CN112111517A - Nd4基因重组腺相关病毒载体及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种包含ND4基因表达盒的重组腺相关病毒载体，所述重组腺相关病毒载体的骨架为pAAV10，所述ND4基因表达盒包含人ND4基因或优化的人ND4基因。本发明还公开了该重组腺相关病毒载体的制备方法和应用。本发明将pAAV10作为ND4的基因载体，将ND4转导至病人眼中时，在确保安全性的同时，在视网膜上的表达量更高，具有更高的转导效率和高效的表达能力，感染视神经细胞的能力更强。将其制备为玻璃体腔注射的药物，能够增强该基因在Leber’s基因治疗中效果，并且可以减少注射剂量和缩短治愈时间。

Description

ND4基因重组腺相关病毒载体及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物制药领域，尤其涉及一种ND4基因重组腺相关病毒载体及其制备方法和应用。
背景技术
Leber遗传性视神经病变(Leber’s hereditary optic neuropathy，LHON)是一种主要累及黄斑乳头束纤维，导致视神经退行性变的线粒体遗传性疾病。本病好发于青中年男性，临床表现为双眼同时或先后急性或亚急性无痛性视力减退，同时可伴有中心视野缺损及色觉障碍。
LHON由线粒体位点突变引起，我国学者已初步确认中国95﹪以上的LHON患者分别与线粒体DNA中11778、14484和3460的位点突变有关，其中11778位点突变最常见，占我国LHON的89.2％，且预后最差。线粒体DNA的11778位点突变的发病机制是，线粒体DNA(mtDNA)第11778位的核苷酸发生突变引起的，即鸟嘌呤(G)→腺嘌呤(A)，此突变使呼吸链上NADH脱氢酶亚单位4中(ND4)基因编码的第340位氨基酸由精氨酸变为组氨酸。虽然它们均为碱性氨基酸，但这一位置的精氨酸是高度保守的。由于突变可能降低电子流动效率影响酶的活性从而减少视神经细胞ATP的产生，细胞逐渐凋亡，从而导致患者发生LHON。
LHON目前尚无方法治疗，是世界公认的青少年致盲眼病之一，随着基因治疗的发展，LHON的基因治疗成为可能，其中的难点在于转染的基因进入细胞核，而LHON的突变位点在线粒体DNA，是线粒体中的ND4异常所致。
国内外已有公司或机构利用这一技术，利用腺相关病毒(adenovirus associatedvirus)pAAV2包装该核酸序列(参见CN102634527B)为基因药物，用于实验研究和临床试验，已取得初步成效。但是利用pAAV2的转导效率低，严重依赖HSP，而且表达缓慢，并会被可溶性肝素所抑制，而且只能到达视网膜浅层。因此急需一种转导效率更高、表达迅速的ND4重组表达载体。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是为了克服现有技术中pAAV2包装NADH脱氢酶亚单位4(ND4)序列为基因药物时转导效率低、表达缓慢等缺陷，提供一种ND4基因重组腺相关病毒载体及其制备方法和应用。本发明将pAAV10作为ND4的基因载体，将ND4转导至病人眼中时，在确保安全性的同时，在视网膜上的表达量更高，具有更高的转导效率和高效的表达能力，感染视神经细胞的能力更强。将其制备为玻璃体腔注射的药物，能够增强该基因在Leber’s基因治疗中效果，并且可以减少注射剂量和缩短治愈时间。
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种包含ND4基因表达盒的重组腺相关病毒载体，所述重组腺相关病毒载体的骨架为pAAV10(即，10型重组腺相关病毒载体)，所述ND4基因表达盒包含人ND4基因或优化的人ND4基因。
较佳地，所述ND4基因表达盒从N端至C端依次包含启动子、线粒体靶向序列、人ND4基因或优化的人ND4基因、和/或UTR序列。
较佳地，所述启动子为CMV启动子或CAG启动子；所述启动子的核苷酸序列优选如SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:7所示。
本发明中，所述线粒体靶向序列(MTS)可以为未经优化的MTS序列，可以为优化后的MTS序列。较佳地，所述线粒体靶向序列(MTS)的核苷酸序列如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10所示；和/或，所述UTR序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。
较佳地，所述人ND4基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示，所述优化的ND4基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:11所示。
较佳地，所述ND4基因表达盒的核苷酸序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示；或者所述ND4基因表达盒的核苷酸序列从N端至C端依次为SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:4、SEQ IDNO:5、SEQ ID NO:6，或依次为SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:6，或依次为SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:6，或依次为SEQ ID NO:7、SEQID NO:4、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:6，或依次为SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6，或依次为SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:6，或依次为SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6，或依次为SEQ ID NO:7、SEQ IDNO:9、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:6，或依次为SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQID NO:6，或依次为SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:6，或依次为SEQID NO:3、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6，或依次为SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:6，或依次为SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:5、SEQID NO:6，或依次为SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:6，或依次为SEQID NO:3、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:6，或依次为SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:6。
在本发明某一较佳实施例中，所述ND4基因表达盒的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，具体包括CMV启动子(203bp)，融合蛋白起始在MTS序列(84bp)，起始密码子为ATG，编码28个氨基酸，NADH脱氢酶亚单位4基因序列(1380bp)编码460个氨基酸，UTR序列为COX10-Fμll(1425bp)。
本发明可以选取表达强度高于CMV的强启动子CAG，选取强启动子和最优人种序列重组构建腺相关病毒，进行包装的基因药物将可以减少注射剂量和缩短治愈时间。
