CN1898377A - 人角膜内皮细胞以及获得和培养用于角膜细胞移植的细胞的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了通过在体外从系统中的临界密度非酶性收获并培养内皮细胞来分离人角膜内皮细胞的方法，所述系统由涂布了细胞外基质蛋白的塑料皿和富含生长因子的培养基组成，其被用于产生扩大的内皮细胞亚群以用于在剥落的供体角膜中的细胞替换步骤或者移植。在本方法中包括了用来将天然角膜内皮从供者角膜移除的以及将培养角膜内皮细胞接种到剥落角膜上以用于移植目的的特殊步骤。

Description

人角膜内皮细胞以及获得和培养用于角膜细胞移植的细胞的方法
本专利申请要求于2003年10月10日提交的美国专利申请系列号60/510,344的优先权，并将其全部内容加入本发明作为参考。
发明背景
发明领域
本专利描述了剖离(dissect)，接种，和随后将人角膜内皮细胞纯培养物在细胞外基质上增殖的改进的方法。
现有技术描述
由于多种原因，眼睛的角膜部分可能需要被手术修复或者被替换。例如，角膜可能被刮坏或者疤痕化或者受到其它物理性损伤，从而很大程度上影响视力。角膜还会受到各种退行性疾病的影响，如果患者要想获得正常或者近正常的视觉，则需要换角膜。
人眼睛中的角膜是由基本平行、相对紧密的组织层所组成的一种特化结构。角膜的最外层或者最表层是上皮层。这是一个组织的保护性层，如果其被损伤会再生。向眼内的方向推进，所见到的是被称为Bowan’s膜的内皮层的基础表面。紧贴着Bowman’s膜的是角膜基质，其为具有分散角膜细胞的细胞外胶原建筑基质。该基质层在其最深水平与被称为Descemet’膜的角质层(cuticular)(细胞膜)结合，其又结合到形成角膜后表面的单细胞厚度的特化内皮细胞的单层。所述的内皮层在患病，受到刮坏或者其它损伤后不会再生，必须更换。
在一些包括人在内的动物种类中，角膜内皮不会正常地在体内复制来替换因损伤或者老化而损失的细胞(Murphy C，等，Invest.Ophthalmology Vis.Sci.1984；25：312-322；Laing R A，et al.，Exp.Eye Res.1976；22：587-594)。但是人角膜细胞可以在体外用富集生长因子的、包含胎牛血清的培养基中在正常的组织培养条件下培养获得(BaumJL，等，Arch.Ophthalmol.97：1136-1140，1979；Engelmann K，et al.，Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.29：1656-1662，1998；Engelmann K，andFriedl P；In Vitro Cell Develop.Biol.25：1065-1072，1989)。如果被培养的细胞可以被用于替换角膜内皮细胞的损失，其将大大增强人角膜供体库。这是很重要的，因为供体角膜可以被扩增以克服当前由于内皮细胞缺乏的原因而无法进行角膜移植的问题(Gospodarowicz D，等，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)76：464-468，1979；Gospodarowicz D，et al.，Arch.Ophthalmol.97：2163-2169，1979)。该角膜库因低的内皮细胞密度而被否决，其占每年全部捐献角膜的30％(National Eye Institute：Summary report on the cornea task force.Invest Ophthalmol Vis Sci12：391-397，1973)。此外，从低起始密度培养人角膜内皮细胞的方法，以及将体外生长的细胞重接种到被剥落的角膜扣(button)的能力，将会使将受者自己未损伤的基质用于同种细胞(allo-cell)和自体基质类型的移植成为可能(Insler MS，and Lopez JG，Cornea 10：136-148，1991)。
