNA配列決定によってさらに検証された。図4は、ESクローンのゲノムDNAの5'末端PCR産物の電気泳動結果を示す。図5は、ESクローンのゲノムDNAの3'末端PCR産物の電気泳動結果を示す。
陽性ESクローン胚盤胞の注射：
顕微注射用胚盤胞の由来：C57BL/6Jマウス（上海SLAC実験動物有限公司から購入）を過剰排卵させ、自然受胎して体内で胚盤胞期まで発育させた。60個の胚を注射し、注射後3匹の偽妊娠マウスのレシピエントの子宮に移植し、レシピエントはC57BL/6J(♂)とCBA（♀）（上海SLAC実験動物有限公司から購入）の雑種第一代であった。生まれたマウスからキメラ率が50％超のマウスを選んで成年まで飼育し、C57BL/6J雌マウスと交尾させ、後代の灰色マウスに対して尻尾のゲノムDNAを抽出してPCR同定を行い（同定のプロトコールは上記と同様）、結果は図6に示すように、両アーム陽性F1代マウス（Loxp/+）を得た。
F1代マウスを成年まで飼育し、NSE-Creツールマウス（上海SLAC実験動物有限公司から購入）と交雑させ、F2代Loxp/+ Creマウスを得た。F2代マウスを成年まで飼育し、F2代同士で雌雄を交尾させ、メンデルの法則に従って遺伝し、得られたF3代突然変異ホモ接合体（Loxp/Loxp Cre）：突然変異ヘテロ接合体（Loxp/+ Cre）：野生型（+/+ Cre）の比率は約1：2：1であった。尻尾のゲノムDNAを抽出してPCR同定を行い（同定のプロトコールは上記と同様）、結果は図7に示す。突然変異ホモ接合体マウスLoxp/Loxp Cre）を後記の動物行動学実験に使用した。
実施例2 Glce突然変異ホモ接合体マウスの形態学的分析
Glce突然変異ホモ接合体マウスの出生比率はメンデルの法則に合致し、マウスの体重を検出した結果は図8に示す。結果から、成年C57BL/6正常マウスと比べ、成年Glce神経特異的ノックアウトマウスの体型がより肥満であったことが明らかになった。
実施例3 Glce突然変異ホモ接合体マウスの体重の分析
Glce突然変異ホモ接合体マウスを電子天秤に乗せて体重を測定し、成年Glce突然変異ホモ接合体マウスと成年C57BL/6正常マウスの体重の違いを検討した。
研究では（図9）、成年C57BL/6正常マウスと比べ、成年Glce突然変異ホモ接合体マウスは肥満症状の発生率がより高く、かつ体重が成年C57BL/6正常マウスに対して統計的に有意差があったことが見られた。
結果から、成年C57BL/6正常マウスの体重の平均値の20％以上という基準で肥満を定義し、雌成年C57BL/6正常マウスの体重は平均で28.7 gで、雌成年Glce突然変異ホモ接合体マウスの体重は平均で34.6 gで、雌成年Glce突然変異ホモ接合体マウスは肥満症状の発生率が約50％で、雌成年C57BL/6正常マウスに対して統計的に有意差があった（P＜0.01）ことが示された。雄成年C57BL/6正常マウスの体重は平均で32.2 gで、雄成年Glce突然変異ホモ接合体マウスの体重は平均で39.5 gで、雄成年Glce突然変異ホモ接合体マウスは肥満症状の発生率が約66％で、雄成年C57BL/6正常マウスに対して統計的に有意差があった（P＜0.01）ことが示された。成年C57BL/6正常マウス（雌も雄も含む）の体重は平均で30.7 gで、成年Glce突然変異ホモ接合体マウス（雌も雄も含む）の体重は平均で37.8 gで、成年Glce突然変異ホモ接合体マウスは肥満症状の発生率の合計が約60％で、成年C57BL/6正常マウスに対して統計的に有意差があった（P＜0.01）ことが示された。
上記結果から、成年C57BL/6正常マウスと比べ、成年Glce突然変異ホモ接合体マウスは肥満症状の発生率がより高いことが十分に示された。
実施例4 Glce突然変異ホモ接合体マウスの体脂肪の分析
Glce突然変異ホモ接合体マウスを解剖した後、両側の性腺周囲脂肪組織、両側の腎臓周囲脂肪組織、両側の鼠径部脂肪組織を含む脂肪組織を採取して電子天秤に乗せて重量を測定し、成年Glce突然変異ホモ接合体マウスと成年C57BL/6正常マウスの脂肪組織の湿重量の違いを検討した。
