CN115927472A - 一种抗vegf抗体体内表达系统的构建和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种表达抗VEGF抗体基因片段系统的构建和应用，用于治疗新生血管增生疾病，包括与年龄相关的黄斑变性，糖尿病黄斑水肿等。具有表达稳定，长期有效，组织损伤风险低等优点。

Description

一种抗VEGF抗体体内表达系统的构建和应用

优先权信息

本申请要求于2021年7月5日提交的中国申请号为的202110757277.9优先权，其全部内容通过引用的方式并入本文。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种表达抗VEGF抗体基因片段系统的构建和应用。具体地说，是以基因治疗载体传输大分子药物基因体内表达以直接发挥生物功能的方法。该方法免除了传统大分子药物生产纯化的复杂工艺，在体内持续稳定表达治疗剂量的生物活性大分子。

背景技术

年龄相关性黄斑变性(AMD)和糖尿病视网膜病变(DR)是致盲的两个主要病因。年龄相关性黄斑变性(AMD)是一种能够导致中心视力丧失的疾病，累及黄斑，黄斑位于视网膜的中心，是眼后部的感光组织，提供清晰的中心视觉，视网膜是一层薄薄的组织，排列在眼睛的后部并接收光线，视网膜将光或图像转换成电冲动，然后将这些冲动或神经信号传递到大脑形成视觉。AMD引起的损害显著地影响眼睛将这些信号转换成图像的能力，视网膜下形成黄色沉积物(drusen)，导致视力扭曲和模糊，随着时间的推移，沉积物的大小和数量增加。这导致血管在视网膜下生长(血管生成)，从而泄漏血液并损伤视网膜。外围视觉(侧视觉)可能不受影响，但在晚期AMD中，直接看到前方的能力丧失。年龄相关性黄斑变性(AMD)有干性和湿性两种类型。干性年龄相关性黄斑变性视网膜色素上皮层、Bruch膜、脉络膜毛细血管等各层逐渐萎缩变性，一旦干性年龄相关性黄斑变性进展到晚期，没有任何治疗可防止视力丧失，无治疗意义。

本发明所针对的AMD为湿性年龄相关性黄斑变性(wet age-related maculardegeneration，wAMD)，原因是玻璃膜疣等引起的bruch膜损害，诱发脉络膜的毛细血管向外层长出新生血管(即choroidal neovascularization，CNV)，新生血管伴有成纤维细胞增生，可破坏脉络膜毛细血管、bruch膜、色素上皮细胞和光感受器细胞，引起严重的视力丧失。

目前湿性年龄相关性黄斑变性采取激光疗法、光动力疗法或者注射疗法。激光疗法用高能量的光束直接对准新生血管，破坏它们来防止进一步的视力丧失。激光治疗也能破坏周围一些健康组织，因此只有一小部分湿性AMD患者适合激光治疗。如果渗漏血管远离黄斑中心凹，则适合激光治疗。光动力疗法(photodynamic therapy，PDT)维替泊芬为第二代卟啉类光敏剂，可被光(波长 689nm)照射激活，通过非热能的激光照射，产生活性氧而闭塞不正常血管，从而终止血管的渗漏，保存视力。注射维替泊芬到手臂静脉血管中，这种药“粘附”于新生血管表面，然后用光束照入患者眼睛的病变部位约90秒，激活新生血管中的药物。与普通激光治疗不同，这种药物不会破坏周围健康组织，但是因为这种药物能被光激活，因此治疗后五天内必须避免皮肤和眼睛暴露于太阳光和室内明亮光线下。注射治疗，即抗血管内皮细胞生长因子疗法。湿性AMD患者眼内的血管内皮细胞因子(VEGF)异常增高，促进了异常新生血管增长，药物治疗例如Ranibizumab可以阻止这种生长因子的作用，该疗法有助于延缓AMD引起的视力丧失，某些情况下能提高视力。

但是激光治疗后新生血管复发的危险性很高，光动力疗法能延缓视力下降速率，但不能阻止视力丧失或恢复已经因晚期AMD而丧失的视力，通常都需要重复治疗。注射治疗目前也需要多次注射。

糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy,DR)是糖尿病性微血管病变中最重要的表现，是一种具有特异性改变的眼底病变，是糖尿病的严重并发症之一。临床上根据是否出现视网膜新生血管为标志，将没有视网膜新生血管形成的糖尿病性视网膜病变称为非增殖性糖尿病性视网膜病变(non- proliferative diabetic retinopathy，NPDR)(或称单纯型或背景型)，而将有视网膜新生血管形成的糖尿病性视网膜病变称为增殖性糖尿病性视网膜病变(proliferative diabetic retinopathy，PDR)。非增殖期的糖尿病视网膜病变的眼底表现为：视网膜静脉扩张、微血管瘤、深层和浅层出血、硬性渗出、棉絮斑、视网膜水肿，长期的黄斑水肿形成黄斑囊样水肿，视力明显下降。增殖期糖尿病视网膜病变损害进一步加重，较大面积毛细血管闭塞缺血，则发生视网膜新生血管，进而新生血管由视网膜表面长入内界膜与玻璃体后界膜间，形成纤维血管膜。新生血管易破裂出血，大量玻璃体积血、机化，导致牵拉性视网膜脱离。缺血区的视网膜产生的血管生长因子，经玻璃体进入前房，致虹膜、房角新生血管形成，最终导致继发闭角型青光眼即新生血管性青光眼。

糖尿病黄斑水肿(DMO)属于糖尿病视网膜病变的一种，是指由糖尿病引起在黄斑中心凹一个视盘直径范围内，细胞外液积聚所致的视网膜增厚或硬性渗出沉积。在过去三十多年中，增殖性糖尿病视网膜病变的早期筛查和预防使其发病率逐年下降，因此，现阶段DMO成为DM患者最主要的致盲原因。DMO最主要的结构改变是血-视网膜屏障的破坏，DM环境使一些紧密连接蛋白遭到破坏，最终导致血管渗漏以及其通透性改变。造成这一改变最主要的分子介质为视网膜合成的血管内皮生长因子(VEGF)。

在DR的治疗方法中，药物治疗如羟苯磺酸钙、递法明、弥可保等主要用于非增殖期糖尿病视网膜病变。

激光光凝是通过其损伤作用，对有病变组织进行破坏，使之从耗氧变为不耗氧，进而使健康的视网膜组织有更好的氧气供应，有助于新生血管的逐渐萎缩，但是光凝的目的是尽量保持视力，阻止病变恶化。它是通过破坏不正常的视网膜，阻止新生血管形成和液体渗漏，然而，疾病仍在发展，不正常的新生血管和渗漏仍可以继续，还需要再次治疗。

玻璃体切除手术是治疗增殖性糖尿病视网膜病变的非常有效的方法，使屈光间质清晰，移走积血及分解物质并将机化膜切断、吸出，消除纤维组织赖以生长的支架，松解对视网膜的牵拉，并注入液体及(或)气体，恢复正常的视网膜解剖关系，保持眼球完整，还可以同时进行眼内光凝。早期的手术成功率可达90％以上，部分患者可以恢复视力，控制疾病的发展。但是，一旦进入疾病的晚期，手术则难以成功。眼部新生血管增生是年龄相关性黄斑变病(AMD)和糖尿病视网膜病变 (DR)主要的病理性标志，血管内皮生长因子(VEGF)在其发病机制中起着重要作用。目前临床治疗以抗VEGF抗体为治疗标准，阻止VEGF引起的新生血管增生，临床效果良好。

单克隆抗体(mAbs)彻底改变了生物学和医学领域。自1989年Ferrara教授等证实血管内皮因子具有促进血管内皮细胞增殖作用以来，VEGF家族细胞因子VEGF-A、B、C、D、E及PLGF 陆续被发现，其中VEGF-A和受体结合触发系列级联反应，促进血管内皮细胞分裂增生，新生血管生成，并维持新生血管的存活，VEGF-A是炎症细胞趋化因子，增加血管渗透性，在手术剥离的wAMD新生血管膜样本上检测到VEGF-A的高表达。作为CNV形成和进展的主要因素，VEGF-A是wAMD和DR的主要治疗靶点。目前临床上抗VEGF蛋白质药物眼部注射已成为治疗眼部新生血管增生疾病的主要药物。然而这种治疗方式需要长期重复注射，给病人带来了很多痛苦和不便。

因为临床建议的治疗剂量需要重复多次注射给药，具有波动的血浆浓度，难以维持稳定的血浆水平；并且由于反复注射，患者需承受多次注射带来的组织损伤和痛苦，同时带来的是临床治疗费用极高。这是蛋白质药物临床眼部注射应用的主要缺点。重组腺相关病毒载体(rAAV)引导的基因疗法可以克服这些缺点。

腺相关病毒(Adeno-associated virus，AAV)是一种微小的(25毫微米)复制缺陷型病毒，属微小病毒科(parvovirus)，为无包膜的单链线状DNA病毒。重组腺相关病毒(rAAV)是用任何感兴趣的基因或DNA序列取代野生型病毒基因组而构建的，可以感染复制期细胞和静止期细胞，具有长效的转基因表达优越性，并且没有观察到病毒引起的病理毒理反应。因此rAAV是近几十年来基因治疗最常用的重组病毒。

发明内容

本文的一方面，提供了一种重组核酸，其特征在于，所述重组核酸编码一个anti-VEGF重链，所述anti-VEGF重链的编码序列包含与选自SEQ ID NO:5-6和23-26中的一个序列有≥90％、≥95％、≥96％、≥97％、≥98％、≥99％、≥99.5％或100％相同性的序列。在一些实施例中，所述anti- VEGF重链的氨基酸序列包含与选自SEQ ID NO:17-18中的一个序列有≥90％、≥95％、≥96％、≥97％、≥98％、≥99％、≥99.5％或100％相同性的序列。在一些实施例中，所述anti-VEGF重链的互补决定区 1(CDR1)，互补决定区2(CDR2)，和互补决定区3(CDR3)的序列分别与SEQ ID NO:31，SEQ ID NO:32，和SEQ ID NO:33相同。在一些实施例中，所述anti-VEGF重链不包含恒定区2(CH2) 以及恒定区3(CH3)。

本文的一方面，提供了一种重组核酸，其特征在于，所述重组核酸编码一个anti-VEGF轻链，所述anti-VEGF轻链的编码序列包含与选自SEQ ID NO:4和19-22中的一个序列有≥90％、≥95％、≥96％、≥97％、≥98％、≥99％、≥99.5％或100％相同性的序列。在一些实施例中，所述anti-VEGF轻链的氨基酸序列包含与SEQ ID NO:16有≥90％、≥95％、≥96％、≥97％、≥98％、≥99％、≥99.5％或100％相同性的序列。在一些实施例中，所述anti-VEGF轻链的互补决定区1(CDR1)，互补决定区2(CDR2)，和互补决定区3(CDR3)的序列分别与SEQ ID NO:28，SEQ ID NO:29，和SEQ ID NO:30相同。

在一些实施例中，所述重组核酸还编码一个anti-VEGF轻链，所述anti-VEGF轻链的编码序列包含与选自SEQ ID NO:4和19-22中的一个序列有≥90％、≥95％、≥96％、≥97％、≥98％、≥99％、≥99.5％或100％相同性的序列。在一些实施例中，所述anti-VEGF轻链的氨基酸序列包含与SEQ ID NO:16有≥90％、≥95％、≥96％、≥97％、≥98％、≥99％、≥99.5％或100％相同性的序列。在一些实施例中，所述anti-VEGF轻链的互补决定区1(CDR1)，互补决定区2(CDR2)，和互补决定区3(CDR3) 的序列分别与SEQ ID NO:28，SEQ IDNO:29，和SEQ ID NO:30相同。在一些实施例中，所述SEQ ID NO:4和19-22以及所述SEQ IDNO:5-6和23-26的组合为选自表1的一个组合。在一些实施例中，所述SEQ ID NO:4和19-22以及所述SEQ ID NO:5-6和23-26的组合为选自表3的一个组合。在一些实施例中，所述anti-VEGF重链的编码序列包含与SEQ ID NO:25有≥90％、≥95％、≥96％、≥97％、≥98％、≥99％、≥99.5％或100％相同性的序列，所述anti-VEGF轻链的编码序列包含与SEQID NO:21有≥90％、≥95％、≥96％、≥97％、≥98％、≥99％、≥99.5％或100％相同性的序列。在一些实施例中，所述anti-VEGF重链的编码序列包含与SEQ ID NO:25有≥99％、≥99.5％或100％相同性的序列，所述anti-VEGF轻链的编码序列包含与SEQ ID NO:21有≥99％、≥99.5％或100％相同性的序列。在一些实施例中，所述anti-VEGF轻链的编码序列位于所述anti-VEGF重链的编码序列的上游 (5’端)。

在一些实施例中，在所述anti-VEGF轻链的编码序列和所述anti-VEGF重链的编码序列之间，包含连接肽的编码序列。在一些实施例中，所述连接肽的氨基酸序列包含SEQ IDNO:14-15任一项，或与SEQ ID NO:14-15任一项有不多于1个，不多于2个，或不多于3个氨基酸的差异的序列。

在一些实施例中，所述的重组核酸包含一个启动子和/或增强子，且所述启动子和/或增强子与编码所述anti-VEGF轻链和/或所述anti-VEGF重链的开放阅读框可操作地连接；可选地，所述启动子为chickenβ-actin启动子；可选地，所述增强子为CMV增强子。在一些实施例中，所述启动子/增强子的序列包含与SEQ ID NO:1有≥90％、≥95％、≥96％、≥97％、≥98％、≥99％、≥99.5％或100％相同性的序列。

在一些实施例中，所述重组核酸包含一个或多个信号肽编码序列，所述信号肽编码序列位于所述anti-VEGF重链的编码序列和/或所述anti-VEGF轻链的编码序列的上游(5’端)。在一些实施例中，在所述anti-VEGF重链的编码序列的5’端连接所述信号肽编码序列；优选地，与anti-VEGF 重链连接的所述信号肽包含与SEQ ID NO:8-13和34-35任一项有≥90％、≥95％、≥96％、≥97％、≥98％、≥99％、或100％相同性的氨基酸序列；优选地，与SEQ ID NO:34有≥90％、≥95％、≥96％、≥97％、≥98％、≥99％、或100％相同性。在一些实施例中，在所述anti-VEGF轻链的编码序列的5’端连接所述信号肽编码序列；优选地，与anti-VEGF轻链连接的所述信号肽包含与SEQ ID NO:8-13和 34-35任一项有≥90％、≥95％、≥96％、≥97％、≥98％、≥99％、或100％相同性的氨基酸序列；优选地，与SEQ IDNO:35有≥90％、≥95％、≥96％、≥97％、≥98％、≥99％、或100％相同性。

在一些实施例中，所述的重组核酸包含一个内含子；可选地，所述内含子位于所述启动子/ 增强子的序列和所述信号肽的编码序列之间。在一些实施例中，所述内含子的序列包含与SEQ ID NO:2-3任一项有≥90％、≥95％、≥96％、≥97％、≥98％、≥99％、≥99.5％或100％相同性的序列。

在一些实施例中，所述的重组核酸包含多聚腺苷酸链(poly(A))序列，所述poly(A)序列位于所述anti-VEGF重链的编码序列和/或所述anti-VEGF轻链的编码序列下游(3’端)；可选地，所述多聚腺苷酸链为人生长激素多聚腺苷酸链。在一些实施例中，所述poly(A)序列包含与SEQ ID NO:7有≥90％、≥95％、≥96％、≥97％、≥98％、≥99％、≥99.5％、或100％相同性的序列。

在一些实施例中，所述的重组核酸包含拨鼠乙肝病毒转录后调控元件(WPRE)序列，所述 WPRE序列位于编码所述anti-VEGF轻链和/或所述anti-VEGF重链的开放阅读框和多聚腺苷酸链 (poly(A))序列之间。在一些实施例中，所述WPRE序列包含与SEQ ID NO:27有≥90％、≥95％、≥96％、≥97％、≥98％、≥99％、≥99.5％、或100％相同性的序列。

本文的一方面，提供了一种病毒载体，其特征在于，所述载体含有如本文所述的一种重组核酸。在一些实施例中，所述载体为腺相关病毒(AAV)载体。在一些实施例中，所述腺相关病毒载体的血清型为选自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAVrh10、 AAV2.7m8、AAV-DJ、AAV-PHP.B、AAV-PHP.S、AAV-PHP.eB中的一种或多种。在一些实施例中，所述载体还包含AAV反向末端重复序列ITR。

本文的一方面，提供了一种病毒粒子，其特征在于，含有如本文所述的一种载体。在一些实施例中，所述病毒粒子为AAV病毒粒子。在一些实施例中，所述AAV病毒粒子的血清型为选自 AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAVrh10、AAV2.7m8、AAV-DJ、AAV-PHP.B、AAV-PHP.S、AAV-PHP.eB中的一种或多种。

本文的一方面，提供了一种药物制剂，其特征在于，所述药物制剂含有如本文所述的一种病毒粒子、如本文所述的一种载体、或如本文所述的一种重组核酸，以及药学上可接受的载剂或赋形剂。在一些实施例中，所述药物制剂为液体制剂。

