WO2005045064A1 - Ｔｂｋ１ノックアウトマウスを用いたスクリーニング方法 - Google Patents

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Definitions

  • the present invention relates to the use of a TANK-binding kinase 1 (TBK1) knockout mouse or a tissue or a cell derived from the knockout mouse to stimulate lipopolysaccharide (LPS) and to stimulate interferon ⁇ (IFN-
  • TTK1 TANK-binding kinase 1
  • LPS lipopolysaccharide
  • 8 interferon ⁇
  • Toll-like receptors are essential for recognizing the invasion of pathogens, and are known to play an important link between innate immunity and adaptive immunity (eg, Rev. Immunol. 20: 197-216, 2002, Annu. Rev. Immunol. 21: 335-376, 2003).
  • TLRs are triacylated lipopeptides recognized by TLR1ZTLR2 heterodimer, diacylated lipopeptides recognized by TLR2ZTLR6 heterodimer, lipopolysaccharide (LPS) recognized by TLR4, and duplexes recognized by TLR3
  • Various bacterial components such as RNA (dsRNA), flagellin which also obtained the flagellar power of bacteria recognized by TLR5, and bacterial DNA including non-methylated CpG motif recognized by TLR9 can be recognized.
  • dsRNA RNA
  • flagellin flagellin which also obtained the flagellar power of bacteria recognized by TLR5
  • bacterial DNA including non-methylated CpG motif recognized by TLR9 can be recognized.
  • the cytoplasmic region of each TLR contains a TollZlL-1 receptor (TIR) domain that is common to both the TLR and IL1 receptor families.
  • TIR TollZlL-1 receptor
  • MyD88 is a cytoplasmic molecule containing both TIR and death domains and functions as an adapter protein for the TLR receptor family and the IL1 receptor family.
  • the TIR domain of MyD88 is required for forming a complex between a receptor containing the TIR domain and an adapter molecule.
  • the death domain mediates the interaction with other death domain-containing molecules such as IRAKI and IRAK4.
  • MyD88 deficiency in response to almost all TLR ligands, results in impaired production of pro-inflammatory cytokins, but with dsRNA ( TLR3 ligand) and LPS (TLR4 ligand) induce the activation of interferon regulator (IRF) -3, causing MyD88-independent production of IFN-18 (eg, J. Immunol. 167: 5887-). 5894, 2001, Int. Immunol. 14: 1225-1231, 2002, Nature Immunol. 3: 392-8, 2002, J. Immunol. 169: 6668-6672, 2002).
  • IRF interferon regulator
  • IFN-18 is controlled by the expression of NF- ⁇ B, ATF-2 / c-Jun, and IRF-3 and IRF-7 (for example, Annu. Rev. Microbiol. 55: 255-81, 2001, Curr. Opin. Infect. Dis. 15: 259-267, 2002, Curr. Opin. Immunol. 14: 111-116, 2002).
  • IRF-3 and IRF-7 are strongly induced in an autocrine positive feedback fashion (see, eg, Curr. Opin. Immunol. 14: 111-116, 2002, Curr Opin Immunol. 15: 52-58, 2003).
  • IRF-3 is localized in the cytoplasm of uninfected cells. Following viral infection, IRF-3 phosphorylates at multiple serine Z threonine residues located at the C-terminal end. The phosphorylated IRF-3 forms a homodimer that translocates into the nucleus, and the IRF-binding element / IFN-stimulated response element (IRF-E / ISRE) Activates a promoter containing the IRF binding site called
  • IKK I ⁇ B kinase
  • IKKi inducible IKK
  • TBK1 NF- ⁇ activating kinase
  • TNF tumor necrosis factor
  • TRF tumor necrosis factor receptor-related factor
  • T2K tumor necrosis factor receptor associated factor
  • IKK-related kinases are thought to be involved in the activation of NF- ⁇ .
  • two research groups have shown that ⁇ i and TBK1 phosphorylate and activate IRF-3 and IRF-7, as well as IFN-j8, RANTES (Regulated on activation) in viral infection as well as the T RIF-dependent signaling pathway. , normal T cell expressed and secreted) and ISG54 (see, for example, Science. 300: 1148-1151, 2003, Nature Immunol. 4: 491-496, 2003).
  • TBK1 (T2K) knockout mice may die around embryonic day 14.5 (E14.5), and double knockout mice of TBK1 (T2K) and TNF may grow similarly to wild-type mice. It is known (see EMBO J. 19: 4976-4985, 2000).
  • lipopolysaccharide (LPS) also known as endotoxin, which exists mainly as an outer membrane component of Gram-negative bacteria, as ligand recognized by TLR4, and lipopolysaccharide, a cell wall component of Gram-positive bacteria, Poticoic acid (LTA), lysate of Mycobacterium tuberculosis, gram-positive bacterial cell wall fraction, etc. are known (Immunity. 11: 443-451, 1999, Int. Immunol. 12:
  • An object of the present invention is to provide a TBK1 knockout mouse or a tissue or cell derived from the knockout mouse, which is used to promote the induction of an antiviral protein such as IFN-18 against LPS stimulation and Z or virus infection. To provide a screening method.
  • the present inventors have studied the physiological role of IKKi and TBK1 by gene targeting.
  • IKK i-cells showed normal gene induction in response to LPS.
  • penile cells induction of the force proinflammatory site force-in mRNA, which showed that the expression of IFN-18 was impaired, was normal.
  • activation of NF- ⁇ B was induced by both mutants, EF, but not in penile cells, ISRE binding activity.
  • expression of IFN-18 and the IFN-inducible gene was severely impaired in the virus-infected pancreatic cells.
  • the present invention relates to (1) a mouse in which part or all of the TANK-binding kinase 1 (TBK1) gene on the chromosome is deleted and the function of expressing TBK1 expressed in a wild type is lost, or Using the mouse-derived tissue or cell, a test substance, a ligand recognized by TLR4, or a substance containing the same, a ligand recognized by TLR4 in the mouse or tissue or cell derived from the mouse, or a ligand thereof.
  • the present invention relates to a method of screening for a ligand recognized by TLR4 or a substance that promotes a response to these components, which comprises measuring and evaluating the degree of response to the components.
  • the present invention also relates to (2) performing a 'comparison with a littermate wild-type mouse as a control' for the evaluation of the degree of response to ligands recognized by TLR4 or the contents thereof.
  • a screening method for a substance promoting response (3) a mouse-derived cell force TBK1 knockout mouse-derived embryonic fibroblast, or a ligand recognized by TLR4 according to (1) or (2), or (1)
  • LPS lipopolysaccharide
  • the present invention relates to a method of screening for a ligand recognized by the described TLR4 or a substance that promotes a response to a substance containing these ligands.
  • the present invention provides (6) a method for screening a substance which promotes a response to a ligand recognized by TLR4 or a substance containing these ligands, which is described in (5), which is an antiviral protein interferon (IFN-j8); (7) Antiviral protein activity ISG54, IP-10 or IRG1; (5) the method for screening for a ligand recognized by TLR4 or a substance that promotes response to a substance containing these, as described in (5);
  • the viral proteins are Mx2, IRF-7, interferon-inducible GTPase, and ISG15, and the method of (5) for screening a ligand recognized by TLR4 or a substance that promotes a response to these components, 9)
  • the degree of induction of ISRE binding activity to LPS stimulation is measured and evaluated, and the ligands recognized by TLR4 described in (4) or contents thereof are A screening method for a substance promoting response, (10) a ligand recognized by TLR4 or
  • the screening methods for substances that enhance the response to these components, and (13) that the antiviral protein against viral infection is ISG54, IP-10, IRG1, or RANTES
  • the features (11) TLR4 according ligand recognized or these The present invention relates to a method for screening a substance that enhances a response to inclusions.
  • FIG. 1 is a diagram relating to the production of IKK i-mice and penmice.
  • RNAdO / zg Thioglycolic acid-induced peritoneal cells, which were also obtained from wild-type and mosquito mice, were stimulated with 100 ng / ml LPS for the indicated times.
  • the total RNAdO / zg) was subjected to electrophoresis, transferred to a nylon membrane, and hybridized using a NKK-terminal fragment of IKKi, a region from which the IKKi gene had been removed in a targeting construct, or a TBK1 cDNA fragment as a probe.
  • the same membrane was rehybridized using the j8-actin probe.
  • (D) shows the results of IFN-j8 promoter reporter Atsushi.
  • HEK293 cells were transiently co-transfected with the indicated expression vector and IFN- ⁇ luciferase reporter vector. 36 hours after transfection, luciferase activity in whole cell lysates was measured.
  • E shows the structure of the TBK1 gene, targeting vector and predicted mutant alleles.
  • Wild type EF and pen EF RNA was extracted, stimulated with 1.O / z gZml of LPS for the indicated times, electrophoresed, transferred to a nylon membrane, and hybridized using an IKKi or TBK1 cDNA fragment as a probe. The same membrane was again hybridized using the j8-actin probe.
  • FIG. 2 is a graph showing impaired induction of IFN- ⁇ and IFN-inducible genes, which is not seen in IKKi-Ion EF, which is found in pen EF stimulated with LPS.
  • A shows IL-6 production by EF ⁇ . Wild-type EF, IKK i- EF (upper) or pen EF (lower) were stimulated with 1 OngZml of TNF-o; lOngZml of IL-1 ⁇ , lOOngZml of BLP or the indicated LPS concentration for 24 hours. . The concentration of IL 6 in the culture supernatant was measured by ELISA. Data are presented as averager SD.
  • B shows the EF gene induction stimulated with LPS.
  • Wild-type, IKK pan (left) or pan (right) were stimulated with 1.0 g LPS for the indicated times. Total RNA was extracted and Northern blot analysis of the indicated genes was performed.
  • C shows the results of microarray analysis of EF stimulated with LPS. Wild-type EF and TB K17-EF were stimulated with LPS and RNA was collected at the indicated times and used for microarray analysis. For Genespring software, make sure that the expression is absolute. The color code of the signal intensity is shown on the left.
  • FIG. 3 is a view showing the necessity of TBK1 for ISRE binding and IFN- ⁇ promoter activity induced by LPS.
