TWI419971B - Tissue Decomposition, Cell Adhesion and Extraction and Culture of Adult Stem Cells. - Google Patents

Description

一種成體幹細胞之組織分解、細胞黏附與萃取暨培養技術。

本發明係有關於製造一種生物製劑，藉由同時剝離切碎、分解消化及篩網過濾胎盤特定部位組織，經特定物質黏附及無血清培養萃取有效篩選大量成體幹細胞之技術。

迄今，間葉幹細胞已由各國著名專家經臨床測試證實是一種有價值幹細胞，其具備有抑制免疫力、幫助修復組織與彌補造血功能等，此外亦有專家公開指出具備上述若干功能之間葉幹細胞，其細胞數量與功能發揮程度有關，細胞數量越多，功能發揮程度越高；細胞數量越少，則反之。間葉幹細胞來源包括有胚胎幹細胞(embryonic stem cell)與成體幹細胞(adult stem cell)，其中成體幹細胞存在於包括有骨髓、臍帶、胎盤及血管壁等，熟習此技術領域之技藝者，皆以相似之培養技術進行擴增培養，可製成生物製劑產品，但先前技藝中除取得成體幹細胞之步驟過於繁瑣影響品質無法一致性，亦無法有效篩選獲得大量之初代培養(P0)成體幹細胞，進而導致影響產量及產品功能性。

由於間葉幹細胞具備有抑制免疫力、幫助修復組織與彌補造血功能等優點，為達到上述已被證實的有效功能，所需的細胞數量將是關鍵因素之一，熟習此技術領域之技藝者通常需要將取得之幹細胞於體外培養數代，以期達到增加細胞數量之目的，於是在培養過程中將培養液加入不等量之人類血清或動物血清，因該血清內容物複雜，易造成產品批次間難以進行品質管控，甚或難以管控該血清引起人畜共通疾病之危險性，因此在產品應用上將產生不可預測的風險存 在。目前坊間市售標榜以胎盤間葉幹細胞為主的產品，實有購買者擔心該產品是使用含動物血清培養液及混雜整體胎盤組織生產出來的，因購買者擔心若該產品之成份與來源過於混雜，則易降低購買產品的意願。

由於現有細胞取得來源複雜，產品品質保證難以落實，包括必須能夠在長時間擴增培養下，依然產生跟原本細胞一模一樣，另外亦必須能夠在長時間擴增培養下，經誘導培養液培養後，依然具有分化形成特定型態及功能之成熟細胞，且為能達到大量取得自胎盤特定組織部位中純化成體幹細胞，同時必須避免使用含人類血清或動物血清培養液以隔絕汙染風險，因此我們發明一種製造胎盤絨毛膜蛻膜間葉幹細胞(placenta chorion-decidual-membrane-derived mesenchymal stem cell,pcMSCs)生物製劑之組織分解、細胞黏附與完全無血清(serum-free)培養萃取生產技術。

由於胚胎幹細胞的取得涉及倫理道德議題，本發明以成體幹細胞為主，遂能避免這層障礙與產品購買者的疑慮。本發明係提供了一種成體幹細胞分離暨增殖之方法，適用於不同個體胎盤絨毛膜蛻膜間葉幹細胞(pcMSCs)之分離及增殖，且經過多次繼代培養增殖後，仍然可以保持穩定的外觀型態與相同的識別度。未分化細胞，諸如組織前趨細胞、幹細胞以及它們的類似物，係具有使用於再生醫學或治療用組織工程的商業潛力，並且對於未分化細胞於再生醫學或治療用的應用而言，於體外培養呈現未分化狀態之未分化細胞的便利之方法是必要的。本發明係提供了一種分離方法萃取特定部位組織，具有高穩定性，且培養過程中排除動物血清，培養條件均為已知物質，可確保臨床應用時無動物物質 汙染之風險。

