WO2007102516A1 - Ｒｎａ干渉用ダブルノックアウト非ヒトモデル動物 - Google Patents
Ｒｎａ干渉用ダブルノックアウト非ヒトモデル動物 Download PDFInfo
- Publication number
- WO2007102516A1 WO2007102516A1 PCT/JP2007/054354 JP2007054354W WO2007102516A1 WO 2007102516 A1 WO2007102516 A1 WO 2007102516A1 JP 2007054354 W JP2007054354 W JP 2007054354W WO 2007102516 A1 WO2007102516 A1 WO 2007102516A1
- Authority
- WO
- WIPO (PCT)
- Prior art keywords
- double
- rna
- model animal
- mda5
- dsrna
- Prior art date
Links
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 title claims abstract description 82
- 238000012228 RNA interference-mediated gene silencing Methods 0.000 title claims abstract description 79
- 230000009368 gene silencing by RNA Effects 0.000 title claims abstract description 79
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims abstract description 161
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 claims abstract description 144
- 101001082073 Homo sapiens Interferon-induced helicase C domain-containing protein 1 Proteins 0.000 claims abstract description 86
- 102100027353 Interferon-induced helicase C domain-containing protein 1 Human genes 0.000 claims abstract description 85
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 80
- 230000006870 function Effects 0.000 claims abstract description 27
- 102100037435 Antiviral innate immune response receptor RIG-I Human genes 0.000 claims abstract description 5
- 101710127675 Antiviral innate immune response receptor RIG-I Proteins 0.000 claims abstract description 5
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 63
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 62
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 claims description 45
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 29
- 230000009471 action Effects 0.000 claims description 18
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 14
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 13
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 13
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 13
- 230000001629 suppression Effects 0.000 claims description 12
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 claims description 10
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 claims description 10
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 claims description 10
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 7
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 6
- 108010014726 Interferon Type I Proteins 0.000 claims description 5
- 102000002227 Interferon Type I Human genes 0.000 claims description 5
- 230000009131 signaling function Effects 0.000 claims 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 abstract description 10
- 230000035772 mutation Effects 0.000 abstract description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 70
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 42
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 41
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 23
- 230000010468 interferon response Effects 0.000 description 19
- 108091036414 Polyinosinic:polycytidylic acid Proteins 0.000 description 18
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 8
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 8
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 8
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 8
- 230000004044 response Effects 0.000 description 8
- 101000595548 Homo sapiens TIR domain-containing adapter molecule 1 Proteins 0.000 description 7
- 101000831496 Homo sapiens Toll-like receptor 3 Proteins 0.000 description 7
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 7
- 108010021099 Lamin Type A Proteins 0.000 description 7
- 102100036073 TIR domain-containing adapter molecule 1 Human genes 0.000 description 7
- 102100024324 Toll-like receptor 3 Human genes 0.000 description 7
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 7
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 6
- 102000008201 Lamin Type A Human genes 0.000 description 6
- 102000006835 Lamins Human genes 0.000 description 6
- 108010047294 Lamins Proteins 0.000 description 6
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 6
- 230000008859 change Effects 0.000 description 6
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 6
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 6
- 210000005053 lamin Anatomy 0.000 description 6
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 6
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 6
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 6
- 102100026720 Interferon beta Human genes 0.000 description 5
- 108090000467 Interferon-beta Proteins 0.000 description 5
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 5
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 5
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 4
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 4
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 4
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 4
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 3
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 3
- 230000005860 defense response to virus Effects 0.000 description 3
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 3
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 3
- 229960002963 ganciclovir Drugs 0.000 description 3
- IRSCQMHQWWYFCW-UHFFFAOYSA-N ganciclovir Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2COC(CO)CO IRSCQMHQWWYFCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 3
- 102000007863 pattern recognition receptors Human genes 0.000 description 3
- 108010089193 pattern recognition receptors Proteins 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 3
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 3
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 3
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 3
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 3
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 3
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 3
- 241000711404 Avian avulavirus 1 Species 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101001011382 Homo sapiens Interferon regulatory factor 3 Proteins 0.000 description 2
- 102100029843 Interferon regulatory factor 3 Human genes 0.000 description 2
- 102000014158 Interleukin-12 Subunit p40 Human genes 0.000 description 2
- 108010011429 Interleukin-12 Subunit p40 Proteins 0.000 description 2
- 241000711408 Murine respirovirus Species 0.000 description 2
- 101500025993 Mus musculus Lamin-A/C Proteins 0.000 description 2
- 101000650589 Mus musculus Roundabout homolog 3 Proteins 0.000 description 2
- 102000010168 Myeloid Differentiation Factor 88 Human genes 0.000 description 2
- 108010077432 Myeloid Differentiation Factor 88 Proteins 0.000 description 2
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 2
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 2
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 2
- 229940124158 Protease/peptidase inhibitor Drugs 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 108020000411 Toll-like receptor Proteins 0.000 description 2
- 102000002689 Toll-like receptor Human genes 0.000 description 2
- 241000711975 Vesicular stomatitis virus Species 0.000 description 2
- 210000002459 blastocyst Anatomy 0.000 description 2
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 2
- -1 cationic lipid Chemical class 0.000 description 2
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 230000000139 costimulatory effect Effects 0.000 description 2
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 2
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 2
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 2
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 230000009547 development abnormality Effects 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 238000001378 electrochemiluminescence detection Methods 0.000 description 2
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 2
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 2
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 2
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 230000011488 interferon-alpha production Effects 0.000 description 2
- 230000017306 interleukin-6 production Effects 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 2
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 2
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 2
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 2
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 2
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 2
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 2
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 2
- AUHDWARTFSKSAC-HEIFUQTGSA-N (2S,3R,4S,5R)-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)-2-(6-oxo-1H-purin-9-yl)oxolane-2-carboxylic acid Chemical compound [C@]1([C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)(N1C=NC=2C(O)=NC=NC12)C(=O)O AUHDWARTFSKSAC-HEIFUQTGSA-N 0.000 description 1
- LDGWQMRUWMSZIU-LQDDAWAPSA-M 2,3-bis[(z)-octadec-9-enoxy]propyl-trimethylazanium;chloride Chemical compound [Cl-].CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCCOCC(C[N+](C)(C)C)OCCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC LDGWQMRUWMSZIU-LQDDAWAPSA-M 0.000 description 1
- BHNQPLPANNDEGL-UHFFFAOYSA-N 2-(4-octylphenoxy)ethanol Chemical compound CCCCCCCCC1=CC=C(OCCO)C=C1 BHNQPLPANNDEGL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 102100032814 ATP-dependent zinc metalloprotease YME1L1 Human genes 0.000 description 1
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 1
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 102100034613 Annexin A2 Human genes 0.000 description 1
- 108090000668 Annexin A2 Proteins 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 108091032955 Bacterial small RNA Proteins 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710117545 C protein Proteins 0.000 description 1
- 102000011727 Caspases Human genes 0.000 description 1
- 108010076667 Caspases Proteins 0.000 description 1
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 1
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 description 1
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 102000016607 Diphtheria Toxin Human genes 0.000 description 1
- 108010053187 Diphtheria Toxin Proteins 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000004457 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 1
- 102100039620 Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Human genes 0.000 description 1
- 101000746373 Homo sapiens Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Proteins 0.000 description 1
- 101000959820 Homo sapiens Interferon alpha-1/13 Proteins 0.000 description 1
- 101001032342 Homo sapiens Interferon regulatory factor 7 Proteins 0.000 description 1
- 208000025500 Hutchinson-Gilford progeria syndrome Diseases 0.000 description 1
- 108010044240 IFIH1 Interferon-Induced Helicase Proteins 0.000 description 1
- GRSZFWQUAKGDAV-UHFFFAOYSA-N Inosinic acid Natural products OC1C(O)C(COP(O)(O)=O)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 GRSZFWQUAKGDAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000001617 Interferon Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010054267 Interferon Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102100040019 Interferon alpha-1/13 Human genes 0.000 description 1
- 102100038070 Interferon regulatory factor 7 Human genes 0.000 description 1
- 108010002352 Interleukin-1 Proteins 0.000 description 1
- 241000581650 Ivesia Species 0.000 description 1
- 239000012097 Lipofectamine 2000 Substances 0.000 description 1
- 108060004795 Methyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 101100286559 Mus musculus Ifih1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000244206 Nematoda Species 0.000 description 1
- 241001045988 Neogene Species 0.000 description 1
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 101000706020 Nicotiana tabacum Pathogenesis-related protein R minor form Proteins 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 101800000795 Proadrenomedullin N-20 terminal peptide Proteins 0.000 description 1
- 208000007932 Progeria Diseases 0.000 description 1
- 102000001253 Protein Kinase Human genes 0.000 description 1
- 108090000944 RNA Helicases Proteins 0.000 description 1
- 102000004409 RNA Helicases Human genes 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 108091081021 Sense strand Proteins 0.000 description 1
- 101710137500 T7 RNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 241000255588 Tephritidae Species 0.000 description 1
- 102000006601 Thymidine Kinase Human genes 0.000 description 1
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 230000035578 autophosphorylation Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000017455 cell-cell adhesion Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000008260 defense mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 230000007783 downstream signaling Effects 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 210000000416 exudates and transudate Anatomy 0.000 description 1
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 1
- 238000010230 functional analysis Methods 0.000 description 1
- 238000010363 gene targeting Methods 0.000 description 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 102000040620 helicase family Human genes 0.000 description 1
- 108091070619 helicase family Proteins 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000007901 in situ hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000006882 induction of apoptosis Effects 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000015788 innate immune response Effects 0.000 description 1
- 229940028843 inosinic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000013902 inosinic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004245 inosinic acid Substances 0.000 description 1
- 230000019734 interleukin-12 production Effects 0.000 description 1
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 1
- 230000031146 intracellular signal transduction Effects 0.000 description 1
- 210000003127 knee Anatomy 0.000 description 1
- 238000011819 knockout animal model Methods 0.000 description 1
- 238000011813 knockout mouse model Methods 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 238000002826 magnetic-activated cell sorting Methods 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000011325 microbead Substances 0.000 description 1
- 244000000010 microbial pathogen Species 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 101150091879 neo gene Proteins 0.000 description 1
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- PIRWNASAJNPKHT-SHZATDIYSA-N pamp Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](C)N)C(C)C)C1=CC=CC=C1 PIRWNASAJNPKHT-SHZATDIYSA-N 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 150000008300 phosphoramidites Chemical class 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 229940115272 polyinosinic:polycytidylic acid Drugs 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 125000001436 propyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 108060006633 protein kinase Proteins 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 230000008054 signal transmission Effects 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 1
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 230000003827 upregulation Effects 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 1
- 239000012130 whole-cell lysate Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
- A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
- A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
- A01K67/0276—Knock-out vertebrates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/111—General methods applicable to biologically active non-coding nucleic acids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
- A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
- A01K2217/054—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic) inducing loss of function
- A01K2217/058—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic) inducing loss of function due to expression of inhibitory nucleic acid, e.g. siRNA, antisense
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
- A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
- A01K2217/075—Animals genetically altered by homologous recombination inducing loss of function, i.e. knock out
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2227/00—Animals characterised by species
- A01K2227/10—Mammal
- A01K2227/105—Murine
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2267/00—Animals characterised by purpose
- A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2320/00—Applications; Uses
- C12N2320/10—Applications; Uses in screening processes
Definitions
- the present invention relates to a double knockout system in which the functions of RIG-I and MDA5 expressed in the wild type are lost by deleting or mutating part or all of the genes encoding RIG-I and MDA5.
- the present invention relates to human model animals and their usage.
