KR20240047474A - 탈락막 태반 중간엽 줄기 세포 및 혈관형성을 촉진시키기 위한 약제학적 조성물의 제조에서의 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명에서는 탈락막 태반 중간엽 줄기 세포 및 이에 대한 배양 방법이 제공된다. 그러한 방법은, 중간엽 줄기 세포에 대한 기존의 배양 방법에서, 유도 단계가 추가되어 탈락막 태반 중간엽 줄기 세포가 디코이 수용체 3(DcR3)을 고도로 발현하게 함을 포함한다. 본 발명에서는 추가로 혈관형성을 촉진시키기 위한 약물의 제조에서 탈락막 태반 중간엽 줄기 세포의 용도가 제공된다.
Description
본 발명은 탈락막 태반 중간엽 줄기 세포(decidual placental mesenchymal stem cell) 및 이의 배양 방법, 특히, 현재 존재하는 중간엽 줄기 세포 배양 방법에 유도 단계가 추가되어 탈락막 태반 중간엽 줄기 세포에서의 디코이 수용체 3(Decoy receptor 3)(DcR3)의 발현을 증가시킴을 포함하는 배양 방법에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 혈관형성을 촉진시키기 위한 약제학적 조성물을 제조에서의 탈락막 태반 중간엽 줄기 세포의 사용에 관한 것이다.
현재, 중간엽 줄기 세포을 확인하기 위해서 사용되는 바이오마커는 대체로 International Society for Cell and Gene Therapy에 의해서 공개된 표준을 나타낸다: 세포는 CD73, CD90 및 CD105를 발현해야 하지만, CD14, CD34, CD45 및 HLA-DR을 발현하지 않는다. 바이오마커들의 조합은 골수 중간엽 줄기 세포를 기반으로 하지만, 조직 특이성의 부족이 중간엽 줄기 세포를 상이한 조직과 구별하기 위한 확인을 어렵게 한다. 반면에, 많은 보고서는 상이한 공급원으로부터의 중간엽 줄기 세포의 거동이 상이함을 지적하였다. 따라서, 중간엽 줄기 세포를 특정 조직과 구별하는 특정 생체분자 마커를 개발할 필요가 있다.
다양한 혈관혀성 인자가 중간엽 줄기 세포에서 발현되므로, 이러한 세포는 혈관형성을 촉진하여 허혈성 질환을 치료하기 위해서 적용되는 것으로 여겨진다. 그러나, 혈관형성을 촉진하는데 있어서 상이한 공급원으로부터의 중간엽 줄기 세포의 메커니즘은 이들의 주요 인자의 상이한 성능으로 인해서 상이할 수 있다.
본 발명은, 유도 단계를 무혈청 배지 제형(MCDB201 배양 배지 + EGF(표피 성장 인자) + ITS 세포 배양 보충물(인슐린, 트랜스페린(Transferrin), 셀레늄))에 추가함을 포함하는, 디코이 수용체 3(DcR3)의 높은 발현을 갖는 탈락막 태반 중간엽 줄기 세포(pcMSC)를 배양하는 방법으로서, 상기 유도 단계가 배양 과정 동안에 자극을 위해 세포 배양 배지에 하나 이상의 사이토카인을 첨가하여 pcMSC가 DcR3을 고도로 발현하도록 하는, 방법을 제공한다.
본 발명의 용어 "고도로 발현" 또는 "높은 발현"은 본 발명의 배양 방법에 의해서 배양된 탈락막 태반 중간엽 줄기 세포의 DcR3 발현 수준이 현재 존재하는 중간엽 줄기 세포 배양 방법에 의해서 배양된 pcMSC의 발현 수준보다 통계학적으로 유의하게 더 높게 나타남을 의미한다.
본 발명의 방법에서, 바람직하게는, 적어도 하나의 사이토카인은 종양 괴사 인자-α(TNF-α), 인터페론-γ(IFN-γ) 또는 이들의 조합으로부터 선택된다.
본 발명의 방법에서, 바람직하게는, 유도 단계는 pcMSC이 배양 디쉬에 부착된 후에 수행된다.