  • Pen is a diagram showing the failure of ISRE binding in EF. Wild-type EF, IKK i7-EF, or pen EF were stimulated with 0.1 gZml of LPS for the indicated times, and NF- ⁇ B binding (right) and ISRE binding activity (left) were determined by EMSA.
  • B shows the results of recovery of IFN-jS promoter activity in pen EF by expression of TBK1.
  • TBK1 + / + (WT) or TBK17-EF was cotransfected with human TBK1 (hTBKl) and IFN-jS promoter luciferase promoter. Twenty-four hours after transfection, the vigorous cells were stimulated with LPS for another 12 hours (LPS stim.) Or not (unstim.) Before luciferase activity was measured.
  • FIG. 4 is a view showing the necessity of TBK1 for IFN-induced gene expression of virus-sensitive EF.
  • A shows the results of Northern blot analysis in which wild-type EF, IKK i-EF and TBKr / -EF were infected with recombinant VSV or Se V for the time indicated, and total RNA was extracted. .
  • B Nuclear translocation of IRF-3 and NF- ⁇ Bp65 in response to VSV infection
  • FIG. ES was infected with recombinant VSV for the time indicated, nuclear proteins were extracted, separated by SDS-PAGE, and blotted with anti-IRF-3 and NF- ⁇ 65 antibodies.
  • the screening method of the substance for promoting the stimulation of LPS and the induction of an antiviral protein against ⁇ or viral infection includes a method in which part or all of the TBK1 gene on the chromosome is deleted and expressed in the wild type. Using a mouse or a tissue or cell derived from the mouse, a test substance, LPS and Z or a virus, the mouse or a tissue or cell derived from the mouse is lost.
  • the above-mentioned mice are not particularly limited as long as they are methods for measuring and evaluating the degree of induction of antiviral proteins against LPS stimulation and Z or virus infection. Examples of the above mice include TBK1 knockout mouse ⁇ and TBKl 'TNF double knockout mouse.
  • mice that grow similarly to wild-type mice are preferred.
  • the mouse-derived tissue include spleen, lymph node, bone marrow, lung, and the like.
  • Examples of the mouse-derived cell include embryonic fibroblasts (EF), macrophages, splenocytes, and dendrites. Cells, lung fibroblasts and the like. Since TBK1 knockout mice die around embryonic day 14.5 (E14.5), culturable immortalized cells such as embryonic fibroblasts are preferred as cells derived from TBK1 knockout mice.
  • E14.5 embryonic day 14.5
  • the TBK1 knockout mouse can be produced, for example, as follows.
  • the TBK1 gene can be obtained by amplifying a mouse gene library by PCR or the like, and screening the obtained gene fragment using a probe derived from the mouse TBK1 gene.
  • the screened TBK1 gene can be subcloned using a plasmid vector or the like, and identified by restriction enzyme mapping and DNA sequencing.
  • all or part of the TBK1-encoding gene was replaced with a pMCl neo gene cassette or the like, and the diphtheria toxin A fragment (DT-A) gene or simple herpes virus thymidine kinase was inserted at the 3 'end.
  • a target vector is prepared by introducing a gene such as the (HSV-tk) gene.
  • the thus produced targeting vector is linearly ligated, introduced into ES cells by an electoporation (electroporation) method or the like, and homologous recombination is performed. From, select ES cells that have undergone homologous recombination with an antibiotic such as G418 or ganciclovia (GANC). In addition, it is preferable to confirm whether or not the selected recombinant ES cells have the desired recombinant power by Southern blotting or the like. The confirmed ES cell clone is microinjected into a mouse blastocyst, and the kakar blastocyst is returned to the foster mother mouse to produce a chimeric mouse.
  • an antibiotic such as G418 or ganciclovia
  • a heterozygous mouse F1 mouse: + Z—
  • TBK1 knockout mice can be produced.
  • RNA is isolated from the mouse obtained by the above method and examined by Northern blotting or the like. There is a method of examining the expression of ⁇ ⁇ ⁇ by Western blotting or the like.
  • LPS, virus, etc. which are bacterial cell wall components of Gram-negative bacteria
  • Bioactivity of endotoxin such as fever, shock, reduction of white blood cells and platelets, bone marrow hemorrhage necrosis, hypoglycemia, IFN induction, activation of B lymphocytes (bone marrow-derived immune response cells) administered to knockout mice by intravenous injection, etc.
  • bacterial LPS or gram-positive bacterial cell components such as lipoticoic acid, M.
  • the virus is not particularly limited as long as the virus component contains a ligand recognized by TLR4.
  • examples include vesicular stomatitis virus (VSV), Sendai virus (SeV), mouse breast cancer virus (MMTV), and RS virus. (RSV) and the like.
  • LPS is administered to the TBK1 knockout mouse or TBKl'TNF double knockout mouse, The virus is infected, and test substances such as peptides, nucleic acids, low molecular weight compounds, and naturally-occurring extracts are administered before or after or simultaneously with LPS administration (irritation) or virus infection, and LPS stimulation of these knockout mouse-derived cells is performed.
  • the degree of response to virus infection Stimulate with LPS or infect a virus derived from out-mouse or TBK1 / TNF double-knock-out mouse with LPS, and before, after or simultaneously with LPS stimulation or virus infection, peptides, nucleic acids, low molecular weight compounds, natural extracts, etc.
  • a method for measuring and evaluating the degree of response to LPS stimulation or virus infection in these knockout mouse-derived cells in the presence of a test substance can be exemplified. Then, when measuring the degree of response to ligands recognized by TLR4 or their inclusions, 'evaluating' comparing with littermate wild-type mice as controls''evaluation' can eliminate variations due to individual differences. I like it.
  • LPS which is recognized by TLR4 as a ligand
  • Specific examples include IFN-j8, IFN-j8-induced ISG54, IP-10 (lFN- ⁇ -Inducible ProteinlO), IRG1, Mx2, IRF-7, interferon-inducible GTPase, ISG15, etc. it can.
  • IFN-j8, IFN-j8, and the like are preferable to measure and evaluate the degree of induction of the antiviral protein against viral infection.
  • ISG54, IP-10, IRG1, RANTES, etc. induced by IFN-j8 can be specifically listed.
  • the promoter obtained by the method of the present invention for screening for a ligand recognized by TLR4 or a substance that promotes a response to the contents thereof is useful for elucidating the mechanism of signal transduction by LPS stimulation or virus infection in vivo.
  • promoting substances may be used as preventive and therapeutic agents for bacterial and viral infections.
  • a pharmaceutically acceptable carrier, binder, stabilizer, excipient, diluent use a pharmaceutically acceptable carrier, binder, stabilizer, excipient, diluent.
  • Various formulation components such as pH buffering agents, disintegrants, solubilizing agents, solubilizing agents, and isotonic agents can be added.
  • an appropriate dose suitable for the sex, weight, and symptoms of the patient can be administered orally or parenterally. That is, it can be administered orally in a commonly used dosage form, for example, in the form of powder, granules, capsules, syrups, suspensions, etc.
  • a solution, emulsion, suspension or the like can be administered parenterally in the form of an injection, or can be administered intranasally in the form of a spray.
  • Embryonic fibroblasts were prepared from embryos at embryonic day 12.5 as described above (J. Immunol. 167: 5887-5894, 2001).
  • Recombinant vesicular stomatitis virus (VSV) was provided by Dr. Yoshiharu Matsuura and Dr. Takayuki Abe (Osaka University).
  • Sendai virus (SeV) was provided by Dr. Tatsuo Shiota (Osaka University).
  • EFs were infected with 1 ⁇ 109 VSV RNA copy Zml or multiplicity of infection (MOI) of 10 SeV virus.
  • Salmonella 'M. Minnesota Re-595 LPS was purchased from Sigma-Aldrich.
  • Synthetic Pam3CSK4 bacterial lipopeptide, BLP was obtained from Boehringer Mannheim.
  • TNF- ⁇ and IL-1 ⁇ were purchased from Genzyme.
  • an expression vector for wild-type IKKi and mutant IKKi derived from the IKKi mutant allele In order to construct an expression vector for wild-type IKKi and mutant IKKi derived from the IKKi mutant allele, the RT-PCR products of IKKi cDNA obtained from wild-type EF and IKKi7-EF were sequenced, and pFLAG- Cloning was performed on a CMV2 vector (Sigma-Aldrich). An expression vector for human IRF-3 was constructed by ligating arboreal HRF-3 cDNA to the pFLAG-CMV2 vector. An expression vector for human TBKl (hTBKl) was constructed by sequencing the RT-PCR product of TBKl cDNA obtained from the human placenta cDNA library and ligating it to the pEF-BOS vector.
  • Genomic DNA fragments encoding ⁇ i and TBK1 were screened from the 129ZSv mouse genomic library and characterized by restriction mapping and sequencing analysis. Both the 1. Okbp fragment of the IKKi gene and the 1.5 kbp fragment of the TBK1 gene were A targeting vector was designed by substituting with the mycin resistance gene cassette. A simple herpesvirus thymidine kinase gene driven by the MC1 promoter was used for negative selection. These targeting vectors were transfected into embryonic day 14.1 ES cells. Targeted ES cells were identified by PCR and Southern blot from G418 and ganciclovir double resistant clones and then injected into C57BLZ6 blastocysts. The obtained male chimeric mouse and C57BLZ6 female mouse were bred. Thereafter, F1 progeny were intercrossed to produce homozygotes of each mutant allele. (Northern plot analysis)
  • EFs (1 ⁇ 10 6 cells) obtained from wild-type embryos, IKK i-embryos and embryos were stimulated with 1.0 / z gZ ml of LPS for a predetermined time.
  • a nuclear extract was prepared and incubated using a radiolabeled oligonucleotide probe containing an NF- ⁇ B binding site or an IFN stimulation control element (ISRE), followed by the aforementioned literature (J. Immunol. 167: 5887-5894). , 2001) and visualized by autoradiography.
  • ISRE IFN stimulation control element
  • Nuclear extracts were separated by SDS-PAGE and transferred to a PVDF membrane.
  • an anti-IRF-3 antibody (Science. 301: 640-643, 2003) and an anti-NF- ⁇ Bp65 antibody (manufactured by Santa Cruz Biotechnology)
  • plotting was performed on a vibrating membrane. Strong membrane-bound antibodies were visualized with horseradish peroxidase-labeled antibodies against egret IgG (Amersham Bioscience) using the ECL system (PerkinElmer Life Sciences).