- RNA interference is a phenomenon in which mRNA having a base sequence complementary to double-stranded RNA is degraded. RNAi is artificially exploited by this phenomenon. It is a technique that suppresses the expression of any gene by introducing double-stranded RNA. Specifically, RNAi is a phenomenon in which long double-stranded RNA is cleaved into 20-mer short double-stranded RNAs by Dicer molecules and suppresses the expression of gene messenger RNA that is homologous to that sequence. Since 1998, Fire et al. Discovered it in nematodes (see, for example, Non-Patent Document 1) and has been observed in various other species such as plants and fruit flies. In these organisms, it has been confirmed that the introduction of foreign double-stranded RNA (dsRNA) suppresses the expression of the target gene, and it is also being used as a method for creating knockout individuals.
- dsRNA foreign double-stranded RNA
- RNAi is unlikely to occur when a dsRNA of 30 bases or more is used as a long dsRNA.
- mammals have developed a variety of defense mechanisms that prevent virus infection.
- dsRNA double-stranded RNA
- Interferon response refers to a phenomenon in which an interferon molecule is produced, binds to an interferon receptor, activates intracellular signal transduction pathways, and causes various responses. As a result, a strong antiviral response is induced.
- dsRNA-dependent protein kinase As is well known, the transcription of the gene encoding dsRNA-dependent protein kinase (PKR) is enhanced, and PKR autophosphorylation and kinase activity are promoted. 2 A phenomenon that phosphorylates a and thereby inhibits translation of the entire gene. Due to such an interferon response, in mammals into which long dsRNA has been introduced, there has been a problem that the specificity of the RNAi effect is lowered and apoptosis is also induced, leading to an increase in cytotoxicity.
- PSR dsRNA-dependent protein kinase
- RNAi methods using 20-mer short RNA have been used, and interferon response by double-stranded RNA in mammalian cells has been avoided to suppress gene expression.
- siRNA 20-mer short RNA
- siRNA As an alternative to siRNA, it has been reported that a small RNA (shRNA) folded into a hairpin structure suppresses gene expression to the same extent as siRNA (see, for example, Non-Patent Document 3).
- innate immune responses against microbial pathogens such as viruses and bacteria include host pattern recognition receptors (PR R) 1 such as Toll-like receptor (TLR) and helicase family members (PAMP) It is caused by recognizing a specific structure of an invading pathogen called) (see, for example, Non-Patent Document 4 and Non-Patent Document 5).
- PR Rs host pattern recognition receptors
- PRRs play an essential role in the recognition of molecular patterns specific to viruses, including DNA, single-stranded (ss) RNA, double-stranded (ds) RNA, and glycoproteins. Yes.
- TLR3 located in the endosomal membrane is known to recognize viral dsRNA in addition to the synthetic dsRNA analog polyinosine polycytidylic acid (poly I: C).
- poly I polyinosine polycytidylic acid
- RIG-I Retinoic acid-inducible protein-I
- MDA-5 Mellanoma differentiation associated gene-5
- RIG-I is a DExDZHbox RNA helicase with two domain (CARD) -like modules that recruit caspases.
- RIG_1-deficient mice have also been reported to consistently not produce type I interferon (IFN) against vesicular stomatitis virus (VSV), Newcastle disease virus (NDV) and Sendai virus (SeV) infection.
- IFN type I interferon
- VSV vesicular stomatitis virus
- NDV Newcastle disease virus
- SeV Sendai virus
- MDA-5 has a structure similar to RIG-I and has been reported to be involved in mediating antiviral responses (see, for example, Non-Patent Document 8 and Non-Patent Document 9).
- Non-Patent Document l Nature 391 p806_811 1998
- Non-Patent Document 2 Nature 411 p494_498 2001
- Non-Patent Document 3 Genes & Dev. 16 p948_958 2002
- Non-Patent Document 4 Annu Rev Immunol. 20, 197-216, 2002
- Non-Patent Document 5 Annu Rev Immunol. 21, 335-376, 2003
- Non-Patent Document 6 Nat Immunol. 5, 730-737, 2004
- Non-Patent Document 7 Immunity Vol.23 19-28 July 2005
- Non-Patent Document 8 Curr Biol. 12, 838-843, 2002
- Non-Patent Document 9 Proc Natl Acad Sci USA. 101, 17264-17269, 2004
- An object of the present invention is to provide a double knockout non-human model animal that enables RNAi using dsRNA in a mammal, a method for using the same, and the like.
- MDA5 Z_ mice In order to investigate the functional role of MDA5 in vivo, the inventors first established MDA5 Z_ mice and analyzed the contribution of MDA5 to virus recognition (see Figures la and lb). MDA5 mRNA expression was not detected in MDA5 cells, as was the case with MDA5 protein (see Figures lc and Id). Many of them in contrast to the RIG- I mouse to die in embryonic stage, MDA5_ 7 _ mouse is growing health was born according to Mendelian ratio, was not observed in macroscopic developmental abnormalities up to 24 weeks of age.
- MDA5 TRIF __ / _ mice did not induce IFN-ct, IL-6 and IL-12 ⁇ 40 in response to poly I: C (see FIG. 2b). These results indicate that MDA5 is essential for poly I: C-induced IFN- ⁇ production and TLR3 signaling is important for IL-12 production, while both MDA5 and TLR3 regulate IL 6 production. It shows that In addition to induction of site force-in, wild-type mouse poly I: C treatment also increased the surface expression of costimulatory molecules such as CD86 in conventional spleen DC (see Figure 2c). Deficiency of either MDA5 or TRIF However, force double deficiency that did not affect CD86 expression resulted in inhibition of CD86 up-regulation.
- RIG- ⁇ ⁇ MEF did not produce any detectable amount of IFN- ⁇ . This indicates that it is essential for the detection of RIG-I force S in vitro transcribed dsRNA.
- in vitro transcribed dsRNA corresponding to several other sequences induced type I IFN via RIG-I rather than MDA5.
- MDA5 and RIG-I are differentially involved in the detection of poly I: C and in vitro transcribed dsRNA, respectively.
- the present inventors are able to significantly suppress the interferon response by dsRNA by losing the function of RIG-I and to induce RNAi in mammals.
- the hypothesis was made.
- RNAi against lamin A could not be induced in RIG-I alone knockout mice in which only the function of RIG-I was lost. Therefore, when IFNa production induction by dsRNA expression is observed by ELISA, only RIG-I appears to be involved in dsRNA recognition but MDA5, which is not perfect, is also able to recognize dsRNA.
- the present invention provides (1) deletion or mutation of part or all of the genes encoding RIG_I and MDA5, thereby losing both the functions of RIG-I and MDA5 expressed in the wild type.
- a type I interferon (IFN) -producing signal It is characterized by causing RNA interference induced by double knockout non-human model animals for RNA interference and (2) long double-stranded RNA longer than at least 30 bases.
- the non-human model animal described in (1) or (2) above which is a non-human model animal described in (1) above, or (3) a non-human model animal power model mouse.
- the present invention also provides (4) a method of using the non-human model animal according to any one of (1) to (3) above or a tissue, organ or cell derived from the non-human model animal for RNA interference, 5) Introducing double-stranded RNA or a double-stranded RNA expression vector into the non-human model animal described in any one of (1) to (3) above or a tissue, organ or cell derived from the non-human model animal to cause RNA interference
- RNA interference A method of suppressing the expression of a target gene by an RNA interference action characterized by induction, and (6) a double-stranded RNA having a long double-stranded RNA longer than at least 30 bases as described above ( 5) a method for suppressing gene expression by RNA interference as described above,
- RNA can be introduced by introducing a predetermined double-stranded RNA or double-stranded RNA expression vector into the cell.
- a method for identifying the function of a target gene characterized by inducing interference and analyzing phenotypic changes appearing in animals, tissues, organs or cells as a result of suppressing gene expression by RNA interference, 8)
- the present invention relates to the method for identifying the function of a target gene according to (7) above, wherein the double-stranded RNA is a long double-stranded RNA longer than at least 30 bases.
- the present invention relates to (9) a non-human model animal according to any one of (1) to (3) above or a tissue, organ or cell derived from the non-human model animal as a long double strand as a test substance. Introduce RNA or the long double-stranded RNA expression vector to induce RNA interference, and analyze expression changes that appear in individual animals, tissues, organs or cells as a result of suppression of gene expression due to RNA interference A screening method for a target gene using RNA interference, or (10) a long double-stranded RNA is a long double-stranded RNA longer than at least 30 bases. The present invention relates to a method for screening a target gene using RNA interference described in (9).
- FIG. 1 a is a diagram showing the structures of a mouse MDA5 gene, a targeting vector, and a predicted disrupted gene.
- the country indicates coding exon.
- B; indicates BamHI.
- Fig. 1b shows the Southern Plot analysis results of the progeny from the heterozygous intercross. Genomic DNA was extracted from the tail of the mouse, digested with BamHI, separated by electrophoresis, and hybridized with the radiolabeled probe shown in a. Southern blot shows 9.4 kb single band for wild type (+ / +) mice, 4.6 kb band for homozygous (_ / _) mice, and both for heterozygous (+ Z_) mice. A band was obtained.
- FIG. 1 a shows the Southern Plot analysis results of the progeny from the heterozygous intercross. Genomic DNA was extracted from the tail of the mouse, digested with BamHI, separated by electrophoresis, and hybridized with the radiolabeled probe shown in
- FIG. 1c shows the northern plot analysis result of peritoneal exudate cells (PEC). Wild type (WT) and MDA5-Z-PEC total RNA treated with 1000 U / ml IFN- ⁇ for 8 hours was extracted, and Northern blot analysis was performed for the expression of MDA5 mRNA. The same membrane was rehybridized with the / 3 actin probe.
- FIG. 1d shows the results of Western blot analysis of MDA5 expression. WT and MDA5 _ / _ MEF were treated with 1000 U / ml IFN- ⁇ for 8 hours, and whole cell lysates were immunoblotted with MDA5 antibody.
- FIG. 2 Figures 2a and 2b show that 200 ⁇ poly 1: ⁇ was injected into the vein of the indicated mouse for the time indicated, and serum IFN-a IL-6 and IL-12p40 It is a figure which shows the result of having measured the production
- FIG. 2c shows the results of analyzing the surface expression of CD86 by flow cytometry on spleen CD llc + B220_cDC of mice injected with PBS or poly I: C.
- FIG. 2e shows the results of treating WT RIG— 7 and MDA5 MEF with in vitro transcribed ds RNA of the indicated length that forms a complex with ribofactamine 2000 for 24 hours.
- the production of IFN- ⁇ in the culture supernatant was measured by ELI SA.
- the d and e error bars indicate 3 soils S. D.
- Figure 3 shows the introduction of 200 400 600bp long dsRNA homologous to the LaminA gene into cells lacking both RIG-I and MDA5 (RIG-I-Z-MDA5-Z-). It is a figure which shows the result of having used the expression of LaminA molecule
- RNAi double knockout non-human animal model of the present invention (hereinafter, sometimes simply referred to as "double knockout animal model") is deficient or partially or entirely lacking the genes encoding RIG-I and MDA5. This is especially true for non-human animal models that lose both the functions of RIG-I and MDA5 expressed in the wild type by mutation, and the signal transmission function of type I interferon (IFN) is lost. Without being restricted, the double knockout model animal of the present invention has a significantly suppressed interferon response because the signal transduction function of type I interferon (IFN chick IFN / 3) production by RIG-I and MDA5 is lost.
- type I interferon IFN chick IFN / 3
- RNAi induced by dsRNA can be used for RNAi induced by dsRNA.
- interferon response is usually generated with dsRNA longer than 30 bases.
- 30-800 base dsRNA in the RNAi method.
- short dsRNA is used for RNAi using the double knockout model animal of the present invention or a tissue, organ or cell derived from the model animal.
- the non-human model animal can be a suitable mammal other than a human, and specifically includes rodents such as mice, rats, and guinea pigs.
- rodents such as mice, rats, and guinea pigs.
- the double knockout model animal of the present invention a non-human model animal in which the gene functions of the RIG-I and MDA5 genes are deficient on the chromosome, ie, the RIG-I and MDA5 molecule protein knockouts.