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种转化体，将上述的重组腺相关病毒载体导入宿主，并使之整合在所述宿主的基因组上。
较佳地，所述宿主为哺乳动物细胞；更佳地，所述哺乳动物细胞为HEK293细胞。
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种制备上述的重组腺相关病毒载体的方法，其包含以下步骤：将所述ND4基因表达盒插入到腺相关病毒载体pAAV10中即得。
该方法能快速，简便地构建携带不同重组人NADH脱氢酶亚单位4基因的重组腺相关病毒载体，并包装获得复杂缺陷腺相关病毒载体。
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种制备ND4融合蛋白的方法，其包括以下步骤：
(1)制备上述的转化体；
(2)筛选重组子，获得阳性克隆，表达并纯化ND4融合蛋白。
为了解决上述技术问题，本发明提供了上述的重组腺相关病毒载体在制备治疗Leber遗传性视神经病变的药物中的应用。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：本发明将pAAV10作为ND4的基因载体，将ND4转导至病人眼中时，在确保安全性的同时，在视网膜上的表达量更高，具有更高的转导效率和高效的表达能力，感染视神经细胞的能力更强。将其制备为玻璃体腔注射的药物，能够增强该基因在Leber’s基因治疗中效果，并且可以减少注射剂量和缩短治愈时间。本发明的pAVV10重组腺相关病毒表达的ND4基因或优化的ND4基因编码的融合蛋白，可以进入线粒体中，且该融合蛋白表达量更高。此外，该融合蛋白优于pAVV2等其它重组腺相关病毒表达的融合蛋白，适用于制备玻璃体腔注射的药物，用于增强该基因在Leber’s基因治疗中效果。
附图说明
图1为两个不同的重组人NADH脱氢酶亚单位4基因质粒图谱，图1A为pAAV-ND4的示意图，图1B为pAAV-优化ND4的示意图。
图2为实施例1中的PCR产物电泳检测结果图。
图3为实施例1中的SDS-PAGE结果图。
图4为实施例2中的术后一个月的眼底照相结果。
图5为实施例2中的视网膜抗ND4的免疫荧光结果。
图6为实施例2中的OCT检测结果。
图7为实施例2中的2-△△CT相对定量方法结果。
图8为实施例2中的Western blot的结果。
图9为实施例3中的小鼠一个月内的体重变化统计图。
图10为实施例3中的QPCR检测检测结果。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
Marker购于生工生物工程(上海)有限公司，
PCR产物纯化回收试剂盒购于生工生物工程(上海)有限公司，
Kpn I/Sal I酶购于生工生物工程(上海)有限公司，
PlasmidTrans II(VGTC)转染试剂盒购于美国Invitrogen公司。
实施例1人NADH脱氢酶亚单位4基因的重组腺相关病毒载体构建及其病毒包装纯化方法
(一)含有人NADH脱氢酶亚单位4基因重组腺相关病毒载体的构建
1)载体构建
将如SEQ ID NO：1所示的重组人NADH脱氢酶亚单位4(ND4)融合基因序列和如SEQID NO：2所示的经优化后的重组人NADH脱氢酶亚单位4(ND4)融合基因序列分别加Kpn I和Sal I两个酶切位点进行合成(基因序列均由成都擎科梓熙生物技术有限公司合成)，或者分别以上述ND4的DNA序列为模板设计引物(2个引物分别含Kpn I和Sal I两个酶切位点)进行PCR扩增，合成产物或扩增产物与质粒载体pAAV-MCS(包括外壳质粒pAAV2、pAAV3、pAAV4、pAAV6、pAAV7和pAAV10，均购于BioVector)分别进行双酶切，回收酶切产物。将ND4和优化ND4的DNA序列的酶切产物分别与pAAV-MCS质粒的酶切产物混合，再加入T4DNA Ligase(购于天根)16℃连接过夜，连接反应体系为本领域技术常规。将连接产物转化至感受态细胞DH5a(天根生化科技(北京)有限公司)，分别得到不同的重组人NADH脱氢酶亚单位4基因质粒：pAAV-ND4(图1A)和pAAV-优化ND4(图1B)。
2)重组子的筛选和鉴定
将上述得到的2个重组人NADH脱氢酶亚单位4基因质粒分别涂布于LB平板上，取37℃培养后的LB平板，出现蓝斑和白斑，其中白色为重组克隆。挑取白色的菌落加入到含有Amp 100mg/L的LB液体培养基中，在37℃、200rpm培养8小时。培养好后取菌液，提取质粒，质粒提取试剂为Biomiga质粒抽提试剂盒，步骤参照厂商说明书。取1μL质粒作为模板进行PCR扩增(扩增程序如表1所示)后电泳鉴定，其中，
SEQ ID NO：1所述特异性引物为：
1F:5’-ATCTCCGCACACTCTCTCCTCA-3’(SEQ ID NO:12)
1R:5’-GAGGAAAACCCGGTAATGATGTC-3’(SEQ ID NO:13)
SEQ ID NO：2所述特异性引物为：
2F:5’-CAGCCCCCACACCCTGAGCAGC-3’(SEQ ID NO:14)
2R:5’-CTGCTGAAGCCGGTGATGATGTC-3’(SEQ ID NO:15)
表1PCR扩增程序
Figure BDA0002102931120000061
Figure BDA0002102931120000071
对所有PCR产物电泳检测(图2)，各得到一个大小约1500bp左右的目的条带，说明筛选出的质粒为目的质粒。图2中，M：蛋白Marker；1：筛选的pAAV2/2-优化ND4阳性重组子；2：筛选的pAAV2/10-优化ND4阳性重组子。
3)菌液保存及PCR扩增及其片段测序
吸取1mL经过鉴定的菌液与灭菌后的的甘油1:3(体积比)比例混匀，于-80℃保存，进行菌液测序(武汉金开瑞生物工程有限公司)，将测序得到的序列分别与对应重组人NADH脱氢酶亚单位4基因比对分析，成功得到序列正确的重组腺相关病毒质粒。
(二)人NADH脱氢酶亚单位4基因重组腺相关病毒生产
1)转染前一天，将HEK293(ATCC)细胞接种于225cm2细胞培养瓶中，接种密度为3.0×107个/mL的细胞,培养基为DMEM+10％牛血清(Corning)，置37℃、含5％CO2的培养箱中培养过夜。
2)转染当天换液，用新鲜的含10％牛血清的DMEM培养基继续培养。待细胞生长至80～90％时，弃去培养基，用PlasmidTrans II(VGTC)转染试剂盒进行转染。具体步骤为：
(a)每个转染瓶取pAdHelper(购于BioVector)、pAAV-r2c10(购于BioVector)、上述所得质粒按摩尔比例1:1:1与DMEM+PlasmidTrans II(VGTC)(转染试剂)在1.5mL无菌Ep管中混匀，编号为A试剂，室温静止10～15min；
(b)将A试剂同30mL DMEM+10％牛血清混合均匀，编号B试剂；
(c)将B试剂均匀加入细胞培养瓶中，37℃含5％CO2的培养箱中继续培养；
(d)转染16小时后，全部替换为完全培养基(DMEM+10％牛血清)进行培养。
3)转染48小时后，收取细胞。
4)将收取细胞用PBS重悬，并反复冻融3次。
(三)人NADH脱氢酶亚单位4基因病毒的纯化与浓缩
采用氯仿处理-PEG/NaCl沉淀-氯仿抽提三步来分离、浓缩和纯化得到rAAV2/2和rAAV2/10病毒。总回收率＝终产物的病毒颗粒数÷物的病毒颗粒数。
(四)病毒纯度和滴度验证
灌制SDS-PAGE分离胶和积层胶,分离胶浓度为10％。分别按每个加样孔加样15μg。电泳完毕后用考马斯亮蓝(碧云天)染色，用相应的脱色液脱色直到显出低背景的、清晰的条带(结果如图3所示)。
结果显示，上述病毒蛋白对应的病毒颗粒(virus particle,VP)的VP1/VP2/VP3(分别对应从上往下的三个条带)＝1:1:10(该比例为相对分子质量之比)，条带清晰，比例正常，无可见杂带，纯度在99％以上。图3中，泳道1:蛋白marker；泳道2：rAAV2/2-优化ND4；泳道3：rAAV2/10-优化ND4。
重组人NADH脱氢酶亚单位4基因的滴度测定采用荧光定量PCR方法检测人NADH脱氢酶亚单位4基因的物理滴度(每ml液体中含有的病毒颗粒数)。
