WO2005102040A1 - Ｔｌｒリガンド及びｉｌ－１応答障害性モデル動物 - Google Patents

Ｔｌｒリガンド及びｉｌ－１応答障害性モデル動物 Download PDF

Info

Publication number
WO2005102040A1
WO2005102040A1 PCT/JP2005/007304 JP2005007304W WO2005102040A1 WO 2005102040 A1 WO2005102040 A1 WO 2005102040A1 JP 2005007304 W JP2005007304 W JP 2005007304W WO 2005102040 A1 WO2005102040 A1 WO 2005102040A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
tlr ligand
human animal
response
cells
ligand
Prior art date
Application number
PCT/JP2005/007304
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Shizuo Akira
Masahiro Yamamoto
Original Assignee
Japan Science And Technology Agency
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Japan Science And Technology Agency filed Critical Japan Science And Technology Agency
Priority to US11/587,154 priority Critical patent/US20090158447A1/en
Priority to CA002563614A priority patent/CA2563614A1/en
Priority to AU2005235182A priority patent/AU2005235182B2/en
Priority to EP05730565A priority patent/EP1738643A4/en
Publication of WO2005102040A1 publication Critical patent/WO2005102040A1/ja

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
    • A01K67/0276—Knock-out vertebrates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5082—Supracellular entities, e.g. tissue, organisms
    • G01N33/5088—Supracellular entities, e.g. tissue, organisms of vertebrates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
    • A01K2217/075—Animals genetically altered by homologous recombination inducing loss of function, i.e. knock out
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/10—Mammal
    • A01K2227/105—Murine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • A01K2267/0393—Animal model comprising a reporter system for screening tests

