JP3740094B2

JP3740094B2 - マイコバクテリア由来リポタンパク／リポペプチド不応答性モデル動物

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Publication number: JP3740094B2
Application number: JP2002173254A
Authority: JP
Inventors: 静男審良
Original assignee: Japan Science and Technology Agency; National Institute of Japan Science and Technology Agency
Current assignee: Japan Science and Technology Agency; National Institute of Japan Science and Technology Agency
Priority date: 2002-06-13
Filing date: 2002-06-13
Publication date: 2006-01-25
Anticipated expiration: 2022-06-13
Also published as: WO2003105578A1; JP2004016051A; US20060059579A1; US7329795B2; CA2488789C; CA2488789A1

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、マイコバクテリア由来リポタンパク／リポペプチドを特異的に認識するＴＬＲ１等のタンパク質をコードする遺伝子の機能が染色体上で欠損した、マイコバクテリア由来リポタンパク／リポペプチド不応答性モデル非ヒト動物や、これらモデル非ヒト動物を用いたマイコバクテリア由来リポタンパク／リポペプチドに対する応答の促進物質又は抑制物質のスクリーニング方法等に関する。
【０００２】
【従来の技術】
トール（Ｔｏｌｌ）遺伝子は、ショウジョウバエの胚発生中の背腹軸の決定（Cell 52, 269-279, 1988、Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 12, 393-416, 1996）、また成体における侵入病原体を検出する自然免疫に関与しており（Nature 406, 782, 2000; Nat. Immunol. 2, 675, 2001; Annu. Rev. Immunol. 20, 197, 2002）、かかるＴｏｌｌは、細胞外領域にロイシンリッチリピート（ＬＲＲ）を有するＩ型膜貫通受容体であり、この細胞質内領域は、哺乳類インターロイキン−１受容体（ＩＬ−１Ｒ）の細胞質内領域と相同性が高いことが明らかとなっている（Nature 351, 355-356, 1991、Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 12, 393-416, 1996、J. Leukoc. Biol. 63, 650-657, 1998）。
【０００３】
近年、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ：Tool Like Receptor）と呼ばれるＴｏｌｌの哺乳類のホモログが同定され（Nature 388, 394-397, 1997、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 588-593, 1998、Blood 91, 4020-4027, 1998、Gene 231, 59-65, 1999）、ヒトＴＬＲファミリーについては、ＴＬＲ２やＴＬＲ４などこれまでに１０種が報告されている。ＴＬＲファミリーの役割は、細菌の共通構造を認識するパターン認識受容体（ＰＲＲ：pattern recognition receptor）として、別々の病原体会合分子パターン（ＰＡＭＰｓ：pathogen-associated molecular patterns）を識別し、転写因子であるＮＦ−κＢの核内への移行を導く同様の細胞内シグナル伝達経路の活性化を引き起こす。かかるシグナル伝達経路は、最終的には炎症性サイトカインを産生させ、宿主防衛反応を誘起し、さらに獲得免疫に対しても宿主防衛反応を誘起させる。また、近年多くのＴＬＲリガンドが報告されている。
【０００４】
ＴＬＲ２は、ペプチドグリカン（ＰＧＮ）、細菌由来トリアシル化リポタンパク質、マイコプラズマ由来ジアシル化リポタンパク質、及びTrypanosoma cruzi（クルーズトリパノソーマ）のＧＰＩアンカーなどのさまざまな細菌成分を認識する（Science 285, 732, 1999; Science 285, 736, 1999; J.Biol. Chem. 274, 33419, 1999; Immunity 11, 443, 1999; J. Immunol. 164, 554, 2000; Nature 401, 811, 1999; J. Immunol. 167, 416, 2001）。ＴＬＲ４は、グラム陰性菌の細胞壁に特異的な糖脂質であるＬＰＳに応答する際必須である。ＴＬＲ５は、細菌の鞭毛のタンパク質成分であるフラジェリンを認識するとされている。さらに、病原体特異的なヌクレオチド、及びヌクレオチド類似体もＴＬＲが認識する。つまり、ＴＬＲ３、ＴＬＲ７及びＴＬＲ９は、ウィルス二重鎖ＲＮＡ、イミダゾキノリン、非メチル化ＣｐＧモチーフを有する細菌ＤＮＡの認識に、それぞれ関与している（Nature 406, 782, 2000; Nat. Immunol. 2, 675, 2001; Annu. Rev. Immunol. 20, 197, 2002; Nat. Immunol. 3, 196, 2002）。