  • Human fetal kidney 293 cells were seeded on a 24-well plate and transfected with a reporter plasmid and a predetermined expression vector using Lipofectoamin 2000 reagent (manufactured by Invitrogen). Transformed to Gent.
  • the EF seeded on a 6-well plate was mixed with an empty pEF-BOS vector (MOCK) or pEF-B8 together with the IFN-j8 promoter reporter plasmid using Fu GENE6 transfection reagent (Roche Diagnostics). Transfected transiently with BOS human TBK1. Twenty-four hours after transfection, the cells were stimulated with 10 gZml of LPS for an additional 12 hours.
  • the luciferase activity of the whole cell lysate was measured using a dual luciferase reporter assay system (Promega).
  • Renilla Nofuev. ⁇ zelepo ⁇ ta ' ⁇ gene (Renilla-luciferase reporter gene) (Promega) was used.
  • EF stimulated with LPS for 2 hours or 4 hours or EF-stimulated total RNA was extracted, and cRNA probe was synthesized.
  • Preparation of cRNA, hybridization and scanning of the microarray were performed according to the manufacturer's instructions. The analysis was performed using the Affymetrix Microarray MG U74A Version 2 (Aifymetrix). Microarray Suite version 5.0 software (Alfymetrix) Data analysis was performed using software (manufactured by Silicon Genetics).
  • IKK i mouse and pen mouse were prepared by gene targeting.
  • ⁇ ⁇ A targeting vector for generating i-mice was constructed using a neomycin resistance gene cassette to replace exon 7 and exon 8 of the IKKi gene, which encodes a part of the second kinase domain.
  • Figure 1A IKK i-mice were born at the expected Mendelian ratio, were fertile, and appeared healthy (FIG. 1B).
  • IKKi transcripts were detected in thioglycolic acid-induced peritoneal cells of homozygous mutant mice (Fig. 1C).
  • a targeting vector for producing a pen mouse was constructed using a neomycin resistance gene cassette to replace exon 9 of the TBK1 gene (FIG. 1E).
  • TBK1 heterozygous mice were born, and powerful mice appeared healthy. However, the penguin died around day 14.5 of the embryo (E14.5), as previously reported (EMBO J. 19: 4976-4985, 2000).
  • Fibroblasts ( ⁇ F) were obtained from embryos on day 5 (FIG. 1F), and the expression of TBK1 mRNA was examined. In wild-type EF, TBK1 mRNA was detected and increased after LPS stimulation. However, in pen EF, no TBK1 mRNA was detected, whereas the IKKi gene was induced normally (FIG. 1G).
  • ⁇ i and TBK1 are involved in NF- ⁇ NF activation. Since IL-6 production is dependent on NF- ⁇ , we have studied the production of IL-6 in EF in response to various stimuli known to activate NF- ⁇ . Was measured. EF was stimulated with TNFa, IL1 ⁇ , the TLR2 ligand Pam3CSK4 (bacterial lipopeptide, BLP) and the TLR4 ligand LPS. As shown in Figure 2A, IKK i-EF and PEN EF produced similar amounts of IL-6 in response to all stimulants examined, as compared to wild-type cells.
  • LPS stimulation induces activation of IRF-3 and induces IFN-18 and a set of IFN-inducible genes
  • IKK i-EF stimulated with LPS
  • IFN-inducible genes such as ISG54, IP-10, IRG1, and RANTES
  • pen EF mRNA induction of IFN- ⁇ , ISG54, IP-10 and IRG1 was significantly impaired, whereas mRNA induction of RANTES and IL6 was similar to that of wild-type cells ( ( Figure 2B).
  • Viral infection induces phosphorylation and dimerization of IRF-3 and induces IFN-j8 and other antiviral molecules (Lin, R, C. Heylbroeck, P. Genin, PM Pitha, J. Hiscott. 1999. Essential role of interferon regulatory factor 3 in direct activation of RANTES chemokine transcription. Mol. Cell Biol. 19: 959-9b., Genin, P., M. Algarte, P. Roof, R Lin, and J. Hiscott. 2000. Regulation of RANTES chemokine gene expression requires cooperativity between NF— kB and
  • IFN-regulatory factor transcription factors J. Immunol. Ib4: 5352-5361.
  • IKKi or TBK1 mediates the expression of the virus-induced gene (FIG. 4A).
  • EF was infected with vesicular stomatitis virus (VSV) or Sendai virus (SeV), and mRNA expression was examined by Northern blot analysis.
  • VSV vesicular stomatitis virus
  • SeV Sendai virus
  • IFN-18 mRNA expression was not observed in the pancreatic cells, and RANTES and IP-10 mRNA expressions were significantly reduced as compared to the live cells.
  • nuclear proteins were also prepared for VSV-infected wild-type EF and T-pan EF, and IRF-3 was detected by performing an immunoplot. As shown in FIG. 4B, accumulation of nuclear IRF-3 and NF- ⁇ Bp65 was observed in wild-type cells. In pancreatic cells, accumulation of IRF-3 was impaired, but exerted no effect on NF- ⁇ ⁇ 65 translocation.
  • TBK1 is an essential molecule for the activation of IRF-3, and that it induces mRNA induction of IFN-j8 and other antiviral molecules in viral infection.
  • virus-infected TBK17-EF induction of RANTES transcripts was impaired
  • LPS LPS
  • Example 2 above demonstrated that TBK1 is essential for the induction of an IFN-inducible gene set including IFN-18. These genes are regulated in a MyD88-independent but TRIF-dependent manner and are activated by the transcription factor IRF-3 (J. Immunol.
  • Example 2 shows that these two kinases have different functions in LPS stimulation and viral infection.
  • IKKi and TBK1 were first identified as molecules related to IKK ⁇ and IKK