Definitions

  • the present invention relates to a model (non-human animal) with impaired response to ligand (TLR ligand) and interleukin-1 (IL-1) response to a Toll-like receptor (TLR) in which the ⁇ - ⁇ gene has been knocked out.
  • TLR Toll-like receptor
  • the present invention relates to a method for screening a substance that promotes or suppresses a response to a TLR ligand or IL-1 using such a model non-human animal.
  • the innate immune system is a biological defense system that detects and eliminates invasion of pathogens such as bacteria and viruses. Once the innate immune system detects the presence of microorganisms, it produces inflammatory cytokines that cause inflammation in vivo. At the same time, it induces the activation of lymphocytes such as T cells and B cells and establishes a defense mechanism against invading microorganisms.
  • the TLR family is known as a receptor involved in the recognition of microorganisms in the innate immune system.
  • TLR inflammatory interleukin-1 receptor
  • IL-1R inflammatory interleukin-1 receptor
  • IKB-- nuclear protein
  • MAIL and ⁇ nuclear protein having an ankyrin repeat at its C-terminal site, and shows high homology to Bel-3, a member of the I ⁇ family (for example, see Non-Patent Documents 4 to 6).
  • I ⁇ B- ⁇ is a nuclear protein having an ankyrin repeat at its C-terminal site, and shows high homology to Bel-3, a member of the I ⁇ family (for example, see Non-Patent Documents 4 to 6).
  • I ⁇ B- ⁇ suppresses the activity of NF- ⁇ B-responsive reporters. This suggests that I ⁇ B- ⁇ has a negative effect on NF- ⁇ B. It has been suggested that it functions as a regulator (for example, see Non-Patent Document 4).
  • TLR and IL-1R signaling pathways send signals downstream using the adapter protein MyD88, and as a result, inflammation-related factors including Cox-2 are expressed (for example, see Non-patent Document 7). 9).
  • MyD88-dependent pathway there is a MyD88-independent pathway in the TLR3 and TLR4 signal transduction pathways, and this MyD88-independent pathway is responsible for interferon type I (IFN) and IFN-inducible genes such as IP-10. Expression is induced (for example, see Non-patent Documents 10 to 12).
  • IFN interferon type I
  • IP-10 IFN-inducible genes
  • Non-Patent Documents 13 to 15 disclose the MyD88-dependent pathway via TLRZIL-1R involved in inflammatory site force-in production activates NF- ⁇ and mitogen-activated protein (MAP) kinase.
  • MAP mitogen-activated protein
  • Non-Patent Document 1 Annu. Rev. Immunol. 21, 335-376 (2003)
  • Non-Patent Document 2 Annu.Rev. Immunol. 20, 197-216 (2002)
  • Non-Patent Document 3 Curr Opin Pharmacol. 3, 396-403 (2003)
  • Non-Patent Document 4 J Biol Chem. 276, 27657-27662 (2001)
  • Non-Patent Document 5 FEBS Lett. 485, 53-56 (2000)
  • Non-Patent Document 6 J Biol Chem. 276, 12485-12488 (2001)
  • Non-Patent Document 7 Science.278, 1612-1615 (1997)
  • Non-Patent Document 8 Immunity.7, 837-847 (1997)
  • Non-Patent Document 9 Mol Cell. 2, 253-258 (1998)
  • Non-Patent Document 10 Nature.413, 732-738 (2001)
  • Non-Patent Document 11 J Immunol. 167, 5887-5894 (2001)
  • Non-Patent Document 12 Immunity. 17, 251-63 (2002)
  • Non-Patent Document 13 Cell.109 Suppl, S81-96 (2002)
  • Non-Patent Document 14 J Endotoxin Res. 6, 453-457 (2000)
  • Non-Patent Document 15 Mol Cell. 11, 293-302 (2003)
  • An object of the present invention is to provide a non-human animal model of a TLR ligand and an IL-1 responsive disorder in which production of IL-6 in response to the TLR ligand and IL-1 is impaired, a powerful TLR ligand and an IL (1)
  • NF- ⁇ BlZp50-deficient mice have a similar phenotype to LR ⁇ - ⁇ -deficient mice in terms of TLRZIL-1R-mediated responses, and endotoxin-induced IL-12 ⁇ 40 and GM- Expression of other genes, such as CSF, was found to be absent in I ⁇ - ⁇ -deficient macrophages.
  • TLRZIL-1R-mediated responses include at least two levels of gene expression that require inducible I ⁇ B ⁇ . Some may be adjusted.
  • the present invention has been completed based on the above findings.
  • the present invention provides (1) a method in which all or a part of an endogenous gene of a non-human animal encoding 1 ⁇ is inactivated by gene mutation such as disruption or deletion, and the like.
  • -Express ⁇ A TLR ligand and IL1 non-responsive model non-human animal, characterized in that TLR ligand and IL1 response to IL1 are impaired, and (2) TLR ligands LPS, BLP, PGN, MALP-2, R-848 or CpG DNA, the TLR ligand and IL1 non-responsive model non-human animal according to (1), or (3) atopic skin
  • the present invention also provides (5) a method using the non-human animal according to any one of the above (1) to (4), a test substance, and TLR ligand or IL-1 or a substance containing them. , Measuring and evaluating the degree of production of IL6 in response to the TLR ligand or IL1 or the contents thereof in the non-human animal, and responding to the TLR ligand or IL1 or the contents thereof.
  • an immune cell derived from a non-human animal according to any one of (1) to (4), a test substance, and a TLR ligand or IL-1 or TLR ligand or IL1 in response to the content of TLR ligand or IL1 or IL6 in these immune cells is measured and evaluated using these components. Promoter or suppression of response to inclusions Quality method for screening.
  • the present invention provides (7) administering a test substance to the non-human animal according to any one of the above (1) to (4), and treating the non-human animal with atopic dermatitis-like inflammatory skin.
  • the present invention relates to a method for screening a therapeutic agent for measuring the degree of a lesion, 'preventing atopic dermatitis-like inflammatory skin lesions characterized by evaluating'.
  • FIG. 1 shows that ⁇ ⁇ B- ⁇ is specifically induced by TLRZIL-1R stimulation.
  • a lOOng ml ⁇ BLP, lO ⁇ g ml ⁇ PGN, 30ng ml " 1 MALP-2, ⁇ R—848, 3 M CpG DNA, lOng mrtL-l j8, 10 g ml ⁇ LPS, lOOng ml- 1 flagellin, Peritoneal macrophages and primary lung cells were stimulated with lOng ml-iTNF-a for 2 hours.
  • RNA (dO / zg) was extracted and subjected to Northern blot analysis to obtain ⁇ B- ⁇ , Bel-3, I The expression of ⁇ B- ⁇ and ⁇ -actin was examined.
  • MEFs of wild-type mice and MyD88-deficient mice were stimulated with 10 ng mrtL-lj8 and 10 g ml'PS for a predetermined period.
  • Total RNA (10 ⁇ g) was extracted and subjected to Northern blot analysis for expression of I ⁇ B- B, Cox-2, IP-10, and ⁇ -actin.
  • FIG. 2 is a view showing target destruction in the mouse I ⁇ - ⁇ gene.
  • a It is a figure which shows the structure of a ⁇ gene, a targeting vector, and a predicted disrupted gene. The black box indicates the exon site of IkBB.
  • FIG. 4 shows the results of Southern blot analysis of mice born by crossing the teguzygote with restriction enzymes: ⁇ , EcoRI.
  • B Genomic DNA was also extracted from the mouse tail, digested with EcoRI, subjected to electrophoresis, and hybridized with the radiolabeled probe shown in a.
  • FIG. 3 shows the immune response of I ⁇ B ⁇ deficient cells and the kinetics of I ⁇ I induction.
  • a, b, c, d Peritoneal macula phage from wild-type mice and I ⁇ - ⁇ -deficient mice were ligated with PGN, R-848, and C pG DNA at a given concentration in the presence of 30ng ml ⁇ IFN-y.
  • the concentrations of IL-6, TNF-a, and NO in the culture supernatant were measured.
  • the numerical value shown is the average value SD from the results of three tests. ND not detected.
  • e.MEFs derived from wild-type mice and I ⁇ - ⁇ -deficient mice were And 10 ng mTNF- ⁇ . Twenty-four hours later, the supernatant was collected and examined for IL-6 by ELISA. The numerical value shown is the average value SD from the results of three tests. ND not detected.
  • Peritoneal macrophages were stimulated with lOng m LPS for a predetermined period. Total RNA ⁇ / zg) was extracted and Northern blot analysis was performed to examine the expression of IL-6, TNF-a, and j8-actin. g.
  • FIG. 4 shows that the cells were not restored when- ⁇ ( ⁇ was introduced into the cells.
  • 8 was determined by ELISA.
  • the values shown are the mean SD of the results of three tests h.I ⁇ produced by stimulating wild-type peritoneal macrophages resolved by electrophoresis with LPS
  • Fig. 4 shows a double RNA product representing mRNA transcripts derived from ⁇ , IL6 and TNF-a.The results of two separate experiments using wild-type cells derived separately are shown.
  • FIG. 4 shows the results of in vitro analysis of I ⁇ B- ⁇ on the IL-6 promoter.
  • Luciferase reporter constructs either mouse IL6 promoter or ELAM1 promoter, along with either control or I ⁇ -expression plasmid, were transiently transfected into RAW 264.7 cells. Luciferase activity was expressed as a fold increase relative to the background exhibited by lysates prepared from non-transfate cells. Data are representative of three independent experiments. Cells were stimulated with the indicated concentration of LPS in all three experiments.
  • b A predetermined amount of the I ⁇ B- ⁇ expression vector was transiently introduced into untreated RAW 264.7 cells together with a certain amount of the IL6 reporter plasmid. Data are representative of three independent experiments.
  • c A reporter construct, either the wild-type or mutant IL6 promoter, was transiently introduced into P19 embryonal carcinoma cells with either control or I ⁇ - ⁇ expression plasmids. For each case, the luciferase activity was normalized by dividing the rate of increase of I ⁇ -expressing cells relative to the knock ground indicated by the lysate by the rate of increase of motta-expressing cells.
  • ChIP ⁇ is untreated (1) or treated with LPS. (+) (1 / zg ml- 1 for 3 hours) Chromatin obtained from RAW 264.7 cells was used together with the indicated antibody.
  • Precipitated DNA at the IL-6 ⁇ B site (left), the ⁇ region of the IL6 gene (center), or the ELA Ml promoter (right) was measured by PCR (ChlP). Data are representative of two independent experiments. e. Unstimulated peritoneal macrophages or LPS-stimulated (10 ng ml- 1 ) peritoneal macrophages were immunoprecipitated with the specified antibody. Then, immunoprecipitation lysate was subjected to immuno-plating together with I ⁇ B-II.
  • FIG. 5 is a view showing the response of TLRZIL-1R in NF- ⁇ B1-deficient mice and the results of microarray analysis of I ⁇ - ⁇ -deficient cells.
  • the concentrations of IL-6 and TNF- ⁇ in the culture supernatant were measured by ELISA.
  • the values shown in the figure are the average SD of the results of three tests. b.
  • cFull-length ⁇ B- ⁇ (Full) or deletion mutant ⁇ - ⁇ ( ⁇ was introduced into wild-type and NF- ⁇ -deficient MEFs using retrovirus into cells. Also, 10 ng ml The same strain of non-cell-introduced cells was stimulated using iTNF, the concentration of IL 6 in the culture supernatant was measured by ELISA, and the indicated value is the SD of the results of three tests d.
  • FIG. 2 is a view showing IL-118-induced activation of a signal transduction pathway in MEFs.
  • a Overview of 16-week-old I ⁇ B- ⁇ -deficient mice (right) and wild-type mice (left).
  • b. the predetermined period stimulated MEFs at lOng ml _1 IL- 1 18.
  • a nuclear extract was prepared, and the DNA binding activity of NF- ⁇ B was measured by EMSA using an NF- ⁇ B-specific probe.
  • Cell extracts using anti-phosphoric acid, ⁇ 38 and ERK antibodies were subjected to Western blotting, and the activities of JNK, p38 and ERK were also measured.
  • FIG. 7a is a diagram showing the results of gene expression analysis of LPS-inducible genes using statistically selected genes.
  • a Experimental genealogy and gene phylogeny obtained from the results of Affimetrix microarray analysis comparing gene expression profiles of wild-type macrophages and I ⁇ -deficient macrophages responsive to lOOng ml ⁇ LPS. "Expressed” genes are shown in red, and “lowly expressed” genes are shown in blue. The relative expression levels are shown in the right column.
  • FIG. 7b b. Diagram showing mRNA transcripts derived from I ⁇ B- ⁇ , GM-CSF and IL-12p40 after LPS stimulation of wild-type peritoneal macrophages separated by electrophoresis It is. Two separate experiments using wild-type cells from different sources were quantified by Phospholmager, and the mRNA levels of a given gene in arbitrary units against ⁇ -actin were graphed (left: I ⁇ B- ⁇ and IL). 12 ⁇ 40, GM-CSF on the right) 0 c. NF- ⁇ site of promoter Zenhansa to be searched. The position corresponding to the transcription start site when mapped is shown. d.
  • Wild-type and NF- ⁇ B1-deficient mouse peritoneal macrophages were stimulated with lOng ml-PS for a predetermined period.
  • Total RNA ⁇ / zg was extracted, and the expression of a given probe was examined by Northern blot analysis.
  • FIG. 8 is a schematic diagram illustrating a multi-step gene expression mechanism by TLRZIL-1R signal via ⁇ B- ⁇ .
  • the TLR ligand and IL1 non-responsive model non-human animal of the present invention include those in which all or part of the endogenous gene of the non-human animal encoding I ⁇ B ⁇ is disrupted due to genetic mutation such as 'deletion' substitution. Is activated, loses the function of expressing ⁇ - ⁇ , impairs the function of expressing I ⁇ - ⁇ expressed in wild type, and responds to TLR ligand and IL-1
  • the TLR ligand is not particularly limited as long as it is a non-human animal in which L6 production is impaired.
  • the TLR ligand include lipopolysaccharide (LPS; TLR4 ligand) which is a glycolipid specific to the cell wall of Gram-negative bacteria.
  • Bacterial lipoprotein (BLP; TLR1ZTLR2 ligand), relatively short to the repeating polysaccharides of N-acetyldarcosamine and N-acetylmuramic acid, which are the skeletal structures of bacterial cell walls, and peptide dalican (PGN; TLR2 ligand) with a peptide chain attached ), Macrophage-activating lipopeptide (MALP-2; TLR6ZTLR2 ligand) derived from a bacterium belonging to the genus Mycoplasma, synthetic compound R-848 (TLR7 ligand), and DNA derived from a bacterial unmethylated CpG motif (CpG DNA ; TLR9 ligand).
  • BLP Bacterial lipoprotein
  • non-responsiveness means that the responsiveness of a living body or cells, tissues or organs constituting the living body to stimulation by the TLR ligand ⁇ IL1 is reduced or almost lost. I do. Therefore, in the present invention, the TLR ligand and IL-1 non-responsive model non-human animal are defined as those in which the reactivity of the living body or cells, tissues or organs constituting the living body is reduced by the stimulation with the TLR ligand ⁇ IL-1. Non-human animals such as mice, rats, and egrets that have lost or are almost lost. Among them, non-human animals exhibiting atopic dermatitis-like inflammatory skin lesions are preferred.
  • the TLR ligand ⁇ IL1 may be stimulated in a living body to which a TLR ligand such as LPS ⁇ IL-1 is administered to a living body, or a TLR ligand ⁇ IL1 such as LPS may be contacted with cells separated from the living body.
  • a stimulus in a test tube to be touched can be exemplified.
  • Non-human animals that have lost the function of expressing I ⁇ B- ⁇ of the present invention include, in addition to ⁇ - ⁇ mice, for example, I ⁇ - ⁇ - /, which lack the function of the I ⁇ -gene.
  • Examples include rodents such as rats.
  • non-human I ⁇ - ⁇ -human animals born according to Mendel's law include litter-type wild-type animals for which accurate comparison experiments can be performed. It is preferable in that it can be obtained together with.
  • a method for producing such an animal in which the function of the I ⁇ - ⁇ gene is deficient will be described below by using an example of ⁇ - ⁇ _ / mouse.
  • the I ⁇ - ⁇ gene is obtained by amplifying a mouse gene library by PCR or the like, and screening the obtained gene fragment using a probe derived from the mouse I ⁇ - ⁇ gene. Can do.
