JP2007236247A - Rna干渉用ダブルノックアウト非ヒトモデル動物 - Google Patents
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Abstract
【課題】本発明の課題は、哺乳動物において二本鎖RNAを用いたRNA干渉を可能とさせるダブルノックアウト非ヒト動物やその使用方法を提供することにある。
【解決手段】RNA干渉用として、RIG−I及びMDA5をコードする遺伝子を欠損或いは変異させることにより、野生型において発現されるRIG−I及びMDA5の機能が失われているダブルノックアウト非ヒト動物を使用する。
【選択図】なし
【解決手段】RNA干渉用として、RIG−I及びMDA5をコードする遺伝子を欠損或いは変異させることにより、野生型において発現されるRIG−I及びMDA5の機能が失われているダブルノックアウト非ヒト動物を使用する。
【選択図】なし
Description
本発明は、RIG−I及びMDA5をコードする遺伝子の一部又は全部を欠損或いは変異させることにより、野生型において発現されるRIG−I及びMDA5の機能が失われているダブルノックアウト非ヒトモデル動物やその使用方法等に関する。
RNA干渉(RNAi;RNA interference)は、二本鎖RNAと相補的な塩基配列を持ったmRNAが分解される現象をいい、RNAi法は、この現象を利用して人工的に二本鎖RNAを導入することにより、任意の遺伝子の発現を抑制する手法とされている。詳しくは、RNAiは、長鎖二本鎖RNAがDicer分子により20mer程度の短鎖二本鎖RNAに切断され、その配列に相同する遺伝子メッセンジャーRNAの発現を抑制する現象であり、この現象は1998年Fireらにより、線虫で発見されてから(例えば、非特許文献1参照)、植物やショウジョウバエなど、他の様々な生物種で観察されている。これらの生物では、外来の二本鎖RNA(dsRNA)を導入することにより、標的遺伝子の発現が抑制されることが確認されており、ノックアウト個体を創生する方法としても利用されつつある。
しかし、哺乳動物においては、長鎖のdsRNAとして30塩基以上のdsRNAを用いた場合にはRNAiが起こりにくいとされている。この原因の一つとして、哺乳動物はウィルス感染を防ぐ様々な防御機構が発達しており、実際に、極めて低い濃度の二本鎖RNA(dsRNA)が存在するだけでインターフェロンの応答が起こるためと考えられている。インターフェロン応答とは、インターフェロン分子が産生され、インターフェロン受容体に結合、細胞内シグナル伝達経路を活性化し様々な応答を引き起こす現象を表す。その結果強力な抗ウイルス応答が誘導される。その反応のうちよく知られたものとして、dsRNA依存的タンパク質キナーゼ(PKR)をコードする遺伝子の転写が高まり、PKRの自己リン酸化とキナーゼ活性が促進され、活性化されたPKRは、eIF−2αをリン酸化し、これにより遺伝子全体の翻訳が阻害される現象があげられる。このようなインターフェロン応答により、長鎖dsRNAを導入した哺乳動物においては、RNAi効果の特異性が下がり、またアポトーシスも誘導されるため、細胞毒性が上がるという問題があった。
そこで、哺乳動物においては、20mer程度の短鎖RNA(siRNA)によるRNAi法を用い、哺乳動物細胞での二本鎖RNAによるインターフェロン応答を回避し、遺伝子発現の抑制を行ってきた(例えば、非特許文献2参照)。また、siRNAに代わるものとして、ヘアピン構造に折り畳んだ小さなRNA(shRNA)が、siRNAと同程度に遺伝子の発現を抑制することが報告されている(例えば、非特許文献3参照)。
しかしながら、その遺伝子発現抑制効果は不安定であり、また、短鎖RNAを用いてもインターフェロンを活性化させてしまう等の問題点が指摘されている。
一方、ウィルスやバクテリア等の微生物病原体に対する自然免疫応答は、Toll様受容体(TLR)及びヘリカーゼファミリーメンバーのような宿主パターン認識受容体(PRR)が、病原体関連分子パターン(PAMP)と呼ばれる侵入病原体の特異構造を認識することによって惹起される(例えば、非特許文献4及び非特許文献5参照)。宿主パターン認識受容体(PRR)は、DNA、一本鎖(ss)RNA、二本鎖(ds)RNA及び糖タンパク質を含むウィルスに特異的な分子パターンの認識に不可欠の役割を果たしている。エンドソーム膜に局在するTLR3は、合成dsRNAアナログであるポリイノシン−ポリシチジル酸(ポリI:C)に加えてウィルスのdsRNAも認識することが知られている。また、細胞質タンパク質であるRIG−I(Retinoic acid-inducible protein-I)及びヘリカードとしても知られるMDA−5(Melanoma differentiation associated gene-5)は、dsRNAディテクターとして同定されている。RIG−Iは、カスパーゼをリクルートするドメイン(CARD)様モジュールを2個有するDExD/Hbox型RNAヘリカーゼである。へリカーゼドメインは、dsRNAの認識に関与していると考えられ、RIG−IにおけるCARDは、IRF3、IRF7及びNF−κBの活性化を導くダウンストリームシグナル伝達の開始に必須であることが報告されている(例えば、非特許文献6参照)。また、RIG−I欠損マウスは、水疱性口内炎ウィルス(VSV)、ニューカッスル病ウィルス(NDV)及びセンダイウイルス(SeV)の感染に対して、一貫してI型インターフェロン(IFN)を産生しないことが報告されている(例えば、非特許文献7参照)。さらに、ウィルス感染に応答したIRF3及びNF−κBの活性化は、RIG−I欠損細胞で障害されていた。また、MDA−5は、RIG−Iに類似した構造を有し、抗ウィルス応答の媒介に関与していることが報告されている(例えば、非特許文献8及び非特許文献9参照)。
RIG−I及びMDA5は、ウィルスdsRNAの認識に関与することが示唆されるものの、インビボでのこれらdsRNAディテクター間の機能的関係に加え、MDA5の機能的役割については知られていない。このようにdsRNAディテクターの明確な機能が解明されていないため、哺乳動物において、これらの作用に基づくインターフェロン応答を抑えることはできなかった。
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本発明の課題は、哺乳動物においてdsRNAを用いたRNAiを可能とさせるダブルノックアウト非ヒトモデル動物やその使用方法等を提供することにある。