组织培养技术正在被成功地用于开发组织和器官等效物。这些技术的基础涉及胶原基质结构，通过使用正确的活细胞、营养成分，和培养条件的组合，这些结构能够被重塑入功能性组织和器官。组织等效物已经被广泛地描述于许多专利中，包括美国专利号4,485,096；4,485,097；4,539,716；4,546,500；4,604,346；4,837,379；和5,827,641，将它们全部在此加入作为参考。一种组织等效物的成功应用是活皮肤等效物，其形态学类似于真的人皮肤。所述的活皮肤等效物有两个层组成：上部分由分化的和层化的人上皮角质形成细胞组成，其覆盖胶原基质中一个较厚的、较低的人皮肤成纤维细胞层。Bell，等，″Recipes for ReconstitutingSkin，″J.of Biochemical Engineering，113：113-119(1991)。
已经对培养角膜上皮和内皮细胞进行了研究。Xie，等，″Asimplified technique for the short-term tissue culture of rabbitcorneal cells，″In Vitro Cellular & Developmental Biology，25：20-22(1989)和Simmons，等，″Corneal Epithelial Wound Closure in TissueCulture：An in vitro Model of Ocular Irritancy，″Toxicology andApplied Pharmacology，88：13-23(1987)。
到本发明出现前，现有技术方法在培养人角膜内皮细胞(HCEC)遇到了问题，例如HCEC细胞只能以高细胞密度(2000-5000细胞/mm2)被接种，因此限制了以小量样品起始原代培养的可能性，而且HCEC细胞不能以低接种密度(50-100细胞/mm2)被连续传代，从而限制了扩大HCEC储备以用于储存和备用目的的能力。
发明简述
本发明提供了在新的细胞外基质上培养HCEC的方法，其使得建立从小量样品(100-500细胞)起始HCEC原代培养成为可能。本发明还提供了通过系列传代成大量用于移植的细胞并低温储存以备用来扩增这些原代HCEC集落的方法。
一种发动包括人类起源在内的角膜内皮细胞的原代培养的方法，其通过使用剖离来使得培养物起始于低起始密度(100-500细胞/mm2)并使接种密度从1扩增到32。这些细胞可以被有效传代7-8次而不会损失它们的形态学完整性和生理功能，如Na/K泵活化和紧密细胞内连接的形成。角膜内皮培养物可以被保存于通常使用的补充了胎牛血清(FBS)、并富集了选择生长因子的培养基中，所述的生长因子例如成纤维细胞生长因子1和2(FGF1，FGF2)，表皮生长因子(EGF)，转化生长因子β(TGFβ)，内皮细胞生长因子(ECGF)，和其它细胞培养领域已知的生长因子。特别地，如果角膜内皮细胞在补充了牛角膜内皮的培养物天然细胞外基质中增殖，或者在含有如纤连蛋白、层粘连蛋白(laminin)，胶原I型和IV型，和RGDS的成分的合成的附着蛋白混合物中增殖，或者在被称为钻石样碳(DLC)的碳血浆沉积物上增殖，培养物在以高分裂率(1∶32或者1∶64)反复传代高达10代后会呈现越发六角形的形态。一个大的、特别是人源的角膜内皮细胞库的产生，可以以低温储存方式存储并用于将来的细胞移植步骤中。
因此，本发明的一个目标是提供一种HCEC细胞培养的方法，其可以被用于建立和系列培养人源的其它类型的细胞如神经元，胰腺β细胞，和软骨细胞(chrondocyte)。
本发明的另一个目标是产生可以被用于其它目的的足够量的HCEC。
本发明的另一个目标是提供人角膜体外细胞培养模型。
本发明的另一个目标是提供通过用本发明培养系统中生长的HCEC替换受损的角膜内皮细胞来使角膜中的角膜内皮细胞再生的方法。
