CN103688170A - 使用免疫学技术进行的体外测定方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及体外测定培养细胞合成的胞外基质的分子的新方法及所述新方法的用途，用于体外测量的试剂盒和/或用于筛选化妆品和/或药物成分的方法。

Description

使用免疫学技术进行的体外测定方法
本发明涉及体外测定培养细胞合成的胞外基质分子的新方法及所述新方法的用途，用于体外测量的试剂盒和/或用于筛选化妆品和/或药物成分的方法。
胞外基质（ECM）尤其是通过其支持、黏附和调节细胞交换的功能在人和动物的机体组织的结构中发挥重要作用。ECM主要由糖蛋白、蛋白质和糖胺聚糖组成。这些分子在与ECM接触的细胞中以天然形式合成。它们从胞内区室排出细胞外。在经历成熟现象后，它们变得有组织，并排列为形成ECM的网络。然后它们处于有功能的形式。
尤其在化妆品和药物领域，ECM分子是研究的课题，其中许多成分旨在刺激ECM分子的合成，从而改善所讨论的组织的一般状态。
在体外，培养细胞在适宜的条件中产生它们的胞外基质，并构成用于研究，尤其是用于测量细胞合成构成ECM的一种或多种分子的活性，以及成分对所述活性的影响的特别简单的模型。在这类培养细胞模型中，ECM分子任选地以多种形式，尤其是以前体形式存在于不同的培养区室（胞内区室、培养基区室）中或包含在ECM区室中。
经典的测量技术包括测量培养基中的ECM分子的量。因此，根据最常用的技术，将ELISA技术用于测定培养基中的ECM分子，如胶原，任选地所述ECM分子的前体形式，如前胶原。另一种更昂贵、更具限制性和更广泛应用的技术包括：在培养基中含有细胞合成ECM分子所使用的放射性标记分子，整体测量所有区室中这样获得的放射性的强度。例如，将氚标记的脯氨酸用于测量培养细胞产生的胶原的总量。这些技术能够显示培养细胞的合成活性，但不显示这样合成的分子的功能性，即ECM中的分子的量。
只有免疫组织化学分析使得有可能测定，且只是部分测定这样合成的ECM分子的功能性。此技术包括：去除培养基，用针对所研究的ECM分子的抗体标记，然后读出和/或显示荧光。此技术使得有可能定量包含在胞内区室、胞外区室及ECM中的分子，尤其显示所述分子的定位。但是，此技术难以实施，且需要昂贵的设备。此外，该技术本身不允许分析大量成分。此外，它具有主观性，且依赖于实验者。因此，在本发明之前，没有允许以足够快速、可靠、简单和可预测的方式测定功能分子（即确实掺入到ECM中的分子，尤其是构成ECM分子）的量的客观的定量测量法。此外，没有允许筛选具有化妆品益处和/或药物益处的成分的方法。
然而，在胞内区室中和/或在胞外区室中测量到了培养细胞高水平合成ECM分子并非必然导致较大量的功能分子，即ECM中的分子。
实际上，申请人能够显示，某些化妆品活性成分可以提供合成ECM的胶原的总体刺激，但未观察到胶原功能性的改善，即ECM中胶原的含量未增加。申请人还发现，某些成分改善胶原功能性，即胶原在ECM中的含量，但未测量到前胶原的合成的增加（实施例6和7）。
因此，现有技术不适合定量ECM分子的功能性，即其在ECM中的含量，因为现有技术不是直接的，且不够可靠、可预测、可再现、可重复和特异。此外，现有技术不允许筛选化妆品和/或药物成分，其有可能以令人满意的方式改善ECM分子的功能性或使得有可能显示其在ECM中的作用。
出版物Diquélou A.等,1995,Relationship between endothelial tissuefactor and thrombogenesis under blood conditions,Thrombosis andhaemostasis,74卷,第2期,778-783页及Ryan J等,1992,Tumor necrosisfactor-induced endothelial tissue factor is associated with subendothelialmatrix vesicles but is not expressed on the apical surface,Blood,80卷,第4期,966-974页描述了在培养4或8小时后测定HUVECS合成的TF。然而，这类培养时间太短而不允许培养细胞合成ECM及研究构成ECM和/或包含在ECM中的分子的功能性。这些实验实际上具有其他目的。
因此，存在对用于测定培养细胞合成的ECM分子的技术的需求，通过该技术可以以可靠、简单、可重复、可预测和特异的方式直接和定量地测定ECM分子的功能性，即所述ECM分子在ECM中的含量。此外，需要这样的技术，该技术不会降解ECM，使得有可能显示和定量所研究的ECM中的分子，尤其原位研究以功能形式存在的所述ECM中的分子，并研究所述ECM中的分子与ECM的其他分子的相互作用。
申请人最近惊奇和意外地发现，可以通过进行裂解培养细胞和在ECM上直接测定目的分子的特定步骤来解决此问题。因此，根据本发明的方法提供现有技术的问题的技术解决方案，且具有快速、适用于小型化和允许有利地以自动化的形式筛选大量成分的优势，所述成分能增加或降低ECM中分子的量。根据本发明的方法还具有不破坏ECM及使得有可能定量和显示ECM分子的优势。