SYBRⅡ(takara)；目的片段引物(20μM)；包装病毒用目的质粒(质粒拷贝数2E+12vg/ml)；待测病毒；PCR八联管(Bio-red)。实验方法：模板1μl，SYBRⅡ7μl，引物1 0.25μl，引物2 0.25μl，加nuclease-free水到14μl。PCR反应条件：预变性：95℃10min；循环：95℃15sec，60℃1min；40个循环。确定其基因组滴度为1×1012vg/mL。
实施例2：人NADH脱氢酶亚单位4基因重组腺相关病毒对Leber’s显性遗传视神经病变的效果实验
(一)兔眼玻璃体腔、视网膜检测ND4表达结果
1、兔眼玻璃体腔注射
取兔子按下表进行分组，每组2只，分别吸取50μl 1×1012vg/mL的不同的上述2种重组人NADH脱氢酶亚单位4基因腺相关病毒在距角膜缘外3mm处穿刺睫状体平坦部进入玻璃体腔内，进行玻璃体腔注射。
Figure BDA0002102931120000091
本发明中，若无特殊说明，所述“野生ND4”均是指人ND4，具体序列对应SEQ ID NO：1；所述“优化ND4”即经优化后的ND4，具体序列对应SEQ ID NO：2。
2、裂隙灯，眼压，眼底照相检查
3组兔子分别于术后1、7、30天进行裂隙灯，眼压的检查。所有兔子均无明显异常，无结膜充血、分泌物，无眼内炎，眼压均无升高。术后一个月的眼底照相(图4)显示，所有兔子的视网膜血管和视神经均无明显并发症或损害。表明正规标准的玻璃体腔注射不会发生明显的炎症反应或其他并发症。
3、视网膜的荧光照相
玻璃体腔注射30天后，视网膜的荧光照相显示，GFP成功在视网膜上表达，表明以rAAV为载体，携带GFP转染兔眼玻璃体内，证明rAAV2/10-ND4和rAAV2/2-ND4重组基因以及其他重组基因均可以在视网膜上表达。
4、免疫荧光检测
玻璃体腔注射30天后，剥离实验组和对照组眼球，制成石蜡切片。石蜡切片置于65℃烘箱中烘片2小时，脱蜡至水，用PBS冲洗三次，每次5min。切片置于EDTA缓冲液中微波修复，中火至沸后断电，间隔10min低火至沸。自然冷却后PBS洗3次，每次5min。切片放入3％过氧化氢溶液，室温下孵育10min。PBS洗3次，每次5min，甩干后5％BSA封闭20min。去除BSA液，每张切片加入50μl稀释的一抗(Abcam)覆盖组织，4℃过夜。PBS洗三次，每次5min。去除PBS液，每张切片加50μl-100μl相应种属的荧光二抗(Abcam)，避光室温下孵育50min-1h。避光PBS洗3次，每次5min。去除PBS液。每张切片加50-100μl DAPI(杭州昊鑫生物科技股份有限公司)避光染核5min。PBS洗3次，每次5min。切片稍干后用抗荧光淬灭封片剂封片，4℃避光保存待拍照。
视网膜抗ND4的免疫荧光预计结果显示，实验W和Z组的荧光强度均高于对照组和AAV2/2组(荧光强度提高了约50％)，存在显著差异(P＜0.05，图5)，说明AAV2/10感染视神经细胞的效果明显优于AAV2/2、AAV2/3、AAV2/4、AAV2/6、AAV2/7。同时rAAV2/10-优化ND4组的免疫荧光检测明显高于rAAV2/10-野生ND4组存在显著差异(P＜0.05，图5)。
5、光学相干断层扫描技术(Optical Coherence tomography,OCT)检测
结果显示实验组与对照组的视网膜神经纤维层厚度无明显差别(P＞0.05，图6)。
(二)RT-PCR(Real-Time PCR)检测ND4表达结果
1、引物设计
首先用NCBI的保守结构域分析软件分析hND4的保守结构，确保所设计引物的扩增片段位于非保守区；然后根据荧光定量PCR的引物设计原则，用primer premier 5设计引物(兔-actin作为内参)：
兔-actin-F：CCTTCTACAACGAGCTGCGC(SEQ ID NO:16)
兔-actin-R：TACAGGGACAGCACGGCC(SEQ ID NO:17)
针对SEQ ID NO：1的引物
H-ND4-1F：CTGCCTACGACAAACAGAC(SEQ ID NO:18)
H-ND4-1R：AGTGCGTTCGTAGTTTGAG(SEQ ID NO:19)
针对SEQ ID NO：2的引物
H-ND4-2F：CTGCCTGCGCCAGACCGAC(SEQ ID NO:20)
H-ND4-2R：TCCAGGGGGTCTGGATCAG(SEQ ID NO:21)
2、提取RNA、反转录
利用TRIZOL试剂盒(天根)提取不同实验组兔子视网膜的总RNA并反转录合成cDNA模板。
3、荧光定量PCR的反应体系和反应程序
在Real-time PCR Detection System仪器上进行荧光定量PCR。在0.2mL的PCR反应管中加入SYBR Green mix 12.5μL、ddH2O 8μL，一对引物各1μL，cDNA样品2.5μL，总体系25μL。每个样品既要用于扩增目的基因又要扩增内参基因兔-actin，各个基因的扩增都做三个重复。实际加样时，为减小误差，各PCR反应管中共有的试剂可加在一起然后分装。加样完毕，进行荧光定量PCR。
按照95℃预变性1s，94℃变性15s，55℃退火15s，72℃延伸45s，共40个循环的反应程序进行扩增，并于每个循环的延伸阶段采集荧光信号。反应结束后做94℃～55℃的融解曲线分析。
采用2-△△CT相对定量方法(Livak et al.2001)研究基因表达量的差异，该方法无需制作标准曲线，以看家基因兔-actin(武汉金开瑞生物工程有限公司)内参基因，仪器自带的分析软件即可自动生成表达数值，与对照组和AB组相比，实验W、Z组ND4基因表达水平显著提高(P＜0.05，图7)，说明rAAV2/10比rAAV2/2、rAAV2/3、rAAV2/4、rAAV2/6、rAAV2/7的感染视神经的能力更强，其中，rAAV2/10比rAAV2/2的mRNA水平约提高了50％。
(三)Western blot(蛋白质印迹实验)检测ND4蛋白的表达
分离不同实验组的家兔眼球的视网膜，按100μL/50mg组织加入对应体积的RIPA裂解液(品牌：Solarbio，货号：R0010)，匀浆器匀浆后离心收取上清。BCA法测定蛋白浓度后，按总蛋白50μg计算实验组和对照组上样体积，进行SDS-PAGE凝胶电泳和Western blot。抗体(abcam)孵育后进行显影。
蛋白质印迹实验组中，W组和Z组的ND4相对表达水平明显高于A组和B组(P＞0.05，图8)，说明rAAV2/10比rAAV2/2的感染能力更强。其中，rAAV2/10比rAAV2/2的蛋白表达水平约提高了3倍左右。
实施例3：将AAV2/2-ND4和AAV2/10-ND4分别注射到小鼠肌肉组织，qPCR分析其表达差异。
Figure BDA0002102931120000121
Figure BDA0002102931120000131
取20只小鼠分为5组，按上表分为对照组(玻璃体注射5×1010vg rAAV-ZsGreen[广州派真生物技术有限公司])、实验组A、B、C、D分别玻璃体注射上述4种重组人NADH脱氢酶亚单位4基因重组腺相关病毒(rAAV2/2-优化ND4、rAAV2/2-ND4和rAAV2/10-优化ND4和rAAV2/10-ND4，50μl，1×1012vg/mL)，在小鼠大腿内侧穿刺注射。观察小鼠一个月内的体重变化(结果如图9所示)并提取小鼠大腿组织mRNA。qPCR检测ND4基因，比较实验组与对照组ND4基因相对表达水平(结果如图10所示)。
从图9可以看出，A、B、C、D组小鼠体重随时间增加，注射AAV2/2和AAV2/10对小鼠是安全的。
从图10可以看出，A、B组rAAV2/2-优化ND4、rAAV2/2-ND4相对表达量提高约40倍，C、D组的rAAV2/10-优化ND4和rAAV2/10-ND4相对表达量提高约120倍。
随着基因治疗在眼部疾病治疗上的快速发展，治愈Leber’s也将不是难事。因为人眼与兔眼的解剖和体积相似，我们以兔子眼睛为模型进行rAAV2/10-ND4的玻璃体腔注射。本实验研究注射剂量，安全水平，术后并发症，为未来的临床试验提供重要的参考。所有兔子的裂隙灯，眼压的检查，均无明显异常，无结膜充血、分泌物，无眼内炎，眼压均无升高。术后一个月的眼底照相显示，所有兔子的视网膜血管和视神经均无明显并发症或损害。表明本实验是安全的。