本発明者らは、まず、インビボでのMDA5の機能的役割を調べるため、MDA5−/−マウスを確立し、ウィルス認識に対するMDA5の寄与を分析した(図1a及び1b参照)。MDA5のmRNAの発現は、MDA5タンパク質の場合と同様に、MDA5−/−細胞では検出されなかった(図1c及び1d参照)。その多くが胚期に死亡するRIG−I−/−マウスとは対照的に、MDA5−/−マウスはメンデル比にしたがって誕生して健康に成長し、24週齢まで巨視的な発達異常は認められなかった。脾臓及びリンパ節におけるCD3、B220、CD11cのフローサイトメトリー分析により、野生型とMDA5−/−マウスとの間には、リンパ球及び樹状細胞の数において変化がないことを確認した。
TLR3、RIG−I及びMDA5は、ポリI:Cの認識及びその後の抗ウィルス応答の誘導に関与しているとされている。しかし、dsRNA刺激に対する応答におけるこれらの分子のインビボでの寄与については、まだ明らかにされていない。したがって、本発明者らは次に、RIG−I、MDA−5、TRIF、又はMDA−5とTRIFの両方を欠損したマウスにおけるポリI:Cへのインビボでの応答について調べた。意外にも、ポリI:Cを投与すると野生型及びRIG−I−/−マウスのいずれの血清中でも、IFN−α、IL−6及びIL−12が急速に誘導され、RIG−IがインビボにおけるポリI:Cを介した応答に不可欠ではないことが示された(図2a参照)。これとは際立って対照的に、MDA5−/−マウスがポリI:Cに応答してIFN−αを生成することはなく、IL−6及びIL−12p40の生成も、かなり減少していた。また、TRIF−/−マウスは通常量のIFN−αを生成していたが、IL−12p40の生成は著しく減少しており、IL−6の生成もかなり減少していた。さらに、MDA5−/−TRIF−/−マウスがポリI:Cに応答してIFN−α、IL−6及びIL−12p40を誘導することはなかった(図2b参照)。これらの結果は、MDA5はポリI:C誘導性のIFN−α生成に不可欠であり、TLR3シグナリングはIL−12の生成に重要である一方で、MDA5及びTLR3の両方がIL−6の生成を調節することを示している。サイトカインの誘導に加え、野生型マウスのポリI:C処理によっても、従来の脾臓DCにおけるCD86などの共刺激分子の表面発現が増加した(図2c参照)。MDA5又はTRIFの一方が欠損していてもCD86発現に影響はなかったが、二重欠損では結果的にCD86のアップレギュレーションが阻害された。このことは、MDA5シグナリング及びTLR3シグナリングの両方が、インビボにおけるポリI:C応答性のcDC活性化に関与していることを示している。GM−CSFを用いて作製した骨髄由来DC(GMCSF−DC)をポリI:Cで刺激すると、野生型又はRIG−I−/−マウスのいずれかの細胞は、ポリI:Cに応答して投与量依存的にIFN−α、IL−6及びIL−12p40を生成する。これとは対照的に、MDA5−/−GMCSF−DCでは、これらのサイトカインの生成がひどく減少していた(図2d参照)。したがって、細胞質中では、RIG−IではなくMDA5がポリI:Cを主に認識していることを確認した。
しかし、イノシン酸は自然状態でのウィルス複製過程では利用されないため、本発明者らはインビトロ転写により長鎖dsRNAを合成し、MDA5又はRIG−Iを欠損しているマウスの胚線維芽細胞(MEF)におけるIFN応答を調べてみた。リポフェクション試薬との錯体を形成するマウスラミン(Lamin)A/Cの配列に対応する、長さの異なる2つのdsRNA(200bp及び400bp)で、MEFを刺激した。ポリI:Cの場合とは異なり、野生型及びMDA5−/−MEFは同等量のIFN−βを生成した(図2e参照)。RIG−I−/−MEFは、検出可能量のIFN−βをまったく生成しなかった。これは、RIG−Iがインビトロ転写dsRNAの検出に不可欠であることを示している。また、他のいくつかの配列に対応するインビトロ転写dsRNAは、MDA5ではなくRIG−Iを介してI型IFNを誘導していた。総合的に考えて、これはMDA5とRIG−IがポリI:C及びインビトロ転写dsRNAの検出にそれぞれ差別的に関与している証拠となる。
これらの知見から、本発明者らは、RIG−Iの機能を喪失させることでdsRNAによるインターフェロン応答を有意に抑制し、哺乳動物におけるRNAiを誘導させることができるのではないかとの仮説を立てた。
しかしながら、RIG−Iの機能のみを喪失させたRIG−I単独ノックアウトマウスでは、ラミンAに対するRNAiを誘導させることはできなかった。そこで、dsRNAの発現によるIFNα産生誘導をELISA法で観察するような場合には、RIG−IのみがdsRNAの認識に関与しているように見えるものの完全ではなく、MDA5もdsRNAの認識に関与しているのではないかという仮説を立て、RIG−IとMDA5を共に欠損する細胞(RIG−I−/−MDA5−/−)に、ラミンA遺伝子に相同的な200、400、600bpの長鎖dsRNAを導入し、その後のラミンA分子の発現をウェスタンブロット法にて確認したところ、野生型細胞ではラミンA分子の低下を認めなかったのに対し、意外にもRIG−IとMDA5を共に欠損する細胞(RIG−I−/−MDA5−/−)においては、これらすべての長鎖dsRNAの導入に対しラミンA分子の発現が低下することを見い出し、本発明を完成するに至った。
すなわち本発明は、(1)RIG−I及びMDA5をコードする遺伝子の一部又は全部を欠損或いは変異させることにより、野生型において発現されるRIG−I及びMDA5の機能が共に失われていることを特徴とするI型インターフェロン(IFN)産生のシグナル伝達機能が失われているRNA干渉用ダブルノックアウト非ヒトモデル動物や、(2)少なくとも30塩基よりも長い長鎖二本鎖RNAによって誘導されるRNA干渉作用を引き起こすことを特徴とする上記(1)記載の非ヒトモデル動物や、(3)非ヒトモデル動物が、モデルマウスであることを特徴とする上記(1)又は(2)記載の非ヒトモデル動物に関する。
また本発明は、(4)上記(1)〜(3)のいずれか記載の非ヒトモデル動物又は該非ヒトモデル動物由来の組織、器官又は細胞をRNA干渉に使用する方法や、(5)上記(1)〜(3)のいずれか記載の非ヒトモデル動物又は該非ヒトモデル動物由来の組織、器官若しくは細胞に、二本鎖RNA又は二本鎖RNA発現ベクターを導入してRNA干渉を誘導することを特徴とするRNA干渉作用により標的遺伝子の発現を抑制する方法や、(6)二本鎖RNAが、少なくとも30塩基よりも長い長鎖二本鎖RNAであることを特徴とする上記(5)記載のRNA干渉作用により遺伝子の発現を抑制する方法や、(7)上記(1)〜(3)のいずれか記載の非ヒトモデル動物又は該非ヒトモデル動物由来の組織、器官若しくは細胞に、所定の二本鎖RNA又は二本鎖RNA発現ベクターを導入してRNA干渉を誘導し、RNA干渉作用による遺伝子の発現抑制の結果、動物個体、組織、器官若しくは細胞に現れる表現型の変化を解析することを特徴とする標的遺伝子の機能を同定する方法や、(8)二本鎖RNAが、少なくとも30塩基よりも長い長鎖二本鎖RNAであることを特徴とする上記(7)記載の標的遺伝子の機能を同定する方法に関する。