本发明的另一个方面是提供通过用本发明培养系统中生长的内皮细胞替换受损的内皮细胞来再生受损的人和哺乳动物内皮细胞的方法。
通过对下面优选实施方案的详细描述，本发明的这些和其它目标，以及其它许多伴随的益处，将变得更明朗。
附图描述
图1显示了在不同基质上培养的人内皮细胞长期系列增殖的世代曲线。
图2举例说明了各种粘附因子对在存在或者不存在bFGF的情况下培养的人角膜内皮细胞增殖的影响。
图3是时间曲线，其显示了培养的人角膜内皮细胞对涂布了粘附剂的被剥落的人角膜扣的粘附。
发明详述和优选实施方案
在体外构建角膜模型的第一步中，内皮细胞被接种到细胞培养插入物(insert)的膜上。这些内皮细胞将形成角膜等效物的内层或者底层。
我们已经研制了这样一个系统，在该系统中，可以将来自供体角膜的天然角膜内皮移除而不会损伤Descemet’s膜的完整性和基质层的结构和功能，其中所述供体的内皮细胞群在细胞数量上不足或者由于疾病或物理破坏导致损伤。可以用稀释的洗涤剂如Triton X-100(0.5-5％)或者氢氧化铵(浓度从10mM到200mM)在4℃-25℃的温度下处理2-60分钟来完成这样的被剥落(denuded)的角膜的制备。用磷酸缓冲盐溶液(PBS)对该剥落的角膜进行充分清洗8-10次以移除任何洗涤剂或者氢氧化铵残余物。然后将该剥落的角膜用于来自培养的人角膜内皮细胞储备的细胞涂布。
将细胞接种到剥落的角膜表面之前，预定的、包含纤连蛋白(PBS中0.1μg-500μg/ml)，层粘连蛋白(PBS中0.1μg-500μg/ml)，RGDS(PBS中0.01μg-100μg/ml)，IV型胶原(0.1M乙酸中0.1μg-1000μg)的粘附蛋白的混合物将被加入到剥落的表面(Descemet’s膜)并在4℃下培养5-60分钟的一段时期。余下的蛋白混合物将在培养期后被移除，将角膜用PBS清洗3次并以内皮侧向上地放置到Teflon凹面支持体上。用11号手术用环钻在角膜上打出直径为11mm的扣。该扣被用来容纳培养的角膜内皮细胞。
用盐水溶液中的0.05％胰蛋白酶和0.02％ EDTA将培养的人内皮细胞从组织培养皿中移出。用颗粒计数器(Coulter Particle Counter)(Z1型，Beckman-Coulter)计数细胞悬液，并且将200μl中200,000细胞的培养基制剂(带有5％胎牛血清的DME-H16，或者含有粘附蛋白如纤连蛋白、层粘连蛋白和成纤维细胞生长因子10ng to 400ng/ml)的混合物的无血清培养基)小心地加入到剥落的角膜扣上。将约0.1到0.5ml的一层1％的透明质酸钠如Healon(Advanced Medical Optics，Santa Ana，CA)铺到细胞悬液上作为防护剂。随后将角膜扣在37℃下在10％ CO2孵箱中温育10分钟-24小时。或者，将被涂布的角膜扣温育20分钟并且将角膜用PBS在25℃下清洗3次以备移植使用。
或者，可以把将人角膜内皮细胞保持在培养物中、扩增角膜内皮细胞、和粘附蛋白的制备这一过程用来涂布从聚合物-凝胶组合物生成的人工角膜基质。简而言之，将聚合胶基质塑成角膜形状，并且用粘附蛋白和生长因子例如纤连蛋白(PBS中0.1μg-500μg/ml)，层粘连蛋白(PBS中0.1μg-500μg/ml)，RGDS(PBS中0.01μg-100μg/ml)，IV型胶原(0.1M乙酸中0.1μg-1000μg)，FGF(PBS中10-400ng/ml)，EGF(PBS中10-400ng/ml)，或者TGFβ(PBS中1-100ng/ml)的混合物处理凹面(内皮面)。4℃下培养10分钟-2小时后，用PBS清洗人工基质三次，并将密度为约150,000-250,000细胞/200ml培养基(带有5％FCS的DMA-H16，或者含有纤连蛋白、层粘连蛋白、RGDS和IV型胶原的粘附蛋白的混合物)的无血清培养基)的培养的人角膜内皮细胞加入到11mm直径的角膜扣中。将0.1到0.5ml的一层10mg/ml的透明质酸钠小心地铺到细胞层上作为防护剂，并将扣在37℃下在10％CO2孵箱中温育10分钟-24小时。温育后将人工角膜扣用PBS清洗3次以备移植使用。