因为Leber’s的病变会引起视盘周围的的视网膜神经节细胞凋亡。眼底照相、OCT的结果显示单次玻璃体腔注射1.5×1010vg/mL rAAV2/10-ND4没有出现安全问题，能被应用在临床试验。免疫荧光、实时定量PCR和Western blot的结果证明rAAV2/10-ND4在兔子的视网膜上的表达比rAAV2/2-hND4等更强。更佳地，本发明还可以选取表达强度高于CMV的强启动子CAG，选取强启动子和最优人种序列重组构建腺相关病毒，进行包装的基因药物将可以减少注射剂量和缩短治愈时间。
SEQUENCE LISTING
<110> 武汉纽福斯生物科技有限公司
<120> ND4基因重组腺相关病毒载体及其制备方法和应用
<130> P180117396C
<160> 21
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 3092
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CMV+MTS序列优化1+ ND4序列未优化+UTR
<400> 1
gtgatgcggt tttggcagta catcaatggg cgtggatagc ggtttgactc acggggattt 60
ccaagtctcc accccattga cgtcaatggg agtttgtttt gcaccaaaat caacgggact 120
ttccaaaatg tcgtaacaac tccgccccat tgacgcaaat gggcggtagg cgtgtacggt 180
gggaggtcta tataagcaga gctatggccg ccagccccca caccctgagc agccgcctgc 240
tgaccggctg cgtgggcggc agcgtgtggt acctggagcg ccgcaccatg ctaaaactaa 300
tcgtcccaac aattatgtta ctaccactga catggctttc caaaaaacac atgatttgga 360
tcaacacaac cacccacagc ctaattatta gcatcatccc tctactattt tttaaccaaa 420
tcaacaacaa cctatttagc tgttccccaa ccttttcctc cgacccccta acaacccccc 480
tcctaatgct aactacctgg ctcctacccc tcacaatcat ggcaagccaa cgccacttat 540
ccagtgaacc actatcacga aaaaaactct acctctctat gctaatctcc ctacaaatct 600
ccttaattat gacattcaca gccacagaac taatcatgtt ttatatcttc ttcgaaacca 660
cacttatccc caccttggct atcatcaccc gatggggcaa ccagccagaa cgcctgaacg 720
caggcacata cttcctattc tacaccctag taggctccct tcccctactc atcgcactaa 780
tttacactca caacacccta ggctcactaa acattctact actcactctc actgcccaag 840
aactatcaaa ctcctgggcc aacaacttaa tgtggctagc ttacacaatg gcttttatgg 900
taaagatgcc tctttacgga ctccacttat ggctccctaa agcccatgtc gaagccccca 960
tcgctgggtc aatggtactt gccgcagtac tcttaaaact aggcggctat ggtatgatgc 1020
gcctcacact cattctcaac cccctgacaa aacacatggc ctaccccttc cttgtactat 1080
ccctatgggg catgattatg acaagctcca tctgcctacg acaaacagac ctaaaatcgc 1140
tcattgcata ctcttcaatc agccacatgg ccctcgtagt aacagccatt ctcatccaaa 1200
ccccctggag cttcaccggc gcagtcattc tcatgatcgc ccacgggctt acatcctcat 1260
tactattctg cctagcaaac tcaaactacg aacgcactca cagtcgcatc atgatcctct 1320
ctcaaggact tcaaactcta ctcccactaa tggctttttg gtggcttcta gcaagcctcg 1380
ctaacctcgc cttacccccc actattaacc tactgggaga actctctgtg ctagtaacca 1440
cgttctcctg gtcaaatatc actctcctac ttacaggact caacatgcta gtcacagccc 1500
tatactccct ctacatgttt accacaacac aatggggctc actcacccac cacattaaca 1560
acatgaaacc ctcattcaca cgagaaaaca ccctcatgtt catgcaccta tcccccattc 1620
tcctcctatc cctcaacccc gacatcatta ccgggttttc ctcttaagag cactgggacg 1680
cccaccgccc ctttccctcc gctgccaggc gagcatgttg tggtaattct ggaacacaag 1740
aagagaaatt gctgggttta gaacaagatt ataaacgaat tcggtgctca gtgatcactt 1800
gacagttttt ttttttttta aatattaccc aaaatgctcc ccaaataaga aatgcatcag 1860
ctcagtcagt gaatacaaaa aaggaattat ttttcccttt gagggtcttt tatacatctc 1920
tcctccaacc ccaccctcta ttctgtttct tcctcctcac atgggggtac acatacacag 1980
cttcctcttt tggttccatc cttaccacca caccacacgc acactccaca tgcccagcag 2040
agtggcactt ggtggccaga aagtgtgagc ctcatgatct gctgtctgta gttctgtgag 2100
ctcaggtccc tcaaaggcct cggagcaccc ccttccttgt gactgagcca gggcctgcat 2160
ttttggtttt ccccacccca cacattctca accatagtcc ttctaacaat accaatagct 2220
aggacccggc tgctgtgcac tgggactggg gattccacat gtttgccttg ggagtctcaa 2280
gctggactgc cagcccctgt cctcccttca cccccattgc gtatgagcat ttcagaactc 2340
caaggagtca caggcatctt tatagttcac gttaacatat agacactgtt ggaagcagtt 2400
ccttctaaaa gggtagccct ggacttaata ccagccggat acctctggcc cccaccccat 2460
tactgtacct ctggagtcac tactgtgggt cgccactcct ctgctacaca gcacggcttt 2520
ttcaaggctg tattgagaag ggaagttagg aagaagggtg tgctgggcta accagcccac 2580
agagctcaca ttcctgtccc ttgggtgaaa aatacatgtc catcctgata tctcctgaat 2640