  • the screened I ⁇ B- ⁇ gene can be subcloned using a plasmid vector or the like, and identified by restriction enzyme mapping and DNA sequencing. Next, all or part of the gene encoding I ⁇ - ⁇ was replaced with a pMCl neo gene cassette or the like, and the diphtheria toxin A fragment (DT-A) gene or simple herpes virus was inserted at the 3 ′ end.
  • the target vector is prepared by introducing a gene such as the thymidine kinase (HSV-tk) gene.
  • the thus produced targeting vector is linearly transformed, introduced into ES cells by an electoporation (electroporation) method or the like, and homologous recombination is carried out.
  • ES cells that have undergone homologous recombination with an antibiotic such as G418 or ganciclovir (GANC) are selected.
  • GANC ganciclovir
  • the confirmed ES cell clone is microinjected into a mouse blastocyst, and the kakar blastocyst is returned to the foster mother mouse to produce a chimeric mouse.
  • a heterozygous mouse F1 mouse; I ⁇ - ⁇ + /
  • RNA is isolated from the mouse obtained by the above method, and Northern blotting is carried out. There is a method of examining the expression of I ⁇ - ⁇ ⁇ ⁇ in the mouse by Western blotting or the like.
  • the fact that the produced I ⁇ - ⁇ mice are unresponsive to TLR ligand and IL-1 can be performed, for example, by comparing LPS with macrophages, mononuclear cells, and the like of I ⁇ B- ⁇ mice.
  • immune cells such as dendritic cells in vitro or in vivo, and measuring the production of IL-6, IL-12p40, GM-CSF, etc. in such cells, or in the elderly stage (for example, 10 weeks of age, preferably Can be confirmed by observing the degree of development of atopic dermatitis-like inflammatory skin lesions in mice aged 15 weeks or older).
  • the non-human animal of the present invention As a method for screening a substance promoting or suppressing a response to the TLR ligand or IL 1 of the present invention or a substance containing the same, the non-human animal of the present invention, a test substance, a TLR ligand or IL-1 Or using these components, in the non-human animal Measuring the degree of production of IL6 in response to TLR ligand or IL1 or a content thereof, and assessing the degree of IL6 production and the immune cells such as macrophages, spleen cells, and dendritic cells derived from the non-human animal of the present invention.
  • test substance Using a test substance and a TLR ligand or IL 1 or a substance containing them, a method for measuring and evaluating the degree of production of IL 6 in response to the TLR ligand or IL 1 or these substances in the immune cells
  • the embodiment of the screening method of the present invention which is not particularly limited as long as it is not so limited, will be described below with reference to examples.
  • An immune cell such as a macrophage obtained from the model non-human animal of the present invention, a test substance, and a TLR ligand or IL-1 or a component thereof are cultured together, and IL 6 in the immune cell is cultured.
  • a screening method for measuring and evaluating the degree of production, or a method of administering a test substance to a model non-human animal of the present invention as a whole, and then immunizing the non-human animal with TLR ligand or IL-1 The screening method for culturing in the presence of the above components and measuring and evaluating the degree of IL-6 production in the immune cells, and the TLR ligand or IL-1 or their inclusion in the model non-human animal of the present invention.
  • the screening method for assessing the degree of IL-6 production in the immune cells by culturing the immune cells that also provide the power of the non-human animal in the presence of the test substance after the administration of the product And the model of the present invention
  • a TLR ligand or IL1 or a substance containing them and / or a test substance are administered to a human animal simultaneously or either, and the degree of IL-6 production in immune cells obtained from the non-human animal is measured.
  • a screening method for evaluation can be mentioned.
  • a test substance is administered to a non-human animal of the present invention, and the atopic skin in the non-human animal is administered.
  • the method is not particularly limited as long as it is a method for measuring and assessing the degree of inflammatory skin lesions like inflammation.
  • administering of the test substance may be performed before or after the onset of atopic dermatitis-like inflammatory skin lesions. However, if symptoms are improved by pre-symptomatic administration, they are useful as prophylactic drugs, and if symptoms are improved by post-symptomatic administration, they are useful as therapeutic drugs.
  • Methods for measuring and assessing the degree of inflammatory skin lesions include eyelid edema, lip and face edema, facial and neck, forelimb flexion, eczema and hair loss on the chest, and pruritic behavior due to the forelimbs And methods for observing the presence or absence of exudation, blood clots, and erosion by visual inspection, etc. Can do.
  • Stimulation with IL-1 or LPS induces I ⁇ B- ⁇ in macrophage cell lines and fibroblasts, and TLR4, a receptor for IL1R and LPS, shares an intracellular signaling pathway.
  • TLR4 a receptor for IL1R and LPS
  • peptide darican TLR2 ligand
  • BLP bacterial lipoprotein
  • flagellin flagellin
  • MALP-2 TLR6ZTLR2 ligand
  • mRNA of I ⁇ B- ⁇ is significantly induced in peritoneal macrophages or lung-derived normal cells. No induction was observed (Fig. La).
  • I ⁇ B- ⁇ and Bcl-3 were induced in response to TNF-a as well as the TLR ligand ⁇ IL-1.
  • TLRZlL-1R TLRZlL-1R
  • I ⁇ B-— induction of I ⁇ B-— is regulated by a MyD88-dependent or MyD88-independent pathway.
  • MEFs embryonic fibroblasts
  • I ⁇ B- ⁇ has been shown to be an inducible protein in the MyD88-dependent pathway of TLRZIL-1R signaling.
  • I ⁇ - ⁇ -deficient mice were generated by targeted gene disruption.
  • a targeting vector was constructed in which two exons encoding the central part of ⁇ - ⁇ were replaced with a neomycin resistance (neoR) gene (Fig. 2a).
  • neoR neomycin resistance
  • Fig. 2a Homologous recombination has occurred in embryonic stem (ES) cells.
  • Mice with mutant alleles were generated using ES cells, confirmed by lot analysis and correctly targeted ( Figure 2b).
  • Homozygous mice were born according to expected Mendelian law.
  • the expression of I ⁇ B- ⁇ mRNA in the mutant mice was examined by Northern blot analysis.
  • LPS-induced inflammation-related molecules in peritoneal macrophages was analyzed.
  • wild-type macrophages produced TNF- ⁇ and oxalate (NO) in response to LPS (FIG. 3a).
  • LPS-induced production of ⁇ NF- ⁇ and NO was normal but IL-6 production was significantly reduced in ⁇ - ⁇ -deficient mice.
  • IL-6 production stimulated by other TLR ligands, such as CpG DNA, R-848, PGN, MALP-2, and BLP was also significantly inhibited in I ⁇ B ⁇ -deficient cells ( Figure 3b, 3c, and 3d).
  • I ⁇ B B-deficient cells lacked IL1-responsive IL-6 production.
  • TLRZIL-1R mitogen-activated protein
  • IL-J3 ⁇ 41-5NF- ⁇ B and MAP kinase It was similar in both type- and I ⁇ B ⁇ -deficient cells (FIGS. 6b and 6c).
  • full-length I ⁇ B- ⁇ or deficient mutant I ⁇ - ⁇ was transformed into I ⁇ ⁇ - ⁇ -deficient MEFs treated with medium or IL1.
  • full-length I ⁇ B- ⁇ restored a decrease in IL-6 production in I ⁇ B- ⁇ -deficient cells.
  • No (FIG. 3g) suggesting that I ⁇ B- ⁇ expression, as well as NF- ⁇ B and MAP kinase activation, was also required for TLRZlL-1-mediated IL-6 production.
  • a luciferase reporter plasmid having a promoter of either the IL6 or ELAM1 gene was used as a control or I ⁇ .
  • RAW264.7 cells were introduced together with the ⁇ - ⁇ expression vector.
  • LPS stimulated the activity of both the IL6 and ELAM1 promoters in a dose-dependent manner.
  • ELAM1 which is a force that further promotes the promoter activity of IL6 in RAW264.7 cells, did not show such a tendency (FIG. 4a).
  • Vigorous enhancement was observed in unstimulated cells Therefore, it was examined whether ectopic expression of ⁇ - has a positive effect on the activity of the IL-6 promoter in unstimulated RAW264.7 cells. It was observed that the basal activity of the IL-6 promoter was upregulated even in unstimulated cells by increasing the amount of I ⁇ - ⁇ introduced (FIG. 4b).
  • the ⁇ 50 subunit was easily detected at the IL 6 ⁇ site of unstimulated cells.
  • the IL-6 ⁇ B site co-immunoprecipitated with ⁇ -I ⁇ B-—, but also at the ELAM1 ⁇ site at the 3 ′ end of the IL-6 gene.
  • peritoneal macrophages and MEFs were obtained from NF- ⁇ BlZp50-deficient mice and analyzed for LPS-induced cytoforce in production.
  • LPS-induced TNF- ⁇ production in NF- ⁇ Bl-deficient macrophages in the presence of IFN-y was much more variable than in wild-type cells.
  • IL6 production in response to LPS was impaired (Cell. 80, 321-330 (1995), Proc Natl Acad Sci US A. 97, 12705-12710 (2000), And Figure 5a).
  • LPS-inducible genes regulated by ⁇ - ⁇ were searched for by microarray analysis. Many LPS-inducible genes were significantly affected by the loss of ⁇ - ⁇ ! (Fig. 7a). Next, some of these genes were subjected to Northern blot analysis to confirm the accuracy. Among these genes, LPS-induced expression of GM-CSF, IL-12p40, G-CSF, C / EBP- ⁇ and endothelin 1 was reduced in I ⁇ - ⁇ -deficient macrophages (Fig. 5e). ), IL-6 and ⁇ - ⁇ regulate the expression of the above genes.
  • I ⁇ - ⁇ plays an important role in TLRZIL-1R-mediated immune response.
  • ⁇ - ⁇ is preceded in the same manner as NF- ⁇ B and MAP kinase activation for its proper production. It is considered necessary.
  • TLRZIL-1R-mediated IL-6 expression may be regulated in a two-step mechanism.
  • the results of microarray analysis indicated that ⁇ ⁇ ⁇ - ⁇ may regulate LPS-inducible genes other than IL6. Further analysis to elucidate the molecular basis of I ⁇ B- ⁇ dependent gene expression will provide new insights into the MyD88-dependent immune response mediated by TLRZIL-1R.
  • Genomic DNA having the I ⁇ - ⁇ gene was isolated from the 129ZSV mouse genomic library and characterized by restriction enzyme mapping and sequence analysis. Encodes the central part of ⁇ ⁇ ⁇ - 2. 2. Replacing the Okb fragment with the neoR cassette allows targeting A plasmid vector was constructed and the simple virus thymidine kinase transcribed by the p GK promoter in the genomic fragment was introduced to perform negative selection (FIG. 2a). This targeting vector was transfected into embryonic stem cells (E14.1). A colony having dual resistance to G418 and ganciclovir was selected and screened by PCR and Southern blotting.
  • mice Two different homologous recombinants were microinjected into C57BLZ6 female mice, and the heterozygous F1 generation was bred to obtain I ⁇ B- ⁇ -deficient mice. Mice that also obtained these different clonality showed the same phenotype.
  • Six- to eight-week-old ⁇ -deficient mice and their littermate wild type were used in the experiments of the present invention. All animal experiments were performed with the approval of the Laboratory Animal Research Committee attached to the Institute for Microbial Diseases (Osaka University, Osaka, Japan).
  • LPS from Salmonella Minnesota Re 595 and PGN from S. aureus were purchased from Sigma and Fluka, respectively.
  • MALP-2 and CpG oligodeoxynucleotides were prepared according to the method described in the literature (J Immunol. 164, 554-557 (2000), Nature. 408, 740-745 (2000)).
  • Flagellin and R-848 were also provided by Drs. A. Adrem and H. Tomizawa, respectively.
  • Polyclonal antibodies to I kappa B- zeta was obtained by immunizing Usagi and have use the C-terminal portion of murine I kappa Beta zeta proteins expressed in bacteria.
  • Each antibody against phosphoric acid ERK, JNK and p38 was purchased from Cell Signaling.
  • Antibodies to each of ERK were obtained from Santa Cruz. Recombinant TNF- ⁇ and IL-113 were obtained from Genzyme. NF- ⁇ BlZp50-deficient mice or MyD88-deficient mice were prepared according to the method described in the literature (Cell. 80, 321-330 (1995), Proc Natl Acad Sci US A. 89, 1473-1476 (1992)).
  • peritoneal macrophages or MEFs induced by thioglycolic acid were cultured in 96-well plates (macrophages were 5 ⁇ 10 4 cells per 1 ⁇ l, MEFs were 1 ⁇ 10 4 cells) in the presence of a predetermined concentration of a predetermined ligand.
  • ELISA was performed according to the manufacturer's manual, and the concentrations of TNF- ⁇ and IL-6 in the culture supernatant were measured (for TNF-a, Genzyme —6 is made by R & D).
  • the NO concentration was measured by the Griess method according to the instructions of the manufacturer (DOJINDO).
  • MEFs (1 ⁇ 10 6 ) were stimulated with lOng ml- 1 IL-1 ⁇ for a predetermined period.
  • nuclear extracts were purified from cells, incubated in the presence of a specific probe for the DN ⁇ binding site of NF- ⁇ , and subjected to electrophoresis. , Visualized by autoradiography.
  • the reporter plasmid was composed of the 5 'flanking region (1240Z + 40) of the mouse IL-6 gene and was used in FIGS. 4a and 4b.
  • the reporter plasmid used in FIG. 4c is from the literature (Proc Natl Acad Sci U S A. 90, 10193-10197 (1993), Proc Natl Acad Sci U S A. 89, 1473-1476 (1992)).
  • the luciferase reporter plasmid derived from the ELAM1 promoter was a gift from DT Golenbock. Full-length I ⁇ B— ⁇ (Full) or deletion mutant I ⁇ B— ⁇ lacking the C-terminal site (AC, J Biol Chem. 276,
  • ChIP assay was performed basically according to the protocol described in the manual (Upstate Biotechnology). Briefly, 2 ⁇ 10 6 RAW264.7 cells or 5 ⁇ with LPS (1 ⁇ g ml for 3 hours), IL-118 (lOng ml for 3 hours) or TNF-a (lOng ml for 3 hours) 10 5 the MEFs were stimulated respectively, with formaldehyde, were solid boss 60 min at 37 ° C. These cells were lysed, sheared by sonication, and incubated in the presence of specific antibodies, followed by incubation in the presence of protein A agarose saturated with salmon sperm DNA (Upstate Biotechnology). did. The precipitated DNA was analyzed by quantitative PCR (35-40 cycles) using the following primers.
  • Peritoneal macrophages and MEFs were stimulated with a given ligand for a given period.
  • the cells were lysed in a lysis buffer containing 1.0% Nonidet P40, 150 mM NaCl, 20 mM Tris-Cl (pH 7.5), 5 mM EDTA and a protein inhibitor (Roche).
  • the cell lysate was lysed by SDS-PAGE and transferred onto a PVDF membrane.
  • the cell lysate was pre-cleared with Protein G Sepharose TM (Amersham Pharmacia Biotech) for 2 hours, and incubated at 4 ° C in the presence of Protein G Sepharose TM containing 1.0 g of the specified antibody. Incubate for 12 hours under agitation. Wash the immunoprecipitate four times with lysis buffer, elute by boiling in Laemmli sample buffer, and use ⁇ - ⁇ - ⁇ as described above. [0047] (9) Gene chip analysis
  • microarray analysis (Affimetrix) responding to LPS was performed according to the method described in the literature (Blood. 102, 4123-4129 (2003)).
  • a color image of gene expression was created using GeneSpring 6.0 (Silicon Genetics) software.
  • the concept that gene expression in the TLR and IL 1R signal transduction pathways has only one stage of conventionally considered NF- ⁇ B or AP-1 activity (one-stage expression control)
  • One more step, the pre-induction of ⁇ ⁇ ⁇ - ⁇ expression is essential, and a new concept, such as “two-step (multi-step) regulation of TLR and IL-1R signal response” is proposed.
  • a new concept such as “two-step (multi-step) regulation of TLR and IL-1R signal response” is proposed.
  • TLRZIL-1R see Figure 8
  • mice since ⁇ - ⁇ -deficient mice exhibit atopic dermatitis-like symptoms, the pathological analysis in the local area and the detailed analysis of gene expression control will be combined in the future, and the cause remains unknown for some time. It is hoped that this will lead to the construction of a new treatment strategy for some intractable diseases.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