- the double knockout model mouse of the present invention can be prepared as follows. Use gene fragments obtained from mouse gene libraries by PCR and other methods, screen RIG-I genes, and screen the RIG-I genes into subclones using viral vectors, plasmid vectors, etc. And identified by restriction enzyme mapping and DNA sequencing.
- a target vector is prepared by introducing a gene such as a kinase (HSV-tk) gene. This made Targuty The vector is linearized and introduced into ES cells by the electroporation method (electroporation), etc., and homologous recombination is performed. From the homologous recombinants, antibiotics such as G418 and gancyclovir (GANC) are used.
- GANC gancyclovir
- MDA5 heterozygous mice (MDA5; + / _) were obtained, and RIG-I heterozygous mice (RIG_I +/- ) mice were crossed with MDA5 heterozygous mice (MDA5 + z). Create RIG_I + / MDA5 + / mouse.
- the double knockout model mouse of the present invention can be prepared by crossing between the mice of this gene type (RIG_I + / _ MDA5 + / one).
- the form of its use is not particularly limited. Specifically, a method for suppressing the expression of a target gene by RNA interference described below, a method for identifying the function of the target gene In addition to the target gene screening method using RNA interference, the dsRNA that recognizes a different site of a predetermined gene or the dsRNA is recognized in the tissue, organ or cell derived from the double knockout model animal of the present invention or the non-human model animal.
- a vector that can be expressed (dsRNA expression vector) or a dsRNA or dsRNA expression vector of a different size of a given gene
- the RNAi mechanism such as analyzing the degree of expression of a given gene, and the like, and the test substance is introduced into the tissue, organ or cell derived from the double knockout model animal of the present invention or the non-human model animal.
- introduce dsRNA or dsRNA expression vector to evaluate the degree of induction of RNAi.
- RNAi promoters or inhibitors, or test substance administered to the double knockout model animal of the present invention Screening methods for RNAi promoters or inhibitors, or test substance administered to the double knockout model animal of the present invention, and its deficiency RNAi action by introducing dsRNA or dsRNA expression vector that recognizes a specific gene (for example, lamin A) that causes disease (eg, progeria syndrome)
- a specific gene for example, lamin A
- the double knockout model animal or double knockout Introducing dsRNA or dsRNA expression vector into model animal-derived tissues, organs or cells to induce RNAi and suppress gene expression, thereby suppressing gene expression, suppression of viral expression, suppression of disease-causing gene expression, etc.
- RNAi When RNAi is induced using the double knockout model animal of the present invention or a tissue, organ or cell derived from the non-human model animal, the interferon response is significantly suppressed, so dsRNA longer than 30 bases Alternatively, even when a dsRNA expression vector is used, RNAi can be induced without problems such as a decrease in the specificity of the RNAi effect due to the interferon response and an increase in cytotoxicity due to induction of apoptosis.
- a dsRNA or a dsRNA expression vector is applied to the double knockout model animal of the present invention or a tissue, organ or cell derived from the double knockout model animal.
- the method is not particularly limited as long as it is a method for introducing RNAi by introduction, and the expression of the target gene is suppressed by RNAi action.
- the dsRNA or dsRNA expression vector used for RN Ai is the target gene to be knocked down, for example, the gene whose sequence is known but whose function is to be clarified, and its expression is the cause of the disease.
- Examples include dsRNA or dsRNA expression vectors that can recognize possible genes. Forces that are usually longer than 30 bases and dsRNA is thought to generate an interferon response.
- the method of the present invention for suppressing expression of a target gene by the action of RNAi produces RNAi by dsRNA longer than this. It is also possible to use 30-800 base dsRNA.
- the short dsRNA is used in the method for suppressing gene expression by the RNAi action of the present invention.
- RNAi action of the present invention pathogens are increased by RNAi that inhibits DNA amplification and protein synthesis in biological tissues. It is possible to obtain powerful knowledge for reducing the activity of growth and cancer cells. In addition, if the function of an unknown target gene is elucidated, the physiological action based on that function will be elucidated, and the pathological action caused by the target gene can be elucidated.
- methods for confirming that gene expression has been suppressed include, for example, reduction of the expression level of mRNA of the target gene, Therefore, the degree of decrease in the expression level of the protein translated from can be achieved by persevering by a known method such as the timestamp stamp method.
- a predetermined dsRNA or dsRNA expression vector is introduced into the double knockout model animal of the present invention or a tissue, organ or cell derived from the double knockout model animal.
- a method for inducing RNAi and analyzing phenotypic changes that appear in animal individuals, tissues, organs or cells as a result of gene expression suppression by RNAi action there is no particular limitation, and the above-mentioned predetermined dsRNA or dsRN A
- the expression vector include a dsRNA or a dsRNA expression vector that can recognize a target gene whose sequence is known but whose function is unclear.
- dsRNA longer than 30 bases is thought to produce an interferon response.However, according to the method for identifying the function of the target gene of the present invention, it is possible to generate RNAi by dsRNA longer than this. It is also possible to use dsRNA of 30 to 800 bases. In addition, since short interferon responses do not completely occur even with short dsRNA, short dsRNA can be used in the method for identifying the function of the target gene of the present invention.
- the target gene screening method using the RNAi action of the present invention includes a dsRNA or dsRNA expression vector as a test substance in the double knockout model animal of the present invention or a tissue, organ or cell of the double knockout model animal.
- the test substance is not particularly limited as long as it is a method for inducing RNAi by introducing RNA and analyzing phenotypic changes appearing in animals, tissues, organs or cells as a result of gene expression suppression by RNAi action.
- Examples of the dsRNA or dsRNA expression vector include dsRNA or a dsRNA expression vector library prepared from a gene library. Usually longer than 30 bases, dsRNA is thought to produce an interferon response.
- RNAi action of the present invention it is possible to generate RNAi with dsRNA longer than this, and it is also possible to use dsRNA of 30 to 800 bases. It is. Also, since short interferon responses are not completely generated even with short dsRNA, short dsRNA can be used in the target gene screening method using the RNAi action of the present invention.
- dsRNA or dsRNA expression that gives a desired change (for example, a change that exhibits symptoms of a desired disease) to the phenotype appearing in an individual animal, tissue, organ or cell
- Screening from a vector library and identifying the target gene from the screened dsRNA is usually carried out using the ssRNA as a probe and performing hybridization, PCR, or vanning operation. It can be done by law.
- dsRNA or a dsRNA expression vector as a test substance is introduced into the double knockout model animal or the tissue, organ or cell of the double knockout model animal and RNAi is introduced.
- RNAi is introduced into the double knockout model animal or the tissue, organ or cell of the double knockout model animal and RNAi is introduced.
- a gene that induces apoptosis can be screened.
- the phenotype for which changes in animal individuals, tissues, organs or cells are to be analyzed is not particularly limited.
- disease symptoms of animal individuals, tissues, organs or cells, animal individuals, tissues, organs or cells Form, amount of substance in animal individual, tissue, organ or cell, amount of substance secreted by animal individual, tissue, organ or cell, animal individual, tissue, dynamics of organ or intracellular substance, cell-cell adhesion, animal individual, tissue , Life of organisms such as movement of organs or cells, life of animals, tissues, organs or cells, and the like.
- the function of the target gene can be identified by analyzing the phenotypic change, while the target gene screening method using the RNAi action of the present invention.
- a means for analyzing phenotypic changes when analyzing changes in the morphology of individual animals, tissues, organs or cells, a method of detecting them with a microscope or macroscopically can be cited.
- tissue, organ, or intracellular substance is mRNA
- Northern hybridization quantitative reverse transfer PCR, or in situ hybridization
- in situ hybridization can be cited as a means of quantitative analysis.
- the Western analysis method using an antibody with the protein encoded by the target gene as an antigen the method of measuring the enzyme activity of the protein encoded by the target gene, and the like can be cited as quantitative analysis means.
- the phenotypic changes that appear only in animal individuals, tissues, organs or cells from which RNAi has been analyzed as described above are the result of inhibition of the expression of the target gene. It can be identified as a function of
- Synthesis of ssRNA constituting dsRNA can be performed by solid-phase synthesis by a standard phosphoramidite method using, for example, an automatic nucleic acid synthesizer. In this way, each of the oligo RNAs constituting the dsRNA is synthesized, and two ssRNAs whose duplex forming parts are complementary are mixed in equimolar amounts and used as dsRNA.
- dsRNA can be directly introduced into cells by the lipofusion method or the like. The ability to use ribosomes composed of phosphatidinoreserin (PS), which is usually negatively charged.
- PS phosphatidinoreserin
- N, N, N-triethyl ammonium chloride (DOTMA, trade name: transfectum, lipofectamine) can also be used.
- DOTMA transfectum, lipofectamine
- the positively charged ribosomal force is adsorbed on the surface of the negatively charged cell and fused with the cell membrane to bind dsRNA. It can be introduced into cells.
- a complex of dsRNA and ribosome can be directly injected into a local region or its surrounding tissue.
- the dsRNA expression vector has the advantage that the period during which dsRNA can be present in the cell is longer and the efficiency of gene expression suppression is higher than when dsRNA is directly introduced into the cell.
- a dsRNA consisting of a sense strand DNA-linker antisense strand DNA of a specific sequence of a gene targeting the expression product of the target gene It can be advantageously produced by inserting an RNA expression cassette downstream of the promoter.
- a dsRNA expression vector including a commercially available product can be used, but a viral vector is preferable when introduced into a mammal.
- viral vectors examples include mouse leukemia retrovirus vectors (Microbiology and Immunology, 158, 1-23, 1992) and adeno-associated virus vectors (Curr. Top. Microbiol • Immunol, 158, 97-129, 1992). And adenoviral vectors (Science, 252, 431-434, 1991) and the ability to specifically mention ribosomes, etc. HIV lentiviral vectors are said to be capable of efficient long-term expression in non-dividing cells Preferred in terms of having characteristics.
- these expression systems may contain a control sequence that regulates expression not only by causing expression.
- the dsRNA expression cassette can be introduced into these expression vectors by a conventional method.
- a dsRNA expression vector is constructed by inserting a dsRNA expression cassette downstream of an appropriate promoter in these expression vectors.
- the method for introducing dsRNA or a dsRNA expression vector into a tissue, organ or cell is not particularly limited.
- calcium phosphate transfection, DEAE—dextran-mediated transfection, transfection ( exemplify transvection), microinjection, cationic lipid-mediated transfusion, electoporation, transduction, scrape loading, 3 ballistic introduction, infection, direct injection, etc. Can do.
- the tissue, organ or cell derived from the double knockout model animal is not particularly limited as long as it is a tissue, organ or cell collected from the double knockout model animal. , Knee, liver, spleen, stomach, intestine and the like.
- As the cells in addition to these tissues, organs derived cells, fetal fibroblasts, mention may be made of dendritic cells, etc., among these tissues, organs or cells, RIG- ⁇ 7 _MD A5_ 7 _ ones It's preferable to pick out.
- MDA5 gene was isolated from genomic DNA extracted by PCR using ES cells (GSI-I).
- a simple Perpes virus driven by the PGK promoter by constructing a targeting vector by replacing the 4.3-kb fragment encoding MDA50RF (including the DExH box) with a neomycin resistance gene cassette (neo) Thymidine kinase (HSV-TK) was inserted into the genomic fragment for negative selection.
- HSV-TK Thymidine kinase
- MyD88 _ / — mice, TLR3— ′ mice, and TRIF _ / _ mice were prepared by the method described in the literature Science 301, 640-3 (2003).
- IFN ⁇ / R ⁇ mice were prepared by the method described in Int Immunol 14 1225-31 (2002).
- RIG adult mice were produced by crossing with ICR mice.
- RIG—I heterozygotes RIG mice and MDA5 heterozygotes (MDA5 + / _ ) mice are mated, their children are RIG— I + / + MDA5 + / + , RIG— I + / _ MDA5 + / + , RI G— I + / + MDA5 + / — RIG— 1 + / MDA5 + / — This genotype uses genomic DNA extracted from the mouse tail and can be used by PCR or Southern blotting. Of these, RIG-I + + MDA5 + + , RIG_I + MDA5 + + , RIG can be identified by crossing mice with RIG—I + / _MDA5 + / _ genotypes.