본 발명의 방법에서, 가장 바람직하게는, 유효량의 TNF-α는 15 내지 20 ng/ml이고, 유효량의 IFN-γ는 10 내지 20 ng/ml이다.
본 발명의 방법에서, 가장 바람직하게는, TNF-α 및 IFN-γ의 자극은 48 시간 동안 수행된다.
본 발명의 방법에서, 가장 바람직하게는, TNF-α 및 IFN-γ는 세포 배양 배지 내로 함께 첨가된다.
상기 배양 방법에 의해서 배양된 탈락막 태반 중간엽 줄기 세포(pcMSC)가 또한 본 발명에서 제공되고, 여기에서, pcMSC는 디코이 수용체 3(DcR3)을 고도로 발현한다.
바람직하게는, pcMSC는 에스트로겐 수용체(ER), 프로게스테론 수용체(PR) 및 디코이 수용체 3(DcR3)을 발현한다.
pcMSC에서의 DcR3의 적용된 잠재력을 추가로 조사하기 위해서, 본 발명은 또한 혈관형성을 필요로 하는 대상체에서 혈관형성을 촉진시키기 위한 약물의 제조에서 약제학적 조성물의 용도를 포함하고, 상기 약제학적 조성물은 유효량의 pcMSC를 투여함을 포함한다.
바람직하게는, 본 발명의 용도에서, 대상체는 인간 또는 포유동물이다.
바람직하게는, 본 발명의 용도에서, 유효량의 pcMSC는 1 x 104 세포 내지 2 x 105 세포이다.
도 1은 pcMSC의 특성을 도시하고 있다. (도 1a) 무혈청 배양 조건에서 pcMSC의 형태는 스핀들 모양의 부착 세포(pindle shape adherent cell)를 나타낸다. 척도 막대: 100 μm. (도 1b) pcMSC의 면역표현형 분석은 바이오마커 CD29, CD44, CD73, CD90, CD105가 양성으로 나타나고, 바이오마커 CD14, CD34, CD45 및 HLA-DR이 음성으로 나타남을 보여주고 있다. (도 1c) 각각 골형성(C2), 연골형성(C4) 및 지방형성(C6)에서의 pcMSC의 시험관내 분화 능력. C1, C3 및 C5는 각각 골형성, 연골형성 및 지방형성에 속하는 각각의 시험관내 유도 조건의 대조 그룹을 나타낸다. 척도 막대: 200 μm.
도 2는 남아 태반으로부터 분리된 pcMSC의 핵형적 특성(karyotypically characteristics)을 입증하고 있다. (도 2의 A) 20번째 계대 pcMSC(20th passage pcMSC)(N100)의 염색체 분석의 대표적인 이미지. 분석은 N98(B), N99(C) 및 N100(D)을 포함한 세 명의 개인의 46개 독립 염색체로서 제시된다. 남아 태반으로부터 분리된 pcMSC의 형광 동일반응계내 혼성화(Fluorescence in situ hybridization)는, X 및 Y 염색체의 이중 양성 결과를 나타내는 남아 신생아로부터의 인간 제대 정맥 내피 세포(HUVEC)에서의 것(E)과는 대조적으로, X 염색체(적색 형광으로 표시됨) 양성 그러나 Y 염색체(녹색 형광으로 표시됨) 음성(F)을 나타냈다. 왼쪽 하단 코너에는 개별 패널의 흰색 상자에 있는 이미지의 확대도 있다. 척도 막대: 50 μm.
도 3은 골수 중간엽 줄기 세포(BMMSC)에 비한 pcMSC의 유전자 발현 분석을 입증하고 있다. 약어: pcMSC: 탈락막 태반 중간엽 줄기 세포; BMMSC: 골수 중간엽 줄기 세포; Adsv: 지방-유래된 중간엽 줄기 세포; hES: 인간 배아 줄기 세포; UniRef: UniProt 참조 클러스터(UniProt Reference Cluster).
도 4는 BMMSC의 것들에 비한 pcMSC의 호르몬 수용체를 도시하고 있다. 약어: PRA: 프로게스테론 수용체 A; PRB: 프로게스테론 수용체 B; ER: 에스트로겐 수용체 α 서브단위.