【０００５】
ＴＬＲはヘテロ二量体を形成するので、リガンドの特異性をさらに明確にすることができる。特に、ＴＬＲ６は、ＴＬＲ２と相互作用してマイコバクテリア由来リポタンパク質を識別する独特の性質を有している（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 13766, 2000; Int. Immunol. 13, 933, 2001）。ＴＬＲ６欠損（ＴＬＲ６^-/-）マウスは、マクロファージ活性化リポペプチド２−ｋＤ（ＭＡＬＰ−２）と呼ばれるジアシル化マイコプラズマ由来リポペプチドに応答し、炎症性サイトカインを産生しない。その一方、トリアシル化細菌由来リポペプチドに対しては、正常な応答を示す。ＴＬＲ２^-/-マクロファージは、前記リポペプチドのどちらにも応答しない（Int. Immunol. 13, 933, 2001）。つまり、ＴＬＲ６は、細菌病原体に由来するリポペプチドのアシル化における僅かな相違を区別していることがわかる。また、ＴＬＲ２が別のＴＬＲとともにヘテロ二量体を形成し、かかるトリアシル化リポペプチド中の他のＰＡＭＰｓを識別するという可能性が生じる。
【０００６】
他方、リポタンパク質は、マイコバクテリア、グラム陰性菌、及びマイコプラズマ種を含む多様な病原体によって産生される（Microbiol. Rev. 60, 316, 1996）。Ｎ末端アシル化リポペプチド領域は、細菌由来及びマイコプラズマ由来リポタンパク質の免疫活性化作用に関与している。細菌由来のリポタンパク質とマイコプラズマ由来のリポタンパク質とでは、Ｎ末端システインのアシル化の程度が異なっている。細菌由来のリポタンパク質ではトリアシル化されているのに対し、マイコプラズマ由来のものではジアシル化されている（Trends Microbiol. 7, 493, 1999）。Ｎ−アシル−Ｓ−ジアシルシステイン及びＳ−ジアシルシステインがパルミトイル化してなる合成リポタンパク質類似体は、それぞれ細菌由来及びマイコプラズマ由来のリポタンパク質に似た免疫活性化作用を示す（Immunobiology 177, 158, 1988; J. Exp. Med. 185, 1951, 1997）。
【０００７】
ＴＬＲ１はＴＬＲ６と類似性が高い（Gene 231, 59, 1999）。ＴＬＲ１の過剰発現により、Staphylococcus epidermidis（表皮ブドウ球菌）から分泌されるフェノール可溶性タンパク質であるモジュリンに対し、ＴＬＲ２を介する応答が阻害されると報告されている（J. Immunol. 166, 15, 2001）。一方、Neisseria meningitides（髄膜炎菌）から放出される可溶性因子の識別にＴＬＲ１が関与しているとの報告もある（J. Immunol. 165, 7125, 2000）。しかし、ＴＬＲ１のインビボでのリガンドはまだ解明されていない。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
インビボにおける菌体成分に対する応答は、細胞表面上の各ＴＬＲの発現レベルの差異により変化することが予測されるものの、未だインビボにおける菌体成分刺激によるシグナル伝達に対するＴＬＲファミリーの各メンバーの関わりは明らかにされていない。また、生体膜などに存在する水不溶性のリポタンパク／リポペプチドが免疫細胞を活性化することは知られていた。しかし、マイコバクテリア由来リポタンパク／リポペプチドを特異的に認識するタンパク質は知られていなかった。本発明の課題は、インビボにおけるマイコバクテリア由来リポタンパク／リポペプチド刺激によるシグナル伝達に対するＴＬＲファミリー各メンバーの関わり、特にＴＬＲ１のインビボにおける役割を明らかにする上で有用な、マイコバクテリア由来リポタンパク／リポペプチドを特異的に認識するタンパク質をコードする遺伝子の機能が染色体上で欠損した、マイコバクテリア由来リポタンパク／リポペプチド不応答性モデル非ヒト動物、特にＴＬＲ１遺伝子の機能が染色体上で欠損した非ヒト動物や、これらを用いたマイコバクテリア由来リポタンパク／リポペプチドに対する応答の促進物質又は抑制物質のスクリーニング方法を提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、既に同定されているＴＬＲ１の遺伝子を、マウス遺伝子ライブラリーから単離し、このＴＬＲ１遺伝子の細胞内領域及び膜貫通領域を含む遺伝子部位を、ネオマイシン耐性遺伝子に置き換え、またそれぞれの３’末端側にチミジンキナーゼをコードする遺伝子であるＨＳＶ−ｔｋ遺伝子を導入させて、Ｇ４１８とガンシクロビアに対して２重に抵抗力のあるＥＳ細胞クローンをスクリーニングし、このＥＳ細胞クローンをＣ５７ＢＬ／６のマウスの胚盤胞(blastocysts)の中に注入し、その生殖系列をとおして、メンデルの法則に従い出生してくるＴＬＲ１遺伝子機能が染色体上で欠損したＴＬＲ１ノックアウトマウスを作製し、このＴＬＲ１ノックアウトマウスと野生型マウスとＴＬＲ２ノックアウトマウスとを比較・解析することにより、ＴＬＲ１がマイコバクテリア由来リポタンパク／リポペプチドを特異的に認識する受容体タンパク質であることを確認し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち本発明は、（１）マイコバクテリア由来リポタンパク／リポペプチドを特異的に認識するタンパク質ＴＬＲ１をコードする遺伝子の機能が染色体上で欠損した非ヒト動物を、マイコバクテリア由来リポタンパク／リポペプチド不応答性モデル動物として使用する方法に関する。