- RIG-I _ / _ MEF and bone marrow-derived GMCSF or Flt3L-DC were prepared as described in literature Immunity 23, 19-28 (2005).
- Flt3L—DC force, etc., pDC and cDC were isolated as described above by MACS using anti-B220 and CD 11c microbeads manufactured by Miltenyi Biotech. Poly (I: C) was purchased from Amersham Biosciences.
- MDA5 _ / _ mice were established and the contribution of MDA5 to virus recognition was analyzed (see figures la and lb). Expression of mRNA of MDA5, as in the case of proteins, MDA5 _ - was not detected in cells (Fig. Lc and ld). In contrast to RIG— ⁇ z—mice, many of whom die at the embryonic stage, MDA5 __ / _ mice are born and grow healthy according to Mendelian ratios, and macroscopic developmental abnormalities are observed up to 24 weeks of age. There wasn't. The spleen and flow cytometric analysis of our Keru CD3, B220, CDl lc lymph nodes, between the wild type and MDA5 _ mice revealed no change in the composition of lymphocytes and DC.
- MEF was treated with 1000 U / ml IFN- / 3 for 8 hours.
- the cells were then lysed in a lysis buffer containing 1.0% Nonidet_P40, 150 mM NaCl, 20 mM Tris—Cl (pH 7.5), ImM EDTA and a protease inhibitor cocktail (Roche). .
- the cell lysate was lysed with SDS-PAGE and transferred to a PVDF membrane. Powerful membranes were plotted with specific antibodies to the MDA5 protein and visualized with an enhanced chemiluminescence system (Perkinermer). The result is shown in Fig. 1d.
- Inject 200 ig poly I C intravenously into mice and dispose of mice 24 hours after injection did.
- Mouse splenocytes were prepared using collagenase and DNasel. Spleen cells were stained with CD86-FI TC (BD Biosciences Pharmingen), B220-PE, and CDllc-APC and analyzed with FACS Calibur (BD Bioscience). The results are shown in Fig. 2c.
- IL-6 production is regulated by both MDA5 and TLR3, and in addition to induction of cytoforce-in, wild-type mouse poly I: C treatment also induced spleen DC. The surface expression of costimulatory molecules such as CD86 was found to increase.
- the mouse lamin A / C cDNA sequence was amplified by PCR, cloned with the pT7 blue T vector (Novagen) and sequenced. In another PCR reaction using primers tagged with the following T7 sequences, the ends of the 200 and 400 bp DNA sequences corresponding to mouse lamin A / C were tagged with a T7 RNA polymerase promoter;
- T7 Lamin. 200 reverse (SEQ ID NO: 2): TAATACGACTCACTATAGGccactcgc ctcagcatctcat
- T7 Lamin. 400 reverse (SEQ ID NO: 3): TAATACGACTCACTATAGGctgttcca cctggtcctcatg
- T7 Lamin. 600 reverse (SEQ ID NO: 4): TAATACGACTCACTATAGGtcctccag gtcacgcagcttt
- the PCT product was gel purified and used for in vitro transcription and production of dsRNA using the T7 RiboMAX TM Express RNAi System (Promega) as per manufacturer's instructions.
- RIG_I and MDA5 both of which were prepared in Example 1 above, RIG—5 / _ MDA5 — / — Fetal fibroblasts collected from fetal mouse embryos (embryo 11.5 days), a portion of which DNA was extracted, and RIG-1 MDA5_ / cells were selected by PCR. Wild-type and RIG-I _ / _ MDA5 _ / _ cells were cultured. 200, 400, 600 bp long dsRNA homologous to the Lamin A gene was adjusted to a final microgram / ml, and It was mixed with Lipofectamine 2000 (Invitrogen) which is a cision reagent. The method followed the method recommended by Invitrogen.
- DsNRA / Ripofuekutamin 2000 mixture with wild-type, and RIG- I- ⁇ MDA5 cells were treated.
- cell culture was continued for another 48 hours, after which the cells were mixed with 1.0% Nonidet-P40, 150 mM NaCl, 20 mM Tris_Cl (pH 7.5), ImM EDTA and protease inhibitor cocktail (Roche).
- the cells were lysed in a lysis buffer containing Cell lysates were lysed by SDS-PAGE and transferred to PVDF membrane. The force and membrane were plotted with the specific antibody of Lamin A / C protein and visualized with an enhanced chemiluminescence system (Perkineraier).
- RNAi double knockout non-human model animals for RNAi of the present invention and tissues, organs or cells derived from the double knockout non-human model animals of the present invention can be used for functional analysis of target genes and suppression of viral expression. It can also be used as a material for development of gene therapy by suppressing the expression of disease-causing genes and in screening methods for the development of RNA pharmaceuticals.
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Animal Husbandry (AREA)
- Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本発明の課題は、哺乳動物において二本鎖ＲＮＡを用いたＲＮＡ干渉を可能とさせるダブルノックアウト非ヒト動物やその使用方法を提供するものである。ＲＮＡ干渉用として、ＲＩＧ－Ｉ及びＭＤＡ５をコードする遺伝子を欠損或いは変異させることにより、野生型において発現されるＲＩＧ－Ｉ及びＭＤＡ５の機能が失われているダブルノックアウト非ヒト動物を使用する。また、この非ヒトモデル動物は少なくとも３０塩基よりも長い長鎖二本鎖ＲＮＡによって誘導されるＲＮＡ干渉作用を引き起こすことができる。
Description
明 細 書
RNA干渉用ダブルノックアウト非ヒトモデル動物
技術分野
[0001] 本発明は、 RIG— I及び MDA5をコードする遺伝子の一部又は全部を欠損或いは 変異させることにより、野生型において発現される RIG— I及び MDA5の機能が失わ れているダブルノックアウト非ヒトモデル動物やその使用方法等に関する。
背景技術
[0002] RNA干渉（RNAi； RNA interference)は、二本鎖 RNAと相補的な塩基配列を持つ た mRNAが分解される現象をレ、い、 RNAi法は、この現象を利用して人工的に二本 鎖 RNAを導入することにより、任意の遺伝子の発現を抑制する手法とされている。詳 しくは、 RNAiは、長鎖二本鎖 RNAが Dicer分子により 20mer程度の短鎖二本鎖 R NAに切断され、その配列に相同する遺伝子メッセンジャー RNAの発現を抑制する 現象であり、この現象は 1998年 Fireらにより、線虫で発見されてから（例えば、非特 許文献 1参照）、植物やショウジヨウバエなど、他の様々な生物種で観察されている。 これらの生物では、外来の二本鎖 RNA (dsRNA)を導入することにより、標的遺伝子 の発現が抑制されることが確認されており、ノックアウト個体を創生する方法としても 利用されつつある。
[0003] し力、し、哺乳動物においては、長鎖の dsRNAとして 30塩基以上の dsRNAを用い た場合には RNAiが起こりにくいとされている。この原因の一つとして、哺乳動物はゥ ィルス感染を防ぐ様々な防御機構が発達しており、実際に、極めて低い濃度の二本 鎖 RNA (dsRNA)が存在するだけでインターフェロンの応答が起こるためと考えられ ている。インターフェロン応答とは、インターフェロン分子が産生され、インターフエ口 ン受容体に結合、細胞内シグナル伝達経路を活性化し様々な応答を引き起こす現 象を表す。その結果強力な抗ウィルス応答が誘導される。その反応のうちょく知られ たものとして、 dsRNA依存的タンパク質キナーゼ（PKR)をコードする遺伝子の転写 が高まり、 PKRの自己リン酸化とキナーゼ活性が促進され、活性化された PKRは、 el F - 2 aをリン酸化し、これにより遺伝子全体の翻訳が阻害される現象があげられる。
このようなインターフェロン応答により、長鎖 dsRNAを導入した哺乳動物においては 、 RNAi効果の特異性が下がり、またアポトーシスも誘導されるため、細胞毒性が上 がるという問題があった。
[0004] そこで、哺乳動物においては、 20mer程度の短鎖 RNA (siRNA)による RNAi法を 用レ、、哺乳動物細胞での二本鎖 RNAによるインターフェロン応答を回避し、遺伝子 発現の抑制を行ってきた (例えば、非特許文献 2参照）。また、 siRNAに代わるものと して、ヘアピン構造に折り畳んだ小さな RNA (shRNA)が、 siRNAと同程度に遺伝 子の発現を抑制することが報告されている (例えば、非特許文献 3参照）。
[0005] し力 ながら、その遺伝子発現抑制効果は不安定であり、また、短鎖 RNAを用いて もインターフェロンを活性化させてしまう等の問題点が指摘されている。
