JP5885154B2 - スフィンゴシン1−リン酸トランスポーターの新規機能 - Google Patents
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Description
[1] Spns2遺伝子を欠損してなる、免疫機能低下非ヒトモデル動物。
[2] 前記Spns2遺伝子の欠損が血管内皮細胞特異的である、[1]に記載の非ヒトモデル動物。
[3] 前記動物がマウスである[1]または[2]に記載の非ヒトモデル動物。
[4] 野生型対照に比べて血中またはリンパ液中のリンパ球の数が減少している、[1]〜[3]に記載の非ヒトモデル動物。
[5] 下記工程:
(a)[1]〜[4]に記載の非ヒトモデル動物及びその野生型対照に被験物質を投与する工程、
(b)前記被験物質を投与した非ヒトモデル動物及び野生型対照における投与前後の血中またはリンパ液中のリンパ球の数を調べ、比較する工程、および、
(c)前記(b)の比較結果に基づいて、血中またはリンパ液中のリンパ球の数を変動させる被験物質を選択する工程を含む、リンパ球のリンパ器官から血中またはリンパ管への遊出を制御する物質のスクリーニング方法。
[6] 被験物質が、以下の工程:
(1)SPNS2発現用細胞に、SPNS2とスフィンゴシンキナーゼを発現させる工程;
(2)上記(1)の細胞培養液に標識したスフィンゴシンを加えて培養し、細胞内に該標識スフィンゴシンを導入し、前記(1)の細胞内で発現したスフィンゴシンキナーゼを反応させて、標識スフィンゴシン1−リン酸を生成させる工程;
(3)さらに、上記(2)の細胞培養液に被験物質を加えて培養し、被験物質と細胞内で発現したSPNS2とを相互作用させる工程;
(4)一定時間培養後に、細胞内外のスフィンゴシン1−リン酸量を測定する工程。
を含む、SPNS2のアンタゴニストおよび/またはアゴニストのスクリーニング方法によってスクリーニングされたアンタゴニストおよび/またはアゴニストである、[5]に記載の方法。
[7] リンパ器官から血中またはリンパ管へのリンパ球遊出を制御する物質が当該遊出を促進させる物質である、[5]または[6]に記載のスクリーニング方法。
[8] リンパ器官から血中またはリンパ管へのリンパ球遊出を制御する物質が当該遊出を阻害する物質である、[5]または[6]に記載のスクリーニング方法。
[9] Spns2遺伝子又はSPNS2の発現または機能を調節する物質を含有してなるリンパ器官から血中またはリンパ管へのリンパ球遊出調節剤。
[10] 物質がSpns2遺伝子又はSPNS2の発現または機能を阻害する物質であり、リンパ器官から血中またはリンパ管へのリンパ球遊出調節が遊出抑制である、[9]に記載の剤。
[11] Spns2遺伝子又はSPNS2の発現または機能を阻害する物質が、下記(i)または(ii)のいずれかである、[10]に記載の剤:
(i)Spns2遺伝子のアンチセンス核酸、リボザイムもしくはRNAi誘導性核酸分子、またはこれらを含む発現ベクター;
(ii)SPNS2に対する抗体もしくはアプタマー、またはこれらをコードする核酸を含む発現ベクター。
[12] 発現ベクターが、血管内皮細胞特異的に発現するものである、[11]に記載の剤。
本発明において「遺伝子」とは、2本鎖DNAのみならず、それを構成するセンス鎖およびアンチセンス鎖といった各1本鎖DNAを包含する趣旨で用いられる。またその長さによって特に制限されるものではない。本発明において遺伝子(DNA)とは、特に言及しない限り、ヒトゲノムDNAを含む2本鎖DNAおよびcDNAを含む1本鎖DNA(正鎖)ならびに該正鎖と相補的な配列を有する1本鎖DNA(相補鎖)、およびこれらの断片のいずれもが含まれる。また当該「遺伝子」には、特定の塩基配列(配列番号1)で示される「遺伝子」だけでなく、これらによりコードされる蛋白質と生物学的機能が同等である蛋白質(例えば同族体(ホモログやスプライスバリアントなど)、変異体および誘導体)をコードする「遺伝子」が包含される。かかる同族体、変異体または誘導体をコードする「遺伝子」としては、具体的には、ストリンジェントな条件下で、前記の配列番号1で示される特定塩基配列の相補配列とハイブリダイズする塩基配列を有する「遺伝子」をあげることができる。