在备选实施方案中，用来形成内皮层的角膜内皮细胞可以来自多种哺乳动物来源。已经使用了来自绵羊、家兔，和奶牛的非转化的角膜内皮细胞。已经用SV40的大T抗原转化了小鼠角膜内皮细胞。(Muragaki，Y.，等，Eur.J.Biochem.207(3)：895-902(1992).)也可以使用的非人细胞类型包括转化的小鼠角膜内皮细胞系，或者来自绵羊或者家兔的正常角膜内皮细胞。正常的家兔内皮细胞可以来自酶解离的角膜内皮或者角膜外植体并在MSBM培养基中被系列培养(Johnson，W.E.et al.，In VitroCell.Dev.Biol.28A：429-435(1992))，所述的培养基通过加入50μg/mL的肝素和0.4μg/mL的肝素结合生长因子-1(MSBME)而被修饰。
在另一个实施方案中，来自非角膜来源的内皮细胞也可以被用于本发明。已经被用于本发明的非角膜来源的内皮细胞包括羊科和犬科的脉管以及人脐静脉内皮细胞。这些内皮细胞可以被包含SV40大T抗原的重组体反转录病毒所转化(Muragaki，et al.，1992，上文)。被转化的细胞继续在角膜等效物中生长并由于它们缺乏接触抑制而在非细胞层的顶部形成堆。非转化的细胞将会在基质细胞—胶原层下形成单层。或者，正常内皮细胞可以被以如上方式转染，只是添加物为表达热敏感基因的重组构建体。这些转化的细胞在降低温度的持续培养下将会生长。汇合的内皮细胞层建立后，可以将温度提升以使转化基因失活，从而使细胞恢复其正常调控并表现出接触抑制，进而形成类似于非转化细胞的内皮细胞单层。多数肽段是热敏感的(除了热激蛋白)，这样，选择可通过升高培养温度而使其失活的肽的余地就很大。这种转化方式还促进了困难条件(hard)的使用以获得并培养如人角膜内皮细胞的细胞类型。
制备细胞外基质(ECM)涂布的板用于原代角膜内皮细胞培养和随后的增殖
将培养中的牛角膜内皮细胞(BCEC)接种到含有10％ FCS，5％ CS，5％葡聚糖，300ug/ml谷氨酰胺，2.5ug/ml两性霉素B，和50ng/ml bFGF的DME-H16培养基的皿上。汇合时(接种7-10天后)，用足以覆盖至少2/3板的量的20mM的NH4OH处理皿。在机械振荡器中振荡5分钟后，吸出NH4OH并用PBS清洗皿5遍。使用前要将皿储存在4℃下至少一周以消除一切活着的BCEC。将层粘连蛋白和纤连蛋白在蒸馏水中溶解至浓度100μg/ml。将IV型胶原溶解到0.6％ v/v乙酸/水中。需要的时候，将层粘连蛋白，纤连蛋白和IV型胶原加入到ECM板用于培养目的。
实施例1：原代人角膜内皮细胞的非酶剖离
用大体积的(50ml)磷酸缓冲盐溶液(PBS)清洗来自人供体的角膜缘(为了移植去除中心部分后)或者全部供体角膜。随后将其内皮侧朝上地置于支持体上。通过显微解剖仔细地将梁网状物和虹膜残余物移除。使用尖头的宝石工用镊非常仔细地剥离内皮细胞层和Descemet’s膜，注意不要剥离任何下面的基质组织。该步骤可以通过在倒置显微镜下观察解离的Descemet’s膜来确认其只在一面携带角膜内皮细胞而另一面则什么都没有。将组织片置于涂布了35mm ECM的组织培养皿或者类似合适的容器上，填充大约0.5ml的培养基(带有15％胎牛血清、富集了250ng/mlb-FGF的DME-H16)。将皿在37℃下于10％的CO2孵箱中温育24小时，随后加入另外1ml的培养基。将样品无干扰地情况下培养约7天以观察角膜内皮细胞集落是否从组织样品中向外迁移，此时(培养样品7-14天后)每隔一天对培养基进行换液，直到细胞计数达到约200-500个细胞。
实施例2：人角膜内皮细胞在高分裂率下的培养