本文的一方面，提供了如本文所述的一种病毒粒子、如本文所述的一种载体、或如本文所述的一种重组核酸在制备药物中的用途，所述用途是治疗眼部疾病。

本文的一方面，提供了一种治疗眼部疾病的方法，包含向有需要的受试者施用如本文所述的一种药物制、一种病毒粒子、一种载体、或一种重组核酸。

在一些实施例中，所述眼部疾病为脉络膜新生血管性疾病。在一些实施例中，所述脉络膜新生血管性疾病所述脉络膜新生血管性疾病为年龄相关性黄斑变性或糖尿病视网膜变性；优选地，所述糖尿病视网膜变性为糖尿病黄斑水肿。在一些实施例中，所述病毒粒子、所述载体、所述重组核酸、或所述药物制剂经眼内注射；优选地，通过玻璃体腔注射。在一些实施例中，所述病毒粒子、所述载体、或所述药物制剂能够在眼内长效表达anti-VEGF抗体或其抗原结合片段，阻止VEGF过表达引起的所述眼部疾病。

附图说明

图1显示的是所构建AAV质粒载体的细胞转染表达和筛选：雷珠单抗(Lucentis)1ug作为标准品对照。

图2a显示的是所构建AAV质粒载体体外表达的anti-VEGF Fab与人VEGF特异性结合，与小鼠血清无结合的WB实验结果。

图2b显示的是所构建AAV质粒载体体外表达的anti-VEGF Fab与人VEGF特异性结合，而与大鼠和小鼠血清无结合的WB实验结果(对照组为Lucentis孵育组)。

图3显示的是用ELISA实验结果证明Lucentis与人VEGF特异性结合，而与大鼠和小鼠血清无结合。

图4显示的是所构建AAV质粒载体通过三质粒系统生产AAVMDR病毒载体的电泳胶检测结果。

图5a显示的是本申请所生产的AAVMDR病毒感染细胞后表达的anti-VEGF Fab的WB检测结果。图5b显示的是本申请所生产的AAVMDR病毒感染细胞后表达的anti-VEGF Fab的ELISA 检测结果。

图6显示的是本申请所生产的AAVMDR病毒在小鼠眼部玻璃腔内表达anti-VEGFFab的 WB检测结果。

图7显示的是本申请所生产的AAVMDR病毒，梯度感染小鼠玻璃体腔后表达的anti-VEGF Fab的ELISA检测结果。

图8显示的是本申请所述病毒AAVMDR体内长效表达anti-VEGF Fab的WB检测结果。

图9显示的是本申请所述病毒AAVMDR感染Rho-hVEGF转基因小鼠，2周，4周后小鼠视网膜全组织铺片荧光照片，检测AAVMDR病毒体内表达anti-VEGF Fab的抗新生血管增生作用。

图10显示的是本申请所述密码子优化后构建到pcDNA3.1质粒上的细胞转染表达和筛选结果。

图11显示的是本申请所述病毒载体质粒密码子优化后细胞转染表达和筛选结果。

图12显示的是本申请所述AAV质粒载体通过三质粒系统生产AAVOPT5-WPREm病毒的电泳胶检测结果。

图13显示的是本申请所生产的AAVOPT和AAVMDR病毒感染细胞后表达anti-VEGFFab 的ELISA检测结果。

图14a显示的是本申请所述AAVOPT5-WPREm病毒对HUVECs增殖的影响。图14b显示的是相关统计数据。

图15a-15c显示的是本申请所述AAVOPT5-WPREm病毒对HUVECs管腔形成的影响。

图16显示的是本申请所述AAVOPT5-WPREm病毒感染Rho-hVEGF转基因小鼠后在小鼠体内表达anti-VEGF Fab的抗血管增生作用。

具体实施方式

本发明的一方面，构建高表达rAAV表达载体，用一个合成启动子，引导抗VEGF(anti- VEGF)抗体基因片段在体内高表达；用AAV包装表达基因，输送到眼部玻璃腔表达，用于治疗与新生血管增生相关性的眼部黄斑病变疾病。这种基因药物给药方式，单次给药，引导治疗基因的长期表达，能克服反复注射引起的眼球损伤，造福患者，并且与目前重组蛋白疗法相比，医疗费用将明显降低。

定义

除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语都具有与本公开所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。尽管类似于或等同于本文中的那些的任何方法和材料可用于实践或测试本文中的制剂和单位剂量，但现在描述一些方法和材料。除非另有说明，否则本文采用或考虑的技术是标准方法。所述材料、方法和实例仅是说明性的而不是限制性的。

如本文和在所附权利要求书中所使用，单数形式“一个/种(a/an)”和“所述(the)”包括复数对象，除非上下文另外清楚地规定。因此，例如，对“一种化合物”的提及包括多种此类剂，并且对“所述盐”的提及包括对一种或多种盐(或多种盐)及其本领域技术人员已知的等效物等等的提及。

如本文所用，除非另有说明，否则术语“或”可以是连词或反意连词。如本文所用，除非另有说明，否则任何实施方案都可以与任何其他实施方案组合。

如本文所用，除非另有说明，否则本文中的一些发明实施方案考虑了数值范围。当存在范围时，所述范围包括范围端点。此外，范围内的每个子范围和值都存在，就好像明确写出一样。

如本文所用，关于参考数值及其语法等效物的术语“约”及其语法等效物可包括所述值的加或减10％的值范围，诸如所述值的加或减10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％的值范围。例如，“约10”的量包括9至11的量。

术语“包含(comprising)”(以及相关术语，诸如“包含(comprise)”或“包含(comprises)”或“具有 (having)”或“包括(including)”)不旨在排除在其他一些实施例中，例如本文中的任何物质组成、组合物、方法或工艺等的实施方案可“由所述特征组成(consist of)”或“基本上由所述特征组成(consist essentially of)”。

术语“受试者”是指已经或将成为治疗、观察或实验对象的哺乳动物。术语“哺乳动物”旨在具有其标准含义，并且涵盖例如人、狗、猫、羊和牛。本文中的方法可用于人类疗法和兽医应用两者。在一些实施例中，受试者是人。

术语“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”涵盖将至少一种本文公开的化合物或其药学上可接受的盐施用于需要这种施用的哺乳动物受试者(特别是人受试者)并且包括(i)阻止疾病诸如癌症的临床症状的发展、(ii)使疾病诸如癌症的临床症状消退和/或(iii)用于预防疾病诸如癌症发作的预防性治疗。

本文中的术语化学实体的“治疗有效量”是指当施用于人受试者或非人受试者时有效提供治疗益处诸如改善症状、减缓疾病进展或预防疾病的量。

如本文所用，除非另有说明，否则术语“核酸”和“多核苷酸”可以互换使用。

术语“启动子”意指启动特定基因的转录所需的由哺乳动物细胞中的酶/蛋白质识别的DNA 序列。例如，与RNA聚合酶和/或任何相关因子结合并在此处启动转录的核苷酸序列。本文描述了启动子的非限制性实例，例如但不限于CB7启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子、劳氏肉瘤病毒 (RSV)启动子、GFAP启动子(胶质原纤维酸性蛋白)、MBP启动子(髓磷脂碱性蛋白)、MMT启动子、EF-1α启动子、UB6启动子、鸡β-肌动蛋白启动子、CAG启动子、RPE65启动子和视蛋白启动子、肝特异性启动子，诸如TBG(甲状腺素结合球蛋白)启动子、APOA2启动子、SERPINA1(hAAT) 启动子、或mIR122启动子、或肌肉特异性启动子，诸如人结蛋白启动子或Pitx3启动子、诱导型启动子，诸如缺氧诱导型启动子或药物诱导型启动子。在一些实施例中，本文提供的病毒载体包含一个或多个控制转基因表达的启动子。在一些实施例中，启动子是组成型启动子。在一些实施例中， CB7启动子包括增强通过载体驱动的转基因表达的其他控制元件。在一些实施例中，启动子包括 TATA盒。在一些实施例中，本文提供的载体包含一个或多个组织特异性启动子(例如，视网膜色素上皮细胞特异性启动子，CNS-特异性启动子，肝特异性启动子或肌肉特异性启动子)。在一些实施例中，本文提供的病毒载体包含RPE65启动子或视蛋白启动子(视网膜细胞/CNS特异性启动子)。在一些实施例中，启动子是诱导型启动子。在一些实施例中，启动子是缺氧诱导型启动子。在一些实施例中，启动子包含缺氧诱导型因子(HIF)结合位点。在一些实施例中，启动子包含HIF-1α结合位点。

术语“增强子”是指可增加编码感兴趣的蛋白。例如，特异性结合到VEGF的抗体或其抗原结合抗体片段或可溶性VEGF受体)的核酸的转录水平的核苷酸序列。增强子序列(长度为50-1500 个碱基对)通常通过为转录相关蛋白(例如，转录因子)提供额外的结合位点来增加转录水平。在一些实施例中，在内含子序列内发现增强子序列。与启动子序列不同，增强子序列可在离转录起始位点更大的距离处起作用(例如，与启动子相比)。增强子的非限制性实例包括RSV增强子、CMV 增强子或SV40增强子。

术语“内含子”是指基因中无编码作用的片段或间插序列。例如，鸡β-肌动蛋白内含子、小鼠微小病毒(MVM)内含子、人因子IX内含子、β-珠蛋白剪切供体/免疫球蛋白重链剪切受体内含子、腺病毒剪切供体/免疫球蛋白剪切受体内含子、SV40晚期剪切供体/剪切受体(19S/16S)内含子和杂合(hybrid)腺病毒剪切供体/IgG剪切受体内含子和多腺苷酸化信号，诸如兔β-珠蛋白多腺苷酸化信号、人生长激素(hGH)多腺苷酸化信号、SV40晚期多腺苷酸化信号、合成的多聚腺苷酸(SPA) 信号和牛生长激素(bGH)多腺苷酸化信号等。在一些实施例中，所述内含子是合成内含子1(SEQ ID NO:2)。在一些实施例中，所述内含子是合成内含子2(SEQ ID NO:3)。

术语“信号肽”是指存在于新生分泌蛋白的N端，但不存在于天然存在的成熟蛋白中的序列。在信号肽被翻译后，“信号肽”被蛋白酶(例如，信号肽酶)裂解。一种方法是使用来自与被表达的蛋白同源的蛋白的信号肽。例如，人抗体信号肽可以用于在CHO或其他细胞中表达IgG。另一种方法是鉴定针对用于表达的特定宿主细胞优化的信号肽。信号肽可以在不同蛋白之间或甚至在不同生物的蛋白之间互换，通常细胞类型的最丰富分泌的蛋白的信号序列被用于蛋白表达。例如，发现血浆中最丰富的蛋白—人白蛋白—的信号肽显著增加在CHO细胞中的蛋白生产收率。在优选实施方案中，信号序列与重链和轻链序列两者融合。优选的序列是用于在眼部/CNS组织中表达的信号肽。信号肽的非限制性实例包括：信号肽1(SEQ ID NO:8)、信号肽2(SEQ ID NO:9)、信号肽3(SEQ ID NO:10)、信号肽4(SEQ ID NO:11)、信号肽5(SEQ ID NO:12)、信号肽6(SEQ ID NO:13)、信号肽7(SEQ ID NO:34)、和信号肽8(SEQ ID NO:35)。

术语“连接肽”是指分隔重链和轻链的编码序列。例如，弗林蛋白酶-F2A连接肽(Fang等， 2005，Nature Biotechnology 23：584-590，和Fang，2007，Mol Ther 15:1153-9，它们各自通过引用完整地结合于此)可以结合到表达盒中以分隔重链和轻链编码序列。可以使用的另外的连接肽包括但不限于：连接肽1(SEQ ID NO:14)或连接肽2(SEQ ID NO:15)。

术语“土拨鼠乙肝病毒转录后调控元件(WPRE)”是一种DNA序列，具有gamma、alpha和 beta成分的三方调节元素，在转录时会产生增强表达的三级结构。该序列通常用于增加病毒载体传递的基因的表达。将它添加至哺乳动物表达盒的3'非翻译区(UTR)时，它可以显着提高mRNA 稳定性和蛋白质产量。可以使用的WPRE序列包括但不限于SEQ ID NO:27。

术语“poly(A)序列”或“多聚腺苷酸化信号序列”是指触发mRNA的核酸内切酶裂解并且在裂解的mRNA的3’端添加一系列腺苷的序列。在一些实施例中，poly(A)信号序列位于编码抗体重链、抗体轻链或抗原结合抗体片段的核酸序列的3’处。Poly(A)尾巴及其结合的蛋白质有助于保护mRNA免受核酸外切酶的降解。多聚腺苷酸化对于转录终止、mRNA从细胞核中输出和翻译也很重要。DNA转录为RNA后，多聚腺苷酸化在细胞核中发生，但随后也可在细胞质中发生。转录终止后，通过与RNA聚合酶相关联的核酸内切酶复合物的作用使mRNA链裂解。存在可使用的若干种poly(A)信号序列，包括源自以下的那些序列：牛生长激素(bgh)、小鼠β-珠蛋白、小鼠α-珠蛋白、人胶原蛋白、多瘤病毒、单纯疱疹病毒胸苷激酶基因(HSV TK)、IgG重链基因多聚腺苷酸化信号、人生长激素(hGH)、由SV40 poly(A)位点组成的组，诸如SV40晚期和早期的poly(A) 位点等。在一些实施例中，所述poly(A)序列是人生长激素多聚腺苷酸链hGH Poly(A)的序列 (SEQ ID NO:7)。

重组核酸

一方面，本发明能用于表达抗VEGF的抗体或其抗原结合片段。在一些实施例中，本文中的抗体或其抗原结合片段根据Drug bank上公布的兰尼单抗(雷珠单抗)氨基酸序列(DB01270)。在一些实施例中，本文中的抗体或其抗原结合片段缺少一个或多个的抗体恒定区(CH)。例如，雷珠单抗的序列缺少恒定区2(CH2)以及恒定区3(CH3)。因此，在一些实施例中，本文中的抗体不包含恒定区2(CH2)。因此，在一些实施例中，本文中的抗体不包含恒定区3(CH3)。在一些实施例中，本文中的抗体不包含恒定区2(CH2)以及恒定区3(CH3)。在一些实施例中，本文中的抗体包含重链可变区(VH)，重链恒定区1(CH1)，轻链可变区(VL)，以及轻链恒定区(CL)，但不包含恒定区2(CH2)以及恒定区3(CH3)。

在一些实施例中，本文中的抗体或其抗原结合片段选自多克隆抗体、单克隆抗体、人源化抗体、人抗体、单链Fv(scFv)、单结构域抗体、Fab、F(ab’)2、单链双抗体，抗体模拟物和抗体可变结构域。在一些实施例中，本文中的抗体为Fab。

一方面，本发明提供一种重组核酸。在一些实施例中，该重组核酸包含抗体基因片段表达框。在一些实施例中，该重组核酸包含一下的一种或多种元件：合成启动子驱动；信号肽引导的anti- VEGF抗体基因片段；自我切割的连接肽，5端加人源内切酶；人生长激素多聚腺苷酸(poly(A)) 的加尾信号。在一些实施例中，表达框的两端由AAV2型的反向末端重复序列包装整合(package)。

在一些实施例中，本文中的重组核酸包含一个anti-VEGF重链的编码序列。在一些实施例中，所述anti-VEGF重链不包含恒定区2(CH2)。在一些实施例中，所述anti-VEGF重链不包含恒定区3(CH3)。在一些实施例中，所述anti-VEGF重链包含：

a)与SEQ ID NO:5有≥90％、≥95％、≥96％、≥97％、≥98％、≥99％、≥99.5％或100％相同性的序列；优选地，与SEQ ID NO:5有≥99％相同性的序列；更优选地，与SEQ IDNO:5有≥99.5％相同性的序列；更优选地，与SEQ ID NO:5有100％相同性的序列；

b)与SEQ ID NO:6有≥90％、≥95％、≥96％、≥97％、≥98％、≥99％、≥99.5％或100％相同性的序列；优选地，与SEQ ID NO:6有≥99％相同性的序列；更优选地，与SEQ IDNO:6有≥99.5％相同性的序列；更优选地，与SEQ ID NO:6有100％相同性的序列；

c)与SEQ ID NO:23有≥90％、≥95％、≥96％、≥97％、≥98％、≥99％、≥99.5％或100％相同性的序列；优选地，与SEQ ID NO:23有≥99％相同性的序列；更优选地，与SEQID NO:23 有≥99.5％相同性的序列；更优选地，与SEQ ID NO:23有100％相同性的序列；

d)与SEQ ID NO:24有≥90％、≥95％、≥96％、≥97％、≥98％、≥99％、≥99.5％或100％相同性的序列；优选地，与SEQ ID NO:24有≥99％相同性的序列；更优选地，与SEQID NO:24 有≥99.5％相同性的序列；更优选地，与SEQ ID NO:24有100％相同性的序列；

e)与SEQ ID NO:25有≥90％、≥95％、≥96％、≥97％、≥98％、≥99％、≥99.5％或100％相同性的序列；优选地，与SEQ ID NO:25有≥99％相同性的序列；更优选地，与SEQID NO:25 有≥99.5％相同性的序列；更优选地，与SEQ ID NO:25有100％相同性的序列；或

f)与SEQ ID NO:26有≥90％、≥95％、≥96％、≥97％、≥98％、≥99％、≥99.5％或100％相同性的序列；优选地，与SEQ ID NO:26有≥99％相同性的序列；更优选地，与SEQID NO:26 有≥99.5％相同性的序列；更优选地，与SEQ ID NO:26有100％相同性的序列。