なお、ここでストリンジェントな条件は、Berger and Kimmel(1987, Guide to Molecular Cloning Techniques Methods in Enzymology, Vol. 152, Academic Press, San Diego CA)に教示されるように、核酸の融解温度(Tm)に基づいて決定することができる。例えばハイブリダイズ後の洗浄条件として、通常「1×SSC、0.1%SDS、37℃」程度の条件をあげることができる。相補鎖はかかる条件で洗浄しても対象とする正鎖とハイブリダイズ状態を維持するものであることが好ましい。特に制限されないが、より厳しいハイブリダイズ条件として「0.5×SSC、0.1%SDS、42℃」程度、さらに厳しいハイブリダイズ条件として「0.1×SSC、0.1%SDS、65℃」程度の洗浄条件をあげることができる。
[ヒトSPNS2]
ヌクレオチド配列(cDNA配列):アクセッション番号 No.AB441165(配列番号1)
アミノ酸配列:アクセッション番号 No.BAH15192.1(配列番号2)
[マウスSPNS2]
ヌクレオチド配列(cDNA配列):アクセッション番号 AB441166(配列番号3)
アミノ酸配列:アクセッション番号 BAH15193.1(配列番号4)
本発明は、Spns2遺伝子を欠損してなる、免疫機能低下非ヒト動物を提供する。
(a)Spns2遺伝子の欠損を含む胚性幹細胞を提供する工程;
(b)該胚性幹細胞を胚に導入し、キメラ胚を得る工程;
(c)該キメラ胚を動物に移植し、キメラ動物を得る工程;
(a)Spns2遺伝子の欠損を含む胚性幹細胞を提供する工程;
(b)該胚性幹細胞を胚に導入し、キメラ胚を得る工程;
(c)該キメラ胚を動物に移植し、キメラ動物を得る工程;
(d)該キメラ動物を交配させ、Spns2遺伝子欠損ヘテロ接合体を得る工程。
1.別冊 実験医学 ザ・プロトコールシリーズ 「ジーンターデティングの最新技術」(2000年、羊土社)コンディショナルターゲティング法p.115-120
2.バイオマニュアルシリーズ8 「ジーンターゲティング」-ES細胞を用いた変異マウスの作製(1995年、羊土社)p.71-77
3.Sambrookら, Molecular Cloning: A LABORATORY MANUAL, 第3版, COLD SPRING HARBO
R LABORATORY PRESS, 2001年, 4. 82-4.85
4.Robertson E. J. in Teratocarcinomas and embryonic stem cells-a practical approach, ed. Robertson, E. J.(IRL Press, Oxford), 1987: pp.108-112
5.Dynecki, S. M.ら, Gene Targeting -a practical approach, 2nd edition, ed. Joyner, A.L.(Oxford Univ. Press), 2000: pp.68-73
6.Dynecki, S. M. ら, Gene Targeting -a practical approach, 2nd edition, ed. Joyner, A. L.(Oxford Univ. Press), 2000: pp.75-81
本発明はまた、被験物質がSpns2遺伝子の発現または機能を調節することを特徴とする、リンパ球のリンパ器官から血中またはリンパ管への遊出を制御する物質のスクリーニング方法を提供する。
(a)本発明の非ヒトモデル動物及び当該非ヒトモデル動物の野生型対照に被験物質を投与する工程、
(b)前記被験物質を投与した非ヒトモデル動物及び野生型対照における投与前後の血中またはリンパ液中のリンパ球の数の変動を調べ、比較する工程、および、
(c)前記(b)の比較結果に基づいて、血中またはリンパ液中のリンパ球の数を変動させる被験物質を選択する工程。
(1)SPNS2発現用細胞に、SPNS2とスフィンゴシンキナーゼを発現させる工程;