本发明涉及使用免疫学技术体外测定培养细胞合成的至少一种胞外基质分子的测定方法，其至少包括以下步骤：
a）培养细胞且优选地铺满培养细胞至少24小时的步骤；
b）收集培养基的优选步骤；
c）用季胺溶液裂解细胞的步骤，所述季胺溶液的浓度优选地在100μM至2M的范围内；
d）收集细胞裂解物的步骤；
e）通过免疫学技术测定所述胞外基质中的分子的步骤。
本发明还涉及使用免疫学技术体外测定培养细胞合成的至少一种胞外基质分子的测定方法，其至少包括以下步骤：
a）培养细胞且优选地铺满培养细胞至少24小时的步骤；
b）收集培养基并测定ECM分子和/或ECM分子的前体的步骤；
c）用季胺溶液裂解细胞的步骤，所述季胺溶液的浓度优选地在100μM至2M的范围内；
d）收集细胞裂解物并测定DNA和/或测定ECM分子和/或ECM分子的前体的步骤；
e）通过免疫学技术测定所述包含在胞外基质中的ECM分子的步骤。
本发明还涉及根据本发明的测定方法的用途，用于筛选和/或体外研究至少一种具有化妆品益处和/或药物益处的成分，所述具有化妆品益处和/或药物益处的成分具有增加和/或降低胞外基质中分子的量的性质。
本发明还涉及筛选和/或体外研究至少一种具有化妆品益处和/或药物益处的成分的方法，所述具有化妆品益处和/或药物益处的成分具有增加和/或降低胞外基质中分子的量的性质，所述方法至少包括以下步骤：
a）在所述成分的存在下培养细胞且优选地在所述成分的存在下铺满培养细胞至少24小时；
b）优选地收集培养基并更优选地测定所述这样收集的培养基中ECM分子和/或ECM分子的前体的步骤；
c）用季胺溶液裂解细胞的步骤，所述季胺溶液的浓度优选地在100μM至2M的范围内；
d）收集细胞裂解物并优选测定DNA和/或测定ECM分子和/或ECM分子的前体的步骤；
e）通过免疫学技术测定所述包含在胞外基质中的ECM分子的步骤。
本发明还涉及用于根据本发明的方法之一的测定方法的试剂盒，所述测定方法通过免疫学方法进行，所述试剂盒优选以100μM至2M的范围内的浓度包含至少一种季胺溶液和任选地与第二抗体结合的抗ECM分子的抗体。本发明还涉及选择用于根据本发明的测定方法的裂解液的方法，其中用待测试的裂解液进行根据本发明的测定方法至少10分钟，优选地10分钟，并将步骤e）中获得的ECM分子的测定结果与细胞裂解物中DNA的测定结果的比值同在相同的时间，优选10分钟中应用20mM氢氧化铵裂解液获得的比值相比较。
根据本发明，“ECM分子”意指构成胞外基质和/或包含在胞外基质中并由人类或动物来源的细胞合成的有机分子。
ECM分子尤其指构成ECM的蛋白质，其特别地选自：
-ECM的胶原家族：纤维胶原，尤其是I、III或V型胶原，FACITS胶原（具有中断的三螺旋的原纤维相关胶原（Fibril Associated Collagenwith Interrupted Triple Helix）），尤其是VI、XII、XIV或XVI型胶原，胶原IV和VII，胶原XXII、XXVII、XVIII；
-ECM的弹性纤维家族：弹性蛋白，原弹性蛋白，与弹性蛋白相关的蛋白质，尤其是肌原纤蛋白1、赖氨酰氧化酶，尤其是LOX和LOXL、EBP（弹性蛋白结合蛋白），纤蛋白3和5，弹联蛋白1和2。
ECM分子尤其指构成ECM的蛋白聚糖，尤其是分泌性蛋白聚糖，其选自基底膜蛋白聚糖，多功能蛋白聚糖，富含亮氨酸的蛋白聚糖（SLRP），尤其是饰胶蛋白聚糖、双糖链蛋白聚糖和光亮蛋白聚糖。
ECM分子还是构成ECM的糖蛋白，尤其是纤连蛋白、层粘连蛋白、SPARC（富含半胱氨酸的分泌性蛋白质）、生腱蛋白、巢蛋白-1。
此外，ECM分子是构成ECM的糖胺聚糖（GAG），尤其是透明质酸、硫酸乙酰肝素、硫酸皮肤素、硫酸软骨素。
ECM分子还是ECM的生长因子，其是包含在ECM中的蛋白质，特别是VEGF、PDGF、HGF、FGF，特别是FGF2和FGF7。
本发明非常有利地使得有可能测定和研究构成ECM的分子，并在孔中原位显示它们，这意味着不用破坏ECM。
ECM的某些分子以前体形式存在于ECM以外的区室。
“ECM分子”意指任选地以前体形式存在于ECM中或其他区室，尤其是胞内区室和培养基中的胞外区室中的分子。
根据本发明，“ECM分子的前体”意指在构成ECM或包含在ECM中之前，由细胞合成的ECM分子的天然和/或中间形式。这些形式在进入ECM前经历成熟的现象，因此通常通过前缀“前”或“原”来表示。它们是例如前胶原、原胶原、前弹性蛋白、原弹性蛋白。
根据本发明，“培养细胞”意指能够合成一种或多种ECM分子的人类细胞或动物细胞。在根据本发明的方法中，按照本发明培养这些培养细胞，并测定这些细胞合成的一种或几种ECM分子。这些细胞优选属于分化的类型，尤其可以是分化的前体型细胞或分化的非前体型细胞或其混合物。它们可以是正常的、突变的或无限增殖化的，以单层细胞方式培养，任选地与能够或不能合成一种或多种ECM分子的一种或多种其他细胞类型共培养。这些细胞尤其是基质细胞，优选成纤维细胞、成骨细胞和/或脂肪母细胞（adipoblast），前脂肪细胞、脂肪细胞、上皮细胞，优选角质形成细胞或内皮细胞。所述培养细胞从活组织检查，优选从皮肤活组织检查提取，或存在于细胞系中。根据优选实施方案，本发明对研究构成ECM并由培养的成纤维细胞合成的分子极其有利。实际上，功能性ECM在皮肤组织的结构中非常重要，根据本发明的方法提供了研究培养孔中的细胞，包括铺满后培养2至4天后的成纤维细胞的途径（access）。