当来自组织样品生长物的原代细胞计数达到200-500时，用STV溶液(生理盐水中0.05％胰蛋白酶和0.02％ EDTA)将细胞从皿中释放出来。当细胞变圆但是依旧粘附于培养皿的时候移除STV溶液。因为剩下的STV会被含有15％胎牛血清的生长介质灭活，所以不必进行离心步骤。将角膜细胞放置到涂布60mm ECM的皿上(大约500个细胞每皿)。每隔一天对培养基进行更换并且在更换培养基时加入250ng/ml浓度的b-FGF。汇合后(约在铺板7-10天后)，在相同的分裂率(1∶16-1∶64)下再次传代细胞，或者将细胞以106细胞/ml每安瓿的密度冻存在10％ DMSO，15％ FCS中并置于液氮保存备用。传代可以进行高达8次而不会丧失细胞功能或者形态学完整性。HCEC原液的冷冻。
对于所收集的每5ml HCEC，在细胞悬液中加入0.5ml的DMSO。将每1.1ml的混合物等份加入到1.5ml冻存管中以得到大约1百万细胞/瓶的终浓度。然后将这些小瓶置于泡沫聚苯乙烯盒中并静置于-80℃的冰箱中24小时。一天后，将安瓿转换到液氮中用于长期存放。
实施例3：角膜扣的剥落
从眼库中获得人供体角膜扣。这些角膜扣被认为由于内皮细胞数量不足的原因而不适于被移植，但是在其它方面它们都是健康且无疾病的，并且其均按照眼库指南所获得。
将角膜扣内皮侧向上地置于支持体上，用PBS清洗3次。随后，将氢氧化铵溶液以10mM-200mM的浓度仔细地加入到角膜扣中而不从顶端溢出。将角膜在大约10℃-25℃下保存5分钟-2小时。然后移除氢氧化铵，用PBS将角膜扣里面清洗大约10次。用棉拭轻柔地滑过内皮表面以移除一切残余的细胞骨架或碎片。用PBS再次清洗角膜扣三遍，用11mm的手术用环钻钻孔，该角膜可以随后被用于用培养的人角膜内皮细胞涂布。
或者，天然的角膜内皮可以通过加入Triton-X100移除，所述Triton-X100的浓度为蒸馏水中的0.5-5％，其被静置在10℃下5分钟-2小时，其后的步骤如前所述。此外，可以用蒸馏水在4℃-25℃下处理角膜内皮20分钟-2小时的时间。随后，用棉拭轻柔地滑过内皮表面以移除一切残余的细胞骨架和碎片。而后用11mm的手术用环钻对角膜钻孔。
实施例4：用粘附蛋白和生长因子处理剥落的角膜
钻孔后，再一次将剥落的角膜扣内皮侧向上地置于支持体上。将含有纤连蛋白(PBS中的浓度范围为10μg-500μg/ml)，层粘连蛋白(PBS中10μg-500μg/ml)，RGDS(PBS中1μg-100μg/ml)，IV型胶原(0.1M乙酸中10μg-1000μg)，b-FGF(PBS中1-500ng/ml)，EGF(PBS中1ng-500ng/ml)的粘附蛋白溶液小心地加入到剥落的角膜扣上。将该样品在4℃培育5分钟-2小时的时间，在培育时间末将混合物去除并用PBS清洗角膜三遍。
实施例5：用培养的人内皮细胞涂布剥落的角膜
如前所述，用STV溶液(生理盐水中的0.05％胰蛋白酶和0.02％ EDTA)移除培养皿中的培养的角膜内皮细胞。将细胞在2000rpm下离心5分钟并移除培养基。用2ml含有0.1-5％胎牛血清的DME-H16培养基重悬细胞沉淀。用颗粒计数器计算大约100μl的悬液以确定每毫升的细胞数。随后将细胞浓度调节到106细胞/ml并且小心地将200μg细胞悬液加入11m钻头钻孔的角膜扣中。将浓度范围为0.2-0.5ml的大约10mg/ml的透明质酸钠层(Healon)仔细地铺到细胞悬液上作为防护剂。随后将角膜扣在37℃下温育在10％CO2孵箱内20分钟-24小时。人角膜内皮细胞涂布的扣备好用于移植。
在一个备选的实施方案中，形成人工基质，尽管该材料可能不会象HCEC在促进生长和形态学完整性(六角形)中那样有效。
为了形成人工基质，将纤连蛋白、层粘连蛋白和RGDS以大约100μg/ml的浓度溶解到蒸馏水中，将IV型胶原以大约1mg/ml的浓度溶解在0.01％醋酸中。将bFGF以大约100μg/ml的浓度溶解在牛血清白蛋白中(0.05％w/v)。将所有材料混合在一起置于15ml离心管中并轻柔地晃动以避免气泡生成。随后将混合物在4℃下温育2小时。