(2)上記(1)の細胞培養液にスフィンゴシンを加えて培養し、細胞内に当該スフィンゴシンを導入し、前記(1)の細胞内で発現したスフィンゴシンキナーゼを反応させて、S1Pを生成させる工程;
(3)さらに、上記(2)の細胞培養液に被験物質を加えて培養し、被験物質と細胞内で発現したSPNS2とを相互作用させる工程;
(4)一定時間培養後に、細胞内外のS1P量を測定する工程。
(1)スフィンゴシンキナーゼおよびSPNS2分子を発現する細胞を構築する工程。
(2)構築した細胞の培養液にスフィンゴシンを加えて培養し、細胞内にスフィンゴシンを導入する工程。導入したスフィンゴシンは、細胞内のスフィンゴシンキナーゼによりS1Pとなる。ここで、導入するスフィンゴシンは、後の検出のために標識ラベルしたものであってもよい。
(3)上記細胞と被験物質を相互作用させ、一定時間培養後、遠心分離などにより細胞と培養液を分離し、細胞内外のS1Pを検出する工程。検出方法は、S1Pが検出可能な方法であればよく、特に限定されない。例えば、クロマトグラフィーや質量分析、またはこれらの組み合わせによって検出することができ、あるいは標識スフィンゴシンから生成した標識S1Pであれば、標識を検出することができる。
(4)被験物質と細胞を相互作用させない場合の細胞内外のS1P量を対照とし、被験物質と細胞を相互作用させた場合の細胞内外のS1Pを比較する工程。
(5)対照の細胞外S1P量に対して、被験物質と細胞を相互作用させた場合の細胞外S1Pが増加した場合に、被験物質はSPNS2アゴニストとし、細胞外S1Pが減少した場合に、被験物質はSPNS2アンタゴニストと判定する工程。
(1)発現ベクターのプロモーターの下流にスフィンゴシンキナーゼコードするcDNAを有するプラスミドを構築し、発現用ベクターを作製してCHO(Chinese Hamster Ovary)細胞に導入し、スフィンゴシンキナーゼ1を発現するCHO細胞(CHO-SphK)を構築する。さらにSPNS2を発現する発現用ベクターを作製し、CHO-SphKに導入する。SPNS2発現確認のために、レポータータンパク質との融合タンパク質を発現する発現用ベクターを用いてもよい。遺伝子の導入は、例えば遺伝子導入試薬(LipofectamineTM-200試薬, Invitogen社)を用いることができる。
(2)CHO-SphKを6−16時間程度培養後、培養液を交換し、標識したスフィンゴシンを加える。脂溶性のスフィンゴシンは、細胞内に発現するマウス・スフィンゴシンキナーゼ1によりリン酸化され、標識S1Pに変換される。
(3)培養液に被験物質を添加し、CO2インキュベータ内で37℃、約30分経過後、各遺伝子を導入したCHO-SphKについて、培地(上清:S)および細胞(沈殿:P)に分離し、抽出された標識S1Pを薄層クロマトグラフィーで展開し、バイオイメージングアナライザーを用いて検出する。
(4)被験物質と細胞を相互作用させない場合の細胞内外のS1P量を対照とし、被験物質と細胞を相互作用させた場合の細胞内外のS1Pを比較する。
(5)対照の細胞外S1P量に対して、被験物質と細胞を相互作用させた場合の細胞外S1Pが増加した場合に、被験物質はSPNS2アゴニストとし、細胞外S1Pが減少した場合に、被験物質はSPNS2アンタゴニストと判定する。
本発明はまた、Spns2遺伝子又はSPNS2の発現または機能を調節する物質を含有してなる、免疫機能調節剤を提供する。本発明の免疫機能調節剤は、リンパ器官から血中またはリンパ管へのリンパ球遊出調節剤であり得る。
2つのloxP部位がエキソン2に隣接するコンディショナルSpns2ノックアウトマウス(Acc. No. CDB0705K:http://www.cdb.riken.jp/arg/mutant%20mice%20list.html)は、(http://www.cdb.riken.jp/arg/Methods.html; 図6A)に記載のとおりに作製した。TT2胚性幹(ES)細胞(T. Yagi et al., Anal. Biochem. 214, 70(1993))をターゲティングベクターでトランスフェクションし、G418の存在下でセレクションし、PCRおよびサザンブロットにより、相同組換えについてスクリーニングした(http://www.cdb.riken.jp/arg/Methods.html)。