ＴＬＲリガンド／ＩＬ－１に応答するＩＬ－６の産生が障害されているＴＬＲリガンド／ＩＬ－１応答傷害性モデル非ヒト動物や、かかる非ヒト動物を利用した、ＴＬＲリガンド／ＩＬ－１に対する応答の促進物質又は抑制物質や、アトピー性皮膚炎様の炎症性皮膚病変の予防・治療薬のスクリーニング方法を提供するものである。ＩκＢ－ζをコードする非ヒト動物の内在性遺伝子の全部又は一部が破壊・欠損・置換等の遺伝子変異により不活性化され、ＩκＢ－ζを発現する機能を喪失し、ＴＬＲリガンド及びＩＬ－１に応答するＩＬ－６の産生が障害されている、ＴＬＲリガンド／ＩＬ－１不応答性モデル非ヒト動物を作出する。また、かかる非ヒト動物と被検物質を用いて、ＴＬＲリガンド／ＩＬ－１に対する応答の促進物質又は抑制物質や、アトピー性皮膚炎様の炎症性皮膚病変の予防・治療薬をスクリーニングする。                                                                         

Description

明 細 書
TLRリガンド及び IL_ 1応答障害性モデル動物
技術分野
[0001] 本発明は、 Ι κ Β - ζ遺伝子がノックアウトされた Toll様受容体 (TLR)に対するリガ ンド (TLRリガンド)及びインターロイキン 1 (IL— 1)応答障害性モデル非ヒト動物 や、力かるモデル非ヒト動物を用いた TLRリガンド又は IL— 1に対する応答の促進物 質又は抑制物質のスクリーニング方法等に関する。
背景技術
[0002] 自然免疫系は、細菌やウィルスなどの病原体の侵入を感知しそれを排除する生体 防御システムである。自然免疫系がひとたび微生物の存在を探知すると炎症性サイト 力インを産生し、生体内で炎症を引き起こす。それと同時に、 T細胞や B細胞といった リンパ球の活性ィ匕を誘導し侵入してきた微生物に対する感染防御機構を成立させる 。この自然免疫系における微生物の認識に関与している受容体として TLRファミリー が知られている。この TLRファミリーや、 TLRファミリーの細胞内ドメインと相同な細胞 内領域を有する炎症性インターロイキン— 1受容体 (IL— 1R)ファミリーメンバーを刺 激すると、転写因子 NF— κ Bや AP—1などを活性化し、 TNF- a , IL— 6 IL—1 2p40といった炎症性サイト力インなど多数のタンパク質の発現を誘導することが知ら れている。
[0003] 力かる免疫応答に関係ある遺伝子の 1つに I κ B - ζ (MAIL及び ΙΝΑΡとしても知 られる）と呼ばれる核タンパク質がある（例えば、非特許文献 1〜6参照)。 Ι κ Β - ζ は、その C末端部位にアンキリンリピートを有する核タンパク質であり、 I κ Βファミリー メンバーである Bel— 3と高い相同性を示す (例えば、非特許文献 4〜6参照)。インビ トロでの研究の結果、 I κ B— ζの異所性発現により NF— κ B応答性レポーターの 活性が抑制される力 このことから、 I κ B— ζが NF— κ Bに対する負の制御因子と して機能することが示唆されている（例えば、非特許文献 4参照)。一方、 I κ B ζの 過剰発現により、線維芽細胞において LPSに誘導される IL 6産生が促進され、 IL 6産生における I κ B - ζの正の効果が示唆されるとの報告もある（例えば、非特許 文献 5参照)。従って、 Ι κ Β - ζの機能が潜在的な共活性化分子又は共抑制化因 子であるかどうかについては今後の検討が必要である。 IL— 1又は LPSによる刺激 は、マクロファージ細胞株及び線維芽細胞において I κ B - ζを誘導することが明ら 力になっている。 IL— 1Rと、 LPSの受容体である TLR4は、細胞内シグナル伝達経 路を共有することも知られている（例えば、非特許文献 1〜3参照)。
[0004] TLR及び IL— 1Rシグナル伝達経路はアダプタータンパク質の MyD88を利用して 下流へとシグナルを送り、その結果、 Cox— 2を含む炎症関連因子が発現される（例 えば、非特許文献 7〜9参照）。 MyD88依存性経路に加え、 TLR3及び TLR4シグ ナル伝達経路には MyD88非依存性経路があり、この MyD88非依存性経路はイン ターフェロン I型 (IFN)や、 IP— 10などの IFN誘導性遺伝子の発現を誘導する（例え ば、非特許文献 10〜12参照)。また、炎症性サイト力イン産生に関与する TLRZIL — 1Rを介した MyD88依存性経路は、 NF— κ Β及びマイトジェン活性ィ匕タンパク質 (MAP)キナーゼを活性ィ匕することが知られている（例えば、非特許文献 13〜15参 照)。
[0005] 非特許文献 1： Annu. Rev. Immunol. 21, 335-376 (2003)
非特許文献 2 :Annu. Rev. Immunol. 20, 197-216 (2002)
非特許文献 3 : Curr Opin Pharmacol. 3, 396-403 (2003)
非特許文献 4: J Biol Chem. 276, 27657-27662 (2001)
非特許文献 5 : FEBS Lett. 485, 53-56 (2000)
非特許文献 6 : J Biol Chem. 276, 12485-12488 (2001)
非特許文献 7 : Science. 278, 1612-1615 (1997)
非特許文献 8 : Immunity. 7, 837-847 (1997)
非特許文献 9 :Mol Cell. 2, 253-258 (1998)
非特許文献 10 : Nature. 413, 732-738 (2001)
非特許文献 11 :J Immunol. 167, 5887-5894 (2001)
非特許文献 12 : Immunity. 17, 251-63 (2002)
非特許文献 13 : Cell. 109 Suppl, S81- 96 (2002)
非特許文献 14: J Endotoxin Res. 6, 453-457 (2000) 非特許文献 15 :Mol Cell. 11, 293-302 (2003)
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0006] 本発明の課題は、 TLRリガンド及び IL— 1に応答する IL— 6の産生が障害されて いる TLRリガンド及び IL— 1応答障害性モデル非ヒト動物や、力かる TLRリガンド及 び IL 1応答障害性モデル非ヒト動物を利用した、 TLRリガンド又は IL— 1に対する 応答の促進物質又は抑制物質のスクリーニング方法や、アトピー性皮膚炎様の炎症 性皮膚病変の予防'治療薬のスクリーニング方法を提供することにある。
課題を解決するための手段
[0007] TLRや IL— 1Rシグナルの活性化により誘導されるタンパク質の一つである I κ B— ζを欠損するマウスを作製したところ、 TLRや IL— 1Rリガンド (受容体に結合する成 分)の刺激による、 IL - 6, IL— 12ρ40といったある種の遺伝子の発現がほとんど認 められなくなったことから、 TLRZIL— 1Rシグナル伝達経路において活性ィ匕する一 群の遺伝子発現に I κ B— ζが必要不可欠であることを見い出した。また、 TNF— a 産生が正常であっても、 Ι κ Β - 欠損マウスでは、 TLRリガンド及び IL—1に応答 する IL 6の産生が著しく損なわれることや、 Ι κ Β- ζが過剰発現されると、転写因 子 NF— κ Βを経由して IL— 6プロモーターの基礎活性がアップレギュレートされるこ とや、さらに内因性 I κ Β— ζは NF— κ Bの p50サブユニットと特異的に会合して、刺 激を受けることにより IL— 6プロモーターの近傍領域にリクルートされることを見い出し た。また、 NF— κ BlZp50欠損マウスには、 TLRZIL— 1Rを介した応答という点 において、 Ι κ Β - ζ欠損マウスと類似の表現型が認められることや、エンドトキシン に誘導される IL 12ρ40や GM— CSF等の他の遺伝子の発現は、 I κ Β— ζ欠損 マクロファージでは欠如していたことを見い出した。 LPSによる I κ B— ζの誘導が IL 6の誘導に先立って生じるとしても、 TLRZIL— 1Rを介した応答の中には、誘導 性 I κ B ζを必要とする少なくとも 2段階の遺伝子発現において調節されるものがあ ると考えられる。本発明は以上の知見に基づき完成するに至ったものである。
[0008] すなわち本発明は、（1) 1 κ Β— ζをコードする非ヒト動物の内在性遺伝子の全部 又は一部が破壊 ·欠損'置換等の遺伝子変異により不活性化され、 Ι κ Β- ζを発現 する機能を喪失し、 TLRリガンド及び IL 1に応答する IL 6の産生が障害されてい ることを特徴とする TLRリガンド及び IL 1不応答性モデル非ヒト動物や、（2) TLRリ ガンドが、 LPS, BLP、 PGN、 MALP— 2、 R— 848又は CpG DNAであることを特 徴とする前記（1)記載の TLRリガンド及び IL 1不応答性モデル非ヒト動物や、（3) アトピー性皮膚炎様の炎症性皮膚病変を呈することを特徴とする前記（1)又は (2)記 載の TLRリガンド及び IL— 1不応答性モデル非ヒト動物や、（4)非ヒト動物がマウス であることを特徴とする前記（1)〜（3)のいずれか記載の TLRリガンド及び IL— 1不 応答性モデル非ヒト動物に関する。
[0009] また本発明は、（5)前記（1)〜 (4)のいずれかに記載の非ヒト動物と、被検物質と、 TLRリガンド若しくは IL—1又はこれらの含有物とを用いて、前記非ヒト動物における TLRリガンド若しくは IL 1又はこれらの含有物に応答する IL 6の産生の程度を測 定 ·評価することを特徴とする TLRリガンド若しくは IL 1又はこれらの含有物に対す る応答の促進物質又は抑制物質のスクリーニング方法や、（6)前記（1)〜 (4)の 、ず れか記載の非ヒト動物に由来する免疫細胞と、被検物質と、 TLRリガンド若しくは IL 1又はこれらの含有物とを用いて、前記免疫細胞における TLRリガンド若しくは IL 1又はこれらの含有物に応答する IL 6の産生の程度を測定'評価することを特徴 とする TLRリガンド若しくは IL 1又はこれらの含有物に対する応答の促進物質又は 抑制物質のスクリーニング方法に関する。
[0010] さらに本発明は、（7)前記（1)〜 (4)のいずれかに記載の非ヒト動物に被検物質を 投与し、前記非ヒト動物におけるアトピー性皮膚炎様の炎症性皮膚病変の程度を測 定 '評価することを特徴とするアトピー性皮膚炎様の炎症性皮膚病変の予防'治療薬 のスクリーニング方法に関する。
図面の簡単な説明
[0011] [図 1]Ι κ B- ζが TLRZIL—1R刺激により特異的に誘導されることを示す図である 。 a. lOOng ml^BLP, lO ^ g ml^PGN, 30ng ml"1MALP - 2, ΙΟΟηΜ R— 848 、 3 M CpG DNA、 lOng mrtL - l j8、 10 g ml^LPS, lOOng ml—1フラゲリン 、及び lOng ml—iTNF— aで 2時間、腹腔マクロファージ及び肺一次細胞を刺激し た。全 RNA dO /z g)を抽出し、ノーザンブロット分析にかけて、 Ι κ B— ζ、 Bel— 3、 I κ B— α、及び β—ァクチンの発現を調べた。 b. 10ng mrtL - l j8、 10 g ml ' PSで野生型マウス及び MyD88欠損マウスの MEFsを所定期間刺激した。全 RNA ( 10 μ g)を抽出し、ノーザンブロット分析にかけ、 I κ B— ζ、 Cox— 2、 IP— 10、及び βーァクチンの発現を調べた。
[図 2]マウス I κ Β - ζ遺伝子におけるターゲット破壊の様子を示す図である。 a. Ι κ Β ζ遺伝子、ターゲッティングベクター及び予測される破壊遺伝子の構造を示す図 である。黒い囲みは IkB ζとなるェクソン部位を示す。制限酵素： Ε, EcoRI. b.へテ 口接合体を交配させて出生したマウスのサザンプロット分析の結果を示す図である。 ゲノム DNAをマウス尾部力も抽出し、 EcoRIで消化し、電気泳動にかけ、 a.に示した 放射標識プローブとハイブリダィズさせた。サザンブロッテイングの結果、野生型マウ ス（ + Z + )では、 10. 3kbのバンド 1本が認められ、ホモ接合体マウス（一 Z—)では 2. 2kbのバンドが認められ、ヘテロ接合体マウス（ + Z )では両方のバンドが認め られた。 c. 10ng ml_1LPSで刺激した腹腔マクロファージのノーザンブロット分析の 結果である。細胞力も抽出した全 RNA ( 10 g)の電気泳動を行い、ナイロン膜上に 移し、 Ι κ Β - ζ及び |8—ァクチンを用いてハイブリダィズさせた。 d.腹腔マクロファ ージのウェスタンブロット分析の結果を示す図である。細胞溶解物をひ—I κ B— ζと 共に免疫ブロッテイングに供した。同じ溶解物を a—ERK1Z2とも免疫ブロッテイン グに供してタンパク質の発現を観察した。 e, f.所定濃度の LPS、 10 g ml—1の a - CD40、 200Umf1( IL -4,及び 10 μ g ml—1の a—IgMの共存下で脾臓細胞を 48 時間培養した。培養時間の最後 12時間に [¾]チミジン（： L Ci)をパルスした。 [3H] チミジンの取込み量をシンチレーシヨンカウンター（Packard社製）で測定した。