tcagaaatta gcctccacat gtgcaatggc tttaagagcc agaagcaggg ttctgggaat 2700
tttgcaagtt acctgtggcc aggtgtggtc tcggttacca aatacggtta cctgcagctt 2760
tttagtcctt tgtgctccca cgggtctaca gagtcccatc tgcccaaagg tcttgaagct 2820
tgacaggatg ttttcgatta ctcagtctcc cagggcacta ctggtccgta ggattcgatt 2880
ggtcggggta ggagagttaa acaacattta aacagagttc tctcaaaaat gtctaaaggg 2940
attgtaggta gataacatcc aatcactgtt tgcacttatc tgaaatcttc cctcttggct 3000
gcccccaggt atttactgtg gagaacattg cataggaatg tctggaaaaa gcttctacaa 3060
cttgttacag ccttcacatt tgtagaagct tt 3092
<210> 2
<211> 3092
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CMV +MTS序列优化1+ ND4序列优化1+UTR
<400> 2
gtgatgcggt tttggcagta catcaatggg cgtggatagc ggtttgactc acggggattt 60
ccaagtctcc accccattga cgtcaatggg agtttgtttt gcaccaaaat caacgggact 120
ttccaaaatg tcgtaacaac tccgccccat tgacgcaaat gggcggtagg cgtgtacggt 180
gggaggtcta tataagcaga gctatggccg ccagccccca caccctgagc agccgcctgc 240
tgaccggctg cgtgggcggc agcgtgtggt acctggagcg ccgcaccatg ctgaagctga 300
tcgtgcccac catcatgctg ctgcccctga cctggctgag caagaagcac atgatctgga 360
tcaacaccac cacccacagc ctgatcatca gcatcatccc cctgctgttc ttcaaccaga 420
tcaacaacaa cctgttcagc tgcagcccca ccttcagcag cgaccccctg accacccccc 480
tgctgatgct gaccacctgg ctgctgcccc tgaccatcat ggccagccag cgccacctga 540
gcagcgagcc cctgagccgc aagaagctgt acctgagcat gctgatcagc ctgcagatca 600
gcctgatcat gaccttcacc gccaccgagc tgatcatgtt ctacatcttc ttcgagacca 660
ccctgatccc caccctggcc atcatcaccc gctggggcaa ccagcccgag cgcctgaacg 720
ccggcaccta cttcctgttc tacaccctgg tgggcagcct gcccctgctg atcgccctga 780
tctacaccca caacaccctg ggcagcctga acatcctgct gctgaccctg accgcccagg 840
agctgagcaa cagctgggcc aacaacctga tgtggctggc ctacaccatg gccttcatgg 900
tgaagatgcc cctgtacggc ctgcacctgt ggctgcccaa ggcccacgtg gaggccccca 960
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gcctgaccct gatcctgaac cccctgacca agcacatggc ctaccccttc ctggtgctga 1080
gcctgtgggg catgatcatg accagcagca tctgcctgcg ccagaccgac ctgaagagcc 1140
tgatcgccta cagcagcatc agccacatgg ccctggtggt gaccgccatc ctgatccaga 1200
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ccaacctggc cctgcccccc accatcaacc tgctgggcga gctgagcgtg ctggtgacca 1440
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tgtacagcct gtacatgttc accaccaccc agtggggcag cctgacccac cacatcaaca 1560
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cccaccgccc ctttccctcc gctgccaggc gagcatgttg tggtaattct ggaacacaag 1740
aagagaaatt gctgggttta gaacaagatt ataaacgaat tcggtgctca gtgatcactt 1800
gacagttttt ttttttttta aatattaccc aaaatgctcc ccaaataaga aatgcatcag 1860
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tcctccaacc ccaccctcta ttctgtttct tcctcctcac atgggggtac acatacacag 1980
cttcctcttt tggttccatc cttaccacca caccacacgc acactccaca tgcccagcag 2040
agtggcactt ggtggccaga aagtgtgagc ctcatgatct gctgtctgta gttctgtgag 2100
ctcaggtccc tcaaaggcct cggagcaccc ccttccttgt gactgagcca gggcctgcat 2160
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aggacccggc tgctgtgcac tgggactggg gattccacat gtttgccttg ggagtctcaa 2280
gctggactgc cagcccctgt cctcccttca cccccattgc gtatgagcat ttcagaactc 2340
caaggagtca caggcatctt tatagttcac gttaacatat agacactgtt ggaagcagtt 2400
ccttctaaaa gggtagccct ggacttaata ccagccggat acctctggcc cccaccccat 2460
tactgtacct ctggagtcac tactgtgggt cgccactcct ctgctacaca gcacggcttt 2520
ttcaaggctg tattgagaag ggaagttagg aagaagggtg tgctgggcta accagcccac 2580
agagctcaca ttcctgtccc ttgggtgaaa aatacatgtc catcctgata tctcctgaat 2640
tcagaaatta gcctccacat gtgcaatggc tttaagagcc agaagcaggg ttctgggaat 2700
tttgcaagtt acctgtggcc aggtgtggtc tcggttacca aatacggtta cctgcagctt 2760