为了涂布组织培养皿，将混合物用磷酸缓冲盐溶液以1∶10稀释，并随后将1ml的溶液加入到35mm皿中并在4℃下储存1小时。使用前，将溶液吸出并且将细胞悬液加入到皿中。
已经对本发明进行了描述，对于本领域技术人员来说，很容易对本发明做出许多修饰而无需离开由所附权利要求所限定的本发明主旨。

Claims (56)

1.非酶性收获和体外培养角膜内皮细胞以用于移植的方法，其包含下列步骤：
a)将角膜内皮细胞从组织源剖离；以低密度在细胞外基质(ECM)涂布的培养板上使所述的角膜内皮细胞生长一段时间；
b)将所述细胞传代到第二培养系统中，其中所述的第二培养系统包含ECM涂布的培养板并添加了充分的细胞生长因子；
c)使所述角膜内皮细胞生长至汇合；和
d)从所述第二培养系统中收获足量的所述角膜内皮细胞以用于受试者的体内移植。
2.权利要求1的方法，其中角膜内皮细胞的剖离还包含下列步骤：在第一培养系统中生长之前，将细胞从所述的组织源移出从而使细胞从所述组织源的基质剖离。
3.权利要求2的方法，其中所述的组织源可以是角膜扣或者缘。
4.权利要求2的方法，其中的ECM包含牛角膜内皮细胞细胞外基质(BCE-ECM)。
5.权利要求2的方法，其中的ECM包含人工形成的细胞外基质(AG-ECM)。
6.用来制造ECM涂布的板的方法，其包含下列步骤：
a)将牛角膜内皮细胞(BCEC)接种到皿上的DME-H16培养基中，所述的培养基含有大约10％胎牛血清，5％小牛血清，5％葡聚糖，300μg/ml谷氨酰胺，2.5μg/ml两性霉素B，和50ng/ml bFGF；
b)使BCEC生长直到汇合；
c)用体积足以覆盖至少2/3板的NH4OH处理所述的皿至少大约5分钟，此后移除NH4OH；和
d)使用前在4℃储存BCEC涂布的皿大约一周以消除任何存活BCEC。
7.权利要求5的方法，其中所述的人工形成的内皮细胞细胞外基质(AG-ECM)是由包含下列步骤的方法制成：
a)纤连蛋白，层粘连蛋白和RGDS(Arg-Gly-Asp-Ser肽)以100μg/mL制备到蒸馏水中；
b)IV型胶原以大约1mg/mL的浓度制备到0.01％乙酸中；
c)碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)以大约100μg/mL的浓度制备到牛血清白蛋白中(0.05％w/v)；
d)将步骤a，b，和c中的溶液混和，然后在4℃下培育两小时；和
e)将步骤d中的混合物用磷酸缓冲盐溶液以大约1∶10稀释，随后在使用前将足量的该溶液加入到一个皿中并使其在4℃下静置大约1小时。
8.适用于移植的人角膜内皮细胞(HCEC)，其是使用权利要求1的方法制备的。
9.适用于移植的人角膜内皮细胞(HCEC)，其是使用权利要求2的方法制备的。
10.适用于移植的人角膜内皮细胞(HCEC)，其是使用权利要求5的方法制备的。
11.一种用于在培养中生长细胞的器具，其具有至少一个与细胞接触的表面，并且在使用前所述的表面被含有BCE-ECM的混合物所涂布。
12.权利要求11的器具，其选自由细胞培养板和烧瓶组成的组。
13.权利要求11的器具，其中所述的细胞是哺乳动物细胞。
14.一种用于在培养中生长细胞的器具，其具有至少一个与细胞接触的表面，并且在使用前所述的表面被含有AG-ECM的混合物所涂布。
15.权利要求14的器具，其中所述的细胞是哺乳动物细胞。
16.一种制备HCEC细胞的方法，其中所述的HCEC缺少I类HLA抗原，其包含下列步骤：
a)从新生的来源剖离人角膜上皮细胞从而使所述的细胞不表达I类HLA抗原；
b)以范围为大约100-500细胞/平方毫米的低密度在原代培养系统中生长所述角膜上皮细胞一段时间，所述系统含有细胞外基质(ECM)涂布的培养板；
c)将所述细胞传递到第二培养系统中，其中所述的第二培养系统包含ECM涂布的培养板并添加了充分的细胞生长因子；