在一些实施例中，本文中的重组核酸包含一个anti-VEGF轻链的编码序列。在一些实施例中，所述anti-VEGF轻链包含：

a)与SEQ ID NO:4有≥90％、≥95％、≥96％、≥97％、≥98％、≥99％、≥99.5％或100％相同性的序列；优选地，与SEQ ID NO:4有≥99％相同性的序列；更优选地，与SEQ IDNO:4有≥99.5％相同性的序列；更优选地，与SEQ ID NO:4有100％相同性的序列；

b)与SEQ ID NO:19有≥90％、≥95％、≥96％、≥97％、≥98％、≥99％、≥99.5％或100％相同性的序列；优选地，与SEQ ID NO:19有≥99％相同性的序列；更优选地，与SEQID NO:19 有≥99.5％相同性的序列；更优选地，与SEQ ID NO:19有100％相同性的序列；

c)与SEQ ID NO:20有≥90％、≥95％、≥96％、≥97％、≥98％、≥99％、≥99.5％或100％相同性的序列；优选地，与SEQ ID NO:20有≥99％相同性的序列；更优选地，与SEQID NO:20 有≥99.5％相同性的序列；更优选地，与SEQ ID NO:20有100％相同性的序列；

d)与SEQ ID NO:21有≥90％、≥95％、≥96％、≥97％、≥98％、≥99％、≥99.5％或100％相同性的序列；优选地，与SEQ ID NO:21有≥99％相同性的序列；更优选地，与SEQID NO:21 有≥99.5％相同性的序列；更优选地，与SEQ ID NO:21有100％相同性的序列；或

e)与SEQ ID NO:22有≥90％、≥95％、≥96％、≥97％、≥98％、≥99％、≥99.5％或100％相同性的序列；优选地，与SEQ ID NO:22有≥99％相同性的序列；更优选地，与SEQID NO:22 有≥99.5％相同性的序列；更优选地，与SEQ ID NO:22有100％相同性的序列。

在一些实施例中，本文中的重组核酸包含选自表1中的anti-VEGF重链与anti-VEGF轻链的编码序列组合：

表1：anti-VEGF重链与anti-VEGF轻链的编码序列组合

“X”表示一个可选的anti-VEGF重链与anti-VEGF轻链的编码序列组合。

在一些实施例中，本文中的重组核酸包含一个anti-VEGF重链的编码序列和一个anti-VEGF 轻链的编码序列，其中，所述anti-VEGF重链的编码序列包含与SEQ ID NO:25有≥90％、≥95％、≥96％、≥97％、≥98％、≥99％、≥99.5％或100％相同性的序列，所述anti-VEGF轻链的编码序列包含与SEQ ID NO:21有≥90％、≥95％、≥96％、≥97％、≥98％、≥99％、≥99.5％或100％相同性的序列。在一些实施例中，所述anti-VEGF重链的编码序列包含与SEQ ID NO:25有≥95％相同性的序列，所述 anti-VEGF轻链的编码序列包含与SEQ ID NO:21有≥95％相同性的序列。在一些实施例中，所述anti- VEGF重链的编码序列包含与SEQ ID NO:25有≥99％相同性的序列，所述anti-VEGF轻链的编码序列包含与SEQID NO:21有≥95％相同性的序列。在一些实施例中，所述anti-VEGF重链的编码序列包含与SEQ ID NO:25有≥95％相同性的序列，所述anti-VEGF轻链的编码序列包含与SEQ ID NO:21有≥99％相同性的序列。在一些实施例中，所述anti-VEGF重链的编码序列包含与SEQ IDNO:25 有≥99％相同性的序列，所述anti-VEGF轻链的编码序列包含与SEQ ID NO:21有≥99％相同性的序列。在一些实施例中，所述anti-VEGF重链的编码序列包含与SEQ ID NO:25有≥99.5％相同性的序列，所述anti-VEGF轻链的编码序列包含与SEQ ID NO:21有≥99.5％相同性的序列。在一些实施例中，所述anti-VEGF重链的编码序列包含与SEQ ID NO:25有100％相同性的序列，所述anti-VEGF 轻链的编码序列包含与SEQ ID NO:21有≥99％相同性的序列。在一些实施例中，所述anti-VEGF重链的编码序列包含与SEQ ID NO:25有≥99％相同性的序列，所述anti-VEGF轻链的编码序列包含与 SEQ ID NO:21有100％相同性的序列。在一些实施例中，所述anti-VEGF重链的编码序列包含与 SEQ ID NO:25有≥99.5％相同性的序列，所述anti-VEGF轻链的编码序列包含与SEQ ID NO:21有 100％相同性的序列。在一些实施例中，所述anti-VEGF重链的编码序列包含与SEQ ID NO:25有 100％相同性的序列，所述anti-VEGF轻链的编码序列包含与SEQ ID NO:21有≥99.5％相同性的序列。在一些实施例中，所述anti-VEGF重链的编码序列包含与SEQ ID NO:25有100％相同性的序列，所述anti-VEGF轻链的编码序列包含与SEQ ID NO:21有100％相同性的序列。

在一些实施例中，所述anti-VEGF重链的氨基酸序列包含与SEQ ID NO:17有≥90％、≥95％、≥96％、≥97％、≥98％、≥99％、≥99.5％或100％相同性的序列；优选地，与SEQ ID NO:17有≥99％相同性的序列；更优选地，与SEQ ID NO:17有≥99.5％相同性的序列；更优选地，与SEQ ID NO:17 有100％相同性的序列。在一些实施例中，所述anti-VEGF重链的氨基酸序列包含与SEQ ID NO:18 有≥90％、≥95％、≥96％、≥97％、≥98％、≥99％、≥99.5％或100％相同性的序列；优选地，与SEQ ID NO:18有≥99％相同性的序列；更优选地，与SEQ ID NO:17有≥99.5％相同性的序列；更优选地，与 SEQ ID NO:18有100％相同性的序列。

在一些实施例中，所述anti-VEGF重链的互补决定区1(CDR1)，互补决定区2(CDR2)，和互补决定区3(CDR3)的序列与SEQ ID NO:17的CDR1，CDR2，和CDR3序列相同。在一些实施例中，所述anti-VEGF重链包含以下三个互补决定区(CDR)：

CDR1:GYDFTHYGMN(SEQ ID NO:31)

CDR2:WINTYTGEPTYAADFKR(SEQ ID NO:32)

CDR3:YPYYYGTSHWYFDV(SEQ ID NO:33)

在一些实施例中，所述anti-VEGF轻链的氨基酸序列包含与SEQ ID NO:16有≥90％、≥95％、≥96％、≥97％、≥98％、≥99％、≥99.5％或100％相同性的序列；优选地，与SEQ ID NO:16有≥99％相同性的序列；更优选地，与SEQ ID NO:16有≥99.5％相同性的序列；更优选地，与SEQ ID NO:16 有100％相同性的序列。在一些实施例中，所述anti-VEGF轻链的互补决定区1(CDR1)，互补决定区2(CDR2)，和互补决定区3(CDR3)的序列与SEQ ID NO:16的CDR1，CDR2，和CDR3序列相同。在一些实施例中，所述anti-VEGF轻链包含以下三个互补决定区(CDR)：

CDR1:SASQDISNYLN(SEQ ID NO:28)

CDR2:FTSSLHS(SEQ ID NO:29)

CDR3:QQYSTVPWT(SEQ ID NO:30)

在一些实施例中，本文中的重组核酸包含一个anti-VEGF重链的编码序列和一个anti-VEGF 轻链的编码序列，其中，所述anti-VEGF轻链的编码序列位于所述anti-VEGF重链的编码序列的上游(5’端)。在一些实施例中，所述anti-VEGF轻链的编码序列位于所述anti-VEGF重链的编码序列的下游(3’端)。

在一些实施例中，在anti-VEGF轻链的编码序列和anti-VEGF重链的编码序列之间，包含连接肽的编码序列。在一些实施例中，连接肽为可自我切割的连接肽。在一些实施例中，连接肽为 2A自切割连接肽，例如T2A，P2A，E2A，F2A。在一些实施例中，连接肽的氨基酸序列包含与SEQ ID NO:14有≥90％、≥95％、≥96％、≥97％、≥98％、≥99％、或100％相同性的序列。在一些实施例中，连接肽的氨基酸序列包含与SEQ ID NO:15有≥90％、≥95％、≥96％、≥97％、≥98％、≥99％、或100％相同性的序列。

在一些实施例中，重组核酸含一个启动子(Promoter)，该启动子与编码anti-VEGF轻链和 /或anti-VEGF重链的开放阅读框(Open Reading Frame，ORF)可操作地连接(operably linked)。在一些实施例中，该启动子为chickenβ-actin启动子。

在一些实施例中，重组核酸含一个增强子，该增强子与编码anti-VEGF轻链和/或anti-VEGF 重链的开放阅读框(Open Reading Frame，ORF)可操作地连接(operablylinked)。在一些实施例中，该增强子为CMV增强子。

在一些实施例中，重组核酸包含与开放阅读框以操作地连接的启动子/增强子的序列，所述启动子/增强子序列包含与SEQ ID NO:1有≥90％、≥95％、≥96％、≥97％、≥98％、≥99％、≥99.5％或 100％相同性的序列。

在一些实施例中，重组核酸包含一个内含子。在一些实施例中，该内含子位于启动子/增强子的序列和(第一个)信号肽的编码序列之间。在一些实施例中，所述内含子的序列包含与SEQ ID NO:2有≥90％、≥95％、≥96％、≥97％、≥98％、≥99％、≥99.5％或100％相同性的序列。在一些实施例中，所述内含子的序列包含与SEQ ID NO:3有≥90％、≥95％、≥96％、≥97％、≥98％、≥99％、≥99.5％或100％相同性的序列。

在一些实施例中，重组核酸中编码anti-VEGF轻链和/或anti-VEGF重链的开放阅读框还包含一个或多个信号肽编码序列。在一些实施例中，所述(第一个)信号肽编码序列位于开放阅读框的5’端。在一些实施例中，所述信号肽编码序列位于所述anti-VEGF重链编码序列和/或所述anti- VEGF轻链编码序列的上游(5’端)。

在一些实施例中，所述信号肽包含与SEQ ID NO:8-13和34-35任一项有≥90％、≥95％、≥96％、≥97％、≥98％、≥99％、或100％相同性的氨基酸序列。在一些实施例中，所述信号肽包含与 SEQ ID NO:8相同的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:8有不多于1个，不多于2个，不多于3个，或不多于4个氨基酸的差异。在一些实施例中，所述信号肽包含与SEQ IDNO:9相同的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:9有不多于1个，不多于2个，不多于3个，或不多于4个氨基酸的差异。在一些实施例中，所述信号肽包含与SEQ ID NO:10相同的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:10有不多于1 个，不多于2个，不多于3个，或不多于4个氨基酸的差异。在一些实施例中，所述信号肽包含与 SEQ ID NO:11相同的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:11有不多于1个，不多于2个，不多于3个，或不多于4个氨基酸的差异。在一些实施例中，所述信号肽包含与SEQ ID NO:12相同的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:12有不多于1个，不多于2个，不多于3个，或不多于4个氨基酸的差异。在一些实施例中，所述信号肽包含与SEQ ID NO:13相同的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:13有不多于1个，不多于2个，不多于3个，或不多于4个氨基酸的差异。在一些实施例中，所述信号肽包含与SEQ ID NO:34相同的氨基酸序列，或与SEQ IDNO:34有不多于1个，不多于2个，不多于3个，或不多于4个氨基酸的差异。在一些实施例中，所述信号肽包含与SEQ ID NO:35相同的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:35有不多于1个，不多于2个，不多于3个，或不多于4个氨基酸的差异。

在一些实施例中，重组核酸包含一个多聚腺苷酸链(poly(A))序列。在一些实施例中，所述poly(A)序列位于所述anti-VEGF重链编码序列和/或所述anti-VEGF轻链编码序列的下游(3’端)。在一些实施例中，所述poly(A)序列与所述anti-VEGF重链编码序列和/或所述anti-VEGF轻链编码序列可操作地连接。在一些实施例中，所述poly(A)序列为人生长激素多聚腺苷酸链。在一些实施例中，所述poly(A)序列包含与SEQ ID NO:7有≥90％、≥95％、≥96％、≥97％、≥98％、≥99％、≥99.5％、或100％相同性的序列。

在一些实施例中，重组核酸包含拨鼠乙肝病毒转录后调控元件(WPRE)序列。在一些实施例中，所述WPRE序列与所述anti-VEGF重链编码序列和/或所述anti-VEGF轻链编码序列可操作地连接。在一些实施例中，所述WPRE序列包含与SEQ ID NO:27有≥90％、≥95％、≥96％、≥97％、≥98％、≥99％、≥99.5％、或100％相同性的序列。

在一些实施例中，本文的重组核酸包含选自下表2的1)一个或多个核苷酸序列；和/或2) 一个或多个编码选自下表的氨基酸序列的序列。

表2：本文包含的DNA/氨基酸序列

序列号	序列名	DNA/氨基酸序列
			SEQ ID NO:1	CMV增强子和chickenβ-actin启动子	DNA序列
SEQ ID NO:2	合成内含子1	DNA序列
			SEQ ID NO:3	合成内含子2	DNA序列
SEQ ID NO:7	人生长激素多聚腺苷酸链	DNA序列
			SEQ ID NO:8：	信号肽1	氨基酸序列
SEQ ID NO:9：	信号肽2	氨基酸序列
			SEQ ID NO:10：	信号肽3	氨基酸序列
SEQ ID NO:11：	信号肽4	氨基酸序列
			SEQ ID NO:12	信号肽5	氨基酸序列
SEQ ID NO:13	信号肽6	氨基酸序列
			SEQ ID NO:34	信号肽7	氨基酸序列
SEQ ID NO:35	信号肽8	氨基酸序列
			SEQ ID NO:14	连接肽1	氨基酸序列
SEQ ID NO:15	连接肽2	氨基酸序列
			SEQ ID NO:27	土拨鼠乙肝病毒转录后调控元件(WPRE)	DNA序列
SEQ ID NO:4	anti-VEGF轻链1	DNA序列
			SEQ ID NO:19	anti-VEGF轻链2	DNA序列
SEQ ID NO:20	anti-VEGF轻链3	DNA序列
			SEQ ID NO:21	anti-VEGF轻链4	DNA序列
SEQ ID NO:22	anti-VEGF轻链5	DNA序列
			SEQ ID NO:5	anti-VEGF重链1	DNA序列
SEQ ID NO:6	anti-VEGF重链2	DNA序列
			SEQ ID NO:23	anti-VEGF重链3	DNA序列
SEQ ID NO:24	anti-VEGF重链4	DNA序列
			SEQ ID NO:25	anti-VEGF重链5	DNA序列
SEQ ID NO:26	anti-VEGF重链6	DNA序列
			SEQ ID NO:16	anti-VEGF轻链	氨基酸序列
SEQ ID NO:17	anti-VEGF重链a	氨基酸序列
			SEQ ID NO:18	anti-VEGF重链b	氨基酸序列

在一些实施例中，所述重组核酸包含，从5’至3’方向，增强子和启动子序列，内含子序列，第一个信号肽的编码序列，anti-VEGF轻链的编码序列，连接肽的编码序列，第二个信号肽的编码序列，anti-VEGF重链的编码序列，和poly(A)信号序列。在一些实施例中，所述重组核酸还包含WPRE 序列，位于poly(A)信号序列之前。在一些实施例中，WPRE序列在编码anti-VEGF轻链/重链的开放读码框之后。在一些实施例中，以上几个核苷酸序列的相邻两个序列之间无多余的核苷酸序列存在。

核酸

本文中的核酸和多肽可用于本公开的方法和载体。在一些实施例中，特异性结合本文中的核酸和多肽的适体可用于本公开的方法和载体。如本文所用，核酸可包含脱氧核糖核苷酸(DNA)或核糖核苷酸(RNA)(无论是单个的或呈聚合物形式的、天然存在的或非天然存在的、双链的或单链的、编码的(例如翻译的基因)或非编码的(例如调节区))或其任何片段、衍生物、模拟物或互补物。在一些实施例中，核酸可以包括寡核苷酸、核苷酸、多核苷酸、核酸序列、基因组序列、互补DNA(cDNA)、反义核酸、DNA区、探针、引物、基因、调节区、内含子、外显子、开放阅读框、结合位点、靶核酸和等位基因特异性核酸。如本文所用，“杂合体”包括在上述核酸(在相同类型内或跨不同类型)中任一者之间形成的双链，包括DNA-DNA、DNA-RNA、RNA-RNA等。