研究では（図10）、成年C57BL/6正常マウスと比べ、成年Glce突然変異ホモ接合体マウスは体脂肪の湿重量が増加し、統計的に有意差があったことが見られた。
結果から、雌成年C57BL/6正常マウスの体脂肪の湿重量は平均で0.94 gで、雌成年Glce突然変異ホモ接合体マウスの体脂肪の湿重量は平均で8.50 gで、雌成年C57BL/6正常マウスに対して統計的に有意差があった（P＜0.01）ことが示された。雄成年C57BL/6正常マウスの体脂肪の湿重量は平均で2.98 gで、雄成年Glce突然変異ホモ接合体マウスの体脂肪の湿重量は平均で7.52 gで、雄成年C57BL/6正常マウスに対して統計的に有意差があった（P＜0.01）ことが示された。成年C57BL/6正常マウス（雌も雄も含む）の体脂肪の湿重量は平均で2.21 gで、成年Glce突然変異ホモ接合体マウス（雌も雄も含む）の体脂肪の湿重量は平均で8.01 gで、成年C57BL/6正常マウスに対して統計的に有意差があった（P＜0.01）ことが示された。
上記結果から、成年C57BL/6正常マウスと比べ、成年Glce突然変異ホモ接合体マウスは体脂肪の湿重量が増加することが十分に示された。
実施例5 Glce突然変異ホモ接合体マウスの脂肪組織の分析
5.1 Glce突然変異ホモ接合体マウスの両側の性腺周囲脂肪組織の分析
Glce突然変異ホモ接合体マウスを解剖した後、両側の性腺周囲脂肪組織を採取して電子天秤に乗せて重量を測定し、成年Glce突然変異ホモ接合体マウスと成年C57BL/6正常マウスの両側の性腺周囲脂肪組織の湿重量の違いを検討した。
成年C57BL/6正常マウスと比べ、成年Glce突然変異ホモ接合体マウスは両側の性腺周囲脂肪組織の湿重量が顕著に増加した（図11）。
結果から、雌成年C57BL/6正常マウスの両側の性腺周囲脂肪組織の湿重量は平均で0.54 gで、雌成年Glce突然変異ホモ接合体マウスの両側の性腺周囲脂肪組織の湿重量は平均で3.10 gで、雌成年C57BL/6正常マウスに対して統計的に有意差があった（P＜0.01）ことが示された。雄成年C57BL/6正常マウスの両側の性腺周囲脂肪組織の湿重量は平均で1.66 gで、雄成年Glce突然変異ホモ接合体マウスの両側の性腺周囲脂肪組織の湿重量は平均で2.85 gで、雄成年C57BL/6正常マウスに対して統計的に有意差があった（P＜0.01）ことが示された。成年C57BL/6正常マウス（雌も雄も含む）の両側の性腺周囲脂肪組織の湿重量は平均で1.24 gで、成年Glce突然変異ホモ接合体マウス（雌も雄も含む）の両側の性腺周囲脂肪組織の湿重量は平均で2.98 gで、成年C57BL/6正常マウスに対して統計的に有意差があった（P＜0.01）ことが示された。
上記結果から、成年C57BL/6正常マウスと比べ、成年Glce突然変異ホモ接合体マウスは両側の性腺周囲脂肪組織の湿重量が顕著に増加することが十分に示された。
5.2 Glce突然変異ホモ接合体マウスの両側の腎臓周囲脂肪組織の分析
Glce突然変異ホモ接合体マウスを解剖した後、両側の腎臓周囲脂肪組織を採取して電子天秤に乗せて重量を測定し、成年Glce突然変異ホモ接合体マウスと成年C57BL/6正常マウスの両側の腎臓周囲脂肪組織の湿重量の違いを検討した。
成年C57BL/6正常マウスと比べ、成年Glce突然変異ホモ接合体マウスは両側の腎臓周囲脂肪組織の湿重量が顕著に増加した（図12）。
結果から、雌成年C57BL/6正常マウスの両側の腎臓周囲脂肪組織の湿重量は平均で0.36 gで、雌成年Glce突然変異ホモ接合体マウスの両側の腎臓周囲脂肪組織の湿重量は平均で2.06 gで、雌成年C57BL/6正常マウスに対して統計的に有意差があった（P＜0.01）ことが示された。雄成年C57BL/6正常マウスの両側の腎臓周囲脂肪組織の湿重量は平均で1.18 gで、雄成年Glce突然変異ホモ接合体マウスの両側の腎臓周囲脂肪組織の湿重量は平均で1.61 gで、雄成年C57BL/6正常マウスに対して統計的に有意差があった（P＜0.01）ことが示された。成年C57BL/6正常マウス（雌も雄も含む）の両側の腎臓周囲脂肪組織の湿重量は平均で0.87 gで、成年Glce突然変異ホモ接合体マウス（雌も雄も含む）の両側の腎臓周囲脂肪組織の湿重量は平均で1.83 gで、成年C57BL/6正常マウスに対して統計的に有意差があった（P＜0.01）ことが示された。
