JP4236549B2 - エンドトキシン不応答性モデル動物 - Google Patents
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Description
本発明者らは、既に、データベース検索分析を用いることにより、3番目のTIRドメインを含むアダプターである、TRIFを同定している(J. Immunol. 169, 6668-6672, 2002)(図1a)。この分析の際に、本発明者らは、別のTIRドメインを含む分子を同定した。この分子のTIRドメインは、MyD88又はTIRAPのTIRドメインと比較して、TRIFのTIRドメインに対してより高い相同性を示した。この分子の遺伝子は、235aaをコードする708bpの翻訳領域を有しており、TRIF関連アダプター分子(TRIF-related adaptor molecule)を意味するTRAMとして、登録及び命名された(アクセッションナンバーAY232653、別名TIRP(J. Biol. Chem. 278, 24526-24532, 2003))。293細胞におけるTRAMの異所的発現は、MyD88及びTRIFを介したそれぞれの活性化と比較すると低水準ではあったが、NF−κB依存的プロモーター及びIFN−βプロモーターを活性化した(図1b、図1c)。
本発明者らは、TRAMの生理学的役割を解明するために、ジーンターゲティングによりTRAM欠損マウスを作製した。マウスのTram遺伝子は、1つのエキソンからなる。本発明者らは、ターゲティングベクターを構築し、エキソン全体をネオマイシン耐性遺伝子カセットに置換した(図1d)。正確なターゲティングを行なった2つのESクローンをC57BL/6の胚盤胞中にマイクロインジェクションし、キメラマウスを作製した。キメラマウスの仔とC57BL/6雌マウスとを交雑させ、サザンブロット分析により変異対立遺伝子の伝達をモニターした(図1e)。次に、ヘテロ接合体マウスを交配させて、Tram遺伝子の無発現変異を保有する子孫を作製した。TRAM欠損マウスは、予想されたメンデル比で生まれ、発達上の異常は認められなかった。Tram遺伝子の欠損を確認するために、野生型肺繊維芽細胞及びTRAM欠損肺繊維芽細胞から得た全RNAに対し、ノーザンブロット分析を行なった。TRAM欠損マウスにおいて、TRAMの転写物は認められなかった。さらに、脾細胞について免疫沈降分析を行なった結果、Tram遺伝子の欠損により、TRAMタンパク質が発現しないことが確認された(図1f)。
これまでのインビトロ研究により、TRAMがIL−1Rを介するMyD88依存的経路に関与していることが明らかになったため(J. Biol. Chem. 278, 24526-24532, 2003)、まず、TRAM欠損細胞においてIL−1Rシグナル伝達に障害があるかどうかについて調べた。IL−1βに応答した、野生型マウス及びTRAM欠損マウスから得たマウス胚繊維芽細胞(MEF)によるIL−6の産生について、ELISAで測定した(図2a)。TRAM欠損MEFにおいて、IL−1βを誘発したIL−6の産生は正常であった。次に、本発明者らは、IL−1βに応答した、NF−κB及びJNK1の活性化について分析した(図2b、図2c)。IL−1βで刺激したところ、野生型MEF及びTRAM欠損MEFの両方において、NF−κB及びJNK1の活性は同程度を示し、TRAMがIL−1Rを介したシグナル伝達経路には関与しないことが証明された。
次に、PGN、LPS、R−848、CpG DNA等の様々なTLRリガンドに応答した、腹腔マクロファージによるTNF−α又はIL−6等の炎症誘発性サイトカインの産生について分析した。PGN、R−848又はCpG DNAで刺激したところ、野生型マクロファージ及びTRAM欠損マクロファージの両方で、同量のIL−6又はTNF−αを産生した。しかしながら、TRAM欠損細胞においては、LPS刺激に応答して、炎症性サイトカインの産生は著しく減少した(図3a)。野生型細胞は、LPS刺激に応答して、投与依存的にTNF−α、IL−6及びIL−12p40を産生した(図3b)。これに対して、TRAM欠損細胞におけるLPS誘発によるTNF−α、IL−6及びIL−12p40の産生は、著しく損なわれていた。したがって、TRAM欠損マウスは、LPS誘発によるサイトカイン産生は、不完全な応答を示すことがわかった。