如本文所用，“分离的”核酸与通常侧接基因或核苷酸序列(如在基因组序列中)的核酸分离和 /或已从其他转录序列(例如，如在RNA库中)完全或部分纯化。例如，本公开的分离的核酸可以相对于其天然存在的复杂细胞环境、或当通过重组技术产生时的培养基、或当化学合成时的化学前体或其他化学品基本上分离。在一些情况下，分离的材料可以形成组合物的一部分，例如，含有其他物质的粗提取物、缓冲系统或试剂混合物。在一些实施例中，可以使用本领域已知的方法，例如通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)或柱色谱法(例如，HPLC)将材料纯化至基本均质。关于基因组DNA (gDNA)，术语“分离的”还可以是指核酸从与基因组DNA天然相关的染色体分离。例如，分离的核酸分子可以含有小于约250kb、200kb、150kb、100kb、75kb、50kb、25kb、10kb、5kb、4kb、 3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb的核苷酸，所述核苷酸侧接核酸分子来源的细胞的gDNA中的核酸分子。

核酸可以与其他编码或调节序列融合，可以认为是分离的。例如，载体中含有的重组DNA 包括在如本文所用的“分离的”定义中。在一些实施例中，分离的核酸可以包括异源宿主细胞或异源生物体中的重组DNA分子，以及溶液中部分或基本上纯化的DNA分子。分离的核酸还涵盖本公开的DNA分子的体内和体外RNA转录物。分离的核酸分子或核苷酸序列可以化学合成或通过重组手段合成。此类分离的核苷酸序列可用于例如制造编码的多肽，作为探针用于分离同源序列(例如，来自其他哺乳动物物种)，用于基因作图(例如，通过与染色体原位杂交)，或用于检测组织(例如，人组织)中的基因表达，诸如通过RNA印迹分析或本文公开的其他杂交技术。本公开还涉及在高度严格杂交条件(诸如用于选择性杂交)下与本文中的核苷酸序列杂交的核酸序列。此类核酸序列可以通过等位基因或序列特异性杂交(例如，在高度严格条件下)进行检测和/或分离。用于核酸杂交的严格条件和方法是技术人员熟知的(参见例如Current Protocols in Molecular Biology,Ausubel,F.等人,JohnWiley&Sons,(1998),以及Kraus,M.和Aaronson,S.,Methods Enzymol.,200:546-556(1991))，所述文献的全部教导内容以引用的方式并入本文。

两个或更多个核苷酸或氨基酸序列之间的“相同性”或“百分比相同性”的计算可以通过为最佳比较目的比对序列来确定(例如，可以在第一序列的序列中引入缺口)。然后比较对应位置的核苷酸，并且两个序列之间的百分比同一性是序列共享的相同位置数的函数(即％同一性＝相同位置数/总位置数x 100)。例如，第一序列中的位置与第二序列中的对应位置被相同的核苷酸占据，那么所述位置的分子是相同的。两个序列之间的百分比同一性是序列共享的相同位置数的函数，考虑到缺口数和每个缺口的长度，需要引入它们以实现两个序列的最佳比对。

在一些实施例中，为了比较目的而比对的序列的长度是参考序列长度的至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、或至少95％。两个序列的实际比较可以通过众所周知的方法(例如使用数学算法)来完成。这种数学算法的非限制性实例在Karlin,S.和Altschul, S.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90-5873-5877(1993)中描述。这种算法被并入NBLAST和XBLAST程序(2.0版)中，如Altschul,S.等人,NucleicAcids Res.,25:3389-3402(1997)中所述。当使用BLAST和Gapped BLAST程序时，可以使用各个程序(例如，NBLAST)的任何相关参数。例如，序列比较的参数可以设置为分数＝100，字长＝12，或者可以改变(例如，W＝5或W＝20)。

在一些实施例中，核酸可以包括类似物(例如，硫代磷酸酯(phosphorothioates)、氨基磷酸酯 (phosphoramidates)、膦酸甲酯(methyl phosphonate)、手性甲基膦酸酯(chiralmethyl phosphonates)、2-0- 甲基核糖核苷酸)、或者修饰的核酸(例如，修饰的主链残基或键联)、或者与糖类、脂质、多肽或其他材料组合的核酸、或者肽核酸(PNA)(例如，染色质、核糖体和转录体)。在一些实施例中，核酸可以包括各种结构的核酸，例如A DNA、BDNA、Z-型DNA、siRNA、tRNA和核酶。在一些实施例中，核酸可以是天然或非天然多态性的，例如与参考序列相比，具有一个或多个序列差异，例如添加、缺失和/或取代。在一些实施例中，参考序列可以基于公开可用的信息，例如加州大学圣克鲁斯人类基因组浏览器网关(U.C.Santa Cruz Human Genome Browser Gateway)(genome.ucsc.edu/cgi- bin/hgGateway)或NCBI网站(www.ncbi.nlm.nih.gov)。在一些实施例中，参考序列可以由本公开的从业者使用本领域熟知的方法来确定，例如，通过对参考核酸进行测序。

载体

本文中的另一方面，提供了一种载体。在一些实施例中，该载体包含本文中的重组核酸。在一些实施例中，该载体为病毒载体。在一些实施例中，该病毒载体为腺相关病毒载体。

在一些实施例中，所述载体包括但不限于腺相关病毒血清型AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、 AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAVrh10、AAV2.7m8、AAV-DJ、AAV-PHP.B、AAV-PHP.S、AAV-PHP.eB中的一种或多种。

腺相关病毒(AAV)是感染人和一些其他灵长类动物物种的小病毒。本文公开的组合物首先包含腺相关病毒(AAV)基因组或其衍生物。

AAV基因组是编码产生AAV病毒粒子所需的功能的多核苷酸序列。这些功能包括在宿主细胞中AAV的复制和包装循环中发挥作用的功能，其包括将AAV基因组封装到AAV病毒粒子中。天然存在的AAV病毒是复制缺陷型的，并且依赖于提供反式辅助功能完成复制和包装周期。因此，本发明载体的AAV基因组通常是复制缺陷型的。

AAV基因组可以是单链形式(正向或负向)，或替代地是双链形式。使用双链形式允许绕过靶细胞中的DNA复制步骤，因此可以加速转基因表达。

AAV基因组可以来自任何天然来源的AAV血清型或分离株或进化枝。因此，AAV基因组可是天然存在的AAV病毒的完整基因组。如技术人员所知，自然界中存在的AAV病毒可以根据各种生物系统进行分类。

通常，AAV病毒根据其血清型来提及。血清型对应于AAV的变体亚种，由于其衣壳表面抗原的表达谱，所述变体亚种具有独特的反应性，可用于将所述变体亚种与其他变体亚种区分开来。通常，具有特定AAV血清型的病毒不与对任何其他AAV血清型具有特异性的中和抗体发生有效地交叉反应。AAV血清型包括AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、 AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15和AAV16，以及最近从灵长类动物脑中鉴定的重组血清型，诸如Rec2和Rec3。

在一些实施例中，AAV血清型是AAV2；在一些实施例中，血清型为AAV4、AAV5或AAV8；它们有效地转导眼中的组织，诸如视网膜色素上皮。在一些实施例中，使用的AAV血清型可以是除 AAV4之外的AAV血清型。AAV血清型的综述可见于Choi等人(Curr GeneTher.2005；5(3)；299-310) 和Wu等人(Molecular Therapy.2006；14(3),316-327)。用于本文中的包含ITR序列、rep或cap基因的AAV基因组或AAV基因组元件的序列可以源自以下AAV全基因组序列的登录号：腺相关病毒1 NC_002077、AF063497；腺相关病毒2NC_001401；腺相关病毒3NC_001729；腺相关病毒3B NC_001863；腺相关病毒4NC_001829；腺相关病毒5Y18065、AF085716；腺相关病毒6NC_001862；禽类AAV ATCC VR-865AY186198、AY629583、NC_004828；禽类AAV菌株DA-1NC_006263、 AY629583；牛AAV NC_005889、AY388617。

AAV病毒也可以根据进化枝或克隆来提及。这是指天然来源的AAV病毒的系统发育关系，并且通常是指可以追溯到共同祖先的AAV病毒的系统发育组，并且包括其所有后代。此外，AAV病毒可以根据特定分离株(即在自然界中发现的特定AAV病毒的遗传分离株)来提及。术语遗传分离株描述了与其他天然存在的AAV病毒进行有限遗传混合，从而在遗传水平上定义了可识别的不同群体的AAV病毒群体。

可用于本文中的AAV进化枝和分离株的实例包括但不限于：进化枝A：AAV1 NC_002077、 AF063497、AAV6 NC_001862、Hu.48AY530611、Hu 43AY530606、Hu 44AY530607、Hu46AY530609；进化枝B：Hu.19AY530584、Hu.20AY530586、Hu 23AY530589、Hu22 AY530588、Hu24 AY530590、 Hu21 AY530587、Hu27 AY530592、Hu28 AY530593、Hu 29AY530594、Hu63AY530624、Hu64 AY530625、 Hu13 AY530578、Hu56 AY530618、Hu57 AY530619、Hu49AY530612、Hu58 AY530620、Hu34 AY530598、 Hu35 AY530599、AAV2 NC_001401、Hu45AY530608、Hu47 AY530610、Hu51 AY530613、Hu52 AY530614、Hu T41 AY695378、Hu S17AY695376、Hu T88 AY695375、Hu T71 AY695374、Hu T70 AY695373、Hu T40 AY695372、HuT32 AY695371、Hu T17 AY695370、Hu LG15 AY695377；进化枝 C：Hu9 AY530629、Hu10AY530576、Hu11 AY530577、Hu53 AY530615、Hu55 AY530617、Hu54 AY530616、Hu7AY530628、Hu18 AY530583、Hu15 AY530580、Hu16 AY530581、Hu25 AY530591、 Hu60AY530622、Ch5 AY243021、Hu3 AY530595、Hu1 AY530575、Hu4 AY530602Hu2、AY530585、Hu61 AY530623；进化枝D：Rh62 AY530573、Rh48 AY530561、Rh54 AY530567、Rh55AY530568、 Cy2 AY243020、AAV7 AF513851、Rh35 AY243000、Rh37 AY242998、Rh36AY242999、Cy6 AY243016、 Cy4 AY243018、Cy3 AY243019、Cy5 AY243017、Rh13 AY243013；进化枝E：Rh38 AY530558、Hu66 AY530626、Hu42 AY530605、Hu67 AY530627、Hu40AY530603、Hu41 AY530604、Hu37 AY530600、 Rh40 AY530559、Rh2 AY243007、Bb1AY243023、Bb2 AY243022、Rh10 AY243015、Hu17 AY530582、 Hu6 AY530621、Rh25AY530557、Pi2 AY530554、Pi1 AY530553、Pi3 AY530555、Rh57 AY530569、 Rh50 AY530563、Rh49 AY530562、Hu39 AY530601、Rh58 AY530570、Rh61 AY530572、Rh52 AY530565、 Rh53AY530566、Rh51 AY530564、Rh64 AY530574、Rh43 AY530560、AAV8 AF513852、Rh8AY242997、 Rh1 AY530556；进化枝F：Hu14(AAV9)AY530579、Hu31 AY530596、Hu32AY530597、克隆分离株 AAV5 Y18065、AF085716、AAV 3NC_001729、AAV 3B NC_001863、AAV4NC_001829、Rh34 AY243001、Rh33 AY243002、Rh32 AY243003。

技术人员可以基于他们的公知常识选择用于本文中的适当AAV血清型、进化枝、克隆或分离株。例如，AAV5衣壳已显示可以有效地转导灵长类视锥细胞感光器，这已通过遗传色觉缺陷的成功纠正得到证明(Mancuso等人,Nature 2009,461:784-7)。

然而应当理解，本发明还涵盖使用可能尚未鉴定或表征的其他血清型的AAV基因组。AAV 血清型决定了AAV病毒感染的组织特异性(或嗜性)。因此，用于根据本发明施用于患者的AAV病毒的优选AAV血清型是对LHON中的眼内靶细胞具有天然嗜性或高感染率的那些。因此，用于施用于患者的AAV病毒的AAV血清型可以是感染神经感觉视网膜和视网膜色素上皮的细胞的血清型。

通常，天然来源的AAV血清型或分离株或进化枝的AAV基因组包含至少一个反向末端重复序列(ITR)。ITR序列以顺式作用提供功能性复制起点，并允许从细胞基因组整合和切除载体。AAV 基因组通常还包含包装基因，诸如编码AAV病毒粒子的包装功能的rep和/或cap基因。rep基因编码蛋白Rep78、Rep68、Rep52和Rep40或其变体中的一种或多种。cap基因编码一种或多种衣壳蛋白，诸如VP1、VP2和VP3或其变体。这些蛋白质构成了AAV病毒粒子的衣壳。下文讨论衣壳变体。

启动子将与每个包装基因可操作地连接。此类启动子的具体实例包括p5、p19和p40启动子(Laughlin等人,1979,PNAS,76:5567-5571)。例如，p5和p19启动子通常用于表达rep基因，而p40 启动子通常用于表达cap基因。

如上所述，本文中的载体中使用的AAV基因组因此可以是天然存在的AAV病毒的完整基因组。例如，包含完整AAV基因组的载体可用于体外制备AAV病毒。然而，尽管这种载体原则上可以施用于患者，但在实践中很少这样做。优选地，为了施用于患者的目的，将使AAV基因组衍生化。这种衍生化在本领域中是标准的，并且本发明涵盖使用任何已知的AAV基因组衍生物，以及可以通过应用本领域已知的技术产生的衍生物。AAV基因组和AAV衣壳的衍生化在Coura和Nardi (Virology Journal,2007,4:99)以及Choi等人和Wu等人,参见上文中进行了综述。

AAV基因组的衍生物包括AAV基因组的任何截短或修饰形式。通常，可以显著截短AAV 基因组以包含最少的病毒序列，还保留上述功能。出于安全原因，这是优选的，以降低载体与野生型病毒重组的风险，并避免因靶细胞中存在病毒基因蛋白而引发细胞免疫反应。

通常，衍生物将包含至少一个反向末端重复序列(ITR)，优选多于一个ITR，诸如两个ITR 或更多个。一个或多个ITR可以来源于具有不同血清型的AAV基因组，或者可以是嵌合或突变ITR。优选的突变ITR是trs(末端解析位点)缺失的突变ITR。这种缺失允许基因组继续复制以产生含有编码序列和互补序列的单链基因组，即自互补AAV基因组。这允许绕过靶细胞中的DNA复制，并因此能够加速转基因表达。

一个或多个ITR将优选地在任一末端侧接编码序列的多核苷酸序列。优选包含一个或多个 ITR以帮助本文中的载体在宿主细胞的细胞核中形成多联体，例如在通过宿主细胞DNA聚合酶的作用将单链载体DNA转化为双链DNA之后。此类游离型多联体的形成在宿主细胞的生命期间保护了载体构建体，从而允许转基因在体内延长表达。

在优选的实施方案中，ITR元件将是衍生物中从天然AAV基因组中保留的唯一序列。因此，衍生物将优选不包含天然基因组的rep和/或cap基因以及天然基因组的任何其他序列。出于上文所述的原因，这是优选的，并且还降低了载体整合到宿主细胞基因组中的可能性。此外，减小AAV基因组的大小允许提高除转基因外在载体中结合其他序列元件(诸如调节元件)的灵活性。

关于AAV2基因组，因此可以在本文中的衍生物中去除以下部分：一个反向末端重复(ITR) 序列、复制(rep)基因和衣壳(cap)。然而，在包括体外实施方案在内的一些实施例中，衍生物可以另外包含AAV基因组的一种或多种rep基因和/或cap基因或其他病毒序列。天然存在的AAV病毒在人类19号染色体上的特定位点以高频率整合，并显示出可忽略不计的随机整合频率，使得在治疗环境中可以耐受载体中整合能力的保留。

当衍生物基因组包含编码衣壳蛋白即VP1、VP2和/或VP3的基因时，所述衍生物可以是一种或多种天然存在的AAV病毒的嵌合、改组或衣壳修饰的衍生物。特别地，本发明涵盖在同一载体内提供来自不同AAV血清型、进化枝、克隆或分离株的衣壳蛋白序列，即假型。

通常将选择嵌合、改组或衣壳修饰的衍生物来为病毒提供一种或多种所需功能。因此，与包含天然存在的AAV基因组(诸如AAV2的基因组)的AAV病毒相比，这些衍生物可以显示出增加的基因递送效率、降低的免疫原性(体液或细胞)、改变的嗜性范围和/或改进的特定细胞类型的靶向。基因递送效率增加可以通过以下方式实现：改进细胞表面的受体或共受体结合、改进内化、改进细胞内和进入细胞核的运输、改进病毒粒子的脱壳以及改进单链基因组向双链形式的转化。效率增加也可与改变的嗜性范围或特定细胞群体的靶向(使得载体剂量不因施用到不需要的组织而被稀释)有关。