  • TLR3 or TLR4 Stimulation of TLR3 or TLR4 on macrophages is known to cause IRF-3-dependent and rapid up-regulation of IFN- ⁇ , IP-10 and RANTES genes (Doyle, S. Vaidya, R. 0 'then onnell, H. Dadgostar, P. Dempsey, T. Wu, G. Rao, R. Sun, M. Haberland, R. Modlin, and G. Cheng. 2002. IRF3 mediates a TLR3 / TLR4—specific antiviral gene program. Immunity. 17: 251—2b3).
  • TBK1 in response to LPS and viral infection, induces the IFN-18 gene. Since IKKi, a component essential for induction, was found to be non-essential, controlling TBK1 activity allowed the regulation of IFN-18 without affecting the induction of proinflammatory site force-in. Expression can be altered.
  • the present invention makes it possible to obtain new therapeutic treatments for septic shock and viral infection.

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Abstract

　ＴＢＫ１ノックアウトマウス又は該ノックアウトマウス由来の組織若しくは細胞を用いて、ＬＰＳ刺激やウイルス感染に対する、ＩＦＮ−β等の抗ウイルスタンパク質の誘導促進物質のスクリーニング方法を提供するものである。 　染色体上のＴＡＮＫ結合キナーゼ１（ＴＢＫ１）遺伝子の一部もしくは全部が欠損し、野生型において発現されるＴＢＫ１を発現する機能が失われているマウス、又は該マウス由来の組織若しくは細胞と、被検物質と、ＴＬＲ４が認識するリガンド又はこれらの含有物とを用いて、前記マウス又は該マウス由来の組織若しくは細胞における、ＴＬＲ４が認識するリガンド又はこれらの含有物に対するＩＦＮ−β等の抗ウイルスタンパク質の誘導の程度を測定・評価し、ＬＰＳ刺激やウイルス感染に対する応答の促進物質をスクリーニングする。

Description

TBK1ノックアウトマウスを用いたスクリーニング方法
技術分野
[0001] 本発明は、 TANK結合キナーゼ 1 (TBK1)ノックアウトマウス又は該ノックアウトマウ ス由来の組織若しくは細胞を用いた、リポポリサッカライド (LPS)刺激及び Z又はゥ ィルス感染に対する、インターフェロン β (IFN- |8 )等の抗ウィルスタンパク質の誘導 促進物質のスクリーニング方法に関する。
背景技術
[0002] Toll様受容体 (TolHike receptors： TLR)は、病原体の侵入を認識するために必 須であり、自然免疫と適応免疫との重要な連結の役割を果たすことが知られている（ 例えば、 Annu. Rev. Immunol. 20:197-216, 2002, Annu. Rev. Immunol. 21:335-376, 2003参照）。 TLRは、 TLR1ZTLR2ヘテロ二量体が認識するトリァシル化リポぺプ チド、 TLR2ZTLR6ヘテロ二量体が認識するジァシル化リポペプチド、 TLR4が認 識するリポポリサッカライド (LPS)、 TLR3が認識する二重鎖 RNA(dsRNA)、 TLR 5が認識する細菌の鞭毛力も得たフラジェリン、 TLR9が認識する非メチルイ匕 CpGモ チーフを含む細菌 DNA等の様々な細菌成分を認識することができる。現在、 TLRの 細胞内シグナル伝達経路について幅広い研究が行なわれている（例えば、 Annu. Rev. Immunol. 20:197—216, 2002, Annu. Rev. Immunol. 21:335—376, 2003参照）。各 TLRの細胞質領域には、 TLR受容体ファミリー及び IL 1受容体ファミリーの両方に 共通する、 TollZlL— 1受容体 (TIR)ドメインが含まれる。 TLRのシグナル伝達の現 象は、シグナル伝達分子のリクルーティングにより、 TIRドメインから開始する。 MyD 88は、 TIRドメイン及びデスドメインの両方を含む細胞質分子であり、 TLR受容体フ アミリー及び IL 1受容体ファミリーのアダプタータンパク質として機能する。 MyD88 の TIRドメインは、 TIRドメインを含む受容体とアダプター分子との複合体形成にぉ ヽ て必要とされている。デスドメインは、 IRAKIや IRAK4等のその他のデスドメインを 含む分子との相互作用を仲介する。 MyD88の欠損により、ほとんど全ての TLRリガ ンドに応答して、結果的に炎症誘発性サイト力インの産生が障害されるが、 dsRNA ( TLR3リガンド）及び LPS (TLR4リガンド）は、インターフェロン制御因子（IRF)—3の 活性ィ匕を誘導し、 MyD88非依存的な IFN— 18の産生を引き起こす (例えば、 J.Immunol. 167:5887-5894, 2001 , Int. Immunol. 14: 1225-1231 , 2002, Nature Immunol. 3:392-8, 2002, J. Immunol. 169:6668-6672, 2002参照）。近年の研究によ り、 dsRNA及び LPSによる IRF— 3の活性化や IFN— j8の誘導が、 TIRを含む別のァ ダプター分子である、 TRIF/TICAM-1により仲介されることが明らかになった（例 えば、 J. Immunol. 169:6668—6672, 2002, Nature Immunol. 4: 161—167, 2003, Science. 301 :640-643, 2003, Nature. 10.1038/nature01889, 2003参照）。
[0003] ウィルス感染における、タイプ I IFN (IFN- α / β )誘導の分子機構は、詳細
に研究されている（例えば、 Annu. Rev. Microbiol. 55:255-81 , 2001 , Curr. Opin. Infect. Dis. 15:259-267, 2002, Curr. Opin. Immunol. 14: 111-116, 2002参照）。 IFN の誘導は、主に転写レベルで制御される。これまでの研究により、 IFN— 18の発 現力 NF- κ B、 ATF-2/c-Jun並びに IRF-3及び IRF-7により制御されることが 知られている（例えば、 Annu. Rev. Microbiol. 55:255-81 , 2001 , Curr. Opin. Infect. Dis. 15:259-267, 2002, Curr. Opin. Immunol. 14: 111-116, 2002参照）。遺伝子破壊 の研究により、タイプ I IFN遺伝子の転写における IRF— 3及び IRF—7の重要な役割 が明らかにされている（例えば、 Immunity. 13:539-548, 2000, Biochem. Biophys. Res. Commun. 306:860-866, 2003参照）。ウィルス感染の間、 IRF— 3は、主に IFN— j8遺伝子の初期活性化において応答し（例えば、 EMBO J. 17: 1087-1095, 1998参 照）、 IRF— 7の発現は、 IFN— 18に依存する。その結果、タイプ I IFNは、自己分泌の 陽性フィードバック様式で強く誘導する（例えば、 Curr. Opin. Immunol. 14: 111-116, 2002, Curr Opin Immunol. 15:52-58, 2003参照）。 IRF— 3は、未感染細胞の細胞質 中に局在する。ウィルス感染後、 IRF— 3は、 C末端の部分に位置する多重セリン Zス レオニン残基でリン酸化する。リン酸ィ匕した IRF— 3は、核の中に移行するホモ二量体 を形成し、 IRF結合要素 ZIFN刺激応答要素（IRF- binding element/IFN- stimulated response element) (IRF-E/ISRE)と呼ばれる IRF 結合部位を含むプロモーター を活性化する。
[0004] IRF— 3の活性ィ匕を誘導する分子機構にっ ヽてはほとんど分力つて ヽな 、が、近年 の研究により、 IRF—3は、 2つの I κ Bキナーゼ（IKK)関連キナーゼ（I κ B kinase (IKK)- related kinases)、すなわち、誘導性 IKK (IKK i)及び TANK結合キナーゼ 1
(TBK1)によりリン酸化されると考えられている（例えば、 Science. 300: 1148-1151 , 2003, Nature Immunol. 4:491-496, 2003参照）。 IKK iは、 IKK εとも呼ばれ、最 初に LPS誘導キナーゼ（LPS-induced kinase)として同定されている（例えば、 Int. Immunol. 11 : 1357-1362, 1999, Mol. Cell. 5:513-522, 2000参照）。 TBK1は、 NF— κ Β活性キナーゼ（NF- κ Β activating kinase) (ΝΑΚ)又は腫瘍壊死因子（TNF)受 容体関連因子（TRAF)— 2関連キナーゼ（tumor necrosis factor (TNF) receptor associated factor (TRAF)— 2 associated kinase) (T2K)とも呼ばれている（例えば、 EMBO J. 18:6694-6704, 1999, Nature. 404:778-782, 2000, EMBO J.
19:4976-4985, 2000参照）。これら 2種のキナーゼは、 IKK α及び IKK j8と相同 性を共有する。これらキナーゼは、 TRAF2や TRAF結合タンパク質である TANKZ I TRAFと相互作用し、 IKK- a及び IKK βの上流で機能すると報告されて!ヽる ( 例えば、 EMBO J. 18:6694-6704, 1999, Genes Cells. 5: 191-202, 2000参照）。 TBK 1の欠損は、広範囲の肝臓変性による胚死亡の原因となり、 TBK1欠損 (ΤΒΚΓん） 胚繊維芽細胞 (EF)は、 NF- κ Bにより制御される特定遺伝子の発現の減少を示し た（例えば、 EMBO J. 19:4976-4985, 2000参照）。したがって、これら 2種の IKK関連 キナーゼは、 NF— κ Βの活性ィ匕に関係していると考えられている。近年、 2つの研究 グループにより、 ΙΚΚ i及び TBK1が IRF— 3及び IRF— 7をリン酸化して活性化し、 T RIF依存的シグナル伝達経路と同様にウィルス感染における IFN— j8、 RANTES ( Regulated on activation, normal T cell expressed and secreted)及び ISG54の 与 を引き起こすことが示唆されている（例えば、 Science. 300: 1148-1151 , 2003, Nature Immunol. 4:491-496, 2003参照）。