さらに本発明は、(9)上記(1)〜(3)のいずれか記載の非ヒトモデル動物又は該非ヒトモデル動物由来の組織、器官若しくは細胞に、被験物質として長鎖二本鎖RNA又は該長鎖二本鎖RNA発現ベクターを導入してRNA干渉を誘導し、RNA干渉作用による遺伝子の発現抑制の結果、動物個体、組織、器官若しくは細胞に現れる表現型の変化を解析することを特徴とするRNA干渉作用を利用した標的遺伝子のスクリーニング方法や、(10)長鎖二本鎖RNAが、少なくとも30塩基よりも長い長鎖二本鎖RNAであることを特徴とする上記(9)記載のRNA干渉を利用した標的遺伝子のスクリーニング方法に関する。
本発明のRNAi用ダブルノックアウト非ヒトモデル動物や、該ダブルノックアウト非ヒトモデル動物由来の組織、器官又は細胞においては、dsRNAによるインターフェロン応答が有意に抑制されるため、哺乳動物において長鎖dsRNAを使用したRNAiを誘導させることが可能となり、本発明のRNAi用ダブルノックアウト非ヒトモデル動物や、該ダブルノックアウト非ヒトモデル動物由来の組織、器官又は細胞は、標的遺伝子の機能解析や、ウィルスの発現抑制、疾患原因遺伝子の発現抑制などによる遺伝子治療の開発材料として、またRNA医薬品の開発等のためのスクリーニング方法にも使用することができる。
本発明のRNAi用ダブルノックアウト非ヒトモデル動物(以下、単に「ダブルノックアウトモデル動物」ということがある。)としては、RIG−I及びMDA5をコードする遺伝子の一部又は全部を欠損或いは変異させることにより、野生型において発現されるRIG−I及びMDA5の機能が共に失われて、I型インターフェロン(IFN)産生のシグナル伝達機能が失われている非ヒトモデル動物であれば特に制限されず、本発明のダブルノックアウトモデル動物は、RIG−I及びMDA5によるI型インターフェロン(IFNαやIFNβ)産生のシグナル伝達機能が失われているため、インターフェロン応答が有意に抑制され、dsRNAによって誘導されるRNAi用に使用することができる。特に通常30塩基よりも長いdsRNAではインターフェロン応答が生じると考えられているが、本発明のダブルノックアウトモデル動物によれば、これよりも長いdsRNAによるRNAi作用を生じさせることが可能であり、RNAi法に30〜800塩基のdsRNAを使用することも可能である。また、短鎖のdsRNAにおいてもインターフェロン応答が完全に生じないわけではないため、本発明のダブルノックアウトモデル動物又は該モデル動物由来の組織、器官又は細胞を用いたRNAiに短鎖dsRNAを使用することもできる。また、非ヒトモデル動物としては、ヒト以外の適宜の哺乳動物を対象とすることができ、具体的には、マウス、ラット、モルモット等の齧歯目動物を挙げることができる。なお、これらのうちマウスを好適な例示として挙げることができる。
本発明のダブルノックアウトモデル動物を作製するためには、RIG−I及びMDA5遺伝子の遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒトモデル動物、すなわちRIG−I分子及びMDA5分子のタンパク質のノックアウト動物を作製する。例えば、本発明のダブルノックアウトモデルマウスは、以下のようにして作製することができる。マウス遺伝子ライブラリーからPCR等の方法により得られた遺伝子断片を用い、RIG−I遺伝子をスクリーニングし、スクリーニングされたRIG−I遺伝子を、ウイルスベクターやプラスミドベクター等を用いてサブクローンし、制限酵素マッピング及びDNAシーケンシングにより特定する。次に、このRIG−Iをコードする遺伝子の全部又は一部をpMC1ネオ遺伝子カセット等に置換し、3’末端側にジフテリアトキシンAフラグメント(DT−A)遺伝子や単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ(HSV−tk)遺伝子等の遺伝子を導入することによって、ターゲットベクターを作製する。この作製されたターゲティングベクターを線状化し、エレクトロポレーション(電気穿孔)法等によってES細胞に導入し、相同的組換えを行い、その相同的組換え体の中から、G418やガンシクロビア(GANC)等の抗生物質により相同的組換えを起こしたES細胞を選択する。この選択されたES細胞が目的とする組換え体かどうかをサザンブロット法等により確認することが好ましい。その確認されたES細胞のクローンをマウスの胚盤胞中にマイクロインジェクションし、かかる胚盤胞を仮親のマウスに戻し、キメラマウスを作製する。このキメラマウスを野生型マウスと交雑させると、RIG−Iヘテロ接合体マウス(RIG−I+/−)を得ることができる。また、同様にしてMDA5ヘテロ接合体マウス(MDA5;+/−)を得て、RIG−Iヘテロ接合体(RIG−I+/−)マウスとMDA5ヘテロ接合体(MDA5+/−)マウスとを掛け合わせ、RIG−I+/−MDA5+/−マウスを作製する。次に、この遺伝子型(RIG−I+/−MDA5+/−)のマウス間同士で交配させることにより、本発明のダブルノックアウトモデルマウス作製することができる
本発明のダブルノックアウトモデル動物又は該非ヒトモデル動物由来の組織、器官若しくは細胞のRNAiに使用する方法としては、前記ダブルノックアウトモデル動物又は非ヒトモデル動物由来の組織、器官又は細胞を使用して、RNAiを誘導するものであれば、その使用の形態については特に制限されず、具体的には、後述するRNA干渉作用により標的遺伝子の発現を抑制する方法、標的遺伝子の機能を同定する方法、RNA干渉作用を利用した標的遺伝子のスクリーニング方法の他、本発明のダブルノックアウトモデル動物又は該非ヒトモデル動物由来の組織、器官若しくは細胞に、所定遺伝子の異なる部位を認識するdsRNA又は該dsRNAを発現しうるベクター(dsRNA発現ベクター)、あるいは、所定遺伝子の異なる大きさのdsRNA又はdsRNA発現ベクターを導入して、所定遺伝子の発現の程度を解析する等のRNAiのメカニズムを解明する方法や、本発明のダブルノックアウトモデル動物又は該非ヒトモデル動物由来の組織、器官若しくは細胞に、被験物質の存在下、dsRNA又はdsRNA発現ベクターを導入して、RNAiの誘導の程度を評価するRNAi促進又は抑制剤のスクリーニング方法や、本発明のダブルノックアウトモデル動物に、被験物質を投与して、その欠損により疾患(例えば、早老症候群)を引き起こす所定遺伝子(例えば、ラミンA)を認識するdsRNA又はdsRNA発現ベクターを導入して、RNAi作用による遺伝子の発現抑制の結果、モデル動物に現れる疾患改善の程度を、被験物質の非存在下の場合と比較・評価する前記疾患の治療薬のスクリーニング方法など、前記ダブルノックアウトモデル動物又はダブルノックアウトモデル動物由来の組織、器官又は細胞にdsRNA又はdsRNA発現ベクターを導入してRNAiを引き起こし、遺伝子の発現を抑制させることで、遺伝子の機能解析や、ウィルスの発現抑制、疾患原因遺伝子の発現抑制などの方法や、RNA医薬品の開発等のためのスクリーニング方法を挙げることができる。