[0006] 一方、ウィルスやバクテリア等の微生物病原体に対する自然免疫応答は、 Toll様受 容体 (TLR)及びへリカーゼファミリーメンバーのような宿主パターン認識受容体（PR R) 1 病原体関連分子パターン (PAMP)と呼ばれる侵入病原体の特異構造を認識 することによって惹起される（例えば、非特許文献 4及び非特許文献 5参照）。宿主パ ターン認識受容体（PRR)は、 DNA、一本鎖（ss) RNA、二本鎖（ds) RNA及び糖タ ンパク質を含むウィルスに特異的な分子パターンの認識に不可欠の役割を果たして いる。エンドソーム膜に局在する TLR3は、合成 dsRNAアナログであるポリイノシン ポリシチジル酸（ポリ I : C)に加えてウィルスの dsRNAも認識することが知られてい る。また、細胞質タンパク質である RIG— I (Retinoic acid-inducible protein-I)及びへ リカードとしても失ロられる MDA— 5 (Melanoma differentiation associated gene— 5)は、 dsRNAディテクタ一として同定されている。 RIG— Iは、カスパーゼをリクルートするド メイン（CARD)様モジュールを 2個有する DExDZHbox型 RNAヘリカーゼである。 ヘリカーゼドメインは、 dsRNAの認識に関与していると考えられ、 RIG Iにおける C ARDは、 IRF3、 IRF7及び NF_ κ Βの活性化を導くダウンストリームシグナル伝達 の開始に必須であることが報告されている (例えば、非特許文献 6参照）。また、 RIG _1欠損マウスは、水疱性口内炎ウィルス（VSV)、ニューカッスル病ウィルス（NDV) 及びセンダイウィルス（SeV)の感染に対して、一貫して I型インターフェロン（IFN)を 産生しないことが報告されている (例えば、非特許文献 7参照）。さらに、ウィルス感染
に応答した IRF3及び NF— κ Βの活性化は、 RIG— I欠損細胞で障害されていた。 また、 MDA— 5は、 RIG— Iに類似した構造を有し、抗ウィルス応答の媒介に関与し ていることが報告されている（例えば、非特許文献 8及び非特許文献 9参照）。
[0007] RIG— I及び MDA5は、ウィルス dsRNAの認識に関与することが示唆されるものの 、インビボでのこれら dsRNAディテクタ一間の機能的関係に加え、 MDA5の機能的 役割については知られていなレ、。このように dsRNAディテクターの明確な機能が解 明されていないため、哺乳動物において、これらの作用に基づくインターフェロン応 答を抑えることはできな力、つた。
[0008] 非特許文献 l : Nature 391 p806_811 1998
非特許文献 2： Nature 411 p494_498 2001
非特許文献 3 : Genes & Dev. 16 p948_958 2002
非特許文献 4 : Annu Rev Immunol.20, 197-216, 2002
非特許文献 5 : Annu Rev Immunol. 21 ,335-376, 2003
非特許文献 6 : Nat Immunol. 5, 730-737， 2004参照
非特許文献 7 : Immunity Vol.23 19-28 July 2005
非特許文献 8 : Curr Biol. 12, 838-843, 2002
非特許文献 9 : Proc Natl Acad Sci USA. 101 , 17264-17269， 2004
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0009] 本発明の課題は、哺乳動物において dsRNAを用いた RNAiを可能とさせるダブル ノックアウト非ヒトモデル動物やその使用方法等を提供することにある。
課題を解決するための手段
[0010] 本発明者らは、まず、インビボでの MDA5の機能的役割を調べるため、 MDA5 Z _マウスを確立し、ウィルス認識に対する MDA5の寄与を分析した（図 l a及び lb参 照）。 MDA5の mRNAの発現は、 MDA5タンパク質の場合と同様に、 MDA5 細胞では検出されなかった（図 l c及び I d参照）。その多くが胚期に死亡する RIG— I マウスとは対照的に、 MDA5_7_マウスはメンデル比にしたがって誕生して健康 に成長し、 24週齢まで巨視的な発達異常は認められなかった。脾臓及びリンパ節に
おける CD3、 B220、 CDl lcのフローサイトメトリー分析により、野生型と MDA5_/ _ マウスとの間には、リンパ球及び樹状細胞の数において変化がないことを確認した。 TLR3、 RIG— I及びMDA5は、ポリ I : Cの認識及びその後の抗ウィルス応答の誘 導に関与しているとされている。しかし、 dsRNA刺激に対する応答におけるこれらの 分子のインビボでの寄与については、まだ明らかにされていなレ、。したがって、本発 明者らは次に、 RIG_I、 MDA_ 5、 TRIF、又は MDA—5と TRIFの両方を欠損し たマウスにおけるポリ I : Cへのインビボでの応答について調べた。意外にも、ポリ I : C を投与すると野生型及び RIG—厂 マウスのいずれの血清中でも、 IFN_ α、 IL- 6及び IL_ 12が急速に誘導され、 RIG— Iがインビボにおけるポリ I : Cを介した応答 に不可欠ではないことが示された（図 2a参照）。これとは際立って対照的に、 MDA5 _/_マウスがポリ I : Cに応答して IFN—ひを生成することはなぐ IL— 6及び IL_ 12p 40の生成も、かなり減少していた。また、 TRIF— マウスは通常量の IFN—ひを生 成していた力 IL—12p40の生成は著しく減少しており、 IL— 6の生成もかなり減少 していた。さらに、 MDA5 TRIF_/_マウスがポリ I : Cに応答して IFN— ct、 IL— 6及び IL— 12ρ40を誘導することはなかった（図 2b参照）。これらの結果は、 MDA5 はポリ I : C誘導性の IFN— α生成に不可欠であり、 TLR3シグナリングは IL— 12の 生成に重要である一方で、 MDA5及び TLR3の両方が IL 6の生成を調節すること を示している。サイト力インの誘導に加え、野生型マウスのポリ I : C処理によっても、従 来の脾臓 DCにおける CD86などの共刺激分子の表面発現が増加した（図 2c参照） MDA5又は TRIFの一方が欠損していても CD86発現に影響はなかった力 二重 欠損では結果的に CD86のアップレギュレーションが阻害された。このことは、 MDA 5シグナリング及び TLR3シグナリングの両方力 インビボにおけるポリ I : C応答性の c DC活性化に関与していることを示している。 GM— CSFを用いて作製した骨髄由来 DC (GMCSF_DC)をポリ I : Cで刺激すると、野生型又は RIG—厂 7 マウスのいず れかの細胞は、ポリ I : Cに応答して投与量依存的に IFN—ひ、 IL— 6及び IL_ 12p4 0を生成する。これとは対照的に、 MDA5 GMCSF— DCでは、これらのサイト力 インの生成がひどく減少していた（図 2d参照）。したがって、細胞質中では、 RIG-I ではなく MDA5がポリ I： Cを主に認識していることを確認した。
[0012] しかし、イノシン酸は自然状態でのウィルス複製過程では利用されないため、本発 明者らはインビトロ転写により長鎖 dsRNAを合成し、 MDA5又は RIG— Iを欠損して レ、るマウスの胚線維芽細胞（MEF)における IFN応答を調べてみた。リボフヱクシヨン 試薬との錯体を形成するマウスラミン (Lamin) AZCの配列に対応する、長さの異なる 2つの dsRNA (200bp及び 400bp)で、 MEFを刺激した。ポリ I : Cの場合とは異なり 、野生型及び MDA5 MEFは同等量の IFN_ βを生成した（図 2e参照）。 RIG —厂 κ MEFは、検出可能量の IFN— βをまったく生成しなかった。これは、 RIG— I 力 Sインビトロ転写 dsRNAの検出に不可欠であることを示している。また、他のいくつ かの配列に対応するインビトロ転写 dsRNAは、 MDA5ではなく RIG— Iを介して I型 I FNを誘導していた。総合的に考えて、これは MDA5と RIG— Iがポリ I : C及びインビ トロ転写 dsRNAの検出にそれぞれ差別的に関与している証拠となる。
[0013] これらの知見から、本発明者らは、 RIG— Iの機能を喪失させることで dsRNAによる インターフェロン応答を有意に抑制し、哺乳動物における RNAiを誘導させることが できるのではなレ、かとの仮説を立てた。
[0014] し力 ながら、 RIG— Iの機能のみを喪失させた RIG— I単独ノックアウトマウスでは、 ラミン Aに対する RNAiを誘導させることはできなかった。そこで、 dsRNAの発現によ る IFN a産生誘導を ELISA法で観察するような場合には、 RIG— Iのみが dsRNAの 認識に関与しているように見えるものの完全ではなぐ MDA5も dsRNAの認識に関 与しているのではないかという仮説を立て、 RIG— IとMDA5を共に欠損する細胞（R IG-Γ' MDAS—^ )に、ラミン A遺伝子【こ中目同白勺な 200、 400、 600bpの長鎖 ds RNAを導入し、その後のラミン A分子の発現をウェスタンプロット法にて確認したとこ ろ、野生型細胞ではラミン A分子の低下を認めなかったのに対し、意外にも RIG— Iと MDA5を共に欠損する細胞（RIG—厂 7_MDA5 )においては、これらすベての 長鎖 dsRNAの導入に対しラミン A分子の発現が低下することを見い出し、本発明を 完成するに至った。
[0015] すなわち本発明は、（1) RIG_I及び MDA5をコードする遺伝子の一部又は全部 を欠損或いは変異させることにより、野生型において発現される RIG— I及び MDA5 の機能が共に失われてレ、ることを特徴とする I型インターフェロン (IFN)産生のシグナ
ル伝達機能が失われてレ、る RNA干渉用ダブルノックアウト非ヒトモデル動物や、 （2) 少なくとも 30塩基よりも長い長鎖二本鎖 RNAによって誘導される RNA干渉作用を 引き起こすことを特徴とする上記（1)記載の非ヒトモデル動物や、（3)非ヒトモデル動 物力 モデルマウスであることを特徴とする上記（1)又は（2)記載の非ヒトモデル動物 に関する。
[0016] また本発明は、（4)上記（1)〜（3)のいずれか記載の非ヒトモデル動物又は該非ヒ トモデル動物由来の組織、器官又は細胞を RNA干渉に使用する方法や、（5)上記（ 1)〜（3)のいずれか記載の非ヒトモデノレ動物又は該非ヒトモデル動物由来の組織、 器官若しくは細胞に、二本鎖 RNA又は二本鎖 RNA発現ベクターを導入して RNA 干渉を誘導することを特徴とする RNA干渉作用により標的遺伝子の発現を抑制する 方法や、（6)二本鎖 RNA力 少なくとも 30塩基よりも長い長鎖二本鎖 RNAであるこ とを特徴とする上記（5)記載の RNA干渉作用により遺伝子の発現を抑制する方法や 、 (7)上記（1)〜（3)のレ、ずれか記載の非ヒトモデル動物又は該非ヒトモデル動物由 来の組織、器官若しくは細胞に、所定の二本鎖 RNA又は二本鎖 RNA発現ベクター を導入して RNA干渉を誘導し、 RNA干渉作用による遺伝子の発現抑制の結果、動 物個体、組織、器官若しくは細胞に現れる表現型の変化を解析することを特徴とする 標的遺伝子の機能を同定する方法や、 （8)二本鎖 RNAが、少なくとも 30塩基よりも 長い長鎖二本鎖 RNAであることを特徴とする上記（7)記載の標的遺伝子の機能を 同定する方法に関する。
[0017] さらに本発明は、（9)上記（1)〜（3)のいずれか記載の非ヒトモデル動物又は該非 ヒトモデル動物由来の組織、器官若しくは細胞に、被験物質として長鎖二本鎖 RNA 又は該長鎖二本鎖 RNA発現ベクターを導入して RNA干渉を誘導し、 RNA干渉作 用による遺伝子の発現抑制の結果、動物個体、組織、器官若しくは細胞に現れる表 現型の変化を解析することを特徴とする RNA干渉作用を利用した標的遺伝子のスク リーニング方法や、（10)長鎖二本鎖 RNAが、少なくとも 30塩基よりも長い長鎖二本 鎖 RNAであることを特徴とする上記（9)記載の RNA干渉を利用した標的遺伝子の スクリーニング方法に関する。
図面の簡単な説明
[図 1]図 1の aは、マウス MDA5遺伝子、ターゲテイングベクター及び予測された破壊 遺伝子の構造を示す図である。國はコーディングェクソンを示す。 B ; BamHIを示す 。図 1の bは、ヘテロ接合体のインタークロスによる子孫のサザンプロット分析結果を 示す図である。ゲノム DNAをマウスの尾から抽出し、 BamHIで分解し、電気泳動で 分離して、 aに示した放射性標識プローブとハイブリダィズした。サザンブロットにより 、野生型（ + / + )マウスには 9. 4kbのシングルバンド、ホモ接合体（_/_)マウス には 4. 6kbのバンド、ヘテロ接合体（ + Z_)マウスには両方のバンドが得られた。 図 1の cは、腹腔滲出細胞（PEC)のノーザンプロット分析結果を示す図ある。 1000U /mlの IFN— βで 8時間処理した野生型（WT)及び MDA5— Z— PECの全 RNAを 抽出し、 MDA5の mRNAの発現について、ノーザンブロット分析を行った。同じ膜を /3ァクチンプローブと再度ハイブリダィズした。図 1の dは、 MDA5発現のウェスタン ブロット分析結果を示す図ある。 WT及び MDA5_/_MEFを 1000U/mlの IFN— βで 8時間処理し、全細胞溶解液を MDA5の抗体でィムノブロットした。