2種のESクローンを宿主胚に導入し、キメラマウスを作製した。ES細胞の寄与が高いキメラマウスをC57BL/6Jマウスと繁殖させ、標的化対立遺伝子を有しているマウスを作出した。次いで、これらのマウスを、サイトメガロウイルス初期エンハンサー/ニワトリベータアクチンプロモーターの制御下、Flpリコンビナーゼを発現するトランスジェニックマウスと交配させてPKG-Neo-pAカセットを除去し、Spns2がflox化したマウスを得た。Spns2グローバルノックアウトマウスを作製するために、Spns2がflox化したマウスを、サイトメガロウイルスプロモーターの制御下(図6)、Creリコンビナーゼを発現するトランスジェニックマウスと交配させた。内皮細胞においてSpns2遺伝子を不活性化するために、Spns2がflox化したマウスを、Tie2プロモーターでドライブされたCreリコンビナーゼを有するTie2-Creマウス(T. N. Sato(Nara Institute of Science and Technology, Japan)、M. Yanagisawa(University of Texas Southwestern Medical Center, Dallas, TX)より供与された;図6)と繁殖させた。標的化が正確なことを確認するため、ターゲティングベクター(図6)において用いた領域の外側に位置するプローブで、DIG DNA Labeling and Detection Kit(Roche)をプローブ調製用およびハイブリダイゼーション用に用いたこと以外はhttp://www.cdb.riken.jp/arg/protocol.htmlに記載されたプロトコールに従ってサザンブロット解析を行った。マウスの遺伝子型決定のために、フォワードプライマー、5’-aggctcatttcatggctgat-3’(配列番号5)およびリバースプライマー、5’-agccctgtgctctctgttgt-3’(配列番号6)(野生型対立遺伝子の552-bp断片、flox化した対立遺伝子の842-bp断片および欠失対立遺伝子の316-bp断片の産物を生成する)を用いてPCRを行った。マウスは全て特定の病原体フリー条件下で飼育した。動物実験は全て、国立循環器病研究センターの動物委員会で承認され、国立循環器病研究センターの規則にしたがって行った。
EDTAを抗凝固剤として用い、吸入麻酔(イソフルレン)下、腹部大動脈を介して野生型(Spns2+/+、n=4)マウス及びSpns2 KO(Spns2-/-、n=4)マウスから血液を採取した。血液の生化学的パラメータ(総タンパク量、総ビリルビン量、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、アラニンアミノトランスフェラーゼ、トリグリセロール、グルコース、血中尿素窒素およびアルブミン)は、血液のバイオケミカルアナライザー、Fuji DRI-CHEM3500V(Fuji Film)を用いることによって決定した。血液学的パラメータおよび血液凝固パラメータ(白血球、赤血球、血小板、ヘモグロビン、ヘマトクリット値、平均赤血球容積、平均赤血球ヘモグロビン量および平均赤血球ヘモグロビン濃度)はSysmex XT-1800iv hematology analyzer(Sysmex)を用いることによって決定した。
特に明記しない限り、抗マウスモノクローナル抗体はeBioscience Inc.から取得した。細胞表面染色のために用いた抗体は、フィコエリスリン(PE)結合抗CD19(ebio1D3)および抗CD23(B3B4)、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)結合抗B220(RA3-6B2)、抗CD19(1D3)(BD Biosciences)および抗CD8(53-6.7)、パシフィックブルー結合抗IgD(11-26)および抗CD4(RM4-5)(BD Biosciences)、PeCy7結合抗IgM(II/41)およびPerCP-Cy5.5結合抗CD21/CD35(7E9)(BioLegend)であった。