また、 TBK1 (T2K)ノックアウトマウスが胎生 14. 5日目（E14. 5)頃に死亡するこ とや、 TBK1 (T2K)及び TNFのダブルノックアウトマウスが野生型マウスと同様に生 育することも知られている（EMBO J. 19:4976-4985, 2000参照）。そしてまた、 TLR4 が認識するリガンドとして、主としてグラム陰性菌の外膜成分として存在するエンドトキ シンとも呼ばれるリポポリサッカライド (LPS)、グラム陽性細菌の細胞壁成分であるリ ポティコ酸（LTA)、結核菌（Mycobacterium tuberculosis)溶解物、グラム陽性菌細 胞壁画分等が知られている（Immunity. 11: 443-451, 1999, Int. Immunol. 12:
113-117, 2000参照）。
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0006] 本発明の課題は、 TBK1ノックアウトマウス又は該ノックアウトマウス由来の組織若し くは細胞を用いて、 LPS刺激及び Z又はウィルス感染に対する、 IFN— 18等の抗ウイ ルスタンパク質の誘導促進物質のスクリーニング方法を提供することにある。
課題を解決するための手段
[0007] 本発明者らは、ジーンターゲテイングにより IKK i及び TBK1の生理学的役割につ いて研究を行った。 IKK i—ん細胞は、 LPSに応答して、正常な遺伝子誘導を示した 。一方、 ΤΒΚΓん細胞は、 IFN— 18の発現が損なわれることを示した力 炎症誘発性 サイト力イン mRNAの誘導は正常であった。 LPSに応答して、 NF— κ Bの活性化は 両方の変異体 EFで誘導されたが、 ΤΒΚΓん細胞では、 ISRE結合活性は誘導され なかった。また、ウィルス感染した ΤΒΚΓん細胞では、 IFN— 18及び IFN誘導性遺伝 子の発現が激しく損なわれた。これらの結果は、 LPS刺激及びウィルス感染による IF N— j8遺伝子の誘導に TBK1は必須である力 IKK iは必須でないことを示している 。本発明者らは、以上の知見に基づき本発明を完成するに至った。
[0008] すなわち本発明は、（1)染色体上の TANK結合キナーゼ 1 (TBK1)遺伝子の一 部もしくは全部が欠損し、野生型において発現される TBK1を発現する機能が失わ れているマウス、又は該マウス由来の組織若しくは細胞と、被検物質と、 TLR4が認 識するリガンド又はこれらの含有物とを用いて、前記マウス又は該マウス由来の組織 若しくは細胞における、 TLR4が認識するリガンド又はこれらの含有物に対する応答 の程度を測定'評価することを特徴とする TLR4が認識するリガンド又はこれらの含有 物に対する応答の促進物質のスクリーニング方法に関する。
[0009] また本発明は、（2) TLR4が認識するリガンド又はこれらの含有物に対する応答の 程度を測定'評価するに際し、対照としての同腹の野生型マウスとの比較'評価を行 うことを特徴とする（1)記載の TLR4が認識するリガンド又はこれらの含有物に対する 応答の促進物質のスクリーニング方法や、（3)マウス由来の細胞力 TBK1ノックァゥ トマウス由来の胚線維芽細胞であることを特徴とする（1)又は（2)記載の TLR4が認 識するリガンド又はこれらの含有物に対する応答の促進物質のスクリーニング方法や 、（4) TLR4が認識するリガンド又はこれらの含有物力 リポポリサッカライド (LPS)で あることを特徴とする（1)一 (3)のいずれか記載の TLR4が認識するリガンド又はこれ らの含有物に対する応答の促進物質のスクリーニング方法や、（5) LPS刺激に対す る抗ウィルスタンパク質の誘導の程度を測定'評価することを特徴とする (4)記載の T LR4が認識するリガンド又はこれらの含有物に対する応答の促進物質のスクリーニン グ方法に関する。
さらに本発明は、（6)抗ウィルスタンパク質力 インターフェロン （IFN— j8 )である ことを特徴とする（5)記載の TLR4が認識するリガンド又はこれらの含有物に対する 応答の促進物質のスクリーニング方法や、（7)抗ウィルスタンパク質力 ISG54、 IP— 10又は IRG1であることを特徴とする（5)記載の TLR4が認識するリガンド又はこれら の含有物に対する応答の促進物質のスクリーニング方法や、（8)抗ウィルスタンパク 質が、 Mx2、 IRF—7、インターフェロン誘導性 GTPase、 ISG15であることを特徴と する（5)記載の TLR4が認識するリガンド又はこれらの含有物に対する応答の促進 物質のスクリーニング方法や、 (9) LPS刺激に対する ISRE結合活性の誘導の程度 を測定'評価することを特徴とする (4)記載の TLR4が認識するリガンド又はこれらの 含有物に対する応答の促進物質のスクリーニング方法や、（10)TLR4が認識するリ ガンド又はこれらの含有物力 ウィルスであることを特徴とする（1)一 (3)のいずれか 記載の TLR4が認識するリガンド又はこれらの含有物に対する応答の促進物質のス クリーニング方法や、（11)ウィルス感染に対する抗ウィルスタンパク質の誘導の程度 を測定'評価することを特徴とする（10)記載の TLR4が認識するリガンド又はこれら の含有物に対する応答の促進物質のスクリ一ユング方法や、 ( 12)抗ウィルスタンパ ク質が、インターフェロン β (IFN— 18 )であることを特徴とする（11)記載の TLR4が認 識するリガンド又はこれらの含有物に対する応答の促進物質のスクリーニング方法や 、（13)ウィルス感染に対する抗ウィルスタンパク質が、 ISG54、 IP— 10、 IRG1又は R ANTESであることを特徴とする（11)記載の TLR4が認識するリガンド又はこれらの 含有物に対する応答の促進物質のスクリーニング方法に関する。
図面の簡単な説明
[図 1]IKK i—んマウス及び ΤΒΚΓんマウスの作製に関する図である。（Α) ΙΚΚ— i遺伝 子、ターゲテイングベクター及び予測された変異アレルの構造を示す図である。
Closed boxes (■)は、コーディングェキソンを示す。 Sは、制限酵素 Sphlを示す。（B )ヘテロ接合体のインタークロスで生じた子孫のサザンプロット分析の結果を示す図 である。マウスの尾部力 ゲノム DNAを抽出し、 Sphlで消化し、電気泳動にかけ、 ( A)に記載した放射能標識プローブでハイブリダィズした。サザンブロットにより、野生 型（ + Z + )には単一の 19kbpバンド力 ホモ接合体 (-Z-)には 4kbpバンド力 へ テロ接合体マウス（+ Z—）にはその両方のバンドが得られた。（C)チォグリコール酸 で誘発した腹膜細胞のノーザンプロット分析の結果を示す図である。野生型マウス及 ひ ΊΚΚ Γんマウスカも得た、チォグリコール酸で誘発した腹膜細胞を、 lOOng/ml の LPSで記載の時間刺激した。全 RNAdO /z g)を電気泳動にかけ、ナイロン膜に 移し、プローブとして IKK iの N末端断片、ターゲティングコンストラクト（targeting construct)における IKK i遺伝子の除去領域、又は TBK1 cDNA断片を用いてハ イブリダィズした。 j8 -ァクチンプローブを用いて、同じ膜を再びハイブリダィズした。 ( D) IFN—j8プロモーターレポーターアツセィの結果を示す図である。 HEK293細胞 を、記載した発現ベクター及び IFN— βルシフェラーゼレポーターベクターを用いて 、トランジェントにコトランスフエクシヨン（co-transfected)した。トランスフエクシヨンから 36時間後、全細胞溶解液におけるルシフェラーゼ活性を測定した。（E)TBK1遺伝 子、ターゲテイングベクター及び予測された変異アレルの構造を示す図である。
Closed boxes (■)は、コーディングェキソンを示す。 Bは、制限酵素 BamHIを示す。 (F)ヘテロ接合体のインタークロスで生じた胚カも得た EFのサザンプロット分析の結 果を示す図である。 EF力 ゲノム DNAを抽出し、 BamHIで消化し、電気泳動にか け、（E)に記載した放射能標識プローブでハイブリダィズした。サザンブロットにより、 野生型（ + Z + )には単一の 3. 5kbpバンド力 ホモ接合体変異体 (一 Z—）には 1. 2 kbpバンド力 ヘテロ接合体マウス（+ Z—）にはその両方のバンドが得られた。（G) E Fのノーザンブロット分析の結果を示す図である。野生型 EF及び ΤΒΚΓん EF力 全 RNAを抽出し、 1. O /z gZmlの LPSで記載の時間刺激し、電気泳動にかけ、ナイ口 ン膜に移し、プローブとして IKK i又は TBK1 cDNA断片を用いてハイブリダィズし た。 j8—ァクチンプローブを用いて、同じ膜を再びノ、イブリダィズした。
[図 2]LPSで刺激した ΤΒΚΓん EFには見られる力 IKK i一ん EFには見られない、 IF N- β及び IFN誘導性遺伝子の障害された誘導を示す図である。 (A) EF〖こよる IL— 6の産生を示す図である。野生型 EF、 IKK i—ん EF (上）又は ΤΒΚΓん EF (下）を、 1 OngZmlの TNF—o;、 lOngZmlの IL— 1 β、 lOOngZmlの BLP又は記載の LPS 濃度で、 24時間刺激した。培養上澄清液中の IL 6の濃度を、 ELISAで測定した。 データは、平均士 SDとして表示した。（B) LPSで刺激した EFの遺伝子誘導を示す 図である。野生型、 IKK Γん (左）又は ΤΒΚΓん (右）を、 1. 0 gの LPSで記載の時 間刺激した。全 RNAを抽出し、記載の遺伝子のノーザンプロット分析を行った。 (C) LPSで刺激した EFのマイクロアレイ分析の結果を示す図である。野生型 EF及び TB K17—EFを LPSで刺激し、記載の時点で RNAを収集し、マイクロアレイ分析に使用 しに。 Genespring software 用 ヽて、絶 発 (absolute expression)を ¾： し 7こ。ン グナル強度のカラーコードを、左に表示した。
[図 3]LPSで誘導した ISRE結合及び IFN— βプロモーター活性における TBK1の必 要性を示す図である。（Α) ΤΒΚΓん EFにおける ISRE結合の障害を示す図である。 野生型 EF、 IKK i7—EF、又は ΤΒΚΓん EFを、 0. 1 gZmlの LPSで記載の時間 刺激し、 NF- κ B結合 (右)及び ISRE結合活性 (左）を EMSAにより決定した。（B) TBK1の発現により、 ΤΒΚΓん EFにおける IFN—jSプロモーターの活性が回復した 結果を示す図である。 TBK1+/+ (WT)又は TBK17—EFを、ヒト TBK1 (hTBKl)及 び IFN—jSプロモータールシフェラーゼプロモーターでコトランスフエクシヨンした。トラ ンスフエクシヨンから 24時間後、ルシフェラーゼ活性を測定する前に、力かる細胞をさ らに 12時間、 LPSで刺激する（LPS stim.)か又は刺激しなかった（unstim.)。
[図 4]ウィルス感性した EFの IFN 誘導性遺伝子発現における TBK1の必要性を示 す図である。（A)野生型 EF、 IKK i—ん EF及び TBKr/—EFを、組換え VSV又は Se Vに記載の時間感染させて全 RNAを抽出し、ノーザンプロット分析を行った結果を 示す図である。（B) VSV感染に応答した IRF— 3及び NF— κ Bp65の核への移行を 示す図である。 ESを組換え VSVに記載の時間感染させ、核タンパク質を抽出し、 S DS— PAGEで分離し、抗 IRF—3抗体及び NF - κ Βρ65抗体でブロットした。
発明を実施するための最良の形態