嵌合衣壳蛋白包括通过在天然存在的AAV血清型的两个或更多个衣壳编码序列之间重组产生的那些。这可以例如通过标记拯救方法进行，其中一种血清型的非感染性衣壳序列与不同血清型的衣壳序列共转染，并且使用定向选择来选择具有所需性质的衣壳序列。不同血清型的衣壳序列可以通过细胞内的同源重组来改变，从而产生新的嵌合衣壳蛋白。

嵌合衣壳蛋白还包括通过使衣壳蛋白序列工程化以在两种或更多种衣壳蛋白之间，例如在两种或更多种不同血清型的衣壳蛋白之间转移特定衣壳蛋白结构域、表面环或特定氨基酸残基而产生的那些。

改组或嵌合衣壳蛋白也可通过DNA改组或通过易错PCR产生。杂合AAV衣壳基因可以通过使相关AAV基因的序列，例如编码多种不同血清型衣壳蛋白的那些随机片段化并且接着随后在自引发聚合酶反应中重新组装这些片段来产生，所述过程也可导致序列同源区域的交叉。可以筛选通过改组几种血清型的衣壳基因以这种方式产生的杂合AAV基因库，以鉴定具有所需功能的病毒克隆。类似地，易错PCR可用于使AAV衣壳基因随机突变，以产生多样化的变体库，然后可以针对所需性质进行选择。

衣壳基因的序列也可以被遗传修饰以引入相对于天然野生型序列的特定缺失、取代或插入。特别地，衣壳基因可以通过在衣壳编码序列的开放阅读框内或在衣壳编码序列的N端和/或C端插入无关蛋白或肽的序列来修饰。

无关蛋白或肽可以有利地是充当特定细胞类型的配体的蛋白质或肽，从而赋予与靶细胞的改进结合或提高病毒靶向特定细胞群体的特异性。实例可包括使用RGD肽来阻断视网膜色素上皮的摄取，并且因此增强周围视网膜组织的转导(Cronin等人,2008ARVOAbstract:D1048)。无关蛋白也可以是作为产生过程的一部分帮助纯化病毒粒子的蛋白质，即表位或亲和标签。通常选择插入位点以不干扰病毒粒子的其他功能，例如病毒粒子的内化、运输。技术人员可以基于他们的公知常识来鉴定合适的插入位点。特定位点公开在Choi等人,参见上文中。

本发明另外涵盖以与天然AAV基因组的序列不同的顺序和构型提供AAV基因组的序列。本发明还涵盖用另一种病毒的序列或用由多于一种病毒的序列构成的嵌合基因替换一个或多个AAV 序列或基因。此类嵌合基因可以由来自不同病毒种类的两种或更多种相关病毒蛋白的序列组成。

为避免疑义，本发明还提供了包含本发明载体的AAV病毒粒子。本文中的AAV粒子包括转衣壳形式，其中具有一种血清型的ITR的AAV基因组或衍生物被包装在不同血清型的衣壳中。本文中的AAV粒子还包括镶嵌形式，其中来自两种或更多种不同血清型的未修饰衣壳蛋白的混合物构成病毒包膜。AAV粒子还包括带有吸附到衣壳表面的配体的化学修饰形式。例如，此类配体可以包括用于靶向特定细胞表面受体的抗体。

本发明另外提供了包含本文中的载体或AAV病毒粒子的宿主细胞。所有上述另外的构建体都可以作为质粒或其他游离型元件提供在宿主细胞中，或替代地一种或多种构建体可以整合到宿主细胞的基因组中。

在这些方面中，本发明提供了用于产生本发明的AAV病毒的方法。所述方法包括提供一种载体，所述载体在宿主细胞中包含腺相关病毒(AAV)基因组或其衍生物和编码相关蛋白产物(如抗体) 的多核苷酸序列，并提供用于复制载体并将载体组装到AAV病毒粒子中的手段。优选地，所述方法包括提供一种载体，所述载体包含AAV基因组的衍生物和编码蛋白/抗体的多核苷酸序列，以及一种或多种编码AAV和/或辅助病毒功能的另外的遗传构建体。通常，AAV基因组的衍生物包含至少一个ITR。任选地，所述方法还包括纯化组装的病毒粒子的步骤。此外，所述方法可以包括配制用于治疗用途的病毒粒子的步骤。

药物制剂、用途、施用途径和有效剂量

本文中的另一方面，提供了一种药物制剂，其特征在于，含有前述编码anti-VEGF抗体的重组核酸、载体或病毒粒子。在一些实施例中，所述药物制剂还包含药学上可接受的载剂和/或赋形剂。在一些实施例中，所述药物制剂为液体制剂。

本文中的另一方面，提供了如本文中的重组核酸、载体、病毒粒子或药物制剂在治疗眼部疾病的用途。在一些实施例中，所述眼部疾病为脉络膜新生血管性疾病。在一些实施例中，所述脉络膜新生血管性疾病为年龄相关性黄斑变病(AMD)或糖尿病视网膜病变(DR)。在一些实施例中，所述糖尿病视网膜病变为糖尿病黄斑水肿(DMO)。

在一些实施例中，提供了如本文中的重组核酸、载体、病毒粒子或药物制剂的施用剂量为治疗有效量。剂量可以指在治疗过程中递送至受试者的总剂量，或者以单个单位(或多个单位或分开剂量)施用递送的量。剂量可以以核酸序列的基因组拷贝(GC)表达。剂量也可以用病毒粒子表示。在一些实施例中，合适的剂量在约1.0x 10⁶GC的病毒颗粒至约1.0x10¹⁵GC的范围内，包括所述范围内的所有整数或分数量。在一些实施例中，施用剂量为每次给药至少1x10⁶、2x10⁶、3x10⁶、4x10⁶、 5x10⁶、6x10⁶、7x10⁶、8x10⁶或9x10⁶GC，包括所述范围内的所有整数或分数量。在一些实施例中，施用剂量为每次给药至少1x10⁷、2x10⁷、3x10⁷、4x10⁷、5x10⁷、6x10⁷、7x10⁷、8x10⁷或9x10⁷GC，包括所述范围内的所有整数或分数量。在一些实施例中，施用剂量为每次给药至少1x10⁸、2x10⁸、 3x10⁸、4x10⁸、5x10⁸、6x10⁸、7x10⁸、8x10⁸或9x10⁸GC，包括所述范围内的所有整数或分数量。在一些实施例中，施用剂量为每次给药至少1x10⁹、2x10⁹、3x10⁹、4x10⁹、5x10⁹、6x10⁹、7x10⁹、8x10⁹或9x10⁹GC，包括所述范围内的所有整数或分数量。在一些实施例中，施用剂量为每次给药至少1x10¹⁰、 2x10¹⁰、3x10¹⁰、4x10¹⁰、5x10¹⁰、6x10¹⁰、7x10¹⁰、8x10¹⁰或9x10¹⁰GC，包括所述范围内的所有整数或分数量。在一些实施例中，施用剂量为每次给药至少1x10¹¹、2x10¹¹、3x10¹¹、4x10¹¹、5x10¹¹、6x10¹¹、7x10¹¹、8x10¹¹或9x10¹¹GC，包括所述范围内的所有整数或分数量。在一些实施例中，施用剂量为每次给药至少1x10¹²、2x10¹²、3x10¹²、4x10¹²、5x10¹²、6x10¹²、7x10¹²、8x10¹²或9x10¹²GC，包括所述范围内的所有整数或分数量。在一些实施例中，施用剂量为每次给药至少1x10¹³、2x10¹³、3x10¹³、 4x10¹³、5x10¹³、6x10¹³、7x10¹³、8x10¹³或9x10¹³GC，包括所述范围内的所有整数或分数量。在一些实施例中，施用剂量为每次给药至少1x10¹⁴、2x10¹⁴、3x10¹⁴、4x10¹⁴、5x10¹⁴、6x10¹⁴、7x10¹⁴、8x10¹⁴或9x10¹⁴GC，包括所述范围内的所有整数或分数量。在一些实施例中，施用剂量为每次给药至少 1x10¹⁵、2x10¹⁵、3x10¹⁵、4x10¹⁵、5x10¹⁵、6x10¹⁵、7x10¹⁵、8x10¹⁵或9x10¹⁵GC，包括所述范围内的所有整数或分数量。在一些实施例中，对于人应用，剂量可以在每次给药1x10⁶至约1x10¹³GC的范围内，包括所述范围内的所有整数或分数量。在一些实施例中，对于人应用，剂量可以在每次给药1x10¹⁰至约1x10¹²GC的范围内，包括所述范围内的所有整数或分数量。再其它给药和剂量可由主治医师确定。

这些上述给药可以在各种体积的载剂、赋形剂或缓冲液制剂中施用，范围为约25至约1000 微升，包括所述范围内的所有数字，这取决于待治疗区域的尺寸、使用的病毒滴度、施用途径和所述方法的所需效果。在一些实施例中，施用的体积为至少约25μl。在一些实施例中，体积为约50μl。在一些实施例中，体积为约75μl。在一些实施例中，体积为约100μl。在一些实施例中，体积为约 125μl。在一些实施例中，体积为约150μl。在一些实施例中，体积为约175μl。在一些实施例中，体积为约200μL。在一些实施例中，体积为约225μl。在一些实施例中，体积为约250μl。在一些实施例中，体积为约275μl。在一些实施例中，体积为约300μL。在一些实施例中，体积为约325μL。在一些实施例中，体积为约350μl。在一些实施例中，体积为约375μl。在一些实施例中，体积为约400μl。在一些实施例中，体积为约450μl。在一些实施例中，体积为约500μl。在一些实施例中，体积为约 550μl。在一些实施例中，体积为约600μl。在一些实施例中，体积为约650μl。在一些实施例中，体积为约700μl。在一些实施例中，体积在约700与1000μl之间。

本公开的核酸、载体、或病毒粒子可以作为药物制剂施用，所述药物制剂包括适用于口服 (包括口腔和舌下)、直肠、鼻腔、局部、透皮贴剂、肺部、阴道、栓剂或肠胃外(包括眼内、玻璃体内、肌内、动脉内、鞘内、皮内、腹膜内、皮下和静脉内)施用或呈适用于通过雾化、吸入或吹入施用的形式的那些药物制剂。药物递送系统的一般信息可见于Ansel等人,Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems(Lippencott Williams&Wilkins,Baltimore Md.(1999)。

在一些实施例中，本公开的核酸、载体、病毒粒子或制剂，可通过任何能使用的递送方法或途径施用。优选地，递送方式为局部施用的。可考虑使用的对眼睛的所有局部施用途径包括局部、结膜下、眼周、眼球后、筋膜下(subtenon)、眼内、玻璃体内、眼内(intracameral)、视网膜下、和脉络膜上施用。全身或肠胃外施用是可行的，包括但不限于静脉、皮下和口服递送。最优选的施用方法是溶液或混悬液的玻璃体内或筋膜下注射；生物溶蚀或非生物溶蚀装置(植入)的玻璃体内或筋膜下放置；或通过溶液或混悬液的局部眼内施用。在一个优选的实施方案中，将通过溶液、混悬液或凝胶的后部近巩膜(posteriorjuxtascleral)施用。在另一个优选的实施方案中，将通过可生物溶蚀植入剂玻璃体内施用。

在一些实施例中，本公开的核酸、载体、病毒粒子或制剂通过在眼内注射施用；优选地在玻璃体腔注射。

在各种实施方案中，药物组合物包括载剂和赋形剂(包括但不限于缓冲剂、碳水化合物、甘露醇、多肽、氨基酸、抗氧化剂、抑菌剂、螯合剂、助悬剂、增稠剂和/或防腐剂)、水、油(包括石油、动物、植物或合成来源的那些，诸如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等)、盐水溶液、右旋糖和甘油水溶液、调味剂、着色剂、防粘剂和其他可接受的添加剂、佐剂或粘合剂、其他药学上可接受的用以接近生理条件的辅助物质，诸如pH缓冲剂、张力调节剂、乳化剂、润湿剂等。赋形剂的实例包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。在一些实施例中，药物制剂基本上不含防腐剂。在其他实施方案中，药物制剂可以含有至少一种防腐剂。药物剂型的一般方法见于Ansel 等人,Pharmaceutical Dosage Forms andDrug Delivery Systems(Lippencott,Williams,&Wilkins, Baltimore Md.(1999))。可以认识到，尽管可以采用本领域普通技术人员已知的任何合适的载剂来施用本公开的组合物，但是载剂的类型可以根据施用方式而变化。也可使用熟知的技术将化合物封装在脂质体内。也可将可生物降解的微球用作本公开的药物组合物的载剂。合适的可生物降解的微球公开于例如美国专利号4,897,268、5,075,109、5,928,647、5,811,128、5,820,883、5,853,763、5,814,344 和5,942,252中。可以施用呈脂质体或微球(或微粒)形式的化合物。用于制备用于向受试者施用的脂质体和微球的方法是本领域技术人员熟知的。美国专利号4,789,734(所述专利的内容以引用的方式并入本文)描述了用于将生物材料封装在脂质体中的方法。基本上，将材料溶解在水溶液中，添加适当的磷脂和脂质，并且需要时，添加表面活性剂，并且必要时对材料进行透析或超声处理。已知方法的综述由G.Gregoriadis,第14章,“Liposomes,”Drug Carriers in Biology and Medicine,页数2.sup.87- 341(AcademicPress,1979)提供。

由聚合物或多肽形成的微球是本领域技术人员熟知的，并且可被调整以通过胃肠道直接进入血流。替代地，可以掺入化合物，并且植入微球或微球的合成物，以便在数天至数月范围内的时间段内缓慢释放。参见例如美国专利号4,906,474、4,925,673和3,625,214以及Jein,TIPS 19:155-157 (1998)，所述文献的内容以引用的方式并入本文。

可调节药物的浓度，使溶液的pH缓冲并进行等渗调节以与眼内或玻璃体内注射相容。

本公开的化合物可以在合适的媒介物中配制成无菌溶液或悬浮液。药物组合物可以通过常规的、熟知的灭菌技术进行灭菌，或者可以进行无菌过滤。所得水溶液可按原样包装供使用或被冻干，冻干的制剂在施用之前与无菌溶液组合。合适的制剂和另外的载剂描述于Remington“The Science and Practice of Pharmacy”(20th Ed.,LippincottWilliams&Wilkins,Baltimore MD)，所述文献的教导内容以引用方式整体并入本文。

制剂或其药学上可接受的盐可以单独提供或与一种或多种其他剂或与一种或多种其他形式组合提供。例如，制剂可以包含特定比例的一种或多种剂，这取决于每种剂的相对效力和预期适应症。例如，在用于靶向两个不同宿主靶标的组合物中，并且在效力类似的情况下，可以使用约1:1比率的剂。所述两种形式可以相同的剂量单位一起配制为例如一种乳膏、一种栓剂、一种片剂、一种胶囊、一种气溶胶喷雾剂或待溶解在饮料中的一包散剂；或者每种形式可以独立单位配制，例如两种乳膏、两种栓剂、两种片剂、两种胶囊、一种片剂和一种用于溶解片剂的液体、两种气溶胶喷雾剂、或者一包散剂和一种用于溶解散剂的液体等。

术语“药学上可接受的盐”意指保留本公开中使用的剂的生物学有效性和性质并且不是生物学或其他方面不期望的那些盐。典型的盐为无机离子(诸如像，钠、钾、钙、镁离子等)形式的那些。此类盐包括具有诸如以下的无机酸或有机酸的盐：盐酸、氢溴酸、磷酸、硝酸、硫酸、甲磺酸、对甲苯磺酸、乙酸、富马酸、琥珀酸、乳酸、扁桃酸、苹果酸、柠檬酸、酒石酸或马来酸。此外，如果剂含有羧基或其它酸性基团，那么可将其转化成具有无机或有机碱的药学上可接受的加成盐。合适的碱的实例包括氢氧化钠、氢氧化钾、氨、环己胺、二环己基胺、乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺等。

药学上可接受的酯或酰胺是指保留本公开中使用的剂的生物学有效性和性质并且不是生物学或其他方面不期望的那些酯或酰胺。典型的酯包括乙酯、甲酯、异丁酯、乙二醇酯等。典型的酰胺包括未取代的酰胺、烷基酰胺、二烷基酰胺等。

在一些实施例中，制剂可以与一种或多种其他化合物、形式和/或剂(例如，如上所述)组合施用。具有一种或多种其他活性剂的药物组合物可以被配制成包含某些摩尔比率。例如，可以使用约99:1至约1:99的摩尔比率的第一活性剂与其他活性剂。在实施方案的一些子集中，第一活性剂: 其他活性剂的摩尔比率的范围选自约80:20至约20:80；约75:25至约25:75、约70:30至约30:70、约66:33至约33:66、约60:40至约40:60；约50:50；以及约90:10至约10:90。第一活性剂:其他活性剂的摩尔比率可以是约1:9，并且在一些实施例中可以是约1:1。两种剂、形式和/或化合物可以相同的剂量单位一起配制为例如一种乳膏、一种栓剂、一种片剂、一种胶囊或待溶解在饮料中的一包散剂；或者每种剂、形式和/或化合物可以独立单位配制，例如两种乳膏、两种栓剂、两种片剂、两种胶囊、一种片剂和一种用于溶解片剂的液体、两种气溶胶喷雾剂、一包散剂和一种用于溶解散剂的液体等。