tttagtcctt tgtgctccca cgggtctaca gagtcccatc tgcccaaagg tcttgaagct 2820
tgacaggatg ttttcgatta ctcagtctcc cagggcacta ctggtccgta ggattcgatt 2880
ggtcggggta ggagagttaa acaacattta aacagagttc tctcaaaaat gtctaaaggg 2940
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gcccccaggt atttactgtg gagaacattg cataggaatg tctggaaaaa gcttctacaa 3060
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<210> 3
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CMV序列
<400> 3
gtgatgcggt tttggcagta catcaatggg cgtggatagc ggtttgactc acggggattt 60
ccaagtctcc accccattga cgtcaatggg agtttgtttt gcaccaaaat caacgggact 120
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gggaggtcta tataagcaga gct 203
<210> 4
<211> 84
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MTS序列优化1
<400> 4
atggccgcca gcccccacac cctgagcagc cgcctgctga ccggctgcgt gggcggcagc 60
gtgtggtacc tggagcgccg cacc 84
<210> 5
<211> 1380
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 5
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ctaacaaccc ccctcctaat gctaactacc tggctcctac ccctcacaat catggcaagc 240
caacgccact tatccagtga accactatca cgaaaaaaac tctacctctc tatgctaatc 300
tccctacaaa tctccttaat tatgacattc acagccacag aactaatcat gttttatatc 360
ttcttcgaaa ccacacttat ccccaccttg gctatcatca cccgatgggg caaccagcca 420
gaacgcctga acgcaggcac atacttccta ttctacaccc tagtaggctc ccttccccta 480
ctcatcgcac taatttacac tcacaacacc ctaggctcac taaacattct actactcact 540
ctcactgccc aagaactatc aaactcctgg gccaacaact taatgtggct agcttacaca 600
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gtcgaagccc ccatcgctgg gtcaatggta cttgccgcag tactcttaaa actaggcggc 720
tatggtatga tgcgcctcac actcattctc aaccccctga caaaacacat ggcctacccc 780
ttccttgtac tatccctatg gggcatgatt atgacaagct ccatctgcct acgacaaaca 840
gacctaaaat cgctcattgc atactcttca atcagccaca tggccctcgt agtaacagcc 900
attctcatcc aaaccccctg gagcttcacc ggcgcagtca ttctcatgat cgcccacggg 960
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atcatgatcc tctctcaagg acttcaaact ctactcccac taatggcttt ttggtggctt 1080
ctagcaagcc tcgctaacct cgccttaccc cccactatta acctactggg agaactctct 1140
gtgctagtaa ccacgttctc ctggtcaaat atcactctcc tacttacagg actcaacatg 1200
ctagtcacag ccctatactc cctctacatg tttaccacaa cacaatgggg ctcactcacc 1260
caccacatta acaacatgaa accctcattc acacgagaaa acaccctcat gttcatgcac 1320
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 6
gagcactggg acgcccaccg cccctttccc tccgctgcca ggcgagcatg ttgtggtaat 60
tctggaacac aagaagagaa attgctgggt ttagaacaag attataaacg aattcggtgc 120
tcagtgatca cttgacagtt tttttttttt ttaaatatta cccaaaatgc tccccaaata 180
agaaatgcat cagctcagtc agtgaataca aaaaaggaat tatttttccc tttgagggtc 240
ttttatacat ctctcctcca accccaccct ctattctgtt tcttcctcct cacatggggg 300
tacacataca cagcttcctc ttttggttcc atccttacca ccacaccaca cgcacactcc 360
acatgcccag cagagtggca cttggtggcc agaaagtgtg agcctcatga tctgctgtct 420
gtagttctgt gagctcaggt ccctcaaagg cctcggagca cccccttcct tgtgactgag 480
ccagggcctg catttttggt tttccccacc ccacacattc tcaaccatag tccttctaac 540
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ttgggagtct caagctggac tgccagcccc tgtcctccct tcacccccat tgcgtatgag 660
catttcagaa ctccaaggag tcacaggcat ctttatagtt cacgttaaca tatagacact 720
gttggaagca gttccttcta aaagggtagc cctggactta ataccagccg gatacctctg 780
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gggttctggg aattttgcaa gttacctgtg gccaggtgtg gtctcggtta ccaaatacgg 1080
ttacctgcag ctttttagtc ctttgtgctc ccacgggtct acagagtccc atctgcccaa 1140
aggtcttgaa gcttgacagg atgttttcga ttactcagtc tcccagggca ctactggtcc 1200
gtaggattcg attggtcggg gtaggagagt taaacaacat ttaaacagag ttctctcaaa 1260