【００１１】
また本発明は、（２）非ヒト動物が齧歯目動物であることを特徴とする上記（１）記載の方法に関する。
【００１２】
さらに本発明は、（３）齧歯目動物がマウスであることを特徴とする上記（２）記載の方法に関する。
【００１３】
【発明の実施の形態】
本発明のマイコバクテリア由来リポタンパク／リポペプチド不応答性モデル非ヒト動物としては、マイコバクテリア由来リポタンパク／リポペプチドを特異的に認識するタンパク質をコードする遺伝子の機能が染色体上で欠損したヒト以外のモデル動物であれば特に制限されるものではないが、マイコバクテリア由来リポタンパク／リポペプチドに加えて、Ｎ−パルミトイル−Ｓ−ジラウリルグリセリル等の合成トリアシル化リポペプチドを特異的に認識するタンパク質をコードする遺伝子の機能が染色体上で欠損したヒト以外のモデル動物であることが好ましく、例えば、マイコバクテリア由来リポタンパク／リポペプチドを特異的に認識するタンパク質をコードする非ヒト動物の内在性遺伝子の全部又は一部を、破壊・欠損・置換等の遺伝子変異により、その機能を不活性化させることにより、マイコバクテリア由来リポタンパク／リポペプチドを特異的に認識するタンパク質をコードする遺伝子の機能を染色体上で欠損させることができる。また、上記マイコバクテリア由来リポタンパク／リポペプチドを特異的に認識するタンパク質としては、マイコバクテリア由来リポタンパク／リポペプチドを特異的に認識することができるタンパク質であれば特に制限されるものではなく、例えば、ＴＬＲ１やＴＬＲ１活性を有するその一部を具体的に挙げることができる。かかるマイコバクテリア由来リポタンパク／リポペプチドを特異的に認識するタンパク質は、そのＤＮＡ配列情報等に基づき公知の方法で調製することができる。また、本発明におけるマイコバクテリア由来リポタンパク／リポペプチドには、マイコバクテリアに由来するリポタンパク／リポペプチドの他、マイコバクテリア菌体自体又はその処理物、ＭＡＬＰ−２等の合成マイコバクテリア由来リポペプチドなども便宜上含まれる。
【００１４】
本発明のマイコバクテリア由来リポタンパク／リポペプチド不応答性モデル非ヒト動物は、野生型非ヒト動物に比べて、マイコバクテリア由来リポタンパク／リポペプチドによる刺激に対する生体又は生体を構成する細胞、組織若しくは器官の反応性が特異的に低下しているか、あるいは失われている非ヒト動物、すなわち、スピロヘーターやグラム陰性菌等マイコバクテリア以外のリポタンパク／リポペプチドによる刺激に対しては正常に生体又は生体を構成する細胞、組織若しくは器官において反応性を有するが、マイコバクテリア由来リポタンパク／リポペプチドにおいては、生体又は生体を構成する細胞、組織若しくは器官の反応性が低下しているか、あるいは失われているマウス、ラット、ウサギ等のヒト以外の動物をいい、具体的には、ＴＬＲ１ノックアウトマウス等のＴＬＲ１遺伝子の機能が染色体上で欠損した非ヒト動物を具体的に挙げることができる。また、上記マイコバクテリア由来リポタンパク／リポペプチドによる刺激としては、マイコバクテリア由来リポタンパク／リポペプチドを生体に投与するインビボでの刺激や、生体から分離された細胞にマイコバクテリア由来リポタンパク／リポペプチドを接触させるインビトロでの刺激等を挙げることができる。
【００１５】
次に、本発明のマイコバクテリア由来リポタンパク／リポペプチド不応答性モデル非ヒト動物の作製方法を、ＴＬＲ１ノックアウトマウスを例にとって説明する。マウス遺伝子ライブラリーからＰＣＲ等の方法により得られた遺伝子断片を用いて、ＴＬＲ１をコードする遺伝子をスクリーニングし、スクリーニングされたＴＬＲ１をコードする遺伝子を、ウイルスベクター等を用いてサブクローンし、ＤＮＡシーケンシングにより特定する。このＴＬＲ１をコードする遺伝子の全部又は一部をｐＭＣ１ネオ遺伝子カセット等に置換し、３’末端側にジフテリアトキシンＡフラグメント（ＤＴ−Ａ）遺伝子や単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ）遺伝子等の遺伝子を導入することによって、ターゲットベクターを作製する。
【００１６】
この作製されたターゲティングベクターを線状化し、エレクトロポレーション（電気穿孔）法等によってＥＳ細胞に導入し、相同的組換えを行い、その相同的組換え体の中から、Ｇ４１８やガンシクロビア（ＧＡＮＣ）等の抗生物質により相同的組換えを起こしたＥＳ細胞を選択する。また、この選択されたＥＳ細胞が目的とする組換え体かどうかをサザンブロット法等により確認することが好ましい。その確認されたＥＳ細胞のクローンをマウスの胚盤胞中にマイクロインジェクションし、かかる胚盤胞を仮親のマウスに戻し、キメラマウスを作製する。このキメラマウスを野生型マウスと交雑させると、ヘテロ接合体マウス（Ｆ１マウス：＋／−）を得ることができ、また、このヘテロ接合体マウスを交雑させることによって、本発明のＴＬＲ１ノックアウトマウスを作製することができる。また、ＴＬＲ１ノックアウトマウスにおいて、ＴＬＲ１が生起しているかどうかを確認する方法としては、例えば、上記の方法により得られたマウスからＲＮＡを単離してノーザンブロット法等により調べたり、またこのマウスにおけるＴＬＲ１の発現をウエスタンブロット法等により調べる方法がある。
【００１７】