目前已發表之學術研究成果中，源自骨髓或胎盤等來源之間葉幹細胞其分離、取得與培養方式皆與本發明技術有所差異，本發明技術特徵包括：(1)使用分解液浸潤組織且同時配合將胎盤特定之絨毛膜蛻膜組織剝離切碎及篩網過濾程序，將切碎物置入塗固特定物質器皿使其黏附於上作為取得間葉幹細胞來源、(2)簡化先前技藝中取得成體幹細胞之步驟、(3)提供有效篩選胎盤絨毛膜蛻膜間葉幹細胞(pcMSCs)。

本發明技術之實驗證明如下內容說明：(1)以塗固不同物質之細胞培養皿進行孵育相同初始細胞之實驗顯示胎盤絨毛膜蛻膜間葉幹細胞(pcMSCs)對特定塗固物質具有偏好性，其中以塗固Human Ccllagen Type IV之細胞培養皿進行孵育時，該物質具備有效篩選非目標細胞之效果，請參閱第一圖。(2)取得全體細胞後，藉由本發明技術內容所提之細胞增殖溶液進行增殖，實驗數據顯示全體細胞數量越多，則初始細胞增殖越多，請參閱第二圖。(3)以本發明技術將來自不同捐贈者之胎盤中所取得胎盤絨毛膜蛻膜間葉幹細胞(pcMSCs)，再以繼代培養方式完成不同繼代次數之實驗顯示可以保持穩定的外觀形態與相同的識別度之結果，請參閱第三圖，因此本發明技術提供了一種成體幹細胞分離暨增殖方法，皆可適用於不同個體胎盤絨毛膜蛻膜間葉幹細胞(pcMSCs)。(4)以本發明技術將胎盤絨毛膜蛻膜間葉幹細胞(pcMSCs)進行繼代擴增培養至二十代時，以細胞表面抗原鑑定技術進行確認鑑定，其中細胞標記CD73、CD90、CD105及HLA-G之測試呈陽性反應；細胞標記CD14、CD34、CD45之測試呈陰性反應，請參閱第四圖。(5)以本 發明技術將胎盤絨毛膜蛻膜間葉幹細胞(pcMSCs)進行繼代擴增培養至十代時，經誘導培養後，細胞分化潛力之實驗顯示胎盤絨毛膜蛻膜間葉幹細胞(pcMSCs)仍然保持具有分化多種胚層細胞之能力，其中，A與D為成骨細胞分化試驗，A為對照組，D為試驗組；B與E為軟骨細胞分化試驗，B為對照組，E為試驗組；C與F為脂肪細胞分化試驗，C為對照組，F為試驗組，請參閱第五圖。

本發明將藉由下列實施方式做進一步之說明，這些實施方式並不限制本發明前面所揭示之內容。本發明所列實施方式除無菌操作、離心分離、細胞增殖培養、細胞表面抗原鑑定，可簡化先前技藝中取得成體幹細胞之步驟，亦可增加先前技藝中起始P0(初代培養)成體幹細胞數量，熟習此技術領域之技藝者，雖可做些許之改良與修飾，但仍不脫離本發明之範疇。

本發明實施方式步驟如下說明：

(一)取自生物體經分娩後排出體外之胎盤，以組織潔淨溶液進行清潔洗淨之，其中該溶液包含有HBSS配方培養基及濃度介於0.9%至1.1%之磷酸鹽緩衝液。

(二)完成上述步驟後，於無塵環境空間內實施本步驟，逕以無菌操作方式使用手術刀進行剝離該胎盤之羊膜組織及絨毛膜蛻膜組織。

(三)完成上述步驟後，於無塵環境空間內實施本步驟，逕以無菌操作方式使用步驟(一)組織潔淨溶液進行清潔洗淨附著於該絨毛膜蛻膜組織之血塊，清潔洗淨完畢後，將該絨毛膜蛻膜組織移至細胞專用培養皿內。

(四)完成上述步驟後，於無塵環境空間內實施本步驟，逕以無菌操作方式使 用組織分解消化溶液進行分解消化步驟(三)培養皿內之絨毛膜蛻膜組織，並且應同時施以手術刀切碎之，其中該溶液包含有SMEM配方培養基、濃度介於0.9mg/ml至1.1mg/ml之Protease 14、濃度介於0.9mg/ml至1.1mg/ml之Collagenase B及濃度介於1.9mg/ml至2.1mg/ml之DNase I，接著放置該培養皿於攝氏溫度4度之環境空間，持續其消化時間介於12小時至16小時。