aatgtctaaa gggattgtag gtagataaca tccaatcact gtttgcactt atctgaaatc 1320
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tcaatgggtg gagtatttac ggtaaactgc ccacttggca gtacatcaag tgtatcatat 120
gccaagtacg ccccctattg acgtcaatga cggtaaatgg cccgcctggc attatgccca 180
gtacatgacc ttatgggact ttcctacttg gcagtacatc tacgtattag tcatcgctat 240
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acccccaatt ttgtatttat ttatttttta attattttgt gcagcgatgg gggcgggggg 360
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<211> 1380
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<213> Artificial Sequence
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<223> ND4序列优化1
<400> 8
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agcctgcaga tcagcctgat catgaccttc accgccaccg agctgatcat gttctacatc 360
ttcttcgaga ccaccctgat ccccaccctg gccatcatca cccgctgggg caaccagccc 420
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atggccttca tggtgaagat gcccctgtac ggcctgcacc tgtggctgcc caaggcccac 660
gtggaggccc ccatcgccgg cagcatggtg ctggccgccg tgctgctgaa gctgggcggc 720
tacggcatga tgcgcctgac cctgatcctg aaccccctga ccaagcacat ggcctacccc 780
ttcctggtgc tgagcctgtg gggcatgatc atgaccagca gcatctgcct gcgccagacc 840
gacctgaaga gcctgatcgc ctacagcagc atcagccaca tggccctggt ggtgaccgcc 900
atcctgatcc agaccccctg gagcttcacc ggcgccgtga tcctgatgat cgcccacggc 960
ctgaccagca gcctgctgtt ctgcctggcc aacagcaact acgagcgcac ccacagccgc 1020
atcatgatcc tgagccaggg cctgcagacc ctgctgcccc tgatggcctt ctggtggctg 1080
ctggccagcc tggccaacct ggccctgccc cccaccatca acctgctggg cgagctgagc 1140
gtgctggtga ccaccttcag ctggagcaac atcaccctgc tgctgaccgg cctgaacatg 1200
ctggtgaccg ccctgtacag cctgtacatg ttcaccacca cccagtgggg cagcctgacc 1260
caccacatca acaacatgaa gcccagcttc acccgcgaga acaccctgat gttcatgcac 1320
ctgagcccca tcctgctgct gagcctgaac cccgacatca tcaccggctt cagcagctaa 1380
<210> 9
<211> 84
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 9
atggccgcca gcccccacac cctgagcagc cgcctgctga ccggctgcgt gggcggcagc 60
gtgtggtacc tggagcgccg cacc 84
<210> 10
<211> 84
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MTS序列优化2
<400> 10
atggccgcct ctccacacac actgagtagc agactgctga ccggctgtgt tggcggctct 60
gtgtggtatc tggaacggcg gaca 84
<210> 11
<211> 1380
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ND4序列优化2
<400> 11
atgctgaagc tgatcgtgcc caccatcatg ctgctgcctc tgacctggct gagcaagaaa 60
cacatgatct ggatcaacac caccacgcac agcctgatca tcagcatcat ccctctgctg 120
ttcttcaacc agatcaacaa caacctgttc agctgcagcc ccaccttcag cagcgaccct 180
ctgacaacac ctctgctgat gctgaccacc tggctgctgc ccctcacaat catggcctct 240
cagagacacc tgagcagcga gcccctgagc cggaagaaac tgtacctgag catgctgatc 300
tccctgcaga tctctctgat catgaccttc accgccaccg agctgatcat gttctacatc 360
tttttcgaga caacgctgat ccccacactg gccatcatca ccagatgggg caaccagcct 420
gagagactga acgccggcac ctactttctg ttctacaccc tcgtgggcag cctgccactg 480
ctgattgccc tgatctacac ccacaacacc ctgggctccc tgaacatcct gctgctgaca 540
ctgacagccc aagagctgag caacagctgg gccaacaatc tgatgtggct ggcctacaca 600
atggccttca tggtcaagat gcccctgtac ggcctgcacc tgtggctgcc taaagctcat 660
gtggaagccc ctatcgccgg ctctatggtg ctggctgcag tgctgctgaa actcggcggc 720
tacggcatga tgcggctgac cctgattctg aatcccctga ccaagcacat ggcctatcca 780
tttctggtgc tgagcctgtg gggcatgatt atgaccagca gcatctgcct gcggcagacc 840
gatctgaagt ccctgatcgc ctacagctcc atcagccaca tggccctggt ggtcaccgcc 900
atcctgattc agaccccttg gagctttaca ggcgccgtga tcctgatgat tgcccacggc 960
ctgacaagca gcctgctgtt ttgtctggcc aacagcaact acgagcggac ccacagcaga 1020
atcatgatcc tgtctcaggg cctgcagacc ctcctgcctc ttatggcttt ttggtggctg 1080