根据本发明，“免疫学方法”意指使用抗蛋白质或抗糖的抗体进行的定量测定的技术。
所述免疫学方法是EIA（酶免疫测定）类型的酶-底物测定技术，尤其是ELISA（酶联免疫吸附测定）、RIA（放射免疫测定）放射性标记和称为FIA（荧光免疫测定）的荧光测量法，尤其是通过时间延迟的荧光（time-delayed fluorescence）进行的测定，称为TRF（时间分辨荧光(TimeResolved Fluorescence)）。
根据本发明，“具有化妆品益处和/或药物益处的成分”意指任选地通过生物工程，尤其是通过微生物发酵合成或修饰的一种或多种天然和/或合成的分子和/或植物提取物，评价了所述分子和/或植物提取物在增加或降低ECM中的分子的量的能力方面的性质。
根据本发明的目的是使用免疫学技术体外测定培养细胞合成的至少一种胞外基质分子的测定方法，其至少包括连续步骤：
-培养细胞的步骤；
-收集培养基的优选步骤；
-用季胺溶液裂解细胞的步骤；
-收集细胞裂解物的步骤；
-通过免疫学技术测定所述包含在胞外基质中的分子的步骤。
根据本发明的方法使得有可能测定ECM的至少一种分子，有利地，一种或两种，更优选至少两种分子。
根据优选实施方案，ECM分子选自构成ECM的蛋白质、构成ECM的糖蛋白、构成ECM的糖胺聚糖、构成ECM的蛋白聚糖及包含在ECM中的生长因子。更优选地，所述ECM分子选自I、III、V、VI、XII、XIV、XVI、IV和VII型胶原、弹性蛋白、原弹性蛋白、肌原纤蛋白1、LOX、LOXL、EBP（弹性蛋白结合蛋白）、纤蛋白3和5、弹联蛋白1和2、基底膜蛋白聚糖、多功能蛋白聚糖、饰胶蛋白聚糖、双糖链蛋白聚糖、光亮蛋白聚糖、纤连蛋白、层粘连蛋白、透明质酸、硫酸乙酰肝素、VEGF、PDGF、FGF-2、FGF-7和HGF。
根据尤其有利的实施方案，ECM分子选自I、III、V、XVIII、IV和VII型胶原、基底膜蛋白聚糖、纤连蛋白、FGF-2、弹性蛋白、透明质酸。根据优选实施方案，ECM分子选自I、III、V、XVIII、IV和VII型胶原。
按照此领域的常规技术优选以单层细胞方式体外培养能够合成ECM分子的细胞。将它们接种在适宜的培养基质，优选包含孔的细胞培养板上，并在合适的培养基中培养，直至铺满，优选80%至100%之间，更优选90%至100%之间，更优选100%的铺满。
对于该方法在中通量筛选中的用途，该平板有利地是96孔或384孔板。常规地包被这些平板，即用特异性包被处理来改善细胞黏附。这种包被可以是构成ECM的分子。优选地，不包被平板或用分子包被平板，所述分子不同于所测定的分子和/或其在ECM中的含量被研究的分子。
根据优选实施方案，培养细胞选自成纤维细胞，优选真皮成纤维细胞和/或角质形成细胞和/或脂肪细胞，有利地是人类细胞，优选从活组织检查，更优选从皮肤活组织检查提取，且优选是正常人类细胞，即未突变的细胞和未无限增殖化的细胞。实际上，所进行的研究已显示，根据本发明的方法尤其适合于这些细胞类型。
通常在铺满时，细胞将开始分泌ECM分子。因此，有利地，维持细胞铺满培养至少24小时且优选至多6天，优选24至96小时，且更优选48小时。根据尤其有利的实施方案，胶原是所测定的ECM分子，且有利地维持成纤维细胞的培养约48小时。
根据一个实施方案，在铺满时，向培养基中加入具有化妆品益处和/或药物益处的成分。它还可以是用于刺激或抑制ECM分子的对照成分。优选地，有利地当培养细胞是成纤维细胞时，刺激对照选自维生素C和TGFβ。然后有利地以5μM至100μM，更优选地以50μM的剂量使用维生素C。然后有利地以1ng/ml至100ng/ml，优选地以10ng/ml的剂量使用TGFβ。
优选地，在含有具有化妆品益处和/或药物益处的成分的培养基中铺满培养细胞至少24小时，且优选至多6天，优选24至96小时，优选48小时。
然后优选进行收集全部或部分培养基的步骤。根据有利的实施方案，通过免疫学方法，优选通过ELISA型测定法测定所研究的且任选地以前体形式包含在培养基中的ECM分子。
然后根据本发明的方法包括这样的步骤，用季胺溶液，优选水溶液，更优选铵的溶液（任选地是盐的形式）裂解培养细胞。根据优选实施方案，季胺溶液选自氯化铵溶液、氢氧化铵溶液及其混合物。
根据本发明，“季胺溶液”意指这样的溶液，其中四价形式的胺代表至少51%的胺形式。
根据优选实施方案，季胺溶液仅在水溶液中包含季胺。根据另一优选实施方案，季胺溶液具有碱性pH，具有优选10和13之间，更优选11的pH。
实施例3中显示的结果证明了季胺溶液相对于用于细胞裂解的常规溶液的优势。令人惊奇地，季胺溶液实际上提供了最好的细胞裂解率及最好的ECM分子的测定率。
在此裂解步骤中，优选在去除全部或部分培养基之后，使季胺溶液与铺满状态的培养细胞接触。