また、作出されたＴＬＲ１ノックアウトマウスがマイコバクテリア由来リポタンパク／リポペプチドに対して不応答性であることは、例えば、マイコバクテリア由来リポタンパク／リポペプチドをＴＬＲ１ノックアウトマウスのマクロファージ、単核細胞、樹状細胞などの免疫細胞にインビトロ又はインビボで接触せしめ、かかる細胞におけるＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−１２、ＩＦＮ−γ等の産生量や、脾臓Ｂ細胞の増殖応答や、脾臓Ｂ細胞表面でのＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＭＨＣクラスII等の抗原の発現量や、ＮＦ−κＢ、ＪＮＫ、ＩＲＡＫ等のＴＬＲ１のシグナル伝達経路における分子の活性化を測定することにより確認することができる。そして、本発明のＴＬＲ１ノックアウトマウスは、マイコバクテリア由来リポタンパク／リポペプチドの作用機序の解明や、マイコバクテリア感染に対する治療戦略を考案する上で有用なモデルとすることができる。
【００１８】
ところで、メンデルの法則に従い出生してくるホモ接合体非ヒト動物には、マイコバクテリア由来リポタンパク／リポペプチドを特異的に認識するタンパク質欠損型とその同腹の野生型とが含まれ、これらホモ接合体非ヒト動物における欠損型とその同腹の野生型を同時に用いることによって個体レベルで正確な比較実験をすることができることから、野生型の非ヒト動物、好ましくはマイコバクテリア由来リポタンパク／リポペプチドを特異的に認識するタンパク質をコードする遺伝子の機能が染色体上で欠損した非ヒト動物と同種の野生型非ヒト動物、さらには同腹の動物を、例えば以下に記載する本発明のマイコバクテリア由来リポタンパク／リポペプチドに対する応答の促進物質又は抑制物質のスクリーニングに際して併用することが好ましい。
【００１９】
本発明のマイコバクテリア由来リポタンパク／リポペプチド不応答性モデル非ヒト動物や該モデル非ヒト動物由来のマクロファージ、脾臓細胞、樹状細胞等の免疫細胞は、マイコバクテリア由来リポタンパク／リポペプチドの作用機序の解明の他、ＴＬＲ１に対するアゴニスト若しくはアンタゴニストなどのマイコバクテリア由来リポタンパク／リポペプチドに対する応答の抑制物質若しくは促進物質のスクリーニングや、肺結核等のマイコバクテリア感染症に対する予防・治療薬のスクリーニング等に用いることができる。かかるＴＬＲ１に対するアゴニスト若しくはアンタゴニストなどのマイコバクテリア由来リポタンパク／リポペプチドに対する応答の促進物質若しくは抑制物質のスクリーニング方法を、以下に例を挙げて説明する。
【００２０】
本発明のマイコバクテリア由来リポタンパク／リポペプチドに対する応答の促進物質又は抑制物質のスクリーニング方法としては、マイコバクテリア由来リポタンパク／リポペプチド不応答性モデル非ヒト動物に由来するマクロファージ、脾臓細胞、樹状細胞等の免疫細胞と、被検物質と、マイコバクテリア由来リポタンパク／リポペプチドとを用いて、かかる免疫細胞におけるマイコバクテリア由来リポタンパク／リポペプチドに対する応答を測定・評価する方法や、マイコバクテリア由来リポタンパク／リポペプチド不応答性モデル非ヒト動物と、被検物質と、マイコバクテリア由来リポタンパク／リポペプチドとを用いて、かかるモデル非ヒト動物におけるマイコバクテリア由来リポタンパク／リポペプチドに対する応答を測定・評価する方法等を挙げることができる。
【００２１】
上記マイコバクテリア由来リポタンパク／リポペプチド不応答性モデル非ヒト動物に由来する免疫細胞を用いたスクリーニング方法としては、マイコバクテリア由来リポタンパク／リポペプチド不応答性モデル非ヒト動物から得られる免疫細胞と被検物質とをあらかじめインビトロで接触せしめた後、かかる免疫細胞をマイコバクテリア由来リポタンパク／リポペプチドの存在下で培養し、該免疫細胞におけるマイコバクテリア由来リポタンパク／リポペプチドに対する応答を測定・評価する方法や、マイコバクテリア由来リポタンパク／リポペプチド不応答性モデル非ヒト動物から得られる免疫細胞とマイコバクテリア由来リポタンパク／リポペプチドとをあらかじめインビトロで接触せしめた後、該免疫細胞を被検物質の存在下で培養し、該免疫細胞におけるマイコバクテリア由来リポタンパク／リポペプチドに対する応答を測定・評価する方法を挙げることができる。
【００２２】
また、マイコバクテリア由来リポタンパク／リポペプチド不応答性モデル非ヒト動物にあらかじめ被検物質を投与した後、該非ヒト動物から得られる免疫細胞をマイコバクテリア由来リポタンパク／リポペプチドの存在下で培養し、該免疫細胞におけるマイコバクテリア由来リポタンパク／リポペプチドに対する応答を測定・評価する方法や、本発明のマイコバクテリア由来リポタンパク／リポペプチド不応答性モデル非ヒト動物にあらかじめ被検物質を投与した後、該非ヒト動物にマイコバクテリア由来リポタンパク／リポペプチドを投与し、該非ヒト動物から得られる免疫細胞におけるマイコバクテリア由来リポタンパク／リポペプチドに対する応答を測定・評価する方法を挙げることができる。
【００２３】
また、本発明のマイコバクテリア由来リポタンパク／リポペプチド不応答性モデル非ヒト動物をあらかじめマイコバクテリア由来リポタンパク／リポペプチドを投与した後、該非ヒト動物から得られる免疫細胞を被検物質の存在下で培養し、該免疫細胞におけるマイコバクテリア由来リポタンパク／リポペプチドに対する応答を測定・評価する方法や、本発明のマイコバクテリア由来リポタンパク／リポペプチド不応答性モデル非ヒト動物をあらかじめマイコバクテリア由来リポタンパク／リポペプチドを投与した後、該非ヒト動物に被検物質を投与し、該非ヒト動物から得られる免疫細胞におけるマイコバクテリア由来リポタンパク／リポペプチドに対する応答を測定・評価する方法を挙げることができる。
【００２４】