ctggcctctc tggccaatct ggcactgcct cctaccatca atctgctggg cgagctgagc 1140
gtgctggtca ccacattcag ctggtccaat atcaccctgc tgctcaccgg cctgaacatg 1200
ctggttacag ccctgtactc cctgtacatg ttcaccacca cacagtgggg aagcctgaca 1260
caccacatca acaatatgaa gcccagcttc acccgcgaga acaccctgat gttcatgcat 1320
ctgagcccca ttctgctgct gtccctgaat cctgatatca tcaccggctt ctccagctga 1380
<210> 12
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 1F
<400> 12
atctccgcac actctctcct ca 22
<210> 13
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 1R
<400> 13
gaggaaaacc cggtaatgat gtc 23
<210> 14
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 2F
<400> 14
cagcccccac accctgagca gc 22
<210> 15
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 2R
<400> 15
ctgctgaagc cggtgatgat gtc 23
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 兔-actin-F
<400> 16
ccttctacaa cgagctgcgc 20
<210> 17
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 兔-actin-R
<400> 17
tacagggaca gcacggcc 18
<210> 18
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> H-ND4-1F
<400> 18
ctgcctacga caaacagac 19
<210> 19
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> H-ND4-1R
<400> 19
agtgcgttcg tagtttgag 19
<210> 20
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> H-ND4-2F
<400> 20
ctgcctgcgc cagaccgac 19
<210> 21
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> H-ND4-2R
<400> 21
tccagggggt ctggatcag 19

Claims (10)

1.一种包含ND4基因表达盒的重组腺相关病毒载体，其特征在于，所述重组腺相关病毒载体的骨架为pAAV10，所述ND4基因表达盒包含人ND4基因或优化的人ND4基因。
2.如权利要求1所述的重组腺相关病毒载体，其特征在于，所述ND4基因表达盒从N端至C端依次包含启动子、线粒体靶向序列、人ND4基因或优化的人ND4基因、和/或UTR序列。
3.如权利要求2所述的重组腺相关病毒载体，其特征在于，所述启动子为CMV启动子或CAG启动子；所述启动子的核苷酸序列优选如SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:7所示。
4.如权利要求2所述的重组腺相关病毒载体，其特征在于，所述线粒体靶向序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10所示；和/或，所述UTR序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。
5.如权利要求2所述的重组腺相关病毒载体，其特征在于，所述人ND4基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示，所述优化的人ND4基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:11所示。
6.如权利要求2所述的重组腺相关病毒载体，其特征在于，所述ND4基因表达盒的核苷酸序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示；或者所述ND4基因表达盒的核苷酸序列从N端至C端依次为SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6，或依次为SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:6，或依次为SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ IDNO:11、SEQ ID NO:6，或依次为SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:6，或依次为SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6，或依次为SEQ ID NO:3、SEQID NO:9、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:6，或依次为SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6，或依次为SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:6，或依次为SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:6，或依次为SEQ ID NO:7、SEQ IDNO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:6，或依次为SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6，或依次为SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:6，或依次为SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6，或依次为SEQ ID NO:7、SEQ IDNO:10、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:6，或依次为SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:6，或依次为SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:6。
7.一种转化体，其特征在于，将如权利要求1～6任一项所述的重组腺相关病毒载体导入宿主，并使之整合在所述宿主的基因组上；较佳地，所述宿主为哺乳动物细胞；更佳地，所述哺乳动物细胞为HEK293细胞。
8.一种制备如权利要求1～6任一项所述的重组腺相关病毒载体的方法，其特征在于，所述方法包含以下步骤：将所述ND4基因表达盒插入到腺相关病毒载体pAAV10中即得。
9.一种制备ND4融合蛋白的方法，其特征在于，其包括以下步骤：
(1)制备如权利要求7所述的转化体；
(2)筛选重组子，获得阳性克隆，表达并纯化ND4融合蛋白。
10.如权利要求1～6任一项所述的重组腺相关病毒载体在制备治疗Leber遗传性视神经病变的药物中的应用。
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