以足够裂解细胞的浓度应用季胺溶液。申请人所进行的研究证明，足够裂解细胞的浓度通常在100μM至2M的范围内。根据优选实施方案，季胺溶液的浓度为1mM至200mM，更优选10mM至100mM，特别优选20mM。在未去除或仅部分去除培养基的特定情况下，考虑稀释因子以用于调节季胺溶液的浓度。
部分显示于实施例2中的这些研究尤其显示，优选的裂解时间在5分钟和60分钟之间。实际上，用更长的时间获得的结果并非更好，证明更长的裂解时间不是合适的。
根据有利的实施方案，季胺溶液选自氯化铵溶液和氢氧化铵溶液及其混合物，所述氯化铵溶液的浓度在100μM至2M、优选1mM至200mM、更优选在10mM至100mM的范围内，特别优选为20mM，所述氢氧化铵溶液的浓度在100μM至2M、优选1mM至200mM、优选10mM至100mM的范围内，特别优选为20mM。
根据备选实施方案，优选通过与用20mM的氢氧化铵溶液处理10分钟获得的结果相比较来选择季胺溶液，特别地当在相同条件中测试时，得到了相同的ECM分子/DNA比值（加或减16%），且优选与用20mM的氢氧化铵处理10分钟得到的结果无显著差异。
根据优选实施方案，通过与应用20mM的氢氧化铵裂解液10分钟获得的结果相比较来选择应用季胺溶液，优选铵的溶液的浓度和时间。因此，将步骤e）中获得的ECM分子的测定结果与细胞裂解物中的DNA的测定结果的比值同在相同的时间中应用20mM的氢氧化铵裂解液获得的比值相比较。
优选地，通过方差统计学分析中所称作的单因素方差分析检验（OneWay Anova test）来进行比较，并以这样的方式选择应用的浓度和时间，使得所测试的溶液的比值没有至少p<0.05且优选p<0.001的显著差异。
裂解步骤优选在室温下，优选在15℃和25℃之间，更优选在20℃进行。所述裂解步骤优选地在搅拌下进行。
根据本发明的方法然后包括收集细胞裂解物的步骤。
根据有利的实施方案，分析细胞裂解物。根据优选实施方案，进行测量DNA的量的步骤，以通过DNA的量来使ECM分子的测定结果合理化。因此，此实施方案使得有可能比较获得的结果，其是通过培养物中的活细胞数间接合理化的。尤其是在评价具有化妆品益处和/或药物益处的成分的情况下，此实施方案使得有可能表示出所观察到的对ECM分子的作用，例如对每个细胞的刺激。
可以通过此领域中常用的技术（例如使用通过荧光检测的嵌入剂而进行的生物化学测定法）进行测量裂解物中DNA的量的步骤。
根据有利的实施方案，通过免疫学方法，优选通过ELISA型测定法测定所研究的且任选地以前体形式包含在细胞裂解物中的ECM分子。
根据本发明的方法然后包括使用免疫学技术，优选通过TRF荧光法测定包含在胞外基质中的分子的步骤。
根据优选实施方案，通过DNA的量使ECM分子的测定结果合理化。基于此类测定中常用的标准范围可以将荧光测量结果转化为ECM分子的量。
根据优选实施方案，分析步骤b）中收集的培养基和/或步骤d）中收集的细胞裂解物，以有利地允许测定多种区室(胞内区室、培养基区室和ECM区室)中的ECM分子。
本发明还涉及使用免疫学技术体外测定培养细胞合成的至少一种胞外基质分子的测定方法，其至少包括以下连续步骤：
a）培养细胞的步骤；
b）收集培养基并测定ECM分子和/或ECM分子的前体的步骤；
c）用季胺溶液裂解细胞的步骤；
d）收集细胞裂解物并测定DNA和/或测定ECM分子和/或ECM分子的前体的步骤；
d）通过免疫学技术测定所述包含在胞外基质中的ECM分子的步骤。
上文描述了优选实施方案。此方法有利地使得有可能测定多种区室(胞内区室、培养基区室和ECM区室)中的ECM分子。
本发明还涉及根据本发明的测定方法在筛选一种或多种具有化妆品益处和/或药物益处的成分中的用途。
因此，本发明还涉及筛选和/或体外研究至少一种具有化妆品益处和/或药物益处的成分的方法，所述具有化妆品益处和/或药物益处的成分具有增加和/或降低胞外基质中分子的量的性质。根据本发明的筛选和/或研究方法包括上文所述的根据本发明的测定方法，其中在所述成分的存在下培养细胞。在步骤a）中，在含有具有化妆品益处和/或药物益处的成分的培养基中铺满培养细胞至少24小时，优选地24至96小时，更优选地48小时。
有利地，根据本发明的筛选和/或研究方法至少包括以下的连续步骤：
a）在所述成分的存在下培养细胞且铺满培养细胞至少24小时的步骤；
b）优选地收集培养基并更优选地测定所述这样收集的培养基中ECM分子和/或ECM分子的前体的步骤；
c）用季胺溶液裂解细胞的步骤；
d）收集细胞裂解物并优选测定DNA和/或测定ECM分子和/或ECM分子的前体的步骤；
e）通过免疫学技术测定所述包含在胞外基质中的ECM分子的步骤。
根据优选实施方案，所述方法进一步包括步骤f）：确定所述成分具有增加或降低胞外基质的分子的量的性质。
然后相对于在无所述成分的情况下进行的实验和/或用作为阳性对照的成分进行的实验，测定所述成分刺激或抑制的能力。在所测定的ECM分子是胶原的情况下，阳性对照优选地选自维生素C、TGFβ及其混合物，所述维生素C的浓度在5μM至100μM的范围内且优选地为50μM，所述TGFβ的剂量优选在1ng/ml至100ng/ml的范围内且更优选为10ng/ml。抗坏血酸和TGFβ确实是所谓的胶原“加强”成分，申请人进行的研究已证明它们在根据本发明的测定方法中的优势（实施例5）。