(五)完成上述步驟後，於無塵環境空間內實施本步驟，逕以無菌操作方式使用孔徑介於70微米至100微米之篩網進行過濾步驟(四)培養皿內之所有物質，接著藉由離心分離方式取得該過濾液中之全體細胞。

(六)完成上述步驟後，於無塵環境空間內實施本步驟，逕以無菌操作方式使用無混合任何血清之細胞增殖溶液進行增殖步驟(五)全體細胞，增殖培養間期每三日更換新鮮之細胞增殖溶液直至細胞濃度介於1×10⁶/cm²至9×10⁶/cm²，其中該溶液包含有MCDB201配方培養基、濃度介於0.9%至1.1%之ITS及濃度介於0.9%至1.1%之磷酸鹽緩衝液。

(七)完成上述步驟後，於無塵環境空間內實施本步驟，逕以無菌操作方式使用塗固濃度介於0.1mg/cm²至1mg/cm²之Human Collagen 4之細胞培養皿進行孵育篩選步驟(六)細胞，持續其孵育24小時後，接著藉由移除未貼附該培養皿之細胞有效篩選獲得初代(P0)胎盤絨毛膜蛻膜間葉幹細胞濃度介於1×10⁴/cm²至9×10⁴/cm²。

(八)完成上述步驟後，逕以細胞表面抗原鑑定技術，進行確認鑑定步驟(七)胎盤絨毛膜蛻膜間葉幹細胞表面抗原特徵，其中該細胞特徵為細胞標記CD73、CD90、CD105及HLA-G之測試呈陽性反應，細胞標記CD14、CD34、CD45 之測試呈陰性反應。

(九)接續步驟(七)，於無塵環境空間內實施本步驟，逕以無菌操作細胞增殖培養方式使用無混合任何血清之幹細胞增殖溶液進行增殖步驟(七)初代細胞之繼代培養，培養間期每三日更換新鮮之幹細胞增殖溶液，其中該溶液包含有MCDB201配方培養基、濃度介於0.9%至1.1%之ITS、濃度介於0.9%至1.1%之磷酸鹽緩衝液及濃度介於9ng/ml至11ng/ml之EGF。

(十)接續步驟(九)，於無塵環境空間內實施本步驟，逕以無菌操作細胞繼代培養方式使用無混合任何血清之幹細胞增殖溶液進行增殖至二十代(P20)時，以細胞表面抗原鑑定技術，進行再確認鑑定該胎盤絨毛膜蛻膜間葉幹細胞表面抗原特徵，其中該細胞特徵為細胞標記CD73、CD90、CD105及HLA-G之測試呈陽性反應，細胞標記CD14、CD34、CD45之測試呈陰性反應。

另外，本發明實施方式要求限於以下說明：

(十一)僅限萃取胎盤絨毛膜之部位，必須移除胎盤絨毛膜蛻膜以外組織。

(十二)以本發明技術取得全體細胞之任何過程中，其中該過程包含必須添加組織分解消化溶液且同時施以手術刀細切至適當之大小均一，再以孔徑介於70微米至100微米之篩網過濾雜質及收集濾液，藉由離心分離方式，移除所有溶液，即可取得全體細胞，該過程中不可以使用研磨及/或震盪方式處理。

(十三)組織分解消化溶液之組成成分，僅限使用SMEM配方培養基、Protease 14、Collagenase B及DNase I四種成分組成之。

(十四)以本發明技術取得全體細胞過程中，僅限使用孔徑介於70微米至100微米之篩網進行過濾。

(十五)以本發明技術獲得之初始細胞，僅限使用塗固Human Collagen Type IV之細胞培養皿培養之，才能有效篩選獲得初代(P0)胎盤絨毛膜蛻膜間葉幹細胞。