新鮮単離した胸腺、脾臓、末梢リンパ節(鼠径部、腋窩および上腕部)ならびに大腿骨および脛骨の全骨髄細胞の単細胞懸濁液を、続けて抗CD16/CD32と10分間インキュベートし、その後にFACS緩衝液(PBS+ 4% 熱により不活性化したFCS + 2 mM EDTA)中で結合抗体を組合せて30分間染色した。抗体染色の前に、250 μlの新鮮な単離血液をへパリン溶液で処理し、BD Pharm Lyse(登録商標)solution(BD Biosciences)で、製造業者のプロトコールに従って赤血球を溶血させた。染色した細胞は、青色(488 nm)、紫色(405 nm)、および赤色(633 nm)レーザーを搭載したFACSCanto II flow cytometer(BD Biosciences)で解析した。FACSのデータはFlowJo software(TreeStar Inc.)で統計学的に解析した。
脾臓、胸腺、腋窩リンパ節、腸間膜リンパ節および小腸(パイエル板を含む)由来の組織サンプルを野生型(Spns2+/+、n=3)およびSpns2 KO(Spns2-/-, n=3)マウスから採取し、20%ホルマリン(中性リン酸緩衝液)中で固定した。各パラフィン包埋組織を4μm厚の切片にし、光学顕微鏡法用にエオシン-ヘマトキシリンで染色した。
S1Pの定量は、以前に記載の方法(A. Inoue et al., EMBO J. 投稿中)をやや修正し、それによって行った。簡単に言うと、血漿および馴化培地を混合し、10倍体積のメタノールおよび内部標準(C17ベースを含有するスフィンガニン−1−リン酸)と共に超音波破砕した。同様に、細胞からのS1P抽出は細胞をメタノール中でホモジェナイズおよび超音波破砕することにより行った。21,500 x gで遠心後、生じた上清を回収してLC−MS/MS解析に用いた。20μlのメタノール抽出物を注入し、溶媒A(水中5 mMギ酸アンモニウム)および溶媒B(95%(v/v)アセトニトリル中5 mMギ酸アンモニウム)を用い、C18 CAPCELL PAK ACR column(1.5 x 250 mm, Shiseido)を搭載したNanospace LC(Shiseido)で分離した。溶離液はESIプローブにより順にイオン化し、親イオン(m/z 380.2)および断片イオン(m/z 264.2)をQuantum Ultra triple quadrupole mass spectrometer(Thermo Fisher Scientific)でポジティブ・モードでモニターした。同様に、リゾホスファチジン酸(LPA)、リゾホスファチジルコリン(LPC)、リゾホスファチジルエタノールアミン(LPE)、リゾホスファチジルグリセロール(LPG)、リゾホスファチジルイノシトール(LPI)、リゾホスファチジルセリン(LPS)を含む他のリゾリン脂質をメタノールで抽出し、LC-MS/MSシステムにより解析した。リゾリン脂質の各クラスについては、12種のアシル鎖(14:0, 16:0, 16:1, 18:0, 18:1, 18:2, 18:3, 20:3, 20:4, 20:5, 22:5および22:6)をモニターした。
ヘパリン処理したシリンジを用い、麻酔した野生型(Spns2+/+、n=4)マウスおよびSpns2 KO(Spns2-/-、n=4)マウスから下大静脈を介して血液を採取し、抗凝固剤としてEDTAを含有するチューブに移した。4℃、1,200 x g 5分間の遠心により血球を血漿から分離し、氷冷PBSで2回洗浄して血漿の残留物を除去した。血球を20 mM Hepes, pH7.4, 138 mM NaCl, 3.3 mM NaH2PO4, 2.9 mM KCl, 1.0 mM MgCl2, 1 mg/mlグルコースおよび1%の脂肪酸フリーのウシ血清アルブミンを含有する氷冷インキュベーション緩衝液中に5 x 108 cells/mlの細胞密度で再懸濁した。500μlの血球懸濁液(2.5 x 108 cells/ml)を4℃または37℃で90分間インキュベートした。インキュベート後、4℃での1,200 x g 5分間の遠心により血球をペレットにした。上清中のS1Pレベルを上記のとおり決定した。血液細胞中のS1P総量を定量するため、4℃での1,200 x g 5分間の遠心により細胞を500μlの細胞懸濁液から回収し、100μlのメタノール中でホモジェナイズした。
ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)、ヒト微小血管内皮細胞(HMVEC)およびヒト大動脈内皮細胞(HAEC)をKuraboから購入し、以前に記載されたとおり(S. Fukuhara et al., Nat. Cell Biol 10, 513(2008))維持した。ヒト皮膚リンパ管内皮細胞(HDLEC)はLonzaから取得し、内皮細胞増殖培地、EGM-2(Lonza)中で維持した。HeLa細胞およびHEK293細胞は10%ウシ血清および抗生物質(ストレプトマイシン100 μg/mlおよびペニシリン100 U/ml)を補充したDulbecco改変Eagle's培地(Nissui)中で培養した。ヒトSpns2を標的にしたステルスsiRNA、Spns2#1(HSS151335(auaucucggagccaugagguccgggcccggaccucauggcuccgagauau;配列番号7))およびSpns2#2(HSS151336(aaucccguaaagcaggugauggcccgggccaucaccugcuuuacgggauu;配列番号8))はInvitrogen Corp.から購入した。コントロールとして、無関係な配列のsiRNA二重鎖を用いた。Lipofectamine RNAi MAX reagent(Invitrogen Corp.)を用いて、HUVECを20 nMのsiRNA二重鎖でトランスフェクションした。48時間培養後、細胞を実験用に用いた。
コントロールsiRNAまたは独立した2種のSpns2 siRNAのいずれかで、或いはそれ無しでトランスフェクションしたHUVECを剥離させ、コラーゲンでコーティングした24ウェルプレートに再びプレーティング(2.5 x 105細胞/well)し、12時間培養した。次いで、細胞をmedium 199(Invitrogen Corp.)で2回洗浄し、20 mM Hepes, pH 7.4、10 mMグリセロリン酸ナトリウム、5 mMフッ化ナトリウム、1 mMセミカルバジド、0.5%の脂肪酸フリーのウシ血清アルブミン、40 ng/ml血管内皮細胞増殖因子、40 ng/ml線維芽細胞増殖因子2、および400 ng/mlアンジオポイエチン1を含有するmedium 199 200μl中でインキュベートした。12時間後、馴化培地を回収し、4℃で5分間、15,000 x gで遠心して細胞残屑を除去した。馴化培地のS1Pレベルは上記のとおり決定した。
in situハイブリダイゼーションはGenostaff Co., Ltdにより行った。8週齢のマウスの胸腺を、灌流した後切除し、Tissue Fixative(Genostaff)で固定し、次いでその専用の手順でパラフィンに包埋し、6μmの切片にした。in situハイブリダイゼーションのために、組織切片をキシレンで脱ワックスし、エタノール系列およびPBSによって再水和した。切片をPBS中、4%パラホルムアルデヒドで15分間固定し、次いでPBSで洗浄した。切片をPBS中8 μg/mlのプロテイナーゼKで30分間、37℃で処理し、PBSで洗浄し、PBS中、4%パラホルムアルデヒドで再固定し、再びPBSで洗浄し、0.2 N HCl中に10分間置いた。PBSで洗浄後、0.1 Mトリエタノールアミン-HCl、pH 8.0、0.25%無水酢酸で10分間インキュベートすることにより、切片をアセチル化した。PBSで洗浄後、切片をエタノール系列により脱水した。Spns2のcDNAテンプレートは、マウスSpns2 cDNA(GenBank Accession No. NM_153060.2)の1629-2163塩基に対応する535-bpの断片であった。Spns2 mRNAのセンスおよびアンチセンスのリボプローブは、digoxigenin RNA labeling kit(Roche)を用い、製造業者のプロトコールに従って合成した。