如果必须或需要，剂和/或剂的组合又可以与其他剂一起施用。可以与本公开的剂和/或剂的组合共同施用的剂的选择可以至少部分地根据所治疗的病状。

剂(或其药学上可接受的盐、酯或酰胺)可以本身施用或以药物组合物的形式施用，其中活性剂与一种或多种药学上可接受的载剂掺合或混合。如本文所用，药物组合物可以是被制备用于向受试者施用的任何组合物。根据本公开使用的药物组合物可以使用一种或多种生理学上可接受的载剂以常规方式配制，所述载剂包括例如有助于将活性剂加工成可以施用的制剂的赋形剂、稀释剂和/或助剂。恰当的制剂可以至少部分取决于所选择的施用途径。可用于本公开的剂或其药学上可接受的盐、酯或酰胺可以使用多种施用途径或方式递送至受试者，所述多种施用途径或方式包括口服、经颊、局部、直肠、经皮、经粘膜、皮下、静脉内、眼内、玻璃体内和肌内应用、以及通过吸入。

在一些实施例中，由于例如存在大的亲脂部分，可以使用油性或非水性溶剂将剂带入溶液中。替代地，可以使用乳剂、混悬剂或其他制剂，例如脂质体制剂。关于脂质体制剂，可以使用任何已知的用于制备用于治疗病状的脂质体的方法。参见例如Bangham等人,J.Mol.Biol.23:238-252 (1965)和Szoka等人,Proc.Natl Acad.Sci.USA 75:4194-4198(1978)，其以引用的方式并入本文。配体也可以与脂质体附接以将这些组合物引导至特定作用部位。本公开的剂也可以整合到食品例如奶油干酪、黄油、沙拉酱或冰淇淋中以促进在某些受试者群体中的溶解、施用和/或依从性。

本公开的化合物可以配制用于肠胃外施用(例如，通过注射，例如眼内或玻璃体内注射)并且可以单位剂量形式与添加的防腐剂一起存在于安瓿、预填充注射器、小体积输液中或存在于多剂量容器中。组合物可以采取诸如在油性或水性媒介物中的混悬剂、溶液或乳剂的形式，例如在水性聚乙二醇中的溶液。

对于可注射制剂，媒介物可以选自本领域已知的合适的那些，包括水溶液或油悬浮液、或乳液、以及芝麻油、玉米油、棉籽油或花生油、以及酏剂、甘露醇、右旋糖、或无菌水溶液、以及类似的药物媒介物。所述制剂还可以包含生物相容的、可生物降解的聚合物组合物，诸如聚(乳酸-共- 乙醇酸)。这些材料可以制成微球或纳米球，装载药物并进一步包衣或衍生化，以提供优良的缓释性能。适用于眼周或眼内注射的媒介物包括例如治疗剂在注射级水中的悬浮液、脂质体和适用于亲脂性物质的媒介物。用于眼周或眼内注射的其他媒介物是本领域熟知的。

在一些实施例中，根据常规程序将组合物配制成适于静脉内施用于人的药物组合物。通常，用于静脉内施用的组合物是呈无菌等渗水性缓冲液形式的溶液。必要时，所述组合物还可以包含增溶剂和局部麻醉剂诸如利多卡因(lidocaine)以减轻注射部位的疼痛。一般来说，所述成分单独或混合在一起以单位剂型(例如作为干燥冻干粉末或无水浓缩物)提供于指示活性剂的量的密闭容器(如安瓿或药囊)中。当组合物待通过输注施用时，所述组合物可用含有无菌药用级水或盐水的输注瓶来分配。在组合物通过注射施用时，可以提供注射用无菌水或盐水的安瓿以使得成分可以在施用之前被混合。

当通过注射施用时，活性化合物可配制成水溶液，特别是生理学上相容的缓冲液，诸如汉克斯溶液(Hanks solution)、林格溶液或生理盐水缓冲液。所述溶液可以含有配制剂，诸如助悬剂、稳定剂和/或分散剂。或者，活性化合物可以呈粉末形式，以在使用前与合适的媒介物例如无菌无热原水混合。在一些实施例中，药物组合物不包含被添加来增强由肽刺激的免疫反应的佐剂或任何其他物质。在一些实施例中，药物组合物包含抑制对肽的免疫反应的物质。配制方法是本领域已知的，例如像在Remington’s PharmaceuticalSciences,最新版本,Mack Publishing Co.,Easton P.中所公开。

在一些实施例中，可以用包含本公开的剂或剂的组合的眼用溶液、混悬剂、软膏剂或插入物来有效治疗眼部病症。滴眼剂可以在使用前通过将活性成分溶解在无菌水溶液诸如生理盐水、缓冲溶液中，或通过将待溶解的粉末组合物组合来制备。可以选择本领域已知的其他媒介物，包括但不限于：平衡盐溶液、盐水溶液、水溶性聚醚诸如聚乙二醇、聚乙烯诸如聚乙烯醇和聚维酮、纤维素衍生物诸如甲基纤维素和羟丙基甲基纤维素、石油衍生物诸如矿物油和白凡士林、动物脂肪诸如羊毛脂、丙烯酸聚合物诸如羧基聚亚甲基凝胶、植物脂肪诸如花生油以及多糖诸如葡聚糖、以及糖胺聚糖诸如透明质酸钠。如果需要，可以添加滴眼剂中常用的添加剂。此类添加剂包括等渗剂(例如，氯化钠等)、缓冲剂(例如，硼酸、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠等)、防腐剂(例如，苯扎氯铵(benzalkonium chloride)、苄索氯铵(benzethonium chloride)、氯丁醇等)、增稠剂(例如，糖类诸如乳糖、甘露醇、麦芽糖等；例如，透明质酸或其盐诸如透明质酸钠、透明质酸钾等；例如，粘多糖诸如硫酸软骨素等；例如，聚丙烯酸钠、羧乙烯基聚合物、交联聚丙烯酸酯、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟乙基纤维素、羧甲基纤维素、羟丙基纤维素或本领域技术人员已知的其他剂)。

本文中的组合物的组分的溶解度可以通过组合物中的表面活性剂或其他适当的共溶剂来提高。此类共溶剂包括聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯60和聚山梨醇酯80；普郎尼克(Pluronic)F68、普郎尼克F-84和普郎尼克P-103、环糊精或本领域技术人员已知的其它剂。此类共溶剂可以约0.01重量％至2重量％的水平使用。

本公开的组合物可以多剂量形式包装。可以优选使用防腐剂以防止使用期间的微生物污染。合适的防腐剂包括：苯扎氯铵、硫柳汞、氯丁醇、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、苯乙醇、依地酸二钠、山梨酸、Onamer M或本领域技术人员已知的其他剂。在现有技术的眼用产品中，此类防腐剂可以以0.004％至0.02％的水平使用。在本申请的组合物中，防腐剂(优选苯扎氯铵)可以0.001 重量％至小于0.01重量％(例如0.001重量％至0.008重量％，优选约0.005重量％)的水平使用。已发现0.005％的苯扎氯铵浓度可足以保护本公开的组合物免受微生物侵袭。

在一些实施例中，本公开的剂以可溶性形式而非悬浮液形式递送，这允许更快速和定量地吸收到作用部位。一般而言，诸如凝胶剂、乳膏、洗剂、栓剂和软膏剂的制剂可以提供更长时间暴露于本公开的剂的区域，而溶液中的制剂例如喷雾剂提供更即时的短期暴露。

另外设想的是，本公开的化合物可以可释放地与生物相容性聚合物附接，以用于在插入物上的、在插入物中的或与插入物附接的缓释制剂，所述插入物用于局部、眼内、眼周或全身施用。生物相容性聚合物的控释也可以与水溶性聚合物一起用于形成可滴制剂。从生物相容性聚合物诸如像PLGA微球或纳米球控释可用于适用于眼内植入或注射以实现缓释施用的制剂，也可使用任何合适的可生物降解的和生物相容性聚合物。

其它编号的实施方案

实施方案1.一种重组核酸，其特征在于，所述重组核酸编码一个anti-VEGF重链，所述 anti-VEGF重链的编码序列包含与选自SEQ ID NO:5-6和23-26中的一个序列有≥90％、≥95％、≥96％、≥97％、≥98％、≥99％、≥99.5％或100％相同性的序列。

实施方案2.如实施方案1所述的重组核酸，其特征在于，所述anti-VEGF重链的氨基酸序列包含与选自SEQ ID NO:17-18中的一个序列有≥90％、≥95％、≥96％、≥97％、≥98％、≥99％、≥99.5％或100％相同性的序列。

实施方案3.如实施方案1或2所述的重组核酸，其特征在于，所述anti-VEGF重链的互补决定区1(CDR1)，互补决定区2(CDR2)，和互补决定区3(CDR3)的序列分别与SEQ ID NO:31， SEQ ID NO:32，和SEQ ID NO:33相同。

实施方案4.如实施方案1-3任一项所述的重组核酸，其特征在于，所述anti-VEGF重链不包含恒定区2(CH2)以及恒定区3(CH3)。

实施方案5.一种重组核酸，其特征在于，所述重组核酸编码一个anti-VEGF轻链，所述 anti-VEGF轻链的编码序列包含与选自SEQ ID NO:4和19-22中的一个序列有≥90％、≥95％、≥96％、≥97％、≥98％、≥99％、≥99.5％或100％相同性的序列。

实施方案6.如实施方案5所述的重组核酸，其特征在于，所述anti-VEGF轻链的氨基酸序列包含与SEQ ID NO:16有≥90％、≥95％、≥96％、≥97％、≥98％、≥99％、≥99.5％或100％相同性的序列。

实施方案7.如实施方案5或6所述的重组核酸，其特征在于，所述anti-VEGF轻链的互补决定区1(CDR1)，互补决定区2(CDR2)，和互补决定区3(CDR3)的序列分别与SEQ ID NO:28， SEQ ID NO:29，和SEQ ID NO:30相同。

实施方案8.如实施方案1-4任一项所述的重组核酸，其特征在于，所述重组核酸还编码一个anti-VEGF轻链，所述anti-VEGF轻链的编码序列包含与选自SEQ ID NO:4和19-22中的一个序列有≥90％、≥95％、≥96％、≥97％、≥98％、≥99％、≥99.5％或100％相同性的序列。

实施方案9.如实施方案8所述的重组核酸，其特征在于，所述anti-VEGF轻链的氨基酸序列包含与SEQ ID NO:16有≥90％、≥95％、≥96％、≥97％、≥98％、≥99％、≥99.5％或100％相同性的序列。

实施方案10.如实施方案9所述的重组核酸，其特征在于，所述anti-VEGF轻链的互补决定区1(CDR1)，互补决定区2(CDR2)，和互补决定区3(CDR3)的序列分别与SEQ ID NO:28， SEQ ID NO:29，和SEQ ID NO:30相同。

实施方案11.如实施方案8-10任一项所述的重组核酸，其特征在于，所述SEQ IDNO:4和 19-22以及所述SEQ ID NO:5-6和23-26的组合为选自表1的一个组合。

实施方案12.如实施方案8-10任一项所述的重组核酸，其特征在于，所述SEQ IDNO:4和 19-22以及所述SEQ ID NO:5-6和23-26的组合为选自表3的一个组合。

实施方案13.如实施方案8-10任一项所述的重组核酸，其特征在于，所述anti-VEGF重链的编码序列包含与SEQ ID NO:25有≥90％、≥95％、≥96％、≥97％、≥98％、≥99％、≥99.5％或100％相同性的序列，所述anti-VEGF轻链的编码序列包含与SEQ ID NO:21有≥90％、≥95％、≥96％、≥97％、≥98％、≥99％、≥99.5％或100％相同性的序列。

实施方案14.如实施方案8-10任一项所述的重组核酸，其特征在于，所述anti-VEGF重链的编码序列包含与SEQ ID NO:25有≥99％、≥99.5％或100％相同性的序列，所述anti-VEGF轻链的编码序列包含与SEQ ID NO:21有≥99％、≥99.5％或100％相同性的序列。

实施方案15.如实施方案8-14任一项所述的重组核酸，其特征在于，所述anti-VEGF轻链的编码序列位于所述anti-VEGF重链的编码序列的上游(5’端)。

实施方案16.如实施方案8-15任一项所述的重组核酸，其特征在于，在所述anti-VEGF轻链的编码序列和所述anti-VEGF重链的编码序列之间，包含连接肽的编码序列。

实施方案17.如实施方案16所述的重组核酸，其特征在于，所述连接肽的氨基酸序列包含 SEQ ID NO:14-15任一项，或与SEQ ID NO:14-15任一项有不多于1个，不多于2个，或不多于3 个氨基酸的差异的序列。

实施方案18.如实施方案1-17任一项所述的重组核酸，其特征在于，包含一个启动子和/或增强子，且所述启动子和/或增强子与编码所述anti-VEGF轻链和/或所述anti-VEGF重链的开放阅读框可操作地连接；可选地，所述启动子为chickenβ-actin启动子；可选地，所述增强子为CMV增强子。

实施方案19.如实施方案18所述的重组核酸，其特征在于，所述启动子/增强子的序列包含与SEQ ID NO:1有≥90％、≥95％、≥96％、≥97％、≥98％、≥99％、≥99.5％或100％相同性的序列。

实施方案20.如实施方案1-19任一项所述的重组核酸，其特征在于，包含一个或多个信号肽编码序列，所述信号肽编码序列位于所述anti-VEGF重链的编码序列和/或所述anti-VEGF轻链的编码序列的上游(5’端)。

实施方案21.如实施方案20所述的重组核酸，其特征在于，在所述anti-VEGF重链的编码序列的5’端连接所述信号肽编码序列；优选地，与anti-VEGF重链连接的所述信号肽包含与SEQ ID NO:8-13和34-35任一项有≥90％、≥95％、≥96％、≥97％、≥98％、≥99％、或100％相同性的氨基酸序列；优选地，与SEQ ID NO:34有≥90％、≥95％、≥96％、≥97％、≥98％、≥99％、或100％相同性。

实施方案22.如实施方案20或21所述的重组核酸，其特征在于，在所述anti-VEGF轻链的编码序列的5’端连接所述信号肽编码序列；优选地，与anti-VEGF轻链连接的所述信号肽包含与 SEQ ID NO:8-13和34-35任一项有≥90％、≥95％、≥96％、≥97％、≥98％、≥99％、或100％相同性的氨基酸序列；优选地，与SEQ ID NO:35有≥90％、≥95％、≥96％、≥97％、≥98％、≥99％、或100％相同性。

实施方案23.如实施方案1-22任一项所述的重组核酸，其特征在于，包含一个内含子；可选地，所述内含子位于所述启动子/增强子的序列和所述信号肽的编码序列之间。

实施方案24.如实施方案23所述的重组核酸，其特征在于，所述内含子的序列包含与SEQ ID NO:2-3任一项有≥90％、≥95％、≥96％、≥97％、≥98％、≥99％、≥99.5％或100％相同性的序列。

实施方案25.如实施方案1-24任一项所述的重组核酸，其特征在于，包含多聚腺苷酸链 (poly(A))序列，所述poly(A)序列位于所述anti-VEGF重链的编码序列和/或所述anti-VEGF轻链的编码序列下游(3’端)；可选地，所述多聚腺苷酸链为人生长激素多聚腺苷酸链。

实施方案26.如实施方案25所述的重组核酸，其特征在于，所述poly(A)序列包含与SEQ ID NO:7有≥90％、≥95％、≥96％、≥97％、≥98％、≥99％、≥99.5％、或100％相同性的序列。

实施方案27.如实施方案1-26任一项所述的重组核酸，其特征在于，包含拨鼠乙肝病毒转录后调控元件(WPRE)序列，所述WPRE序列位于编码所述anti-VEGF轻链和/或所述anti-VEGF重链的开放阅读框和多聚腺苷酸链(poly(A))序列之间。

实施方案28.如实施方案27所述的重组核酸，其特征在于，所述WPRE序列包含与SEQ ID NO:27有≥90％、≥95％、≥96％、≥97％、≥98％、≥99％、≥99.5％、或100％相同性的序列。

实施方案29.一种病毒载体，其特征在于，所述载体含有如实施方案1-28任一项所述的重组核酸。

实施方案30.如实施方案29所述的载体，其特征在于，所述载体为腺相关病毒(AAV)载体。

实施方案31.如实施方案30所述的载体，其特征在于，所述腺相关病毒载体的血清型为选自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAVrh10、AAV2.7m8、 AAV-DJ、AAV-PHP.B、AAV-PHP.S、AAV-PHP.eB中的一种或多种。

实施方案32、如实施方案30或31所述的载体，其特征在于，所述载体还包含AAV反向末端重复序列ITR。

实施方案33.一种病毒粒子，其特征在于，含有如实施方案29-32任一项所述的载体。

实施方案34.如实施方案33所述的病毒粒子，其特征在于，所述病毒粒子为AAV病毒粒子。

实施方案35.如实施方案34所述的病毒粒子，其特征在于，所述AAV病毒粒子的血清型为选自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAVrh10、AAV2.7m8、 AAV-DJ、AAV-PHP.B、AAV-PHP.S、AAV-PHP.eB中的一种或多种。

