JP2002255701A - 原虫用凍結保護剤及び凍結溶解後の希釈液 - Google Patents
原虫用凍結保護剤及び凍結溶解後の希釈液Info
- Publication number
- JP2002255701A JP2002255701A JP2001055123A JP2001055123A JP2002255701A JP 2002255701 A JP2002255701 A JP 2002255701A JP 2001055123 A JP2001055123 A JP 2001055123A JP 2001055123 A JP2001055123 A JP 2001055123A JP 2002255701 A JP2002255701 A JP 2002255701A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- protozoan
- freeze
- protozoa
- diluent
- trehalose
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Withdrawn
Links
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 原虫の凍結保存に有効な凍結保護
剤及び凍結融解後の希釈液を提供する。 【解決手段】 原虫の凍結保存液中に凍結保護剤
として、グリセリン、トレハロース、さらに選択的にポ
リビニルピロリドンを用いることにより、原虫の凍結保
護効果が認められた。さらに、当該凍結保存液の凍結融
解後の希釈液として、上記と同組成の保護剤を添加させ
ることにより、希釈後の原虫生存率の低下を防止するこ
とが可能となった。
剤及び凍結融解後の希釈液を提供する。 【解決手段】 原虫の凍結保存液中に凍結保護剤
として、グリセリン、トレハロース、さらに選択的にポ
リビニルピロリドンを用いることにより、原虫の凍結保
護効果が認められた。さらに、当該凍結保存液の凍結融
解後の希釈液として、上記と同組成の保護剤を添加させ
ることにより、希釈後の原虫生存率の低下を防止するこ
とが可能となった。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、原虫用凍結保存液
及び凍結融解後の希釈液に関する。
及び凍結融解後の希釈液に関する。
【０００２】
【従来技術及び発明が解決しようとする課題】従来、原
虫を凍結保存する場合、その凍結保存液に凍結保護剤と
してグリセリンが添加されているが、グリセリンのみで
は凍結により原虫の生存率が低下し、十分な凍結保護効
果が認められない。また原虫は、凍結保存後、融解し希
釈されると、さらにその生存率が低下してしまう。従っ
て、本発明は、原虫の凍結保存に有効な凍結保護剤及び
凍結融解後の希釈液を提供することにある。
虫を凍結保存する場合、その凍結保存液に凍結保護剤と
してグリセリンが添加されているが、グリセリンのみで
は凍結により原虫の生存率が低下し、十分な凍結保護効
果が認められない。また原虫は、凍結保存後、融解し希
釈されると、さらにその生存率が低下してしまう。従っ
て、本発明は、原虫の凍結保存に有効な凍結保護剤及び
凍結融解後の希釈液を提供することにある。
【０００３】
【課題を解決するための手段】上記目的を達成するため
に、本発明者らは、原虫の凍結保存液中に凍結保護剤と
して、グリセリン、トレハロース、さらに選択的にポリ
ビニルピロリドン（以下、ＰＶＰと称することもある）
を添加させることにより、原虫の凍結保護効果があるこ
とを見出し、本発明を完成するに至った。さらに本発明
者らは、当該凍結保存液の凍結融解後の希釈液として、
上記と同様にグリセリンに加えトレハロース、さらに選
択的にポリビニルピロリドンを含有する希釈液を使用す
ることにより、希釈後の原虫生存率の低下を防止するこ
とが可能であることを見出した。
に、本発明者らは、原虫の凍結保存液中に凍結保護剤と
して、グリセリン、トレハロース、さらに選択的にポリ
ビニルピロリドン（以下、ＰＶＰと称することもある）
を添加させることにより、原虫の凍結保護効果があるこ
とを見出し、本発明を完成するに至った。さらに本発明
者らは、当該凍結保存液の凍結融解後の希釈液として、
上記と同様にグリセリンに加えトレハロース、さらに選
択的にポリビニルピロリドンを含有する希釈液を使用す
ることにより、希釈後の原虫生存率の低下を防止するこ
とが可能であることを見出した。
【０００４】
【発明の実施の形態】本発明の原虫の凍結保存剤として
の組成は、基礎浮遊液にグリセリン（終濃度１０％〜２
０％）とトレハロース（終濃度０．１Ｍ〜０．５Ｍ）を
含有することである。さらに、上記組成に選択的にポロ
ビニルピロリドンなどの高分子剤（終濃度０．１％〜
０．５％）を添加したものが使用される。その他の添加
剤については凍結される原虫に応じて適宜選択すること
ができる。また、基礎浮遊液としては、ＰＢＳ-やハン
クスあるいは、Ｌａｋｅ液など特に限定はされるもので
はない。
の組成は、基礎浮遊液にグリセリン（終濃度１０％〜２
０％）とトレハロース（終濃度０．１Ｍ〜０．５Ｍ）を
含有することである。さらに、上記組成に選択的にポロ