(十六)本發明技術實施過程中，僅限使用無人類血清及/或動物血清，亦不含任何未知成分血清之各種溶液。

(十七)以本發明技術擴增培養初代(P0)胎盤絨毛膜蛻膜間葉幹細胞，於培養期間使用幹細胞增殖溶液之組成成分，僅限使用MCDB201配方培養基、ITS、EGF及磷酸鹽緩衝液四種成分組成之。

材料A(Material A)‧‧‧老鼠第一型膠原蛋白(Mouse Collagen Type I)

材料B(Material B)‧‧‧層粘連蛋白(Laminin)

材料C(Material C)‧‧‧纖維連接蛋白素(Fibronectin)

材料D(Material D)‧‧‧人類第一型膠原蛋白(Human Collagen Type I)

材料E(Material E)‧‧‧人類第四型膠原蛋白(Human Collagen Type IV)

材料F(Material F)‧‧‧無任何物質黏附(None Coating)

第一圖：以不同塗固材料之培養皿培養胎盤絨毛膜蛻膜間葉幹細胞(pcMSCs)之結果，由圖可見胎盤絨毛膜蛻膜間葉幹細胞(pcMSCs)對特定材料具有偏好性，於材料E上具有最佳的生長效率，本發明分離與培養方式與目前已發表學術成果中有關之間葉幹細胞(源自骨髓或胎盤等不同來源)不同。

第二圖：不同全體細胞數量對胎盤絨毛膜蛻膜間葉幹細胞生長影響之結果。

第三圖：不同捐贈者不同繼代次數生長情形之結果，由圖可見以此分離方法所得之細胞，來自不同捐贈者胎盤具有類似的形態，且經多次繼代培養仍能保持穩定之外觀形態。

第四圖：細胞表面抗原鑑定之結果，由圖可見符合一般對間葉細胞表面抗原訊號之定義，其中具有CD73、CD90、CD105之表現，並有HLA-G細胞表面抗原之表現且未偵測到CD14、CD34、CD45之訊號。

第五圖：幹細胞分化潛能試驗之結果，由圖可見胎盤絨毛膜蛻膜間葉幹細 (pcMSCs)具有分化多種胚層細胞之能力，其中，A與D為成骨細胞分化試驗，A為對照組，D為試驗組；B與E為軟骨細胞分化試驗，B為對照組，E為試驗組；C與F為脂肪細胞分化試驗，C為對照組，F為試驗組。

材料A(Material A)‧‧‧老鼠第一型膠原蛋白(Mouse Collagen Type I)

材料B(Material B)‧‧‧層粘連蛋白(Laminin)

材料C(Material C)‧‧‧纖維連接蛋白素(Fibronectin)

材料D(Material D)‧‧‧人類第一型膠原蛋白(Human Collagen Type I)

材料E(Material E)‧‧‧人類第四型膠原蛋白(Human Collagen Type IV)

材料F(Material F)‧‧‧無任何物質黏附(None Coating)

Claims (34)