ハイブリダイゼーションは、Probe Diluent-1(Genostaff)中、300 ng/mlのプローブ濃度で、60℃で16時間行った。ハイブリダイゼーションの後、切片を5xSSCと同等の5xHybriWash(Genostaff)中で、50℃で20分間洗浄し、次いで50%ホルムアミド、2xHybriWash中で、50℃で20分間洗浄した後、10 mM Tris-HCl、pH 8.0、1 M NaClおよび1 mM EDTA中50 μg/ml RNaseAで、37℃で30分間RNase処理した。次いで、切片を2xHybriWashで、50℃で20分間、2回、0.2xHybriWashで、50℃で20分間、2回、そしてTBST(0.1% Tween20 in TBS)で1回洗浄した。TBST中0.5% blocking reagent(Roche)で30分間処理した後、切片をTBSTで1:1000希釈したanti-DIG AP conjugate(Roche)と室温で2時間、インキュベートした。切片をTBSTで2回洗浄し、次いで100 mM NaCl、50 mM MgCl2、0.1% Tween20、100 mM Tris-HCl、pH 9.5中でインキュベートした。発色反応はNBT/BCIP solution(Sigma)で一晩行い、次いでPBSで洗浄した。切片はKernechtrot stain solution(Mutoh)で対比染色し、脱水し、Malinol(DBS)とマウントした。
内皮細胞におけるSpns2の発現を測定するために、図13の説明中に示した細胞から、TRIzol reagent(Invitrogen Corp.)を用いて全RNAを調製し、Superscript II(Invitrogen Corp.)を用い、製造業者の指示書に従って、ランダムヘキサマープライマーにより逆転写した。PCRは、ヒトSpns2の遺伝子特異的プライマーを用いて行った。グリセロアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH)の増幅も、コントロールとして平行して行った。Spns2のsiRNA媒介性ノックダウンの有効性を評価するため、コントロールsiRNAまたは独立した2種のSpns2 siRNAのいずれかで、或いはそれ無しでトランスフェクションしたHUVECから全RNAを抽出し、既報(J. Zhang et al., J. Biol. Chem. 286, 8055(2011))に従って、QuantiFast SYBR Green RT-PCR kit(Qiagen)を用いた定量的リアルタイム逆転写(RT)-PCR解析に供した。各反応に関しては、100 ngの全RNAを50℃で10分間転写し、その後に95度の変性過程を5分ならびに95℃10秒および60℃30秒を40サイクル続けた。蛍光データは、Mastercycler ep realplex(Eppendorf)を用いて収集し解析した。標準化のために、ヒトGAPDHの発現を、内在性コントロールとして並行して測定した。RT-PCRおよびリアルタイムRT-PCRの両方の研究のために、以下のプライマー:
ヒトSpns2、5’-actttggggtcaaggaccga-3’(配列番号9)および5’-aatcaccttcctgttgaagcg-3’ (配列番号10)
ヒトGAPDH、5’-atggggaaggtgaaggtcg-3’ (配列番号11)および5’-ggggtcattgatggcaacaata-3’ (配列番号12)
を用いた。
データはGraphPad Prism software(GraphPad Software Inc.)を用いて解析した。統計学的有意性は、対応のある標本についてはMann-Whitney U検定(両側検定)、また複数の群については一元配置分散分析およびノンパラメトリック検定を用いて決定した。P-値< 0.05を統計学的有意とみなした。