[図 3]Ι κ B ζ欠損細胞における免疫応答、並びに I κ Β ζ誘導のキネティックス を示す図である。 a, b, c, d.野生型マウス及び I κ Β - ζ欠損マウス由来の腹腔マク 口ファージを、 30ng ml^IFN - y存在下において、所定濃度の PGN、 R— 848、 C pG DNAと共に、 10ng ml^LPS, 100ng πιΓ^Ι^Ρ及び 30ng m^MALP— 2の 共存下で 24時間培養した。培養上清中の IL— 6、 TNF - a、及び NOの濃度を測 定した。表記した数値は、 3回試験した結果の平均値士 SDである。 N. D.検出され ず。 e.野生型マウス及び I κ Β- ζ欠損マウス由来の MEFsを 10ng mf'lL- l jS ^ び 10ng m TNF— αで刺激した。 24時間後に上清を回収し、 ELISAで IL— 6を 調べた。表記した数値は、 3回試験した結果の平均値士 SDである。 N. D.検出され ず。 f.腹腔マクロファージを lOng m LPSで所定期間刺激した。全 RNA ^ /z g)を 抽出し、ノーザンブロット分析を行い、 IL— 6、 TNF- a、及び j8—ァクチンの発現 を調べた。 g.完全長 Ι κ B— ζ (Full)をレトロウイルスを用いてトランスフエクシヨンす ることにより I κ B- ζ欠損 MEFsにおける IL— 1応答性が復活するが、欠失変異型 I κ Β - ζ ( Δ を細胞へ導入しても復活しな力つたことを示す図である。 lOng ml—il L - l |8の存在下又は不在下における培養上清中の IL— 6濃度を ELISAで測定し た。表記した数値は、 3回試験した結果の平均値士 SDである。 h.電気泳動により分 離 (resolve)した野生型腹腔マクロファージを LPSで刺激したことにより生じた I κ Β— ζ、 IL 6及び TNF— aに由来する mRNA転写物を表す二重 RNA産物を示す図 である。別個に由来する野生型細胞を用いて別々に 2回行った実験結果を
Phospholmagerで定量し、 βーァクチンに対する任意ユニットにおける所定遺伝子の mRNA量をグラフに表した（左は I κ B— ζ及び IL— 6、右は TNF— α )。
[図 4]IL— 6プロモーター上の I κ B- ζの試験管内分析の結果を示す図である。 a. 対照又は I κ Β - 発現プラスミドのいずれかと共に、マウス IL 6プロモーター又は ELAM1プロモーターのいずれかのルシフェラーゼレポーター構築物を RAW264. 7細胞に一過性にトランスフエタトした。ルシフェラーゼ活性は、非トランスフエタト細胞 から調製した溶解物によって示されるバックグラウンドに対して何倍に増加したかで 表した。データは個別に 3回行った実験を代表するものである。 3回の実験全てにお いて、所定濃度の LPSで細胞を刺激した。 b.所定量の I κ B- ζ発現ベクターを一 定量の IL 6レポータープラスミドと共に、無処理の RAW264. 7細胞に一過性に細 胞へ導入した。データは個別に 3回行った実験を代表するものである。 c野生型又 は変異型 IL 6プロモーターのいずれかであるレポーター構築物を、対照又は I κ Β - ζ発現プラスミドのいずれかと共に、 P19胚性癌細胞に一過性に細胞へ導入した 。それぞれの場合のレポーター構築物に関し、溶解物によって示されるノ ックグラウ ンドに対する I κ Β ζ発現細胞の増加率をモッタ発現細胞の増加率で割ることによ り、ルシフェラーゼ活性を正規ィ匕した。 d. ChIP〖こは、無処理の（一）又は LPS処理し た（+ ) ( 1 /z g ml—1で 3時間） RAW264. 7細胞力ら得たクロマチンを、表記の所定抗 体と共に用いた。 IL - 6 κ B部位 (左）、 IL 6遺伝子の ^領域、（中央）、又は ELA Mlプロモーター（右）における沈殿 DNAを PCR (ChlP)で測定した。データは個別 に 2回行った実験を代表するものである。 e.非刺激腹腔マクロファージ又は LPSで 刺激した（lOng ml—1)腹腔マクロファージを所定抗体と共に免疫沈降させた。その後 、 ひ I κ B— ζと共に免疫沈降溶解物の免疫プロッティングを行った。
[図 5]NF— κ B1欠損マウスにおける TLRZIL—1Rの応答及び I κ Β— ζ欠損細胞 のマイクロアレイ分析の結果を示す図である。 a.野生型及び NF— κ B1欠損マウス の腹腔マクロファージを 30ng mf'lFN - γ存在下で lOng ml_1LPSと 24時間共培 養した。培養上清中の IL— 6及び TNF— αの濃度を ELISAで測定した。図に示す 値は 3回試験した結果の平均値士 SDである。 b. 30ng ml^IFN— γ存在下におい て、また lOOng ml^BLP, lO ^ g ml^PGN, 30ng ml^MALP— 2、 ΙΟΟηΜ R— 848、 3 M CpG DNA、 lOng ml—^lL— 1 β又は lOng ml^TNF - aの共存下で 、野生型及び NF— κ ΒΙ欠損マウスの腹腔マクロファージ及び MEFsを 24時間培養 した。 IL—l j8及び TNF— aに誘導される IL— 6産生を MEFsによって分析した。 E LISAにより、培養上清中の IL 6濃度を測定した。表記値は 3回試験した結果の平 均値士 SDである。 c完全長 Ι κ B— ζ (Full)又は欠失変異型 Ι κ Β— ζ ( Δ を野 生型及び NF— κ ΒΙ欠損 MEFsにレトロウイルスを用いて細胞へ導入した。また、 10 ng ml—iTNF ひを用いて非細胞導入細胞の同株を刺激した。培養上清中の IL 6 濃度を ELISAにより測定した。表記値は 3回試験した結果の平均値士 SDである。 d .無処理の（一）、 IL - 1 βで処理した（上、 +) ( lOng ml—1で 3時間）又は TNF— a で処理した（下、 +) ( lOng ml—1で 3時間） MEFsから得たクロマチンと、図に示す所 定抗体を用いて ChIPを行った。インプット用の沈殿 DNA (左）、又は IL— 6kB部位（ 右）の PCR (ChlP)アツセィを行った。データは 2回行った実験結果を代表するもの である。 e.野生型及び NF— κ B1欠損マウスの腹腔マクロファージを lOng ml_1LP Sで所定期間刺激した。全 RNA (5 /z g)を抽出し、ノーザンプロット分析にかけて所 定プローブの発現を調べた。
[図 6]Ι κ Β- ζ欠損マウスにおけるインビボでの IL 6産生、並びに I κ Β - ζ欠損 MEFsにおけるシグナル伝達経路の、 IL— 1 18に誘導される活性ィ匕の様子を示す図 である。 a. 16週齢の I κ B— ζ欠損マウス (右)及び野生型マウス (左）の全体像であ る。 b. lOng ml_1IL— 1 18で MEFsを所定期間刺激した。核抽出物を調製し、 NF— κ B特異的プローブを用いる EMSAにより、 NF - κ Βの DNA結合活性を測定した 。 c.抗リン酸ィ ΰΝΚ、 ρ38、及び ERK抗体を用いる細胞抽出物をウェスタンブロッテ イングに供し、 JNK、 p38及び ERKの活性も測定した。
[図 7a]統計的に選択した遺伝子を用いる LPS誘導性遺伝子の遺伝子発現分析の結 果を示す図である。 a. lOOng ml^LPSに応答する野生型マクロファージ及び I κ Β ζ欠損マクロファージの遺伝子発現プロフィールを比較する Affimetrixマイクロアレ ィ分析の結果から得た実験的系等図及び遺伝子系統図である。「発現された」遺伝 子は赤色で示し、「少なく発現された」遺伝子は青色で示した。相対発現レベルを右 のカラムに示した。
[図 7b]b.電気泳動によって分離した野生型腹腔マクロファージに対する LPS刺激を 受けて、 I κ B— ζ、 GM— CSF及び IL—12p40に由来する mRNA転写物を表す 二重 RNA産物を示す図である。別々に由来する野生型細胞を用いて行う別々の 2 回の実験を Phospholmagerで定量し、 βーァクチンに対する任意ユニットにおける所 定遺伝子の mRNA量をグラフに表した（左は I κ B— ζ及び IL 12ρ40、右は GM - CSF) 0 c.検索対象のプロモーター Zェンハンサ一の NF— κ Β部位を示す図で ある。マッピングしたときに転写開始部位に相当する位置を示す。 d.野生型及び NF - κ B1欠損マウスの腹腔マクロファージを lOng ml— PSで所定期間刺激した。全 RNA ^ /z g)を抽出し、ノーザンプロット分析により、所定プローブの発現を調べた。
[図 8]Ι κ B- ζを介した TLRZIL— 1Rシグナルによる多段階遺伝子発現機構を説 明する模式図である。
発明を実施するための最良の形態
本発明の TLRリガンド及び IL 1不応答性モデル非ヒト動物としては、 I κ B ζを コードする非ヒト動物の内在性遺伝子の全部又は一部が破壊 '欠損'置換等の遺伝 子変異により不活性化され、 Ι κ Β - ζを発現する機能を喪失し、野生型において発 現される I κ Β - ζを発現する機能が損なわれ、 TLRリガンド及び IL—1に応答する I L 6の産生が障害されている非ヒト動物であれば特に制限されるものではなぐ上記 TLRリガンドとしては、グラム陰性菌の細胞壁に特異的な糖脂質であるリポポリサッカ ライド（LPS ;TLR4リガンド）、細菌由来リポプロテイン（BLP ;TLR1ZTLR2リガンド )、細菌細胞壁の骨格構造である N ァセチルダルコサミンと N ァセチルムラミン酸 の繰返し多糖類に比較的短!、ペプチド鎖が結合したペプチドダリカン (PGN ;TLR2 リガンド）、マイコプラズマ属に属する細菌に由来するマクロファージ活性化リポぺプ チド（MALP— 2 ;TLR6ZTLR2リガンド）、合成化合物 R— 848 (TLR7リガンド）及 び細菌由来非メチル化 CpGモチーフを有する DNA (CpG DNA ;TLR9リガンド）な どを挙げることができる。
[0013] 本発明において不応答性とは、 TLRリガンドゃ IL 1による刺激に対する生体又は 生体を構成する細胞、組織若しくは器官の反応性が低下している力、あるいはほぼ 失われていることを意味する。したがって、本発明において TLRリガンド及び IL— 1 不応答性モデル非ヒト動物とは、 TLRリガンドゃ IL—1による刺激に対して、生体又 は生体を構成する細胞、組織若しくは器官の反応性が低下している力 あるいはほ ぼ失われているマウス、ラット、ゥサギ等のヒト以外の動物をいう。これらの中でも、アト ピー性皮膚炎様の炎症性皮膚病変を呈する非ヒト動物が好ましい。また、 TLRリガン ドゃ IL 1による刺激としては、 LPS等の TLRリガンドゃ IL— 1を生体に投与する生 体における刺激や、生体から分離された細胞に LPS等の TLRリガンドゃ IL 1を接 触させる試験管内の刺激等を挙げることができる。
[0014] 本発明の I κ B - ζを発現する機能を喪失した非ヒト動物として、 Ι κ Β - ζ マウス の他、例えば I κ Β - 遺伝子の機能が欠損した I κ Β - ζ— /_ラット等の齧歯目動物 を例示することができる。これら I κ Β— ζ遺伝子の機能が欠損した非ヒト動物として は、メンデルの法則に従い出生してくる I κ Β— ζチ非ヒト動物が、正確な比較実験を することができる同腹の野生型と共に得ることができる点で好ましい。かかる I κ Β - ζ 遺伝子の機能が欠損した動物の作製方法を、 Ι κ Β - ζ _/マウスを例にとって以下説 明する。
[0015] I κ Β— ζ遺伝子は、マウス遺伝子ライブラリーを PCR法等により増幅し、得られた 遺伝子断片をマウス I κ Β- ζ遺伝子由来のプローブを用いてスクリーニングすること ができる。スクリーニングされた I κ B - ζ遺伝子は、プラスミドベクター等を用いてサ ブクローンし、制限酵素マッピング及び DNAシーケンシングにより特定することがで きる。次に、この I κ Β- ζをコードする遺伝子の全部又は一部を pMClネオ遺伝子 カセット等に置換し、 3'末端側にジフテリアトキシン Aフラグメント (DT— A)遺伝子や 単純へルぺスウィルスのチミジンキナーゼ (HSV— tk)遺伝子等の遺伝子を導入す ることによって、ターゲットベクターを作製する。
[0016] この作製されたターゲテイングベクターを線状ィ匕し、エレクト口ポレーシヨン (電気穿 孔)法等によって ES細胞に導入し、相同的組換えを行い、その相同的組換え体の中 から、 G418やガンシクロビア（GANC)等の抗生物質により相同的組換えを起こした ES細胞を選択する。また、この選択された ES細胞が目的とする組換え体力どうかを サザンプロット法等により確認することが好まし 、。その確認された ES細胞のクローン をマウスの胚盤胞中にマイクロインジェクションし、カゝかる胚盤胞を仮親のマウスに戻 し、キメラマウスを作製する。このキメラマウスを野生型マウスと交雑させると、ヘテロ接 合体マウス (F1マウス; I κ Β - ζ +/ )を得ることができ、また、このへテロ接合体マウス を交雑させることによって、本発明の I κ Β- ζチマウスを作製することができる。また 、 I κ Β— ζチマウスにおいて、 I κ Β— ζが生起しているかどうかを確認する方法とし ては、例えば、上記の方法により得られたマウスから RNAを単離してノーザンブロット 法等により調べたり、またこのマウスにおける I κ Β- ζの発現をウェスタンブロット法 等により調べる方法がある。
[0017] また、作出された I κ Β- ζ マウスが TLRリガンド及び IL— 1に対して不応答性で あることは、例えば、 LPSを I κ B- ζ マウスのマクロファージ、単核細胞、榭状細胞 などの免疫細胞にインビトロ又はインビボで接触せしめ、かかる細胞における IL— 6、 IL— 12p40、 GM— CSF等の産生量を測定することにより、あるいは、高齢期（例え ば 10週齢、好ましくは 15週齢以上）のマウスにおけるアトピー性皮膚炎様の炎症性 皮膚病変の発症の程度を観察することにより確認することができる。
[0018] 本発明の TLRリガンド若しくは IL 1又はこれらの含有物に対する応答の促進物 質又は抑制物質のスクリーニング方法としては、本発明の非ヒト動物と、被検物質と、 TLRリガンド若しくは IL—1又はこれらの含有物とを用いて、前記非ヒト動物における TLRリガンド若しくは IL 1又はこれらの含有物に応答する IL 6の産生の程度を測 定 '評価する方法や、本発明の非ヒト動物に由来するマクロファージ、脾臓細胞、榭 状細胞等の免疫細胞と、被検物質と、 TLRリガンド若しくは IL 1又はこれらの含有 物とを用いて、前記免疫細胞における TLRリガンド若しくは IL 1又はこれらの含有 物に応答する IL 6の産生の程度を測定'評価する方法であれば特に制限されるも のではなぐ力かる本発明のスクリーニング方法の実施の形態を以下に例を挙げて 説明する。