도 5는 pcMSC의 탈락막화가 에스트라디올 및 프로게스테론의 시험관내 유도에 의해서 유도될 수 있음을 나타낸다. (A) PCR 정량적 분석의 결과. (B) 웨스턴 블롯 정량적 분석의 결과. (C) ELISA 정량적 분석의 결과. *은 0.01 < P ≤0.05를 의미하고, **은 0.005 < P ≤ 0.01을 의미하고, ***은 P ≤ 0.005을 의미하고; 및 N.D.는 검출되지 않음을 의미한다.
도 6은 pcMSC 및 BMMSC의 TNF 수용체 수퍼패밀리 연관된 유전자 발현 수준의 비교를 나타낸다.
도 7은 pcMSC 및 BMMSC에서의 DcR3의 단백질 발현 수준의 결과를 입증하고 있다.
도 8은 DcR3의 발현 수준이 TNF-α 및 IFN-γ의 유도에 의해서 향상됨을 입증하고 있다.
도 9는 DcR3에 의한 pcMSC의 시험관내 튜브 형성 분석의 실험 공정을 예시하고 있다.
도 10은 pcMSC가 DcR3에 의해서 혈관형성을 촉진함을 입증하는 시험관내 튜브 형성 분석의 결과를 예시하고 있다. (도 10a) ELISA 분석의 결과. (도 10b) 형광 현미경에 의해서 촬영된 이미지. (도 10c) 형광 현미경에 의해서 촬영된 이미지의 통계학적 결과. 결과는 평균 ± SD (n=3)으로 표현된다. *은 0.01 < P ≤ 0.05를 의미하고; **은 0.005 < P ≤ 0.01을 의미하고; ***은 P < 0.005를 의미한다.
도 2는 남아 태반으로부터 분리된 pcMSC의 핵형적 특성(karyotypically characteristics)을 입증하고 있다. (도 2의 A) 20번째 계대 pcMSC(20th passage pcMSC)(N100)의 염색체 분석의 대표적인 이미지. 분석은 N98(B), N99(C) 및 N100(D)을 포함한 세 명의 개인의 46개 독립 염색체로서 제시된다. 남아 태반으로부터 분리된 pcMSC의 형광 동일반응계내 혼성화(Fluorescence in situ hybridization)는, X 및 Y 염색체의 이중 양성 결과를 나타내는 남아 신생아로부터의 인간 제대 정맥 내피 세포(HUVEC)에서의 것(E)과는 대조적으로, X 염색체(적색 형광으로 표시됨) 양성 그러나 Y 염색체(녹색 형광으로 표시됨) 음성(F)을 나타냈다. 왼쪽 하단 코너에는 개별 패널의 흰색 상자에 있는 이미지의 확대도 있다. 척도 막대: 50 μm.
도 3은 골수 중간엽 줄기 세포(BMMSC)에 비한 pcMSC의 유전자 발현 분석을 입증하고 있다. 약어: pcMSC: 탈락막 태반 중간엽 줄기 세포; BMMSC: 골수 중간엽 줄기 세포; Adsv: 지방-유래된 중간엽 줄기 세포; hES: 인간 배아 줄기 세포; UniRef: UniProt 참조 클러스터(UniProt Reference Cluster).
도 4는 BMMSC의 것들에 비한 pcMSC의 호르몬 수용체를 도시하고 있다. 약어: PRA: 프로게스테론 수용체 A; PRB: 프로게스테론 수용체 B; ER: 에스트로겐 수용체 α 서브단위.
도 5는 pcMSC의 탈락막화가 에스트라디올 및 프로게스테론의 시험관내 유도에 의해서 유도될 수 있음을 나타낸다. (A) PCR 정량적 분석의 결과. (B) 웨스턴 블롯 정량적 분석의 결과. (C) ELISA 정량적 분석의 결과. *은 0.01 < P ≤0.05를 의미하고, **은 0.005 < P ≤ 0.01을 의미하고, ***은 P ≤ 0.005을 의미하고; 및 N.D.는 검출되지 않음을 의미한다.