然后通过与在无所述成分的情况下测定的比值和/或用阳性对照测定的比值（通过步骤d）中测量的DNA合理化）相比较，根据步骤e）中测定的ECM分子的比值（通过步骤d）中测量的DNA合理化）来分类成分。所述比较优选通过方差统计学分析中所称作的单因素方差分析来进行。
-如果用所述成分获得的比值显著地大于用未处理的对照获得的比值，其中至少p<0.05且优选p<0.001，则所述成分提高了ECM中分子的功能性，即增加了所述分子在ECM中的含量；
-如果所述成分的比值显著地大于用抗坏血酸和/或TGFβ获得的比值，其中至少p<0.05且优选p<0.001，则所述成分提高了ECM中胶原的功能性，即增加了胶原在ECM中的含量；
-如果所述成分的比值显著地小于未处理的对照的比值，其中至少p<0.05且优选p<0.001，则所述成分降低了ECM中分子的功能性，即减少了所述分子在ECM中的含量。
具有化妆品益处的成分可以用于美容护理，尤其是用于抗衰老处理，尤其是用于减少皱纹和皮肤衰老的迹象，和/或用于改善皮肤的硬度（firmness），所述成分增加所测定的ECM分子（尤其是胶原）在ECM中的含量的能力高于50μM的抗坏血酸。
具有药物益处的成分可以用于改善创伤愈合过程，用于治疗关节病，所述成分增加所测定的ECM分子（尤其是胶原）在ECM中的含量的能力高于50μM的维生素C。
具有药物益处的成分可以用于治疗纤维化和肥厚性瘢痕（hypertrophic scar），所述成分具有降低ECM中分子的含量的能力。
本发明进一步涉及试剂盒，其用于通过免疫学方法进行的测定方法和/或用于筛选和/或研究根据本发明的具有化妆品益处和/或药物益处的成分的方法，所述免疫学方法用于进行根据本发明的测定方法，所述试剂盒包含季胺溶液和抗ECM分子的抗体。在根据本发明的方法的上下文中描述了季胺溶液的优选和/或有利的特征。
抗ECM分子的抗体是单克隆或多克隆抗体，且优选地选自抗-胶原抗体、抗-弹性蛋白抗体及其混合物。
任选地通过使用第二抗体，通过EIA（酶免疫测定）类型的酶-底物测定技术，尤其是ELISA（酶联免疫吸附测定），称为RIA（放射免疫测定）的放射性标记，及称为FIA（荧光免疫测定）的荧光测量法，尤其是称为TRF（时间分辨荧光）的时间延迟荧光可以测量抗体。
根据优选实施方案，根据本发明的测定试剂盒进一步包含抗坏血酸溶液，所述抗坏血酸溶液的浓度优选在5μM至100μM的范围内，且优选为50μM。
根据优选实施方案，根据本发明的测定试剂盒还包含抗ECM分子的前体的抗体和/或用于根据本发明的方法的DNA测定的双苯酰亚胺（bisbenzimide）溶液。
本发明还涉及根据本发明的测定试剂盒的用途，用于实施根据本发明的方法。
本发明还涉及选择用于根据本发明的测定方法的裂解液的方法，其中用待测试的裂解液进行根据本发明的测定方法至少10分钟，优选地10分钟，并将步骤e）中获得的ECM分子的测定结果与细胞裂解物中DNA的测定结果的比值同在相同的时间，优选10分钟中应用20mM氢氧化铵裂解液获得的比值相比较。
优选地，通过方差统计学分析中所称作的单因素方差分析来进行比较，如果所测试的溶液的比值没有至少p<0.05且优选p<0.001的显著差异，则选择所测试的裂解液。
这样选择的裂解液可以用于在根据本发明的测定方法中取代季胺溶液。因此本发明还涉及通过根据本发明的选择方法选择的裂解液。
根据优选实施方案，根据本发明的方法包括步骤a）、b）、c）、d）和e）及可选的f）。
对本领域技术人员而言，在阅读说明性描述之后，本发明的其他目的、特征和优势将显而易见，该说明性描述涉及仅以说明的方式给出，而不以任意方式限制本发明的范围的实施例。
实施例是本发明不可或缺的部分，基于全部说明书（包括实施例）就任意现有技术而言显得新颖的任意特征在功能上和普遍性上都是本发明不可或缺的部分。
因此，每个实施例具有通用的范围。
此外，在实施例中，除非另有说明，温度表示为摄氏度，压力为大气压。
实施例：
实施例1：用于根据本发明的ECM中的I型胶原的测定方法
原理：
通过根据本发明的方法测定的ECM分子是成纤维细胞合成的I型胶原。
方案：
-步骤a）：
将获自腹部活组织检查的正常人成纤维细胞接种在96孔板中，并在确定成分培养基（FGM）中培养，在培养3天后获得100%铺满的细胞。
-步骤b）：
铺满后培养48小时后，移出并丢弃培养基。
-步骤c）：
进行裂解步骤：110μl 20mM的氢氧化铵溶液在室温并搅拌下裂解10分钟。
-步骤d）：
收集并分析裂解物。通过使用双苯酰亚胺法（Picogreen试剂盒,Invitrogen）测定包含在裂解物中的双链DNA。
-步骤e）：
通过使用抗胶原I抗体在ECM上直接测定ECM中的胶原。将与铕缀合的第二抗体用于检测溶液，并测量荧光（试剂盒-PerkinElmer）。
相对于所测量的dsDNA的量合理化荧光结果。
在6个孔上进行实验（n=6）。
所提供的结果对应于平均值（平均数）和标准差（SD）。