[0019] 本発明のモデル非ヒト動物から得られるマクロファージ等の免疫細胞と、被検物質 と、 TLRリガンド若しくは IL—1又はこれらの含有物とを共に培養し、該免疫細胞にお ける IL 6産生の程度を測定'評価するスクリーニング方法や、本発明のモデル非ヒ ト動物に被検物質をあら力じめ投与した後、該非ヒト動物力も得られる免疫細胞を TL Rリガンド若しくは IL 1又はこれらの含有物の存在下で培養し、該免疫細胞におけ る IL 6産生の程度を測定'評価するスクリ一ユング方法や、本発明のモデル非ヒト 動物に TLRリガンド若しくは IL— 1又はこれらの含有物をあら力じめ投与した後、該 非ヒト動物力も得られる免疫細胞を被検物質の存在下で培養し、該免疫細胞におけ る IL 6産生の程度を測定'評価するスクリ一ユング方法や、本発明のモデル非ヒト 動物に TLRリガンド若しくは IL 1又はこれらの含有物と被検物質とを同時又はどち らか一方を先に投与し、該非ヒト動物力 得られる免疫細胞における IL 6産生の程 度を測定'評価するスクリ一二ング方法を挙げることができる。
[0020] 本発明のアトピー性皮膚炎様の炎症性皮膚病変の予防'治療薬のスクリーニング 方法としては、本発明の非ヒト動物に被検物質を投与し、前記非ヒト動物におけるアト ピー性皮膚炎様の炎症性皮膚病変の程度を測定'評価する方法であれば特に制限 されず、被検物質の投与は、アトピー性皮膚炎様の炎症性皮膚病変の発症前であつ ても、発症後でもよぐ発症前投与で症状が改善されれば予防薬として、発症後投与 で症状が改善されれば治療薬として有用である。上記アトピー性皮膚炎様の炎症性 皮膚病変の程度を測定'評価する方法としては、眼瞼の浮腫、口唇と顔面の浮腫、 顔面と首、前肢屈曲部位、胸部における湿疹や脱毛、前肢による搔痒行動、顔面の 皮膚が剥離し、滲出、血痂、びらんの有無を目視等により観察する方法を挙げること ができる。
[0021] 以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこ れらの例示に限定されるものではない。
実施例 1
[0022] [TLRZIL— 1R刺激による I κ B— ζの特異的誘導]
IL—1又は LPSによる刺激は、マクロファージ細胞株及び線維芽細胞において I κ B- ζを誘導し、 IL 1Rと LPSの受容体である TLR4は、細胞内シグナル伝達経路 を共有していることから、他の TLRリガンドにも応答して I κ B— ζが誘導されるかどう かを調べた。 IL—1及び LPSに加え、ペプチドダリカン（PGN) (TLR2リガンド）、細 菌性リポタンパク質（BLP) (TLR1ZTLR2リガンド）、フラゲリン (flagellin) (TLR5リ ガンド）、 MALP— 2 (TLR6ZTLR2リガンド）、 R— 848 (TLR7リガンド）、及び CpG DNA (TLR9リガンド）による刺激を受けても I κ B— ζの mRNAは腹腔マクロファー ジ又は肺由来正常細胞で著しく誘導された力 TNF- aによる刺激では誘導は認 められなかった（図 la)。他方、 I κ Bファミリーの別のメンバーである I κ B- α及び B cl— 3は、 TLRリガンドゃ IL—1同様に TNF— aにも応答して誘導された。これらを 総合すると I κ B- α及び Bel— 3と異なり、 I κ B— ζの誘導は TLRZlL— 1Rによる 刺激に対して特異的に認められる。
[0023] 次に、 I κ B— ζの誘導が MyD88依存性又は MyD88非依存性経路によって調節 されるかどうかを調べてみた。 MyD88欠損マウスカゝら得た胚線維芽細胞 (MEFs)で は、 IL— 1及び LPSに応答する Ι κ Β— ζの誘導は完全に欠如していた（図 lb)。従 つて I κ B— ζは、 TLRZIL— 1Rシグナル伝達の MyD88依存性経路における誘導 性タンパク質であることがわ力つた。
実施例 2
[0024] [Ι Κ Β- ζ遺伝子ノックアウトマウス]
TLRZIL— 1R応答における I κ B- ζのインビボでの役割を解明するために、標 的遺伝子破壊法により I κ Β- ζ欠損マウスを作製した。 Ι κ Β- ζの中心部分をコー ドするェキソン 2つをネオマイシン耐性 (neoR)遺伝子に置き換えたターゲッティング ベクターを構築した（図 2a)。胚幹 (ES)細胞で相同的組換えが生じたことがサザンブ ロット分析により確認され、正しくターゲットされた ES細胞を用いて変異対立遺伝子を もつマウスを作製した（図 2b)。ホモ接合型マウスは予想されるメンデルの法則に従つ て生まれた。変異マウスにおける I κ B - ζ mRNAの発現をノーザンブロット分析によ り調べた。 LPSは、野生型細胞で I κ B ζ誘導を刺激したが、 I κ Β ζ欠損細胞 では I κ Β - ζ mRNAは全く認められな力つた（図 2c)。免疫ブロット分析の結果から も、 I κ B— ζ遺伝子が破壊されることにより I κ Β - ζタンパク質の発現が消失するこ とがさらに確認された（図 2d)。 I κ Β— ζ欠損マウスの Βリンパ球及び Τリンパ球は正 常な構成を示していた。しかし、 I κ Β— ζ欠損脾臓細胞では LPS応答性の増殖が 損なわれていたが、 a CD40、 IL 4及び α— IgMに対する応答性は損なわれず (図 2e及び 2f)、 I κ B— ζ欠損細胞で TLR4応答が損なわれることを示唆している。
[0025] さらに、高齢の I κ Β— ζ欠損マウスは全てアトピー性皮膚炎様の炎症性皮膚病変 を呈した（図 6a)。皮膚表現型に関する分析の詳細は数々の文献に記載されて 、る。 実施例 3
[0026] [Ι Κ Β - ζ欠損細胞における免疫応答と I κ B ζ誘導のキネティッタス]
次に、腹腔マクロファージにおける LPSに誘導される炎症関連分子の産生を分析 した。 IFN— y存在下で野生型マクロファージは LPSに応答して TNF— α及び硝 酸ォキシド (NO)を産生した（図 3a)。 Ι κ Β - ζ欠損マウスにおいて LPS誘導性の Τ NF - α及び NOの産生は正常であっても、 IL— 6の産生は著しく減少していた。さら に、 CpG DNA、 R— 848、 PGN、 MALP— 2、 BLP等、別の TLRリガンドに刺激さ れる IL 6の産生もまた I κ B ζ欠損細胞では顕著に阻害されていた（図 3b、 3c、 及び 3d)。また、 I κ B ζ欠損細胞では、 IL 1応答性の IL 6産生の欠如が認め られた。しかし TNF— α誘導性 IL 6産生は、野生型及び I κ Β— ζ欠損細胞の両 方で同程度に観察された（図 3e)。次いで、 LPSに応答する IL— 6mRNAの発現を 調べた。 LPSは、野生型細胞において IL— 6mRNA誘導を刺激した。これとは全く 対照的に、 Ι κ Β - ζ欠損細胞における IL— 6mRNAレベルは劇的に減少しており（ 図 3f)、 I κ B— ζ欠損細胞における IL— 6産生量の減少力 mRNA誘導欠損を反 映して 、る可能性を示して 、る。
[0027] 前記のように、炎症性サイト力イン産生に関与する TLRZIL—1Rを介した MyD88 依存性経路は、 NF- κ B及びマイトジェン活性ィ匕タンパク質 (MAP)キナーゼを活 性化することが知られている力 IL— J¾ 1~5NF— κ B及び MAPキナーゼの 活性ィ匕は、野生型及び I κ B ζ欠損細胞の両方において同程度だった（図 6b及び 図 6c)。次に、完全長 I κ B— ζ又は欠損変異型 I κ Β— ζを、培地又は IL 1で処 理した I κ Β- ζ欠損 MEFsにトランスフエタトした。 IL— 1刺激条件下では、完全長 I κ B— ζは、 I κ B— ζ欠損細胞における IL— 6産生の減少を回復させた力 欠損変 異型 I κ B— ζでは力かる回復は認められず（図 3g)、 NF - κ B及び MAPキナーゼ の活性化同様に I κ B - ζ発現もまた TLRZlL—lを介した IL— 6の産生にとって必 要であることが示唆された。
[0028] 前記のように、 Ι κ Β - ζと IL— 6はいずれも TLRリガンド及び IL 1に対して応答 する誘導遺伝子であることがこれまでに報告されて ヽることから、これら両遺伝子のキ ネテイツタスを測定するため、腹腔マクロファージを用いて経時的ノーザンプロット分 析を行った。 LPS刺激の 30分後に Ι κ B— ζが誘導されていることが観察され、 120 分後に力かる誘導が最大値に到達した。他方 IL— 6mRNAは、 I κ B— ζ又は TNF αの誘導よりさらに後の時点で誘導された（図 3h)。これらの結果を総合すると、 T LRZIL—1Rを介した IL— 6遺伝子の発現には、それに先立って I κ Β— ζが誘導さ れることが必要であることが示唆される。 I κ Β— ζが TLRZIL—1Rを経由するシグ ナル伝達経路における誘導性タンパク質でもあることから、 TLRZIL— 1Rを介した 炎症性 IL 6の産生は少なくとも 2段階で制御されていると考えられる。
実施例 4
[0029] [IL 6プロモーター上の I κ Β- ζの試験管内における分析]
Ι κ Β - ζ力 リガンドに誘導される IL— 6プロモーターの活性ィ匕を促進するかどうか を調べるため、 IL 6又は ELAM1遺伝子のいずれかのプロモーターを有するルシ フェラーゼレポータープラスミドを、対照又は I κ Β - ζ発現ベクターと共に RAW264 . 7細胞に導入した。 LPSは、 IL 6及び ELAM1プロモーター両方の活性を投与 量依存で刺激した。 Ι κ Β - ζが過剰発現する場合、 RAW264. 7細胞において IL 6のプロモーター活性がさらに亢進される力 ELAM1においてはその傾向が認め られな力つたことを見い出した（図 4a)。力かる亢進傾向が非刺激細胞で観察された ことから、 Ι κ Β - の異所性発現が、未刺激 RAW264. 7細胞において IL— 6プロ モーターの活性に正の効果を示す力どうかを調べた。 I κ Β— ζの導入量を増加する ことにより、 IL— 6プロモーターの基礎活性が未刺激細胞においてもアップレギユレ ートされることが観察された (図 4b)。
[0030] 次に、 I κ B— ζの過剰発現の亢進に、 IL 6プロモーターのどの部位が関与して いるかを調べてみた。 IL— 6プロモーターの NF— κ Β結合部位力 活性化に重要な 役割を担っていることが明らかになっているので、野生型レポーター又は NF— κ Β 結合部位が欠損している変異型レポーターを Ρ 19胚性癌細胞にトランスフエタトした（ Proc Natl Acad Sci U S A. 90, 10193-10197(1993))。 I κ B— ζが異所性発現するこ とにより、野生型レポーターが活性ィヒされた。それとは対照的に変異型レポーターを 導入した場合は、 Ι κ Β - ζの過剰発現の効果は完全に消失した（図 4c)。
[0031] IL— 6プロモーターの κ B部位における I κ B— ζの特異的関与を直接調べるため に、 α— I κ Β— ζ、 a— NF— κ Bp50、 a— NF— κ B、 RelAの各抗体及び対照 抗体を用いるクロマチン免疫沈降アツセィ (ChIP)を行った。 LPSで刺激した細胞を a—p50及び α RelAにより免疫沈降した場合、 IL— 6及び ELAM1プロモーターの κ B部位は検出された力 IL— 6遺伝子の 3'末端では認められな力つた。特に、既に 報告（Mol Cell. 9, 625-636 (2002))されているように、非刺激細胞の IL 6 κ Β部位 において ρ50サブユニットは容易に検出された。それとは全く対照的に、 LPS刺激細 胞において IL— 6 κ B部位は、 α—I κ B— ζと免疫共沈降したが、 ELAM1 κ Β部 位においても IL— 6遺伝子の 3'末端においても力かる免疫共沈降は生じず（図 4d)、 IL 6プロモーターにおける I κ B ζの選択的関与が明らかになった。
[0032] 最後に I κ Β - ζと NF— κ Βファミリーメンバーとの会合を検討した。免疫沈降分析 の結果、 I κ Β— ζタンパク質と ρ50との相互作用が認められた力 RelA, RelB、 c— Rel、 p52サブユニットのいずれとも相互作用を生じなかった（図 4e)。これらの知見か ら、 I κ B— ζによる正の効果が ρ50サブユニットとの会合を介してもたらされることが 示された。
実施例 5
[0033] [NF - κ B1欠損マウスにおける TLRZIL— 1Rの応答及び I κ B— ζ欠損細胞の マイクロアレイ分析]
遺伝子学的手法により上記仮説を確認するため、 NF— κ BlZp50欠損マウスか ら腹腔マクロファージ及び MEFsを得て、 LPS誘導性のサイト力イン産生を分析した 。既に報告されているように、 IFN- y存在下において NF— κ Bl欠損マクロファー ジにおける LPS誘導性 TNF— αの産生は、野生型細胞の場合と変化がな力つた。 他方、 NF— κ B1欠損細胞では、 LPSに応答する IL 6産生が損なわれていた（ Cell. 80, 321-330 (1995), Proc Natl Acad Sci U S A. 97, 12705-12710 (2000)、及び 図 5a)。また、 1しー1ゃ他の丁0^リガンドに誘導される1しー6産生は、 NF— κ Bl欠 損細胞で著しく損なわれていた（図 5b)。結果的に、 NF— κ ΒΙ欠損マウスにおける TLRZIL—1Rを介した応答は、 Ι κ Β - ζ欠損マウスにおける応答を想起させるも のであった。