ビニルピロリドンなどの高分子剤（終濃度０．１％〜
０．５％）を添加したものが使用される。その他の添加
剤については凍結される原虫に応じて適宜選択すること
ができる。また、基礎浮遊液としては、ＰＢＳ-やハン
クスあるいは、Ｌａｋｅ液など特に限定はされるもので
はない。
【０００５】凍結される原虫は、タイレリア属、バベシ
ア属、トリパノソーマ属などであるが特に限定はされな
い。
ア属、トリパノソーマ属などであるが特に限定はされな
い。
【０００６】また、凍結及び保存に用いる機材として
は、プログラムフリーザーあるいは−８０℃以下の保冷
能力有するディープフリーザーが利用可能である。さら
に凍結保存には液体窒素保存容器も使用可能である。
は、プログラムフリーザーあるいは−８０℃以下の保冷
能力有するディープフリーザーが利用可能である。さら
に凍結保存には液体窒素保存容器も使用可能である。
【０００７】以下に実施例により本発明を詳述するが、
本実施例に限定されるものではない。
本実施例に限定されるものではない。
【０００８】
【実施例】《実施例１》表1に示すようにタイレリア属
であるTheileria sergentiを用いて、グリセリンにトレ
ハロースを加え更にポリビニルピロリドンを添加するこ
とによる凍結保存液としての効果を確認する実験を行っ
た。基礎浮遊液のＬａｋｅ液に終濃度として、２０％グ
リセリン、０．５Ｍトレハロース、及び０．５％ポリビ
ニルピロリドンを添加した凍結保存液を用いた。また、
対照として、２０％グリセリンを含有するＬａｋｅ液を
用いた。予め原虫に感染させたフタトゲチマダニより外
科的に唾液腺を摘出し、基礎浮遊液中でホモジナイズし
た。本原虫浮遊液を上記各凍結保存液で、原虫の含有量
が１×１０3〜５×１０3個／ｍｌとなるように浮遊させ
た。この浮遊液を−８０℃のディープフリーザーで急速
凍結し、液体窒素内で１ヵ月以上保存した。
であるTheileria sergentiを用いて、グリセリンにトレ
ハロースを加え更にポリビニルピロリドンを添加するこ
とによる凍結保存液としての効果を確認する実験を行っ
た。基礎浮遊液のＬａｋｅ液に終濃度として、２０％グ
リセリン、０．５Ｍトレハロース、及び０．５％ポリビ
ニルピロリドンを添加した凍結保存液を用いた。また、
対照として、２０％グリセリンを含有するＬａｋｅ液を
用いた。予め原虫に感染させたフタトゲチマダニより外
科的に唾液腺を摘出し、基礎浮遊液中でホモジナイズし
た。本原虫浮遊液を上記各凍結保存液で、原虫の含有量
が１×１０3〜５×１０3個／ｍｌとなるように浮遊させ
た。この浮遊液を−８０℃のディープフリーザーで急速
凍結し、液体窒素内で１ヵ月以上保存した。
【０００９】その後、融解し、同原虫に感染していない
牛（２〜５カ月齢）５頭ずつに対してそれぞれ頸部皮下
に注射した。原虫の凍結保存効果の判定は、注射した牛
の血液を継時的に採取し血液塗抹した後ギムザ染色によ
り原虫の有無を確認することにより行った。その結果
は、表１に示す通り、グリセリンのみを凍結保護剤とし
て使用した場合、原虫の凍結保存効果は低く１頭の牛も
感染することはなかったが、グリセリン、トレハロース
及びポリビニルピロリドンを添加した場合、５頭とも原
虫感染が認められた。このように、グリセリン、トレハ
ロース及びポリビニルピロリドンを凍結保護剤として添
加することにより、原虫の凍結保存効果は向上した。
牛（２〜５カ月齢）５頭ずつに対してそれぞれ頸部皮下
に注射した。原虫の凍結保存効果の判定は、注射した牛
の血液を継時的に採取し血液塗抹した後ギムザ染色によ
り原虫の有無を確認することにより行った。その結果
は、表１に示す通り、グリセリンのみを凍結保護剤とし
て使用した場合、原虫の凍結保存効果は低く１頭の牛も
感染することはなかったが、グリセリン、トレハロース
及びポリビニルピロリドンを添加した場合、５頭とも原
虫感染が認められた。このように、グリセリン、トレハ
ロース及びポリビニルピロリドンを凍結保護剤として添
加することにより、原虫の凍結保存効果は向上した。
【００１０】
【表１】
【００１１】《実施例２》同凍結保存液が原虫の凍結融
解後の希釈液としての効果について検討した。実施例１
と同様に原虫を凍結保存後、融解し、同凍結保存液、ま
たはＰＢＳ-で１０倍に希釈したものを、それぞれ非感
染牛４頭に注射した。原虫の生存確認の方法も実施例１
と同法により実施した。その結果を表２に示す。グリセ
リン、トレハロース及びＰＶＰを含有する希釈液で希釈
後、接種した牛では４頭全てにおいて原虫感染が認めら
れたが、ＰＢＳ-で希釈した場合は、原虫感染は認めら
れなかった。よって、グリセリン、トレハロースと選択
的に添加したポリビニルピロリドンは原虫の凍結融解後
の希釈液としても有効であることが明らかとなった。
解後の希釈液としての効果について検討した。実施例１
と同様に原虫を凍結保存後、融解し、同凍結保存液、ま
たはＰＢＳ-で１０倍に希釈したものを、それぞれ非感
染牛４頭に注射した。原虫の生存確認の方法も実施例１
と同法により実施した。その結果を表２に示す。グリセ
リン、トレハロース及びＰＶＰを含有する希釈液で希釈
後、接種した牛では４頭全てにおいて原虫感染が認めら