结果：
Figure BDA0000442220330000151
讨论：
由于荧光的量与所测量的胶原量成比例，可以通过使用标准范围来测定胶原的量。
实施例2：裂解时间对用于根据本发明的ECM中的I型胶原的测定方法的影响的研究
原理：
通过根据本发明的方法测定的ECM分子是成纤维细胞合成的I型胶原，其为裂解时间的函数。
方案：
使用实施例1中所述的方案，其中在不同持续时间（5分钟至240分钟的范围）中用20mM的氢氧化铵溶液进行裂解步骤。
对于每个持续时间，在6个孔中进行实验（n=6）。
所提供的结果对应于平均值（平均数）和标准差（SD），通过单因素方差分析（Dunnett）确定相对于10分钟的最适持续时间的显著性。
NS：不显著；NT：不可分析。
*：在p<0.05显著；**：在p<0.01显著；***：在p<0.001显著。
结果
表2
Figure BDA0000442220330000161
结论：
观察到，对于检测活细胞的量而言，在2.5分钟提取的DNA的量太少。从5分钟开始，测量的胶原的量和dsDNA的量随时间推移而一致（homogeneous）。胶原未随时间推移而被氢氧化铵溶液降解，将最适裂解时间确定为10分钟。进行了实验，其中裂解步骤的持续时间为至多48小时，且确认了这些观察结果。
实施例3：裂解液的性质对用于根据本发明的ECM中的V型胶原的测定方法的影响的研究
原理：
通过根据本发明的方法测定的ECM分子是成纤维细胞合成的V型胶原，根据裂解液的性质进行研究。
方案：
以相同的方式应用实施例1中所述的方案。
因此，将从腹部活组织检查获得的正常人成纤维细胞接种在96孔板中，并在确定成分培养基（FGM）中培养至100%的铺满。
铺满后在37℃、0.5%CO2下培养48小时，之后收集培养基。
所测试的裂解液如下：
-根据本发明的溶液NH4OH：110μl 20mM的氢氧化铵溶液。
-溶液1：含52.55g尿素、15.01g硫脲、964mg DTT和37.2mg EDTA的溶液。
-溶液2：含10mM Tris/0.1%Triton的溶液。
-溶液3：含50mM Hepes的溶液。
-溶液4：含50Mm Tris HCl（pH7.5）、去垢剂（0.5mM脱氧胆酸钠）和螯合剂（20mM EGTA）的溶液。
-溶液5：含50mM EDTA的溶液。
-溶液6：含0.2N NaOH和1%SDS的溶液。
应用所测试的裂解液的时间是在室温且搅拌下10分钟。
收集并分析裂解物。通过使用双苯酰亚胺法（Picogreen试剂盒,Invitrogen）测定包含在裂解物中的双链DNA。
通过使用抗胶原V抗体在ECM上直接测定ECM中的胶原V。将与铕缀合的第二抗体用于检测溶液，并测量荧光（
Figure BDA0000442220330000171
试剂盒-PerkinElmer）。
测量荧光。
对于每种裂解液，在6个孔中进行实验（n=6）。
结果提供在表3.1中。
重复实验，所测试的裂解液如下：
-根据本发明的溶液NH4OH：110μl浓度在200μM和2M之间的氢氧化铵溶液。
-20mM单乙胺溶液。
-20mM二乙胺溶液。
-20mM三乙胺溶液。
结果提供在表3.2和3.3中。
所提供的结果对应于平均值（平均数）和标准差（SD），通过单因素方差分析（Dunnett）确定相对于NH4OH裂解液的显著性。
NS：不显著；NT：不可分析。
*：在p<0.05显著；**：在p<0.01显著；***：在p<0.001显著。
结果：
表3.1：
Figure BDA0000442220330000181
表3.2：
Figure BDA0000442220330000182
表3.3：
Figure BDA0000442220330000183
Figure BDA0000442220330000191
讨论：
所进行的测试证明，氢氧化铵溶液使得有可能获得比常用的细胞裂解液及伯胺、仲胺和叔胺溶液更可靠、可重复和可重现的结果。氢氧化铵溶液允许在对于细胞裂解和胶原V的测量都是最好的条件中进行测定。对于细胞裂解和胶原V的测量，所测试的其他季胺溶液也显示非常有趣的结果。此外，用不同浓度的氢氧化铵裂解液获得的胶原V/DNA的比值并非显著不同于用20mM溶液获得的比值。由于20mM溶液使用方便，所以此溶液浓度是最适的。
实施例4：用于根据本发明的三个区室中的I型胶原的测定方法
原理：
收集不同的区室（胞内区室（细胞裂解物）、培养基区室和ECM区室）并测定不同形式的胶原I。
方案：
应用实施例1中所述的方法，并分析所收集的培养基和裂解培养基。
在无活性成分和具有以0.1至100μM的不同浓度溶解在PBS中的抗坏血酸的情况下进行实验。
在所收集的培养基中，通过ELISA进行（PIPc试剂盒,TAKARA）前胶原测定（表4.1），所述ELISA用于测定胞外前胶原的量。
在所收集的裂解培养基中，通过ELISA进行（PIPc试剂盒,TAKARA）前胶原测定（表4.2），所述ELISA用于测定胞内前胶原的量。还进行了DNA测定（Picogreen试剂盒,Invitrogen），以用于将每个孔中的所有测量结果对活细胞的量合理化。