上記結果から、成年C57BL/6正常マウスと比べ、成年Glce突然変異ホモ接合体マウスは両側の腎臓周囲脂肪組織の湿重量が顕著に増加することが十分に示された。
5.3 Glce突然変異ホモ接合体マウスの内臓脂肪組織の分析
Glce突然変異ホモ接合体マウスを解剖した後、両側の性腺周囲脂肪組織および両側の腎臓周囲脂肪組織を採取して電子天秤に乗せて重量を測定し、内臓脂肪組織の湿重量の合計重量は両側の性腺周囲脂肪組織と両側の腎臓周囲脂肪組織の湿重量の合計で、成年Glce突然変異ホモ接合体マウスと成年C57BL/6正常マウスの両側の内臓脂肪組織の湿重量の違いを検討した。
成年C57BL/6正常マウスと比べ、成年Glce突然変異ホモ接合体マウスは内臓脂肪組織の湿重量が顕著に増加した（図13）。
結果から、雌成年C57BL/6正常マウスの内臓脂肪組織の湿重量は平均で0.90 gで、雌成年Glce突然変異ホモ接合体マウスの内臓脂肪組織の湿重量は平均で5.16 gで、雌成年C57BL/6正常マウスに対して統計的に有意差があった（P＜0.01）ことが示された。雄成年C57BL/6正常マウスの内臓脂肪組織の湿重量は平均で2.84 gで、雄成年Glce突然変異ホモ接合体マウスの内臓脂肪組織の湿重量は平均で4.45 gで、雄成年C57BL/6正常マウスに対して統計的に有意差があった（P＜0.01）ことが示された。成年C57BL/6正常マウス（雌も雄も含む）の内臓脂肪組織の湿重量は平均で2.11 gで、成年Glce突然変異ホモ接合体マウス（雌も雄も含む）の内臓脂肪組織の湿重量は平均で4.81 gで、成年C57BL/6正常マウスに対して統計的に有意差があった（P＜0.01）ことが示された。
上記結果から、成年C57BL/6正常マウスと比べ、成年Glce突然変異ホモ接合体マウスは内臓脂肪組織の湿重量が顕著に増加することが十分に示された。
5.4 Glce突然変異ホモ接合体マウスの皮下脂肪組織（たとえば両側の鼠径部脂肪組織）の分析
Glce突然変異ホモ接合体マウスを解剖した後、両側の鼠径部脂肪組織を採取して電子天秤に乗せて重量を測定し、皮下脂肪組織の湿重量は両側の鼠径部脂肪組織の湿重量の合計で、成年Glce突然変異ホモ接合体マウスと成年C57BL/6正常マウスの皮下脂肪組織の湿重量の違いを検討した。
成年C57BL/6正常マウスと比べ、成年Glce突然変異ホモ接合体マウスは両側の鼠径部脂肪組織（皮下脂肪組織を代表する）の湿重量が顕著に増加した（図14）。
結果から、雌成年C57BL/6正常マウスの両側の鼠径部脂肪組織の湿重量は平均で0.04 gで、雌成年Glce突然変異ホモ接合体マウスの両側の鼠径部脂肪組織の湿重量は平均で3.34 gで、雌成年C57BL/6正常マウスに対して統計的に有意差があった（P＜0.01）ことが示された。雄成年C57BL/6正常マウスの両側の鼠径部脂肪組織の湿重量は平均で0.13 gで、雄成年Glce突然変異ホモ接合体マウスの両側の鼠径部脂肪組織の湿重量は平均で3.07 gで、雄成年C57BL/6正常マウスに対して統計的に有意差があった（P＜0.01）ことが示された。成年C57BL/6正常マウス（雌も雄も含む）の両側の鼠径部脂肪組織の湿重量は平均で0.10 gで、成年Glce突然変異ホモ接合体マウス（雌も雄も含む）の両側の鼠径部脂肪組織の湿重量は平均で3.20 gで、成年C57BL/6正常マウスに対して統計的に有意差があった（P＜0.01）ことが示された。
上記結果から、成年C57BL/6正常マウスと比べ、成年Glce突然変異ホモ接合体マウスは両側の鼠径部脂肪組織（皮下脂肪組織を代表する）の湿重量が顕著に増加することが十分に示された。
実施例6 Glce突然変異ホモ接合体マウスの抑うつの行動学的分析
6.1 自発的行動