实施方案36、一种药物制剂，其特征在于，所述药物制剂含有如实施方案33-35任一项所述的病毒粒子、如实施方案29-32任一项所述的载体、或如实施方案1-28任一项所述的重组核酸，以及药学上可接受的载剂或赋形剂。

实施方案37、如实施方案36所述的药物制剂，其特征在于，所述药物制剂为液体制剂。

实施方案38、如实施方案33-35任一项所述的病毒粒子、如实施方案29-32任一项所述的载体、或如实施方案1-28任一项所述的重组核酸在制备药物中的用途，所述用途是治疗眼部疾病。

实施方案39、一种治疗眼部疾病的方法，包含向有需要的受试者施用如实施方案36-37任一项所述的药物制剂、如实施方案33-35任一项所述的病毒粒子、如实施方案29-32任一项所述的载体、或如实施方案1-28任一项所述的重组核酸。

实施方案40、如实施方案38所述的用途或如实施方案39所述的方法，其特征在于，所述眼部疾病为脉络膜新生血管性疾病。

实施方案41、如实施方案40所述的用途或方法，其特征在于，所述脉络膜新生血管性疾病所述脉络膜新生血管性疾病为年龄相关性黄斑变性或糖尿病视网膜变性；优选地，所述糖尿病视网膜变性为糖尿病黄斑水肿。

实施方案42、如实施方案38-41任一项所述的用途或方法，其特征在于，所述病毒粒子、所述载体、所述重组核酸、或所述药物制剂经眼内注射；优选地，通过玻璃体腔注射。

实施方案43、如实施方案38-42任一项所述的用途或方法，其特征在于，所述病毒粒子、所述载体、或所述药物制剂能够在眼内长效表达anti-VEGF抗体或其抗原结合片段，阻止VEGF过表达引起的所述眼部疾病。

实施例

实施例1：病毒载体的构建及表达筛选

构建antiVEGF Fab表达质粒：MDR1、MDR2、MDR3、MDR4、MDR5、MDR6、OPT1、 OPT4、OPT5、OPT6。

pAAV-CBA-MDR(以下简称pAAVMDR)病毒载体构建。载体基因组包含AAV反向末端重复序列ITR、CBA启动子(chickenβ-actin，核酸序列见SEQ ID NO:1)和MDR目的基因序列。其中在CBA启动子前加上增强基因表达的CMV增强子。目的基因表达框包含一段合成内含子(SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3)、信号肽(选自SEQ ID NO:8-13和34-35)、轻链(选自SEQ IDNO:4 和19-22)、重链(选自SEQ ID NO:5,6和23-26)、以连接肽(SEQ ID NO:14或SEQ IDNO:15) 将轻链和重链分开，以及能够增加转录产物稳定性的人的生长激素poly(A)序列SEQ ID NO:7，另外还可添加了WPREm元件(SEQ ID NO:27)。各个OPT载体也以类似方式构建。各个表达载体使用的具体序列元件见表3：

表3：各个antiVEGF Fab OPT载体的构成元件

*每个表达载体均含有AAV反向末端重复序列ITR、CBA启动子(chickenβ-actin)/CMV增强子、人生长激素poly(A)序列。另外，部分载体还包含WPREm元件(SEQ ID NO:27)，位于人生长激素poly(A)序列之前。

实施例2：病毒载体质粒细胞转染表达和筛选：Lucentis 1ug作为标准品对照

HEK293细胞生长密度达到90％以上，消化收集细胞，接种到6孔板内，接种密度为1×10⁶，分为空白组(PBS组)和转染组(5个样品：转染五种pAAVMDR-NFS-kana质粒)。取每个质粒2.5 ug，PEI进行转染，质粒：PEI比例：1:3，空白组加入同样量的PBS。转染72小时后，收集细胞培养上清，10KD超滤管浓缩至0.3mL左右。各取10μL浓缩液，Lucentis标准品1ug作为参照，进行SDS-PAGE凝胶电泳分离和和Western blot。二抗Anti-Human Kappa-HRPantibody detection孵育后进行ECL显影。如图1显示，样品顺序从左至右依次为空白对照、MDR1、MDR2、MDR3、MDR4、 MDR5、Lucentis。与Lucentis标准品相比，各pAAVMDR-NFS-kana质粒表达antiVEGF Fab蛋白条带清晰，分子量与Lucentis分子量一致。

实施例3：Western blot验证载体表达的Fab与人VEGF的特征型结合，LUCENTIS为对照

图2a：取含5ug总蛋白的小鼠血清，1.5ug hVEGF165重组蛋白(纽福斯生产纯化制备)，分别制备3份样品，进行SDS-PAGE凝胶电泳分离和和Western blot。分别用MDR-1、MDR-2和 MDR-3质粒转染细胞上液作为第一抗体，Anti-Human Kappa-HRP antibody作为第二抗体，检测表达的antiVEGF Fab与抗原hVEGF165的结合。

如图2a所示，从左至右依次为MDR1、MDR2和MDR3质粒转染细胞上清液孵育结果。由图所知，MDR1、MDR2和MDR3表达的Fab与人VEGF(hVEGF)特异性结合，而不与小鼠血清任何成分结合。本实验证明pAAVMDR载体表达的antiVEGF Fab蛋白，只识别人类hVEGF165，不识别小鼠血清中任何成分。

图2b：Western blot验证载体表达的Fab与人VEGF的特征型结合，LUCENTIS为对照。

分别取5μg总蛋白小鼠血清、5μg大鼠血清，1.5μg hVEGF165重组蛋白(纽福斯生产纯化制备)，分别制备3份样品，进行SDS-PAGE凝胶电泳分离和和Western blot。分别用MDR-5和 MDR-6质粒转染细胞培养上清液作为第一抗体，以市场上的Lucentis为对照。AntiHuman Kappa-HRP antibody作为第二抗体，检测表达的antiVEGF Fab与抗原hVEGF165的结合。

如图2b所示，从左至右依次为Lucentis孵育结果、MDR5细胞浓缩样品孵育结果和MDR6 细胞浓缩样品孵育结果图。由图可知，MDR5和MDR6与Lucentis一样可以特异性结合hVEGF，而不结合小鼠VEGF和大鼠VEGF。Lucentis结合人类hVEGF165，不识别小鼠，大鼠VEGF。MDR- 5和MDR-6细胞培养液中表达的抗体与标准品Lucentis行为一致，仅结合人源hVEGF165，不识别鼠源VEGF。

实施例4：ELISA验证载体表达的antiVEGF Fab的特征型结合

图3：高吸附结合96孔板，不同列分别加样铺板：第1列human VEGF165 10ng；第2列为小鼠血清10ug；第3列为大鼠血清10ug；第4列为1号人血清10ug；第5列为2号人血清10ug；第6列为3号人血清10ug；第7列为小鼠血清10uL(约610ug蛋白)；第8列为大鼠血清10 uL(约680ug蛋白)；第9列为1号人血清10uL(约820ug蛋白)；第10列为2号人血清10uL (约720ug蛋白)；第11列为3号人血清10uL(770ug蛋白)。用碳酸盐缓冲液进行2倍梯度稀释系列稀释，4℃过夜包被。根据ELISA标准操作过程，每孔加入100μL 200ng/mL Lucentis的孵育液，37℃进行孵育。AntiHuman Kappa-HRP antibody作为第二抗体孵育，加入HRP底物显色后终止反应，检测Lucentis与血清样品VEGF的结合。

如图3所示，第1列VEGF、第4-6和9-11列人血清均与Lucentis有颜色反应。第2、7列小鼠血清和第3、8列列大鼠血清均不与Lucentis产生颜色反应。说明Lucentis仅识别人类hVEGF165，识别人类血清样品，不识别大小鼠血清样品VEGF。

实施例5：三质粒系统分别生产AAVMDR4、AAVMDR5和AAVMDR6

pAdHelper、pAAV-RC、pAAVMDR-NFS三质粒共转染293T细胞，293T细胞接种于细胞工厂，72小时后收取细胞。用细胞裂解液重悬细胞，冻融3次。采用超速离心、QHP阴离子柱吸附洗脱、浓缩三步来分离、浓缩和纯化本申请所述病毒rAAVMDR。

制备SDS-PAGE分离胶和积层胶。分别按每个加样孔加样15μL。电泳完毕后用考马斯亮蓝染色，常规脱色液脱色，作为病毒纯度鉴定。

图4所示AAVMDR4、AAVMDR5和AAVMDR6纯化病毒纯度鉴定：E Lane为纯化病毒样品。胶图显示VP1/VP2/VP3＝1:1:10，符合AAV衣壳蛋白比例特征，条带清晰，纯度在90％以上。rAAVMDR病毒物理滴度测定采用荧光定量PCR方法检测，AAVMDR4、AAVMDR5和AAVMDR6 样品基因组滴度分别为2.08E13、4.10E13、2.5E13 vg/mL。

实施例6：病毒在体外研究的表达和定量

检测anti-VEGF抗体的表达量比较病毒表达MDR2、MDR4、MDR5和MDR6的表达。取293T细胞，6孔板培养，48小时后，病毒感染实验。弃去6孔板中的全培养基(DMEM，10％FBS，1％谷氨酰胺替代物(2mM))，加入1mL新鲜的感染培养基(DMEM，1％谷氨酰胺替代物(2mM))。换液后，6孔板中加入MOI＝1E5的病毒颗粒，37℃培养1h后补液2mL，继续培养72h。收集细胞培养上清浓缩后分别进行WB和ELISA检测其anti-VEGF抗体含量，使用购买的药用Lucentis注射液作为标准品。

图5a为病毒MDR4(M4)、MDR2(M2)、MDR5(M5)、MDR6(M6)感染细胞后上清样品中anti-VEGF Fab表达鉴定。从左至右依次为：M4、M2、M5、M6和空白对照样品，图5b为病毒M4、M2、M5、M6感染细胞：1E6 cell,MOI＝1E5。感染72小时后，收集上清液，ELISA方法测定anti-VEGF Fab含量，药用Lucentis注射液作为标准品。从左至右依次为：M4(计算含量为8.09ug)、M2 (计算含量为10.17ug)、M5(计算含量为12.28ug)和M6(计算含量为11.09ug)。

实施例7：病毒在小鼠眼部表达：方法：小鼠：C57小鼠，6-8wks(年龄)

测试组：小鼠玻璃腔注射AAVMDR(4x10E10vg)；对照：小鼠玻璃腔注射PBS。注射4周后，摘取注射眼球，每个眼球加入100uL RIPA裂解液进行组织匀浆破碎和超声，12000rpm离心2 min后取上清，Western assay检测antiVEGF Fab表达。上样量分别为：2.5uL、5uL；阳性对照： Lucentis蛋白：50ng；阴性对照：PBS注射眼球样品。检测：抗人-K-HRP。

如图6所示：AAVMDR病毒注射小鼠眼球检测出清晰的Fab表达条带，分子量与Lucentis 标准品一致。

实施例8：小鼠玻璃体腔注射AAVMDR5二周，检测anti-VEGF Fab的表达结果(ng/eye)

C57/BL6小鼠分为实验组(rAAV-antiVEGF Fab病毒组)和对照组(PBS组)。小鼠玻璃体腔内分别注射1微升本申请所述病毒AAVMDR，剂量依次为5E9vg、1E10vg、2E10vg、4E10vg，空白组注射同等体积的PBS。2周后摘取小鼠眼球。注射眼球加入RIPA裂解液后进行组织匀浆破碎和超声，12000rpm离心2min后取上清，分装并保存于-20℃。

通过ELISA检测小鼠眼球内表达含量。高吸附结合96孔板，每孔分别加入50nghVEGF， 4℃过夜包被。标准品Lucentis起始浓度为100ng/mL，进行2倍系列稀释；样品列各加入2微升实验组和空白组注射眼球匀浆上清液，设置2个复孔，37℃孵育2小时。1:4000稀释抗体Anti-Human Kappa-HRP conjugated antibody，每孔加入100μL，于室温孵育1小时。洗涤后每孔加入100μL TMB 显色液，室温避光孵育20分钟，每孔加入100μL终止液。全波长酶标仪测定450nm下吸光值，四参数法拟合回归计算实验数据，实验数据所计算含量以PBS对照组数据规范化。

如图7所示，从左至右依次为5E9样品、1E10样品、2E10样品和4E10实验数据图。小鼠眼球内antiVEGF Fab的表达含量随剂量的增加而增加，符合剂量依赖效应。

如图8所示，C57小鼠注射本申请所述病毒AAVMDR5(剂量为4E11vg)，或空白组注射同等体积的PBS后，在病毒组内的小鼠体内的antiVEGF Fab在注射后的两个月内持续表达。

实施例9：AAVMDR5病毒抗眼部血管增生的研究

以人Rhodopsin起动子驱动人VEGF165在小鼠眼部特异性表达，产生新生血管眼部增生疾病症状。定级血管增生程度，观察人源性抗人VEGF抗体改善血管增生的程度，用以研究抗人VEGF 药物的生物效应。转基因小鼠经基因型鉴定和眼底观察选定符合要求的基因小鼠，进行病毒注射，研究其抗眼部血管增生的生物效应。基因小鼠分为实验组和空白组。实验组微量注射器在小鼠玻璃体腔内分别注射1微升本申请所述病毒AAVMDR5，剂量为1E10vg，空白组注射同等体积的PBS。术后7天内每天滴加消炎眼药水，每天观察小鼠眼睛状态。

申请所述病毒AAVMDR5注射2周后，使用5％的水合氯醛通过腹腔注射麻醉小鼠，通过左心室行全身循环灌注，约灌注生理盐水2毫升，再灌注每毫升含50mg dextran-FITC(分子量： 2×10⁶)的生理盐水1毫升。断脊处死小鼠，摘取双眼眼球，PBS冲洗后，4％多聚甲醛固定20分钟。自睫状体后部近锯齿缘剪开巩膜，去掉眼前段和玻璃体，显微镜下剥取视网膜，剪裁成4瓣花瓣状，转移至4％多聚甲醛固定。PBS漂洗三次，将视网膜节细胞层朝上平铺于载玻片上，加抗荧光淬灭封片液后，用盖玻片封片。将样本置于荧光显微镜下观察并拍照。

图9所示为小鼠Dextran-FITC灌注后视网膜铺片图片：(a)：hVEGF转基因小鼠TO36939 品系阳性鼠15天视网膜血管萤光照片；(b)：TO36939 hVEGF阴性小鼠15天视网膜血管萤光照片； (c)：TO36939 hVEGF阳性小鼠玻璃体腔注射PBS 2周后视网膜血管萤光照片(年龄：40)；(d)： TO36939 hVEGF阳性小鼠玻璃体腔注射AAVMDR5病毒2周后视网膜血管萤光照片(年龄：40天)； (e)：TO36939 hVEGF阳性小鼠玻璃体腔未注射眼与注射眼(AAVMDR5病毒，1E10 vg/eye)注射2周后视网膜血管萤光照片比较(年龄：40天)。由图片可知，在小鼠15天时，hVEGF阳性鼠视网膜新生血管芽已显著增多。阴性鼠视网膜组织完整，血管脉络清晰，无新生血管增生特征。给药2 周后，hVEGF阳性鼠未注射眼，血管增生症状严重，萤光强度显示血管紊乱扩张；注射AAVMDR5 病毒小鼠眼视网膜新生血管增生症状减弱，萤光强度明显减弱。

实施例10：病毒载体质粒密码子优化后细胞转染表达和筛选

将如前所述的MDR6、OPT1、OPT4、OPT5、OPT6序列构建到pcDNA3.1载体上。MDR6- 2、OPT1、OPT4、OPT5、OPT6的重链核苷酸序列依次为SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26，轻链核苷酸序列依次为SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22。HEK293细胞生长密度达到90％以上，消化收集细胞，接种到6孔板内，接种密度为1×10⁶，分别转染6个样品(上述六种质粒)，每种样本两个孔。取质粒2.5ug，PEI进行转染，质粒：PEI比例：1:3。转染72小时后，收集细胞培养上清进行ELISA 检测。如图10所示样本从左到右分别为MDR6-2(两孔均值414ng/ml)、OPT1(两孔均值434ng/ml)、 OPT4(两孔均值503ng/ml)、OPT5(两孔均值678ng/ml)和OPT6(两孔均值342ng/ml)，其中OPT4 与OPT5表达量最高。

进一步构建AAVOPT4、AAVOPT4-WPREm、AAVOPT5和AAVOPT5-WPREm质粒(质粒名称中的“WPREm”表示该表达载体包含WPREm元件(SEQ ID NO:27))。HEK293细胞生长密度达到90％以上，消化收集细胞，接种到12孔板内，接种密度为3×10⁵，分别转染4个样品(上述4种质粒)。取质粒1.25ug，PEI进行转染，质粒：PEI比例：1:3，空白组加入同样量的PBS。转染72 小时后，收集细胞培养上清进行ELISA检测。结果如图11所示，从左到右依次为空白组(NC)、 AAVOPT4、AAVOPT4-WPREm、AAVOPT5和AAVOPT5-WPREm，表达量依次为5ng/ml、657ng/ml、 929ng/ml、970ng/ml和1268ng/ml。增加WPREm后表达量明显提高，AAVOPT5-WPREm表达量最高。