S1Pは、密接に関連する2つのアイソザイム、スフィンゴシンキナーゼ1および2により細胞の内側で生成され、細胞の外側へと移行して、その細胞表面受容体を刺激する(S. Spiegel, S. Milstien, J. Biol. Chem. 282, 2125(2007))。in vitroの解析により、ATP結合カセットトランスポーターが、肥満細胞、赤血球、乳癌細胞および星状細胞等のいくつかの細胞種においてS1P放出を媒介することが明らかとなっている(N. Kobayashi, N. Kobayashi, A. Yamaguchi, T. Nishi, J. Biol. Chem. 284, 21192(2009)、P. Mitra et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 16394(2006)、K. Sato et al., J. Neurochem.(2007)、K. Takabe et al., J. Biol. Chem. 285, 10477(2010))。本発明者らおよび他の研究者は、ゼブラフィッシュにおいて、Spns2をS1Pトランスポーターと同定している(A. Kawahara et al., Science 323, 524(2009)、N. Osborne et al., Curr. Biol. 18, 1882(2008))。しかしながら、動物におけるSpns2の生理学的機能は全く知られていままであった。更に、S1P媒介性リンパ球輸送の原因となるS1Pトランスポーターは同定されていなかった。
Claims (10)
- Spns2遺伝子を欠損してなる、免疫機能低下非ヒトモデル動物。
- 前記Spns2遺伝子の欠損が血管内皮細胞特異的である、請求項1に記載の非ヒトモデル動物。
- 前記動物がマウスである請求項1または2に記載の非ヒトモデル動物。
- 野生型対照に比べて血中またはリンパ液中のリンパ球の数が減少している、請求項1〜3のいずれか1項に記載の非ヒトモデル動物。
- 下記工程:
(a)請求項1〜4のいずれか1項に記載の非ヒトモデル動物及びその野生型対照に被験物質を投与する工程、
(b)前記被験物質を投与した非ヒトモデル動物及び野生型対照における投与前後の血中またはリンパ液中のリンパ球の数を調べ、比較する工程、および、
(c)前記(b)の比較結果に基づいて、血中またはリンパ液中のリンパ球の数を変動させる被験物質を選択する工程を含む、リンパ球のリンパ器官から血中またはリンパ管への遊出を制御する物質のスクリーニング方法。 - 被験物質が、以下の工程:
(1)SPNS2発現用細胞に、SPNS2とスフィンゴシンキナーゼを発現させる工程;
(2)上記(1)の細胞培養液に標識したスフィンゴシンを加えて培養し、細胞内に該標識スフィンゴシンを導入し、前記(1)の細胞内で発現したスフィンゴシンキナーゼを反応させて、標識スフィンゴシン1−リン酸を生成させる工程;
(3)さらに、上記(2)の細胞培養液に被験物質を加えて培養し、被験物質と細胞内で発現したSPNS2とを相互作用させる工程;
(4)一定時間培養後に、細胞内外のスフィンゴシン1−リン酸量を測定する工程。
を含む、SPNS2のアンタゴニストおよび/またはアゴニストのスクリーニング方法によってスクリーニングされたアンタゴニストおよび/またはアゴニストである、請求項5に記載の方法。 - リンパ器官から血中またはリンパ管へのリンパ球遊出を制御する物質が当該遊出を促進させる物質である、請求項5または6に記載のスクリーニング方法。
- リンパ器官から血中またはリンパ管へのリンパ球遊出を制御する物質が当該遊出を阻害する物質である、請求項5または6に記載のスクリーニング方法。
- Spns2遺伝子又はSPNS2の発現または機能を阻害する物質を含有してなるリンパ器官から血中またはリンパ管へのリンパ球遊出抑制剤であって、
物質が、下記(i)または(ii):
(i)Spns2遺伝子のアンチセンス核酸、リボザイムもしくはRNAi誘導性核酸分子、またはこれらを含む発現ベクター;
(ii)SPNS2に対する抗体もしくはアプタマー、またはこれらをコードする核酸を含む発現ベクター
のいずれかである、リンパ球遊出抑制剤。 - 発現ベクターが、血管内皮細胞特異的に発現するものである、請求項9に記載の剤。
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