[0012] 本発明の LPS刺激及び Ζ又はウィルス感染に対する抗ウィルスタンパク質の誘導 促進物質のスクリーニング方法としては、染色体上の TBK1遺伝子の一部もしくは全 部が欠損し、野生型にぉ 、て発現される TBK1を発現する機能が失われて 、るマウ ス、又は該マウス由来の組織若しくは細胞と、被検物質と、 LPS及び Z又はウィルス とを用い、前記マウス又は該マウス由来の組織若しくは細胞における、 LPS刺激及び Z又はウィルス感染に対する抗ウィルスタンパク質の誘導の程度を測定'評価する方 法であれば特に制限されるものではなぐ上記マウスとしては、 TBK1ノックアウトマウ スゃ、 TBKl 'TNFダブルノックアウトマウスを例示することができる力 野生型マウス と同様に生育する TBKl 'TNFのダブルノックアウトマウスが好ましい。また、上記マ ウス由来の組織としては、脾臓、リンパ節、骨髄、肺等を挙げることができ、上記マウ ス由来の細胞としては、胚線維芽細胞 (EF)、マクロファージ、脾細胞、榭状細胞、肺 繊維芽細胞等を挙げることができる。 TBK1ノックアウトマウスは胎生 14. 5日目（E1 4. 5)頃に死亡することから、 TBK1ノックアウトマウス由来の細胞としては胚線維芽 細胞等の培養可能な不死化細胞が好まし 、。
[0013] 上記 TBK1ノックアウトマウスは、例えば以下のように作製することができる。 TBK1 遺伝子は、マウス遺伝子ライブラリーを PCR法等により増幅し、得られた遺伝子断片 をマウス TBK1遺伝子由来のプローブを用いてスクリーニングすることができる。スク リー-ングされた TBK1遺伝子は、プラスミドベクター等を用いてサブクローンし、制 限酵素マッピング及び DNAシーケンシングにより特定することができる。次に、この T BK1をコードする遺伝子の全部又は一部を pMClネオ遺伝子カセット等に置換し、 3'末端側にジフテリアトキシン Aフラグメント（DT— A)遺伝子や単純へルぺスウィルス のチミジンキナーゼ (HSV— tk)遺伝子等の遺伝子を導入することによって、ターゲッ トベクターを作製する。
[0014] この作製されたターゲテイングベクターを線状ィ匕し、エレクト口ポレーシヨン (電気穿 孔)法等によって ES細胞に導入し、相同的組換えを行い、その相同的組換え体の中 から、 G418やガンシクロビア（GANC)等の抗生物質により相同的組換えを起こした ES細胞を選択する。また、この選択された ES細胞が目的とする組換え体力どうかを サザンプロット法等により確認することが好まし 、。その確認された ES細胞のクローン をマウスの胚盤胞中にマイクロインジェクションし、カゝかる胚盤胞を仮親のマウスに戻 し、キメラマウスを作製する。このキメラマウスを野生型マウスと交雑させると、ヘテロ接 合体マウス (F1マウス： +Z—)を得ることができ、また、このへテロ接合体マウスを交 雑させることによって、本発明に用いられる TBK1ノックアウト（ΤΒΚΓん)マウス を作製することができる。また、 TBK1ノックアウトマウスにおいて、 TBK1が生起して いるかどうかを確認する方法としては、例えば、上記の方法により得られたマウスから RNAを単離してノーザンブロット法等により調べたり、またこのマウスにおける TBK1 の発現をウェスタンプロット法等により調べる方法がある。
[0015] また、作出された TBK1ノックアウトマウスが TLR4が認識するリガンド又はこれらの 含有物に対して不応答性であることは、例えば、グラム陰性菌の細菌細胞壁成分で ある LPSやウィルス等を TBK1ノックアウトマウスに静脈注射等により投与し、発熱、 ショック、白血球や血小板の減少、骨髄出血壊死、血糖低下、 IFN誘発、 Bリンパ球（ 骨髄由来免疫応答細胞)の活性ィ匕等のエンドトキシンの生物活性を測定することや、 TBK1ノックアウトマウスの胚線維芽細胞に、細菌由来の LPS、又はグラム陽性菌菌 体成分である、リポティコ酸、結核菌溶解物、ウィルス等の存在下において、例えば I FN- β等の抗ウィルスタンパク質の発現を測定することにより確認することができる。 上記ウィルスとしては、ウィルス構成成分に TLR4が認識するリガンドを含むものであ れば特に制限されず、例えば水疱性口内炎ウィルス (VSV)、センダイウィルス (SeV )、マウス乳癌ウィルス (MMTV)、 RSウィルス (RSV)等を挙げることができる。
[0016] 本発明の TLR4が認識するリガンド又はこれらの含有物に対する応答の促進物質 のスクリーニング方法として、具体的には、前記 TBK1ノックアウトマウスや TBKl 'T NFダブルノックアウトマウスに LPSを投与したり、ウィルスを感染させ、 LPS投与（刺 激)やウィルス感染の前後又は同時に、ペプチド、核酸、低分子化合物、天然由来 の抽出物等の被検物質を投与し、これらノックアウトマウス由来の細胞における LPS 刺激やウィルス感染に対する応答の程度を測定'評価する方法や、前記 TBK1ノック アウトマウスや TBK1 · TNFダブルノックアウトマウスに由来する細胞に LPSで刺激し たり、ウィルスを感染させ、 LPS刺激やウィルス感染の前後又は同時に、ペプチド、 核酸、低分子化合物、天然由来の抽出物等の被検物質を共存させ、これらノックァゥ トマウス由来の細胞における LPS刺激やウィルス感染に対する応答の程度を測定- 評価する方法を例示することができる。そして、 TLR4が認識するリガンド又はこれら の含有物に対する応答の程度を測定'評価するに際し、対照としての同腹の野生型 マウスとの比較'評価することが個体差によるバラツキをなくすることができるので好ま しい。
[0017] TLR4が認識するリガンドカLPSである場合、 LPS刺激に対する抗ウィルスタンパ ク質の誘導の程度や、 ISRE結合活性の誘導の程度を測定'評価することが好ましく 、上記抗ウィルスタンパク質としては、 IFN— j8や、 IFN— j8に誘導される ISG54、 IP -10 (lFN- γ -Inducible ProteinlO)、 IRG1や、 Mx2、 IRF— 7、インターフェロン誘導 性 GTPase、 ISG15などを具体的に例示することができる。また、 TLR4が認識するリ ガンドの含有物がウィルスである場合、ウィルス感染に対する抗ウィルスタンパク質の 誘導の程度を測定'評価することが好ましぐ上記抗ウィルスタンパク質としては、 IF N— j8や、 IFN- j8に誘導される ISG54、 IP— 10、 IRG1、 RANTESなどを具体的に ί列示することができる。
[0018] 本発明の TLR4が認識するリガンド又はこれらの含有物に対する応答の促進物質 のスクリーニング方法により得られる促進物質は、インビボにおける LPS刺激やウイ ルス感染によるシグナル伝達におけるメカニズムの解明に有用であり、促進物質は細 菌感染症やウィルス感染症の予防 ·治療剤として使用しうる可能性がある。細菌感染 症やウィルス感染症の予防'治療効果が期待できる上記促進物質を医薬品として用 いる場合は、薬学的に許容される通常の担体、結合剤、安定化剤、賦形剤、希釈剤 、 pH緩衝剤、崩壊剤、可溶化剤、溶解補助剤、等張剤などの各種調剤用配合成分 を添加することができる。またこれら医薬品を用いる予防若しくは治療方法にぉ 、て は、患者の性別 ·体重，症状に見合った適切な投与量を、経口的又は非経口的に投 与することができる。すなわち通常用いられる投与形態、例えば粉末、顆粒、カプセ ル剤、シロップ剤、懸濁液等の剤型で経口的に投与することができ、あるいは、例え ば溶液、乳剤、懸濁液等の剤型にしたものを注射の型で非経口投与することができ る他、スプレー剤の型で鼻孔内投与することもできる。
[0019] 以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこ れらの例示に限定されるものではない。
実施例 1
[0020] [材料と方法]
(細胞、ウィルス及び試薬）
4%のチォグリコール酸 2mlをマウス腹腔内に投与し、 3日後にチォグリコール酸を 誘発した腹膜細胞を回収した。胚繊維芽細胞 (EF)は、胎生 12. 5日目の胚より前記 文献 (J. Immunol. 167:5887-5894, 2001)の通りに調製した。組換え水疱性口内炎ゥ ィルス（VSV)は、 Dr. Yoshiharu Matsuura及び Dr. Takayuki Abe (大阪大学）より提 供された。センダイウィルス（SeV)は、 Dr. Tatsuo Shiota (大阪大学）より提供された。 EFを、 1 X 109の VSVの RNAコピー Zml又は感染効率（MOI) 10の SeVウィルス で感染させた。サルモネラ 'ミネソタ（S. minnesota)Re— 595の LPSは、 Sigma- Aldrich 社より購入した。合成 Pam3CSK4 (細菌リポペプチド、 BLP)は、 Boehringer Mannheim社より入手した。 TNF—α及び IL—1 βは、 Genzyme社より購入した。
(プラスミド）
野生型 IKK i及び IKK i変異アレル由来の変異 IKK iの発現ベクターを構築す るため、野生型 EF及び IKK i7—EFから得た IKK i cDNAの RT— PCR産物を配 列決定し、 pFLAG- CMV2ベクター（Sigma- Aldrich社製）にクローユングした。ヒト IRF —3の発現ベクターは、ヒ HRF— 3 cDNAを pFLAG-CMV2ベクターに連結させること により構築した。ヒト TBKl (hTBKl)の発現ベクターは、ヒト胎盤 cDNAライブラリー より得た TBK1 cDNAの RT-PCR産物を配列決定し、 pEF-BOSベクターに連結さ せること〖こより構築した。
(IKK iフ—マウス及び TBK1—んマウスの作製）
ΙΚΚ i及び TBK1をコードするゲノム DNA断片を 129ZSvマウスゲノムライブラリ 一からスクリーニングし、制限酵素マッピング及びシーケンシング分析で特徴づけを 行った。 IKK i遺伝子の 1. Okbp断片と TBK1遺伝子の 1. 5kbp断片の両方をネオ マイシン耐性遺伝子カセットで置換し、ターゲテイングベクターを設計した。 MC1プロ モーターにより作動する単純へルぺスウィルスチミジンキナーゼ遺伝子をネガティブ 選択のために用いた。これらのターゲテイングベクターを、胎生 14. 1日目の ES細胞 にトランスフエクシヨンした。 G418及びガンシクロビア二重耐性クローンから、 PCR及 びサザンブロットによりターゲテイングした ES細胞を同定し、その後、 C57BLZ6胚 盤胞中に注入した。得られた雄キメラマウスと C57BLZ6雌マウスとを交配した。その 後、 F1子孫同士をインタークロスさせ、各変異アレルのホモ接合体を作製した。 (ノーザンプロット分析）
Sepazol-RNA I (Nacalai Tesque社製）を用いて全 RNAを単離し、電気泳動にかけ、 ナイロン膜に移した。前記文献（J. Immunol. 167:5887-5894, 2001)記載の cDNAプ ローブを用いて、ハイブリダィゼーシヨンを行った。 cDNAプローブは全て、前記文献 (J. Immunol. 167:5887-5894, 2001)記載のサブトラクティブスクリーニングより得られ た。
(電気泳動移動度シフトアツセィ; EMS A)
野生型胚、 IKK i—ん胚及び ΤΒΚΓん胚から得た EF (1 X 106細胞）を、 1. 0 /z gZ mlの LPSで、所定の時間刺激した。核抽出物を調製し、 NF— κ B結合部位又は IF N刺激制御要素 (ISRE)を含む放射能標識したオリゴヌクレオチドプローブを用いて インキュベーションを行い、前記文献（J. Immunol. 167:5887-5894, 2001)記載の通り オートラジオグラフィ一で視覚化した。
(ウェスタンブロット分析）