[0034] さらに、 NF- κ B1欠損細胞において I κ Β— ζの異所性発現が IL 6の産生を誘 導するかどうかを試験した。野生型細胞と比較して、 I κ B— ζを介した IL— 6の産生 は NF— κ B1欠損 MEFsでは減少しており、 NF— κ Bl力 κ B— ζの効果を発揮 する際に重要な役割を果たしていることが示唆される（図 5c)。 IL— 1及び TNF— a による刺激のいずれも、 NF- κ B及び MAPキナーゼ等、類似のシグナル伝達分子 セットの活性ィ匕をもたらし、 IL— 6が発現される。しかし、 IL— 1ZTLRリガンドを経由 するシグナル伝達は、 I κ B— ζを IL 6プロモーターに特異的に補充する力 TNF aを経由するシグナル伝達にはそのような補充は認められず（図 5d)、 TLR/IL 1Rと TNFRの応答性の間にみられる差異が説明できると推察される。
[0035] 次に、マイクロアレイ分析により、 Ι κ Β - ζによって調節される他の LPS誘導性遺 伝子を検索した。 Ι κ Β- ζの欠損により、多数の LPS誘導性遺伝子が顕著な影響を 受けて!/、た（図 7a)。次にそれら遺伝子の 、くつかをノーザンプロット分析にかけて精 度を確認した。それら遺伝子の中で、 LPSに誘導された GM— CSF、 IL— 12p40、 G— CSF、 C/EBP - δ及びエンドセリン 1の発現は、 I κ Β— ζ欠損マクロファージ では減少しており（図 5e)、 IL— 6に加え、 Ι κ Β- ζが上記遺伝子の発現を調節して いることを示している。実際、経時的ノーザンプロット分析の結果からは、 LPSに応答 する上記遺伝子の誘導に関する動態は、 TNF—ひよりむしろ IL— 6のキネティックス に似ていることが示され（図 3h及び図 7b)、 TLRZIL— 1Rシグナル伝達経路におけ る上記遺伝子の少なくとも 2段階ある調節モデルをさらに支持している。
[0036] 最後に、 Ι κ Β - ζの要件が、試験した遺伝子の κ Β部位の配列と相関しているか どうかを調べた。しかし、プロモーターに別々の κ Β部位が含まれ、相当する κ Β部 位の配列間に共通の特徴がある力識別することができず（図 7c)、特定プロモーター 上で機能する I κ B— ζの能力は、 NF— κ Βの能力同様に、恐らぐ κ Β部位におけ る DNA タンパク質相互作用によってのみ決まる訳ではなぐ隣接塩基配列と結合 又は相互作用する他の転写因子又はコアクチベータ一によつても決定されると考え られる（EMBO J. 22, 5530-5539 (2003))。さらに、それらの中で IL— 6プロモーター の κ Β部位と最大の相同性を示す I κ Β - ζプロモーターの κ Β部位にも関わらず（ 図 7c)、 LPS誘導性の I κ B— ζ mRNAの発現は通常 NF— κ B1欠損細胞で観察 され（図 7d)、 LPSに応答する I κ B- ζ自体の調節が、 IL— 6の調節とは異なること が示唆される。
[0037] 本発明にお ヽて、 I κ Β— ζが TLRZIL— 1Rを介した免疫応答に重要な役割を果 たしていることの遺伝学的証拠を示した。特に TLRZIL— 1Rを介した IL— 6産生の 場合には、その適切な産生のためには、 NF- κ B及び MAPキナーゼの活性化同 様に、 Ι κ Β - ζが先行して発現することが必要であると考えられる。 Ι κ Β - ζ自体が 誘導性タンパク質であることから、 TLRZIL— 1Rを介した IL— 6発現は、 2段階の機 構で調節されている可能性がある。また、マイクロアレイ分析の結果から、 Ι κ Β - ζ が IL 6以外の LPS誘導性遺伝子を制御している可能性が示された。 I κ B— ζ依 存性遺伝子発現の分子的基礎を解明する分析をさらに行うことにより、 TLRZIL— 1 Rを介した MyD88依存性免疫応答に関する新たな知見が期待される。
実施例 6
[0038] [方法]
( 1) 1 κ Β— ζ欠損マウスの作製
129ZSVマウスゲノムライブラリーから I κ Β- ζ遺伝子を有するゲノム DNAを単 離し、制限酵素マッピング及び配列分析により特徴付けを行った。 Ι κ Β- ζの中心 部分をコードする 2. Okb断片を neoRカセットに置き換えることにより、ターゲッティン グベクターを構築し、負の選択を行うために上記ゲノム断片中の pGKプロモーター によって転写される単純へルぺスウィルスチミジンキナーゼを揷入した（図 2a)。この ターゲッティングベクターを胚性幹細胞（E14. 1)にトランスフエタトした。 G418とガン シクロビアに二重に耐性をもつコロニーを選択し、 PCR及びサザンブロッテイングによ るスクリーニングを行った。 2つの異なる相同組換え体を C57BLZ6雌マウスにマイク 口インジェクションし、ヘテロ接合体 F1世代を交配させて I κ B— ζ欠損マウスを得た 。これら異なるクローン力も得られたマウスは同じ表現型を示した。 6〜8週齢の Ι κ Β ζ欠損マウス及びそれらの同腹野生型を本発明の実験に用いた。全ての動物実 験は、微生物病研究所付属実験動物研究委員会 (大阪大学、大阪、 日本)の承認を 得て実施した。
[0039] (2)試薬及びマウス
サルモネラ菌（Salmonella Minnesota Re 595)由来の LPSと黄色ブドウ球菌 (S.aureus)由来の PGNは、それぞれ Sigma社と Fluka社から購入した。 MALP— 2及 び CpGオリゴデォキシヌクレオチドは文献 (J Immunol. 164, 554-557 (2000), Nature. 408, 740-745 (2000))記載の方法に従って調製した。フラゲリン及び R— 848はそれ ぞれ A. Adrem博士及び H. Tomizawa博士力も提供を受けた。 I κ B— ζに対するポリ クローナル抗体は、細菌で発現させたマウス I κ Β— ζタンパク質の C末端部分を用 いてゥサギを免疫して得た。リン酸ィ匕 ERK、 JNK及び p38に対する各抗体は Cell Signaling社から購入した。 ERK：、 JNK、 p38、 RelA、 p50、 c— Rel及び C/EBP— βのそれぞれに対する抗体は Santa Cruz社から入手した。組換え TNF— α及び IL —1 13は Genzyme社から入手した。 NF— κ BlZp50欠損マウス又は MyD88欠損 マウスは文献（Cell. 80, 321-330 (1995), Proc Natl Acad Sci U S A. 89, 1473-1476 (1992))記載の方法に従って調製した。
[0040] (3)炎症性サイト力イン濃度及び NOの測定
チォグリコール酸に誘導される腹腔マクロファージ又は MEFsを 96ゥエルプレート（ マクロファージは 1ゥエルあたり 5 X 104細胞、 MEFsは 1 X 104細胞）において所定濃 度の所定リガンド共存下で培養した。製造者マニュアルに従って ELISAを行い、培 養上清の TNF— α及び IL— 6の濃度を測定した (TNF— aには Genzyme社製、 IL —6には R&D社製)。 NO濃度は製造者 (DOJINDO)の指示に従い、 Griess法により 測定した。
[0041] (4)電気泳動移動度シフトアツセィ
lOng ml—1の IL— 1 βで MEFs ( 1 X 106)を所定期間刺激した。文献（Nature. 408, 740-745 (2000))記載の方法に従い、細胞から核抽出物を精製し、 NF— κ Βの DN Α結合部位に対する特異的プローブの共存下でインキュベートし、電気泳動にかけ、 オートラジオグラフィ一で視覚化した。
[0042] (5)プラスミド及びレトロウイルストランスフエクシヨン
レポータープラスミドは、マウス IL— 6遺伝子の 5'フランキング領域（一 1240Z+4 0)で構成され、図 4a及び 4bで使用した。図 4cで用いたレポータープラスミドは文献 収載のものである（Proc Natl Acad Sci U S A. 90, 10193—10197(1993), Proc Natl Acad Sci U S A. 89, 1473-1476 (1992))。 ELAM1プロモーター由来ルシフェラーゼ レポータープラスミドは、 D. T. Golenbockから譲られたものである。完全長 I κ B— ζ ( Full)又は C末端部位を欠く欠失変異型 I κ B— ζ ( A C、 J Biol Chem. 276,
27657-27662 (2001))を文献収載の方法どおりにして pMRXレトロウイルスベクターに クロー-ングした (J Biol Chem. 278, 36005-36012 (2003))。 Plat— Eパッケージング 細胞は、 T. Kitamura博士の厚意で提供を受けた（Gene Ther. 7, 1063-1066 (2000)) 。要点を述べると、レトロウイルスを作出するために、リボフヱクタミン 2000試薬（ Invitrogen社製）を用いて Plat— E細胞にトランスフエタトし、トランスフエクシヨンの 60 時間後にレトロウイルスを含む Plat— E細胞の培養上清を回収した。 4 gZmlのポリ プレン存在下で MEFsを 6時間感染させ、感染 48時間後に分析した。
[0043] (6)ルシフェラーゼレポーターアツセィ
SUPERFECTトランスフエクシヨン試薬（QIAGEN社製）を用い、レポータープラスミド を対照又は I κ B— ζ発現ベクターのいずれ力と共に RAW264. 7及び P19細胞に 一過性に共トランスフエタトした。文献記載（28, 29)の方法に従い、全細胞溶解物の ノレシフェラーゼ活'性をデュアノレノレシフェラーゼレポーターアツセィシステム（Promega 社製、 Maiden, W1)を用いて測定した（Nat Immunol. 3, 392-398 (2002), Nat Immunol. 2, 835-841 (2001))。 [0044] (7)クロマチン免疫沈降（ChIPアツセィ）
ChIPアツセィは基本的に説明書にあるプロトコール（Upstate Biotechnology社製） に則って行った。概要を述べると、 LPS (1 μ g ml 3時間）、 IL— 1 18 (lOng ml 3時間）又は TNF— a (lOng ml 3時間）で、 2 X 106個の RAW264. 7細胞又は 5 X 105個の MEFsをそれぞれ刺激し、ホルムアルデヒドを用い、 37°Cで 60分間固 定した。これらの細胞を溶解し、超音波処理にかけて分断 (sheared)し、特異的抗体 共存下でー晚インキュベーションし、続いて鮭精子 DNA (Upstate Biotechnology社 製）で飽和したプロテイン Aァガロースの共存下でインキュベーションした。沈殿 DN Aを以下のプライマーを用いて定量 PCR (35〜40サイクノレ）で分析した。
[0045] 定量 PCRに使用したプライマー；
IL 6プロモーターの κ B部位には、
5'- CGATGCTAAACGACGTCACATTGTGCA- 3' (配列番号 1)
及び 5'- CTCCAGAGCAGAATGAGCTACAGACAT- 3' (配列番号 2)
IL— 6プロモーターの 3'遺伝子セグメントには、
5'- GCAGATGGACTTAGCTCGTCTCATTCA -3' (配列番号 3)
及び 5'- CCACTCCTTCTGTGACTCCAGCTTATC -3' (配列番号 4)
ELAM1プロモーターの κ B部位には、
5'- GATGCAGTTGAGAATTTCCTCTTAGCC- 3' (配列番号 5)
及び 5'- TGGAATAGTTGTTCTGGCGTTGGATCC- 3' (配列番号 6)
[0046] (8)ウェスタンブロット分析及び免疫沈降
腹腔マクロファージ及び MEFsを所定リガンドで所定期間刺激した。 1. 0%Nonidet P40、 150mM NaCl、 20mM Tris— Cl (pH7. 5)、 5mM EDTA及び蛋白質阻 害物質 (Roche社製)を含む溶解緩衝液に上記細胞を溶解した。この細胞溶解物を S DS— PAGEにより溶解し、 PVDF膜上に移した。免疫沈降を行うため、細胞溶解物 をプロテイン Gセファロース TM (Amersham Pharmacia Biotech社製）で 2時間前処理（ preclear)し、所定抗体 1. 0 gを含むプロテイン Gセファロース TM共存下において 4 °Cで 12時間攪拌下でインキュベーションした。免疫沈降物を溶解緩衝液で 4回洗浄 し、 Laemmliサンプル緩衝液を用いて沸騰溶出し、 α -Ι κ Β- ζを用い、上述のとお [0047] (9)遺伝子チップ分析
野生型腹腔マクロファージ及び I κ B— ζ欠損腹腔マクロファージを用い、 LPSに 応答するマイクロアレイ分析 (Affimetrix社製）を文献収載の方法 (Blood. 102, 4123-4129 (2003))に従って行った。 GeneSpring6.0 (Silicon Genetics社製）ソフトゥェ ァを使用して遺伝子発現のカラー画像を作成した。
産業上の利用可能性
[0048] 本発明によると、 TLRや IL 1Rシグナル伝達経路における遺伝子発現は従来考 えられてきた NF— κ Bや AP—1の活性ィ匕という一段階しかないという考え（1段階発 現制御）ではなぐ Ι κ Β- ζの事前の発現誘導というさらなる一段階必要不可欠であ ると 、う「TLRや IL— 1Rシグナル応答における 2段階 (多段階)発現制御」 、う新た な概念が提起され (図 8参照）、 TLRZIL— 1Rによる多段階遺伝子発現制御機構を 解明することが可能となる。また、 Ι κ Β- ζ欠損マウスはアトピー性皮膚炎様症状を 呈することから、今後その局所における病理学的な解析と遺伝子発現制御の詳細な 解析とが融合することにより、これまで原因不明であった難治性疾患に対する新たな 治療戦略の構築に結実することが期待される。