れたが、ＰＢＳ-で希釈した場合は、原虫感染は認めら
れなかった。よって、グリセリン、トレハロースと選択
的に添加したポリビニルピロリドンは原虫の凍結融解後
の希釈液としても有効であることが明らかとなった。
【００１２】
【表２】
【００１３】
【発明の効果】本発明により、原虫の凍結保存に有効な
凍結保護剤が提供される。また、凍結融解後の希釈操作
において、希釈液に同様の凍結保護剤を添加することに
より、原虫の生存率に悪影響を及ぼさない希釈液が提供
される。本発明の発明の用途としては、研究以外にワク
チンの製造等、獣医領域や畜産分野などに広く利用が期
待される。
凍結保護剤が提供される。また、凍結融解後の希釈操作
において、希釈液に同様の凍結保護剤を添加することに
より、原虫の生存率に悪影響を及ぼさない希釈液が提供
される。本発明の発明の用途としては、研究以外にワク
チンの製造等、獣医領域や畜産分野などに広く利用が期
待される。
Claims (6)
- 【請求項１】 グリセリン及びトレハロースを含有する
ことを特徴とする原虫用凍結保護剤。 - 【請求項２】 グリセリン、トレハロース、及び選択的
にポリビニルピロリドンを含有することを特徴とする請
求項１記載の凍結保護剤。 - 【請求項３】 各々終濃度として、グリセリン１０％〜
２０％、トレハロース０．１Ｍ〜０．５Ｍ、ポリビニル
ピロリドン０．１％〜０．５％を含有することを特徴と
する請求項１または２に記載の凍結保護剤。 - 【請求項４】 請求項１から３のいずれかに記載の凍結
保護剤及び原虫を含有する凍結保存液の凍結融解後の希
釈液において、グリセリン及びトレハロースを含有する
ことを特徴とする希釈液。 - 【請求項５】 グリセリン、トレハロース、及び選択的
にポリビニルピロリドンを含有することを特徴とする請
求項４記載の希釈液。 - 【請求項６】 各々終濃度として、グリセリン１０％〜
２０％、トレハロース０．１Ｍ〜０．５Ｍ、ポリビニル
ピロリドンまたはフィコール０．１％〜０．５％を含有
することを特徴とする請求項４または５に記載の希釈
液。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001055123A JP2002255701A (ja) | 2001-02-28 | 2001-02-28 | 原虫用凍結保護剤及び凍結溶解後の希釈液 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001055123A JP2002255701A (ja) | 2001-02-28 | 2001-02-28 | 原虫用凍結保護剤及び凍結溶解後の希釈液 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002255701A true JP2002255701A (ja) | 2002-09-11 |
Family
ID=18915354
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2001055123A Withdrawn JP2002255701A (ja) | 2001-02-28 | 2001-02-28 | 原虫用凍結保護剤及び凍結溶解後の希釈液 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2002255701A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2020520253A (ja) * | 2017-05-17 | 2020-07-09 | ウニベルシダード ノヴァ デ リスボンＵｎｉｖｅｒｓｉｄａｄｅ Ｎｏｖａ Ｄｅ Ｌｉｓｂｏａ | 凍結保護剤および／または凍結保存剤組成物、その方法およびその使用 |
-
2001
- 2001-02-28 JP JP2001055123A patent/JP2002255701A/ja not_active Withdrawn
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2020520253A (ja) * | 2017-05-17 | 2020-07-09 | ウニベルシダード ノヴァ デ リスボンＵｎｉｖｅｒｓｉｄａｄｅ Ｎｏｖａ Ｄｅ Ｌｉｓｂｏａ | 凍結保護剤および／または凍結保存剤組成物、その方法およびその使用 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Olaciregui et al. | Cryopreservation of epididymal stallion sperm | |
| Gil et al. | Influence of extender, temperature, and addition of glycerol on post-thaw sperm parameters in ram semen | |
| Hewitt et al. | Cryopreservation of epididymal dog sperm | |