核抽出物を SDS— PAGEで分離し、 PVDF膜に移した。抗 IRF— 3抗体（Science. 301:640-643, 2003)及び抗 NF— κ Bp65抗体（Santa Cruz Biotechnology社製）を用 いて、力かる膜にプロットした。力かる膜結合抗体は、 ECLシステム（PerkinElmer Life Sciences社製）を用いて、ゥサギ IgG (Amersham Bioscience社製）に対する西洋わさ びペルォキシダーゼ標識抗体により視覚化した。
(レポーターアツセィ）
ヒト胎児腎臓 293細胞を 24ゥエルプレートに播種し、 Lipofectoamin 2000試薬（ Invitrogen社製）を用いて、レポータープラスミドと共に、所定の発現ベクターでトラン ジェントにトランスフエクシヨンした。 6ゥエルプレートに播種した EFを、 Fu GENE6ト ランスフエクシヨン試薬（Roche Diagnostics社製）を用いて、 IFN— j8プロモーターレポ 一タープラスミドと共に、空の pEF- BOSベクター（MOCK)又は pEF- BOSヒト TBK1 でトランジェントにトランスフエクシヨンした。トランスフエクシヨンから 24時間後、かかる 細胞を 10 gZmlの LPSでさらに 12時間刺激した。全細胞溶解液のルシフェラー ゼ活性は、デュアルルシフェラーゼレポーターアツセィシステム（DuaHuciferase reporter assay system) (Promega社製）を用いて測定した。内部標準として、レニラル 、ノフエフ. ~~ゼレポ ~~タ' ~~遺伝子 (Renilla— luciferase reporter gene) (Promega社製)を 使用した。
(マイクロアレイ分析）
LPSで 2時間若しくは 4時間刺激した EF又は刺激して ヽな 、EF力 全 RNAを抽 出し、 cRNAプローブの合成を行った。製造者の指示に従い、 cRNAの調製、ハイ ブリダィゼーシヨン及びマイクロアレイのスキャニング（scanning)を行った。ァフィメトリ ックスマイクロアレイ MG U74Aバージョン 2 (Aifymetrix社製）を用いて分析を行った 。 Microarray Suite version 5.0 software (Alfymetrix社製)
Figure imgf000014_0001
software ( Silicon Genetics社製）を用いてデータ分析を行った。
実施例 2
[結果]
(IKK iフ—マウス及び ΤΒΚΓんマウスの作製）
IKK i及び TBK1の生理学的役割を検討するため、ジーンターゲテイングにより IK K iフ—マウス及び ΤΒΚΓんマウスを作製した。 ΙΚΚ i—んマウスを作製するためのター ゲティングベクターは、第 2のキナーゼドメインの一部をコードする IKK i遺伝子のェ キソン 7及びェキソン 8を置換するために、ネオマイシン耐性遺伝子カセットを用いて 構築した（図 1A)。 IKK i—んマウスは、予想されたメンデル比で生まれ、繁殖性であ り、健康そうであった（図 1B)。 IKK i遺伝子の N末端断片をプローブとして使用し、 ホモ接合体変異マウスのチォグリコール酸誘発腹膜細胞中の IKK i転写物を検出 した（図 1C)。し力しながら、シーケンシング分析を行ったところ、変異アレルから得た IKK-i mRNAはターゲティングしたェキソンを欠き、早発性（premature)のストップコ ドンを含み、 2つのキナーゼドメインのうち 1つのみを含む切断タンパク質を生成する ことが明らかになった (データは図示せず)。トランジェントなトランスフエクシヨンアツセ ィを用いて、野生型 IKK-iタンパク質及び変異 IKK-iタンパク質の生物活性を評価 した（図 1D)。野生型 IKK iタンパク質は、 IFN— 18プロモーターの活性を投与量依 存的に誘導したが、変異 IKK iタンパク質は誘導しな力つた。したがって、変異 IKK -iタンパク質力 少なくとも IFN- |8の誘導に関しては、生物活性を有さないと結論づ けた。
ΤΒΚΓんマウスを作製するためのターゲテイングベクターは、 TBK1遺伝子のェキ ソン 9を置換するために、ネオマイシン耐性遺伝子カセットを用いて構築した（図 1E) 。 TBK1のへテロ接合体マウスが誕生し、力かるマウスは健康そうであった。しかしな がら、 ΤΒΚΓんマウスは、以前に報告（EMBO J. 19:4976-4985, 2000)されていた通 り、胎生 14. 5日目（E14. 5)頃に死亡した。胎生 12. 5日目の胚から繊維芽細胞 (Ε F)を得て（図 1F)、 TBK1 mRNAの発現を調べた。野生型 EFでは、 TBK1 mRN Aが検出され、 LPS刺激した後に増加した。しかしながら、 ΤΒΚΓん EFでは、 TBK1 mRNAが全く検出されなかったのに対し、 IKK i遺伝子は正常に誘導されていた（ 図 1G)。
(ΙΚΚ-Γん細胞及び ΤΒΚΓん細胞における IL-6産生の誘導）
ΙΚΚ i及び TBK1は、 NF- κ Βの活性化に関係している。 IL 6産生はNF— κ Β に依存するため、本発明者らは、 NF— κ Βを活性ィ匕することで知られている様々な刺 激に応答して、 EFにおける IL— 6の産生を測定した。 EFを、 TNF a、 IL 1 β、 TLR 2リガンドである Pam3CSK4 (細菌性リポペプチド、 BLP)及び TLR4リガンドである L PSで刺激した。図 2Aに示されるように、 IKK i—ん EF及び ΤΒΚΓん EFは、調べた全 ての刺激剤に応答して、野生型細胞と比較して同様の IL 6量を産生した。
(TBK17—EFにおける LPS応答 IFN誘導性遺伝子セットの誘導）
LPS刺激は、 IRF— 3の活性ィ匕を誘導し、 IFN— 18及び IFN誘導性遺伝子セット (a set of lFN-inducible genes)の誘導を引き起こす（J. Immunol. 167:5887-5894, 2001、 Nakaya, T, Μ. bato, Ν. Hata, Μ. As agin, Η. buemon, b. Noguchi, N. Tanaka, and T. Taniguchi. Gene induction pathways mediated by distinct IRFs during viral infection. 2001. Biochem. Biophys. Res. Commun. 283:1150—1156.)。そこで、ノーザ ンブロット分析によりこれら IRF— 3制御遺伝子の発現を調べた（図 2B)。 IKK iフ— E Fにおいては、 LPSに応答して、 IFN— 18及び IL 6遺伝子の発現の増大を示した。 さらに、 LPSで刺激した IKK iフ— EFにおいては、 ISG54、 IP— 10、 IRG1、 RANT ES等の IFN誘導性遺伝子の発現もアップレギュレートした。これらの応答は、 IKK i —んマウス力も得た骨髄由来榭状細胞及びチォグリコール酸誘発腹膜細胞において も、インタタトであった（データは図示せず）。一方、 ΤΒΚΓん EFにおいては、 IFN— β、 ISG54、 IP— 10及び IRG1の mRNA誘導が著しく損なわれたのに対し、 RANT ES及び IL 6の mRNA誘導は野生型細胞と類似して 、た（図 2B)。
[0023] 次に、 LPSで刺激した EFの DNAマイクロアレイ分析を行った。野生型 EF及び TB K17—EFを LPSで 2時間又は 4時間刺激した。野生型 EFに誘導された遺伝子を図 2 Cに示す。 TBKl—ん EFでは、 Mx2、 IRF— 7、インターフェロン誘導性 GTPase、 ISG 15等の IFN誘導性遺伝子は誘導されなカゝつた。一方、 ΤΒΚΓん細胞では、 IL 6、 I CAM— 1、 I κ B— 18等の MyD88依存的遺伝子の誘導が正常であることを示した（図 2C) 0 EMSA分析により、野生型細胞と同様に、 IKK i—ん細胞及び ΤΒΚΓん細胞 の両方においても、 NF— κ Βの正常な活性ィ匕が見られることが明らかになった（図 3 Α)。これに対して、 ΤΒΚΓん細胞では、 ISRE結合活性が誘導されなカゝつた力 野生 型細胞及び ΙΚΚ-Γん細胞の両方にぉ ヽては確認された（図 3Α)。
[0024] IFN- βの誘導に TBK1が必要であることを確認するため、 ΤΒΚΓん細胞中の ΤΒ K1を再構成（re- constitution)力 LPS刺激により IFN— j8プロモーターの活性化を 回復することが可能であるかどうかを調べた（図 3B)。 LPSは、モッタトランスフエクショ ンした野生型 EFにおいては IFN— j8プロモーターを活性化した力 ΤΒΚΓん EFに おいては活性ィ匕しな力つた。し力しながら、ヒト TBK1の一時的な発現は、 LPSで刺 激した ΤΒΚΓん EFの IFN— j8プロモーターを活性化能を付与した。したがって、これ らの結果は、 TLR4仲介 IFN— j8の発現に TBK1が必須であることを示唆している。 (TBK1は、ウィルス感染における IFN— 18遺伝子の誘導に必須の分子）
ウィルス感染は、 IRF - 3のリン酸化及び二量体化を誘導し、 IFN - j8及びその他の 抗ウィルス性分子の誘導を引き起こす（Lin, R, C. Heylbroeck, P. Genin, P. M. Pitha, J. Hiscott. 1999. Essential role of interferon regulatory factor 3 in direct activation of RANTES chemokine transcription. Mol. Cell Biol. 19:959— 9bり.、 Genin, P., M. Algarte, P. Roof, R. Lin, and J. Hiscott. 2000. Regulation of RANTES chemokine gene expression requires cooperativity between NF— kB and
IFN- regulatory factor transcription factors. J. Immunol. Ib4:5352- 5361.)。そこで、 I KK i又は TBKlのどちらが、ウィルスを誘導した遺伝子の発現を仲介するのかを調 ベた（図 4A)。 EFを水疱性口内炎ウィルス (VSV)又はセンダイウィルス (SeV)に感 染させ、ノーザンブロット分析により mRNAの発現を調べた。 IKK i7—EFでは、 VS V又は SeVのウィルス感染に応答して、 IFN—jS、 RANTES及び IP— 10に対する m RNAが、野生型細胞と同様に誘導された。一方、 ΤΒΚΓん細胞では、 IFN— 18の m RNA発現は観察できず、 RANTES及び IP— 10の mRNA発現は生型細胞と比較し て著しく減少した。 IRF— 3の活性ィ匕を調べるため、 VSVに感染した野生型 EF及び T ΒΚΓん EF力も核タンパク質を調製し、免疫プロットを行って IRF-3を検出した。図 4 Bに示されるように、野生型細胞では、核の IRF— 3及び NF— κ Bp65の蓄積が認めら れた。 ΤΒΚΓん細胞では、 IRF— 3の蓄積が損なわれたが、 NF— κ Βρ65の移行には 影響を与えな力つた。これらの結果は、 TBK1が IRF— 3の活性ィ匕に必須の分子であ り、それがウィルス感染において IFN— j8及びその他の抗ウィルス性分子の mRNA 誘導を引き起こすことを示唆する。ウィルス感染した TBK17—EFにおいて、 RANTE S転写物の誘導は損なわれた力 これに対して、 LPSで刺激した場合は、 RANTES の mRNAは明らかに誘導されたことに注目すべきである。
[まとめ]
上記実施例 2により、 IFN— 18を含む IFN誘導遺伝子セットの誘導に TBK1が必須 であることが証明された。これらの遺伝子は、 MyD88非依存的に、しかし TRIF依存 的に制御されており、転写因子 IRF— 3により活性ィ匕される (J. Immunol.