d)使所述细胞生长至细胞汇合；和
e)从第二培养系统中收获足量的所述细胞以用于受试者的体内移植。
17.权利要求16的方法，其中的ECM包含牛角膜内皮细胞细胞外基质(BCE-ECM)。
18.权利要求16的方法，其中的ECM包含人工产生的细胞外基质(AG-ECM)。
19.适用于移植的人角膜内皮细胞(HCEC)，其是使用权利要求16的方法制备的。
20.一种制备HCEC细胞的方法，其中所述的HCEC缺少I类HLA抗原，其包含下列步骤：
a)从组织源剖离人角膜上皮细胞，以范围为大约100-500细胞/平方毫米的低密度在原代培养系统中生长所述角膜上皮细胞一段时间，所述系统含有细胞外基质(ECM)涂布的培养板；
b)将所述细胞传代到第二培养系统中，其中所述的第二培养系统包含ECM涂布的培养板并添加了充分的细胞生长因子；
c)使所述细胞生长至汇合；
d)从所述第二培养系统中收获足量的所述细胞以用于受试者的体内移植；和
e)转化所述的细胞从而产生细胞系并且所述的细胞在HLA基因座含有靶向的破坏从而抑制了HLA抗原的表达。
21.适用于移植的人角膜内皮细胞(HCEC)，其是使用权利要求20的方法制备的。
22.权利要求1的方法，其中使用基于凝胶的检测方法，使用非基于凝胶的检测方法或者用遗传标记来确定每个HCEC细胞系的基因型
23.权利要求1的方法，其中使用血清学或者分子方法来确定每个HCEC细胞系的靶免疫类型。
24.权利要求20的方法，其中的靶免疫类型由HLA组织分型来确定。
25.一个细胞库，其包含多个种群的HLA型HCEC细胞系，其中每个HCEC细胞系衍生自不同的供体并且对独特的HLA单倍体型是纯合的。
26.权利要求25的细胞库，其中的HCEC细胞系获自不同种族性的供体。
27.权利要求25的细胞库，其中所述库的内容是被编有目录的。
28.从多个供体中产生基因型HCEC细胞的HCEC细胞库的方法，其包括下列步骤：
(a)选择供体；
(b)确定每个供体的基因型；
(c)从获得自每个供体的原代培养物中分离HCEC细胞；
(d)培养所述分离的HCEC细胞以获得HCEC细胞系；
(e)确定每个HCEC细胞系的基因型；和
(f)将从(g)中获得的每个HCEC细胞系的基因型编成目录。
29.从多个供体中产生免疫型HCEC细胞的HCEC细胞库的方法，其包括下列步骤：
(a)选择供体；
(b)确定每个供体的免疫型；
(c)形成HCEC细胞的原代培养物；
(d)从每个供体中分离HCEC细胞；
(e)培养所述分离的HCEC细胞以获得HCEC细胞系；
(f)确定每个HCEC细胞系的免疫型；和
(g)将在(e)中获得的每个HCEC细胞系的免疫型编成目录。
30.从多个供体中产生基因型和免疫型HCEC细胞的HCEC细胞库的方法，其包括下列步骤：
(a)选择供体；
(b)确定每个供体的基因型和免疫型；
(c)形成HCEC细胞的原代培养物；
(d)从每个供体中分离HCEC细胞；
(e)培养所述HCEC细胞以获得HCEC细胞系；
(f)确定每个HCEC细胞系的基因型和免疫型；和
(g)将在(e)中获得的每个HCEC细胞系的基因型和免疫性编成目录。
31.权利要求28的方法，其中的供体是哺乳动物。
32.权利要求28的方法，其中的供体是人。
33.权利要求29的方法，其中的供体是人。
34.一种转运HCEC以用于移植的方法，其包含下列的步骤：
a)依照权利要求2的方法在可生物降解的聚合物膜上生长HCEC至汇合；
b)将涂布了所述HCEC的膜放置于填充了培养基的烧瓶或者合适容器中；
c)转运所述涂布了HCEC的膜。
35.权利要求34的方法，其中所述的靶组织是角膜扣。
36.权利要求34的方法，其中所述的靶组织是第二培养系统。
37.一种转运HCEC以用于移植的方法，其包含下列的步骤：
a)依照权利要求2的方法在可生物降解的聚合物膜上生长HCEC至汇合；
b)将涂布了所述HCEC的膜放置于供体靶组织上；