测定了ECM中胶原I的量，并提供在表4.3中。
将所测量的胶原和前胶原的量对存在于每个孔中的DNA的量合理化。
相对于对照进行了单因素方差统计学分析。
NS：不显著；NT：不可分析。
*：在p<0.05显著；**：在p<0.01显著；***：在p<0.001显著。
结果：
表4.1：
Figure BDA0000442220330000201
表4.2：
Figure BDA0000442220330000202
表4.3：
讨论：
可以分别通过参考人类前胶原和胶原的标准曲线来计算前胶原和胶原的量。
如所显示的，已知抗坏血酸或维生素C增加了胞外基质中前胶原的合成和分泌。用根据本发明的方法也测量到了这些刺激作用，其包括对ECM中胶原I的含量的作用。此作用具有多达50μM的剂量依赖性，在50μM观察到了分子的阈值效应。在维生素C的作用下在胞内区室中观察到的浓度低于用未经处理的对照观察到的浓度，因为更大程度的前胶原分泌入胞外基质。
实施例5：I型胶原和V型胶原的测定方法作为筛选方法的用途
原理：
测试了已知对胶原合成具有刺激作用的具有化妆品益处的活性成分对ECM中的I型胶原以及ECM中的V型胶原的作用。
方案：
根据实施例1中所述的方案用从63岁老年供体的活组织检查提取的成纤维细胞进行实验。
所测试的具有化妆品益处的活性成分是：
-以从5至100μM的不同浓度测试了溶解在PBS缓冲溶液中的50μM抗坏血酸。
-以从0.5至2%v/v的不同浓度测试了描述于专利申请WO2009121422中并由申请人在名称PhytokineTM下销售的大豆蛋白质的水解产物。
在活性成分的存在下在37℃、0.5%CO2下铺满培养细胞48小时，或在无活性成分（对照）的情况下在37℃、0.5%CO2下铺满培养细胞48小时。
对于每种条件，在6个孔中进行实验（n=6）——所提供的结果对应于平均值（平均数）和标准差（SD）。
在PhytokineTM的作用下测定I型胶原获得的结果提供在表5.1中，测定V型胶原获得的结果提供在表5.2中。
在抗坏血酸的作用下测定I型胶原获得的结果提供在表5.3中，测定V型胶原获得的结果提供在表5.4中。
相对于对照，通过单因素方差分析（Dunnett）来计算显著性。
NS：不显著；NT：不可分析。
*：在p<0.05显著；**：在p<0.01显著；***：在p<0.001显著。
结果：
表5.1：
Figure BDA0000442220330000221
表5.2：
Figure BDA0000442220330000231
表5.3：
Figure BDA0000442220330000232
表5.4：
讨论：
结果显示，PhytokineTM和抗坏血酸均以显著的剂量效应诱导刺激胶原I和V的合成。对于胶原I测定，抗坏血酸的功效的最适剂量是50μM。
实施例6：用于I型胶原的测定方法作为筛选方法的用途
原理：
测试了已知对胶原合成具有刺激作用的具有化妆品益处的活性成分对ECM中的I型胶原的作用。
方案：
根据实施例1中所述的方案用从63岁老年供体的活组织检查提取的成纤维细胞进行实验。
所测试的具有化妆品益处的活性成分是：
-溶解在PBS缓冲液中的50μM抗坏血酸。
-以1%（v/v）测试植物提取物，其是Davilla rugosa叶的水性提取物。
在活性成分的存在下在37℃、0.5%CO2下铺满培养细胞48小时，或在无活性成分（对照）的情况下在37℃、0.5%CO2下铺满培养细胞48小时。
对于每个条件，在6个孔中进行实验（n=6）——所提供的结果对应于平均值（平均数）和标准差（SD）。
通过单因素方差分析（Dunnett）检验计算显著性。
NS：不显著；NT：不可分析。
*：在p<0.05显著；**：在p<0.01显著；***：在p<0.001显著。
结果
Figure BDA0000442220330000251
讨论：
结果显示，所测试的50μM抗坏血酸和植物提取物诱导ECM中胶原1的量显著增加。所测试的植物提取物比抗坏血酸更有效，因此尤其可以用于皱纹的美容处理及用于增加皮肤的硬度的具有化妆品益处和/或药物益处的成分。
实施例7：用根据本发明的方法筛选的成分的性质的研究
-培养基中的前胶原测定：
在实施例6中，根据实施例4中所述的方法测定了在步骤b）中收集的培养基中的前胶原。
结果提供在表7中。
表7：
Figure BDA0000442220330000261
结论：植物提取物未显示出增加培养基中前胶原的合成，但已证明基质中胶原I的量的增加。
-免疫组织化学分析：
方案：根据以下方案进行免疫组织化学分析：
将从活组织检查获得的正常人成纤维细胞以40,000细胞/cm2的比例接种在Lab-Tek8孔载玻片上，并在确定成分培养基FGM中培养至100%的铺满。应用所评价的成分（1%v/v植物提取物或50μM抗坏血酸）72小时。
铺满后培养72小时后，去除培养基，并进行免疫标记。应用多克隆抗-胶原I一级抗体，在去除培养基后加入与荧光色素alexa488缀合的第二抗体。
在LSM700共聚焦显微镜下检查荧光。
结果：测量为荧光的函数的结果如下：
Figure BDA0000442220330000271