167:5887-5894, 2001, Science. 301:640-643, 2003, Nature. 10.1038/nature01889, 2003参照）。さらに、 TBKlは TRIFと相互作用し、 IRF— 3をリン酸ィ匕すると報告され ており（Science. 300:1148-1151, 2003, Nature Immunol. 4:491-496, 2003参照）、 TB K1が TLR4— TRIF— IRF3シグナル伝達経路に必須の分子であることを示唆してい る。これらのデータと一致して、 ΤΒΚΓん細胞では、 ISRE結合活性の誘導が消滅し た。また、ウィルス感染における、 IFN- jS、 RANTES及び IP— 10の mRNA誘導は 、 ΤΒΚΓん細胞では消滅した。これに対して、 IKK i—ん細胞は、 LPS及びウィルス感 染の両方に応答して、正常なレベルの遺伝子誘導を示した。したがって、インビトロ 研究にお 、て IKK i及び TBK1は同様の機能を示したが（Science. 300: 1148-1151 ,
2003, Nature Immunol. 4:491-496, 2003, Int. Immunol. 11 : 1357-1362, 1999, Mol. Cell. 5:513-522, 2000, Nature. 404:778-782, 2000参照）、上記実施例 2におけるデ ータは、これら 2つのキナーゼカ LPS刺激及びウィルス感染においては異なる機能 を有することを示している。
IKK i及び TBK1は、 IKK α及び IKK |8に関連する分子として最初に同定さ れた。 ΙΚΚ α、 IKK- jS、 IKK i又は TBK1の過剰発現は、 NF— κ Βの活性化を 引き起こす。しかしながら、 ΙΚΚ i及び TBK1は、その NF— κ Bを活性化させる方法 において、 IKK α及び IKK j8とは異なる。 IKK α及び IKK j8は、セリン 32及 びセリン 36の両方をリン酸化するが、 IKK i及び TBK1は、セリン 36のみをリン酸化 する（Int. Immunol. 11 : 1357-1362, 1999, Mol. Cell. 5:513—522, 2000, EMBO J. 18:6694-6704, 1999, Nature. 404:778-782, 2000参照）。さらに、近年の報告により、 IKK i及び TBK1が、 TANKZl— TRAFと相互作用し、リン酸化することや（ΕΜΒΟ
J. 18:6694-6704, 1999, Genes Cells. 5: 191-202, 2000参照）、 IKK i又は TBK1の 存在下では、 TANKと NEMOZIKK— y及び IKK α / β複合体との会合が著し く増加することが分かっており、これらは、 ΙΚΚ i及び TBK1が、 IKK a Z jSの上流 で NF—κ Bの活性化に関与することを示唆している（Chariot A, Leonard A, Muller J, Bonif M, Brown K, Siebenlist U. 2002. Association of the adaptor TANK with the IkB kinase (IKK) regulator NEMO connects IKK complexes with IKKe and TBK1 kinases. J. Biol. Chem. 277:37029—37036. First published on July 19, 2002;
10.1074/jbc.M205069200)。しかしながら、遺伝子ノックアウト研究により、 NF—κ Βの DNA結合活性力 ΤΒΚΓん細胞における TNF ひ又は IL 1刺激のいずれか〖こよ りアップレギュレートすることが明らかになった（Nature. 404:778-782, 2000参照）。ま た、 ΤΒΚΓん EFにおける NF— κ B DNA結合活性のアップレギュレーションは、 ΤΝ F— a及び IL 1 βと同様に LPSに応答して、野生型細胞において認められるアップ レギュレーションに匹敵することを確認した（図 3A)。また、 NF— κ Bの活性ィ匕に依存 する IL 6の産生は、 ΤΒΚΓん細胞では正常であった。 IKK i—ん細胞は LPSに応答 して IL—6の産生の減少を示すことが以前に報告（Kravchenko, V. V., J. C.
Mathison, K. Schwamborn, F. Mercurio, and R. J. Ulevitch. 2003. IKKi/IKKe plays a key role in integrating signals induced by pro-inflammatory stimuli. J. Biol. Chem. 278:26612-26619. First published on May 6, 2003; 10.1074/jbc.M303001200)され ているが、本発明者らの行った実験では、 LPSで刺激した IKK i—ん EFにおいて同 様の NF— κ B活性化及び IL 6産生が認められた。したがって、 IKK i及び TBK1 は、炎症誘発性サイト力インの産生を引き起こす NF— κ Bの活性ィ匕に不必要である ことを示唆している。それでもなお、 IKK i及び TBK1が互いに NF— κ Bの活性化を 補完する可能性を除外することができな 、。
[0026] マクロファージへの TLR3又は TLR4の刺激は、 IFN— β、 IP— 10及び RANTES 遺伝子の IRF— 3依存的で急速なアップレギュレーションを引き起こすことが知られて 、る (Doyle, S. Vaidya, R. 0'し onnell, H. Dadgostar, P. Dempsey, T. Wu, G. Rao, R. Sun, M. Haberland, R. Modlin, and G. Cheng. 2002. IRF3 mediates a TLR3/TLR4— specific antiviral gene program. Immunity. 17:251— 2b3)。上じ実施 [列 2 に示すように、 VSV又は SeVで感染した ΤΒΚΓん EFにおいて、 IFN— j8、 IP— 10及 び RANTES転写物の誘導が消滅することが明らかになった。し力しながら、 LPSに 応答して、 RANTES mRNAは、 TBKl7—EFで誘導された。 RANTESの mRNA 誘導は、野生型細胞と比較して、 ΤΒΚΓん EFにおいてわずかに減少したようであつ た力 この減少は、 IFN— j8の自己分泌産生による二次的なアップレギュレーション が欠如していることが原因力も知れない。現在、この矛盾の分子機構については分 かっていないが、これらの結果は、 RANTES mRNAの発現が、細胞の種類又は適 用した刺激によって、 IFN— 18及び IP— 10の発現とは異なって制御されることを示唆 している。
産業上の利用可能性
[0027] 本発明によると、 LPS及びウィルス感染に応答して、 TBK1は IFN— 18遺伝子の誘 導に必須の構成成分である力 IKK iは必須でないことが明らかになったことから、 TBK1活性をコントロールすることにより、炎症誘発性サイト力インの誘導に影響を与 えることなく IFN— 18の発現を変更することができる。本発明により、敗血性ショック及 びウィルス感染のための新たな治療的処置を得ることが可能となる。

Claims

請求の範囲
[1] 染色体上の TANK結合キナーゼ 1 (TBK1)遺伝子の一部もしくは全部が欠損し、野 生型にお 、て発現される TBK1を発現する機能が失われて 、るマウス、又は該マウ ス由来の組織若しくは細胞と、被検物質と、 TLR4が認識するリガンド又はこれらの含 有物とを用いて、前記マウス又は該マウス由来の組織若しくは細胞における、 TLR4 が認識するリガンド又はこれらの含有物に対する応答の程度を測定'評価することを 特徴とする TLR4が認識するリガンド又はこれらの含有物に対する応答の促進物質 のスクリーニング方法。
[2] TLR4が認識するリガンド又はこれらの含有物に対する応答の程度を測定'評価する に際し、対照としての同腹の野生型マウスとの比較'評価を行うことを特徴とする請求 項 1記載の TLR4が認識するリガンド又はこれらの含有物に対する応答の促進物質 のスクリーニング方法。
[3] マウス由来の細胞力 TBK1ノックアウトマウス由来の胚線維芽細胞であることを特徴 とする請求項 1又は 2記載の TLR4が認識するリガンド又はこれらの含有物に対する 応答の促進物質のスクリーニング方法。
[4] TLR4が認識するリガンド又はこれらの含有物力 リポポリサッカライド (LPS)であるこ とを特徴とする請求項 1一 3のいずれか記載の TLR4が認識するリガンド又はこれら の含有物に対する応答の促進物質のスクリ一二ング方法。
[5] LPS刺激に対する抗ウィルスタンパク質の誘導の程度を測定'評価することを特徴と する請求項 4記載の TLR4が認識するリガンド又はこれらの含有物に対する応答の 促進物質のスクリ一二ング方法。
[6] 抗ウィルスタンパク質力 インターフェロン β (IFN- β )であることを特徴とする請求 項 5記載の TLR4が認識するリガンド又はこれらの含有物に対する応答の促進物質 のスクリーニング方法。
[7] 抗ウィルスタンパク質力 ISG54、 IP— 10又は IRG1であることを特徴とする請求項 5 記載の TLR4が認識するリガンド又はこれらの含有物に対する応答の促進物質のス クリーニング方法。
[8] 抗ウィルスタンパク質力 Mx2、 IRF— 7、インターフェロン誘導性 GTPase、 ISG15 であることを特徴とする請求項 5記載の TLR4が認識するリガンド又はこれらの含有 物に対する応答の促進物質のスクリーニング方法。
[9] LPS刺激に対する ISRE結合活性の誘導の程度を測定'評価することを特徴とする 請求項 4記載の TLR4が認識するリガンド又はこれらの含有物に対する応答の促進 物質のスクリ一ユング方法。
[10] TLR4が認識するリガンド又はこれらの含有物が、ウィルスであることを特徴とする請 求項 1一 3のいずれか記載の TLR4が認識するリガンド又はこれらの含有物に対する 応答の促進物質のスクリーニング方法。
[11] ウィルス感染に対する抗ウィルスタンパク質の誘導の程度を測定'評価することを特 徴とする請求項 10記載の TLR4が認識するリガンド又はこれらの含有物に対する応 答の促進物質のスクリーニング方法。
[12] 抗ウィルスタンパク質力 インターフェロン β (IFN- β )であることを特徴とする請求 項 11記載の TLR4が認識するリガンド又はこれらの含有物に対する応答の促進物質 のスクリーニング方法。
[13] ウィルス感染に対する抗ウィルスタンパク質力 ISG54、 IP— 10、 IRG1又は RANT ESであることを特徴とする請求項 11記載の TLR4が認識するリガンド又はこれらの 含有物に対する応答の促進物質のスクリーニング方法。
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