c)使HCEC在供体组织上生长足以防止在转运期间移动的时间；
d)在储存介质中转运所述的组织。
38.权利要求37的方法，其中的靶组织是剥落的角膜。
39.权利要求34的方法，其中所述可生物降解的聚合物包含适合于用BCE-ECM或者其它生物相容的涂层如钻石样碳涂布的半固体状态。
40.一种用于保护权利要求35的所述再生靶组织在转运或者移植过程中剥落的方法，其包含下面的步骤：
a)依照权利要求2的方法在可生物降解的聚合物膜上生长HCEC至汇合；
b)将涂布了所述HCEC的膜放置于供体靶组织上；
c)在已经被缀合到bFGF的1％透明质酸钠存在的情况下，使HCEC在供体组织上生长足以防止在转运期间移动的时间；和
d)将所述的组织在含有缀合到bFGF的1％透明质酸钠的储存介质中转运。
41.权利要求40的方法，其中所述的靶组织是剥落的角膜。
42.依照权利要求40处理的靶组织。
43.一种储存HCEC再生的靶组织以用于移植的方法，其包含下面的步骤：
a)依照权利要求2的方法在可生物降解的聚合物膜上生长HCEC至汇合；
b)将涂布了HCEC的膜放置到供体靶组织上；
c)使HCEC在供体组织上生长足以防止在转运期间移动的时间；
d)在储存介质中的所述组织中加入抗结冰或者防冷冻剂；和
e)将靶组织在非常低的温度下储存。
44.一种剥离天然角膜使其适于移植或者校正的方法，其包括下列步骤：
a)将角膜扣或者其它靶组织放置在适当的支持体中；
b)将足量的剥离制剂加入到步骤a的支持体上从而使其完全覆盖所述的靶组织；
c)将所述的组织与所述的剥离制剂在接近室温下温育足够长的时间；和
d)用适当的缓冲液清洗靶组织大约10遍。
45.权利要求44的方法，其中的剥离制剂包含磷酸缓冲盐溶液中的浓度为大约0.01-1％v/v的Triton X溶液。
46.权利要求44的方法，其中的温育时间为大约5分钟。
47.权利要求44的方法，其中的剥离制剂包含浓度为大约20mM的氢氧化铵溶液。
48.权利要求47的方法，其中的温育时间为大约2-5分钟。
49.一种剥离天然角膜使其适于移植或者校正的方法，其包括下列步骤：
a)将角膜扣或者其它靶组织放置在适当的支持体中；
b)将足量的蒸馏水加入到步骤a的支持体上从而使其完全覆盖所述的靶组织；
c)将所述的组织与所述的剥离制剂在接近室温下温育约15分钟；
d)吸出约一半体积的水；
e)从角膜扣机械地扫过湿润的内皮；和
f)用磷酸缓冲盐溶液清洗角膜扣大约3遍。
50.一种再构的细胞外基质制备物，其包含足量的生长因子混合物和足量的粘附因子混合物。
51.权利要求50的生长因子混合物，其包含适当生物缓冲液中的足量的bFGF，EGF和polycarbophyll。
52.权利要求51的生长因子混合物，其中bFGF，EGF和polycarbophyll的浓度分别约为3.33μg/mL，33.33μg/mL和0.33mg/mL。
53.权利要求50的粘附因子混合物，其包含适当生物缓冲液中的足量的层粘连蛋白，纤连蛋白，RGDS，和IV型胶原。
54.权利要求53的粘附因子混合物，其中层粘连蛋白，纤连蛋白，和RGDS的浓度大约是83.33μg/mL，而且IV型胶原的浓度大约是250μg/mL。
55.一种涂布剥落的角膜的方法，其包含下列步骤：
a)将角膜扣或者其它靶组织放置到合适的支持体中；
b)用磷酸缓冲盐溶液清洗所述的角膜扣；
c)将足量的权利要求50的再构的细胞外基质制备物加入到步骤a的所述支持体中，使其完全覆盖所述的靶组织；
d)在大约4℃下温育所述的角膜扣一段充分的时间；和
e)用磷酸缓冲盐溶液或者其它合适的缓冲液清洗所述的角膜扣。
56.依照权利要求55的涂布剥落的角膜的方法，还包括下列步骤：
f)在接种新的内皮细胞前，向所述的角膜扣中加入大约300μL1％的透明质酸钠。
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