Creレコンビナーゼを持つGlce遺伝子突然変異ホモ接合体マウスを暗黒の実験箱（110 mm × 110 mm × 330 mm）に置き、マウスの自発的行動を5分間測定した。赤外撮影によってマウスの行動の様子を撮影した。上海吉量ソフトウェア科技有限公司の動画追跡ソフトと分析ソフトによってマウスの行動軌跡および行動時間を分析した。
研究では、青年期C57BL/6正常マウスと比べ、青年期Glce突然変異ホモ接合体マウスは自発的行動の合計距離、行動時間および行動速度に有意差がなかったことが示された（図15）。
結果から、青年期Glce突然変異ホモ接合体マウスの生まれつきの習性は、C57BL/6正常マウスに対して有意差がないことが明らかになった。
6.2 オープンフィールド実験
マウスを明らかなオープンフィールドの実験箱（500 mm × 500 mm × 590 mm）に置き、マウスの探索行動を5分間測定した。赤外撮影によってマウスの行動の様子を撮影した。上海吉量ソフトウェア科技有限公司の動画追跡ソフトと分析ソフトによってマウスの行動軌跡および行動時間を分析した。
結果から、青年期C57BL/6正常マウスと比べ、青年期Glce突然変異ホモ接合体マウスはオープンフィールド実験における行動の合計距離、行動時間および行動速度のいずれも顕著に低下したことが示された（図16）。結果から、青年期Glce突然変異ホモ接合体マウスは、C57BL/6正常マウスと比べ、行動が顕著に減少することが明らかになった。
青年期C57BL/6正常マウスと比べ、青年期Glce突然変異ホモ接合体マウスはオープンフィールドの中央領域における行動の距離、行動時間および行動速度のいずれも顕著に低下し（図17）、結果から、青年期Glce突然変異ホモ接合体マウスはC57BL/6正常マウスと比べ、新規環境を探索する行動が顕著に減少することが明らかになった。
青年期C57BL/6正常マウスと比べ、青年期Glce突然変異ホモ接合体マウスはオープンフィールドの周辺領域における行動の距離、行動時間および行動速度のいずれも顕著に低下し（図18）、結果から、青年期Glce突然変異ホモ接合体マウスはC57BL/6正常マウスと比べ、行動が顕著に減少することが明らかになった。
全体的に、青年期C57BL/6正常マウスと比べ、青年期Glce突然変異ホモ接合体マウスは活動が顕著に減少し、かつ新規環境を探索する行動が顕著に減少し、これは青年期Glce突然変異ホモ接合体マウスはある程度の抑うつを有することを示す。
6.3 強制水泳
マウスを直径12 cm、高さ25 cmの水槽（水温21〜22℃）に置き、水温が低い水で泳ぐことを強制し、マウスの行動を6分間測定し、マウスの後半の4分間における無動時間を記録した。ビデオ撮影によってマウスの行動の様子を撮影した。マウスの行動時間を分析した。研究では、青年期C57BL/6正常マウスと比べ、青年期Glce突然変異ホモ接合体マウスは強制水泳実験における無動時間が顕著に増加したことが見られた（図19）。
結果から、青年期Glce突然変異ホモ接合体マウスは、C57BL/6正常マウスと比べ、ある程度の抑うつを有することが明らかになった。
実施例7 Glce突然変異ホモ接合体マウスの卒中の行動学的分析
Creレコンビナーゼを持つGlce遺伝子突然変異ホモ接合体マウスを清潔な飼育環境において飼育した。当該マウス動物モデルは高齢期（約1.5年）において卒中様症状が発生した。一連の卒中の行動学実験によってマウス動物モデルの卒中様症状および重篤度を評価したが、実験方法は2001年にStrokeに発表されたラットの卒中症状の重篤度を評価する一連の総合的な行動学実験（Chen Jら, Stroke. 2001）を参照し、運動テスト、感覚テスト、平衡能力テスト、主体の反射テスト、異常の行動能力テストなどを含み、具体的に、平地歩行テスト、尾懸垂テスト、視覚・触覚テスト、固有感覚テスト、平均台テスト、耳介反射、閉瞼反射、驚き反射、引き付け、痙攣、ジストニアなどの行動試験で、マウスの行動を採点した。
Glce遺伝子突然変異ホモ接合体マウス群では、40匹のうち、10匹が高齢期において卒中が発生し、卒中の発生率が25％で、対照群であるC57BL/6マウス群では、40匹のマウスのうち、2匹が高齢期において卒中が発生し、卒中の発生率が5％で、結果から、Glce伝子突然変異ホモ接合体マウスはC57BL/6マウスと比べて卒中が発生しやすいことが明らかになった。