そして、本発明のダブルノックアウトモデル動物又は該非ヒトモデル動物由来の組織、器官若しくは細胞を使用してRNAiを誘導した場合、インターフェロン応答が有意に抑制されているので、たとえ30塩基よりも長いdsRNA又はdsRNA発現ベクターを用いた場合であっても、インターフェロン応答によるRNAi効果の特異性の低下や、アポトーシス誘導による細胞毒性の上昇等の問題のないRNAiを誘導することが可能となる。
本発明のRNAi作用により標的遺伝子の発現を抑制する方法としては、上記本発明のダブルノックアウトモデル動物又は該ダブルノックアウトモデル動物由来の組織、器官又は細胞に、dsRNA又はdsRNA発現ベクターを導入してRNAiを誘導する方法であれば特に制限されず、RNAi作用により標的遺伝子の発現が抑制される。RNAiに使用するdsRNA又はdsRNA発現ベクターとしては、ノックダウンさせたい標的遺伝子、例えば、配列は判明しているがどのような機能を有するかを解明したい遺伝子や、その発現が疾患の原因と考えられる遺伝子などを認識することができるdsRNA又はdsRNA発現ベクターを挙げることができる。通常30塩基よりも長いdsRNAではインターフェロン応答が生じると考えられているが、本発明のRNAi作用による標的遺伝子の発現を抑制する方法によれば、これよりも長いdsRNAによるRNAiを生じさせることが可能であり、30〜800塩基のdsRNAを使用することも可能である。また、短鎖のdsRNAにおいても、インターフェロン応答が完全に生じないわけではないため、本発明のRNAi作用による遺伝子の発現を抑制する方法に短鎖dsRNAを使用することもできる。
本発明のRNAi作用による遺伝子の発現を抑制する方法によれば、生物組織中におけるDNAの増幅作用やタンパク質合成作用を抑止するRNAiにより、病原体の増殖やガン細胞の活性を下げるための有力な知見を得ることができる。また、未知の標的遺伝子の機能が解明されれば、その機能に基づく生理作用が解明され、標的遺伝子に起因する病理作用の解明が可能となる。なお、本発明のRNAi作用による遺伝子の発現を抑制する方法において、遺伝子の発現が抑制されたことを確認する方法としては、例えば、標的遺伝子のmRNAの発現量の減少や、そのmRNAから翻訳されるタンパク質の発現量の減少の程度をウェスタンブロット法等の公知の方法により、確認することにより行うことができる。
本発明の標的遺伝子の機能を同定する方法としては、上記本発明のダブルノックアウトモデル動物又は該ダブルノックアウトモデル動物由来の組織、器官又は細胞に、所定のdsRNA又はdsRNA発現ベクターを導入してRNAiを誘導し、RNAi作用による遺伝子の発現抑制の結果、動物個体、組織、器官若しくは細胞に現れる表現型の変化を解析する方法であれば特に制限されず、上記所定のdsRNA又はdsRNA発現ベクターとしては、例えば、配列は判明しているが機能が明らかでなく、どのような機能を有するかを解明したい標的遺伝子を認識することができるdsRNA又はdsRNA発現ベクターを挙げることができる。通常30塩基よりも長いdsRNAではインターフェロン応答が生じると考えられているが、本発明の標的遺伝子の機能を同定する方法によれば、これよりも長いdsRNAによるRNAiを生じさせることが可能であり、30〜800塩基のdsRNAを使用することも可能である。また、短鎖のdsRNAにおいても、インターフェロン応答が完全に生じないわけではないため、本発明の標的遺伝子の機能を同定する方法に短鎖dsRNAを使用することもできる。
本発明のRNAi作用を利用した標的遺伝子のスクリーニング方法としては、前記本発明のダブルノックアウトモデル動物又は該ダブルノックアウトモデル動物の組織、器官又は細胞に、被験物質としてdsRNA又はdsRNA発現ベクターを導入してRNAiを誘導し、RNAi作用による遺伝子の発現抑制の結果、動物個体、組織、器官若しくは細胞に現れる表現型の変化を解析する方法であれば特に制限されず、上記被験物質としてのdsRNA又はdsRNA発現ベクターとしては、例えば、遺伝子ライブラリーから作製したdsRNA又はdsRNA発現ベクターライブラリーを挙げることができる。通常30塩基よりも長いdsRNAではインターフェロン応答が生じると考えられているが、本発明のRNAi作用を利用した標的遺伝子のスクリーニング方法によれば、これよりも長いdsRNAによるRNAiを生じさせることが可能であり、30〜800塩基のdsRNAを使用することも可能である。また、短鎖のdsRNAにおいても、インターフェロン応答が完全に生じないわけではないため、本発明のRNAi作用を利用した標的遺伝子のスクリーニング方法に短鎖dsRNAを使用することもできる。RNAi作用による遺伝子の発現抑制の結果、動物個体、組織、器官若しくは細胞に現れる表現型に、所望の変化(例えば、所望の疾患の症状を呈する変化)を与えたdsRNAをdsRNA又はdsRNA発現ベクターライブラリーの中からスクリーニングし、スクリーニングしたdsRNAからの標的遺伝子の同定は、前記遺伝子ライブラリーを対象に、当該ssRNAをプローブとして、ハイブリダイゼーションやPCRやパニング操作等を行う常法により行うことができる。例えば、アポトーシスを誘導する遺伝子を標的遺伝子とする場合、前記のダブルノックアウトモデル動物又は該ダブルノックアウトモデル動物の組織、器官又は細胞に、被験物質としてのdsRNA又はdsRNA発現ベクターを導入してRNAiを誘導し、前記ダブルノックアウトモデル動物にアポトーシスを引き起こす薬剤を投与するか又は前記ダブルノックアウトモデル動物の組織、器官又は細胞にアポトーシスを引き起こす薬剤を接触させて刺激し、刺激後も生存する細胞を回収して、使用したdsRNA又はdsRNA発現ベクターから標的遺伝子を同定することで、アポトーシスを誘導する遺伝子をスクリーニングすることができる。