また、本発明のマイコバクテリア由来リポタンパク／リポペプチド不応答性モデル非ヒト動物と、被検物質と、マイコバクテリアを用いて、かかるモデル非ヒト動物におけるマイコバクテリア由来リポタンパク／リポペプチドに対する応答を測定・評価する方法としては、マイコバクテリア由来リポタンパク／リポペプチド不応答性モデル非ヒト動物にあらかじめ被検物質を投与した後、該モデル非ヒト動物をマイコバクテリアに感染させ、該モデル非ヒト動物におけるマイコバクテリア由来リポタンパク／リポペプチドに対する応答を測定・評価する方法や、マイコバクテリア由来リポタンパク／リポペプチド不応答性モデル非ヒト動物をあらかじめマイコバクテリアに感染させた後、該モデル非ヒト動物に被検物質を投与し、該モデル非ヒト動物におけるマイコバクテリア由来リポタンパク／リポペプチドに対する応答を測定・評価する方法を挙げることができる。
【００２５】
本発明においてマイコバクテリア由来リポタンパク／リポペプチドに対する応答の測定・評価とは、マイコバクテリア由来リポタンパク／リポペプチドと特異的に反応し、細胞内にシグナルを伝達する機能の測定・評価をいい、かかるシグナル伝達機能としては、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−１２、ＩＦＮ−γ等のサイトカインを産生する機能や、亜硝酸イオンを産生する機能や、細胞を増殖する機能や、細胞表面においてＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＭＨＣクラスII等の抗原を発現する機能や、ＮＦ−κＢ、ＪＮＫ、ＩＲＡＫ等のＴＬＲ９のシグナル伝達経路における分子を活性化させる機能などを具体的に例示することができるが、これらに限定されるものではない。また前記したように、マイコバクテリア由来リポタンパク／リポペプチドに対する応答を測定・評価するに際し、対照として同腹の野生型非ヒト動物、特に同腹の野生型非ヒト動物の測定値と比較・評価することが個体差によるバラツキをなくすることができるので好ましい。
【００２６】
本発明のマイコバクテリア由来リポタンパク／リポペプチドに対する反応性を特異的に欠如したモデル非ヒト動物により、ＴＬＲ１がマイコバクテリア由来リポタンパク／リポペプチドの認識に特異的に関与していることが明らかとなったことから、これらのモデル非ヒト動物は、結核菌による肺結核や腎結核等に対する治療戦略を考案する上で、非常に有用なモデル動物となることが考えられる。またＴＬＲ１のアゴニストは、上記各種マイコバクテリア感染症等のＴＬＲ１活性の欠失又は異常に起因する疾病等の診断・治療に有用な物質である可能性がある。
【００２７】
ＴＬＲ１とＴＬＲ２は哺乳類細胞中での相互作用し、マイコバクテリア由来リポタンパク／リポペプチドに対する応答性を一層高めることから、これらを宿主細胞内で共発現させると、マイコバクテリア感染症の予防・治療薬となりうる。本発明のＴＬＲ１及びＴＬＲ２の発現系を含むマイコバクテリア感染症の予防・治療薬における発現系としては、上記ＴＬＲ１及びＴＬＲ２を宿主細胞内で発現させることができる発現系であればどのようなものでもよいが、ＳＶ４０のようなパポバウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルス、レトロウイルス由来のウイルスベクターに、ＴＬＲ１やＴＬＲ２をコードする遺伝子を個別にインテグレーションしたものや、ＴＬＲ１及びＴＬＲ２をコードする遺伝子をコインテグレーションしたものを例示することができる。この発現系は発現を起こさせるだけでなく発現を調節する制御配列を含んでいてもよい。
【００２８】
本発明において、予防・治療薬を医薬品として用いる場合は、薬学的に許容される通常の担体、結合剤、安定化剤、賦形剤、希釈剤、ｐＨ緩衝剤、崩壊剤、可溶化剤、溶解補助剤、等張剤などの各種調剤用配合成分を添加することができる。またこれら医薬品を用いる予防若しくは治療方法においては、患者の性別・体重・症状に見合った適切な投与量の上記予防・治療薬を、経口的又は非経口的に投与することができる。すなわち通常用いられる投与形態、例えば粉末、顆粒、カプセル剤、シロップ剤、懸濁液等の剤型で経口的に投与することができ、あるいは、例えば溶液、乳剤、懸濁液等の剤型にしたものを注射の型で非経口投与することができる他、スプレー剤の型で鼻孔内投与することもできる。
【００２９】
【実施例】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
参考例（ＴＬＲ２ノックアウトマウスの作製）
１２９／ＳｖＪマウス遺伝子ライブラリー（Stratagene社製）から、ヒトＴＬＲ２遺伝子と類似したマウスＥＳＴクローン由来のプローブを用いて、ＴＬＲ２遺伝子をスクリーニングし、pBluescriptベクター（Stratagene社製）中でサブクローンし、制限酵素マッピング及びＤＮＡ配列決定により特定した。ターゲッティングベクターは、ＴＬＲ２遺伝子の細胞内領域を含むエクソン部位１．３ｋｂの遺伝子フラグメントを、ポリＡシグナルをもつpMC1-neo（Stratagene社製）に置換することにより構築した。かかるターゲッティングベクターは、４．８ｋｂの５′遺伝子フラグメントと１．０ｋｂの３′遺伝子フラグメントとをフランキング配列として有し、ＨＳＶ−ｔｋカセットを５′末端に含んでいる。このターゲッティングベクターをＳａｌＩにより線状化し、胎生１４．１日目の胚幹細胞（ＥＳ細胞）にエレクトポレーションした。上記エレクトロポレーションしたＥＳ細胞から、Ｇ４１８及びガンシクロビアに抵抗性を示し、かつ突然変異ＴＬＲ２対立遺伝子を含有していたものをスクリーニングし、かかるＥＳ細胞をＣ５７ＢＬ／６マウスの胚盤胞中にマイクロインジェクションしキメラマウスを作製し、この雄のキメラマウスとＣ５７ＢＬ／６雌マウスとを交配させることによってＴＬＲ２ノックアウトマウスを作製した（Immunity 11, 443-451, 1999）。