7.1 運動テスト
（1）平地歩行テスト：マウスを平地に置き、マウスが正常に歩行できるか観察し、正常に歩行できる場合、0点と評価した。直行できたか観察し、直行できなかった場合、1点と、逆の場合、0点と評価した。損傷側を中心に回ったか観察し、損傷側を中心に回った場合、1点と、逆の場合、0点と評価した。損傷側に転倒したか観察し、損傷側に転倒した場合、1点と、逆の場合、0点と評価した。
（2）尾懸垂テスト：マウスの尾を吊り上げ、マウスの肢体の活動状況を、前肢が内側に曲がって強く掴んだか観察し、マウスの前肢が内側に曲がって強く掴んだ場合、1点と、逆の場合、0点と評価した。後肢が内側に曲がって強く掴んだか観察し、マウスの後肢が内側に曲がって強く掴んだ場合、1点と、逆の場合、0点と評価した。30秒内で頭部が上がって懸垂軸との角度が10度を超えたか観察し、30秒内で頭部が上がって懸垂軸との角度が10度を超えた場合、1点と、逆の場合、0点と評価した。
7.2 感覚テスト
（1）視覚・触覚テスト：マウスの体を掴み、マウスの前肢が自由に活動できるようにし、マウスを台の縁部またはケージの縁部に向かせ、マウスは前肢をすぐ前へ伸ばして台の縁部またはケージの縁部を掴むことができたか、観察した。マウスは前肢をすぐ前へ伸ばして台の縁部またはケージの縁部を掴むことができた場合、1点と、逆の場合、0点と評価した。
（2）固有感覚テスト：マウスの体を掴み、マウスの後肢が自由に活動できるようにし、マウスの前肢を台の縁部またはケージの縁部に置き、後肢を宙に浮かせ、ピンセットでマウスの後肢の大腿の筋肉を掴み、マウスの後肢がすぐ引けたか、観察した。マウスの後肢がすぐ引けなかった場合、1点と、逆の場合、0点と評価した。
7.3 平衡能力テスト
マウスを平均台の一方の端部に置き、マウスの平均台における自由行動の状況を観察し、主に以下の7つの項目を含む：（1）身体の平衡を保ち、平均台で自由に歩けたか観察し、身体の平衡を保ち、平均台で自由に歩けた場合、0点と評価した。
（2）平均台の縁部を掴んだか観察し、平均台の縁部を掴んだ場合、1点と評価した。
（3）平均台を抱いたが、1本の後肢が落ちたか観察し、平均台を抱いたが、1本の後肢が落ちた場合、2点と評価した。
（4）平均台を抱いたが、2本の後肢が落ちたか、あるいは平均台で回り、かつ平均台の上にいた時間が60秒を超えたか観察し、平均台を抱いたが、2本の後肢が落ちたか、あるいは平均台で回り、かつ平均台の上にいた時間が60秒を超えた場合、3点と評価した。
（5）平均台で平衡を保とうとしたが、最終的に落ち、平均台の上にいた時間が40秒を超えたか観察し、平均台で平衡を保とうとしたが、最終的に落ち、平均台の上にいた時間が40秒を超えた場合、4点と評価した。
（6）平均台で平衡を保とうとしたが、最終的に落ち、平均台の上にいた時間が20秒を超えたか観察し、平均台で平衡を保とうとしたが、最終的に落ち、平均台の上にいた時間が20秒を超えた場合、5点と評価した。
（7）平均台で平衡を保とうとするか、平均台を抱こうとする意欲がなく、平均台の上にいた時間が20秒未満で落ちたか観察し、平均台で平衡を保とうとするか、平均台を抱こうとする意欲がなく、平均台の上にいた時間が20秒未満で落ちた場合、6点と評価した。
7.4 主体の反射テストおよび異常の行動能力テスト
（1）耳介反射：綿棒でマウスの耳道を刺激し、マウスに頭を振る反応あったか観察し、あるとマウスが耳介反射を有すると、ないとマウスが耳介反射を有さないといつことで、1点と評価した。
（2）閉瞼反射：綿棒でマウスの虹彩を刺激し、マウスに瞼を閉じる反応あったか観察し、あるとマウスが閉瞼反射を有すると、ないとマウスが閉瞼反射を有さないといつことで、1点と評価した。
（3）驚き反射：大きな音を出し、たとえば、瓶を落とし、マウスが驚いて跳ぶ反応あったか観察し、あるとマウスが驚き反射を有すると、ないとマウスが驚き反射を有さないといつことで、1点と評価した。
（4）マウスに引き付け、痙攣、ジストニアなどの現象が現れたか観察した。マウスに引き付け、痙攣、ジストニアなどの現象が現れたら、1点と評価した。