도 6은 pcMSC 및 BMMSC의 TNF 수용체 수퍼패밀리 연관된 유전자 발현 수준의 비교를 나타낸다.
도 7은 pcMSC 및 BMMSC에서의 DcR3의 단백질 발현 수준의 결과를 입증하고 있다.
도 8은 DcR3의 발현 수준이 TNF-α 및 IFN-γ의 유도에 의해서 향상됨을 입증하고 있다.
도 9는 DcR3에 의한 pcMSC의 시험관내 튜브 형성 분석의 실험 공정을 예시하고 있다.
도 10은 pcMSC가 DcR3에 의해서 혈관형성을 촉진함을 입증하는 시험관내 튜브 형성 분석의 결과를 예시하고 있다. (도 10a) ELISA 분석의 결과. (도 10b) 형광 현미경에 의해서 촬영된 이미지. (도 10c) 형광 현미경에 의해서 촬영된 이미지의 통계학적 결과. 결과는 평균 ± SD (n=3)으로 표현된다. *은 0.01 < P ≤ 0.05를 의미하고; **은 0.005 < P ≤ 0.01을 의미하고; ***은 P < 0.005를 의미한다.
구체예의 상세한 설명은 본 발명의 바람직한 구체예를 예시하기 위한 것이며, 본 발명을 특정 구체예로 제한하려는 의도가 아니라는 것을 이해해야 한다. 본 발명은 본 발명의 동일한 사상 및 범위 내의 모든 대안적인 구체예를 포괄하도록 의도된다는 것을 유의해야 한다. 본 발명의 개념을 기반으로 하는 타인에 의해 이루어진 일부 필수적이지 않은 변형 및 조정은 여전히 본 발명의 보호 범위에 속한다.
실시예 1. 탈락막 태반 중간엽 줄기 세포(pcMSC)의 확인
본 발명의 연구에서, 일종의 중간엽 줄기 세포를 인간 태반 탈락막(human placental decidua), 즉 태반 융모탈락막-유래된 중간엽 간질 세포(placenta choriodecidual-derived mesenchymal stromal cell)(pcMSC)으로부터 성공적으로 분리하였다.
일종의 중간엽 줄기 세포를, 중간엽 줄기 세포의 기본적인 국제 정의와 부합하는, 태반의 융모탈락막 부분으로부터 분리하였고(도 1), 이어서, 세포가 염색체 확인 및 형광 동일반응계내 이종접합 염색 분석(fluorescence in situ heterozygous staining analysis)에 의해서 모계 부위(탈락막 부위임)에서 유래한 것으로 확인되었다(도 2).
중간엽 줄기 세포의 기본 정의는 상이한 조직 공급원으로부터 분리된 세포들을 구별할 수 없기 때문에, 탈락막 중간엽 줄기 세포를 식별하기에 충분한 바이오마커를 찾기 위해서, 본 발명에서는 골수 중간엽 줄기 세포와 탈락막 중간엽 줄기세포의 유전자 발현을 분석하였다.
본 발명에서는 골수 중간엽 줄기 세포(BMMSC)와 pcMSC 사이의 차이를 입증하기 위해서 여러 수용체 유전자를 수집하였다. 도 3에 도시된 바와 같이, pcMSC은 BMMSC에서 발현되지 않는 에스트로겐 수용체(ESR) 및 프로게스테론 수용체(PGR)를 발현했으며, BMMSC 및 pcMSC 둘 모두는 IFN-γ 수용체(IFNGR) 및 TNF-α 수용체 (TNFRSF1A)를 발현하였다. 결과는 ESR 및 PGR가 탈락막 중간엽 줄기 세포에 특유함을 확인시켰다.
pcMSC의 호르몬 수용체를 BMMSC의 것과 추가로 비교하면, 단백질 발현은 상이한 수용체 특이적 항체를 사용한 웨스턴 블롯(Western Blot)에 의해서 확인되었으며, 유방암 세포주 MDA-MB-231 및 T47D는 각각 프로게스테론 수용체(PR) 및 에스트로겐 수용체(ER)의 음성 및 양성 대조군으로 사용되었다. 결과는, BMMSC(BM) 및 지방-유래된 중간엽 줄기 세포(AdMSC)와 비교한 결과, pcMSC 만이 프로게스테론 수용체(PR)와 에스트로겐 수용체(ER)를 발현했음을 입증하였다(도 4 참조).