また、動物個体、組織、器官若しくは細胞でその変化を解析すべき表現型としては特に制限はされないが、例えば動物個体、組織、器官若しくは細胞の疾患症状、動物個体、組織、器官若しくは細胞の形態、動物個体、組織、器官若しくは細胞内の物質量、動物個体、組織、器官若しくは細胞が分泌する物質量、動物個体、組織、器官若しくは細胞内物質の動態、細胞間接着、動物個体、組織、器官若しくは細胞の運動、動物個体、組織、器官若しくは細胞の寿命等の生命体行動等を挙げることができる。本発明の標的遺伝子の機能を同定する方法においては、上記表現型の変化を解析することにより標的遺伝子の機能を同定することができ、他方、本発明のRNAi作用を利用した標的遺伝子のスクリーニング方法においては、上記表現型の変化を解析することにより所望の機能を有する標的遺伝子をスクリーニングすることができる。また、表現型の変化を解析する手段としては、動物個体、組織、器官若しくは細胞の形態の変化を解析する場合には、顕微鏡、あるいは肉眼的に検出する方法を挙げることができ、動物個体、組織、器官若しくは細胞内の物質がmRNAの場合には、ノーザンハイブリダイゼーション、定量的リバーストランスフェレースPCR、あるいは In situ hybridization等を定量的解析手段として挙げることができ、タンパク質の場合には、標的遺伝子がコードするタンパク質を抗原とする抗体によるウェスタンブロッティング法や、標的遺伝子がコードするタンパク質が有する酵素活性を測定する方法等を定量的解析手段として挙げることができる。このようにして解析した、RNAiが誘導された動物個体、組織、器官若しくは細胞にのみ現れる表現型の変化は、標的遺伝子の発現阻害の結果生じているものであるので、これを標的遺伝子の機能として同定することができる。
dsRNAを構成するssRNAの合成は、例えば自動核酸合成装置を用いた標準的なホスホアミダイト法による固相合成で行うことができる。こうしてdsRNAを構成するオリゴRNAの各々を合成し、二重鎖形成部が相補的な2本のssRNAを等モルで混合することでdsRNAとして用いることができる。dsRNAは、リポフェクション法等により直接細胞内に導入することができる。通常陰電荷を有するホスファチジルセリン(PS)からなるリポソームを用いることができるが、より安定したリポソームを形成する陽イオン性脂質であるN−[1−(2,3−ジオレイルオキシ)プロピル]−N,N,N−トリエチルアンモニウムクロライド(DOTMA、商品名:トランスフェクタム、リポフェクトアミン)を用いることもできる。これら陽イオン脂質と陰電荷をもつdsRNAとの複合体を形成させると、正に荷電しているリポソームが、負に荷電している細胞の表面に吸着し、細胞膜と融合することでdsRNAを細胞内に導入することができる。また、動物個体、組織若しくは器官への導入に際しては、局部又はその周辺組織にdsRNAとリポソームの複合体を直接注入することができる。
上記dsRNA発現ベクターは、dsRNAを直接細胞内に導入した場合より、dsRNAが細胞内に存在できる期間が長くなり、遺伝子発現抑制の効率が高くなるという利点を有する。かかるdsRNA発現ベクターとしては、標的遺伝子の発現産物を標的とした遺伝子の特定配列のセンス鎖DNA−リンカー−アンチセンス鎖DNAからなるdsRNA発現カセットをプロモーターの下流に挿入することにより有利に作製することができる。また、dsRNA発現用のベクターは市販品を含め公知のものを用いることができるが、哺乳動物に導入する場合にはウイルスベクターであることが好ましい。ウイルスベクターとしては、例えば、マウス白血病レトロウイルスベクター(Microbiology and Immunology, 158, 1-23, 1992)や、アデノ随伴ウイルスベクター(Curr. Top. Microbiol. Immunol., 158, 97-129, 1992)や、アデノウイルスベクター(Science, 252, 431-434, 1991)や、リポソーム等を具体的に挙げることができるが、HIVレンチウイルスベクターは、非分裂細胞にも効率よく長期発現が可能であるという特徴を有する点で好ましい。また、これら発現系は、発現を起こさせるだけでなく、発現を調節する制御配列を含んでいてもよい。これらの発現ベクターへのdsRNA発現カセットの導入は常法によって行うことができ、例えばこれら発現ベクター中の適当なプロモーターの下流にdsRNA発現カセットを挿入することによりdsRNA発現ベクターを構築することができる。
また、組織、器官又は細胞内にdsRNA又はdsRNA発現ベクターを導入する方法としては特に制限されないが、例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション、DEAE−デキストラン媒介トランスフェクション、トランスベクション(transvection)、マイクロインジェクション、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、スクレープローディング (scrape loading)、弾丸導入(ballistic introduction)、感染、直接注入等を例示することができる。
上記ダブルノックアウトモデル動物由来の組織、器官又は細胞としては、ダブルノックアウトモデル動物から採取される組織、器官又は細胞であれば特に制限されるものではなく、組織、器官としては、心臓、肺臓、膵臓、肝臓、脾臓、胃、腸等を挙げることができる。また、細胞としては、これら組織、器官由来の細胞の他、胎児線維芽細胞、樹状細胞等を挙げることができ、これら組織、器官又は細胞のうち、RIG−I−/−MDA5−/−のものを選び出すことが好ましい。
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
(MDA5−/−マウスの作製)
PCRにより、ES細胞(GSI−I)から抽出したゲノムDNAからMDA5遺伝子を単離した。MDA5ORF(DExH boxを含む)をコードする4.3−kbの断片をネオマイシン耐性遺伝子カセット(neo)で置換することによりターゲティングベクターを構築し、PGKプロモーターにより動かされた単純ペルペスウィルスチミジンキナーゼ(HSV−TK)を、ネガティブ選択のため、ゲノム断片に挿入した。ターゲティングベクターをES細胞にトランスフェクトした後、G418とガンシクロビアの二重耐性コロニーを選択し、PCRによりスクリーニングし、さらにサザンブロットによって確認した。相同組換体を雌のC57BL/6マウスにマイクロインジェクションし、MDA5−/−マウスを得るために、ヘテロ接合体のF1子孫をインタークロスした。