各項目の合計得点を算出し、合計得点1〜6点は軽度損傷で、合計得点7〜12点は中度損傷で、合計得点13〜18点は重度損傷である。
たとえば、図20におけるマウスは、平地歩行テストでは、直行できないので1点を、損傷側を中心に回ったので1点を、損傷側に転倒したので1点を、尾懸垂テストでは、前肢が内側に曲がって強く掴んだので1点を、後肢が内側に曲がって強く掴んだので1点を、30秒内で頭部が上がって懸垂軸との角度が10度を超えたので1点を、視覚・触覚テストでは、前肢をすぐ前へ伸ばして台の縁部またはケージの縁部を掴むことができたので0点を、固有感覚テストでは、後肢がすぐ引けたので0点を、平衡能力テストでは、マウスが平均台で平衡を保とうとしたが、最終的に落ち、平均台の上にいた時間が40秒を超えたので4点を、マウスが耳介反射を有するので0点を、閉瞼反射を有するので0点を、驚き反射を有するので0点を、マウスに引き付けが現れたので1点を得た。当該マウスの合計得点は、1+1+1+1+1+1+0+0+4+0+0+0+1=11で、中度卒中と評価した。
実施例8 Glce突然変異ホモ接合体マウスの脳組織梗塞の分析
TTC（2,3,5-トリフェニルテトラゾリウムクロリド）染色方法によって卒中マウスの脳組織梗塞の様子を検出した。操作手順は、麻酔後そのまま脳を採取し、切片しやいように-20度の冷蔵庫で5〜10分間快速凍結した。切片：1 mmおきにカットした。切片をTTCに置き、通常の濃度は2％である。アルミホイルで覆った後、37度のインキュベーターで15〜30分間置き、脳切片が均一に染色液に触れるように、脳切片を度々ひっくり返った。その後、4％パラホルムアルデヒドで30分間固定した。撮影した。
TTCは脂溶性光感受性複合体で、哺乳動物組織の虚血梗塞を染色して検出することができる。呼吸鎖におけるピリジン-ヌクレオチダーゼ系のプロトン受容体で、正常組織における脱水素酵素と反応して赤色に呈色し、虚血組織で脱水素酵素の活性が低下し、反応しないため、変化せずに蒼白になる。
結果は図21に示すように、TTCによって染色した後、卒中マウスの正常脳組織は赤で、梗塞した脳組織は蒼白であったことが示された。嗅球、前頭葉、脳梁、海馬組織、線条体、扁桃体、下垂体、側頭葉、小脳、脳橋、延髄などのいずれにも梗塞が現れたことが見られた。
実施例9 Glce突然変異ホモ接合体マウスの不安の行動学的分析
Creレコンビナーゼを持つGlce遺伝子突然変異ホモ接合体マウス（以下、Glce突然変異ホモ接合体マウスと略す）を清潔な飼育環境において飼育した。マウスの青年期（＞3月齢）において自発的行動、オープンフィールド実験、高架式十字迷路実験を含む一連の動物行動学実験によってマウス動物モデルの不安症様症状を評価した。
9.1 自発的行動
マウスを明らかな暗黒の実験箱（110mm × 110mm × 330mm）に置き、マウスの自発的行動を5分間測定した。赤外撮影によってマウスの行動の様子を撮影した。上海吉量ソフトウェア科技有限公司の動画追跡ソフトと分析ソフトによってマウスの行動軌跡および行動時間を分析した。
研究では、青年期C57BL/6正常マウスと比べ、青年期Glce突然変異ホモ接合体マウスは自発的行動の合計距離、行動時間および行動速度に有意差がなかったことが見られた（図22）。
結果から、青年期Glce突然変異ホモ接合体マウスの生まれつきの習性は、C57BL/6正常マウスに対して有意差がないことが明らかになった。
9.2 オープンフィールド実験
マウスを明らかなオープンフィールドの実験箱（500 mm × 500 mm × 590 mm）に置き、マウスの探索行動を5分間測定した。赤外撮影によってマウスの行動の様子を撮影した。上海吉量ソフトウェア科技有限公司の動画追跡ソフトと分析ソフトによってマウスの行動軌跡および行動時間を分析した。
研究では、青年期C57BL/6正常マウスと比べ、青年期Glce突然変異ホモ接合体マウスはオープンフィールドの中央領域における行動の合計距離、行動時間および行動速度のいずれも顕著に低下したことが見られた（図23）。