[図 2]図 2の a及び bは、表示のマウスの静脈内に、 200 §のポリ1 :〇を表示した時間 注入しておき、血清中の IFN— a IL— 6及び IL— 12p40の生成を ELISAで測定 した結果を示す図である。データは、血清試料の平均値土 S . D.である。図 2の cは PBS又はポリ I : Cを注入されたマウスの脾臓 CD l l c+B220_cDCについて、 CD8 6の表面発現をフローサイトメトリーで分析した結果を示す図である。図 2の dは、 WT RIG—厂 、及び MDA5_ GMCSF— DCを、濃度を次第に増大させたポリ I : C で 24時間刺激した結果を示す図である。培養上清中の IFN— a IL— 6及び IL—1 2ρ40の生成を ELISAで測定した。図 2の eは、 WT RIG—厂 7 及び MDA5 MEFを、リボフヱクトァミン 2000と錯体を形成する、表示した長さのインビトロ転写 ds RNAで 24時間処理した結果を示す図である。培養上清中の IFN— βの生成を ELI SAで測定した。 d及び eのエラーバーは、 3回の土 S . D.を示す。
[図 3]図 3は RIG— Iと MDA5を共に欠損する細胞（RIG— I— Z— MDA5— Z— )に、 Lam inA遺伝子に相同的な 200 400 600bpの長鎖 dsRNAを導入し、その後の LaminA 分子の発現をウェスタンプロット法に供した結果を示す図である。
発明を実施するための最良の形態
[0019] 本発明の RNAi用ダブルノックアウト非ヒトモデル動物（以下、単に「ダブルノックァ ゥトモデル動物」ということがある。）としては、 RIG— I及びMDA5をコードする遺伝 子の一部又は全部を欠損或いは変異させることにより、野生型において発現される R IG— I及び MDA5の機能が共に失われて、 I型インターフェロン（IFN)産生のシグナ ル伝達機能が失われている非ヒトモデル動物であれば特に制限されず、本発明のダ ブルノックアウトモデル動物は、 RIG— I及び MDA5による I型インターフェロン（IFN ひや IFN /3 )産生のシグナル伝達機能が失われているため、インターフェロン応答が 有意に抑制され、 dsRNAによって誘導される RNAi用に使用することができる。特に 通常 30塩基よりも長レ、dsRNAではインターフェロン応答が生じると考えられてレ、るが 、本発明のダブルノックアウトモデル動物によれば、これよりも長い dsRNAによる RN Ai作用を生じさせることが可能であり、 RNAi法に 30〜800塩基の dsRNAを使用す ることも可能である。また、短鎖の dsRNAにおいてもインターフェロン応答が完全に 生じないわけではないため、本発明のダブルノックアウトモデル動物又は該モデル動 物由来の組織、器官又は細胞を用いた RNAiに短鎖 dsRNAを使用することもできる 。また、非ヒトモデル動物としては、ヒト以外の適宜の哺乳動物を対象とすることができ 、具体的には、マウス、ラット、モルモット等の齧歯目動物を挙げることができる。なお
、これらのうちマウスを好適な例示として挙げることができる。
[0020] 本発明のダブルノックアウトモデル動物を作製するためには、 RIG— I及び MDA5 遺伝子の遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒトモデル動物、すなわち RIG— I分 子及び MDA5分子のタンパク質のノックアウト動物を作製する。例えば、本発明のダ ブルノックアウトモデルマウスは、以下のようにして作製することができる。マウス遺伝 子ライブラリーから PCR等の方法により得られた遺伝子断片を用レ、、 RIG— I遺伝子 をスクリーニングし、スクリーニングされた RIG— I遺伝子を、ウィルスベクターやプラス ミドベクター等を用いてサブクローンし、制限酵素マッピング及び DNAシーケンシン グにより特定する。次に、この RIG— Iをコードする遺伝子の全部又は一部を pMCl ネオ遺伝子カセット等に置換し、 3'末端側にジフテリアトキシン Aフラグメント（DT— A)遺伝子や単純へルぺスウィルスのチミジンキナーゼ（HSV— tk)遺伝子等の遺伝 子を導入することによって、ターゲットベクターを作製する。この作製されたターグティ
ングベクターを線状化し、エレクト口ポレーシヨン (電気穿孔）法等によって ES細胞に 導入し、相同的組換えを行い、その相同的組換え体の中から、 G418やガンシクロビ ァ（GANC)等の抗生物質により相同的組換えを起こした ES細胞を選択する。この 選択された ES細胞が目的とする組換え体かどうかをサザンプロット法等により確認す ることが好ましレ、。その確認された ES細胞のクローンをマウスの胚盤胞中にマイクロ インジェクションし、力かる胚盤胞を仮親のマウスに戻し、キメラマウスを作製する。こ のキメラマウスを野生型マウスと交雑させると、 RIG— Iヘテロ接合体マウス（RIG_I+ 7_)を得ることができる。また、同様にして MDA5ヘテロ接合体マウス（MDA5 ; +/_) を得て、 RIG— Iヘテロ接合体（RIG_I+/— )マウスと MDA5ヘテロ接合体（MDA5 + z一）マウスとを掛け合わせ、 RIG_I+/ MDA5+/ マウスを作製する。次に、この遺 伝子型 (RIG_I+/_MDA5+/一）のマウス間同士で交配させることにより、本発明の ダブルノックアウトモデルマウス作製することができる。
本発明のダブルノックアウトモデル動物又は該非ヒトモデル動物由来の組織、器官 若しくは細胞の RNAiに使用する方法としては、前記ダブルノックアウトモデル動物 又は非ヒトモデル動物由来の組織、器官又は細胞を使用して、 RNAiを誘導するもの であれば、その使用の形態については特に制限されず、具体的には、後述する RN A干渉作用により標的遺伝子の発現を抑制する方法、標的遺伝子の機能を同定す る方法、 RNA干渉作用を利用した標的遺伝子のスクリーニング方法の他、本発明の ダブルノックアウトモデル動物又は該非ヒトモデル動物由来の組織、器官若しくは細 胞に、所定遺伝子の異なる部位を認識する dsRNA又は該 dsRNAを発現しうるべク ター（dsRNA発現ベクター）、あるいは、所定遺伝子の異なる大きさの dsRNA又は d sRNA発現ベクターを導入して、所定遺伝子の発現の程度を解析する等の RNAiの メカニズムを解明する方法や、本発明のダブルノックアウトモデル動物又は該非ヒトモ デル動物由来の組織、器官若しくは細胞に、被験物質の存在下、 dsRNA又は dsR NA発現ベクターを導入して、 RNAiの誘導の程度を評価する RNAi促進又は抑制 剤のスクリーニング方法や、本発明のダブルノックアウトモデル動物に、被験物質を 投与して、その欠損により疾患 (例えば、早老症候群）を引き起こす所定遺伝子 (例え ば、ラミン A)を認識する dsRNA又は dsRNA発現ベクターを導入して、 RNAi作用
による遺伝子の発現抑制の結果、モデル動物に現れる疾患改善の程度を、被験物 質の非存在下の場合と比較'評価する前記疾患の治療薬のスクリーニング方法など 、前記ダブルノックアウトモデル動物又はダブルノックアウトモデル動物由来の組織、 器官又は細胞に dsRNA又は dsRNA発現ベクターを導入して RNAiを引き起こし、 遺伝子の発現を抑制させることで、遺伝子の機能解析や、ウィルスの発現抑制、疾患 原因遺伝子の発現抑制などの方法や、 RNA医薬品の開発等のためのスクリーニン グ方法を挙げること力 Sできる。そして、本発明のダブルノックアウトモデル動物又は該 非ヒトモデル動物由来の組織、器官若しくは細胞を使用して RNAiを誘導した場合、 インターフェロン応答が有意に抑制されているので、たとえ 30塩基よりも長い dsRNA 又は dsRNA発現ベクターを用いた場合であっても、インターフェロン応答による RN Ai効果の特異性の低下や、アポトーシス誘導による細胞毒性の上昇等の問題のな レ、RNAiを誘導することが可能となる。
[0022] 本発明の RNAi作用により標的遺伝子の発現を抑制する方法としては、上記本発 明のダブルノックアウトモデル動物又は該ダブルノックアウトモデル動物由来の組織、 器官又は細胞に、 dsRNA又は dsRNA発現ベクターを導入して RNAiを誘導する方 法であれば特に制限されず、 RNAi作用により標的遺伝子の発現が抑制される。 RN Aiに使用する dsRNA又は dsRNA発現ベクターとしては、ノックダウンさせたい標的 遺伝子、例えば、配列は判明しているがどのような機能を有するかを解明したい遺伝 子や、その発現が疾患の原因と考えられる遺伝子などを認識することができる dsRN A又は dsRNA発現ベクターを挙げることができる。通常 30塩基よりも長レ、dsRNAで はインターフェロン応答が生じると考えられている力 本発明の RNAi作用による標的 遺伝子の発現を抑制する方法によれば、これよりも長レ、dsRNAによる RNAiを生じさ せることが可能であり、 30〜800塩基の dsRNAを使用することも可能である。また、 短鎖の dsRNAにおいても、インターフェロン応答が完全に生じないわけではないた め、本発明の RNAi作用による遺伝子の発現を抑制する方法に短鎖 dsRNAを使用 することちでさる。
[0023] 本発明の RNAi作用による遺伝子の発現を抑制する方法によれば、生物組織中に おける DNAの増幅作用やタンパク質合成作用を抑止する RNAiにより、病原体の増
殖やガン細胞の活性を下げるための有力な知見を得ることができる。また、未知の標 的遺伝子の機能が解明されれば、その機能に基づく生理作用が解明され、標的遺 伝子に起因する病理作用の解明が可能となる。なお、本発明の RNAi作用による遺 伝子の発現を抑制する方法において、遺伝子の発現が抑制されたことを確認する方 法としては、例えば、標的遺伝子の mRNAの発現量の減少や、その mRNAから翻 訳されるタンパク質の発現量の減少の程度をゥヱスタンプロット法等の公知の方法に より、確霄忍することにより行うこと力 Sできる。
[0024] 本発明の標的遺伝子の機能を同定する方法としては、上記本発明のダブルノック アウトモデル動物又は該ダブルノックアウトモデル動物由来の組織、器官又は細胞に 、所定の dsRNA又は dsRNA発現ベクターを導入して RNAiを誘導し、 RNAi作用 による遺伝子の発現抑制の結果、動物個体、組織、器官若しくは細胞に現れる表現 型の変化を解析する方法であれば特に制限されず、上記所定の dsRNA又は dsRN A発現ベクターとしては、例えば、配列は判明しているが機能が明らかでなぐどのよ うな機能を有するかを解明したい標的遺伝子を認識することができる dsRNA又は ds RNA発現ベクターを挙げることができる。通常 30塩基よりも長い dsRNAではインタ 一フエロン応答が生じると考えられているが、本発明の標的遺伝子の機能を同定す る方法によれば、これよりも長い dsRNAによる RNAiを生じさせることが可能であり、 30〜800塩基の dsRNAを使用することも可能である。また、短鎖の dsRNAにおい ても、インターフェロン応答が完全に生じないわけではないため、本発明の標的遺伝 子の機能を同定する方法に短鎖 dsRNAを使用することもできる。
[0025] 本発明の RNAi作用を利用した標的遺伝子のスクリーニング方法としては、前記本 発明のダブルノックアウトモデル動物又は該ダブルノックアウトモデル動物の組織、器 官又は細胞に、被験物質として dsRNA又は dsRNA発現ベクターを導入して RNAi を誘導し、 RNAi作用による遺伝子の発現抑制の結果、動物個体、組織、器官若しく は細胞に現れる表現型の変化を解析する方法であれば特に制限されず、上記被験 物質としての dsRNA又は dsRNA発現ベクターとしては、例えば、遺伝子ライブラリ 一から作製した dsRNA又は dsRNA発現ベクターライブラリーを挙げることができる。 通常 30塩基よりも長レ、dsRNAではインターフェロン応答が生じると考えられてレ、るが
、本発明の RNAi作用を利用した標的遺伝子のスクリーニング方法によれば、これよ りも長レ、dsRNAによる RNAiを生じさせることが可能であり、 30〜800塩基の dsRN Aを使用することも可能である。また、短鎖の dsRNAにおいても、インターフェロン応 答が完全に生じないわけではないため、本発明の RNAi作用を利用した標的遺伝子 のスクリーニング方法に短鎖 dsRNAを使用することもできる。 RNAi作用による遺伝 子の発現抑制の結果、動物個体、組織、器官若しくは細胞に現れる表現型に、所望 の変化（例えば、所望の疾患の症状を呈する変化）を与えた dsRNAを dsRNA又は d sRNA発現ベクターライブラリーの中からスクリーニングし、スクリーニングした dsRN Aからの標的遺伝子の同定は、前記遺伝子ライブラリーを対象に、当該 ssRNAをプ ローブとして、ハイブリダィゼーシヨンや PCRやバニング操作等を行う常法により行う ことができる。例えば、アポトーシスを誘導する遺伝子を標的遺伝子とする場合、前記 のダブルノックアウトモデル動物又は該ダブルノックアウトモデル動物の組織、器官又 は細胞に、被験物質としての dsRNA又は dsRNA発現ベクターを導入して RNAiを 誘導し、前記ダブルノックアウトモデル動物にアポトーシスを引き起こす薬剤を投与 するか又は前記ダブルノックアウトモデル動物の組織、器官又は細胞にアポトーシス を引き起こす薬剤を接触させて刺激し、刺激後も生存する細胞を回収して、使用した dsRNA又は dsRNA発現ベクター力 標的遺伝子を同定することで、アポトーシスを 誘導する遺伝子をスクリーニングすることができる。