에스트로겐 수용체 및 프로게스테론 수용체가 탈락막 중간엽 줄기 세포에 특유하였음을 확인하기 위해서, 탈락막 중간엽 줄기 세포(pcMSC) 및 골수 중간엽 줄기 세포(BMMSC)를 10 nM 에스트로겐 및 1 μM 프로게스테론(E/P)으로 자극시켰고, 배양된 배지 및 세포를 3, 6, 및 9일째에 프로락틴 (PRL)의 발현을 평가하기 위한 후속 정량적 PCR(qPCR), 웨스턴 블롯 및 효소-결합 면역흡착 분석(ELISA) 정량적 분석을 위해서 수확하였다. β-액틴을 웨스턴 블롯에서의 정량적 표준으로서 사용하였고, 모든 실험을 삼중으로 반복하였다.
결과는 도 5에 나타내어져 있다. qPCR(A)의 결과와 관계 없이, 웨스턴 블롯(B) 또는 ELISA(C) 정량적 분석은 단지 pcMSC가 탈락막화(decidualization)로 분화할 수 있으며, 지표 유전자 PRL가 유의하게 증가하였음을 입증하였다. BMMSC는 호르몬에 의해서 조절되지 않았다. 결과는 탈락막 중간엽 줄기 세포가 탈락막 부위에서 유래한 독특한 거동을 나타냈음을 다시 한번 확인시켰다.
더욱이, pcMSC 및 BMMSC의 종양 괴사 인자(TNF) 수용체 수퍼패밀리 관련된 유전자의 발현 수준들을 또한 비교하였다. 종양 괴사 인자(TNF) 수용체 수퍼패밀리 관련된 유전자를 pcMSC와 BMMSC 사이의 특이적 유전자 발현 패턴을 평가하기 위해서 수집하여 분석하였다.
비록, 여러 유전자가 pcMSC에서 구별가능한 패턴을 나타냈지만(도 6 참조), 디코이 수용체 3(DcR3; 또는 TNFRSF6B)는 DcR3가 pcMSC에서만 발현되고 BMMSC에서는 발현되지 않는다는 것을 확인하기 위해 더욱 집중되고 추가 분석되었다. 도 7에 도시된 바와 같이, DcR3은 pcMSC에서 발현되었지만, 상이한 성별로부터 분리된 BMMSC에서는 발현되지 않았다. 그 이래로, 에스트로겐 수용체(ER), 프로게스테론 수용체(PR), 및 디코이 수용체 타입 3(DcR3)은 pcMSC의 생리학적으로 중요한 바이오마커가 상이한 조직에서 유래된 중간엽 줄기 세포를 구별하는 데 사용되게 할 수 있는 것으로 여겨졌다.
실시예 2. DcR3의 높은 발현을 갖는 탈락막 태반 중간엽 줄기 세포(pcMSC)를 배양하는 방법
본 발명은, 통상의 중간엽 줄기 세포 배양 방법에 염증-관련된 사이토카인 TNF-α와 IFN-γ를 추가함을 포함하는, 탈락막 태반 중간엽 줄기 세포(pcMSC)를 배양하는 새로운 방법을 제공한다.
상세하게는, 세포 계대배양을 위한 무혈청 줄기 세포 배양 배지를 사용한 통상의 멸균된 세포 배양 방법에 의해서 pcMSC를 배양하였고, 신선한 줄기 세포 배양 배지를 배양 중 3일마다 교체하였고, 여기에서, 배지는 MCDB201 제형 배양 배지, 1% 인슐린-트랜스페린-셀레늄(Insulin-Transferrin-Selenium)(ITS) 및 10 ng/mL 표피 성장 인자(EGF)를 포함한다.