結果から、青年期Glce突然変異ホモ接合体マウスは、C57BL/6正常マウスと比べ、新規環境を探索する行動が顕著に現象し、かつより強烈な不安が生じることが明らかになった。
9.3 高架式十字迷路実験
マウスをオープンアーム1本の長さ30 cm、幅6 cm、クローズアーム1本の長さ30 cm、幅6 cm、高さ14.5 cmの高架式十字迷路に置き、地面から約50 cm離れた高さで、ビデオ撮影によってマウスの5分間内での高架式十字迷路における行動状況を撮影した。マウスの行動を分析したところ、青年期C57BL/6正常マウスと比べ、青年期Glce突然変異ホモ接合体マウスは高架式十字迷路実験では、オープンアームを探索する時間は顕著に減少し、クローズアームで留まった時間は顕著に増加し、中央領域で留まった時間は有意差がなかったことが見られた（図24）。
結果から、青年期Glce突然変異ホモ接合体マウスは、C57BL/6正常マウスと比べ、不安の程度が顕著に増加することが明らかになった。雄青年期Glce突然変異ホモ接合体マウスは、雌青年期Glce突然変異ホモ接合体マウスと比べ、不安がより顕著であった。これ以外、ある程度の不安が生じた青年期Glce突然変異ホモ接合体マウスは、ある程度の抑うつも生じた。
実施例10 肥満症またはその関連疾患（たとえば高脂血症）を治療する薬物による薬物選別プラットフォームの検証
本実施例において、実施例1で構築されたモデル動物のマウスに現在臨床で肥満症またはその関連疾患を治療する薬物であるシブトラミンまたは山芋多糖（Chinese yam polysaccharide）を注射し、モデル動物のマウスの肥満の重篤度を評価した。
結果から、薬物のシブトラミンまたは山芋多糖は顕著にモデル動物のマウスの肥満の重篤度を低下させることができ、具体的に、顕著にモデル動物のマウスの肥満症状の発生率、および/または脂肪組織の湿重量（たとえば両側の性腺周囲脂肪組織の湿重量、両側の腎臓周囲脂肪組織の湿重量、内臓脂肪組織の湿重量、および/または皮下脂肪組織の湿重量）を低下させることができることが明らかになった。
実施例11 肥満症またはその関連疾患（たとえば高脂血症）を治療する薬物の選別プラットフォームによる候補薬物の選別
本実施例において、実施例1で構築されたモデル動物のマウスに肥満症またはその関連疾患の治療薬を注射し、モデル動物のマウスの肥満の重篤度を評価した。
プラセボを投与したモデル動物のマウスと肥満の重篤度の違いを比較することによって、顕著に肥満症状の発生率、および/または脂肪組織の湿重量（たとえば両側の性腺周囲脂肪組織の湿重量、両側の腎臓周囲脂肪組織の湿重量、内臓脂肪組織の湿重量、および/または皮下脂肪組織の湿重量）を低下させることができた候補薬物は、当該肥満症または関連疾患の潜在的な治療薬である。
ほかの肥満症またはその関連疾患も上記方法を参照し、モデル動物のマウスの肥満の重篤度を評価することによって、候補薬物を選別することができる。
各文献がそれぞれ単独に引用されるように、本発明に係るすべての文献は本出願で参考として引用する。また、本発明の上記の内容を読み終わった後、当業者が本発明を各種の変動や修正をすることができるが、それらの等価の形態のものは本発明の請求の範囲に含まれることが理解されるはずである。
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Claims (10)

  1. 非ヒト哺乳動物の肥満症またはその関連疾患の動物モデルの構築方法であって、
    （a）非ヒト哺乳動物の細胞を提供し、前記細胞におけるGlce遺伝子を不活性化させ、Glce遺伝子が不活性化した非ヒト哺乳動物細胞を得る工程と、
    （b）工程（a）で得られたGlce遺伝子が不活性化した細胞を利用し、Glce遺伝子が不活性化した肥満症またはその関連疾患の動物モデルを製造する工程と、
    を含むことを特徴とする方法。
  2. 工程（a）には、さらに、
    （a1）DNA相同組換え技術によって、前記Glce遺伝子におけるエクソン3〜エクソン5のうちの1つまたは複数のエクソンを削除または破壊し、選別マーカーで置換し、Glce遺伝子が不活性化した非ヒト哺乳動物細胞を得る工程。