1. 一種生物材料，其為胎盤絨毛膜蛻膜間葉幹細胞(placenta chorion-decidual-membrane-derived mesenchymal stem cell,pcMSCs)，並已寄存於財團法人食品工業發展研究所，寄存編號為BCRC960408。
2. 一種促進組織再生、組織修復、血管新生、造血功能及輔助免疫調節之生物製劑，係由根據申請專利範圍第1項之生物材料與繼代培養以擴增該生物材料之溶液組成者，其為可進行重複繼代培養仍可保持該生物材料穩定之外觀形態及同時具備分化多種細胞的能力。
3. 根據申請專利範圍第2項之生物製劑，其中該生物材料係由哺乳動物分娩後之胎盤絨毛膜蛻膜組織所得。
4. 根據申請專利範圍第3項之生物製劑，其中該胎盤絨毛膜蛻膜組織係為選自豬、牛、羊、犬、兔、鼠及人類之胎盤絨毛膜蛻膜組織。
5. 根據申請專利範圍第3項之生物製劑，其中該胎盤絨毛膜蛻膜組織係為人類之胎盤絨毛膜蛻膜組織。
6. 根據申請專利範圍第3項之生物製劑，其係經連續步驟處理包括：(a)將胎盤清潔洗淨並以手術刀手動剝離該胎盤之絨毛膜蛻膜組織；(b)將附於該絨毛膜蛻膜組織血塊清潔洗淨；(c)分解消化並同時以手術刀手動切碎該絨毛膜蛻膜組織；(d)以篩網過濾該絨毛膜蛻膜組織進而取得含該組織分離出來的細胞之濾液；(e)將該濾液以無血清細胞培養溶液進行細胞培養；(f)再將該細胞均勻分布於一塗固有一生物物質之培養載體進行持續培養24小時後，經移除未貼附 該培養皿之細胞，最後，將篩選獲得初代(P0)胎盤絨毛膜蛻膜間葉幹細胞以供使用。
7. 根據申請專利範圍第6項之生物製劑，其中步驟(c)該組織分解消化溶液係選自SMEM培養基，以及進一步包含0.9mg/ml~1.1mg/ml Protease 14、0.9mg/ml~1.1mg/ml Collagenase B及1.9mg/ml~2.1mg/ml DNase I。
8. 根據申請專利範圍第6項之生物製劑，其中該步驟(c)係將該絨毛膜蛻膜組織浸泡於攝氏溫度4度環境持續消化分解12~16小時而形成糜粥狀。
9. 根據申請專利範圍第6項之生物製劑，其中步驟(e)該細胞培養溶液係選自MCDB201培養基，以及進一步包含0.9%~1.1%(v/v)ITS及0.9%~1.1%(v/v)磷酸鹽緩衝液。
10. 根據申請專利範圍第6項之生物製劑，其中步驟(f)該細胞係選自由胎盤間葉幹細胞、組織前驅細胞、母細胞、組織特化細胞、基質細胞、組織前趨細胞、間葉細胞、脂肪衍生基質細胞、脂肪衍生幹細胞及胎盤衍生幹細胞所組成之群。
11. 根據申請專利範圍第6項之生物製劑，其中步驟(f)該生物物質組份係選自由Laminin、Fibronectin、Human Collagen Type I、Human Collagen Type IV及它們的衍生物所構成之群組。
12. 根據申請專利範圍第6項之生物製劑，其中步驟(f)該生物物質組份係選自由Human Collagen Type IV及其衍生物所構成之群組。
13. 根據申請專利範圍第6項之生物製劑，其中該步驟(f)係以數量0.1~1.0mg/cm²之生物物質組份予以塗佈固定於一培養載體。
14. 根據申請專利範圍第6項之生物製劑，其中該步驟(f)係將有效提供1~9×10⁴/cm²生物材料即初代胎盤絨毛膜蛻膜間葉幹細胞以供使用。
15. 根據申請專利範圍第2項之生物製劑，其中該溶液係選自MCDB201培養基，以及進一步包含0.9%~1.1%(v/v)ITS、0.9%~1.1%(v/v)磷酸鹽緩衝液及9ng/ml~11ng/ml EGF，俾使該幹細胞持續繼代培養。
16. 根據申請專利範圍第2項之生物製劑，其特徵為至少包含重複進行該繼代培養之重複次數達到20次仍可保持該生物材料穩定之外觀形態，其中至少包含重複次數達到10次仍可保持該生物材料穩定之外觀形態及同時具備分化多種細胞的能力。