【００３０】
実施例１（ＴＬＲ１ノックアウトマウスの作製）
１２９Ｓｖマウス遺伝子ライブラリー（Clontech社製）から、マウスＴＬＲ１遺伝子由来のプローブを用いて、ＴＬＲ１遺伝子をスクリーニングし、pBluescript II SK(+)ベクター（Stratagene社製）中でサブクローンし、制限酵素マッピング及びＤＮＡ配列決定により特定した。ターゲッティングベクターは、マウスＴＬＲ１の細胞内領域及び膜貫通領域をコードする遺伝子部位（マウスＴＬＲ１のアミノ酸配列５７５−７９５を含むエクソンの一部を、５’末端側から１．０ｋｂ及び３’末端側から１０ｋｂまで）を、ネオマイシン耐性遺伝子カセット（Staratagene社製）に置換し、負の選択マーカーとして単純ヘルペスウィルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫ）を挿入することにより構築した（図１）。このターゲッティングベクターをＳａｌＩにより線状化し、胎生１４．１日目の胚幹細胞（ＥＳ細胞）にエレクトポレーションし、Ｇ４１８及びガンシクロビアに抵抗性を示す１２５個のクローンを選択し、ＰＣＲ法及びサザンブロット法により３個のクローンをスクリーニングした。
【００３１】
突然変異ＴＬＲ１対立遺伝子を含有していた３個の標的ＥＳクローンを、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの胚盤胞中にマイクロインジェクションしてキメラマウスを作製した。この雄のキメラマウスをＣ５７ＢＬ／６雌マウスと交配させ、ヘテロ接合体Ｆ１マウスを作製し、かかるヘテロ接合体Ｆ１マウスをインタークロスすることによってホモ接合体マウス（ＴＬＲ１ノックアウトマウス：ＴＬＲ１^-/-）を得た。なお、ホモ接合体マウスの確認は、マウスの尾から抽出した各ゲノムＤＮＡをＥｃｏＲＩでダイジェストし、図１に示すプローブを用いるサザンブロット法により行った（図２）。ＴＬＲ１^-/-マウスの腹腔マクロファージは、ＴＬＲ１のｍＲＮＡを発現していなかった（図３）。これに対し、ＴＬＲ１^-/-マクロファージ中でのＴＬＲ２のｍＲＮＡの発現は、野生型細胞の場合と比較して、正常であった。本発明のＴＬＲ１^-/-はメンデルの法則に従い作製することができ、健やかに成長し、繁殖可能で、生後６ヶ月までは明らかな異常を全く示さなかった。また、ＴＬＲ１^-/-マウスにおける胸腺細胞及び脾細胞中のリンパ球群には、変化がなかった。
【００３２】
実施例２（腹腔マクロファージの調製と酵素結合免疫吸着定量法）
野生型マウス（wild-type）、ＴＬＲ１ノックアウトマウス（ＴＬＲ１^-/-）及びＴＬＲ２ノックアウトマウス（ＴＬＲ２^-/-）のそれぞれの腹腔内に４％のチオグリコール酸培地（ＤＩＦＣＯ社製）を２ｍｌずつ注入し、３日後に各マウスの腹腔内から腹腔滲出細胞を単離し、これらの細胞を１０％のウシ胎仔血清を添加したＲＰＭＩ１６４０培地（Nacalai tesque社製）中で３７℃にて２時間培養し、腹腔マクロファージ（５×１０⁴）を培養し、示されたリポタンパク質等の細菌成分で２４時間刺激した。培養上澄液中のＴＮＦα（Genzyme Techne社製）及びＩＬ−６（R & D社製）の濃度は、酵素結合免疫吸着定量法（ＥＬＩＳＡ）で測定した。
【００３３】
（ＰＡＭＰｓに対する応答）
ＰＡＭＰｓにはMycobacterium tuberculosis（結核菌）から精製した未変性１９ｋＤリポタンパク質（Science 285, 732, 1999の記載に従い精製）、Salmonella minnesota Re595のＬＰＳ、及びStaphylococcus aureus（黄色ブドウ球菌）のＰＧＮを使用した。チオグリコール酸で刺激した野生型マウス及びＴＬＲ１^-/-マウスの腹腔マクロファージを、これらのＰＡＭＰｓの存在下で２４時間培養し、培養上澄液中のＴＮＦαの濃度を測定した。未変性１９ｋＤリポタンパク質を用いたときの結果を図４に、ＬＰＳ及びＰＧＮを用いたときの結果を図５に示す。野生型マクロファージは、１９ｋＤリポタンパク質に応答し、投与量依存的にＴＮＦαを産生したが、ＴＬＲ１^-/-マクロファージによるＴＮＦαの産生には、実験したリポタンパク質の濃度５μｇ／ｍｌ及び１０μｇ／ｍｌにおいて、障害が認められた（図４）。一方、ＬＰＳ及びＰＧＮで刺激すると、ＴＬＲ１^-/-マクロファージは、野生型細胞とほぼ同程度、投与量依存的にＴＮＦαを産生した（図５）。また、同様に、培養した腹腔マクロファージ（５×１０⁴）を未変性１９ｋＤリポタンパク質とＬＰＳとでそれぞれ２４時間刺激し、培養上澄液中のＩＬ−６の濃度を測定した。図６に示す結果からもわかるように、未変性１９ｋＤリポタンパク質に応答したＩＬ−６の産生も、ＴＬＲ１^-/-マクロファージでは、野生型細胞に比べ少なかったが、ＬＰＳに応答したＩＬ−６の産生は両者間において大差がなかった。さらに、全てのマイコバクテリアの識別にＴＬＲ１が関与しているのかどうかについて検討するため、段階的に量を増加させた生菌のM. bovis（ウシ型結核菌）ＢＣＧ（Kyowa社製）を用いて腹腔マクロファージを２４時間刺激し、培養上澄液中のＴＮＦα濃度を測定した。ＢＣＧに応答してＴＮＦαを産生する能力は、図７に示すように、ＴＬＲ１^-/-マクロファージでは部分的に損なわれていた。これらの結果から、ＴＬＲ１は、生菌のマイコバクテリアだけではなく、マイコバクテリアから精製した１９ｋＤリポタンパク質の識別にも関与していることが判明した。