また、動物個体、組織、器官若しくは細胞でその変化を解析すべき表現型としては 特に制限はされないが、例えば動物個体、組織、器官若しくは細胞の疾患症状、動 物個体、組織、器官若しくは細胞の形態、動物個体、組織、器官若しくは細胞内の 物質量、動物個体、組織、器官若しくは細胞が分泌する物質量、動物個体、組織、 器官若しくは細胞内物質の動態、細胞間接着、動物個体、組織、器官若しくは細胞 の運動、動物個体、組織、器官若しくは細胞の寿命等の生命体行動等を挙げること ができる。本発明の標的遺伝子の機能を同定する方法においては、上記表現型の 変化を解析することにより標的遺伝子の機能を同定することができ、他方、本発明の RNAi作用を利用した標的遺伝子のスクリーニング方法においては、上記表現型の 変化を解析することにより所望の機能を有する標的遺伝子をスクリーニングすることが
できる。また、表現型の変化を解析する手段としては、動物個体、組織、器官若しくは 細胞の形態の変化を解析する場合には、顕微鏡、あるいは肉眼的に検出する方法 を挙げることができ、動物個体、組織、器官若しくは細胞内の物質が mRNAの場合 には、ノーザンハイブリダィゼーシヨン、定量的リバーストランスフエレース PCR、ある レ、は In situ hybridization等を定量的解析手段として挙げることができ、タンパク質の 場合には、標的遺伝子がコードするタンパク質を抗原とする抗体によるウェスタンプロ ッティング法や、標的遺伝子がコードするタンパク質が有する酵素活性を測定する方 法等を定量的解析手段として挙げることができる。このようにして解析した、 RNAiが 誘導された動物個体、組織、器官若しくは細胞にのみ現れる表現型の変化は、標的 遺伝子の発現阻害の結果生じてレ、るものであるので、これを標的遺伝子の機能とし て同定することができる。
[0027] dsRNAを構成する ssRNAの合成は、例えば自動核酸合成装置を用いた標準的 なホスホアミダイト法による固相合成で行うことができる。こうして dsRNAを構成する オリゴ RNAの各々を合成し、二重鎖形成部が相補的な 2本の ssRNAを等モルで混 合することで dsRNAとして用いることができる。 dsRNAは、リポフエクシヨン法等によ り直接細胞内に導入することができる。通常陰電荷を有するホスファチジノレセリン (P S)からなるリボソームを用いることができる力 より安定したリボソームを形成する陽ィ オン性脂質である N— [1— (2, 3—ジォレイルォキシ）プロピル]— N, N, N—トリエ チルアンモニゥムクロライド（DOTMA、商品名：トランスフエクタム、リポフエクトァミン） を用いることもできる。これら陽イオン脂質と陰電荷をもつ dsRNAとの複合体を形成 させると、正に荷電しているリボソーム力 負に荷電している細胞の表面に吸着し、細 胞膜と融合することで dsRNAを細胞内に導入することができる。また、動物個体、組 織若しくは器官への導入に際しては、局部又はその周辺組織に dsRNAとリボソーム の複合体を直接注入することができる。
[0028] 上記 dsRNA発現ベクターは、 dsRNAを直接細胞内に導入した場合より、 dsRNA が細胞内に存在できる期間が長くなり、遺伝子発現抑制の効率が高くなるという利点 を有する。力かる dsRNA発現ベクターとしては、標的遺伝子の発現産物を標的とし た遺伝子の特定配列のセンス鎖 DNA—リンカ アンチセンス鎖 DNAからなる ds
RNA発現カセットをプロモーターの下流に挿入することにより有利に作製することが できる。また、 dsRNA発現用のベクターは市販品を含め公知のものを用いることがで きるが、哺乳動物に導入する場合にはウィルスベクターであることが好ましい。ウィル スベクターとしては、例えば、マウス白血病レトロウイルスベクター（Microbiology and I mmunology, 158， 1-23, 1992)や、アデノ随伴ウィルスベクター（Curr. Top. Microbiol • Immunol , 158, 97-129, 1992)や、アデノウイルスベクター（Science, 252, 431-434, 1991)や、リボソーム等を具体的に挙げることができる力 HIVレンチウィルスベクタ 一は、非分裂細胞にも効率よく長期発現が可能であるという特徴を有する点で好まし レ、。また、これら発現系は、発現を起こさせるだけでなぐ発現を調節する制御配列を 含んでいてもよい。これらの発現ベクターへの dsRNA発現カセットの導入は常法に よって行うことができ、例えばこれら発現ベクター中の適当なプロモーターの下流に d sRNA発現カセットを揷入することにより dsRNA発現ベクターを構築することができる
[0029] また、組織、器官又は細胞内に dsRNA又は dsRNA発現ベクターを導入する方法 としては特に制限されなレ、が、例えば、リン酸カルシウムトランスフエクシヨン、 DEAE —デキストラン媒介トランスフエクシヨン、トランスべクシヨン (transvection)、マイクロイン ジェクシヨン、カチオン性脂質媒介トランスフエクシヨン、エレクト口ポレーシヨン、形質 導入、スクレープローテイング (scrape loading), 3単丸専入 (ballistic introduction),感 染、直接注入等を例示することができる。
[0030] 上記ダブルノックアウトモデル動物由来の組織、器官又は細胞としては、ダブルノッ クアウトモデル動物から採取される組織、器官又は細胞であれば特に制限されるもの ではなぐ組織、器官としては、心臓、肺臓、膝臓、肝臓、脾臓、胃、腸等を挙げること ができる。また、細胞としては、これら組織、器官由来の細胞の他、胎児線維芽細胞、 樹状細胞等を挙げることができ、これら組織、器官又は細胞のうち、 RIG—厂 7_MD A5_7_のものを選び出すことが好ましレ、。
[0031] 以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこ れらの例示に限定されるものではない。
実施例 1
[0032] (MDA5_/ _マウスの作製）
PCRにより、 ES細胞（GSI— I)力 抽出したゲノム DNAから MDA5遺伝子を単離 した。 MDA50RF (DExH boxを含む）をコードする 4· 3— kbの断片をネオマイシ ン耐性遺伝子カセット（neo)で置換することによりターグティングベクターを構築し、 P GKプロモーターにより動かされた単純ペルぺスウィルスチミジンキナーゼ（HSV—T K)を、ネガティブ選択のため、ゲノム断片に揷入した。ターグティングベクターを ES 細胞にトランスフエタトした後、 G418とガンシクロビアの二重耐性コロニーを選択し、 PCRによりスクリーニングし、さらにサザンブロットによって確認した。相同組換体を雌 の C57BL/6マウスにマイクロインジェクションし、 MDA5— 7—マウスを得るために、 ヘテロ接合体の F1子孫をインタークロスした。
[0033] (MyD88_/—マウス、 TRIF_/_マウス、 TLR3 、 TRIF マウス及び RIG— I _マウスの作製）
MyD88_/—マウス、 TLR3—' マウス、 TRIF_/_マウスについては、文献 Science 301， 640-3 (2003)に記載の方法により作製した。また、 IFN α / R~ マウスは、 I nt Immunol 14 1225-31 (2002)に記載の方法により作製した。さらに、 ICRマウスとの 交配により、 RIG 厂 成体マウスを作製した。
[0034] (RIG— I MDA5_/_マウスの作製）
RIG— Iヘテロ接合体（RIG マウスと MDA5ヘテロ接合体（MDA5+/_)マ ウスとを交配すると、その子は RIG— I+/+MDA5+/+, RIG— I+/_MDA5+/+ , RI G— I+/+MDA5+/— RIG— 1+/ MDA5+/—のどれかとなる。この遺伝子型はマウス 尾より抽出したゲノム DNAを用い、 PCR法もしくはサザンブロット法を用いることによ り同定することが出来る。このうち、 RIG— I+/_MDA5+/_の遺伝子型のマウス間同 士で交配させることにより、 RIG-I+ +MDA5+ + , RIG_I+ MDA5+ +, RIG — I+/+MDA5+ ， RIG— MDA5+/—、 RIG— I— ^ MDA5+/+、 RIG— I— 7 — MDA5+/—、 RIG— I+/+MDA5— Z—、 RIG— MDA5— 7—、 RIG 厂 7 MD A5— 7—、のどれかとなる。このうち、 RIG—厂 Z—MDA5—7—マウスを PCR法もしくは サザンブロット法により同定した。
[0035] (細胞、試薬及びウィルス）
RIG— I_/ _MEF及び骨髄由来GMCSF又はFlt3L— DCの作製にっぃては、文 献 Immunity 23, 19-28 (2005)記載のとおり作製した。 Miltenyi Biotech社製の抗 B22 0及び CD 11cマイクロビーズを用いた MACSにより、 Flt3L— DC力ら pDC及び cD Cを前述のとおり単離した。ポリ（I : C)は、 Amersham Biosciences社から購入した。 実施例 2
[0036] (MDA5 マウスの性状）
MDA5_/_マウスを確立し、ウィルス認識に対する MDA5の寄与を分析した（図 la 及び lb参照）。 MDA5の mRNAの発現は、タンパク質の場合と同様に、 MDA5_ —細胞では検出されなかった（図 lc及び ld)。その多くが胚期に死亡する RIG—厂 z —マウスとは対照的に、 MDA5_/_マウスはメンデル比にしたがって誕生して健康に 成長し、 24週齢まで巨視的な発達異常は認められなかった。脾臓及びリンパ節にお ける CD3、 B220、 CDl lcのフローサイトメトリー分析により、野生型と MDA5_ マ ウスとの間には、リンパ球及び DCの組成に変化がないことが明らかになった。
[0037] (ノーザンブロット）
1000U/mlの IFN— βを用いて又は用いずに、 PECを 8時間処理し、 TRIzol試 薬（Invitrogen社製）を用いて全 RNAを抽出した。 RNAを電気泳動にかけ、ナイロン 膜に転写した後、表示の cDNAプローブとハイブリダィズさせた。 MDA5mRNAの 発現を検出するため、 308bpの断片（777— 1084)をプローブとして使用した。同じ 膜を j3ァクチンプローブと再度ハイブリダィズさせた。結果は図 1の cのとおりである。
[0038] (ウェスタンブロット）
1000U/mlの IFN— /3で MEFを 8時間処理した。その後、 1. 0%の Nonidet_P40 、 150mMの NaCl、 20mMの Tris— Cl (pH7. 5)、 ImMの EDTA及びプロテア一 ゼ阻害剤カクテル (Roche社製）を含む溶解緩衝液中で細胞を溶解した。 SDS -PA GEで細胞溶解物を溶解し、 PVDF膜に転写した。力かる膜を MDA5タンパク質の 特異抗体でプロットし、増強した化学発光システム (Perkinermer社製）により視覚化し た。結果は図 1の dのとおりである。
[0039] (フローサイトメトリー）
マウスの静脈内に 200 i gのポリ I : Cを注入し、注入から 24時間後にマウスを処分
した。コラゲナーゼ及び DNaselを用いてマウスカ 脾細胞を調製した。 CD86— FI TC (BD Biosciences Pharmingen社製）、 B220— PE、及び CDl lc— APCで脾細胞 を染色し、 FACS Calibur (BD Bioscience社製）で分析した。結果は図 2の cのとおりで あり、 IL— 6の生成は、 MDA5及び TLR3の両方によって調節され、サイト力インの 誘導に加え、野生型マウスのポリ I : C処理によっても、脾臓 DCにおける CD86などの 共刺激分子の表面発現が増加することがわかった。
実施例 3
[0040] (インビトロ転写 dsRNAの調製）
マウスラミン A/Cの cDNA配列を PCRで増幅し、 pT7ブルー Tベクター（Novagen 社製）にてクローン化し、配列決定した。以下の T7配列でタグしたプライマーを用い た別の PCR反応により、マウスラミン A/Cに対応する 200及び 400bpの DNA配列 の末端に、 T7RNAポリメラーゼプロモーターをタグした；
T7 Lamin.フォワード（配列番号 1)： TAATACGACTCACTATAGGacttgttggc tgcgcaggc
T7 Lamin. 200リバース（配列番号 2)： TAATACGACTCACTATAGGccactcgc ctcagcatctcat
T7 Lamin. 400リバース（配列番号 3)： TAATACGACTCACTATAGGctgttcca cctggtcctcatg
T7 Lamin. 600リバース（配列番号 4)： TAATACGACTCACTATAGGtcctccag gtcacgcagcttt
PCT産物をゲル精製し、 T7 RiboMAX™Express RNAi System (Promega社製）を製造 者の説明書どおりに用いての dsRNAのインビトロ転写及び作製に使用した。
[0041] (RIG—厂 MDA5_/_による RNAi)
上記実施例 1で作製した RIG _ Iと MDA5を共に欠損する、 RIG—厂 /_MDA5_/ —マウスの胎児 (胎生 11. 5日）から採取した胎児線維芽細胞から、その一部よりゲノ ム DNAを抽出し、 PCR法により RIG— 1 MDA5_/ の細胞を選び出した。野生 型、及び RIG— I_/_MDA5_/_の細胞を培養した。ラミン A遺伝子に相同的な 200 、 400、 600bpの長鎖 dsRNAを最終 1マイクログラム/ mlとなるように調整し、リポフエ
