JP4236692B2 - マイコプラズマ由来リポタンパク/リポペプチド不応答性モデル非ヒト動物 - Google Patents
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Description
参考例(TLR2ノックアウトマウスの作製)
129/SvJマウス遺伝子ライブラリー(ストラタジーン社製)から、ヒトTLR2遺伝子と類似したマウスESTクローン(登録番号D77677)由来のプローブを用いて、TLR2遺伝子をスクリーニングし、pBluescriptベクター(ストラタジーン社製)中でサブクローンし、制限酵素マッピング及びDNA配列決定により特定した。ターゲッティングベクターは、TLR2遺伝子の細胞内領域を含むエクソン部位1.3kbの遺伝子フラグメントを、ポリAシグナルをもつpMC1-neo(ストラタジーン社製)に置換することにより構築した。かかるターゲッティングベクターは、4.8kbの5′遺伝子フラグメントと1.0kbの3′遺伝子フラグメントとをフランキング配列として有し、HSV−tkカセットを5′末端に含んでいる。このターゲッティングベクターをSalIにより線状化し、胎生14.1日目の胚幹細胞(ES細胞)にエレクトポレーションした。上記エレクトロポレーションしたES細胞から、G418及びガンシクロビアに抵抗性を示し、かつ突然変異TLR2対立遺伝子を含有していたものをスクリーニングし、かかるES細胞をC57BL/6マウスの胚盤胞中にマイクロインジェクションしキメラマウスを作製し、この雄のキメラマウスとC57BL/6雌マウスとを交配させることによってTLR2ノックアウトマウスを作製した(Immunity 11, 443-451, 1999)。
129/SvJマウス遺伝子ライブラリー(ストラタジーン社製)から、マウスTLR6遺伝子(登録番号AB020808)由来のプローブを用いて、TLR6遺伝子をスクリーニングし、pBluescript II SK(+)ベクター(ストラタジーン社製)中でサブクローンし、制限酵素マッピング及びDNA配列決定により特定した。ターゲッティングベクターは、マウスTLR6の細胞内領域及び膜貫通領域をコードする遺伝子部位(およそ6kb)を、ネオマイシン耐性遺伝子カセット(pMC1-neo;ストラタジーン社製)に置換し、負の選択マーカーとして単純ヘルペスウィルスチミジンキナーゼ(HSV−TK)を挿入することにより構築した(図1)。このターゲッティングベクターを線状化し、胎生14.1日目の胚幹細胞(ES細胞)にエレクトポレーションし、G418及びガンシクロビアに抵抗性を示す126個のクローンを選択し、PCR法及びサザンブロット法により3個のクローンをスクリーニングした。
さなかった。
野生型マウス(wild-type)、TLR6ノックアウトマウス(TLR6-/-)及びTLR2ノックアウトマウス(TLR2-/-)のそれぞれの腹腔内に4%のチオグリコール酸培地(DIFCO社製)を2mlずつ注入し、3日後に各マウスの腹腔内から腹腔滲出細胞を単離し、これらの細胞を10%のウシ胎仔血清(GIBCO社製)を添加したRPMI1640培地(GIBCO社製)中で37℃にて2時間培養し、氷温のハンクス緩衝液(Hank's buffered salt solution:HBSS;GIBCO社製)で洗浄することにより非付着細胞を取り除き、付着細胞を腹腔マクロファージとして以下の実験に使用した。
本発明者らは、TLR2が細菌由来のリポプロテインやペプチドグリカンの認識に必須であり、TLR4がLPSやリポタイコ酸の認識に必須であることを、TLR2ノックアウトマウスやTLR4ノックアウトマウスを作製することにより既に明らかにしている。そこで、TLR6ノックアウトマウスのこれらLPS、スピロヘータ由来リポプロテイン、黄色ブドウ球菌由来ペプチドグリカンに対する応答性を調べてみた。