TLR3リガンド及びTLR4が認識するリガンドは、MyD88非依存的形式において、IFN−βの産生を誘発し、その後IFN誘発遺伝子を発現することが明らかになっている(Immunity 11, 443-451, 1999、J. Immunol. 167, 5887-5894, 2001、J. Immunol. 166, 5688-5694, 2001)。TRAM欠損マウスは、TLR4を介したMyD88依存的な生物応答を障害することから、次にMyD88非依存的応答も障害するかどうかについて調べた。ノーザンブロット分析により、野生型マウス及びTRAM欠損マウスの両方におけるIFN−β誘発遺伝子及びIFN誘発遺伝子の発現について分析した。野生型骨髄由来DCにおいて、LPSは、ISG54、IP−10、RANTES、MCP−1等のIFN−β誘発遺伝子及びIFN誘発遺伝子の発現を刺激した。しかしながら、LPS誘導によるこれら遺伝子の発現は、TRAM欠損細胞においては著しく障害されていた(図4a)。TLR3の応答の場合は、ポリ(I:C)の刺激に続いて、野生型腹腔マクロファージ及びTRAM欠損腹腔マクロファージの両方で、これら遺伝子の比較できる程度の誘発が認められた(図4b)。これらのデータは、TRAMの欠損が、TLR4を介したMyD88依存的応答だけではなく、MyD88非依存的応答に対しても影響を及ぼすことを示した。
IP−10 mRNAのLPS誘発は、Stat1のシグナル伝達に依存している。このことは、Stat1欠損マウスにおいて、野生型細胞と比較した場合に、LPSで刺激したマクロファージではIP−10 mRNAの発現が著しく低下したことにより証明された(J. Immunol. 163, 1537-1544, 1999、J. Leukoc. Biol. 69, 598-604, 2001、Nat. Immunol. 3, 392-398, 2002)。野生型マクロファージでは、Stat1の701Yは、LPSを2時間刺激した後でリン酸化した。しかしながら、TRAM欠損マクロファージにおいては、Stat1のチロシンリン酸化が検出されなかった(図5a)。対照的に、ポリ(I:C)を刺激したところ、野生型細胞及びTRAM欠損細胞の両方において、同程度のStat1リン酸化を示した(図5b)。
ELAM−1プロモーター由来のルシフェラーゼレポータープラスミド(NF−κBルシフェラーゼレポーター)は、Dr. D. T. Golenbockより提供された。マウスIFN−βプロモータールシフェラーゼレポーターは、PCRにより、以前の報告(Immunity 7, 837-847, 1997)の通りに作製した。FlagがタグされたヒトTRAM(Flag-tagged human TRAM)をpEF−BOSベクターにクローニングした。TRIF及びMyD88の発現ベクターは、文献(J. Immunol. 169, 6668-6672, 2002)記載のものを用いた。
293細胞に、レポータープラスミド及び示された発現ベクターを一時的にコ・トランスフェクションした。全細胞溶解液のルシフェラーゼ活性は、デュアルルシフェラーゼレポーターアッセイシステム(Dual-luciferase reporter assay system)(Promega社製)を用いて、文献(J. Immunol. 169, 6668-6672, 2002)記載の通り測定した。内部標準として、レニラルシフェラーゼ(Rennilla-luciferase)レポーター遺伝子(50ng)を使用した。
(ES)細胞(E14.1)からTaKaRa LA TaqTM(TaKaRa社製)を用いてPCRにより抽出したゲノムDNAから、Tram遺伝子を単離した。ターゲティングベクターは、TRAM ORF全体をコードする1.0kb断片をネオマイシン耐性遺伝子カセット(neo)で置換し、負の選択のためにPGKプロモーターにより作動する単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼをゲノム断片に挿入することにより構築した(図1d)。かかるターゲティングベクターをES細胞中にトランスフェクションした後、G418及びガンシクロビアに抵抗性を示す二重耐性コロニーを選択し、PCRとサザンブロットでスクリーニングを行なった。相同的組換え体をC57BL/6雌マウスにマイクロインジェクションし、ヘテロ接合体のF1子孫をインタークロスして、TRAM欠損マウスを得た。こうしたインタークロスにより生まれたTRAM欠損マウス及びその野生型の同腹子を実験に使用した。
R−848は、株式会社ジャパンエナジー、医薬バイオ研究所(Pharmaceuticals and Biotechnology Laboratory, Japan Energy Corporation)より提供された。CpGオリゴデオキシヌクレオチドを文献(Nat. Immunol. 3, 196-200, 2002)記載の通りに調製した。フェノール−クロロホルム−石油エーテル抽出手順により調製したサルモネラ・ミネソタ(Salmonella minnesota)Re−595のLPS、S. aureus由来のPGN、ならびにポリ(I:C)を、Sigma社、Fluka社及びAmersham社よりそれぞれ購入した。抗ホスホJNK抗体及び抗ホスホStat1抗体は、Cell Signaling Technology社より購入した。抗JNK1抗体、抗Stat1抗体及び抗アクチン抗体は、Santa Cruz社製である。マウスTRAMのアミノ酸219〜232に対して、ポリクローナル抗TRAM抗体を作製した。ポリクローナル抗IRF−3抗体及び抗IRAK−1抗体は、文献(Science 301, 640-643, 2003)記載の通りであった。抗IgM抗体分析(Anti-IgM antibody analysis)は、Jackson ImmunoResearch Laboratoryより購入した。FITC標識ストレプトアビジン、PE共役抗B220抗体、ビオチン共役抗CD69抗体、抗CD86抗体及び抗I−Ab抗体は、Pharmingen社製である。