PCRにより、ES細胞(GSI−I)から抽出したゲノムDNAからMDA5遺伝子を単離した。MDA5ORF(DExH boxを含む)をコードする4.3−kbの断片をネオマイシン耐性遺伝子カセット(neo)で置換することによりターゲティングベクターを構築し、PGKプロモーターにより動かされた単純ペルペスウィルスチミジンキナーゼ(HSV−TK)を、ネガティブ選択のため、ゲノム断片に挿入した。ターゲティングベクターをES細胞にトランスフェクトした後、G418とガンシクロビアの二重耐性コロニーを選択し、PCRによりスクリーニングし、さらにサザンブロットによって確認した。相同組換体を雌のC57BL/6マウスにマイクロインジェクションし、MDA5−/−マウスを得るために、ヘテロ接合体のF1子孫をインタークロスした。
(MyD88−/−マウス、TRIF−/−マウス、TLR3−/−、TRIF−/−マウス及びRIG−I−/−マウスの作製)
MyD88−/−マウス、TLR3−/−マウス、TRIF−/−マウスについては、文献Sceience 301, 640-3 (2003)に記載の方法により作製した。また、IFNα/βR−/−マウスは、Int Immunol 14 1225-31(2002)に記載の方法により作製した。さらに、ICRマウスとの交配により、RIG−I−/−成体マウスを作製した。
MyD88−/−マウス、TLR3−/−マウス、TRIF−/−マウスについては、文献Sceience 301, 640-3 (2003)に記載の方法により作製した。また、IFNα/βR−/−マウスは、Int Immunol 14 1225-31(2002)に記載の方法により作製した。さらに、ICRマウスとの交配により、RIG−I−/−成体マウスを作製した。
(RIG−I−/−MDA5−/−マウスの作製)
RIG−Iヘテロ接合体(RIG−I+/−)マウスとMDA5ヘテロ接合体(MDA5+/−)マウスとを交配すると、その子はRIG−I+/+MDA5+/+,RIG−I+/−MDA5+/+,RIG−I+/+MDA5+/−RIG−I+/−MDA5+/−のどれかとなる。この遺伝子型はマウス尾より抽出したゲノムDNAを用い、PCR法もしくはサザンブロット法を用いることにより同定することが出来る。このうち、RIG−I+/−MDA5+/−の遺伝子型のマウス間同士で交配させることにより、RIG−I+/+MDA5+/+,RIG−I+/−MDA5+/+,RIG−I+/+MDA5+/−,RIG−I+/−MDA5+/−、RIG−I−/−MDA5+/+、RIG−I−/−MDA5+/−、RIG−I+/+MDA5−/−、RIG−I+/−MDA5−/−、RIG−I−/−MDA5−/−、のどれかとなる。このうち、RIG−I−/−MDA5−/−マウスをPCR法もしくはサザンブロット法により同定した。
RIG−Iヘテロ接合体(RIG−I+/−)マウスとMDA5ヘテロ接合体(MDA5+/−)マウスとを交配すると、その子はRIG−I+/+MDA5+/+,RIG−I+/−MDA5+/+,RIG−I+/+MDA5+/−RIG−I+/−MDA5+/−のどれかとなる。この遺伝子型はマウス尾より抽出したゲノムDNAを用い、PCR法もしくはサザンブロット法を用いることにより同定することが出来る。このうち、RIG−I+/−MDA5+/−の遺伝子型のマウス間同士で交配させることにより、RIG−I+/+MDA5+/+,RIG−I+/−MDA5+/+,RIG−I+/+MDA5+/−,RIG−I+/−MDA5+/−、RIG−I−/−MDA5+/+、RIG−I−/−MDA5+/−、RIG−I+/+MDA5−/−、RIG−I+/−MDA5−/−、RIG−I−/−MDA5−/−、のどれかとなる。このうち、RIG−I−/−MDA5−/−マウスをPCR法もしくはサザンブロット法により同定した。
(細胞、試薬及びウィルス)
RIG−I−/−MEF及び骨髄由来GMCSF又はFlt3L−DCの作製については、文献Immunity 23, 19-28 (2005)記載のとおり作製した。Miltenyi Biotech社製の抗B220及びCD11cマイクロビーズを用いたMACSにより、Flt3L−DCからpDC及びcDCを前述のとおり単離した。ポリ(I:C)は、Amersham Biosciences社から購入した。
RIG−I−/−MEF及び骨髄由来GMCSF又はFlt3L−DCの作製については、文献Immunity 23, 19-28 (2005)記載のとおり作製した。Miltenyi Biotech社製の抗B220及びCD11cマイクロビーズを用いたMACSにより、Flt3L−DCからpDC及びcDCを前述のとおり単離した。ポリ(I:C)は、Amersham Biosciences社から購入した。
(MDA5−/−マウスの性状)
MDA5−/−マウスを確立し、ウィルス認識に対するMDA5の寄与を分析した(図1a及び1b参照)。MDA5のmRNAの発現は、タンパク質の場合と同様に、MDA5−/−細胞では検出されなかった(図1c及び1d)。その多くが胚期に死亡するRIG−I−/−マウスとは対照的に、MDA5−/−マウスはメンデル比にしたがって誕生して健康に成長し、24週齢まで巨視的な発達異常は認められなかった。脾臓及びリンパ節におけるCD3、B220、CD11cのフローサイトメトリー分析により、野生型とMDA5−/−マウスとの間には、リンパ球及びDCの組成に変化がないことが明らかになった。
MDA5−/−マウスを確立し、ウィルス認識に対するMDA5の寄与を分析した(図1a及び1b参照)。MDA5のmRNAの発現は、タンパク質の場合と同様に、MDA5−/−細胞では検出されなかった(図1c及び1d)。その多くが胚期に死亡するRIG−I−/−マウスとは対照的に、MDA5−/−マウスはメンデル比にしたがって誕生して健康に成長し、24週齢まで巨視的な発達異常は認められなかった。脾臓及びリンパ節におけるCD3、B220、CD11cのフローサイトメトリー分析により、野生型とMDA5−/−マウスとの間には、リンパ球及びDCの組成に変化がないことが明らかになった。
(ノーザンブロット)
1000U/mlのIFN−βを用いて又は用いずに、PECを8時間処理し、TRIzol試薬(Invitrogen社製)を用いて全RNAを抽出した。RNAを電気泳動にかけ、ナイロン膜に転写した後、表示のcDNAプローブとハイブリダイズさせた。MDA5mRNAの発現を検出するため、308bpの断片(777−1084)をプローブとして使用した。同じ膜をβアクチンプローブと再度ハイブリダイズさせた。結果は図1のcのとおりである。
1000U/mlのIFN−βを用いて又は用いずに、PECを8時間処理し、TRIzol試薬(Invitrogen社製)を用いて全RNAを抽出した。RNAを電気泳動にかけ、ナイロン膜に転写した後、表示のcDNAプローブとハイブリダイズさせた。MDA5mRNAの発現を検出するため、308bpの断片(777−1084)をプローブとして使用した。同じ膜をβアクチンプローブと再度ハイブリダイズさせた。結果は図1のcのとおりである。
(ウェスタンブロット)