实施例11：三质粒系统分别生产AAVOPT5-WPREm

pAdHelper、pAAV-RC、pAAV-MDR-NFS三质粒共转染293T细胞，293T细胞接种于细胞工厂，72小时后收取细胞。用细胞裂解液重悬细胞。采用超速离心、QHP阴离子柱吸附洗脱、浓缩三步来分离、浓缩和纯化本申请所述病毒rAAVOPT5-WPREm。病毒裂解后，将“病毒浓缩液”梯度稀释至1000、10000及100000倍进行QPCR检测病毒滴度。

制备SDS-PAGE分离胶和积层胶。分别按每个加样孔加样2E10vg/孔。电泳完毕后用考马斯亮蓝染色，常规脱色液脱色，作为病毒纯度鉴定。图12所示AAVOPT5-WPREm纯化病毒纯度鉴定：M为预染蛋白Marker(Abs924)0.5ul、1和2为AAVMDR6 2×10¹⁰、3和4为AAVOPT5-WPREm 2×10¹⁰、5为AAV2-IRES-hrGFP 2×10¹⁰。胶图显示VP1/VP2/VP3＝1:1:10，符合AAV衣壳蛋白比例特征，条带清晰，纯度在90％以上。

实施例12：病毒感染细胞表达和筛选

病毒MDR6、OPT4-WPREm、OPT5-WPREm感染细胞后上清样品中anti-VEGF Fab表达鉴定。1×10⁵HEK293接种12孔板后MDR6与OPT5感染细胞：MOI＝1E5。感染72小时后，收集上清液，ELISA方法测定anti-VEGF Fab含量，药用Lucentis注射液作为标准品。

如图13所示，OPT4-WPREm表达量为1173ng/ml，OPT5-WPREm表达量为1927ng/ml，MDR6-2表达量为1893ng/ml，其中OPT5的表达量最高。

实施例13：AAVOPT5-WPREm病毒影响HUVECs增值的研究

HUVECs细胞的增殖效率受VEGF含量的影响，以HUVECs的增殖速度为指标判定VEGF含量的变化，从而验证AAVOPT5药物的作用机制。

图14a所示，HUVEC的增值效率与AAVOPT5-WPREm药物的剂量负相关，说明AAVOPT5阻断了hVEGFA的活性从而阻止HUVECs的增殖，并随剂量增加阻断效应增强。如图14b所示，使用Graphpad计算可得对于10ng/mL的hVEGFA而言半数抑制浓度(IC50)为38.33ng/mL。

实施例14：AAVOPT5-WPREm具有抗血管生成作用

HUVECs在VEGFA的引导下会在基质胶上形成管腔结构，当VEGFA被阻断时，HUVECs的管腔形成受阻。将减少生长因子的基底膜提取物(BME,R&D systems)添加到96孔板中，放置 30分钟。HUVEC(5×10³细胞/孔)悬浮在含有VEGF-A(25ng/ml)的基础培养基中，并置于提前添加了BME的96孔板中。分别用1ng、5ng、10ng AAVOPT5-WPREm处理细胞,孵育16小时后观察成管情况并拍摄图像。使用ImageJ软件的血管生成分析插件统计成管网络的面积和成管长度(像素为计量单位)。

图15a-15c所示为不添加及添加不同量AAVOPT5-WPREm后HUVECs成管情况的对比图. (图15a)(从左至右依次为不添加、添加1ng、5ng、10ng)及成管面积和成管长度统计图(图15b、 15c)，可以看到成管面积(TMA)和成管长度(TSL)随着AAVOPT5药物浓度的升高显著降低。不添加时成管面积约为100000pixels，成管长度约为3600pixels；添加1ngAAVOPT5时成管面积约为48000pixels，成管长度约为3500pixels；添加5ng AAVOPT5-WPREm时成管面积约为10000pixels，成管长度约为1800pixels；添加10ng AAVOPT5-WPREm时成管面积约为2000pixels，成管长度约为600pixels。

实施例15：AAVOPT5-WPREm病毒抗眼部血管增生的研究

以人Rhodopsin启动子驱动人VEGF165在小鼠眼部特异性表达，产生新生血管眼部增生疾病症状。定级血管增生程度，观察人源性抗人VEGF抗体改善血管增生的程度，用以研究抗人VEGF 药物的生物效应。转基因小鼠经基因型鉴定和眼底观察选定符合要求的基因小鼠，进行病毒注射，研究其抗眼部血管增生的生物效应。基因小鼠分为实验组和空白组。实验组微量注射器在小鼠玻璃体腔内分别注射1.5微升本申请所述病毒AAVOPT5，剂量为1E10vg，空白组注射同等体积的PBS。术后7天内每天滴加消炎眼药水，每天观察小鼠眼睛状态。

病毒AAVOPT5-WPREm注射28天后，使用2mg/ml的Doxycycline(去氧氢四环素)对给药小鼠进行诱导使人VEGF165在小鼠眼部表达，眼部血管症状出现。诱导7天后5％的水合氯醛通过腹腔注射麻醉小鼠，通过左心室行全身循环灌注，约灌注生理盐水2毫升，再灌注每毫升含50mg dextran-FITC(分子量：2×10⁶)的生理盐水1毫升。断脊处死小鼠，摘取双眼眼球，PBS冲洗后，4％多聚甲醛固定20分钟。自睫状体后部近锯齿缘剪开巩膜，去掉眼前段和玻璃体，显微镜下剥取视网膜，剪裁成4瓣花瓣状，转移至4％多聚甲醛固定。PBS漂洗三次，将视网膜节细胞层朝上平铺于载玻片上，加抗荧光淬灭封片液后，用盖玻片封片。将样本置于荧光显微镜下观察并拍照。

图16所示为小鼠Dextran-FITC灌注后视网膜铺片图片：T03943 hVEGF阳性小鼠玻璃体腔未注射眼与注射眼(AAVOPT5-WPREm病毒，1E10 vg/eye)注射35天，去氧氢四环素诱导7 天后视网膜血管萤光照片比较。由图片可知，hVEGF阳性鼠未注射眼，血管增生症状严重，萤光强度显示血管紊乱扩张；注射AAVOPT5-WPREm病毒小鼠眼视网膜新生血管增生症状减弱，萤光强度明显减弱。

Claims (43)

1.一种重组核酸，其特征在于，所述重组核酸编码一个anti-VEGF重链，所述anti-VEGF重链的编码序列包含与选自SEQ ID NO:5-6和23-26中的一个序列有≥90％、≥95％、≥96％、≥97％、≥98％、≥99％、≥99.5％或100％相同性的序列。

2.如权利要求1所述的重组核酸，其特征在于，所述anti-VEGF重链的氨基酸序列包含与选自SEQ ID NO:17-18中的一个序列有≥90％、≥95％、≥96％、≥97％、≥98％、≥99％、≥99.5％或100％相同性的序列。

3.如权利要求1或2所述的重组核酸，其特征在于，所述anti-VEGF重链的互补决定区1(CDR1)，互补决定区2(CDR2)，和互补决定区3(CDR3)的序列分别与SEQ ID NO:31，SEQ IDNO:32，和SEQ ID NO:33相同。

4.如权利要求1-3任一项所述的重组核酸，其特征在于，所述anti-VEGF重链不包含恒定区2(CH2)以及恒定区3(CH3)。

5.一种重组核酸，其特征在于，所述重组核酸编码一个anti-VEGF轻链，所述anti-VEGF轻链的编码序列包含与选自SEQ ID NO:4和19-22中的一个序列有≥90％、≥95％、≥96％、≥97％、≥98％、≥99％、≥99.5％或100％相同性的序列。

6.如权利要求5所述的重组核酸，其特征在于，所述anti-VEGF轻链的氨基酸序列包含与SEQ ID NO:16有≥90％、≥95％、≥96％、≥97％、≥98％、≥99％、≥99.5％或100％相同性的序列。

7.如权利要求5或6所述的重组核酸，其特征在于，所述anti-VEGF轻链的互补决定区1(CDR1)，互补决定区2(CDR2)，和互补决定区3(CDR3)的序列分别与SEQ ID NO:28，SEQ IDNO:29，和SEQ ID NO:30相同。

8.如权利要求1-4任一项所述的重组核酸，其特征在于，所述重组核酸还编码一个anti-VEGF轻链，所述anti-VEGF轻链的编码序列包含与选自SEQ ID NO:4和19-22中的一个序列有≥90％、≥95％、≥96％、≥97％、≥98％、≥99％、≥99.5％或100％相同性的序列。

9.如权利要求8所述的重组核酸，其特征在于，所述anti-VEGF轻链的氨基酸序列包含与SEQ ID NO:16有≥90％、≥95％、≥96％、≥97％、≥98％、≥99％、≥99.5％或100％相同性的序列。

10.如权利要求9所述的重组核酸，其特征在于，所述anti-VEGF轻链的互补决定区1(CDR1)，互补决定区2(CDR2)，和互补决定区3(CDR3)的序列分别与SEQ ID NO:28，SEQ IDNO:29，和SEQ ID NO:30相同。

11.如权利要求8-10任一项所述的重组核酸，其特征在于，所述SEQ ID NO:4和19-22以及所述SEQ ID NO:5-6和23-26的组合为选自表1的一个组合。

12.如权利要求8-10任一项所述的重组核酸，其特征在于，所述SEQ ID NO:4和19-22以及所述SEQ ID NO:5-6和23-26的组合为选自表3的一个组合。

13.如权利要求8-10任一项所述的重组核酸，其特征在于，所述anti-VEGF重链的编码序列包含与SEQ ID NO:25有≥90％、≥95％、≥96％、≥97％、≥98％、≥99％、≥99.5％或100％相同性的序列，所述anti-VEGF轻链的编码序列包含与SEQ ID NO:21有≥90％、≥95％、≥96％、≥97％、≥98％、≥99％、≥99.5％或100％相同性的序列。

14.如权利要求8-10任一项所述的重组核酸，其特征在于，所述anti-VEGF重链的编码序列包含与SEQ ID NO:25有≥99％、≥99.5％或100％相同性的序列，所述anti-VEGF轻链的编码序列包含与SEQ ID NO:21有≥99％、≥99.5％或100％相同性的序列。

15.如权利要求8-14任一项所述的重组核酸，其特征在于，所述anti-VEGF轻链的编码序列位于所述anti-VEGF重链的编码序列的上游(5’端)。

16.如权利要求8-15任一项所述的重组核酸，其特征在于，在所述anti-VEGF轻链的编码序列和所述anti-VEGF重链的编码序列之间，包含连接肽的编码序列。

17.如权利要求16所述的重组核酸，其特征在于，所述连接肽的氨基酸序列包含SEQ IDNO:14-15任一项，或与SEQ ID NO:14-15任一项有不多于1个，不多于2个，或不多于3个氨基酸的差异的序列。

18.如权利要求1-17任一项所述的重组核酸，其特征在于，包含一个启动子和/或增强子，且所述启动子和/或增强子与编码所述anti-VEGF轻链和/或所述anti-VEGF重链的开放阅读框可操作地连接；可选地，所述启动子为chickenβ-actin启动子；可选地，所述增强子为CMV增强子。

19.如权利要求18所述的重组核酸，其特征在于，所述启动子/增强子的序列包含与SEQID NO:1有≥90％、≥95％、≥96％、≥97％、≥98％、≥99％、≥99.5％或100％相同性的序列。

20.如权利要求1-19任一项所述的重组核酸，其特征在于，包含一个或多个信号肽编码序列，所述信号肽编码序列位于所述anti-VEGF重链的编码序列和/或所述anti-VEGF轻链的编码序列的上游(5’端)。

21.如权利要求20所述的重组核酸，其特征在于，在所述anti-VEGF重链的编码序列的5’端连接所述信号肽编码序列；优选地，与anti-VEGF重链连接的所述信号肽包含与SEQ IDNO:8-13和34-35任一项有≥90％、≥95％、≥96％、≥97％、≥98％、≥99％、或100％相同性的氨基酸序列；优选地，与SEQ ID NO:34有≥90％、≥95％、≥96％、≥97％、≥98％、≥99％、或100％相同性。

22.如权利要求20或21所述的重组核酸，其特征在于，在所述anti-VEGF轻链的编码序列的5’端连接所述信号肽编码序列；优选地，与anti-VEGF轻链连接的所述信号肽包含与SEQ ID NO:8-13和34-35任一项有≥90％、≥95％、≥96％、≥97％、≥98％、≥99％、或100％相同性的氨基酸序列；优选地，与SEQ ID NO:35有≥90％、≥95％、≥96％、≥97％、≥98％、≥99％、或100％相同性。

23.如权利要求1-22任一项所述的重组核酸，其特征在于，包含一个内含子；可选地，所述内含子位于所述启动子/增强子的序列和所述信号肽的编码序列之间。

24.如权利要求23所述的重组核酸，其特征在于，所述内含子的序列包含与SEQ ID NO:2-3任一项有≥90％、≥95％、≥96％、≥97％、≥98％、≥99％、≥99.5％或100％相同性的序列。

25.如权利要求1-24任一项所述的重组核酸，其特征在于，包含多聚腺苷酸链(poly(A))序列，所述poly(A)序列位于所述anti-VEGF重链的编码序列和/或所述anti-VEGF轻链的编码序列下游(3’端)；可选地，所述多聚腺苷酸链为人生长激素多聚腺苷酸链。

26.如权利要求25所述的重组核酸，其特征在于，所述poly(A)序列包含与SEQ ID NO:7有≥90％、≥95％、≥96％、≥97％、≥98％、≥99％、≥99.5％、或100％相同性的序列。

27.如权利要求1-26任一项所述的重组核酸，其特征在于，包含拨鼠乙肝病毒转录后调控元件(WPRE)序列，所述WPRE序列位于编码所述anti-VEGF轻链和/或所述anti-VEGF重链的开放阅读框和多聚腺苷酸链(poly(A))序列之间。

28.如权利要求27所述的重组核酸，其特征在于，所述WPRE序列包含与SEQ ID NO:27有≥90％、≥95％、≥96％、≥97％、≥98％、≥99％、≥99.5％、或100％相同性的序列。

29.一种病毒载体，其特征在于，所述载体含有如权利要求1-28任一项所述的重组核酸。

30.如权利要求29所述的载体，其特征在于，所述载体为腺相关病毒(AAV)载体。

31.如权利要求30所述的载体，其特征在于，所述腺相关病毒载体的血清型为选自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAVrh10、AAV2.7m8、AAV-DJ、AAV-PHP.B、AAV-PHP.S、AAV-PHP.eB中的一种或多种。

32.如权利要求30或31所述的载体，其特征在于，所述载体还包含AAV反向末端重复序列ITR。

33.一种病毒粒子，其特征在于，含有如权利要求29-32任一项所述的载体。

34.如权利要求33所述的病毒粒子，其特征在于，所述病毒粒子为AAV病毒粒子。

35.如权利要求34所述的病毒粒子，其特征在于，所述AAV病毒粒子的血清型为选自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAVrh10、AAV2.7m8、AAV-DJ、AAV-PHP.B、AAV-PHP.S、AAV-PHP.eB中的一种或多种。

36.一种药物制剂，其特征在于，所述药物制剂含有如权利要求33-35任一项所述的病毒粒子、如权利要求29-32任一项所述的载体、或如权利要求1-28任一项所述的重组核酸，以及药学上可接受的载剂或赋形剂。

37.如权利要求36所述的药物制剂，其特征在于，所述药物制剂为液体制剂。

38.如权利要求33-35任一项所述的病毒粒子、如权利要求29-32任一项所述的载体、或如权利要求1-28任一项所述的重组核酸在制备药物中的用途，所述用途是治疗眼部疾病。

39.一种治疗眼部疾病的方法，包含向有需要的受试者施用如权利要求36-37任一项所述的药物制剂、如权利要求33-35任一项所述的病毒粒子、如权利要求29-32任一项所述的载体、或如权利要求1-28任一项所述的重组核酸。

40.如权利要求38所述的用途或如权利要求39所述的方法，其特征在于，所述眼部疾病为脉络膜新生血管性疾病。

41.如权利要求40所述的用途或方法，其特征在于，所述脉络膜新生血管性疾病所述脉络膜新生血管性疾病为年龄相关性黄斑变性或糖尿病视网膜变性；优选地，所述糖尿病视网膜变性为糖尿病黄斑水肿。

42.如权利要求38-41任一项所述的用途或方法，其特征在于，所述病毒粒子、所述载体、所述重组核酸、或所述药物制剂经眼内注射；优选地，通过玻璃体腔注射。

43.如权利要求38-42任一项所述的用途或方法，其特征在于，所述病毒粒子、所述载体、或所述药物制剂能够在眼内长效表达anti-VEGF抗体或其抗原结合片段，阻止VEGF过表达引起的所述眼部疾病。

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