クシヨン試薬であるリポフエクタミン 2000 (Invitrogen社）と混合した。その方法は Invitr ogen社の推薦する方法に準じた。その後、この dsNRA/リポフエクタミン 2000混合 物で野生型、及び RIG— I— κ MDA5 細胞を処理した。処理後更に 48時間細 胞培養を継続し、その後、細胞を 1. 0%の Nonidet- P40、 150mMの NaCl、 20mM の Tris_Cl (pH7. 5)、 ImMの EDTA及びプロテアーゼ阻害剤カクテル（Roche社 製）を含む溶解緩衝液中で細胞を溶解した。 SDS— PAGEで細胞溶解物を溶解し、 PVDF膜に転写した。力、かる膜をラミン A/Cタンパク質の特異抗体でプロットし、増 強した化学発光システム（Perkineraier社製）により視覚化した。その結果、野生型細 胞ではラミン A分子の低下を認めなかったのに対し、 RIG— Iと MDA5を共に欠損す る細胞（RIG—厂 MDA5 ）においては、これらすベての長鎖 dsRNAを導入に 対しラミン A分子の発現が低下すること確認した（図 3参照）。
産業上の利用可能性
本発明の RNAi用ダブルノックアウト非ヒトモデル動物や、該ダブルノックアウト非ヒト モデル動物由来の組織、器官又は細胞においては、 dsRNAによるインターフェロン 応答が有意に抑制されるため、哺乳動物において長鎖 dsRNAを使用した RNAiを 誘導させることが可能となり、本発明の RNAi用ダブルノックアウト非ヒトモデル動物や 、該ダブルノックアウト非ヒトモデル動物由来の組織、器官又は細胞は、標的遺伝子 の機能解析や、ウィルスの発現抑制、疾患原因遺伝子の発現抑制などによる遺伝子 治療の開発材料として、また RNA医薬品の開発等のためのスクリーニング方法にも 使用すること力 Sできる。
Claims
[1] RIG— I及び MDA5をコードする遺伝子の一部又は全部を欠損或いは変異させるこ とにより、野生型において発現される RIG— I及び MDA5の機能が共に失われてい ることを特徴とする I型インターフェロン (IFN)産生のシグナル伝達機能が失われて
[2] 少なくとも 30塩基よりも長い長鎖二本鎖 RNAによって誘導される RNA干渉作用を 引き起こすことを特徴とする請求項 1記載の非ヒトモデル動物。
[3] 非ヒトモデル動物が、モデルマウスであることを特徴とする請求項 1又は 2記載の非ヒ トモデル動物。
[4] 請求項 1〜3のいずれか記載の非ヒトモデル動物又は該非ヒトモデル動物由来の組 織、器官又は細胞を RN A干渉に使用する方法。
[5] 請求項 1〜3のいずれか記載の非ヒトモデル動物又は該非ヒトモデル動物由来の組 織、器官若しくは細胞に、二本鎖 RNA又は二本鎖 RNA発現ベクターを導入して R NA干渉を誘導することを特徴とする RNA干渉作用により標的遺伝子の発現を抑制 する方法。
[6] 二本鎖 RNA力 少なくとも 30塩基よりも長い長鎖二本鎖 RNAであることを特徴とす る請求項 5記載の RNA干渉作用により遺伝子の発現を抑制する方法。
[7] 請求項 1〜3のいずれか記載の非ヒトモデル動物又は該非ヒトモデル動物由来の組 織、器官若しくは細胞に、所定の二本鎖 RNA又は二本鎖 RNA発現ベクターを導入 して RNA干渉を誘導し、 RNA干渉作用による遺伝子の発現抑制の結果、動物個体 、組織、器官若しくは細胞に現れる表現型の変化を解析することを特徴とする標的遺 伝子の機能を同定する方法。
[8] 二本鎖 RNA力 少なくとも 30塩基よりも長い長鎖二本鎖 RNAであることを特徴とす る請求項 7記載の標的遺伝子の機能を同定する方法。
[9] 請求項 1〜3のいずれか記載の非ヒトモデル動物又は該非ヒトモデル動物由来の組 織、器官若しくは細胞に、被験物質として長鎖二本鎖 RNA又は該長鎖二本鎖 RNA 発現ベクターを導入して RNA干渉を誘導し、 RNA干渉作用による遺伝子の発現抑 制の結果、動物個体、組織、器官若しくは細胞に現れる表現型の変化を解析するこ
とを特徴とする RNA干渉作用を利用した標的遺伝子のスクリーニング方法。
長鎖二本鎖 RNAが、少なくとも 30塩基よりも長い長鎖二本鎖 RNAであることを特徴 とする請求項 9記載の RNA干渉を利用した標的遺伝子のスクリーニング方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2006-061200 | 2006-03-07 | ||
| JP2006061200A JP2007236247A (ja) | 2006-03-07 | 2006-03-07 | Ｒｎａ干渉用ダブルノックアウト非ヒトモデル動物 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| WO2007102516A1 true WO2007102516A1 (ja) | 2007-09-13 |
Family
ID=38474943
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PCT/JP2007/054354 WO2007102516A1 (ja) | 2006-03-07 | 2007-03-06 | Ｒｎａ干渉用ダブルノックアウト非ヒトモデル動物 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2007236247A (ja) |
| WO (1) | WO2007102516A1 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114410685A (zh) * | 2021-10-20 | 2022-04-29 | 浙江大学 | Stk11基因敲除细胞系及其构建方法和用途 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2003144141A (ja) * | 2001-11-14 | 2003-05-20 | Gencom Co | ＲＮＡｉ効果が増強したＥＳ細胞 |
-
2006
- 2006-03-07 JP JP2006061200A patent/JP2007236247A/ja active Pending
-
2007
- 2007-03-06 WO PCT/JP2007/054354 patent/WO2007102516A1/ja active Application Filing
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2003144141A (ja) * | 2001-11-14 | 2003-05-20 | Gencom Co | ＲＮＡｉ効果が増強したＥＳ細胞 |
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| ANDREJEVA J. ET AL.: "The V proteins of paramyxoviruses bind te IFN-inducible RNA helicase, mda-5, and inhibit its activation of the IFN-beta promoter", PROC. NATL. ACAD. SCI. U.S.A., vol. 101, no. 49, 7 December 2004 (2004-12-07), pages 17264 - 17269, XP003017395 * |
| KATO H. ET AL.: "Cell type-specific involvement of RIG-I in antiviral response", IMMUNITY, vol. 23, no. 1, July 2005 (2005-07-01), pages 19 - 28, XP003017393 * |
| KATO H. ET AL.: "Differential roles of MDA5 and RIG-I helicases in the recognition of RNA viruses", NATURE, vol. 441, no. 7089, 4 May 2006 (2006-05-04), pages 101 - 105, XP003017391 * |
| KOVACSOVICS M. ET AL.: "Overexpression of Helicard, a CARD-containing helicase cleaved during apoptosis, accelerates DNA degradation", CURR. BIOL., vol. 12, no. 10, 14 May 2002 (2002-05-14), pages 838 - 843, XP003017394 * |
| YONEYAMA M. ET AL.: "The RNA helicase RIG-I has an essential function in double-stranded RNA-induced innate antiviral responses", NAT. IMMUNOL., vol. 5, no. 7, July 2004 (2004-07-01), pages 730 - 737, XP003017392 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114410685A (zh) * | 2021-10-20 | 2022-04-29 | 浙江大学 | Stk11基因敲除细胞系及其构建方法和用途 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2007236247A (ja) | 2007-09-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US8894996B2 (en) | Immunoadjuvant composition and use thereof | |
| US20070033663A1 (en) | ES cells having enhanced RNAi effect | |
| JP2022113700A (ja) | ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓゲノム編集に基づく、Ｆｅｌ ｄ１ノックアウト並びに関連組成物及び方法 | |
| US20040010130A1 (en) | Recombinant gene containing inverted repeat sequence and utilization thereof | |
| US20160003807A1 (en) | Tlr8 transgenic animals | |
| EP1459727B1 (en) | Nonhuman model animal unresponsive to immunopotentiating synthetic compound | |
| WO2007102516A1 (ja) | Ｒｎａ干渉用ダブルノックアウト非ヒトモデル動物 | |
| US20050257280A1 (en) | Nonhuman model animal nonresponsive to endotoxin and lipoprotein or lipopeptide | |
| CA2471432C (en) | Nonhuman model animal lacking the ability to control lymphocyte migration | |
| JP4236549B2 (ja) | エンドトキシン不応答性モデル動物 | |
| WO2024012578A1 (zh) | 一种tlr7和/或tlr8基因人源化修饰的非人动物 | |
| WO2024002259A1 (zh) | 一种osm、osmr、il31ra和/或il31基因修饰的非人动物 | |
| JP4100595B2 (ja) | マイコプラズマ由来リポタンパク／リポペプチド不応答性モデル非ヒト動物 | |
| JP4493336B6 (ja) | 免疫賦活化作用を有する合成化合物不応答性モデル非ヒト動物 | |
| US6677501B2 (en) | P2X7 receptor-deficient mice and uses thereof | |
| JP2012019768A (ja) | Ｊｍｊｄ３遺伝子改変非ヒト哺乳動物、Ｊｍｊｄ３遺伝子改変骨髄キメラ非ヒト哺乳動物、及びその利用 | |
| WO2007116800A1 (ja) | Ｉ型インターフェロン不応答性非ヒトモデル動物 | |
| JP4236692B2 (ja) | マイコプラズマ由来リポタンパク／リポペプチド不応答性モデル非ヒト動物 | |
| EP1989939B1 (en) | Method using an oasis gene-deficient mouse | |
| JP2009207467A (ja) | Ｔｏｌｌ様受容体３遺伝子導入マウスから樹立した細胞株並びにＴｏｌｌ様受容体３のアゴニスト又はアンタゴニストのスクリーニング方法。 | |
| JP2009207465A (ja) | Ｔｏｌｌ様受容体３遺伝子導入マウス | |
| JP2004049083A (ja) | パピローマウイルスベクターを用いたＲＮＡｉ表現型を有する非ヒト哺乳動物の作製方法 | |
| JP2006500063A (ja) | 自己免疫疾患を治療する方法および自己免疫疾患の治療化合物をスクリーニングする方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| 121 | Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application | ||
| NENP | Non-entry into the national phase |
Ref country code: DE |
|
| 122 | Ep: pct application non-entry in european phase |
Ref document number: 07737901 Country of ref document: EP Kind code of ref document: A1 |