1000U/mlのIFN−βでMEFを8時間処理した。その後、1.0%のNonidet-P40、150mMのNaCl、20mMのTris−Cl(pH7.5)、1mMのEDTA及びプロテアーゼ阻害剤カクテル(Roche社製)を含む溶解緩衝液中で細胞を溶解した。SDS−PAGEで細胞溶解物を溶解し、PVDF膜に転写した。かかる膜をMDA5タンパク質の特異抗体でブロットし、増強した化学発光システム(Perkinermer社製)により視覚化した。結果は図1のdのとおりである。
1000U/mlのIFN−βでMEFを8時間処理した。その後、1.0%のNonidet-P40、150mMのNaCl、20mMのTris−Cl(pH7.5)、1mMのEDTA及びプロテアーゼ阻害剤カクテル(Roche社製)を含む溶解緩衝液中で細胞を溶解した。SDS−PAGEで細胞溶解物を溶解し、PVDF膜に転写した。かかる膜をMDA5タンパク質の特異抗体でブロットし、増強した化学発光システム(Perkinermer社製)により視覚化した。結果は図1のdのとおりである。
(フローサイトメトリー)
マウスの静脈内に200μgのポリI:Cを注入し、注入から24時間後にマウスを処分した。コラゲナーゼ及びDNaseIを用いてマウスから脾細胞を調製した。CD86−FITC(BD Biosciences Pharmingen社製)、B220−PE、及びCD11c−APCで脾細胞を染色し、FACS Calibur(BD Bioscience社製)で分析した。結果は図2のcのとおりであり、IL−6の生成は、MDA5及びTLR3の両方によって調節され、サイトカインの誘導に加え、野生型マウスのポリI:C処理によっても、脾臓DCにおけるCD86などの共刺激分子の表面発現が増加することがわかった。
マウスの静脈内に200μgのポリI:Cを注入し、注入から24時間後にマウスを処分した。コラゲナーゼ及びDNaseIを用いてマウスから脾細胞を調製した。CD86−FITC(BD Biosciences Pharmingen社製)、B220−PE、及びCD11c−APCで脾細胞を染色し、FACS Calibur(BD Bioscience社製)で分析した。結果は図2のcのとおりであり、IL−6の生成は、MDA5及びTLR3の両方によって調節され、サイトカインの誘導に加え、野生型マウスのポリI:C処理によっても、脾臓DCにおけるCD86などの共刺激分子の表面発現が増加することがわかった。
(インビトロ転写dsRNAの調製)
マウスラミンA/CのcDNA配列をPCRで増幅し、pT7ブルーTベクター(Novagen社製)にてクローン化し、配列決定した。以下のT7配列でタグしたプライマーを用いた別のPCR反応により、マウスラミンA/Cに対応する200及び400bpのDNA配列の末端に、T7RNAポリメラーゼプロモーターをタグした;
7T Lamin. フォワード(配列番号1):TAATACGACTCACTATAGGacttgttggctgcgcaggc
7T Lamin. 200リバース(配列番号2):TAATACGACTCACTATAGGccactcgcctcagcatctcat
7T Lamin. 400リバース(配列番号3):TAATACGACTCACTATAGGctgttccacctggtcctcatg
T7 Lamin.600 リバース(配列場号4):TAATACGACTCACTATAGGtcctccaggtcacgcagcttt
PCT産物をゲル精製し、T7 RiboMAXTMExpress RNAi System(Promega社製)を製造者の説明書どおりに用いてのdsRNAのインビトロ転写及び作製に使用した。
マウスラミンA/CのcDNA配列をPCRで増幅し、pT7ブルーTベクター(Novagen社製)にてクローン化し、配列決定した。以下のT7配列でタグしたプライマーを用いた別のPCR反応により、マウスラミンA/Cに対応する200及び400bpのDNA配列の末端に、T7RNAポリメラーゼプロモーターをタグした;
7T Lamin. フォワード(配列番号1):TAATACGACTCACTATAGGacttgttggctgcgcaggc
7T Lamin. 200リバース(配列番号2):TAATACGACTCACTATAGGccactcgcctcagcatctcat
7T Lamin. 400リバース(配列番号3):TAATACGACTCACTATAGGctgttccacctggtcctcatg
T7 Lamin.600 リバース(配列場号4):TAATACGACTCACTATAGGtcctccaggtcacgcagcttt
PCT産物をゲル精製し、T7 RiboMAXTMExpress RNAi System(Promega社製)を製造者の説明書どおりに用いてのdsRNAのインビトロ転写及び作製に使用した。
(RIG−I−/−MDA5−/−によるRNAi)
上記実施例1で作製したRIG−IとMDA5を共に欠損する、RIG−I−/−MDA5−/−マウスの胎児(胎生11.5日)から採取した胎児線維芽細胞から、その一部よりゲノムDNAを抽出し、PCR法によりRIG−I−/−MDA5−/−の細胞を選び出した。野生型、及びRIG−I−/−MDA5−/−の細胞を培養した。ラミンA遺伝子に相同的な200、400、600bpの長鎖dsRNAを最終1マイクログラム/mlとなるように調整し、リポフェクション試薬であるリポフェクタミン2000(Invitrogen社)と混合した。その方法はInvitrogen社の推薦する方法に準じた。その後、このdsNRA/リポフェクタミン2000混合物で野生型、及びRIG−I−/−MDA5−/−細胞を処理した。処理後更に48時間細胞培養を継続し、その後、細胞を1.0%のNonidet-P40、150mMのNaCl、20mMのTris−Cl(pH7.5)、1mMのEDTA及びプロテアーゼ阻害剤カクテル(Roche社製)を含む溶解緩衝液中で細胞を溶解した。SDS−PAGEで細胞溶解物を溶解し、PVDF膜に転写した。かかる膜をラミンA/Cタンパク質の特異抗体でブロットし、増強した化学発光システム(Perkinermer社製)により視覚化した。その結果、野生型細胞ではラミンA分子の低下を認めなかったのに対し、RIG−IとMDA5を共に欠損する細胞(RIG−I−/−MDA5−/−)においては、これらすべての長鎖dsRNAを導入に対しラミンA分子の発現が低下すること確認した(図3参照)。