통상의 배양 방법과는 상이하게, 본 발명에서는 pcMSC가 배양 디쉬에 부착된 후에 유도 단계가 추가된다.
본 발명에서, 세포를 4개의 그룹, 즉, (1) 음성 대조군; (2) 20ng/mL TNF-α를 함유한 유도; (3) 20ng/mL IFN-γ를 함유한 유도; 및 (4) 20ng/mL TNF-α와 20ng/mL IFN-γ를 동시에 함유한 유도로 분리하였다.
우선, 1 x 105 pcMSC를, 인큐베이터에서 밤새 배양한 후에, 6-웰 배양 플레이트에서 배양하고, 각각의 웰의 배양 배지를 제거하고, 각각의 웰에는 각각의 그룹의 조건에 따라서 (1) 자극 인자 없는 완전 배지, (2) 20ng/mL TNF-α를 함유한 완전 배지, (3) 20ng/mL IFN-γ를 함유하는 완전 배지, 및 (4) 20ng/mL TNF-α와 20ng/mL IFN-γ를 갖는 완전 배지를 각각 공급하였다. pcMSC를 48 시간 동안 배양하고, 이어서, 유도 후에 웨스턴 블롯에 의해서 확인하였다. 결과는 DcR3의 발현 수준이 모든 사이토카인 유도된 그룹의 pcMSC에서 증가되었음을 나타냈다(도 8 참조).
본 발명은 DcR3의 발현 수준을 증가시키기 위해 pcMSC의 유도를 위한 적용 가능한 사이토카인 용량을 추가로 시험하였다. 결과는 pcMSC의 DcR3 발현 수준이 또한 15ng/mL TNF-α를 사용함으로써 또한 증가될 수 있고, pcMSC의 DcR3 발현 수준이 10ng/mL IFN-γ를 사용함으로써 증가될 수 있음을 보여주었다. 유사하게, 이들 두 사이토카인이 유도를 위해 함께 첨가된 경우, pcMSC에서의 DcR3의 발현 수준을 증가시키는 결과가 또한 관찰되었다.
실시예 3. pcMSC은 혈관형성을 촉진시킬 수 있는 잠재력을 가졌다
탈락막 중간엽 줄기 세포(pcMSC)에서의 DcR3의 적용 잠재력을 더 조사하기 위해서, 본 발명에서는 연구를 위해 pcMSC를 사용하였다.
본 발명은 TNF-α 및 IFN-γ의 유도의 유무에 관계없이 pcMSC들 사이의 혈관형성의 차이를 추가로 시험하였다.
앞서 기재된 배양 방법에 따르면, pcMSC는 트랜스웰 인서트(Transwell inserts)에서 배양되었으며, 실험의 절차는 도 9에 도시되어 있다. 사용된 세포의 수는 트랜스웰 인서트의 직경에 따라 조정되었다.
우선, 1 x 104 pcMSC를 24-웰 배양 디쉬에 특이적인 트랜스웰 인서트에서 배양하였다. 48 시간 동안의 15ng/mL TNF-α와 10ng/mL IFN-γ에 의한 유도 후에, 트랜스웰 인서트를 내피 세포주(SVEC)를 함유한 배양 디쉬 내로 이동시키고, 본 발명의 유도된 pcMSC를 시험관내 튜브 형성 분석을 위해서 SVEC와 공동-배양하였다. SVEC를 매트리겔 세포 배양 매트릭스(Matrigel cell culture matrix) 상에서 배양하였다. 전체 분기점(branch point)의 양을 6 시간의 공동-배양 후의 형광 현미경 관찰에 의해서 포착된 이미지들로 계산하였다.
배양된 배지의 DcR3 농도를 사이토카인에 의한 본 발명의 pcMSC의 48 시간 유도 후에 ELISA 분석에 의해서 평가하였다. 유도된 그룹의 DcR3 발현 수준은 비-유도된 그룹의 발현 수준 보다 유의하게 더 높았다(도 10a에 도시된 바와 같음).