実施例2により調製した野生型マウス及びTLR6ノックアウトマウスの腹腔マクロファージ(5×104cells)を、10μMのB.burgdorferi由来リポプロテインOspA若しくはOspC、10μMのT. pallidum由来リポプロテイン17−kDa(17)若しくは47−kDa(47)、100ng/mlのLPS、又は図3に示された各種濃度のペプチドグリカン(PGN)といっしょに24時間培養した。培養後、培養上清中のTNFαの各濃度をELSIAにより測定した。この結果を図3に示す。これらの結果から、TLR6ノックアウトマウス(TLR6-/-)由来のマクロファージは、OspA、OspC、17、47、LPS、PGNに対して野生型マウス由来のマクロファージとほぼ同程度のTNFαを産生することがわかった。
野生型マウス又はTLR6ノックアウトマウス由来腹腔マクロファージのリポペプチドに対する応答性を、合成グラム陰性菌由来リポペプチドJBT3002及び合成マイコプラズマ由来リポペプチドMALP−2を用いて調べた。実施例2により調製した野生型マウス及びTLR6ノックアウトマウスの腹腔マクロファージ(5×104cells)を、図4に示された各種濃度のJBT3002(Dr.Z. Dongより提供された)又はMALP−2(Dr. P. F. Muhlradtより提供された)といっしょに24時間培養し刺激した。培養後、培養上清中のTNF−α(TNFα)及びNO2 −(NO)の産生量を測定した(図4)。なお、NO2 −はNO2/NO3アッセイキット(同仁科学研究所社製)を使用し、Greiss法により測定した。
TLRのシグナルは、アダプター分子であるMyD88を介してセリン/トレオニンキナーゼであるIRAKを活性化し、次いでMAPキナーゼ及びNF−κBを活性化することが知られている(Immunity 11, 115-122, 1999)。また、マイコプラズマ由来リポタンパク/リポペプチドが、TLR2及びMyD88シグナル伝達経路を介して生体反応を引き起こしていることも知られている(J. Immunol. 164, 554-557, 2000)。そこで野生型マウス、TLR6ノックアウトマウス及びTLR2ノックアウトマウスを用いて細菌由来のリポタンパク/リポペプチドが細胞内シグナル伝達分子を活性化するかどうかを調べてみた。実施例2により調製した野生型マウス(wild-type)、TLR6ノックアウトマウス(TLR6-/-)及びTLR2ノックアウトマウス(TLR2-/-)の腹腔マクロファージ(1×106cells)を、0.1ng/mlのJBT3002又は0.3ng/mlのMALP−2で20分間又は40分間刺激し、各マウスのマクロファージから核蛋白質を抽出し、NF−κBのDNA結合部位を含む特異的プローブといっしょにインキュベートし、電気泳動を行い、オートラジオグラフィーにより視覚化した(図5)。
Claims (4)
- TLR6をコードする遺伝子機能が染色体上で欠損し、マイコプラズマ由来リポタンパク/リポペプチドに対する反応性を特異的に欠如した非ヒト哺乳動物を、マイコプラズマ由来リポタンパク/リポペプチド不応答性モデル動物として使用する方法。
- 非ヒト哺乳動物が齧歯目動物であることを特徴とする請求項1記載の使用する方法。
- 齧歯目動物がマウスであることを特徴とする請求項2記載の使用する方法。
- マウスが、マウス遺伝子ライブラリーからマウスESTクローン由来のプローブを用いてスクリーニングすることにより得られたTLR6遺伝子の細胞内領域及び膜貫通領域を含む遺伝子部位の全部又は一部の遺伝子フラグメントを、ポリAシグナルとマーカー遺伝子をもつプラスミドに置換してターゲッティングベクターを構築し、該ターゲッティングベクターを線状化した後胚幹細胞に導入し、TLR6遺伝子機能を欠損した標的胚幹細胞を、マウスの胚盤胞中にマイクロインジェクションしキメラマウスを作製し、このキメラマウスと野生型マウスとを交配させてヘテロ接合体マウスを作製し、かかるヘテロ接合体マウスをインタークロスすることによって得られるTLR6ノックアウトマウスであることを特徴とする請求項3記載の使用する方法。
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