    を含むことを特徴とする請求項1に記載の方法。
  3. 工程（b）には、さらに、
    （b1）工程（a）で得られたGlce遺伝子が不活性化した非ヒト哺乳動物細胞を利用し、キメラ非ヒト哺乳動物を製造する工程と、
    （b2）工程（b1）で得られたキメラ非ヒト哺乳動物を正常の野生型非ヒト哺乳動物と交尾・繁殖させ、子孫からGlce遺伝子が不活性化したヘテロ接合体の非ヒト哺乳動物を選別する工程と、
    （b3）工程（b2）で得られたヘテロ接合体の非ヒト哺乳動物を互いに交尾させてGlce遺伝子が不活性化したホモ接合体の非ヒト哺乳動物を得ることによって、Glce遺伝子が不活性化した非ヒト哺乳動物の動物モデルを得る工程と、
    を含むことを特徴とする請求項1に記載の方法。
  4. 工程（b3）には、さらに、Glce遺伝子が不活性化したホモ接合体の非ヒト哺乳動物を同じ種のニューロン特異的ノックアウトのツールとしての非ヒト哺乳動物と交雑させることによって、ニューロン特異的なGlce遺伝子が不活性化した非ヒト哺乳動物の動物モデルを得る工程（b4）を含むことを特徴とする請求項3に記載の方法。
  5. 前記工程（b）で得られたGlce遺伝子が不活性化した非ヒト哺乳動物の動物モデルでは、野生型の対照動物と比べ、以下の群から選ばれる1つまたは複数の特徴を有することを特徴とする請求項1に記載の方法：
    （t1）体型の肥満度が増加する；
    （t2）肥満症状の発生率が増加する；
    （t3）脂肪組織の湿重量が増加する；
    （t4）オープンフィールド行動レベルが低下する；
    （t5）新規環境を探索する欲望が低下する；
    （t6）抑うつ様行動が増加する；
    （t7）抑うつ度が増加する；
    （t8）不安様行動が増加する；
    （t9）不安度が増加する；
    （t10）恐怖様行動が増加する；
    （t11）恐怖度が増加する；
    （t12）認知障害が増加する；
    （t13）卒中の発生率が増加する。
  6. 請求項1に記載の方法によって製造された非ヒト哺乳動物モデルの使用であって、肥満症またはその関連疾患を研究する動物モデルとして使用することを特徴とする使用。
  7. 請求項1に記載の方法によって製造された非ヒト哺乳動物モデルの使用であって、肥満症またはその関連疾患を軽減または治療することができる物質（治療剤）を選別または同定するために使用することを特徴とする使用。
  8. 肥満症またはその関連疾患を治療または緩和する潜在的な治療剤を選別または同定する方法であって、以下の工程を含むことを特徴とする方法：
    （a）試験群では、被験化合物の存在下において、被験化合物を請求項1に記載の方法によって製造された非ヒト哺乳動物モデルに施用し、試験群における前記動物モデルの肥満症またはその関連疾患の重篤度Q1を検出し、かつ前記被験化合物を施用せずにほかの条件が同様の対照群では、対照群における前記動物モデルの肥満症またはその関連疾患の重篤度Q2を検出する工程；
    （b）前の工程で検出された重篤度Q1と重篤度Q2を比較することによって、前記被験化合物が肥満症またはその関連疾患を治療または緩和する潜在的な治療剤であるか、確認する工程；
    ここで、重篤度Q1が重篤度Q2よりも顕著に低い場合、前記被験化合物が肥満症またはその関連疾患を治療または緩和する潜在的な治療剤であることを示す。
  9. グルクロニルC5-エピメラーゼ（Glucuronyl C5-epimerase、Glce）遺伝子が不活性化または下方調節した細胞の使用であって、非ヒト哺乳動物の肥満症またはその関連疾患の動物モデルを構築する生物製剤を製造するために使用することを特徴とする使用。
  10. Glce遺伝子またはそのタンパク質の不活性化剤の使用であって、非ヒト哺乳動物の肥満症またはその関連疾患の動物モデルを構築する生物製剤を製造するために使用することを特徴とする使用。
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