チオグリコール酸を誘発させた腹腔マクロファージを、96ウエルプレートで、記載の濃度のPGN、LPS、R−848又はCpG DNAで培養した(ウエル毎に5×104細胞)。培養上澄液中のTNA−α、IL−6及びIL−12p40の濃度を、製造者の指示に従って、ELISAで測定した(TNF−α及びIL−12p40はGenzyme社製、IL−6はR&D社製)。
10ng ml-1のGM−CSFを用いて、野生型マウス又はTRAM欠損マウスの骨髄細胞を6日間培養した。未成熟のDCを回収し、分析した。
マウスの肺を切除し、PBS内で洗浄し、小さく切断し、撹拌し、37℃で30分間酵素消化した。消化用緩衝液(10ml/肺)は、400nMのEDTAを含む0.25%のトリプシン溶液からなる。得られた細胞懸濁液に、氷温の完全DMEM培地を添加した。遠心分離(1100rpm、5分間)した後、ペレットを完全培地で再び懸濁し、その後皿で培養した。肺繊維芽細胞は、切除から10日後、各実験に使用した。
腹腔マクロファージ及び肺繊維芽細胞(1×106)を、100ng/mlのLPS及び50μg/mlのポリ(I:C)で、それぞれ記載の時間刺激した。細胞から核抽出物を精製し、NF−κB DNA結合部位に特異的なプローブを用いてインキュベーションを行ない、電気泳動にかけ、文献(Immunity 9, 1, 143-150, 1998)記載の通りにオートラジオグラフィーで視覚化した。
脾細胞(1×105)を、96ウエルプレートで、記載の濃度のLPS、R−848又はCpG DNAを用いて、24時間培養した。最後の12時間は、1マイクロキュリーの[3H]チミジンのパルス標識を行ない、その後、[3H]の摂取量をβシンチレーションカウンター(Packard社製)で測定した。
腹腔マクロファージ(2×106)、胚繊維芽細胞(1×106)及び肺繊維芽細胞(1×106)を、それぞれ100ng/mlのLPS、10ng/mlのIL−1β及び50μg/mlのポリ(I:C)で、記載の時間刺激した。その後、1.0%のNonidet-P40、150mMのNaCl、20mMのトリス−Cl(pH7.5)、1mMのEDTA及びプロテアーゼ阻害剤カクテル(Roche Diagnostics社製)を含む溶解緩衝液中に、かかる細胞を溶解した。細胞溶解液をSDS−PAGEで溶解し、PVDF膜(Bio-Rad社製)に移した。かかる膜を特定の抗体でブロットし、強化した化学発光システム(enhanced chemiluminescence system)(Perkin Elmer Life Sciences社製)で視覚化した。細胞溶解液のIRAK−1活性を、文献(Immunity 13, 539, 2000)記載の通りにインビトロキナーゼアッセイにより測定した。
50μg/mlのポリ(I:C)、10μg/mlのLPS又は10μg/mlの抗IgM抗体を用いて、200万個の脾細胞を培養した。培養から36時間後、細胞を収集し、PE共役抗B220抗体及びビオチン共役抗CD69、CD86又はI−Ab抗体で染色し、その後、ストレプトアビジン−FITCで染色した。染色した細胞を、セルクエストのソフトウェア(Cell Quest software)(Beckton Dickinson社製)により、FACS Caliburで分析した。
50μg/mlのポリ(I:C)及び1μg/mlのLPSを用いて、肺繊維芽細胞(1×106)及び腹腔マクロファージ(5×106)をそれぞれ記載の時間刺激した後、溶解した。未変性PAGEサンプル緩衝液(62.5mMのトリス−Cl、pH6.8、15%のグリセロール及び1%のデオキシコール酸)中の細胞溶解液を、未変性PAGE上で分離させ、その後、文献(Immunity 13, 539, 2000)記載の通りに抗IRF−3抗体で免疫ブロットを行なった。
Claims (1)
- 染色体上のTRIF関連アダプター分子(TRIF-related adaptor molecule;TRAM)遺伝子が欠損し、野生型において発現されるTRAMを発現する機能が失われており、TLR4が認識するリガンドに対する応答性が特異的に障害されているマウスを、TLR4を介したMyD88非依存的なエンドトキシン不応答性のモデル動物として使用する方法。
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