17. 根據申請專利範圍第11項至第14項之生物製劑，其特徵為有效篩選標的細胞係選自無血清培養基之黏附型未分化幹細胞。
18. 一種根據申請專利範圍第2項至第17項所述之促進組織再生、組織修復、血管新生、及輔助免疫調節之生物製劑，其用途係應用於醫學美容領域、再生醫學領域、及醫藥領域。
19. 一種製造促進組織再生、組織修復、血管新生、及輔助免疫調節之生物製劑之方法，該方法包括下述連續步驟：(a)將胎盤清潔洗淨並以手術刀手動剝離該胎盤之絨毛膜蛻膜組織；(b)將附於該絨毛膜蛻膜組織血塊清潔洗淨；(c)分解消化並同時以手術刀手動切碎該絨毛膜蛻膜組織；(d)以篩網過濾該絨毛膜蛻膜組織進而取得含該組織分離出來的細胞之濾液；(e)將該濾液以無血清細胞培養溶液進行細胞培養；(f)再將該細胞均勻分布於一塗固有一生物物質之培養載體進行持續培養24小時後，經移除未貼附該培養皿之細胞，將篩選取得初 代(P0)胎盤絨毛膜蛻膜間葉幹細胞以供使用；(g)提供一無血清細胞繼代培養溶液進行擴增培養。
20. 根據申請專利範圍第19項之方法，其中步驟(c)該組織分解消化溶液係選自SMEM培養基，以及進一步包含0.9mg/ml~1.1mg/ml Protease 14、0.9mg/ml~1.1mg/ml Collagenase B及1.9mg/ml~2.1mg/ml DNase I。
21. 根據申請專利範圍第19項之方法，其中該步驟(c)係將該絨毛膜蛻膜組織浸泡於攝氏溫度4度環境持續消化分解12~16小時而形成糜粥狀。
22. 根據申請專利範圍第19項之方法，其中步驟(d)該過濾篩網係選自70~100微米孔徑。
23. 根據申請專利範圍第19項之方法，其中步驟(e)該細胞培養溶液係選自MCDB201培養基，以及進一步包含0.9%~1.1%(v/v)ITS及0.9%~1.1%(v/v)磷酸鹽緩衝液。
24. 根據申請專利範圍第19項之方法，其中該步驟(e)係以每三日更換新鮮細胞培養溶液直至形成細胞濃度為1~9×10⁶/cm²。
25. 根據申請專利範圍第19項之方法，其中步驟(f)該細胞係選自由胎盤間葉幹細胞、組織前驅細胞、母細胞、組織特化細胞、基質細胞、組織前趨細胞、間葉細胞、脂肪衍生基質細胞、脂肪衍生幹細胞及胎盤衍生幹細胞所組成之群。
26. 根據申請專利範圍第19項之方法，其中步驟(f)該生物物質組份係選自由Laminin、Fibronectin、Human Collagen Type I、Human Collagen Type IV及它們的衍生物所構成之群組。
27. 根據申請專利範圍第19項之方法，其中步驟(f)該生物物質組份係選自由Human Collagen Type IV及其衍生物所構成之群組。
28. 根據申請專利範圍第19項之方法，其中該步驟(f)係以數量0.1~1.0mg/cm²之生物物質組份予以塗佈固定於一培養載體。
29. 根據申請專利範圍第19項之方法，其中該步驟(f)係將有效提供1~9×10⁴/cm²生物材料即初代胎盤絨毛膜蛻膜間葉幹細胞以供使用。
30. 根據申請專利範圍第19項之方法，其中步驟(g)該細胞繼代培養溶液係選自MCDB201培養基，以及進一步包含0.9%~1.1%(v/v)ITS、0.9%~1.1%(v/v)磷酸鹽緩衝液及9ng/ml~11ng/ml EGF。
31. 根據申請專利範圍第26項至第29項之方法，其特徵為有效篩選標的細胞係選自無血清培養基之黏附型未分化幹細胞。
32. 根據申請專利範圍第30項之方法，係至少包含重複進行該繼代培養之重複次數達到20次仍可保持該篩選取得之初代胎盤絨毛膜蛻膜間葉幹細胞穩定之外觀形態，其中係至少包含重複次數達到10次仍可保持該幹細胞穩定之外觀形態及同時具備分化多種細胞的能力。
33. 根據申請專利範圍第19項之方法，其特徵為進行重複繼代培養仍可保持該幹細胞穩定之外觀形態及同時具備分化多種細胞的能力。
34. 一種根據申請專利範圍第19項至第32項之方法，其係應用於醫學美容領域、再生醫學領域、及醫藥領域。