【００３４】
（合成アシル化リポペプチドに対する応答）
また、トリアシル化リポペプチド及びジアシル化リポペプチドの応答にはいずれもＴＬＲ２が必須であること、及びＴＬＲ６がＴＬＲ２と相互作用してジアシル化リポペプチドを特異的に識別することは、本発明者によってこれまでに示されている（Int. Immunol. 13, 933, 2001）。１９ｋＤリポタンパク質の調製に応答したサイトカインの産生は、ＴＬＲ２^-/-マクロファージでは阻害されていた（Science 291, 1544, 2001）。こうした結果はすべて、ＴＬＲ１がＴＬＲ２とも相互作用して、トリアシル化リポタンパク質を識別していることを示している。ＴＬＲ１が識別する化学構造を解明するため、野生型マウス及びＴＬＲ１^-/-マウスの腹腔マクロファージを、合成細菌由来トリアシル化ペプチドであるＰａｍ₃ＣＳＫ₄及び合成マイコプラズマ由来ジアシル化ペプチドであるＭＡＬＰ−２で刺激した。ＴＬＲ１^-/-マクロファージでは、野生型細胞と比較して、Ｐａｍ₃ＣＳＫ₄に応答したＴＮＦαの産生が有意に阻害されていたが（図８）、ＴＬＲ１^-/-細胞は、ＭＡＬＰ−２に正常に応答していた（図９）。これらの結果から、ＴＬＲ１がトリアシル化細菌由来リポタンパク質の識別に関与していることがわかる。また、ＴＬＲ１は、個々のＴＬＲ２リガンドを識別し、リポペプチドのアシル化の程度を判別していることがわかる。
【００３５】
実施例３（ＴＬＲ１、ＴＬＲ２及びＴＬＲ６の共発現による、リポペプチドの刺激に応答したＮＦ−κＢ作用の調節）
ＴＬＲ１、ＴＬＲ２及びＴＬＲ６の発現ベクターでＨＥＫ２９３細胞の形質転換を行い、その際にpELAMルシフェラーゼレポータープラスミドを使用した。リポフェクトアミン２０００（Invitrogen社製）による形質転換効率を標準化するため、示されたベクターをpELAMルシフェラーゼリポータープラスミド（J. Biol. Chem. 274, 10689, 1999）及びpRL-TK（Promega社製）と共に用いて、ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞の一時的な形質転換を行った。形質転換の２４時間後、１０ｎｇ／ｍｌのＰａｍ₃ＣＳＫ₄でかかる細胞を８時間刺激した。その後、細胞を溶解し、Dual-luciferase reporter assay system（Promega社製）を製造者の指示通りに用い、ルシフェラーゼ活性を測定した。結果を図１０に示す。ＴＬＲ２の発現は、Ｐａｍ₃ＣＳＫ₄刺激に応答したＮＦ−κＢの活性化をもたらし、ＴＬＲ１の共発現は、かかる活性化を有意に増強した。これに対して、ＴＬＲ６とＴＬＲ２の共発現により、Ｐａｍ₃ＣＳＫ₄刺激に誘導されたＮＦ−κＢの活性化が増強することはなかった。こうした結果は、互いに協力してＰａｍ₃ＣＳＫ₄を識別する際に関与しているのが、ＴＬＲ６ではなくＴＬＲ１及びＴＬＲ２であることを示している。
【００３６】
実施例４（ＴＬＲ１及びＴＬＲ２の哺乳類細胞中での相互作用）
３μｇのＦｌａｇ標識ＴＬＲ２、ＴＬＲ４、又は６μｇのＨＡ標識ＴＬＲ１を用い、ＨＥＫ２９３細胞をコトランスフェクションした。３６時間後、１．０％のNonidet P-40、１５０ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのトリスＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭのＥＤＴＡ及びプロテアーゼ阻害剤の混合液であるComplete（Roche Diagnostics社製）を含む溶解緩衝液中で、かかる細胞を溶解した。タンパク質Ｇ−セファロースを用い、かかる溶解液の前処理を１時間行い、２μｇの抗ＦｌａｇＭ２抗体又は２μｇの抗ＨＡ１２ＣＡ５抗体及びタンパク質Ｇ−セファロースを用い、免疫沈降を１２時間行った。溶解緩衝液でビーズを４回洗浄し、免疫沈降したタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル緩衝液中で溶出させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離してＰＶＤＦ膜上に移した。抗ＨＡ抗体（Roche Diagnostics社製）及びＨＲＰ標識抗マウスＩｇ抗体で、ＨＡ標識ＴＬＲ１を検出した。二次抗体であるHRP-conjugated抗Flag M2抗体で、Ｆｌａｇ標識タンパク質を同定した。その後、enhanced chemiluminescence system（DuPont社製）で、かかる抗体の検出を行った。
【００３７】
ＨＡ標識ＴＬＲ１の免疫沈降を行った結果、Ｆｌａｇ標識ＴＬＲ２については共沈降が生じたが、ＴＬＲ４については生じなかった。ＨＡ標識ＴＬＲ１も相互的にＦｌａｇ標識ＴＬＲ２と共沈降した（図１１）。しかし、Ｐａｍ₃ＣＳＫ₄刺激によって、ＴＬＲ１−ＴＬＲ２間の会合の程度が影響を受けることはなかった。これらの結果により、ＨＥＫ２９３細胞中でＴＬＲ１とＴＬＲ２がリガンド非依存的に会合していることが示唆される。
【００３８】
実施例５（ＴＬＲ１及びＴＬＲ２が識別するリポペプチド）