Claims

請求の範囲
[1] Ι κ Β- ζをコードする非ヒト動物の内在性遺伝子の全部又は一部が破壊 '欠損'置 換等の遺伝子変異により不活性化され、 Ι κ Β- ζを発現する機能を喪失し、 TLRリ ガンド及び IL - 1に応答する IL - 6の産生が障害されて!ヽることを特徴とする TLRリ ガンド及び IL 1不応答性モデル非ヒト動物。
[2] TLRリガンドが、 LPS, BLP、 PGN、 MALP— 2、 R— 848又は CpG D
NAであることを特徴とする請求項 1記載の TLRリガンド及び IL 1不応答性モデル 非ヒト動物。
[3] アトピー性皮膚炎様の炎症性皮膚病変を呈することを特徴とする請求項 1又は 2記載 の TLRリガンド及び IL 1不応答性モデル非ヒト動物。
[4] 非ヒト動物がマウスであることを特徴とする請求項 1〜3のいずれか記載の TLRリガン ド及び IL 1不応答性モデル非ヒト動物。
[5] 請求項 1〜4のいずれかに記載の非ヒト動物と、被検物質と、 TLRリガンド若しくは IL
- 1又はこれらの含有物とを用いて、前記非ヒト動物における TLRリガンド若しくは IL 1又はこれらの含有物に応答する IL 6の産生の程度を測定'評価することを特徴 とする TLRリガンド若しくは IL 1又はこれらの含有物に対する応答の促進物質又は 抑制物質のスクリーニング方法。
[6] 請求項 1〜4のいずれか記載の非ヒト動物に由来する免疫細胞と、被検物質と、 TLR リガンド若しくは IL 1又はこれらの含有物とを用いて、前記免疫細胞における TLR リガンド若しくは IL 1又はこれらの含有物に応答する IL 6の産生の程度を測定- 評価することを特徴とする TLRリガンド若しくは IL 1又はこれらの含有物に対する 応答の促進物質又は抑制物質のスクリーニング方法。
[7] 請求項 1〜4のいずれかに記載の非ヒト動物に被検物質を投与し、前記非ヒト動物に おけるアトピー性皮膚炎様の炎症性皮膚病変の程度を測定'評価することを特徴と するアトピー性皮膚炎様の炎症性皮膚病変の予防'治療薬のスクリーニング方法。
PCT/JP2005/007304 2004-04-20 2005-04-15 Ｔｌｒリガンド及びｉｌ－１応答障害性モデル動物 WO2005102040A1 (ja)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US11/587,154 US20090158447A1 (en) 2004-04-20 2005-04-15 TLR ligand and IL-1 Response-Injured Animal Model
CA002563614A CA2563614A1 (en) 2004-04-20 2005-04-15 Tlr ligand and il-1 response-injured animal model
AU2005235182A AU2005235182B2 (en) 2004-04-20 2005-04-15 TLR ligand and IL-1 response-injured animal model
EP05730565A EP1738643A4 (en) 2004-04-20 2005-04-15 ANIMAL MODEL HAVING RESPONSE TO TLR LIGAND AND ILLEGED IL-1

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2004-124758 2004-04-20
JP2004124758A JP2005304365A (ja) 2004-04-20 2004-04-20 Ｔｌｒリガンド及びｉｌ−１応答障害性モデル動物

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2005102040A1 true WO2005102040A1 (ja) 2005-11-03

Family

ID=35196650

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2005/007304 WO2005102040A1 (ja) 2004-04-20 2005-04-15 Ｔｌｒリガンド及びｉｌ－１応答障害性モデル動物

Country Status (6)

Country Link
US (1) US20090158447A1 (ja)
EP (1) EP1738643A4 (ja)
JP (1) JP2005304365A (ja)
AU (1) AU2005235182B2 (ja)
CA (1) CA2563614A1 (ja)
WO (1) WO2005102040A1 (ja)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007050531A2 (en) * 2005-10-25 2007-05-03 Janssen Pharmaceutica N.V. Diagnostic application of mail
US7629135B2 (en) 2006-12-22 2009-12-08 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Toll-like receptor agonists and antagonists and methods of use thereof

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2431291T3 (es) 2006-01-10 2013-11-25 Colgate-Palmolive Company Métodos para modular receptores de superficie celular para prevenir o reducir la inflamación

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP4381138B2 (ja) * 2001-07-12 2009-12-09 大鵬薬品工業株式会社 Ｉｌ−１８遺伝子導入動物

Non-Patent Citations (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HARUTA H ET AL: "Isolation of a novel interleukin-1-inducible nuclear protein bearing ankyrin-repeat motifs.", J BIOL CHEM., vol. 276, no. 16, 2001, pages 12485 - 12488, XP002996620 *
HUBER M A ET AL: "The IKK-2/Ikappa Balpha /NF-kappa B pathway plays a key role in the regulation of CCR3 and eotaxin-1 in fibroblasts. A critical link to dermatitis in Ikappa Balpha -deficient mice.", J BIOL CHEM., vol. 277, no. 2, 2002, pages 1268 - 1275, XP002996624 *
KANEHIRA K ET AL: "Atarashii IkB Family Protein MAIL no Dotei to Hatsugen. Kino Kaiseki.", VETERINARY BIOCHEMISTRY., vol. 38, no. 2, 2001, pages 19 - 25, XP002996619 *
KITAMURA H ET AL: "Bacterial lipopolysaccharide induces mRNA expression of an IkappaB MAIL through toll-like receptor 4.", J VET MED SCI., vol. 64, no. 5, 2002, pages 419 - 422, XP002996626 *
KITAMURA H ET AL: "Bacterial lipopolysaccharide-induced expression of the IkappaB protein MAIL in B-lymphocytes and macrophages.", ARCH HISTOL CYTOL., vol. 66, no. 1, 2003, pages 53 - 62, XP002996625 *
KITAMURA H ET AL: "MAIL, a novel nuclear I kappa B protein that potentiates LPS-induced IL-6 production.", FEBS LETT., vol. 485, no. 1, 2000, pages 53 - 56, XP004337768 *
KLEMENT J F ET AL: "IkappaBalpha deficiency results in a sustained NF-kappaB response and severe widespread dermatitis in mice.", MOL CELL BIOL., vol. 16, no. 5, 1996, pages 2341 - 2349, XP002996623 *
MEMET S ET AL: "IkappaBepsilon-Deficient Mice: Reduction of One T Cell Precursor Subspecies and Enhanced Ig Isotype Switching and Cytokine Synthesis.", J IMMUNOL., vol. 163, no. 11, 1999, pages 5994 - 6005, XP002996622 *
See also references of EP1738643A4 *
SHIINA T ET AL: "Targeted disruption of MAIL, a nuclear IkappaB protein, leads to severe atopic dermatitis-like disease.", J BIOL CHEM., vol. 279, no. 53, 2004, pages 55493 - 55498, XP002996627 *
YAMAZAKI S ET AL: "A novel IkappaB protein, IkappaB-zeta, induced by proinflammatory stimuli, negatively regulates nuclear factor-kappaB in the nuclei.", J BIOL CHEM., vol. 276, no. 29, 2001, pages 27657 - 27662, XP002996621 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007050531A2 (en) * 2005-10-25 2007-05-03 Janssen Pharmaceutica N.V. Diagnostic application of mail
WO2007050531A3 (en) * 2005-10-25 2007-09-27 Janssen Pharmaceutica Nv Diagnostic application of mail
US7432343B2 (en) 2005-10-25 2008-10-07 Janssen Pharmaceutica N.V. Diagnostic application of mail
US7629135B2 (en) 2006-12-22 2009-12-08 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Toll-like receptor agonists and antagonists and methods of use thereof

Also Published As

Publication number Publication date
CA2563614A1 (en) 2005-11-03
AU2005235182B2 (en) 2008-04-10
AU2005235182A1 (en) 2005-11-03
JP2005304365A (ja) 2005-11-04
EP1738643A4 (en) 2009-10-28
US20090158447A1 (en) 2009-06-18
EP1738643A1 (en) 2007-01-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Kalis et al. Toll‐like receptor 4 expression levels determine the degree of LPS‐susceptibility in mice
Yamamoto et al. Enhanced TLR-mediated NF-IL6–dependent gene expression by Trib1 deficiency
Mémet et al. IκBε-deficient mice: reduction of one T cell precursor subspecies and enhanced Ig isotype switching and cytokine synthesis
Weaver et al. ABIN-3: a molecular basis for species divergence in interleukin-10-induced anti-inflammatory actions
Persky et al. IL-12, but not IFN-α, promotes STAT4 activation and Th1 development in murine CD4+ T cells expressing a chimeric murine/human Stat2 gene
Xiao et al. The Tpl2 mutation Sluggish impairs type I IFN production and increases susceptibility to group B streptococcal disease
WO2005102040A1 (ja) Ｔｌｒリガンド及びｉｌ－１応答障害性モデル動物
Pattison et al. Loss of Mef2D function enhances TLR induced IL-10 production in macrophages
EP1302541B1 (en) Method for recognizing bacterial DNA
EP1459727B1 (en) Nonhuman model animal unresponsive to immunopotentiating synthetic compound
Wu et al. Targeted disruption of Rab1a causes early embryonic lethality
JP3740094B2 (ja) マイコバクテリア由来リポタンパク／リポペプチド不応答性モデル動物
JP4100595B2 (ja) マイコプラズマ由来リポタンパク／リポペプチド不応答性モデル非ヒト動物
JP4236692B2 (ja) マイコプラズマ由来リポタンパク／リポペプチド不応答性モデル非ヒト動物
EP1680959B1 (en) Mouse model wherein responsiveness to lipopolysaccharide (lps) is specifically impaired
JP4493336B6 (ja) 免疫賦活化作用を有する合成化合物不応答性モデル非ヒト動物
WO2005045064A1 (ja) Ｔｂｋ１ノックアウトマウスを用いたスクリーニング方法
CN115043929A (zh) Vsig4基因人源化非人动物的构建方法及应用
WO2007144974A1 (ja) 自己免疫性非ヒト動物及びそれを用いたスクリ－ニング方法

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AE AG AL AM AT AU AZ BA BB BG BR BW BY BZ CA CH CN CO CR CU CZ DE DK DM DZ EC EE EG ES FI GB GD GE GH GM HR HU ID IL IN IS KE KG KM KP KR KZ LC LK LR LS LT LU LV MA MD MG MK MN MW MX MZ NA NI NO NZ OM PG PH PL PT RO RU SC SD SE SG SK SL SM SY TJ TM TN TR TT TZ UA UG US UZ VC VN YU ZA ZM ZW

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): GM KE LS MW MZ NA SD SL SZ TZ UG ZM ZW AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HU IE IS IT LT LU MC NL PL PT RO SE SI SK TR BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW ML MR NE SN TD TG

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2563614

Country of ref document: CA

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2005235182

Country of ref document: AU

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWW Wipo information: withdrawn in national office

Country of ref document: DE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2005730565

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 11587154

Country of ref document: US

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 2005730565

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2005235182

Country of ref document: AU

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 2005235182

Country of ref document: AU