| Riesco et al. | Evaluation of zebrafish (Danio rerio) PGCs viability and DNA damage using different cryopreservation protocols | |
| CN107372460A (zh) | 一种抗氧化应激的猪精液常温保存稀释剂、保存液及应用 | |
| EP2271209A1 (en) | Materials and methods for hypothermic collection of whole blood | |
| Malo et al. | Dimethylformamide is not better than glycerol for cryopreservation of boar semen | |
| JP2011109987A (ja) | 血液細胞の凍結保存剤 | |
| Isachenko et al. | Cryobanking of human ovarian tissue for anti-cancer treatment: comparison of vitrification and conventional freezing | |
| KR101403597B1 (ko) | 정액 동결 보존용 조성물 | |
| JP2002255701A (ja) | 原虫用凍結保護剤及び凍結溶解後の希釈液 | |
| CN115517242B (zh) | 一种猪精冷冻保存试剂盒及其应用 | |
| Papis et al. | Effect of the composition of vitrification media on survival of rabbit embryos | |
| Salamon | Deep freezing of boar semen III. Effects of centrifugation, diluent and dilution rate, pellet volume, and method of thawing on survival of spermatozoa | |
| Hong et al. | Vitrification of Boer Goat Morulae and Early Blastocysts by Straw and Open‐Pulled Straw Method | |
| Talluri et al. | Effect of isolation protocols and cryoprotectants on freezing of stallion epididymal spermatozoa | |
| Mtango et al. | The effect of prefreezing the diluent portion of the straw in a step-wise vitrification process using ethylene glycol and polyvinylpyrrolidone to preserve bovine blastocysts | |
| Ping et al. | Cryopreservation of epididymal sperm in tree shrews (Tupaia belangeri) | |
| Ali et al. | Freezability of water buffalo spermatozoa is improved with the addition of catalase in cryodiluent | |
| WO2011143741A1 (en) | Extenders for mammalian sperm processing and preservation | |
| Khan et al. | Effect of supplementation of polyvinylpyrrolidone in extender on buffalo semen parameters | |
| Ma et al. | Effect of glycerol addition time on the cryopreserved Korean native brindle cattle (Chikso) sperm quality | |
| Talluri et al. | Effect of two different permeable cryoprotectants on freezability of exotic stallion and jack semen | |
| KR100944145B1 (ko) | 아마이드를 포함하는 정자의 동결보존제 및 정자의동결방법 | |
| JP3872863B2 (ja) | 哺乳動物胚保存用ストロー |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A300 | Withdrawal of application because of no request for examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A300 Effective date: 20080513 |