ＴＬＲ１^-/-マウスにおいてはＰａｍ₃ＣＳＫ₄への応答は有意に阻害されていたが、本発明者はＴＬＲ１非依存的なサイトカインの産生を観察した。ＴＬＲ１が識別する特異的なリガンドをさらに絞りこむため、Ｎ末端の脂肪酸の組み合わせが異なるリポペプチドを合成した。合成Ｎ−パルミトイル−Ｓ−ジパルミトイルグリセリル（Ｐａｍ₃）ＣＳＫ₄、及びＭＡＬＰ−２の合成方法については、文献（Science 285, 736, 1999; J. Immunol. 164, 554, 2000）の通りである。合成リポタンパク質類似体のＪＢＴ３００２は、文献（J. Leukoc. Biol. 63, 766, 1998）の通りである。また、Ｎ−パルミトイル−Ｓ−ジラウリルグリセリル（Ｎ−Ｐａｍ−Ｓ−Ｌａｕ₂）ＣＳＫ₄、Ｎ−ラウリル−Ｓ−ジラウリルグリセリル（Ｌａｕ₃）ＣＳＫ₄、Ｎ−ミリスチル−Ｓ−ジミリスチルグリセリル（Ｍｙｒ₃）ＣＳＫ₄などの別のＮ末端アシル機能を有する他のリポペプチド（Peptide Institute Inc.社製）を使用した。これらはペプチドのＮ末端システインで置換された脂肪酸の長さが異なっている。また、Ｎ−Ｐａｍ−Ｓ−Ｌａｕ₂ＣＳＫ₄とＪＢＴ３００２の脂質部分は同一である。
【００３９】
野生型マウス、ＴＬＲ１^-/-マウス及びＴＬＲ２^-/-マウスのマクロファージを上記合成ペプチド化合物Ｍｙｒ₃ＣＳＫ₄、Ｌａｕ₃ＣＳＫ₄、Ｌａｕ₂Ｎ−ＰａｍＣＳＫ₄及びＪＢＴ３００２でそれぞれ刺激し、ＴＮＦαの産生を測定した。結果を、それぞれ図１２〜図１５に示す。これらすべての合成ペプチドは野生型細胞を活性化し、投与量依存的にＴＮＦαを産生させていた。ＴＬＲ２^-/-マウスのマクロファージについては、これらのリポペプチドのいずれかに応答したＴＮＦαの産生は全く検出されなかった。ＴＬＲ１^-/-のマクロファージについては、Ｍｙｒ₃ＣＳＫ₄及びＬａｕ₃ＣＳＫ₄に応答したＴＮＦαの産生能力は損なわれていた（図１２及び図１３）。また、Ｌａｕ₂Ｎ−ＰａｍＣＳＫ₄又はＪＢＴ３００２で刺激した場合、ＴＬＲ１^-/-細胞におけるＴＮＦαの産生がかなり損なわれていたが、このことは、ＴＬＲ１の識別にリポタンパク質の脂質部分の微妙な相違が影響していることを示している（図１４及び図１５）。これらのことから、マイコバクテリア由来産物だけではなくトリアシル化リポタンパク質の識別にもＴＬＲ１が関与しているという確証が得られた。ＴＬＲ１とＴＬＲ２は、相互作用により協働してＰａｍ₃ＣＳＫ₄を検出するが、これは、ＴＬＲ２がＴＬＲ１又はＴＬＲ６と対になって、異なるＰＡＭＰｓを識別することを示している。
【００４０】
【発明の効果】
本発明のＴＬＲ１ノックアウトマウス等のマイコバクテリア由来リポタンパク／リポペプチド不応答性モデル非ヒト動物は、マイコバクテリア由来リポタンパク／リポペプチドに対してのみ不応答性であるため、このモデル非ヒト動物を用いることによって、肺結核等のマイコバクテリア感染症に対する抑制物質若しくは促進物質又はＴＬＲ１に対するアゴニスト若しくはアンタゴニストなどのマイコバクテリア由来リポタンパク／リポペプチドに対する応答性の抑制物質若しくは促進物質のスクリーニングが可能となり、ひいては、マイコバクテリア属をはじめとする細菌による感染成立の分子機構の解明における新たな有用情報を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のＴＬＲ１ノックアウトマウス、野生型マウス及びターゲッティングベクターの遺伝子地図を示す図である。
【図２】本発明のＴＬＲ１ノックアウトマウスのサザンブロット分析の結果を示す図である。
【図３】本発明のＴＬＲ１ノックアウトマウスのノーザンブロット分析の結果を示す図である。
【図４】本発明のＴＬＲ１ノックアウトマウス及び野生型マウスにおける１９ｋＤリポタンパク質刺激によるＴＮＦα産生の結果を示す図である。
【図５】本発明のＴＬＲ１ノックアウトマウス及び野生型マウスにおけるＬＰＳ及びＰＧＮ刺激によるＴＮＦα産生の結果を示す図である。
【図６】本発明のＴＬＲ１ノックアウトマウス及び野生型マウスにおけるリポタンパク質、ＬＰＳ刺激に応答したＩＬ−６の産生の結果を示す図である。
【図７】本発明のＴＬＲ１ノックアウトマウス及び野生型マウスにおけるＢＣＧ刺激によるＴＮＦα産生の結果を示す図である。
【図８】本発明のＴＬＲ１ノックアウトマウス、ＴＬＲ２ノックアウトマウス、及び野生型マウスにおけるＰａｍ₃ＣＳＫ₄刺激によるＴＮＦα産生の結果を示す図である。
【図９】本発明のＴＬＲ１ノックアウトマウス、ＴＬＲ２ノックアウトマウス、及び野生型マウスにおけるＭＡＬＰ−２刺激によるＴＮＦα産生の結果を示す図である。
【図１０】本発明のＴＬＲ１、ＴＬＲ２及びＴＬＲ６の共発現のＰａｍ₃ＣＳＫ₄刺激に誘導されたＮＦ−κＢの活性化の結果を示す図である。
【図１１】本発明のＨＡ標識ＴＬＲ１の免疫沈降を行った結果を示す図である。
【図１２】本発明のＴＬＲ１ノックアウトマウス、ＴＬＲ２ノックアウトマウス、及び野生型マウスにおけるＭｙｒ₃ＣＳＫ₄刺激によるＴＮＦα産生の結果を示す図である。
【図１３】本発明のＴＬＲ１ノックアウトマウス、ＴＬＲ２ノックアウトマウス、及び野生型マウスにおけるＬａｕ₃ＣＳＫ₄刺激によるＴＮＦα産生の結果を示す図である。
【図１４】本発明のＴＬＲ１ノックアウトマウス、ＴＬＲ２ノックアウトマウス、及び野生型マウスにおけるＬａｕ₂Ｎ−ＰａｍＣＳＫ₄刺激によるＴＮＦα産生の結果を示す図である。
【図１５】本発明のＴＬＲ１ノックアウトマウス、ＴＬＲ２ノックアウトマウス、及び野生型マウスにおけるＪＢＴ３００２刺激によるＴＮＦα産生の結果を示す図である。

Claims

マイコバクテリア由来リポタンパク／リポペプチドを特異的に認識するタンパク質ＴＬＲ１をコードする遺伝子の機能が染色体上で欠損した非ヒト動物を、マイコバクテリア由来リポタンパク／リポペプチド不応答性モデル動物として使用する方法。
非ヒト動物が齧歯目動物であることを特徴とする請求項１記載の方法。
齧歯目動物がマウスであることを特徴とする請求項２記載の方法。