结论：
显示研究能够确认用根据本发明的方法获得的结果。
此外，这些结果证明了筛选成分的优势，所述成分的性质作为ECM中分子的量的函数，并证明了根据本发明的方法的优势。

Claims (22)

1.使用免疫学技术体外测定培养细胞合成的至少一种胞外基质分子的测定方法，其至少包括以下步骤：
a）培养所述细胞且优选铺满培养所述细胞至少24小时的步骤；
b）收集培养基的优选步骤；
c）用季胺溶液裂解所述细胞的步骤；
d）收集细胞裂解物的步骤；
e）通过免疫学技术测定所述胞外基质中所述分子的步骤。
2.根据权利要求1的测定方法，其中进行了所述收集培养基的步骤b）。
3.根据前述权利要求中任一项的测定方法，其中所述ECM分子选自构成ECM的蛋白质、构成ECM的糖蛋白、构成ECM的糖胺聚糖、构成ECM的蛋白聚糖及包含在ECM中的生长因子。
4.根据权利要求3的测定方法，其中所述ECM分子选自I、III、V、VI、XII、XIV、XVI、IV和VII型胶原、弹性蛋白、原弹性蛋白、肌原纤蛋白1、LOX、LOXL、EBP（弹性蛋白结合蛋白）、纤蛋白3和5、弹联蛋白1和2、基底膜蛋白聚糖、多功能蛋白聚糖、饰胶蛋白聚糖、双糖链蛋白聚糖、光亮蛋白聚糖、纤连蛋白、层粘连蛋白、透明质酸、硫酸乙酰肝素。
5.根据权利要求3的测定方法，其中所述ECM分子选自VEGF、PDGF、FGF-2、FGF-7和HGF。
6.根据前述权利要求中任一项的测定方法，其中所述培养细胞选自基质细胞，优选成纤维细胞、成骨细胞和/或脂肪母细胞，上皮细胞，优选角质形成细胞或内皮细胞。
7.根据权利要求6的测定方法，其中所述培养细胞选自成纤维细胞和/或角质形成细胞和/或脂肪细胞。
8.根据前述权利要求中任一项的测定方法，其中在进行所述步骤c）之前，维持所述培养细胞铺满培养24至96小时的时间。
9.根据权利要求8的测定方法，其中向所述培养基加入具有化妆品益处和/或药物益处的活性成分。
10.根据权利要求9的测定方法，其中所述成分选自维生素C和TGFβ，所述维生素C的剂量优选地在5μM至100μM的范围内，所述TGFβ的剂量优选地在1ng/ml至100ng/ml的范围内。
11.根据权利要求2至10中任一项的测定方法，其中通过免疫学方法，优选地通过ELISA型测定法在所述步骤b）中收集的培养基中测定所述ECM分子和/或所述ECM分子的前体。
12.根据前述权利要求中任一项的测定方法，其中所述季胺溶液是铵溶液，优选地是以盐的形式存在的铵溶液。
13.根据前述权利要求的测定方法，其中所述季胺溶液选自氯化铵溶液、氢氧化铵溶液及其混合物。
14.根据前述权利要求中任一项的测定方法，其中所述季胺溶液的浓度在10mM至200mM的范围内。
15.根据前述权利要求中任一项的测定方法，其中将所述季胺溶液应用于所述细胞的时间在5至60分钟的范围内。
16.根据前述权利要求中任一项的测定方法，其中在所述步骤d）中收集的细胞裂解物中进行DNA和/或所述ECM分子的测定。
17.根据前述权利要求中任一项的测定方法，其中通过TRF荧光法进行所述步骤e），所述步骤e）是通过使用免疫学技术测定所述包含在胞外基质中的分子。
18.根据前述权利要求中任一项的测定方法，其至少包括以下步骤：
a）培养所述细胞且优选地铺满培养所述细胞至少24小时的步骤；
b）收集所述培养基并测定所述ECM分子和/或ECM分子的前体的步骤；
c）用所述季胺溶液裂解所述细胞的步骤；
d）收集所述细胞裂解物并测定所述DNA和/或测定所述ECM分子和/或所述ECM分子的前体的步骤；
e）通过所述免疫学技术测定所述包含在胞外基质中的ECM分子的步骤。
19.根据前述权利要求中任一项的测定方法的用途，用于筛选和/或体外研究至少一种具有化妆品益处和/或药物益处的成分，所述具有化妆品益处和/或药物益处的成分具有增加和/或降低胞外基质中分子的量的性质。
20.筛选和/或体外研究至少一种具有化妆品益处和/或药物益处的成分的方法，所述具有化妆品益处和/或药物益处的成分具有增加和/或降低胞外基质中分子的量的性质，所述方法至少包括以下步骤：
a）培养细胞的步骤；
b）优选地收集培养基并更优选地测定所述这样收集的培养基中ECM分子和/或ECM分子的前体的步骤；
c）用季胺溶液裂解细胞的步骤；
d）收集细胞裂解物并优选地测定DNA和/或测定ECM分子和/或ECM分子的前体的步骤；
e）通过免疫学技术测定所述包含在胞外基质中的ECM分子的步骤。
21.用于根据前述权利要求中任一项的测定方法的试剂盒，所述测定方法通过免疫学方法进行，所述试剂盒包含季胺溶液和任选地与第二抗体结合的抗ECM分子的抗体。
22.选择用于根据权利要求1至18中任一项的测定方法或根据权利要求20的筛选方法的裂解液的方法，其中用待测试的裂解液进行根据本发明的测定方法至少10分钟，优选地10分钟，并将步骤e）中获得的ECM分子的测定结果与步骤d）中细胞裂解物中DNA的测定结果的比值同在相同的时间，优选10分钟中应用20mM氢氧化铵裂解液获得的比值相比较。
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