上記実施例1で作製したRIG−IとMDA5を共に欠損する、RIG−I−/−MDA5−/−マウスの胎児(胎生11.5日)から採取した胎児線維芽細胞から、その一部よりゲノムDNAを抽出し、PCR法によりRIG−I−/−MDA5−/−の細胞を選び出した。野生型、及びRIG−I−/−MDA5−/−の細胞を培養した。ラミンA遺伝子に相同的な200、400、600bpの長鎖dsRNAを最終1マイクログラム/mlとなるように調整し、リポフェクション試薬であるリポフェクタミン2000(Invitrogen社)と混合した。その方法はInvitrogen社の推薦する方法に準じた。その後、このdsNRA/リポフェクタミン2000混合物で野生型、及びRIG−I−/−MDA5−/−細胞を処理した。処理後更に48時間細胞培養を継続し、その後、細胞を1.0%のNonidet-P40、150mMのNaCl、20mMのTris−Cl(pH7.5)、1mMのEDTA及びプロテアーゼ阻害剤カクテル(Roche社製)を含む溶解緩衝液中で細胞を溶解した。SDS−PAGEで細胞溶解物を溶解し、PVDF膜に転写した。かかる膜をラミンA/Cタンパク質の特異抗体でブロットし、増強した化学発光システム(Perkinermer社製)により視覚化した。その結果、野生型細胞ではラミンA分子の低下を認めなかったのに対し、RIG−IとMDA5を共に欠損する細胞(RIG−I−/−MDA5−/−)においては、これらすべての長鎖dsRNAを導入に対しラミンA分子の発現が低下すること確認した(図3参照)。
Claims (10)
- RIG−I及びMDA5をコードする遺伝子の一部又は全部を欠損或いは変異させることにより、野生型において発現されるRIG−I及びMDA5の機能が共に失われていることを特徴とするI型インターフェロン(IFN)産生のシグナル伝達機能が失われているRNA干渉用ダブルノックアウト非ヒトモデル動物。
- 少なくとも30塩基よりも長い長鎖二本鎖RNAによって誘導されるRNA干渉作用を引き起こすことを特徴とする請求項1記載の非ヒトモデル動物。
- 非ヒトモデル動物が、モデルマウスであることを特徴とする請求項1又は2記載の非ヒトモデル動物。
- 請求項1〜3のいずれか記載の非ヒトモデル動物又は該非ヒトモデル動物由来の組織、器官又は細胞をRNA干渉に使用する方法。
- 請求項1〜3のいずれか記載の非ヒトモデル動物又は該非ヒトモデル動物由来の組織、器官若しくは細胞に、二本鎖RNA又は二本鎖RNA発現ベクターを導入してRNA干渉を誘導することを特徴とするRNA干渉作用により標的遺伝子の発現を抑制する方法。
- 二本鎖RNAが、少なくとも30塩基よりも長い長鎖二本鎖RNAであることを特徴とする請求項5記載のRNA干渉作用により遺伝子の発現を抑制する方法。
- 請求項1〜3のいずれか記載の非ヒトモデル動物又は該非ヒトモデル動物由来の組織、器官若しくは細胞に、所定の二本鎖RNA又は二本鎖RNA発現ベクターを導入してRNA干渉を誘導し、RNA干渉作用による遺伝子の発現抑制の結果、動物個体、組織、器官若しくは細胞に現れる表現型の変化を解析することを特徴とする標的遺伝子の機能を同定する方法。
- 二本鎖RNAが、少なくとも30塩基よりも長い長鎖二本鎖RNAであることを特徴とする請求項7記載の標的遺伝子の機能を同定する方法。
- 請求項1〜3のいずれか記載の非ヒトモデル動物又は該非ヒトモデル動物由来の組織、器官若しくは細胞に、被験物質として長鎖二本鎖RNA又は該長鎖二本鎖RNA発現ベクターを導入してRNA干渉を誘導し、RNA干渉作用による遺伝子の発現抑制の結果、動物個体、組織、器官若しくは細胞に現れる表現型の変化を解析することを特徴とするRNA干渉作用を利用した標的遺伝子のスクリーニング方法。
- 長鎖二本鎖RNAが、少なくとも30塩基よりも長い長鎖二本鎖RNAであることを特徴とする請求項9記載のRNA干渉を利用した標的遺伝子のスクリーニング方法。
Priority Applications (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2006061200A JP2007236247A (ja) | 2006-03-07 | 2006-03-07 | Rna干渉用ダブルノックアウト非ヒトモデル動物 |
PCT/JP2007/054354 WO2007102516A1 (ja) | 2006-03-07 | 2007-03-06 | Rna干渉用ダブルノックアウト非ヒトモデル動物 |
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---|---|---|---|
JP2006061200A JP2007236247A (ja) | 2006-03-07 | 2006-03-07 | Rna干渉用ダブルノックアウト非ヒトモデル動物 |
Publications (1)
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Family
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Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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JP2006061200A Pending JP2007236247A (ja) | 2006-03-07 | 2006-03-07 | Rna干渉用ダブルノックアウト非ヒトモデル動物 |
Country Status (2)
Country | Link |
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Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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JP2003144141A (ja) * | 2001-11-14 | 2003-05-20 | Gencom Co | RNAi効果が増強したES細胞 |
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2006
- 2006-03-07 JP JP2006061200A patent/JP2007236247A/ja active Pending
-
2007
- 2007-03-06 WO PCT/JP2007/054354 patent/WO2007102516A1/ja active Application Filing
Also Published As
Publication number | Publication date |
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WO2007102516A1 (ja) | 2007-09-13 |
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