본 발명의 pcMSC 및 SVEC를 6 시간 동안 공동-배양하였고, 전체 분기점의 수를 형광 현미경에 의해서 촬영된 이미지를 통해서 계산하였다. 각각의 그룹의 대표적인 이미지가 도 10b에 도시되어 있다.
본 발명에서, 2 x 105 pcMSC를 동일한 실험에 대한 6-웰 배양 디쉬에 특이적인 트랜스웰 인서트에서 또한 배양하였고, 유사한 결과를 또한 얻었다(데이터는 나타내지 않음).
통계학적 결과는, 정상 대조군과 비교하여, pcMSC가 TNF-α 및 IFN-γ에 의해서 유의하게 유도된 더 많은 분기점을 유도하였으며, 이러한 현상은 항-DcR3 항체(0.5 μg/mL)를 사용함으로써 역전되었음을 보여주었다(도 10c 참조). 항-DcR3 항체의 중화 그룹에서의 분기점의 수는 정상 대조 그룹에 비하여 심지어 더 낮은 수준으로 가장 낮은 것으로 나타났다. 결과는 DcR3의 지속적인 발현이 혈관신생에 영향을 미친다는 것을 반영했다. 따라서, pcMSC는 DcR3을 발현시킴으로써 혈관형성을 촉진할 수 있다.
Claims (11)
- 탈락막 태반 중간엽 줄기 세포(decidual placental mesenchymal stem cell)(pcMSC)를 배양하는 방법으로서, 상기 방법은 유도 단계를 무혈청 배지 제형(serum-free medium formulation)에 추가함을 포함하고, 상기 유도 단계는 적어도 하나의 사이토카인을 배양 과정 동안에 자극을 위해서 세포 배지 내로 첨가하여, pcMSC가 디코이 수용체 3(Decoy receptor 3)(DcR3)를 고도로 발현하도록 하고; 상기 무혈청 배지 제형은 MCDB201 배지, 에스트로겐 수용체 및 인슐린-트랜스페린-셀레늄(ITS) 세포 배양 보충물을 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
- 제1항에 있어서, 적어도 하나의 사이토카인이 종양 괴사 인자-α(TNF-α), 인터페론-γ(IFN-γ), 또는 이들의 조합으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 방법.
- 제1항에 있어서, 유도 단계는, pcMSC가 배양 디쉬(culture dish)에 부착된 후에, 적어도 하나의 사이토카인을 첨가함으로써 수행되는 것을 특징으로 하는, 방법.
- 제2항에 있어서, TNF-α의 유효량이 15 내지 20 ng/mL이고, IFN-γ의 유효량이 10 내지 20 ng/mL인 것을 특징으로 하는, 방법.
- 제2항에 있어서, TNF-α 및 IFN-γ의 자극이 48 시간 동안 수행되는 것을 특징으로 하는, 방법.
- 제2항에 있어서, TNF-α 및 IFN-γ가 세포 배양 배지 내로 함께 첨가되는 것을 특징으로 하는, 방법.
- 제1항의 방법에 의해서 배양된 탈락막 태반 중간엽 줄기 세포(pcMSC)로서, 상기 pcMSC가 디코이 수용체 3(Decoy receptor 3)(DcR3)을 고도로 발현하는 것을 특징으로 하는, 탈락막 태반 중간엽 줄기 세포(pcMSC).
- 제7항에 있어서, 상기 pcMSC가 에스트로겐 수용체(ER), 프로게스테론 수용체(PR) 및 DcR3을 발현하는 것을 특징으로 하는, pcMSC.
- 혈관형성을 촉진시키기 위한 약물의 제조에서 약제학적 조성물의 용도로서, 약제학적 조성물이 유효량의 제7항의 탈락막 태반 중간엽 줄기 세포(pcMSC)를 포함하는 것을 특징으로 하는, 용도.
- 제9항에 있어서, 상기 pcMSC이 에스트로겐 수용체(ER), 프로게스테론 수용체(PR) 및 디코이 수용체 3(DcR3)을 발현하는 것을 특징으로 하는, 용도.
- 제9항에 있어서, pcMSC의 유효량이 1 x 104 세포 내지 2 x 105 세포인 것을 특징으로 하는, 용도.
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